KR20230149299A - 초점 간질 및 신경병성 통증 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 조작된 리간드 개폐 이온 채널 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신경병성 통증 또는 초점 간질을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 신경병증성 통증 또는 초점 간질과 관련된 뉴런을 형질도입하는데 적합한 AAV 캡시드 폴리펩타이드 및/또는 핵산이 추가로 제공된다. 본 발명은 신경병성 통증 또는 초점 간질 관리를 담당하는 뉴런에 대한 바람직한 형질도입 효율 및/또는 향성을 제공하는 특정 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터에 관한 것이다.

Description

초점 간질 및 신경병성 통증 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 조작된 리간드 개폐 이온 채널
본 발명은 초점 간질 및 신경병성 통증 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 조작된 리간드 개폐 이온 채널에 관한 것이다.
난치성 신경학적 질환은 종종 비정상적으로 작용하는 뉴런과 관련이 있다. 이러한 상태를 치료하기 위한 치료법을 개발하려는 시도는 질환과 관련된 다루기 쉬운 표적 단백질의 부족으로 인해 방해를 받았다.
만성 통증에 가장 흔히 사용되는 치료법은 오피오이드 진통제 및 비스테로이드성 소염진통제를 적용하는 것이지만, 이들 약물은 중독을 유발할 수 있고 약물 의존성, 내성, 호흡 억제, 진정작용, 인지기능 감퇴, 환각 및 기타 전신 부작용과 같은 부작용을 유발할 수 있다. 의약품의 광범위한 사용에도 불구하고, 통증 완화 효과에 대한 성공률은 현저히 낮다. 통증 치료를 위한 보다 침습적인 옵션은 신경 차단 및 전기 자극을 포함한다. 통증 관리를 위한 가장 침습적이며 가장 덜 선호되는 방법은 통증을 유발하는 신경 또는 이의 부분을 완전히 외과적으로 제거하는 것이다.
초점 간질은 미국에서 2백만 명이 넘는 사람들에게 영향을 미치고 뇌의 특정 위치에서 시작되는 예측할 수 없는 발작을 특징으로 하는 만성적이고 쇠약하게 만드는 신경 장애이다. 재발성 발작은 인지 및 정서적 결함을 초래하며, 현재 개입은 제한된 효능과 여러 부작용을 제공한다. 초점 발작은 뉴런의 하위 집합에서 비정상적인 발화에서 비롯되지만 대부분의 항간질 약물은 전신 화합물 투여에 의존하고 뇌 전체 활동을 변경한다. 따라서, 간질 환자는 정상적인 인지에 관여하는 뉴런의 의도하지 않은 변조와 다른 생물학적 시스템의 바람직하지 않은 비표적 변화로 인해 상당한 부작용을 겪는다.
이상적인 통증 및 초점 간질 치료는 통증 및/또는 발작 생성을 담당하는 특정 뉴런의 활동만을 변경시킬 것이다. 따라서 통증 또는 초점 간질을 치료하기 위한 새로운 전략은 비정상적인 활동을 제어하기 위해 재조합 핵산에 의해 암호화된 이종 단백질을 뉴런의 하위 집단으로 전달하는 것이다. 예를 들어, 표적 뉴런은 특정 소분자 리간드에 매우 반응하지만 그렇지 않으면 비활성인 조작된 리간드 개폐 이온 채널(화학유전 수용체)을 암호화하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로 형질도입되어 조정 가능한 효능을 얻을 수 있다.
이러한 전략은 신경병성 통증, 특히 말초 신경병증 및 삼차 신경통을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 전자는 말초 신경계의 손상 또는 기능 장애로 인해 발생하는 일반적인 신경 장애이다. 무감각, 따끔거림, 통증이 특징이며 종종 손과 발에서 시작되지만 신체의 다른 부위에도 영향을 미칠 수 있다. 삼차신경을 보호하는 수초(myelin sheath)가 손상되어 발생하는 자살병이라고도 알려진 삼차신경통은 몇 초에서 몇 분까지 지속될 수 있는 극단적이고 산발적인 쇼크 같은 안면 통증을 유발한다. 현재의 약리학적 및 외과적 접근 방식은 심각한 부작용이 있는 반면 중독에 대한 완화 및 가능성은 거의 제공하지 않는다. 후근 신경절(DRG) 및 삼차 신경절(TGG)은 통증 전달 과정에서 활성 구조이기 때문에 조작된 화학유전학 수용체는 AAV 매개 유전자 전달에 의해 DRG 및 TGG의 뉴런에서 발현될 수 있다.
이 전략의 한 가지 고려사항은 뉴런의 표적 집단(예를 들어, DRG 및 TGG 또는 해마에서)에 대한 AAV 벡터의 형질도입 효율 및 방향성이다. AAV 벡터를 사용하여 뉴런의 특정 하위 집단을 효과적으로 형질도입하는 안전하고 효율적인 전략이 당업계에 필요하다.
이 전략의 또 다른 고려사항은 뉴런 활성을 제어하기 위한 이종 단백질의 선택이다. 최근, 발작 활동을 변경하기 위해 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체(DREADD)는 동물 간질 모델에서 유망한 결과를 낳았다. 그러나, 억제성 DREADD는 2차 전령을 통해 이온 채널을 간접적으로 활성화하는 G 단백질 결합 수용체에 의존하며 일관되지 않게 뉴런 전위를 변경할 수 있다. 말초 신경병증 및 삼차 신경통과 같은 신경병성 통증의 치료를 위해 또는 초점 간질 치료에서 신경 활성을 제어하기 위해(예를 들어, DRG 및 TGG에서) 대체 단백질(조작된 리간드 개폐 이온 채널)에 대한 당업계의 요구가 있다.
본 발명은 이러한 AAV 벡터, 조작된 리간드 개폐 이온 채널 등을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경병성 통증을 치료하는 방법을 제공하며, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하고, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 신경병성 통증은 말초 신경병증이다. 일부 실시태양에서, 신경병성 통증은 삼차신경통이다.
한 양태에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입한다. 일부 실시태양에서, 신경계 질환 또는 장애는 신경병성 통증, 경직, 척수 손상 또는 견열 손상이다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9에 따른 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV9-TV 벡터이다.
한 양태에서, 본 발명은 뉴런을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여 뉴런을 형질도입하는 방법을 제공하며, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 방법은 시험관 내에서 뉴런을 형질도입한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 생체 내 뉴런을 형질도입한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 이종 핵산을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 뉴런을 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 이종 핵산을 뉴런에 전달하는 방법을 제공하며, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런이다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 시험관 내에서 iPSC 유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터이다. 일부 실시태양에서, 방법은 시험관 내에서 iPSC 유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF, 또는 AAV-PHP.S 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV9-TV 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV5 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV2.5-TV2YF 벡터이다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 및 5-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5-7 및 9 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492에 상응하는 위치에서 비-트레오닌 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 비-트레오닌 돌연변이는 발린, 아이소류신 또는 류신 치환이다. 일부 실시태양에서, 비-트레오닌 돌연변이는 발린 치환이다.
일부 실시태양에서, 뉴런은 후근 신경절 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 삼차 신경절 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 아이소렉틴 B4(IB4) 양성 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 NF200 양성 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 CGRP 양성 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 C 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 Aδ 섬유를 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 투여된다.
한 양태에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법을 제공하며, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하고, 뉴런은 해마 뉴런이다.
한 양태에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, AAV 벡터는 대상에서 해마 뉴런을 형질도입한다. 일부 실시태양에서, 신경계 질환 또는 장애는 초점 간질, 정신분열증, 자폐 스펙트럼 장애, 알츠하이머병, 레트 증후군 또는 취약 X 증후군이다.
한 양태에서, 본 발명은 뉴런을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여 뉴런을 형질도입하는 방법을 제공하며, 뉴런은 해마 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 방법은 시험관 내에서 뉴런을 형질도입한다. 일부 실시태양에서, 방법은 생체 내 뉴런을 형질도입한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 이종 핵산을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 뉴런을 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 이종 핵산을 뉴런에 전달하는 방법을 제공하며, 뉴런은 해마 뉴런이다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터이다. 일부 실시태양에서, 방법은 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF, 또는 AAV-PHP.S 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV9 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV9-TV 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV5 벡터이다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함한다.
청구항 30 내지 40 중 어느 한 항의 방법에서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 및 5-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 6-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 뉴런은 흥분성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 CAMK2 양성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 억제성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 GABAergic 뉴런이다.
일부 실시태양에서, 초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)이다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(수조) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여, 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 해마에서 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여된다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 개폐 이온 채널은 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유래된 리간드 결합 도메인 및 인간 글리신 수용체로부터 유래된 이온 기공 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 23-220과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 잔기로부터 선택된 잔기에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 표 3에 열거된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33의 R101W, Y115E 및 Y210W에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101W 및 Y210V에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101M 및 L131F에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3이다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 255-457, SEQ ID NO: 27의 260-452, SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체에서 유래된 Cys-루프 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-172를 포함한다. 일부 실시태양에서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-180을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, β1-2 루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 81-84를 포함한다.
일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이고, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 AZD-0328, TC-6987, ABT-126, TC-5619, TC-6683, 바레니클린 및 파시니클린/RG3487로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 리간드는 TC-5619이다. 일부 실시태양에서, 리간드는 ABT-126이다.
일부 실시태양에서, 대상은 영장류이다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간이다. 일부 실시태양에서, 대상은 성인 인간이다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 제공한다:
(a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
(b) 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침.
일부 실시태양에서, 키트는 척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여를 통한 AAV 벡터의 투여를 위해 구성된 장치를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 장치는 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 신경절내(IG) 투여에 의해 투여하도록 구성된다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 제공한다:
(a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
(b) 해마 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침.
일부 실시태양에서, 키트는 두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(수조) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사를 통한 AAV 벡터의 투여를 위해 구성된 장치를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 장치는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의한 투여를 위해 구성된다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 이종 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키트는 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 TC-5619이다. 일부 실시태양에서, 리간드는 ABT-126이다.
한 양태에서, 본 발명은 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경병성 통증을 치료하는 방법을 제공하며, 이종 핵산은 대상의 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런에 전달되고, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 신경병성 통증은 말초 신경병증이다. 일부 실시태양에서, 신경병성 통증은 삼차 신경통이다.
한 양태에서, 본 발명은 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경계 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 신경계 질환 또는 장애는 신경병성 통증, 경직, 척수 손상 또는 견열 손상이다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산은 척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, 이종 핵산은 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 투여된다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산은 벡터 내에 포함된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입한다.
일부 실시태양에서, 뉴런은 아이소렉틴 B4(IB4) 양성 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 NF200 양성 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 CGRP 양성 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 C 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 Aδ 섬유를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법을 제공하며, 이종 핵산은 대상의 해마 뉴런에 전달되고, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이종 핵산은 대상의 해마 뉴런으로 전달되고, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 신경계 질환 또는 장애는 초첨 간질, 정신분열증, 자폐 스펙트럼 장애, 알츠하이머병, 레트 증후군 또는 취약 X 증후군이다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산은 두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(수조) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여, 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여된다. 일부 실시태양에서, 이종 핵산은 해마에서 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여된다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산은 벡터 내에 포함된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 해마 뉴런을 형질도입한다.
