KR20230149789A - Method of providing information for diagnosis of ovarian cancer - Google Patents

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KR20230149789A
KR20230149789A KR1020230140073A KR20230140073A KR20230149789A KR 20230149789 A KR20230149789 A KR 20230149789A KR 1020230140073 A KR1020230140073 A KR 1020230140073A KR 20230140073 A KR20230140073 A KR 20230140073A KR 20230149789 A KR20230149789 A KR 20230149789A
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김세익
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Abstract

본 발명은 난소암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다. 특히, 난소암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 대상체의 시료로부터 얻은 CA-125 수치 및 아시네토박터 상대 존재비를 측정하고, 이를 변수로 하여 난소암일 확률을 진단하는 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a method of providing information for diagnosing ovarian cancer. In particular, in order to provide information necessary for diagnosing ovarian cancer, the CA-125 level and the relative abundance of Acinetobacter obtained from the subject's sample are measured, and the probability of ovarian cancer is diagnosed using these as variables.

Description

난소암 진단을 위한 정보제공 방법 {Method of providing information for diagnosis of ovarian cancer}{Method of providing information for diagnosis of ovarian cancer}

본 발명은 난소암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of providing information for diagnosing ovarian cancer.

난소암 (Ovarian cancer)은 전 세계적으로 가장 치명적인 부인 암 중 하나이다. 미국에서 2019년 난소암으로 인한 암 사망 건수는 13,980 명 (여성 암 사망의 4.9 %)으로 추정되며, 한국에서는 난소암의 발생이 점차 증가하고 있는 추세이다. 그러나 난소암에 대한 효과적인 진단 방법이 없어 대부분의 난소암은 치료가 어려운 단계에서 진단되어 높은 재발 및 사망률을 보인다.Ovarian cancer is one of the most lethal gynecological cancers worldwide. In the United States, the number of cancer deaths due to ovarian cancer in 2019 is estimated at 13,980 (4.9% of female cancer deaths), and in Korea, the incidence of ovarian cancer is gradually increasing. However, because there is no effective diagnostic method for ovarian cancer, most ovarian cancers are diagnosed at a stage when treatment is difficult, resulting in high recurrence and mortality rates.

난소암와 양성 난소 종양을 구별하는 것은 외과적 접근을 포함한 치료 계획을 결정하기 위해 중요한 문제이다. 현재 난소암에 사용할 수 있는 검출 도구는 혈액 암 항원 125 (CA-125) 수준, 초음파 촬영, 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔 및 자기 공명 영상 (MRI) 등이 이용된다. 그러나 그들의 진단 성능과 정확도가 차이가 있다는 점을 고려할 때, 여전히 난소암 진단 방법에 개선이 필요하다.Distinguishing between ovarian cancer and benign ovarian tumors is an important issue for determining treatment plans, including surgical approaches. Currently available detection tools for ovarian cancer include blood cancer antigen 125 (CA-125) levels, ultrasonography, computed tomography (CT) scans, and magnetic resonance imaging (MRI). However, considering the differences in their diagnostic performance and accuracy, there is still a need for improvement in ovarian cancer diagnosis methods.

최근 마이크로 바이옴 연구에 따르면 미생물 군 구성의 유의한 차이가 구강암, 식도암, 췌장암 및 결장 직장암과 관련이 있음이 밝혀졌다. 미생물 게놈의 시퀀싱 기술의 발전으로 마이크로 바이옴 데이터가 확장되고 미생물 군-숙주 상호 작용에 대한 이해가 확대되고 있으며, 특히 미생물에 의해 분비되고 체액에서 검출 가능한 세포외소포 (extracellular vesicles)에 대한 연구가 이루어지고 있다. 그러나 혈액 미생물 세포외소포와 난소암의 관계는 아직 조사되지 않았다.Recent microbiome studies have shown that significant differences in microbiome composition are associated with oral, esophageal, pancreatic, and colorectal cancers. Advances in sequencing technologies for microbial genomes are expanding microbiome data and expanding our understanding of microbiome-host interactions, particularly studies of extracellular vesicles secreted by microorganisms and detectable in body fluids. It is being done. However, the relationship between blood microbial extracellular vesicles and ovarian cancer has not yet been investigated.

한국등록특허 제 1576053 호Korean Patent No. 1576053

본 발명은 메타제노믹 분석을 이용한 난소암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.The present invention provides a method of providing information for diagnosing ovarian cancer using metagenomic analysis.

본 발명은 메타제노믹 분석을 이용한 난소암 진단을 위한 진단기기를 제공한다.The present invention provides a diagnostic device for diagnosing ovarian cancer using metagenomic analysis.

1. 대상체의 샘플에서 아시네토박터 (acinetobacter) 상대 존재비를 측정하는 단계; 및1. Determining the relative abundance of Acinetobacter in a sample of the subject; and

하기 수학식1에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계;를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.A method of providing information for diagnosing ovarian cancer, including calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 1 below.

[수학식 1][Equation 1]

Y1 = X1 * 환자 나이(age) + X2 * 아시네토박터 상대 존재비.Y1 = X1 * patient age (age) + X2 * Acinetobacter relative abundance.

(X1는 수학식 1에서의 환자 나이에 대한 가중치, X2는 수학식 1에서의 아시네토박터 상대 존재비에 대한 가중치이며, 상기 X1과 X2의 합은 0 내지 1 사이이다.)(X1 is the weight for the patient's age in Equation 1, X2 is the weight for the relative abundance of Acinetobacter in Equation 1, and the sum of X1 and X2 is between 0 and 1.)

2. 위 1에 있어서, 상기 X1은 0.015 내지 0.045, 상기 X2는 0.35 내지 0.65인, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.2. The method of providing information for diagnosing ovarian cancer in 1 above, wherein X1 is 0.015 to 0.045 and X2 is 0.35 to 0.65.

3. 대상체의 샘플에서 CA-125 및 아시네토박터 상대 존재비를 측정하는 단계; 및3. Determining the relative abundance of CA-125 and Acinetobacter in a sample from the subject; and

하기 수학식2에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계;를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.A method of providing information for diagnosing ovarian cancer, including calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 2 below.

[수학식 2] [Equation 2]

Y2 = X3 * 환자 나이 + X4 * 샘플 CA-125 수치 + X5 * 아시네토박터 상대 존재비.Y2 = X3 * Patient age + X4 * Sample CA-125 level + X5 * Acinetobacter relative abundance.

(X3은 수학식 2에서의 환자 나이에 대한 가중치, X4는 수학식 2에서의 아시네토박터 상대 존재비에 대한 가중치, X5는 수학식 2에서의 상기 샘플 CA-125에 대한 가중치이며, 상기 X3 내지 X5의 합은 0 내지 1 사이이다.)(X3 is the weight for the patient's age in Equation 2, X4 is the weight for the relative abundance of Acinetobacter in Equation 2, X5 is the weight for the sample CA-125 in Equation 2, The sum of X5 is between 0 and 1.)

4. 위 3에 있어서, 상기 X3은 0.010 내지 0.030, 상기 X4는 0.003 내지 0.0055, 상기 X5는 0.45 내지 0.65인, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.4. The method of providing information for diagnosing ovarian cancer according to 3 above, wherein X3 is 0.010 to 0.030, X4 is 0.003 to 0.0055, and X5 is 0.45 to 0.65.

5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 혈액에서 아시네토박터 상대 존재비를 측정하는 단계는,5. The method of any one of 1 to 4 above, wherein the step of measuring the relative abundance of Acinetobacter in the blood of the subject is,

상기 혈액에서 분리된 세포외소포에 포함된 DNA를 분석하여 수행되는 것인, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.A method of providing information for diagnosing ovarian cancer, which is performed by analyzing DNA contained in extracellular vesicles isolated from the blood.