일부 실시태양에서, 뉴런은 흥분성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 CAMK2 양성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 억제성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 GABAergic 뉴런이다.
일부 실시태양에서, 초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)이다.
일부 실시태양에서, 리간드 개폐 이온 채널은 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유래된 리간드 결합 도메인 및 인간 글리신 수용체로부터 유래된 이온 기공 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 23-220과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 잔기로부터 선택된 잔기에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 표 3에 열거된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3이다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 255-457, SEQ ID NO: 27의 260-452, SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체에서 유래된 Cys-루프 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-172를 포함한다. 일부 실시태양에서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-180을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, β1-2 루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 81-84를 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이고, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법은 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 AZD-0328, TC-6987, ABT-126, TC-5619, TC-6683, 바레니클린 및 파시니클린/RG3487로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 리간드는 TC-5619이다. 일부 실시태양에서, 리간드는 ABT-126이다.
일부 실시태양에서, 대상은 영장류이다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간이다. 일부 실시태양에서, 대상은 성인 인간이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다.
도 1은 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 iPSC 유래 감각 전구체 뉴런에서의 GFP 발현의 세포 형광 이미지를 도시한다.
도 2는 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 iPSC 유래 감각 전구체 뉴런에서의 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 3은 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 iPSC 유래 감각 전구체 뉴런에서의 GFP 발현의 세포 형광 이미지를 도시한다.
도 4는 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 iPSC 유래 감각 전구체 뉴런에서의 GFP 단백질 발현 수준의 ELISA 결과를 도시한다.
도 5는 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 iPSC 유래 감각 전구체 뉴런에서 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 6은 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 DRG 조직에서의 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 7은 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 DRG 조직에서의 GFP 단백질 발현 수준의 ELISA 결과를 도시한다.
도 8은 AAV 벡터를 래트 DRG에 직접 주입한 후 AAV 캡시드의 향성을 분석하는 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다.
도 9는 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 DRG 조직의 면역형광 이미징 결과의 정량 분석을 도시한다.
도 10은 양성 GFP 염색을 갖는 래트 DRG에서 다양한 감각 뉴런의 백분율에 따라 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터의 향성을 나타내는 파이 차트를 보여준다.
도 11은 연구 V01220에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 비인간 영장류(NHP) DRG 조직에서의 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 12a는 연구 V01220에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 NHP DRG 조직에서의 GFP 단백질 발현 수준의 ELISA 결과를 도시한다. 도 12b는 연구 V01331에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 NHP DRG 조직에서의 GFP 단백질 발현 수준의 ELISA 결과를 도시한다.
도 13a는 연구 V01220에서 NHP DRG에 직접 주사한 후 표시된 AAV 캡시드의 향성을 분석하는 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 13b는 연구 V01220에서 NHP DRG에 직접 주사한 후 표시된 AAV 캡시드의 향성을 분석하는 확대된 면역형광 이미지를 도시한다. 도 13c는 연구 V01331에서 NHP DRG에 직접 주사한 후 표시된 AAV 캡시드의 향성을 분석하는 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다.
도 14는 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 E18(배아 18일) 래트 혼합 해마 배양물에서 GFP 발현의 세포 형광 이미지를 도시한다.
도 15는 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 E18 래트 혼합 해마 배양물에서 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 16은 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 E18 래트 혼합 해마 배양물에서 GFP 발현의 세포 형광 이미지를 도시한다.
도 17은 형질도입 후 5일째에 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 E18 래트 혼합 해마 배양물에서 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 18은 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 해마 조직에서 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다. 모든 데이터 포인트는 개별 동물의 왼쪽 또는 오른쪽 반구에 해당한다. 그룹의 각 동물은 고유한 색상으로 표시된다.
도 19는 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 해마 조직에서의 GFP 수준의 ELISA 결과를 도시한다. 모든 데이터 포인트는 개별 동물의 왼쪽 또는 오른쪽 반구에 해당한다. 그룹의 각 동물은 고유한 색상으로 표시된다.
도 20은 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 해마의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다.
도 21a-21b는 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 래트 해마의 반정량적 면역형광 분석을 왼쪽 및 오른쪽 반구를 통한 섹션별로 도시한다. 도 21a는 각각의 반구의 해마 섹션당 GFP 커버리지의 백분율을 보여준다. 도 21b는 각 해마에서 반구별로 양성 픽셀당 GFP 강도를 보여준다.
도 22a는 연구 V01220에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 비인간 영장류(NHP) 해마 조직에서 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다. 도 22b는 연구 V01331에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 비인간 영장류(NHP) 해마 조직에서의 GFP mRNA 수준의 ddPCR 평가를 도시한다.
도 23a는 연구 V01220에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 NHP 해마 조직에서의 GFP 단백질 발현 수준의 ELISA 결과를 도시한다. 도 23b는 연구 V01331에서 생체 내 직접 주사에 의해 표시된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 NHP 해마 조직에서의 GFP 단백질 발현 수준의 ELISA 결과를 도시한다.
도 24a는 연구 V01220에서 AAV9를 직접 주사한 마우스의 NHP 해마의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 24b는 연구 V01331에서 AAV5 또는 AAV9를 직접 주사한 마우스의 NHP 해마의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다.
도 25는 초기 주사 12주 후 AAV9-hSyn-CODA71-GFP(녹색)의 해마 발현을 나타내는 이미지를 포함한다. 뉴런 세포체는 NeuN(파란색)으로 표시된다.
도 26은 CODA71 또는 대조군 벡터로 형질도입되고 효현제 TC-5619로 처리된 CA1 뉴런의 활동 전위를 도시한다. 블랙 트레이스(하단)는 램프 테스트 프로토콜을 나타낸다.
도 27a는 효현제 TC-5619를 적용한 후 뉴런의 RMP(mV) 판독값(위쪽) 및 입력 저항(MΩ) 판독값(아래쪽)을 도시한다. 도 27b는 효현제 TC-5619를 적용한 후 뉴런의 레오베이스(pA) 판독값(상부) 및 AP 계수(% 기준선) 판독값(하부)을 도시한다. 도 27a 및 도 27b에서, 빨간색 선은 CODA71 벡터로 형질도입된 뉴런을 나타내고 파란색 선은 대조군(스크램블된) 벡터로 형질도입된 뉴런을 나타낸다.
도 28은 효현제 TC-5619는 붕가로톡신(BTX)의 존재하에 적용된 후 뉴런의 RMP(mV) 판독값(왼쪽 위), 입력 저항(MΩ) 판독값(오른쪽 위), 레오베이스(pA) 판독값(왼쪽 아래) 및 AP 계수(% 기준선) 판독값(오른쪽 아래)을 도시한다. 빨간색 선은 CODA71 벡터로 형질도입된 뉴런을 나타내고 파란색 선은 대조군(스크램블된) 벡터로 형질도입된 뉴런을 나타낸다.
도 29는 마우스에서의 수술 및 전기 자극 절차의 개략도를 도시한다.
도 30은 TC-5619 주사 후 45분에 CODA71 형질도입된 마우스에서 다양한 진폭으로 천공 경로 입력의 60Hz 자극에서 전기적으로 유발된 CA1 반응의 예를 도시한다.
도 31은 CODA71 벡터(파란색 선) 또는 스크램블된 대조군 벡터(빨간색 선)를 주사한 마우스에 대한 발작 역치 차트를 도시한다.
도 32는 마우스에서의 수술 및 기록 절차의 개략도를 도시한다.
도 33은 CA1에 일측성 카인산 주사 후 마우스에서 자발적 발작의 기록을 도시한다.
도 34a는 TC-5619 또는 비히클 투여 시 CODA71 벡터(빨간색 선) 또는 스크램블드 대조군 벡터(파란색 선)를 주사한 마우스의 발작 밀도 차트를 도시한다. 도 34b는 TC-5619 또는 비히클 대조군의 투여 시 CODA71 벡터 또는 스크램블드 대조군 벡터를 주사한 마우스의 발작 밀도 차트를 도시한다.
도 35는 TC-5619 또는 비히클 대조군으로 처리된 표시된 마우스의 발작 빈도 차트를 도시한다.
도 36은 TC-5619 또는 비히클 대조군으로 처리된 표시된 마우스의 발작 기간 차트를 도시한다.
본 발명의 세부사항은 하기 첨부된 설명에 기재되어 있다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다. 명세서 및 첨부된 청구항에서, 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형도 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명에 따른 실시태양은 이하에서 보다 완전하게 기술될 것이다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본 명세서에서 설명하는 실시태양에 한정되지 않는다. 오히려, 이들 실시태양은 본 발명을 더욱 충실하고 완전하게 하며, 당업자에게 본 발명의 범위를 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다. 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 모든 지정된 일부 실시태양, 특징 및 용어는 인용된 실시태양, 특징 또는 용어 및 이들의 생물학적 등가물을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시태양을 기술하기 위한 것이며 한정하려는 의도가 아니다.
본 방법 및 조성물을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 또는 조성물로 제한되지 않으며, 이들은 물론 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정의 실시태양을 기술하는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 범주는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명을 읽을 때 당업자에 의해 분명할 바와 같이, 본 명세서에 기술되고 도시된 개개 실시태양 각각은 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 다른 몇몇 실시태양 중 어느 것의 특징으로부터 용이하게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특징을 가진다. 임의의 열거된 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
정의
본 명세서 전체에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 분명하게 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩타이드 및 이의 동등물, 예를 들어, 당업자에게 공지된 폴리펩타이드에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서 전체에서, 용어 "및/또는"은 본 명세서에서 달리 표시되지 않는 한 "및" 또는 "또는"에 대해 사용된다.
본 발명 전체에서, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 변형, 예컨대 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹의 제외를 의미하지는 않는다. 추가로, 본 명세서 전채적으로 수치 범위의 언급은 이들 사이의 모든 정수 및 소수점을 포함한다.
본 발명 전체에서, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 어구 "로 필수적으로 이루어진"은 대상 발명의 기본적 및 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 구체화된 물질 또는 단계에 대해 기술된 조성물, 방법 또는 키트 범주의 제한을 의미한다. 예를 들어, 개시된 서열"로 필수적으로 이루어진" 폴리펩타이드는 개시된 서열의 아미노산 서열 + 또는 - 서열의 경계에서 열거된 결합 중인 아미노산 잔기보다 약 5개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 약 5개의 잔기, 4개의 잔기, 3개의 잔기, 2개의 잔기 또는 약 1개 미만의 잔기, 또는 열거된 결합 중인 아미노산 잔기보다 약 1개의 잔기, 2개의 잔기, 3개의 잔기, 4개의 잔기 또는 5개 초과의 잔기를 가진다.
문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 본 발명 전체에서, 어구 "이루어진"은 청구범위에 구체화되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분의 조성물, 방법 또는 키트로부터의 제외를 의미한다. 예를 들어, 개시된 서열"로 이루어진" 폴리펩타이드는 개시된 아미노산 서열만으로 이루어진다.
용어 "약" 및 "대략"은 동의어로서 사용된다. 약/대략과 함께 또는 이들 없이 본 명세서에서 사용되는 임의의 숫자는 적절한 기술에서 당업자에 의해 인식되는 임의의 정상적 변동을 아우르는 것을 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외), 언급된 기준 값의 방향 중 하나(초과 또는 미만)에서 10% 내에 속하는 값의 범위를 의미한다.
용어 "분리된"은 천연 상태에서 발견된 바와 같이 정상적으로 수반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 일부 실시태양에서, 용어 "얻어진"은 분리된과 동의어로 사용된다.
용어 "대상", "개체" 및 "환자"는 포유 동물과 같은 척추 동물을 의미하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 포유 동물은 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 양, 말, 인간이 아닌 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 침팬지) 또는 인간일 수 있다. 생체내에서 획득되거나 시험관 내에서 배양된 피험자의 조직, 세포 또는 이의 유도체도 포함된다. 인간 대상은 성인, 십대, 어린이(2세 내지 14세), 유아(1개월 내지 24개월) 또는 신생아(1개월 이하)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 성인은 약 65세 이상 또는 약 60세 이상의 노인이다.
용어 "샘플"은 분석이 실시되는 생물학적 물질의 용적 및/또는 질량을 의미한다. 일부 실시태양에서, 샘플은 조직 샘플, 세포 샘플, 유체 샘플 등을 포함한다. 일부 실시태양에서, 샘플은 대상(예를 들어, 인간 대상)로부터 취해지거나 대상에 의해 제공된다. 일부 실시태양에서, 샘플은 임의의 내부 기관, 암성, 전암성, 또는 비암성 종양, 뇌, 피부, 모발(뿌리를 포함), 눈, 근육, 골수, 연골, 백색 지방조직, 및/또는 갈색 지방조직으로부터 취한 조직의 일부를 포함한다. 일부 실시태양에서, 유체 샘플은 구강 상피세포 채취, 혈액, 제대혈, 타액, 정액, 소변, 복수액, 흉수, 수액, 폐 세척, 눈물, 땀 등을 포함한다. 당업자는, 일부 실시태양에서, "샘플"이 공급원(예를 들어, 대상)으로부터 직접적으로 얻어진다는 점에서 "1차 샘플"이라는 것을 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, "샘플"은, 예를 들어, 성분을 잠재적으로 오염시키는 어떤 것을 제거하기 위한, 특정 성분을 분리시키기 위한 그리고/또는 관심 대상의 특정 성분을 정제하기 위한, 1차 샘플의 가공 결과이다. 일부 실시태양에서, 샘플은 세포 또는 세포 집단(예를 들어, 뉴런 세포)이다. 세포 샘플은 대상로부터 직접적으로 유래될 수 있거나(예를 들어, 1차 샘플) 세포주일 수 있다. 세포주는 비포유류 세포(예를 들어, 곤충 세포, 효모 세포 및/또는 박테리아 세포) 또는 포유류 세포(예를 들어, 불멸 세포주)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "치료하는", "치료" 및 본 명세서에 사용된 문법적 동의어는 일반적으로 질환의 증상을 감소시키거나, 제거하거나, 예방하기 위한 조성물 또는 방법의 사용을 지칭하며, 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 달성하는 것을 포함한다. 치료적 이점은 치료 중인 장애 또는 병태의 진행을 늦추거나, 진행을 멈추거나, 진행을 반전시키거나, 증상의 근절 또는 개선을 의미한다. 치료의 예방적 이점은 병태 위험을 감소시키거나, 병태 진행을 늦추거나, 병태 발생 가능성을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 치료는 대상 및/또는 생리학적 결과에 영향을 미치는 세포의 집단에 조성물(예를 들어, AAV 벡터)을 전달하는 것을 의미한다. 일부 실시태양에서, 치료는 하나 이상의 질환 증상의 개선(예를 들어, 감소, 개선 또는 교정)을 초래한다. 개선은 관찰 가능한 또는 측정 가능한 개선일 수 있거나, 대상의 웰빙의 일반적 느낌의 개선일 수 있다. 질환 치료는 질환 증상 중증도의 감소를 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 치료는 질환 개시 전과 비슷한 수준으로 질환 증상 중증도의 감소를 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 치료는 질환 증상의 단기간(예를 들어, 일시적 또는 급성) 및/또는 장기간(예를 들어, 지속 또는 만성) 감소를 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 치료는 질환 증상의 관해를 의미할 수 있다. 일부 실시태양에서, 치료는 질환 발생을 예방하기 위해 특정 질환이 발생할 위험에 있는 대상의 예방적 치료를 의미할 수 있다. 질환 발생의 예방은 질환 증상의 완전한 예방, 질환 개시의 지연, 후속적으로 발생된 질환 증상 중증도의 감소 또는 질환 발생 가능성의 감소를 의미할 수 있다.
용어 "관리" 또는 "제어하는"은 특정 질환을 앓고 있는 개체에 대해 삶의 질을 개선시키기 위해 본 발명에서 고려된 조성물 또는 방법의 사용을 의미한다.
용어 "유효량"은 지시된 결과(예를 들어, 표적 뉴런을 형질도입하는 것)를 달성할 수 있는 양을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 생체 내 투여를 위한 유효량은, 예를 들어, 치료 목적을 위한 충분한 양의 표적 뉴런을 형질도입하는 것과 같은 바람직한 결과를 달성할 수 있는 용량을 지칭한다.
"치료적 유효량"은 목적하는 치료적 결과를 달성하는 데 필요한 조성물의 양이다. 치료적 유효량은, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 질환 상태 및 연령 및 대상의 체중에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 또한 치료적으로 유리한 효과가 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 큰 것이다. "치료적 유효량"은 대상을 치료하는 데 효과적인 조성물의 양을 포함한다.
"증가"는 기준 또는 대조군 수준에 비해 적어도 5%의 값의 증가(예를 들어, 증가된 형질도입 효율)를 의미한다. 예를 들어, 증가는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, 1000% 이상의 증가를 포함할 수 있다. 증가는 또한 기준 또는 대조군 수준보다 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배) 더 높은 증가를 의미한다.
"감소", "줄이다", "축소하다" 또는 이의 동의어는 기준 또는 대조군 수준에 비해 적어도 5%의 값의 감소(예를 들어, 감소된 형질도입 효율)를 의미한다. 예를 들어, 감소는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, 1000% 이상의 감소를 포함할 수 있다. 감소는 기준 또는 대조군 수준보다 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)인 감소를 의미한다.
용어 "기준" 또는 "대조군" 수준은 본 발명 전체에서 상호 호환적으로 사용되고, 본 발명의 조성물로 치료되지 않은 대상 또는 샘플, 또는 비히클 대조군으로 치료된 대상 또는 샘플에서 특정 생리학적 및/또는 치료적 효과의 값을 의미한다. 일부 실시태양에서, 기준 수준은 본 발명의 조성물의 투여 전에 대상 또는 샘플에서의 측정인 특정 생리학적 및/또는 치료적 효과의 값(예를 들어, 기준 수준)을 의미한다.
용어 "리간드"는 다른 더 큰 분자에 결합하는 분자를 의미한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 수용체에 결합한다. 일부 실시태양에서, 수용체에 대한 리간드의 결합은 수용체의 기능을 변경하여 그 기능을 활성화하거나 억제한다. 일부 실시태양에서, 리간드 개폐 이온 채널(LGIC)과 같은 수용체에 대한 리간드의 결합은 이온 채널의 개방 또는 폐쇄를 야기한다.
용어 "리간드"는 내인성 또는 천연 유래 리간드를 의미할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 리간드는 신경 전달 물질(예를 들어, λ-아미노뷰티르산(GABA), 아세틸콜린, 세로토닌 및 기타) 및 신호전달 중간체(예를 들어, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2)), 아미노산(예를 들어, 글리신) 또는 뉴클레오타이드(예를 들어, ATP)를 의미한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 비천연, 즉, 합성 또는 비자연적으로 생기는, 리간드(예를 들어, 결합제)를 의미할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 리간드는 소분자를 의미한다. 리간드 결합은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, 방사성 표지된 리간드와의 결합 검출). "수용체-리간드 결합" 및 "리간드 결합"은 본 발명 전체에서 상호교환적으로 사용되며 수용체(예를 들어, LGIC)와 리간드 사이의 물리적 상호작용을 의미한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 수용체의 신호 결합 부위와 리간드의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 발명 전체에서 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 수용체 및 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 의미한다. 분자의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수((Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본 발명에 기술된 것을 포함하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
용어 "야생형" 또는 "천연"은 당업자에 의해 이해되는 당업계의 용어이고 유기체, 변종, 유전자, 단백질, 또는 돌연변이 또는 변이체와 구별되는 자연에서 발생하는 특성의 전형적인 형태를 의미한다. 예를 들어, 야생형 단백질은 자연에서 발생하는 단백질의 전형적인 형태이다.
용어 "비천연", "변이체" 및 "돌연변이체"는 천연 또는 야생형, 조성물의 돌연변이체, 예를 들어, 천연 또는 야생형, 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 변이체 폴리펩타이드를 의미하기 위해 본 명세서 및 청구항 전체적으로 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 변형된 아미노산 폴리머; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 메틸화, 카복실화, 탈아미드화, 아세틸화 또는 표지 성분과의 접합을 포함한다.
아미노산 변형은 아미노산 치환, 아미노산 결실 및/또는 아미노산 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 대체(보존적 돌연변이, 보존적 치환 또는 보존적 변이라고도 함)는 주어진 아미노산을 유사한 생화학적 특성(예를 들어, 전하, 소수성 및 크기)을 가진 다른 아미노산으로 변경하는 단백질의 아미노산 대체이다. 본 발명 전체에 사용된 바와 같이, "보존적 변이"는 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 또 다른 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 보존적 변이의 예는 아이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 것으로의 치환; 또는 리신을 아르기닌으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 또는 아스파라긴을 글루타민으로 치환하는 것과 같이 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것 등이다. 보존적 치환의 다른 예시적인 예는 다음의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프랄린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 아이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 아이소류신으로; 라이신에서 아르기닌, 글루타민 또는 글루타메이트로; 메티오닌에서 류신 또는 아이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 발린에서 이소류신 또는 류신으로 등.
용어 "조작된"은 유도체화된 모 조성물 또는 단백질과 별개인 특성을 갖는 비천연 유래 조성물 또는 단백질을 의미하기 위해 본 명세서 및 청구항 전체에서 사용된다.