6. 대상체의 샘플에서 CA-125 수치를 측정하는 단계; 및6. Measuring CA-125 levels in a sample from the subject; and

하기 수학식3에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계;를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.A method of providing information for diagnosing ovarian cancer, including calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 3 below.

[수학식 3][Equation 3]

Y3 = X6 * 대상체 나이 + X7 * 샘플 CA-125 수치.Y3 = X6 * subject age + X7 * sample CA-125 level.

(X6은 수학식 3에서의 환자 나이에 대한 가중치, X7는 수학식 3에서의 샘플 CA-125에 대한 가중치이며, 상기 X6과 X7의 합은 0 내지 1 사이이다.)(X6 is the weight for patient age in Equation 3, X7 is the weight for sample CA-125 in Equation 3, and the sum of X6 and X7 is between 0 and 1.)

7. 위 6에 있어서, 상기 X6은 0.010 내지 0.035, 상기 X7는 0.002 내지 0.005인, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.7. The method of providing information for diagnosing ovarian cancer in item 6 above, wherein X6 is 0.010 to 0.035 and X7 is 0.002 to 0.005.

8. 하기 수학식2에 따라 대상이 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 연산부를 포함하는, 난소암 진단기기.8. An ovarian cancer diagnostic device including an arithmetic unit that calculates the probability that a subject has ovarian cancer according to Equation 2 below.

[수학식 2][Equation 2]

Y2 = X3 * 환자 나이 + X4 * 샘플 CA-125 수치 + X5 * 아시네토박터 상대 존재비.Y2 = X3 * Patient age + X4 * Sample CA-125 level + X5 * Acinetobacter relative abundance.

(X3은 수학식 2에서의 환자 나이에 대한 가중치, X4는 수학식 2에서의 아시네토박터 상대 존재비에 대한 가중치, X5는 수학식 2에서의 상기 샘플 CA-125에 대한 가중치이며, 상기 X3 내지 X5의 합은 0 내지 1 사이이다.)(X3 is the weight for the patient's age in Equation 2, X4 is the weight for the relative abundance of Acinetobacter in Equation 2, X5 is the weight for the sample CA-125 in Equation 2, The sum of X5 is between 0 and 1.)

9. 위 8에 있어서, 상기 X3은 0.010 내지 0.030, 상기 X4는 0.003 내지 0.0055, 상기 X5는 0.45 내지 0.65인, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.9. The method of providing information for diagnosing ovarian cancer according to 8 above, wherein X3 is 0.010 to 0.030, X4 is 0.003 to 0.0055, and X5 is 0.45 to 0.65.

본 발명을 통해 효율적으로 양성 난소 종양과 악성 난소 종양을 구별할 수 있으며, 난소암 진단에 활용될 수 있다.Through the present invention, it is possible to efficiently distinguish between benign and malignant ovarian tumors and can be used for diagnosing ovarian cancer.

도 1 은 전체 연구 설계 흐름도이다.
도 2는 모든 환자에서 메타 유전체 프로파일의 랜드스케이프를 나타낸다. 도 2 (A)는 문 수준(phylum-level)의 구성을 나타낸다. 도 2 (B)는 속 수준(genus-level)의 구성을 나타낸다. 플롯 아래의 빨간색 및 녹색 가로 막대는 각각 난소 암 환자와 양성 난소 종양 환자를 나타낸다.
도 3은 두 그룹 간의 속 수준에서의 α- 다양성을 비교한 결과이다. 도 3 (A)는 트레이닝 세트, 도 3 (B)는 테스트 세트의 결과이다.
도 4는 속 수준의 다차원 플롯을 나타낸다. 도 4 (A)는 훈련 세트, 도 4 (B)는 테스트 세트를 나타낸다.
도 5는 속 수준의 미생물 군유의 8 가지 통계적 방법 중의 전체 바이오 마커의 중첩을 나타낸다.
도 6은 양성 난소 종양에서 난소 암을 구별하는 진단 모델 간의 성능 비교 결과를 나타낸다.
Figure 1 is an overall study design flow chart.
Figure 2 presents the landscape of metagenomic profiles in all patients. Figure 2 (A) shows the structure at the phylum-level. Figure 2 (B) shows the organization at the genus-level. Red and green horizontal bars below the plot represent patients with ovarian cancer and patients with benign ovarian tumors, respectively.
Figure 3 shows the results of comparing α-diversity at the genus level between the two groups. Figure 3(A) is the training set, and Figure 3(B) is the test set.
Figure 4 shows a multidimensional plot at the genus level. Figure 4(A) shows the training set, and Figure 4(B) shows the test set.
Figure 5 shows the overlap of overall biomarkers among eight statistical methods of microbiome abundance at the genus level.
Figure 6 shows the results of performance comparison between diagnostic models for distinguishing ovarian cancer from benign ovarian tumors.

본 발명은 대상체의 샘플에서 아시네토박터 (acinetobacter) 상대 존재비를 측정하는 단계 및 하기 수학식 1에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for providing information for diagnosing ovarian cancer, comprising measuring the relative abundance of Acinetobacter in a sample of a subject and calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 1 below: It's about.

[수학식 1][Equation 1]

Y1 = X1 * 환자 나이(age) + X2 * 아시네토박터 상대 존재비.Y1 = X1 * patient age (age) + X2 * Acinetobacter relative abundance.

본 발명에서 아시네토박터 (Acinetobacter)란 그람음성 (gram-negative) 세균으로 대상체 내의 마이크로 바이옴의 일부이며, 암 진단을 위한 지표로 사용될 수 있다. 예를 들어, 난소암 (Ovarian cancer, OC) 등의 지표로 사용될 수 있다.In the present invention, Acinetobacter is a gram-negative bacterium that is part of the microbiome in a subject and can be used as an indicator for cancer diagnosis. For example, it can be used as an indicator of ovarian cancer (OC).

본 발명에서 대상체 샘플에 포함된 아시네토박터에 의해 분비된 세포외소포는 상피 세포의 세포 독성 및 숙주 염증 반응을 유도할 수 있다.In the present invention, extracellular vesicles secreted by Acinetobacter contained in the subject sample can induce cytotoxicity of epithelial cells and host inflammatory response.

본 명세서에서 “대상체”란 당뇨병이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 래트(rat), 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.In this specification, “subject” refers to all animals such as rats, mice, livestock, etc., including humans, that have developed or may develop diabetes. As a specific example, it may be a mammal, including humans.

본 발명에서 아시네토박터의 상대 존재비의 측정은 대상체의 샘플을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 대상체의 혈액, 타액, 체모 등이 해당할 수 있다.In the present invention, the relative abundance of Acinetobacter can be measured using a sample of an object. For example, this may include the subject's blood, saliva, or body hair.

본 발명에서 아시네토박터 상대 존재비 (relative abundance)란 CLR 변환 (a centered log ratio transformation)을 사용하여 계산된 비율일 수 있다.In the present invention, the relative abundance of Acinetobacter may be a ratio calculated using a centered log ratio transformation (CLR) transformation.

본 발명에서 아시네토박터 상대 존재비는 “대상체의 혈액에서 아시네토박터 계산 (count) 값/전체 속 (genus)의 계산 (count) 값”일 수 있다.In the present invention, the relative abundance of Acinetobacter may be “count value of Acinetobacter in the blood of the subject/count value of the entire genus.”