일반적으로, "서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 각각 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 의미한다. 전형적으로, 서열 동일성을 결정하기 위한 기법은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 것 및/또는 이에 의해 암호화된 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이들 서열을 제 2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 둘 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이들의 "동일성 백분율"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산이든 또는 아미노산 서열이든 두 서열의 동일성 백분율은 두 정렬된 서열 사이의 정확한 매칭의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 100을 곱한다. 동일성 백분율은 또한, 예를 들어, 미국 국립 보건원으로부터 이용 가능한 컴퓨터 프로그램 버전 2.2.9를 포함하는 어드밴스드 BLAST 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. BLAST 프로그램은 Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)] 및 Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)에서 논의되는 바와 같은 정렬 방법에 기반한다. 간략하게, BLAST 프로그램은 동일한 정렬된 기호(일반적으로 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 두 서열 중 더 짧은 기호의 총 수로 나눈 것으로서 동일성을 정한다. 프로그램은 비교 중인 단백질의 전체 길이에 걸쳐 동일성 백분율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 디폴트 파라미터는, 예를 들어, blastp 프로그램에 의해 더 짧은 질의 서열로 검색을 최적화하도록 제공된다. 프로그램은 또한 Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17:149-163 (1993)의 SEG 프로그램에 의해 결정되는 바와 같은 질의 서열의 마스크-오프 세그먼트에 대한 SEG 필터의 사용을 가능하게 한다. 서열 동일성의 목적하는 정도의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 개재된 정수 값이다. 전형적으로, 개시된 서열과 청구된 서열 사이의 동일성 백분율은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%이다.
본 발명 전체에 사용되는 바와 같은, "실질적으로 동일한"은 85% 이상, 예를 들어 90% 이상, 예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%인 서열 동일성을 갖는 것을 의미하되, 조성물의 활성은 서열 동일성의 차이를 초래하는 서열의 변형에 의해 변경되지 않는다.
본 발명 전체에 사용되는 바와 같이, "아미노산 돌연변이"는 상응하는 모 서열에 대한 아미노산 서열의 임의의 차이, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 지칭한다.
본 발명 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 하나 이상의 핵산 제어 서열을 의미한다. 프로모터는 TATA 요소와 같은 전사 시작 부위 근처의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 시스 작용 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 규제하에서 활성인 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제 2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 여기서 발현 제어 서열은 제 2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 발명 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터", "바이러스성 벡터" 또는 "유전자 전달 벡터"는 핵산 전달 비히클로 기능하고 핵산(예를 들어, AAV 발현 카세트) 비리온 내에 패키징된 핵산(예를 들어, AAV 발현 카세트)를 포함하는 바이러스 입자를 의미한다. 본 발명의 예시적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV), 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 벡터"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 폴리펩타이드 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드(AAV 벡터 게놈)를 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 이종 핵산(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 포유동물 세포로 전달될 이식유전자)을 포함할 수 있다. AAV 벡터는 종종 캡시드 폴리펩타이드의 명칭(혈청형)에 따라 명명된다. 예를 들어, AAV5 벡터는 AAV 벡터가 AAV5 캡시드 폴리펩타이드를 포함한다는 것을 나타낸다.
바이러스 역가에 대한 언급에서 사용되는 용어 "벡터 게놈 유닛", "게놈 유닛", "게놈 입자(gp)" 또는 "게놈 복제물"(gc)은 감염성 또는 작용성과 상관없이, 비리온에 캡슐화된 벡터 게놈의 수를 지칭한다. 특정 벡터 제제에서 게놈 입자의 수는 당업계에서 잘 이해되는 방법, 예를 들어, 게놈 DNA의 정량적 PCR, 또는 예를 들어, Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278의 방법에 의해 측정될 수 있다.
바이러스에 대한 언급에서 사용되는 용어 "감염 단위(infection unit: iu)," "감염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973에 기술된 바와 같은 복제 중심 분석으로서도 알려진 감염성 중심 분석에 의해 측정되는 바와 같은 감염성 및 복제-적격 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
"감염성" 비리온, 바이러스 또는 바이러스 입자는 바이러스 종에 대해 자극성인 세포로 전달가능한 폴리뉴클레오티드 성분을 포함하는 것이다. 이 용어는 반드시 바이러스의 복제 능력을 의미하지는 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는 표적 세포에 접근할 때, 표적 세포를 감염시킬 수 있고 표적 세포에서 이종 핵산을 발현할 수 있는 것이다. 따라서, "감염성"은 바이러스 입자가 표적 세포에 접근하고, 표적 세포에 들어가고, 표적 세포에서 이종 핵산을 발현하는 능력을 의미한다. 감염성은 시험관 내 감염성 또는 생체 내 감염성을 지칭할 수 있다. 바이러스 감염성은 전체 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비율로 표현될 수 있다.
바이러스 역가에 대한 언급에서 사용되는 용어 "형질도입 단위"(transducing unit: tu)"는, 예를 들어, Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; 또는 Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU assay)에 기술된 바와 같은 기능성 분석에서 측정되는 기능성 이식유전자 산물의 생성을 초래하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.　
세포에서 이종 핵산을 발현하는 바이러스 입자의 능력은 "형질도입"으로 지칭될 수 있다. 세포에서 이종 핵산을 발현하는 바이러스 입자의 능력은 GFP가 바이러스 입자로 감염된 세포에서 생산되고 검출 및/또는 측정되는 녹색 형광 단백질(GFP) 분석과 같은 마커 유전자(예를 들어, 바이러스가 뉴클레오타이드 GFP를 암호화하는 서열)의 평가; 또는 예를 들어 효소 면역 분석법(ELISA) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 생산된 단백질의 측정에 의한 생성된 단백질의 측정을 포함하는 여러 기술을 사용하여 분석될 수 있다.
용어 "향성(tropism)"은 하나 이상의 특정 세포 유형을 감염시키는 AAV 벡터의 능력을 지칭하지만, 벡터가 하나 이상의 특정 세포 유형에서 세포를 형질도입하기 위해 기능하는 방법을 또한 포함할 수 있다; 즉, 향성은 AAV 비리온의 특정 세포 또는 조직 유형(들)으로의 우선적인 진입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형으로의 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 우선적인 상호작용, 임의로 그리고 바람직하게는 이어지는 세포에서 AAV 비리온에 의해 운반되는 서열의 발현(예를 들어, 전사 및, 임의로 번역), 예를 들어 재조합 바이러스의 경우, 이종 뉴클레오타이드 서열(들)의 발현을 지칭한다.
용어 "향성 프로파일"은 본 명세서에 기술된 AAV 벡터에 의한 하나 이상의 표적 세포, 조직 및/또는 기관의 형질도입 패턴을 지칭한다.
달리 나타내지 않는 한, "효율적인 형질도입" 또는 "효율적인 향성" 또는 유사한 용어는 적합한 대조군(예를 들어, 대조군의 각각의 형질도입 또는 향성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% , 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175% 또는 200%)에 의해 결정될 수 있다. 적절한 대조군은 원하는 향성 프로파일을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 유사하게, 캡시드 및/또는 바이러스가 표적 조직 또는 유사한 용어에 대해 "효율적으로 형질도입하지 않는지" 또는 "효율적인 향성을 갖지 않는지"는 적합한 대조군을 참조하여 결정될 수 있다.
본 발명 전체에서 사용된 "뉴런 활성", "뉴런의 활성", "뉴런 발화" 및 이들의 변형 및 동의어는 뉴런의 자극 또는 여기로부터 발생하는 전기적 활성을 의미한다. 일부 실시태양에서, 뉴런 활성은 자동 또는 수동 패치 클램프 기술을 사용하여 측정된다. 일부 실시태양에서, 뉴런의 활성을 결정하는 것은 뉴런의 흥분성 시냅스후 전위(EPSP), 억제성 시냅스후 전위(IPSP) 및/또는 활동 전위를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 뉴런의 활성 수준은 흥분성 시냅스후 전위(EPSP), 억제성 시냅스후 전위(IPSP) 및/또는 활동 전위에 의존하거나 영향을 받는다.
본 발명 전체에서 사용된 "신경학적 질환" 또는 "신경학적 장애"는 신경계의 질환 또는 장애를 의미한다. 일부 실시태양에서, 신경학적 질환은 뇌, 척수, 신경 또는 신경계의 임의의 구성요소의 구조적, 생화학적 및/또는 전기적 이상과 관련되거나, 이에 의해 유발되거나, 또는 그 결과이다.
본 발명 전체에서 사용된 질환의 "징후"는 질환 상태를 나타내는 것으로 간주되는 신체적 또는 정신적 특징을 의미한다. 일부 실시태양에서, 징후는 질환의 객관적 표시이다. 일부 실시태양에서, 징후는 의사와 같은 환자 이외의 사람에 의해 객관적으로 평가, 검사, 관찰 또는 측정된다.
본 발명 전체에서 사용된 질환의 "증상"은 질환의 상태를 나타내는 것으로 간주되는 신체적 또는 정신적 특징, 특히 환자에게 명백한 이러한 특징을 의미한다. 일부 실시태양에서, 증상은 환자에 의해 주관적으로 평가된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 증상은 통증이며; 일부 실시태양에서, 증상은 간질이다.
아미노산의 위치와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, "상응하는" 또는 "상응한다"라는 용어는 제 1 폴리펩타이드 및 참조 폴리펩타이드 서열이 정렬될 때 참조 폴리펩타이드에서 주어진 아미노산과 정렬되는 제 1 폴리펩타이드 서열의 아미노산을 지칭한다. 정렬은 이러한 목적을 위해 설계된 소프트웨어, 예를 들어 해당 버전에 대한 기본 매개변수를 갖는 Clustal Omega 버전 1.2.4를 사용하여 당업자에 의해 수행된다.
개요
본 발명은 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하기 위한 특정 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 이러한 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런에 대해 향상된 형질도입 및/또는 향성을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 신경병성 통증을 치료하기 위해 DRG 및/또는 TGG 뉴런에 전달된다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 조작된 리간드 개폐 이온 채널(eLGIC) 수용체 또는 이의 키메라 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런에서 향상된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런에 대해 향상된 향성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 생체 내 인간 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 시험관 내에서 인간 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 체외에서 인간 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런의 증가된 형질도입을 나타낸다.
본 발명은 또한 해마 뉴런을 형질도입하기 위한 특정 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다. 이러한 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 해마 뉴런에 대해 향상된 형질도입 및/또는 향성을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 초점 간질을 치료하기 위해 해마 뉴런으로 전달된다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 조작된 리간드 개폐 이온 채널(eLGIC) 수용체 또는 이의 키메라 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 해마 뉴런에서 향상된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 해마 뉴런에 대해 향상된 향성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 생체 내 인간 해마 뉴런의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 시험관 내에서 인간 해마 뉴런의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 생체외 인간 해마 뉴런의 증가된 형질도입을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 기능적 AAV 캡시드의 일부이며, 상기 기능적 AAV 캡시드는 비 암호화 RNA, 단백질 암호화 서열, 발현 카세트, 다중 발현 카세트, 상동 재조합을 위한 서열, 유전자 표적화 서열 및 치료적 발현 카세트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를 패키징한다. 일부 실시태양에서, 기능성 AAV 캡시드는 조작된 LGIC 수용체 또는 이의 키메라 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를 패키징한다.
일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드는 AAV 벡터 내에 함유된다. 일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드는 게놈 표적화 카세트이다. 일부 실시태양에서, 발현 카세트는 CRISPR/CAS 발현 시스템이다. 일부 실시태양에서, 치료 발현 카세트는 치료 단백질 또는 항체를 암호화한다.