본 발명에서 상기 대상체의 샘플에서 아시네토박터 상대 존재비를 측정하는 단계는 상기 샘플에서 분리된 세포외소포에 포함된 DNA를 분석하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 혈액에서 분리된 세포외소포의 DNA를 분석하여 아시네토박터 상대 존재비를 측정할 수 있다.In the present invention, the step of measuring the relative abundance of Acinetobacter in a sample of the subject may be performed by analyzing DNA contained in extracellular vesicles isolated from the sample. For example, the relative abundance of Acinetobacter can be measured by analyzing the DNA of extracellular vesicles isolated from the subject's blood.

본 발명에서 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계는 변수에 따른 수학식을 이용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 환자 나이 및 아시네토박터 상대 존재비를 변수로 사용하는 경우, 상기 수학식 1을 이용하여 계산할 수 있다.In the present invention, the step of calculating the probability that a subject has ovarian cancer can be calculated using a mathematical formula according to variables. For example, when patient age and Acinetobacter relative abundance are used as variables, it can be calculated using Equation 1 above.

본 발명에서 환자 나이 (age)는 만 나이로 계산하였다.In the present invention, the patient's age was calculated as full age.

본 발명에서 상기 수학식 1의 각 변수는 수학식 1에서 차지하는 가중치에 따라, 각각의 가중치를 곱한 값으로 계산될 수 있다. 그리고 각 가중치의 값의 합은 0 내지 1 사이(예를 들어, 0 초과 1 이하)일 수 있다.In the present invention, each variable in Equation 1 can be calculated as a value multiplied by each weight, depending on the weight it occupies in Equation 1. And the sum of the values of each weight may be between 0 and 1 (eg, greater than 0 and less than or equal to 1).

예를 들어, X1는 수학식 1에서의 환자 나이에 대한 가중치이며, X2는 수학식 1에서의 아시네토박터 상대 존재비에 대한 가중치일 수 있다.For example, X1 may be a weight for the patient's age in Equation 1, and X2 may be a weight for the relative abundance of Acinetobacter in Equation 1.

본 발명에서 상기 X1은 0.010 내지 0.050, 예를 들어, 0.015 내지 0.045, 0.020 내지 0.040 일 수 있다.In the present invention, X1 may be 0.010 to 0.050, for example, 0.015 to 0.045, or 0.020 to 0.040.

본 발명에서 상기 X2는 0.30 내지 0.70, 예를 들어, 0.35 내지 0.65, 0.40 내지 0.60 일 수 있다.In the present invention, X2 may be 0.30 to 0.70, for example, 0.35 to 0.65, or 0.40 to 0.60.

본 발명은 대상체의 샘플에서 CA-125 및 아시네토박터 상대 존재비를 측정하는 단계 및 하기 수학식2에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계;를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.The present invention provides information for diagnosing ovarian cancer, including measuring the relative abundance of CA-125 and Acinetobacter in a sample of the subject and calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 2 below. It's about method.

[수학식 2] [Equation 2]

Y2 = X3 * 환자 나이(age) + X4 * 혈액 CA-125 수치 + X5 * 아시네토박터 상대 존재비.Y2 = X3 * Patient age + X4 * Blood CA-125 level + X5 * Acinetobacter relative abundance.

본 발명에서 CA-125 (Cancer antigen 125)이란 암 항원 125를 말하며, 종양 표지자 중 하나이다. 예를 들어, 난소암, 자궁체부암 등의 지표로 사용될 수 있다.In the present invention, CA-125 (Cancer antigen 125) refers to cancer antigen 125 and is one of the tumor markers. For example, it can be used as an indicator of ovarian cancer, uterine cancer, etc.

본 발명에서 CA-125 수치 측정은 대상체의 샘플을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 대상체의 혈액, 타액, 체모 등이 해당할 수 있다.In the present invention, CA-125 levels can be measured using a sample from a subject. For example, this may include the subject's blood, saliva, or body hair.

본 발명에서 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계는 변수에 따른 수학식을 이용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 환자 나이, CA-125 수치 및 아시네토박터 상대 존재비를 변수로 사용하는 경우, 상기 수학식 2를 이용하여 계산할 수 있다.In the present invention, the step of calculating the probability that a subject has ovarian cancer can be calculated using a mathematical formula according to variables. For example, when patient age, CA-125 level, and Acinetobacter relative abundance are used as variables, it can be calculated using Equation 2 above.

본 발명에서 상기 수학식 2의 각 변수는 수학식 2에서 차지하는 가중치에 따라, 각각의 가중치를 곱한 값으로 계산될 수 있다. 그리고 각 가중치의 값의 합은 0 내지 1 사이(예를 들어, 0 초과 1 이하)일 수 있다.In the present invention, each variable in Equation 2 can be calculated as a value multiplied by each weight according to the weight occupied in Equation 2. And the sum of the values of each weight may be between 0 and 1 (eg, greater than 0 and less than or equal to 1).

예를 들어, X3은 수학식 2에서의 환자 나이에 대한 가중치, X4는 수학식 2에서의 아시네토박터 상대 존재비에 대한 가중치, X5는 수학식 2에서의 상기 샘플 CA-125에 대한 가중치일 수 있다.For example, X3 may be the weight for patient age in Equation 2, X4 may be the weight for Acinetobacter relative abundance in Equation 2, and there is.

본 발명에서 상기 X3은 0.001 내지 0.050, 예를 들어, 0.005 내지 0.040, 0.010 내지 0.030일 수 있다.In the present invention, X3 may be 0.001 to 0.050, for example, 0.005 to 0.040, or 0.010 to 0.030.

본 발명에서 상기 X4는 0.001 내지 0.010, 예를 들어, 0.002 내지 0.007, 0.003 내지 0.0055일 수 있다.In the present invention, X4 may be 0.001 to 0.010, for example, 0.002 to 0.007, 0.003 to 0.0055.

본 발명에서 상기 X5는 0.30 내지 0.80, 예를 들어, 0.35 내지 0.75, 0.45 내지 0.65일 수 있다.In the present invention, X5 may be 0.30 to 0.80, for example, 0.35 to 0.75, or 0.45 to 0.65.

본 발명은 대상체의 혈액에서 CA-125 수치를 측정하는 단계 및 하기 수학식3에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of providing information for diagnosing ovarian cancer, including measuring CA-125 levels in the blood of a subject and calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 3 below.

[수학식 3][Equation 3]

Y3 = X6 * 대상체 나이 + X7 * 혈액 CA-125 수치.Y3 = X6 * subject age + X7 * blood CA-125 level.

본 발명에서 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계는 변수에 따른 수학식을 이용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 환자 나이 및 CA-125 수치를 변수로 사용하는 경우, 상기 수학식 3을 이용하여 계산할 수 있다.In the present invention, the step of calculating the probability that a subject has ovarian cancer can be calculated using a mathematical formula according to variables. For example, when patient age and CA-125 levels are used as variables, it can be calculated using Equation 3 above.

본 발명에서 상기 수학식 3의 각 변수는 수학식 3에서 차지하는 가중치에 따라, 각각의 가중치를 곱한 값으로 계산될 수 있다. 그리고 각 가중치의 값의 합은 0 내지 1 사이(예를 들어, 0 초과 1 이하)일 수 있다.In the present invention, each variable in Equation 3 can be calculated as a value multiplied by each weight, depending on the weight it occupies in Equation 3. And the sum of the values of each weight may be between 0 and 1 (eg, greater than 0 and less than or equal to 1).

예를 들어, X6은 수학식 3에서의 환자 나이에 대한 가중치, X7는 수학식 3에서의 혈액 CA-125에 대한 가중치일 수 있다.For example, X6 may be the weight for patient age in Equation 3, and X7 may be the weight for blood CA-125 in Equation 3.