본 발명은 치료 요법, 백신 또는 연구 도구 개발 방식에서 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 대상에게 투여되는 총 핵산의 양을 감소시키기 위해 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 핵산이 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV를 사용하여 유사한 치료 효과를 얻을 때 상기 핵산이 이러한 AAV 벡터를 사용하여 형질도입될 때 상기 대상에게 투여되는 핵산의 양과 비교하여 더 적은 총 핵산량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 제공하며, 캡시드 폴리펩타이드는 대조군 캡시드 폴리펩타이드와 비교하여 AAV 벡터가 인간 후근 신경절 및/또는 삼차 신경절 뉴런에서 증가된 형질도입 및/또는 향성을 나타낼 수 있게 한다.
본 발명은 또한 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 말초 신경병증 및 삼차 신경통과 같은 신경병성 통증을 치료하는 방법을 제공하며, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널 또는 이의 키메라 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 제공하며, 캡시드 폴리펩타이드는 AAV 벡터가 대조군 캡시드 폴리펩타이드와 비교하여 인간 해마 뉴런에서 증가된 형질도입 및/또는 향성을 나타내도록 한다.
본 발명은 또한 이종 핵산의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 치료가 필요한 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법을 제공하며, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널 또는 이의 키메라 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터
파보바이러스과의 구성원인 아데노-연관 바이러스(AAV)는 약 4.7 킬로베이스(kb)의 단일 가닥 선형 DNA 게놈을 가진 작은 비외피형 정이십면체 바이러스이다. AAV는 바이러스가 정제된 아데노바이러스 스톡에서 오염물질로 발견되었기 때문에 디펜도바이러스 속으로 지정된다(D. M. Knipe, P. M. Howley, Field's Virology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, ed. Sixth, 2013). AAV는 자연적으로 복제 결함이 있기 때문에, 야생형 상태에서, AAV는 복제에 필요한 단백질 인자를 제공하기 위해 헬퍼 바이러스(일반적으로 아데노바이러스)에 의존한다. AAV의 4.7kb 게놈은 복제에 중요한 헤어핀 모양으로 접히는 2개의 역 말단 반복체(ITR)에 플랭킹된다. 자연적으로 복제 결함이 있고 인체의 거의 모든 세포 유형을 변환할 수 있는 AAV는 유전자 치료 또는 백신 전달에서 치료 용도로 이상적인 벡터를 나타낸다. 야생형 상태에서, AAV의 수명 주기는 감염 후 AAV 게놈이 숙주 염색체에 부위 특이적으로 통합되는 잠복기 및 아데노바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스 감염 후 통합 게놈이 이후 구조, 복제 및 감염성 바이러스에 패키징되는 감염 단계를 포함한다. 벡터화되면, AAV의 바이러스 Rep 및 Cap 유전자가 제거되고 바이러스 생산 중에 트랜스로 제공되어, ITR이 남아 있는 유일한 바이러스 DNA가 된다(A. Vasileva, R. Jessberger, Nature reviews. Microbiology, 3, 837-847(2005)). 그런 다음 Rep 및 Cap은 유전자 추가 또는 유전자 표적화를 수행하기 위해 가능한 전달 벡터 구성의 배열로 대체된다. 이러한 벡터화된 AAV는 분할 및 비분할 세포 모두를 형질도입하고 정지 조직에서 견고하고 안정적인 발현을 보여준다. 공개된 다양한 미국 출원은 미국 공개 번호 2015/0176027, 2015/0023924, 2014/0348794, 2014/0242031, 및 2012/0164106을 포함하는 AAV 벡터 및 비리온을 기술하며; 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
그러나, 다양한 조직 및 세포 유형을 형질도입하는 AAV 벡터의 인상적인 능력에도 불구하고, 형질도입 효율 및 바람직한 향성 측면에서 특정 뉴런 세포의 형질도입이 개선된 AAV 벡터에 대한 당업계의 요구가 남아있다. 또한, 투여 방법은 형질도입되는 세포의 위치, 양 및 유형에 영향을 미칠 수 있다. 한 번의 주사로 얼마나 많은 AAV를 전달할 수 있는지에 대한 물리적 제한이 있고 바람직한 결과(예를 들어, 치료 결과)는 대상에서 뉴런의 적절한 그룹의 활성을 자극하거나 억제하는 것과 관련되기 때문에 뉴런으로의 전달에는 높은 수준의 형질도입 및 적절한 향성이 필요하다.
본 발명은 생체 내, 시험관 내 및/또는 생체 외 대상에서 뉴런의 하위 집단의 상당히 개선된 형질도입을 입증하는 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 제공한다.
알려진 모든 AAV 혈청형의 게놈 구성은 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000개 뉴클레오타이드(nt) 미만인 선형 단일 가닥 DNA 분자이다. 역전 말단 반복체(ITR)는 비구조적 복제(Rep) 단백질과 구조적(VP) 단백질에 대한 고유한 암호화 뉴클레오타이드 서열을 플랭킹한다. VP 단백질(VP1, -2 및 -3)은 캡시드를 형성하고 바이러스의 향성에 기여한다. 말단 145nt ITR은 자기 상보적이며 T자형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 듀플렉스가 형성될 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 세포 DNA 폴리머라제 복합체의 프라이머 역할을 하는 바이러스 DNA 복제의 기점 역할을 한다. 포유동물 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후에 Rep 유전자가 발현되고 바이러스 게놈의 복제에서 기능한다.
일부 실시태양에서, 바이러스 벡터의 외부 단백질 "캡시드", 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10은 자연에서 발생한다. 일부 실시태양에서, 캡시드는 변경된 향성, 증가된 형질도입 효율 및/또는 면역 회피와 같은 자연에 존재하지 않는 특정한 독특한 특성을 갖도록 (예를 들어, 유도 진화 또는 합리적 설계를 통해) 합성적으로 조작된다. 합리적으로 설계된 캡시드의 예는 VP3 바이러스 캡시드 폴리펩타이드 상의 하나 이상의 표면 노출 티로신(Y), 세린(S), 트레오닌(T) 및 라이신(K) 잔기의 돌연변이이다.
AAV 벡터에서 사용될 수 있는 AAV ITR의 비제한적인 예는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16로부터의 ITR을 포함한다.
2개의 ITR을 포함하는 AAV 벡터는 약 4.4kB의 페이로드 용량을 갖는다. 자가-상보적 AAV(scAAV) 벡터는 제3의 ITR을 함유하고 벡터의 재조합 부분의 두 가닥을 패키징하여 본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드에 대해 약 2.1kB만 남긴다. 한 실시태양에서, AAV 벡터는 scAAV 벡터이다.
AAV의 패키징 용량(약 9kB)의 대략 두 배인 확장된 패키징 용량은 이중 AAV 벡터 전략을 사용하여 달성되었다. 본 명세서에서 고려되는 AAV 생성에 유용한 이중 벡터 전략은 스플라이싱(트랜스-스플라이싱), 동종 재조합(중첩) 또는 이 둘의 조합(하이브리드)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이중 AAV 트랜스-스플라이싱 전략에서, 스플라이스 도너(SD) 신호는 5'-반쪽 벡터의 3' 말단에 배치되고 스플라이스 수용체(SA) 신호는 3'-반쪽 벡터의 5' 말단에 배치된다. 이중 AAV 벡터와 두 반쪽의 역전 말단 반복체(ITR)-매개 머리-꼬리 연쇄동일화에 의해 동일한 세포가 동시 감염되면, 트랜스-스플라이싱은 성숙한 mRNA와 전체 크기 단백질의 생산을 초래한다(Yan et al., 2000). 트랜스-스플라이싱은 근육과 망막에서 큰 유전자를 발현하는 데 성공적으로 사용되었다(Reich et al., 2003; Lai et al., 2005). 대안적으로, 이중 AAV 벡터에 함유된 큰 이식유전자 발현 카세트의 두 반쪽은 상동 중첩 서열(5'-반쪽 벡터의 3' 말단 및 3'-반쪽 벡터의 5' 말단에서, 이중 AAV 중첩)을 함유할 수 있고, 이는 상동 재조합에 의해 단일 대형 게놈의 재구성을 매개할 것이다(Duan et al., 2001). 이 전략은 이식유전자 중첩 서열의 재조합 특성에 따라 달라진다(Ghosh et al., 2006). 세 번째 이중 AAV 전략(하이브리드)은 외인성 유전자(즉, 알칼리 포스파타제; Ghosh et al., 2008, Ghosh et al., 2011))의 높은 재조합 영역을 트랜스-스플라이싱 벡터에 추가하는 것을 기반으로 한다. 추가된 영역은 이중 AAV 간의 재조합을 증가시키기 위해 5'-반쪽 벡터에서 SD 신호의 하류와 3'-반쪽 벡터에서 SA 신호의 상류에 배치된다.
"하이브리드 AAV"는 상이한 AAV 혈청형(및 바람직하게는 하나 이상의 AAV ITR과 상이한 혈청형)의 캡시드로 포장된 AAV 게놈을 지칭하고, 그렇지 않으면 유사형 AAV로 지칭될 수 있다. 예를 들어, AAV 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 게놈은, AAV 캡시드 및 게놈(및 바람직하게는, 하나 이상의 AAV ITR)은 상이한 혈청형인 경우, AAV 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 캡시드 및 이의 변형 내에 캡슐화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 슈도타이핑된 AAV 입자는 유형 "x/y"로 언급될 수 있으며, 여기서 "x"는 ITR의 공급원을 나타내고 "y"는 캡시드의 혈청형을 나타내며, 예를 들어 2/5 AAV 입자는 AAV2의 ITR과 AAV5의 캡시드를 가진다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 형질감염, 감염 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 바이러스 생산 세포 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 생체 내 숙주 세포는 본 발명에서 고려되는 바이러스 벡터로 감염된다. 특정 실시태양에서, 용어 "표적 세포"는 숙주 세포와 상호교환적으로 사용되며 원하는 세포 유형의 감염된 세포를 의미한다.
고역가 AAV 제제는, 예를 들어, 미국 특허 5,658,776; 6,566,118; 6,989,264; 및 6,995,006; 미국 2006/0188484; WO98/22607; WO2005/072364; 및 WO/1999/011764; 및 Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003; Samulski et al., (1989) J. Virology 63, 3822 ; Xiao et al., (1998) J. Virology 72, 2224 ; lnoue et al., (1998) J. Virol. 72, 7024에 기술된 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 슈도타입 AAV 벡터를 생성하는 방법(예를 들어, WO 00/28004)뿐만 아니라 생체 내 투여 시 면역원성을 감소시키기 위한 AAV 벡터의 다양한 변형 또는 제형이 또한 보고되었다(예를 들어, WO 01/23001; WO 00/73316; WO 04/112727; WO 05/005610; WO 99/06562 참조).
일부 실시태양에서, AAV 캡시드 폴리펩타이드(또는 본 발명의 돌연변이체)를 포함하는 AAV 벡터는 대상에서 세포 또는 뉴런의 하위 집단에 대한 조작된 수용체의 표적화된 발현에 기여한다. 일부 실시태양에서, 뉴런은 통각수용체이다.