본 발명에서 상기 X6은 0.001 내지 0.10, 예를 들어, 0.001 내지 0.050, 0.010 내지 0.035일 수 있다.In the present invention, X6 may be 0.001 to 0.10, for example, 0.001 to 0.050, or 0.010 to 0.035.

본 발명에서 상기 X7는 0.001 내지 0.010, 예를 들어, 0.0015 내지 0.007, 0.002 내지 0.005일 수 있다.In the present invention, X7 may be 0.001 to 0.010, for example, 0.0015 to 0.007, or 0.002 to 0.005.

본 발명은 하기 수학식2에 따라 대상이 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 연산부를 포함하는, 난소암 진단기기에 관한 것이다.The present invention relates to an ovarian cancer diagnostic device, including a calculation unit that calculates the probability that a subject has ovarian cancer according to Equation 2 below.

[수학식 2][Equation 2]

Y2 = X3 * 환자 나이 + X4 * 혈액 CA-125 수치 + X5 * 아시네토박터 상대 존재비.Y2 = X3 * Patient age + X4 * Blood CA-125 level + X5 * Acinetobacter relative abundance.

(X3은 수학식 2에서의 환자 나이에 대한 가중치, X4는 수학식 2에서의 아시네토박터 상대 존재비에 대한 가중치, X5는 수학식 2에서의 상기 혈액 CA-125에 대한 가중치이며, 상기 X3 내지 X5의 합은 0 내지 1 사이(예를 들어, 0 초과 1 이하)이다.)(X3 is the weight for the patient's age in Equation 2, X4 is the weight for the relative abundance of Acinetobacter in Equation 2, X5 is the weight for the blood CA-125 in Equation 2, The sum of X5 is between 0 and 1 (e.g., greater than 0 and less than or equal to 1).

본 발명에서 진단기기는 수학식을 도입하여 계산하는 연산부가 포함된 것이라면 제한되지 않는다.In the present invention, the diagnostic device is not limited as long as it includes an operation unit that calculates by introducing mathematical equations.

기타 세부 사항에 관한 내용은 상기 정보제공 방법에 기재된 내용을 참고할 수 있다.For other details, please refer to the information provided in the information provision method above.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail using examples and experimental examples to specifically explain the present invention.

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

1.1. 연구 모집단 (Study Population)1.1. Study Population

부속 종괴 수술을 받을 예정인 환자의 생물학적 샘플을 수집하였다. 환자의 혈액 샘플과 암 조직을 수술 전날과 수술 시점에 각각 채취하여 서울 대학교 휴먼 바이오 뱅크에 보관하였다.Biological samples were collected from patients scheduled to undergo surgery for an adnexal mass. The patient's blood samples and cancer tissue were collected the day before and at the time of surgery, respectively, and stored in the Seoul National University Human Biobank.

관련 환자를 특정하고 Human Biobank에서 냉동 혈액 샘플을 얻었다. 연구 모집단에 대한 포함 기준은 다음과 같았다.Relevant patients were identified and frozen blood samples were obtained from the Human Biobank. Inclusion criteria for the study population were as follows:

(1) 18 세 이상; (2) 2012 년 6 월에서 2018 년 2 월 사이에 부속기 종괴 (adnexal mass) 수술을 받음; 및 (3) 상피 OC 또는 양성 난소 종양으로 병리학적으로 진단됨.(1) 18 years of age or older; (2) underwent surgery for an adnexal mass between June 2012 and February 2018; and (3) pathologically diagnosed as epithelial OC or benign ovarian tumor.

다만, 다음과 같은 상태의 환자는 제외하였다.However, patients with the following conditions were excluded.

(A) 동시적으로 또는 수술 전에 OC 이외의 악성 종양으로 진단됨; (B) 수술전신 보조 화학 요법 또는 표적 요법을 받음; (C) 경계성 난소 종양 (borderline ovarian tumors)에 해당됨; 및 (D) 말기 신장 질환 (end-stage renal disease), 조절되지 않는 진성 당뇨병 (uncontrolled diabetes Mellitus) 또는 장기간 코르티코 스테로이드 사용 (long-term corticosteroid use)과 같은 심각한 동반 질환 (severe comorbidities)에 해당됨.(A) Diagnosed with a malignancy other than OC concurrently or prior to surgery; (B) received preoperative adjuvant chemotherapy or targeted therapy; (C) Corresponds to borderline ovarian tumors; and (D) have severe comorbidities such as end-stage renal disease, uncontrolled diabetes mellitus, or long-term corticosteroid use.

상기 기준에 의해 총 166 명의 OC 환자와 76 명의 양성 난소 종양 환자를 선정하였다. 의료 기록을 검토하여 진단 연령, BMI, 동반 질환 및 초기 혈액 CA-125 수치를 포함한 기본 특성을 수집하였다. 또한 모든 환자의 병리학 결과를 검토하고 연구 그룹을 위해 FIGO 단계에 대한 정보를 수집하였다. 이후 OC 군과 양성 난소 종양 군의 임상 병리학적 특성을 비교 하였다. 메타제노믹 (Metagenomic) 프로파일링은 아래 설명된 절차에 따라 환자의 동결된 혈액 샘플로 수행하였다.A total of 166 OC patients and 76 benign ovarian tumor patients were selected based on the above criteria. Medical records were reviewed to collect baseline characteristics, including age at diagnosis, BMI, comorbidities, and initial blood CA-125 level. We also reviewed the pathology results of all patients and collected information on FIGO stage for the study group. Afterwards, the clinicopathological characteristics of the OC group and the benign ovarian tumor group were compared. Metagenomic profiling was performed on frozen blood samples from patients according to the procedures described below.

1.2. 혈액 샘플에서 EV 분리 및 DNA 추출1.2. EV isolation and DNA extraction from blood samples

차동 원심 분리 방법을 사용하여 혈액 샘플에서 세포외소포 (Extracellular Vesicle)를 분리하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 15 분 동안 3000rpm으로 원심 분리하고, 100 μL의 상층 액을 1 PBS, pH 7.4 (ML 008-01, 대한민국 Welgene)와 혼합하였다. 부유 입자는 4℃에서 1 분 동안 10,000 X g에서 원심 분리를 통해 가라앉혔다. 원심 분리 후 0.22-μm 필터를 통해 상층액을 살균하여 세균과 이물질을 완전히 제거하였다.Extracellular vesicles were isolated from blood samples using a differential centrifugation method. Blood samples were centrifuged at 3000 rpm for 15 min at 4°C, and 100 μL of supernatant was mixed with 1 PBS, pH 7.4 (ML 008-01, Welgene, Korea). Suspended particles were settled by centrifugation at 10,000 After centrifugation, the supernatant was sterilized through a 0.22-μm filter to completely remove bacteria and foreign substances.

세포외소포의 막에서 DNA를 추출하기 위해, 이전 단계에서 혈액에서 분리된 EV를 100℃에서 40 분 동안 끓였다. 남아있는 부유 입자와 파편을 제거하기 위해 4℃에서 30 분 동안 13,000 rpm의 원심 분리 후 상층액을 수집하였다. EVs의 DNA는 표준 프로토콜 (PowerSoil DNA Isolation Kit, MO BIO, Carlsbad, CA, USA)에 따라 DNA 분리 키트를 사용하여 추출하였다. 각 샘플에서 EV의 DNA는 QIAxpert 시스템 (QIAGEN, Hilden, Germany)을 사용하여 정량화하였다.To extract DNA from the membrane of extracellular vesicles, EVs isolated from blood in the previous step were boiled at 100°C for 40 minutes. The supernatant was collected after centrifugation at 13,000 rpm for 30 minutes at 4°C to remove remaining suspended particles and debris. DNA from EVs was extracted using a DNA isolation kit according to standard protocols (PowerSoil DNA Isolation Kit, MO BIO, Carlsbad, CA, USA). The DNA of EVs in each sample was quantified using the QIAxpert system (QIAGEN, Hilden, Germany).