캡시드 폴리펩타이드
일부 실시태양에서, 본 발명은 상응하는 캡슐화된 AAV 벡터가 뉴런 세포의 적어도 하위 집단에 대해 향상된 형질도입 및/또는 향성을 달성할 수 있게 하는 캡시드 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명의 예시적인 캡시드 폴리펩타이드는 하기 표 1에 열거되어 있다:
예시적인 캡시드 폴리펩타이드
명칭 아미노산 서열 뉴클레오타이드 서열
AAV2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 13
AAV2.5 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 14
AAV2.5-TV SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 15
AAV2.5-2YF SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 16
AAV2.5-TV2YF SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 17
AAV5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 18
AAV6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 19
AAV9 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 20
AAV9-TV SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 21
AAV9-2YF SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 22
AAV9-TV2YF SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 23
AAV-PHP.S SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 24
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1에 따른 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2.5이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2에 따른 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2.5-TV이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 T492에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 T492에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3에 따른 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2.5-2YF이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 Y705 및/또는 Y731에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 Y705F 및/또는 Y731F에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 16에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2.5-TV2YF이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 T492, Y705 및/또는 Y731에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 T492V, Y705F 및/또는 Y731F에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함하고, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 F705 및/또는 F731에 해당하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함하고, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 17에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV5이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 6에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 6에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 6의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 18에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV6이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV9이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 20에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV9-TV이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492V에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 21에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV9-2YF이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 Y705 및/또는 Y731에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 Y705F 및/또는 Y731F에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 10의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 22에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV9-TV2YF이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492, Y705 및/또는 Y731에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492, Y705F 및/또는 Y731F에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11에 따른 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함하며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11의 V492에 상응하는 위치에 발린을 포함하며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 11의 F705 및/또는 F731에 상응하는 위치(들)에 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 23에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 AAV-PHP.S이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 12에 따른 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 12의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 24에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 8)의 T492, Y705 및/또는 Y731에 상응하는 하나 이상의 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하는 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 AAV는 캡시드 폴리펩타이드는 혈청형 AAV2, AAV2.5, AVV5, AAV6, AAV9, AAV-PHP.S 또는 다른 AAV 혈청형이다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 위치는 2개 이상의 위치, 2개의 위치 또는 3개의 위치이다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 AAV9 캡시드 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 8)의 T492V, Y705F 및/또는 Y731F 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 AAV 캡시드 폴리펩타이드는 혈청형 AAV2, AAV2.5, AVV5, AAV6, AAV9, AAV-PHP.S 또는 다른 AAV 혈청형이다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 2개 이상의 치환, 2개의 치환 또는 3개의 치환이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "T492, Y705 및/또는 Y731"은 예를 들어 T492+Y705, T492+Y731, T492+Y705+Y731, 또는 이들의 임의의 다른 가능한 조합을 지칭한다. 유사하게, "T492V, Y705F 및/또는 Y731F"는, 예를 들어, T492V+Y705F, T492V+Y731F, T492V+Y705F+Y731F 또는 이들의 임의의 다른 가능한 조합을 지칭한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 99.7% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 서열과 비교하여 돌연변이된(치환, 결실 및/또는 부가된) 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 치환은 T492V이다. 일부 실시태양에서, 치환은 T492I이다. 일부 실시태양에서, 치환은 T492L이다. 일부 실시태양에서, T492 잔기는 발린(Val), 류신(Leu) 및 아이소류신(Ile)으로부터 선택되는 소수성 아미노산으로 치환된다. 일부 실시태양에서, T492 잔기는 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 아이소류신(Ile), 프롤린(Pro), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met) 및 트립토판(Trp)으로부터 선택되는 소수성 아미노산으로 치환된다.
뉴런과 신경 섬유
일부 실시태양에서, 본 발명은 해마에 위치한 표적 뉴런, 즉 해마 뉴런을 형질도입하는 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 해마 뉴런은 흥분성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 해마 뉴런은 Ca2+/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 II(CaMKII) 양성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 해마 뉴런은 억제성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 해마 뉴런은 GABAergic 뉴런이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 후근 신경절(또는 척추 신경절; 후근 신경절로도 알려짐)에 위치하는 표적 뉴런을 형질도입하는 방법을 제공한다. 후근 신경절(DRG)은 척수 신경의 후근에 있는 뉴런(신경절)의 클러스터이다. 1차 뉴런으로 알려진 감각 뉴런의 세포체는 후근 신경절에 위치한다. 후근 신경절 뉴런의 축삭은 구심성으로 알려져 있다. 말초 신경계에서, 구심성은 감각 정보를 중추 신경계(즉, 뇌와 척수)로 전달하는 축삭을 지칭한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 삼차 신경절(또는 가세리안 신경절, 또는 반월 신경절, 또는 가세르 신경절)에 위치한 표적 뉴런을 형질도입하는 방법을 제공한다. 삼차 신경절(TGG)은 경막의 공동(Meckel's cave)을 차지하여, 측두골의 추체부 정점 부근의 삼차 신경절자국을 덮는 삼차 신경(CN V)의 감각 신경절이다.
축색돌기(신경 섬유로도 알려져 있음)는 일반적으로 신경 세포체로부터 떨어진 활동 전위로 알려진 전기 자극을 전도하는 척추동물의 신경 세포의 길고 가느다란 돌출부이다. 각 뉴런은 하나의 축삭만 가진다. 따라서 뉴런 세포는 축색돌기(신경 섬유)로 분류할 수 있다.
신경 섬유의 3가지 일반 클래스(그룹 A, B 및 C)는 데란저 및 가세르에 의해 분류된다. 그룹 A 신경 섬유는 많이 수초화되어 있고, 그룹 B 신경 섬유는 적당히 수초화되어 있고, 그룹 C 신경 섬유는 무수초화되어 있다.
그룹 A 신경 섬유(A 섬유)에는 알파(α), 베타(β), 감마(γ) 및 델타(δ)의 4개의 세분이 있다. 이러한 세분은 상이한 양의 수초화 및 축색 두께를 가지며 신호를 다른 속도로 전송한다. 유형 Aα 섬유는 대체 분류 시스템의 유형 Ia 및 유형 Ib 감각 섬유를 포함하며 각각 근방추 말단 및 골지 힘줄의 섬유이다. 유형 Aβ 섬유 및 유형 Aγ는 신장 수용체로부터의 유형 II 구심성 섬유이다. 피부의 Aβ형 섬유는 대부분 촉감에 사용된다. 유형 Aδ 섬유는 침해수용기의 구심성 섬유이다. Aδ 섬유는 말초 기계수용체와 열수용체에서 척수의 후각으로 정보를 전달한다. Aδ 섬유는 주로 급성 통증(예리하고 즉각적이며 상대적으로 짧은 지속)과 관련된 정보를 수신하고 전송하는 역할을 한다. 이러한 유형의 통증은 자극제: 온도 유도, 기계적 및 화학적의 여러 분류로 인해 발생할 수 있다. 이것은 움츠림 반응 활성화의 반사 아크에 있는 Aδ 섬유에 의해 시작된 움츠림 반사의 일부일 수 있다. Aδ 섬유는 냉, 압력 및 급성 통증 신호를 전달하며; 이들은 가늘고(직경 2-5μm) 수초화되어 있기 때문에, 무수초화 C 섬유보다 임펄스를 더 빠르게 보내지만 더 두꺼운 수초화 그룹 A 신경 섬유보다 더 느리기 때문이다. 이들의 전도 속도는 보통이다.
그룹 B 신경 섬유(B 섬유)는 축색돌기이며, 이는 적당히 수초화되어 있으며, 이는 그룹 A 신경 섬유보다 덜 수초화되고 그룹 C 신경 섬유보다 더 수초화됨을 의미한다. 이들은 일반적으로 자율신경계의 일반적인 내장 구심성 섬유 및 신경절이전 신경 섬유이다.
그룹 C 신경 섬유(C 섬유)는 수초화되지 않고 작은 직경과 낮은 전도 속도를 가진다. 그룹 C 섬유는 자율 신경계(ANS)의 신경절후 섬유와 후근(IV 섬유)의 신경 섬유를 포함한다. 이 섬유는 감각 정보를 전달한다. 이러한 신경 섬유의 손상 또는 부상은 신경병성 통증을 유발한다.
성숙한 통각수용기의 말초 말단은 자극이 감지되고 전기 에너지로 변환되는 곳이다. 전기 에너지가 임계값에 도달하면, 활동 전위가 유도되어 중추신경계(CNS)로 이동한다. 이것이 통증에 대한 의식적인 인식을 허용하는 일련의 사건으로 이어진다. 통각수용기의 감각 특이성은 자극의 특정 특징에 대해서만 높은 역치에 의해 설정된다. 화학적, 열적 또는 기계적 환경에 의해 높은 임계값에 도달한 경우에만 통각 수용기가 자극된다. 통각수용기의 대부분은 이들이 반응하는 환경 양식에 따라 분류된다. 일부 통각수용기는 이러한 양식 중 하나 이상에 반응하고 결과적으로 다양식으로 지정된다. 다른 통각수용기는 이러한 양식 중 어느 것도 반응하지 않으며(비록 염증 조건하에서 자극에 반응할 수 있음) 수면 또는 침묵이라고 한다.
통각수용기는 2가지 상이한 유형의 축삭을 갖는다. 첫 번째는 Aδ 섬유 축삭이다. 이들은 수초화되어 활동 전위가 CNS를 향해 초당 약 20미터의 속도로 이동하도록 할 수 있다. 다른 유형은 더 느리게 전도하는 C 섬유 축삭이다. 이들은 약 2미터/초의 속도에서만 작동한다. 이것은 축삭의 약한 수초화 또는 비수초화 때문이다. 결과적으로 통증은 두 단계로 나타난다. 첫 번째 단계는 빠르게 전도되는 Aδ 섬유에 의해 매개되고 두 번째 부분은 (다양식) C 섬유로 인해 매개된다. Aδ 섬유와 관련된 통증은 초기의 극도로 예리한 통증과 관련될 수 있다. 두 번째 단계는 급성 손상의 결과로 더 오래 지속되고 약간 덜 강렬한 통증이다. C 섬유에 대규모 또는 장기간 입력이 있는 경우, 척수 후각에 점진적인 축적이 있으며; 이 현상은 근육의 파상풍과 유사하지만 와인드업(wind-up)이라고 한다. 와인드업이 발생하면 통증에 대한 민감도가 증가할 가능성이 있다.
상이한 부류의 신경 섬유는 뉴로필라멘트 200(NF200은 신경필라멘트 중질 폴리펩타이드로도 알려짐), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 및 아이소렉틴 B4(IB4)와 같은 바이오마커에 의해 구별될 수 있다. Aα 및 Aβ 섬유는 일반적으로 NF200 양성이지만 IB4 음성이다. Aδ 섬유는 일반적으로 NF200과 IB4 모두에 대해 양성이다. C 섬유는 일반적으로 IB4 양성이지만 NF200 음성이다. 따라서, NF200+ 뉴런은 대부분 심하게 수초화된 Aα 또는 적당히 수초화된 Aβ 섬유를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 뉴런은 가벼운 터치 및 고유 수용에 대한 신호를 중재한다. 그러나 일부 NF200+ 뉴런은 통각에 대한 신호를 중재할 수도 있다. IB4+ 뉴런은 대부분 통각수용을 위한 무수초 C 섬유 또는 Aδ 섬유를 포함한다. 그리고 CGRP+ 뉴런은 대부분 통각수용을 위한 무수초 C 섬유 또는 약간 수초 Aδ 섬유를 포함한다.
캡시드 폴리펩타이드의 특성
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 하나 이상의 뉴런에서 증가된 형질도입 및/또는 향성을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 대조군 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2 캡시드 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 1)이다. 일부 실시태양에서, 대조군 캡시드 폴리펩타이드는 AAV2.5 캡시드 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)이다. 일부 실시태양에서, 대조군 캡시드 폴리펩타이드는 AAV9 캡시드 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 8)이다. 일부 실시태양에서, 대조군 캡시드 폴리펩타이드는 AAV5 캡시드 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 6)이다. 당업자는, 예를 들어, 본 발명의 실시예 섹션에 예시된 바와 같이 연구에서 적절한 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 쉽게 인식할 것이다.
형질도입/향성은, 본 발명의 예시적 섹션에 기술된 것들을 포함하는, 예를 들어, ELISA, ddPCR 및/또는 면역형광 분석을 포함하는 당업계에 공지된 기술뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 하나 이상의 표적 뉴런에서 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 형질도입은 모든 범위와 그 사이의 하위 범위를 포함하는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 7배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 70배 또는 약 100배 증가된다. 일부 실시태양에서, 형질도입은 모든 범위와 그 사이의 하위 범위를 포함하는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 70배, 또는 적어도 100배 증가된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터는 대조군 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 하나 이상의 표적 뉴런에서 증가된 향성을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 향성은 대상의 특정 위치에서 전체 형질도입된 뉴런 중 형질도입된 표적 뉴런의 백분율에 의해 측정된다. 일부 실시태양에서, 향성은 모든 범위와 그 사이의 하위 범위를 포함하는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 95% 초과 증가된다. 일부 실시태양에서, 향성은 모든 범위와 그 사이의 하위 범위를 포함하는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 증가된다.
일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 해마 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 흥분성 뉴런이다.
일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 DRG 또는 TGG 뉴런이다.
일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 A 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 Aα 또는 Aβ 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 Aδ 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 C 섬유를 포함한다.
일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 NF200 양성 및 IB4 음성인 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 NF200 양성 및 IB4 양성인 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 NF200 음성 및 IB4 양성인 신경 섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 뉴런은 CGRP 양성인 신경 섬유를 포함한다.
이종 핵산
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 벡터는 이종 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 이종 핵산은 수용체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용체는 조작된 리간드 개폐 이온 채널(LGIC) 또는 이의 키메라 버전이다. 일부 실시태양에서, 조작된 LGIC는 소분자 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터의 투여는 eLGIC를 암호화하는 이종 핵산을 대상의 뉴런 세포의 하위 집단으로 전달하고 뉴런 내에서 eLGIC의 발현을 야기한다. 일부 실시태양에서, eLGIC의 발현은 이들 뉴런의 활성이 상응하는 소분자 리간드의 투여에 의해 조절되도록 한다.
일부 실시태양에서, 이종 핵산은 이의 전사 또는 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 제어 요소는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 향상시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연성, 구조성, 유도성 및/또는 조직-특이적으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
이러한 제어 요소는 선택된 유전자와 일반적으로 관련된 제어 서열(예를 들어, 내인성 세포 제어 요소)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종 제어 서열이 사용될 수 있다. 유용한 이종 제어 서열은 일반적으로 포유동물 또는 바이러스 유전자를 암호하하는 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 예는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, 관심 유전자에 이종인 내인성 세포 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터 영역(CMV-IE)과 같은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 루 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 뮤린 메탈로티오네인 유전자와 같은 비바이러스 유전자에서 파생된 서열도 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포 유형 특이적 또는 조직 특이적 프로모터는 이종 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 특정 세포 유형(들) 또는 조직(들)에서 이종 핵산에 의해 암호화되는 상응하는 유전자 생성물을 선택적으로 또는 우선적으로 생산할 수 있게 한다. 일부 실시태양에서, 유도성 프로모터는 이종 핵산에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 이종 핵산은 비-AAV 방법을 사용하여(예를 들어, 비-AAV 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 합성 나노입자 등을 사용하여) 뉴런에 전달될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 이종 핵산은 벡터에 통합된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 복제-결핍 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스), 아데노-연관 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 알파바이러스, 백시니아 바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-1)이다.
조작된 리간드 개폐 이온 채널(eLGIC)
본 발명은 수용체, 이의 돌연변이체, 및 말초 신경병증 및 삼차 신경통과 같은 초점 간질 및/또는 신경병성 통증의 치료에서 이의 사용 방법을 기술한다. 일부 실시태양에서, 수용체는 조작된 리간드 개폐 이온 채널(LGIC)이다. 일부 실시태양에서, 수용체는 키메라 eLGIC이다.
일부 실시태양에서, 수용체는 조작된 수용체(eLGIC)이다. 용어 "조작된 수용체"는 상응하는 모 수용체와 물리적으로 그리고/또는 기능적으로 별개가 되도록 실험적으로 변경된 수용체를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시태양에서, 모 수용체는 야생형 수용체이다. 용어 "야생형 수용체"는 천연에서 발견되는 단백질의 폴리펩타이드 서열과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 수용체를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 야생형 수용체는 인간에서 자연적으로 생기는 수용체뿐만 아니라 다른 진핵생물, 예를 들어, 원생생물, 진균, 식물 또는 동물, 예를 들어, 효모, 곤충, 선충, 해면동물, 포유류, 비포유류 척추동물에서 자연적으로 생기는 오솔로그를 포함한다. 다른 일부 실시태양에서, 모 수용체는 비천연 수용체이고; 즉, 이는 천연에서 생기지 않는 수용체, 예를 들어, 야생형 수용체로부터 조작된 수용체이다. 예를 들어, 모 수용체는 하나의 야생형 수용체로부터의 하나 이상의 서브유닛을 제 2 야생형 수용체로부터의 하나 이상의 서브유닛과 함께 포함하는 조작된 수용체일 수 있다. 따라서 얻어진 단백질은 둘 이상의 야생형 수용체로부터의 서브유닛을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 모 수용체는 키메라 수용체이다. 본 발명의 조작된 수용체는, 예를 들어, 모 수용체 돌연변이체 및 스위치 수용체를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 수용체는 상응하는 모 수용체에 대한 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 야생형 수용체의 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 상응하는 모 수용체와 약 99%, 약 98%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50% 이하의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시태양에서, 모 수용체 돌연변이는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 상응하는 모 수용체와 85% 이상, 예를 들어, 상응하는 모 수용체와 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 예를 들어, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 동일성을 공유한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체(예를 들어, 모 수용체 돌연변이체)는 오류 유발 PCR에 의해 생성된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인(LBD)은 모 수용체의 상응하는 리간드 결합 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 야생형 수용체의 리간드 결합 도메인에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 모 수용체의 상응하는 리간드 결합 도메인과 85% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 모 수용체의 상응하는 리간드 결합 도메인과 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일성, 또는 100% 동일성을 가진다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 모 수용체의 상응하는 리간드 결합 도메인과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조작된 수용체의 이온 기공 도메인(IPD)은 모 수용체의 상응하는 이온 기공 도메인에 대해 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 야생형 수용체의 이온 기공 도메인에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 이온 기공 도메인은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 모 수용체의 상응하는 이온 기공 도메인과 85% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 모 수용체의 상응하는 이온 기공 도메인과 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일성, 또는 100% 동일성을 가진다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 이온 기공 도메인은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 모 수용체의 상응하는 이온 기공 도메인과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 공유한다.
일부 실시태양에서, 아미노산 돌연변이는 상응하는 모 수용체에 대한 기능 상실 아미노산 돌연변이이다. "기능 상실" 아미노산 돌연변이는, 예를 들어, 모 수용체에 대한 내인성 리간드의 결합에 대해 조작된 수용체에 대한 내인성 리간드의 결합을 감소시킴으로써, 또는 상응하는 모 수용체에 대한 리간드의 결합에 대한 반응에서 전형적으로 활성화되는 조작된 수용체의 신호전달 경로(들) 하류의 활성을 감소시킴으로써, 모 수용체에 대한 조작된 수용체의 기능을 감소시키거나, 실질적으로 감소시키거나, 없애는 하나 이상의 돌연변이를 의미한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다.
일부 실시태양에서, 아미노산 돌연변이는 상응하는 모 수용체에 대한 기능 획득 아미노산 돌연변이이다. "기능 획득" 아미노산 돌연변이는, 예를 들어 모 수용체에 대한 내인성 리간드의 결합에 대해 리간드에 대한 조작된 수용체의 친화도를 변경시키거나 향상시킴으로써, 또는 상응하는 모 수용체에 대한 내인성 리간드의 결합에 대해 조작된 수용체에 대한 리간드의 결합에 반응하여 활성화된 신호전달 경로의 활성을 변경시키거나 향상시킴으로써, 모 수용체에 대한 조작된 수용체의 기능을 변형시키는 하나 이상의 돌연변이를 의미한다. 일부 실시태양에서, 기능 획득 돌연변이는 리간드에 대한 조작된 수용체의 증가된 친화도를 초래한다. 특정 실시태양에서, 기능 획득 돌연변이는 효현제 리간드에 대한 조작된 수용체의 증가된 친화도를 초래한다. 일부 실시태양에서, 기능 획득 돌연변이는 조작된 수용체에 결합시 작용제 리간드로서 작용하는 길항제 리간드를 초래한다(예를 들어, 길항제 신호 전달 경로 대신 효현제 신호 전달 경로의 활성화를 초래한다). 일부 실시태양에서, 기능 획득 돌연변이는 조작된 수용체에 결합시 효현제 리간드로서 작용하는 조절자 리간드를 초래한다. 일부 실시예에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 주제 조작된 수용체, 또는 이의 리간드 결합 도메인 및/또는 이온 기공 도메인은 상응하는 모 수용체와 비교하여 하나 이상의 기능 상실 아미노산 돌연변이 및 하나 이상의 기능 획득 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다.