1.3. 미생물 메타제노믹 분석 (Microbial Metagenomic Analysis)1.3. Microbial Metagenomic Analysis

16S rDNA 유전자 기반 메타 게놈 분석을 위해 박테리아 게놈 DNA를 상기 16S rDNA 유전자의 V3-V4 초가변 영역 (hypervariable regions)에 특이적인 프라이머인 16S_V3_f (5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3', 서열번호 1) 및 16S_V4_r (5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAG ACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3', 서열번호 2)를 이용하여 증폭시켰다.For 16S rDNA gene-based metagenome analysis, bacterial genomic DNA was subjected to primers specific for the V3-V4 hypervariable regions of the 16S rDNA gene, 16S_V3_f (5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3', SEQ ID NO: 1) and 16S_V4_r ( It was amplified using 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAG ACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3', SEQ ID NO: 2).

라이브러리는 MiSeq 시스템 가이드 (Illumina, San Diego, CA, USA)에 따라 PCR 제품을 사용하여 준비하고, QIAxpert (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정량화하였다. 그런 다음 각 앰플리콘을 정량화하고 제조업체의 권장 사항에 따라 MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA)에서 등몰 비율 (equimolar ratio)을 설정하고, 풀링 및 시퀀싱하였다.Libraries were prepared using PCR products according to the MiSeq system guide (Illumina, San Diego, CA, USA) and quantified using QIAxpert (QIAGEN, Hilden, Germany). Each amplicon was then quantified, set to equimolar ratio, pooled, and sequenced on a MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) according to the manufacturer's recommendations.

1.4. 마이크로바이오타에서 미생물 구성 분석 (Analysis of Microbial Composition in the Microbiota)1.4. Analysis of Microbial Composition in the Microbiota

어댑터 서열 (adapter sequences)과 일치하는 Paired-end reads는 Cutadapt (버전 1.1.6)에 의해 트리밍하였다 (trimmed). Paired-end reads를 포함하는 결과 FASTQ 파일은 CASPER와 병합된 다음 Bokulich가 설명하는 Phred (Q) 점수 기반 기준으로 품질 필터링하였다. 병합 후 300bp보다 짧은 reads를 제거하였다. 키메라 서열을 확인하기 위해 Greengenes 데이터베이스에 대해 VSEARCH를 사용하여 참조 기반 키메라 검출 단계를 수행하였다.Paired-end reads matching adapter sequences were trimmed by Cutadapt (version 1.1.6). The resulting FASTQ files containing paired-end reads were merged with CASPER and then quality filtered using the Phred (Q) score-based criteria described by Bokulich. After merging, reads shorter than 300bp were removed. To identify chimeric sequences, a reference-based chimera detection step was performed using VSEARCH against the Greengenes database.

다음으로, 서열 reads는 97 % 서열 유사성의 임계값(threshold) 하에서, de novo 클러스터링 알고리즘이 있는 CD-HIT를 사용하여 OTU (operational taxonomic unit)로 클러스터링하였다.Next, sequence reads were clustered into operational taxonomic units (OTUs) using CD-HIT with a de novo clustering algorithm, under a threshold of 97% sequence similarity.

OTU의 대표 서열은 최종적으로 UCLUST (기본 매개 변수 아래 QIIME (버전 1.9.1)의 parallel_assign_taxonomy_uclust.py 스크립트)와 함께 Greengenes 데이터베이스 (버전 13.8)를 사용하여 분류하였다. 개인별 분류군의 풍부함을 추정하는 Chao 지수는 각 표본의 다양성을 측정하기 위해 추정하였다.Representative sequences of OTUs were finally classified using the Greengenes database (version 13.8) with UCLUST (parallel_assign_taxonomy_uclust.py script in QIIME (version 1.9.1) under default parameters). The Chao index, which estimates the abundance of individual taxa, was estimated to measure the diversity of each sample.

1.5. 난소암(OC) 진달 모델 개발1.5. Development of the Jindal model for ovarian cancer (OC)

OC에 대한 진단 모델을 구성하고 검증하기 위해 총 242 개 샘플에서 OC와 양성 난소 종양의 비율을 고려하여 각 그룹의 샘플을 2 : 1의 비율로 트레이닝 세트 및 테스트 세트로 무작위로 나누었다. 각 트레이닝 세트 및 테스트 세트의 값은 중앙 로그 비율로 변환하였다. 마이크로 바이옴 바이오 마커의 발견과 진단 모델의 구축은 트레이닝 세트 (n = 161)에서 수행되었으며, 새로 개발된 진단 모델의 검증은 테스트 세트 (n = 81)에서 수행하였다.To construct and validate the diagnostic model for OC, samples from each group were randomly divided into training set and test set at a ratio of 2:1, considering the ratio of OC and benign ovarian tumors in a total of 242 samples. The values of each training set and test set were converted to a median log ratio. Discovery of microbiome biomarkers and construction of diagnostic models were performed on the training set (n = 161), and validation of the newly developed diagnostic model was performed on the test set (n = 81).

제로 비율이 99 % 이상이면 속 (genus)을 필터링하였다. OC와 양성 난소 종양 그룹간에 차별적으로 분포된 특정 마이크로 바이옴 바이오마커를 식별하기 위해 필터링된 카운트 데이터와 함께 널리 사용되는 8 가지 통계 방법 (Wilcoxon, Metastats, EdgeR, DESeq2, ZIG, ZIBSeq, ANCOM 및 CLR Perm)을 사용하여 메타 유전체 분석을 수행하였다.If the zero rate was greater than 99%, the genus was filtered. Eight widely used statistical methods (Wilcoxon, Metastats, EdgeR, DESeq2, ZIG, ZIBSeq, ANCOM, and CLR) with filtered count data to identify specific microbiome biomarkers differentially distributed between OC and benign ovarian tumor groups. Meta-genome analysis was performed using Perm.

풍부한 데이터를 기반으로 알고리즘이 개발되었기 때문에 풍부한 OTU를 사용하였다. 각 통계 방법에 의해 식별된 중요한 마이크로 바이옴 바이오마커 목록을 비교하여 각 방법이 다른 마이크로 바이옴 바이오마커 목록을 제공하고 대부분의 중복된 바이오마커가 매우 그럴듯한 바이오마커일 것으로 예상되기 때문에 가능한 한 겹치는 바이오마커를 선택하였다.Because the algorithm was developed based on abundant data, abundant OTUs were used. We compared the list of significant microbiome biomarkers identified by each statistical method to determine the extent to which overlapping biomarkers were possible, since each method provides a different list of microbiome biomarkers and most overlapping biomarkers are expected to be highly plausible biomarkers. A marker has been selected.

우리는 마이크로 바이옴 바이오마커를 환자 나이 및 혈액 CA-125 수치와 결합하여 양성 난소 종양에서 OC를 식별하는 여러 진단 모델을 구성했으며, 이러한 모델은 테스트 세트에서 검증하였다. 개발된 모델의 진단 성능을 평가하기 위해 각 모델의 민감도, 특이성 및 AUC를 계산하였다.We combined microbiome biomarkers with patient age and blood CA-125 levels to construct several diagnostic models to identify OC in benign ovarian tumors, and these models were validated on a test set. To evaluate the diagnostic performance of the developed models, the sensitivity, specificity, and AUC of each model were calculated.

1.6. 통계 분석1.6. statistical analysis

두 그룹 간의 임상 병리학적 특성의 차이를 평가하기 위해 통계 분석을 수행하였다. 연속 변수를 비교하는데 Student's t-test와 Mann-Whitney U 검정을 사용하였고, 범주형 변수를 비교하는데 Pearson의 카이 제곱 검정 (chi-square test)과 Fisher's exact test를 사용하였다. 섀넌 지수 (Shannon index)는 마이크로바이오타 (microbiota)의 α-다양성을 측정하기 위해 계산하였다.Statistical analysis was performed to evaluate differences in clinicopathological characteristics between the two groups. Student's t-test and Mann-Whitney U test were used to compare continuous variables, and Pearson's chi-square test and Fisher's exact test were used to compare categorical variables. The Shannon index was calculated to measure the α-diversity of microbiota.

메타 게놈 분석에 적용된 8 가지 통계 방법의 요약은 하기와 같다:A summary of the eight statistical methods applied to metagenome analysis is as follows:

(1) Wilcoxon rank sum test는 관측치에 순위 합계 (rank sum)를 사용하는 2-표본 t-검정의 비모수 (nonparametric) 유형이다.(1) The Wilcoxon rank sum test is a nonparametric type of 2-sample t-test that uses rank sum for observations.

(2) Metastats는 그룹 별 표본 (sample) 수와 분류군 (taxaons) 수를 비교한다. 분류군 수가 표본 수보다 클 때 Welch's t-test statistics를 적용하였다. 그렇지 않으면 Fisher's exact test를 사용하였다.(2) Metastats compares the number of samples per group and the number of taxaons. When the number of taxa was greater than the number of samples, Welch's t-test statistics were applied. Otherwise, Fisher's exact test was used.

(3) EdgeR 및 (4) DESeq2 방법은 일반적으로 RNA 서열 데이터 분석에 사용된다. 16S rDNA에서 메타 게놈 데이터를 추출함에 따라 이러한 방법의 적용이 자주 시도되고 있다. 두 방법 모두 음 이항 모델이다. 그러나 두 방법의 차이점은 EdgeR은 M-value 정규화의 수정된 평균 (a trimmed mean of M-values normalization)을 사용하는 반면, DESeq2는 상대적 로그 표현 정규화 (a relative log expression normalization)를 사용한다는 점이다.(3) EdgeR and (4) DESeq2 methods are commonly used for RNA sequence data analysis. Application of these methods is frequently attempted as metagenome data is extracted from 16S rDNA. Both methods are negative binomial models. However, the difference between the two methods is that EdgeR uses a trimmed mean of M-values normalization, while DESeq2 uses a relative log expression normalization.

(5) ZIG는 OTU 테이블의 희소성을 고려하여 분류군 수에 로그 정규 혼합 모델을 사용한다. 높은 허위 양성률 (false-positive rates)을 극복하기 위해 모수 추정치의 실험적 베이즈 축소 (empirical Bayes shrinkage of parameter estimates)를 채택하였다.(5) ZIG uses a lognormal mixture model for the number of taxa considering the sparsity of the OTU table. To overcome high false-positive rates, experimental Bayes shrinkage of parameter estimates was adopted.

(6) ZIBSeq는 상대 존재비를 위해 베타 혼합 모델을 사용한다. 총합 스케일링 정규화 후 상대 존재비는 많은 수의 0과 왜곡 된 분포의 결과로 인해 수행되었다.(6) ZIBSeq uses a beta mixing model for relative abundance. Relative abundance after sum scaling normalization was performed due to the large number of zeros and resulting in a skewed distribution.

(7) ANCOM은 OTU의 상대 존재비를 비교하는 데 사용되었으며, 모든 쌍별 분류군의 로그 비율 변환 후 두 그룹의 비교에 Wilcoxon rank sum test가 사용되었다. Kruskal-Wallis test는 세 그룹의 비교에 사용되었으며 Freidman test는 반복 데이터 비교에 사용되었다.(7) ANCOM was used to compare the relative abundance of OTUs, and the Wilcoxon rank sum test was used for comparison of two groups after log-ratio transformation of all pairwise taxa. The Kruskal-Wallis test was used for comparison of three groups, and the Freidman test was used for comparison of repeated data.

(8) CLR Perm은 계수 데이터를 사용하여 중앙 로그 비율 변환 (the centered log-ratio transformation) 후 로지스틱 모델 (logistic model)을 맞추어 합 (sum)을 상대 존재비의 하나의 제약으로 완화한다. 허위 발견률 (the false discovery rate, FDR)을 줄이기 위해 permutation test를 채택하였다.(8) CLR Perm uses count data to fit a logistic model after the centered log-ratio transformation, thereby relaxing the sum into a single constraint of relative abundance. A permutation test was adopted to reduce the false discovery rate (FDR).

R 통계 소프트웨어 (버전 3.4.4; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria; ISBN 3-900051-07-0; http://www.R-project.org)를 통계 분석에 사용하였다. 0.05 미만의 양쪽(two-sided) p-value는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.R statistical software (version 3.4.4; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria; ISBN 3-900051-07-0; http://www.R-project.org) was used for statistical analysis. A two-sided p-value of less than 0.05 was considered statistically significant.

2. 결과2. Results

2.1. 연구 모집단의 특성2.1. Characteristics of the study population

전체 연구 설계는 도 1과 같다. 하기 표 1은 모든 환자의 임상 병리학적 특성을 보여준다. OC 그룹의 환자는 양성 난소 종양 그룹의 환자보다 유의하게 나이가 많았지만 (OC 그룹 환자 평균: 53.6세 및 양성 난소 종양 그룹 평균: 49.4세; p = 0.041), 체질량 지수 (BMI), 폐경기 상태 및 동반 질환과 같은 다른 특성은 비슷했다. 환자를 트레이닝 세트 및 테스트 세트로 2 : 1 무작위로 분배한 후에도 OC 환자는 트레이닝 세트에서 양성 난소 종양이 있는 환자보다 여전히 나이가 많았지만 테스트 세트에서는 환자의 연령이 비슷했다. 트레이닝 세트 및 테스트 세트 모두에서 OC와 양성 난소 종양 그룹간에 BMI, 폐경기 상태 및 동반 질환에 차이가 관찰되지 않았다.The overall study design is shown in Figure 1. Table 1 below shows the clinicopathological characteristics of all patients. Patients in the OC group were significantly older than those in the benign ovarian tumor group (mean patient in OC group: 53.6 years and mean in benign ovarian tumor group: 49.4 years; p = 0.041), but had lower body mass index (BMI), menopausal status, and Other characteristics, such as comorbidities, were similar. Even after a 2:1 random distribution of patients into training and test sets, OC patients were still older than patients with benign ovarian tumors in the training set, whereas patients were similar in age in the test set. No differences in BMI, menopausal status, and comorbidities were observed between the OC and benign ovarian tumor groups in both the training and testing sets.

(BMI: 체질량 지수, CA-125: 암 항원 (Cancer antigen) 125, FIGO: 국제 부인과 및 산부인과 연맹 (International Federation of Gynecology and Obstetrics), SD: 표준 편차.)(BMI: Body Mass Index, CA-125: Cancer antigen 125, FIGO: International Federation of Gynecology and Obstetrics, SD: Standard deviation.)

트레이닝 세트에서 혈액 CA-125 수치는 OC 환자에서 유의하게 높았다 (OC 환자 그룹의 중앙값 (median: 331.1 IU / mL 및 양성 난소 종양 환자 그룹의 중앙값: 22.3 IU / mL; p <0.001). OC 환자 110 명 중 39 명 (35.5 %)과 71 명 (64.5 %)이 각각 국제 부인과 및 산부인과 연맹 (FIGO) I-II 및 III-IV 기 진단을 받았다. 가장 흔한 조직학적 유형은 고등급 장액성 암종 (high-grade serous carcinoma)으로 OC 환자의 54.5 %에서 관찰되었다. 양성 난소 종양이 있는 51 명의 환자 중 점액성 낭포종 (mucinous cystadenoma)이 47.1 %로 가장 흔한 병리 진단이었고, 장액성 낭포종 (serous cystadenoma)이 15.7 %로 그 뒤를 이었다.In the training set, blood CA-125 levels were significantly higher in OC patients (median: 331.1 IU/mL in the OC patient group and median: 22.3 IU/mL in the benign ovarian tumor patient group; p < 0.001) compared to 110 OC patients. Of these, 39 (35.5%) and 71 (64.5%) were diagnosed with International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) stages I-II and III-IV, respectively. The most common histologic type was high-grade serous carcinoma. -grade serous carcinoma) was observed in 54.5% of OC patients. Among 51 patients with benign ovarian tumors, mucinous cystadenoma was the most common pathological diagnosis at 47.1%, followed by serous cystadenoma. This was followed by 15.7%.

테스트 세트에서 OC 그룹은 양성 난소 종양 그룹에 비해 유의하게 더 높은 혈액 CA-125 수준을 나타냈다 (OC 그룹 환자의 중앙값: 432.3 IU / mL 및 양성 난소 종양 환자 그룹의 중앙값: 20.6 IU / mL; p <0.001). FIGO I-II 기 질환은 OC 환자의 41.1 %에서 관찰되었다. OC 및 양성 난소 종양 그룹에서 가장 흔한 조직학적 유형은 각각 고등급 장액성 암종 (high-grade serous carcinoma) 50.0 %와 장액성 낭포종 28.0 %이었다.In the test set, the OC group showed significantly higher blood CA-125 levels compared to the benign ovarian tumor group (median for patients in the OC group: 432.3 IU/mL and median for patients in the benign ovarian tumor group: 20.6 IU/mL; p < 0.001). FIGO stage I-II disease was observed in 41.1% of OC patients. The most common histological types in the OC and benign ovarian tumor groups were high-grade serous carcinoma (50.0%) and serous cystoma (28.0%), respectively.

2.2. 두 그룹 간의 메타제노믹 프로필(Metagenomic Profiles) 비교2.2. Comparison of Metagenomic Profiles between the Two Groups

도 2는 모든 환자의 메타제노믹 프로필을 나타낸다. 도 2 (A)는 OC 및 양성 난소 종양 그룹에서 검출된 모든 31 개의 문(Phylum-level)을 보여준다. 속 수준(Genus-level) 구성에서는 모든 환자에서 총 587 개의 속이 검출되었다. 그 중 적어도 두 가지 통계적 방법으로 식별된 110 개의 유의하게 다르게 분포된 속은 도 2 (B)에 상대 존재비를 보였다. 여기에서 아시네토박터 속은 OC 및 양성 난소 종양 그룹 모두에서 높은 상대 존재비를 나타냈다. 트레이닝 세트에서 난소암 환자 110 명 중 107 명 (97.3 %)이 아시네토박터를 앓고 있었고, 양성 난소 종양 환자 51 명 중 50 명 (98.0 %)이 아시네토박터를 앓고 있었다. 테스트 세트에서 아시네토박터는 각각 OC 및 양성 난소 종양 그룹의 98.2 % (55/56) 및 100.0 % (25/25)에서 발견되었다.Figure 2 shows the metagenomic profile of all patients. Figure 2(A) shows all 31 phylum-levels detected in the OC and benign ovarian tumor groups. In genus-level organization, a total of 587 genera were detected in all patients. Among them, 110 significantly differently distributed genera identified by at least two statistical methods showed their relative abundances in Figure 2(B). Here, the genus Acinetobacter showed high relative abundance in both OC and benign ovarian tumor groups. In the training set, 107 of 110 (97.3%) patients with ovarian cancer had Acinetobacter, and 50 of 51 (98.0%) patients with benign ovarian tumors had Acinetobacter. In the test set, Acinetobacter was found in 98.2% (55/56) and 100.0% (25/25) of the OC and benign ovarian tumor groups, respectively.

속 수준 α-다양성을 비교했을 때, Shannon 지수는 트레이닝 세트 (중앙값 (median): 3.294 vs. 3.263, p = 0.270)와 테스트 세트 (중앙값, 3.210 vs. 3.238; p = 0.810)로 나타났다 (도 3 참조).When comparing genus-level α-diversity, the Shannon index was significantly higher for the training set (median: 3.294 vs. 3.263, p = 0.270) and test set (median, 3.210 vs. 3.238; p = 0.810) (Figure 3). reference).

β-다양성을 비교하기 위해 다차원 플롯을 사용하여 속 수준에서 클러스터링을 분석하였다. 그러나 이러한 플롯은 훈련 및 테스트 세트에서 OC 그룹과 양성 난소 종양 그룹 간의 구별되는 클러스터링을 나타내지 않았다 (도 4 참조).Clustering was analyzed at the genus level using multidimensional plots to compare β-diversity. However, these plots did not reveal distinct clustering between the OC group and the benign ovarian tumor group in the training and testing sets (see Figure 4).

2.3. 트레이닝 세트에서 난소 암 진단 모델 개발2.3. Developing an ovarian cancer diagnostic model from a training set

다양한 통계적 방법을 사용한 메타제노믹 분석을 통해 OC 그룹과 양성 난소 종양 그룹간에 차이가 있는 속 수준의 마이크로 바이옴 바이오 마커를 통계적으로 유의미하게 식별하였다: Wilcoxon test, Metastats, EdgeR, DESeq2, zero-inflated Gaussian mix model (ZIG), zero-inflated beta regression (ZIBSeq), analysis of composition of microbiomes (ANCOM), centered log-ratio transformation 및 permutation logistic regression model (CLR Perm)은 각각 1, 98, 3, 8, 447, 56, 1 및 2 개의 바이오마커들이 FDR (≤0.05)을 사용하여 조정된 q 값으로 식별되었다. 표 2는 각 통계 방법에 의해 확인된 상위 10 개의 마이크로 바이옴 바이오마커를 중첩 순서로 나타낸다.Statistically significant genus-level microbiome biomarkers were identified that differed between the OC group and the benign ovarian tumor group through metagenomic analysis using various statistical methods: Wilcoxon test, Metastats, EdgeR, DESeq2, zero-inflated. Gaussian mix model (ZIG), zero-inflated beta regression (ZIBSeq), analysis of composition of microbiomes (ANCOM), centered log-ratio transformation, and permutation logistic regression model (CLR Perm) were 1, 98, 3, 8, and 447, respectively. , 56, 1 and 2 biomarkers were identified with adjusted q values using FDR (≤0.05). Table 2 presents the top 10 microbiome biomarkers identified by each statistical method, in order of overlap.

GeneGene WilcoxonWilcoxon MetastatsMetastats EdgeREdgeR DESeq2DESeq2 ZIGZIG ZIBSeqZIBSeq ANCOMANCOM CLR PermCLR Perm AcinetobacterAcinetobacter <0.001<0.001 0.0080.008 0.0930.093 0.0430.043 <0.001<0.001 <0.001<0.001 AcinetobacterAcinetobacter <0.001<0.001 IsoptericolaIsoptericola 0.8410.841 <0.001<0.001 0.4870.487 1One 0.0020.002 <0.001<0.001 Not detectedNot detected 0.8550.855 TerrisporobacterTerrisporobacter 0.8410.841 0.0230.023 0.6000.600 1One <0.001<0.001 <0.001<0.001 Not detectedNot detected 0.9440.944 SM1A02SM1A02 0.9890.989 0.0080.008 0.5280.528 1One <0.001<0.001 0.0020.002 Not detectedNot detected 0.9350.935 Candidatus AlysiosphaeraCandidatus Alysiosphaera 0.8410.841 <0.001<0.001 0.4760.476 1One 0.0050.005 <0.001<0.001 Not detectedNot detected 0.9010.901 RalstoniaRalstonia 0.8410.841 <0.001<0.001 0.4620.462 1One <0.001<0.001 0.0050.005 Not detectedNot detected 0.9130.913 HydrogenophagaHydrogenophaga 0.7710.771 <0.001<0.001 0.8720.872 1One <0.001<0.001 0.0270.027 Not detectedNot detected 0.8090.809 PseudorhodoferaxPseudorhodoferax 0.9210.921 0.0240.024 0.8110.811 1One <0.001<0.001 0.0070.007 Not detectedNot detected 0.7790.779 BryobacterBryobacter 0.8410.841 0.0230.023 0.4200.420 1One 0.0070.007 0.9990.999 Not detectedNot detected 0.8490.849 VaribaculumVaribaculum 0.8410.841 0.0130.013 0.6000.600 1One 0.5990.599 <0.001<0.001 Not detectedNot detected 0.4160.416

(표 2는 q 값으로 나타냄.)(Table 2 shows q value.)

다음으로, 8 가지 통계 방법 중 이러한 속 수준의 마이크로 바이옴 바이오마커의 중복을 조사하였다 (도 5 참조). 총 486 개의 바이오마커가 적어도 하나의 통계적 방법에 의해 유의하게 차별적으로 분포된 것으로 확인되었다. 이 중 110 개와 9 개 마커가 각각 적어도 2 개 및 3 개 통계 방법에서 겹쳐 나타났다. 아시네토박터는 7 가지 통계 분석 방법으로 겹쳐서 확인된 유일한 일반적인 속이었다. 특히, 아시네토박터는 양성 난소 종양 그룹 보다 OC 그룹에서 훨씬 더 풍부하게 나타났다 (중앙값 (interquartile range): 0.084 (0.037-0.222) vs. 0.033 (0.008-0.075); Wilcoxon rank sum test, p <0.001). 따라서 우리는 양성 난소 종양에서 OC를 구별하기 위해 아시네토박터를 가장 가능성이 높은 속 수준의 미생물 바이오마커로 선택하였다.Next, we examined the overlap of these genus-level microbiome biomarkers among eight statistical methods (see Figure 5). A total of 486 biomarkers were confirmed to be significantly differentially distributed by at least one statistical method. Of these, 110 and 9 markers overlapped in at least 2 and 3 statistical methods, respectively. Acinetobacter was the only common genus identified by overlapping seven statistical analysis methods. In particular, Acinetobacter was significantly more abundant in the OC group than in the benign ovarian tumor group (median (interquartile range): 0.084 (0.037-0.222) vs. 0.033 (0.008-0.075); Wilcoxon rank sum test, p <0.001) . Therefore, we selected Acinetobacter as the most likely genus-level microbial biomarker to distinguish OC from benign ovarian tumors.

아시네토박터의 상대 존재비와 환자의 임상 병리학적 변수를 결합하여 OC를 양성 난소 종양과 구별하기 위한 몇 가지 진단 모델을 구축하였다. 이에 대한 모델식과 그 가중치는 하기와 같다.By combining the relative abundance of Acinetobacter and patients' clinicopathological variables, several diagnostic models were constructed to distinguish OC from benign ovarian tumors. The model equation and its weights are as follows.

(1) 환자 나이 + 아시네토박터 상대 존재비(1) Patient age + Acinetobacter relative abundance

[수학식 4][Equation 4]

y = 0.0282 * 환자 나이 + 0.4757 * 아시네토박터 상대 존재비y = 0.0282 * patient age + 0.4757 * Acinetobacter relative abundance

2) 환자 나이 + 아시네토박터 상대 존재비 + CA-1252) Patient age + Acinetobacter relative abundance + CA-125

[수학식 5][Equation 5]

y = 0.0209 * 환자 나이 + 0.0043 * CA-125 + 0.5299 * 아시네토박터 상대 존재비y = 0.0209 * patient age + 0.0043 * CA-125 + 0.5299 * Acinetobacter relative abundance

3) 환자 나이 + CA-1253) Patient age + CA-125

[수학식 6][Equation 6]

y = 0.0225 * 환자 나이 + 0.003 * CA-125y = 0.0225 * patient age + 0.003 * CA-125

환자 나이, 혈액 CA-125 수치 및 아시네토박터의 상대 존재비로 구성된 모델 (상기 (2) 참조)은 86.4 % 민감도와 78.4 % 특이성을 나타냈다 (표 3 참조). 또한 상기 (2) 모델은 다른 모델보다 AUC가 0.898로 우수하였다.A model consisting of patient age, blood CA-125 level and relative abundance of Acinetobacter (see (2) above) gave 86.4% sensitivity and 78.4% specificity (see Table 3). In addition, model (2) above had an AUC of 0.898, which was superior to other models.

2.4. 난소 암 진단 모델 검증2.4. Validation of ovarian cancer diagnostic model

개발된 진단 모델은 테스트 세트에서 검증되었다. 다양한 모델 중 상기 (2) 모델인 환자 나이, 초기 혈액 CA-125 수치, 상대적인 아시네토박터 상대 존재비로 구성된 모델은 다음과 같이 양성 난소 종양과 OC를 구별하는데 가장 좋은 진단 성능을 나타냈다: 민감도 82.1 %; 특이도 68.0 %; 및 AUC 0.846 (표 3 및 도 6).The developed diagnostic model was validated on a test set. Among various models, model (2) above, which consists of patient age, initial blood CA-125 level, and relative Acinetobacter relative abundance, showed the best diagnostic performance in distinguishing OC from benign ovarian tumors as follows: sensitivity 82.1% ; Specificity 68.0%; and AUC 0.846 (Table 3 and Figure 6).

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Metagenomic biomarker for diagnosis of ovarian cancer <130> 20P11038 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55 <110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Metagenomic biomarker for diagnosis of ovarian cancer <130> 20P11038 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial primer <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (2)

대상체의 샘플에서 CA-125 수치를 측정하는 단계; 및
하기 수학식3에 따라 대상체가 난소암에 걸렸을 확률을 계산하는 단계;를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.
[수학식 3]
Y3 = X6 * 대상체 나이 + X7 * 샘플 CA-125 수치.
(X6은 수학식 3에서의 환자 나이에 대한 가중치, X7는 수학식 3에서의 샘플 CA-125에 대한 가중치이며, 상기 X6과 X7의 합은 0 내지 1 사이이다.)
measuring CA-125 levels in a sample from the subject; and
A method of providing information for diagnosing ovarian cancer, including calculating the probability that the subject has ovarian cancer according to Equation 3 below.
[Equation 3]
Y3 = X6 * subject age + X7 * sample CA-125 level.
(X6 is the weight for patient age in Equation 3, X7 is the weight for sample CA-125 in Equation 3, and the sum of X6 and X7 is between 0 and 1.)
청구항 1에 있어서, 상기 X6은 0.010 내지 0.035, 상기 X7는 0.002 내지 0.005인, 난소암 진단을 위한 정보제공 방법.The method of claim 1, wherein X6 is 0.010 to 0.035 and X7 is 0.002 to 0.005.
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