일부 실시태양에서, 기능 돌연변이의 손실 및 기능 돌연변이의 획득은 동일한 잔기에 존재하는데, 즉 동일한 돌연변이이다. 다른 실시태양에서, 기능 돌연변이의 손실 및 기능 돌연변이의 획득은 상이한 아미노산 잔기에서 돌연변이이다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 실시태양에서, 기능 돌연변이의 상실 및/또는 기능 돌연변이의 획득을 포함하는 주제 조작된 수용체(또는 리간드 결합 도메인 및/또는 이온 기공 도메인)는 상응하는 모 수용체, 예를 들어 야생형 수용체 또는 비천연 수용체(또는 리간드 결합 도메인 및/또는 이의 이온 기공 도메인)와 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 99%, 약 98%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시태양에서, 주제 조작된 수용체(또는 리간드 결합 도메인 및/또는 이온 기공 도메인)는 상응하는 모 수용체(또는 리간드 결합 도메인 및/또는 이온 기공 도메인)와 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 85% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성, 일부 경우 96%, 97%, 98% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 99% 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 공유한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 수용체는 하나의 야생형 수용체로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열, 예를 들어, 서브유닛과 제 2 야생형 수용체로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열, 예를 들어, 서브유닛의 조합에 의해 생성되는 수용체를 포함한다. 다시 말해서, 조작된 수용체는 서로에 대해 이종성인 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 "이종성"은 천연에서 함께 생기지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 수용체는 본 명세서에서 "키메라 수용체"로서 의미된다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체는 본 발명의 조작된 수용체가 생성되는 모 수용체로서 작용한다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체는 제 1 LGIC로부터의 리간드 결합 도메인 및 제 2 LGIC로부터의 이온 기공 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 모 수용체 돌연변이체는 효현제 리간드에 대한 증가된 친화도를 입증한다. 일부 실시태양에서, 야생형 수용체에 결합할 때 길항제 또는 조절제로서 작용하는 리간드는 모 수용체 돌연변이체에 결합할 때 효현제로서 작용한다.
일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 "리간드-개폐 이온 통로" 또는 LGIC이다. LGIC는 특정 리간드에 의한 활성화 시 이온을 통과시키는 막관통 단백질의 거대 그룹을 의미한다. LGIC는 적어도 2개의 도메인으로 구성된다: 리간드 결합 도메인 및 막관통 이온 기공 도메인. LGIC에 대한 리간드 결합은 LGIC의 활성화 및 이온 기공의 개방을 초래한다. 리간드 결합은 특정 이온 또는 이온들에 대한 통로 투과성의 극적인 변화를 야기하고; 통로가 비활성이거나 폐쇄될 때 어떤 이온도 효과적으로 통로를 통과할 수 없지만, 리간드 결합 시 최대 107개의 이온/초로 통과할 수 있다. 일부 실시태양에서, LGIC는 세포외 리간드(예를 들어, 신경 전달 물질)에 반응하며, 사이토졸 내로의 이온 유입을 용이하게 한다. 일부 실시태양에서, LGIC는 세포내 리간드(예를 들어, ATP와 같은 뉴클레오타이드 및 PIP2와 같은 신호전달 중간체)에 반응하고, 사이토졸로부터 세포외 환경으로 이온의 방출을 용이하게 한다. 중요하게는, LGIC의 활성화는 세포막을 가로지른 이온(예를 들어, Ca2+, Na+, K+, Cl- 등)의 수송을 초래하고, 리간드 그 자체의 수송을 초래하지 않는다.
LGIC 수용체는 다중 서브세트를 포함하고, 동종의 수용체 또는 이종의 수용체 중 하나일 수 있다. 동종의 수용체는 모든 동일 유형인 서브세트를 포함한다. 이종 수용체는 서브세트로 포함되며 적어도 하나의 서브세트는 수용체 내에 포함된 적어도 하나의 다른 서브세트와 상이하다. 예를 들어, 글리신 수용체는 두 가지 유형이 있는, 5개의 서브유닛을 포함한다: 4개의 아이소폼(α1 내지 α4)이 있는 α-서브유닛, 단일의 공지된 아이소폼이 있는 β-서브유닛. 예시적인 동종 GlyR은 5개의 α1-GlyR 서브세트를 포함하는 GlyR이다. 유사하게, 동종 GABAA 수용체는 β3-GABAA 서브유닛을 포함할 수 있고, nAchR 수용체는 α7-nAchR 서브세트를 포함할 수 있다. 예시적인 이종 GlyR은 하나 이상의 α-서브세트 및 하나 이상의 β-서브세트(예를 들어, α1β-GlyR)를 포함할 수 있다. 예시적인 LGIC 수용체의 서브세트는 표 2에 도시된다.
LGIC 수용체 및 서브세트
수용체 서브유닛 서브유닛 아이소형
GlyR GLRA1
GLRA2
GLRA3
GLRA4
GLRB
5HT3 5-HT3A
5-HT3B
5-HT3C
5-HT3D
5-HT3E
nAChR α α1
α2
α3
α4
α5
α6
α7
α8
α9
α10
β β1
β2
β3
β4
γ γ
δ δ
ε ε
GABAA α α1
α2
α3
α4
α5
GABAA α α6
β β1
β2
β3
γ γ1
γ2
γ3
δ δ
ε ε
π π
ρ ρ1
ρ2
ρ3
P2X P2X1
P2X2
P2X3
P2X4
P2X5
P2X6
P2X7
KCNQ α Kvα1
Kvα2
Kvα3
Kvα4
Kvα5
Kvα6
Kvα7
Kvα8
Kvα9
Kvα10
Kvα11
Kvα12
β Kvβ1
Kvβ2
Kvβ3
minK
MiRP1
MiRP2
MiRP3
KCNE1-유사
KCNIP1
KCNIP2
KCNIP3
KCNIP4
특정 실시태양에서 사용하는 데 적합한 LGIC 패밀리의 예시적인 예는 Cys-루프 수용체, 예컨대 글리신 수용체(GlyR), 세로토닌 수용체(예를 들어, 5-HT3 수용체), λ-아미노뷰티르산 A(GABA-A) 수용체, 및 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAchR)뿐만 아니라; 산-감지(양성자-개폐성) 이온 통로(ASIC), 상피 나트륨 통로(ENaC), 이오노트로픽 글루탐산염 수용체, IP3 수용체, P2X 수용체, 리아노딘(Ryanodine) 수용체, 및 아연 활성화 통로(Zinc activated channel: ZAC)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기술된 방법과 함께 사용하기에 적합한 LGIC의 특정 비제한적 예는 HTR3A; HTR3B; HTR3C; HTR3D; HTR3E; ASIC1; ASIC2; ASIC3; SCNN1A; SCNN1B; SCNN1D; SCNN1G; GABRA1; GABRA2; GABRA3; GABRA4; GABRA5; GABRA6; GABRB1; GABRB2; GABRB3; GABRG1; GABRG2; GABRG3; GABRD; GABRE; GABRQ; GABRP; GABRR1; GABRR2; GABRR3; GLRA1; GLRA2; GLRA3; GLRA4; GLRB; GRIA1; GRIA2; GRIA3; GRIA4; GRID1; GRID2; GRIK1; GRIK2; GRIK3; GRIK4; GRIK5; GRIN1; GRIN2A; GRIN2B; GRIN2C; GRIN2D; GRIN3A; GRIN3B; ITPR1; ITPR2; ITPR3; CHRNA1; CHRNA2; CHRNA3; CHRNA4; CHRNA5; CHRNA6; CHRNA7; CHRNA9; CHRNA10; CHRNB1; CHRNB2; CHRNB3; CHRNB4; CHRNG; CHRND; CHRNE; P2RX1; P2RX2; P2RX3; P2RX4; P2RX5; P2RX6; P2RX7; RYR1; RYR2; RYR3; 및 ZACN을 포함한다.
본 발명의 조작된 수용체의 생성에서의 용도를 발견하는 야생형 LGIC 수용체 서열의 비제한적 예는 다음을 포함한다. 서열에서, 신호 펩타이드는 이탤릭체이며, 리간드 결합 도메인은 볼드체이고, 이온 기공 도메인은 밑줄 표시되어 있다:
일부 실시태양에서, 야생형 LGIC 수용체는 CHRNA7 유전자(젠뱅크 수탁번호 NM_000746.5)에 의해 암호화된 인간 니코틴성 콜린성 수용체 알파 7 서브유닛(α7-nAchR)(젠뱅크 수탁번호 NP_000737.1, SEQ ID NO: 25)이다:
(SEQ ID NO: 25)
야생형 LGIC 수용체는 GLRA1 유전자(NM_001146040.1)에 의해 암호화된 인간 알파 1 글리신 수용체(GlyRα1)(젠뱅크 수탁번호 NP_001139512.1, SEQ ID NO: 26)이다:
(SEQ ID NO: 26).
일부 실시태양에서, 야생형 LGIC 수용체는 GLRA2 유전자(젠뱅크 수탁번호 NM_001118885.1)에 의해 암호화된 인간 알파 2 글리신 수용체(GlyRα2)(젠뱅크 수탁번호 NP_001112357.1, SEQ ID NO: 27)이다:
(SEQ ID NO: 27).
일부 실시태양에서, 야생형 LGIC 수용체는 GLRA3 유전자(젠뱅크 수탁번호 NM_006529.3)에 의해 암호화된 인간 알파 3 글리신 수용체(GlyRα3) 아이소폼 L(젠뱅크 수탁번호 NP_006520.2, SEQ ID NO: 28)이다:
(SEQ ID NO: 28).
일부 실시태양에서, 야생형 LGIC 수용체는 GLRA3 유전자(젠뱅크 수탁번호 NM_001042543.3)에 의해 암호화된 인간 알파 3 글리신 수용체(GlyRα3) 아이소폼 K(젠뱅크(GenBank) 수탁번호 NP_001036008.1, SEQ ID NO: 29)이다:
(SEQ ID NIO: 29).
일부 양태에서, 조작된 수용체는 키메라 LGIC 수용체이다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체는 적어도 제 1 LGIC로부터 유래된 리간드 결합 도메인 서열 및 이온 기공 전도 도메인 서열, 또는 더 단순하게는, 적어도 제 2 LGIC로부터 유래된 "이온 기공 도메인 서열"을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유래된 아미노산 서열은 이것이 유래된 LGIC의 상응하는 영역과 동일하다. 일부 실시태양에서, 유래된 아미노산 서열은 이것이 유래된 LGIC의 상응하는 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 위치에서 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, LGIC 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 원래 아미노산 서열의 상응하는 영역과 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 잔기까지 상이하다. 일부 실시태양에서, 유래된 아미노산 서열은 LGIC 아미노산 서열의 해당 영역에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% (이 사이의 모든 범위 및 하위 범위 포함) 서열 동일성을 가진다.
일부 실시태양에서, 제 1 및 제 2 LGIC는 Cys-루프 수용체이다. Cys-루프 수용체의 리간드 결합 도메인 서열 및 이온 기공 도메인 서열은 당업계에 주지되어 있고, 공공연하게 입수 가능한 소프트웨어, 예를 들어, PubMed, Genbank, Uniprot 등의 사용에 의해 문헌으로부터 용이하게 확인될 수 있다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인은 제 1 LGIC의 리간드 결합 도메인에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 제 2 LGIC의 이온 기공 도메인에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 위에 기술된 서열에서, 리간드 결합 도메인은 볼드체이며, 이온 기공 도메인은 밑줄 표시되어 있다.
일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체의 리간드 결합 도메인 서열로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 GlyRα1(SEQ ID NO: 26)이다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26의 GlyRα1의 약 아미노산 29-235, 예를 들어, 아미노산 29-235, 아미노산 29-240, 아미노산 29-246, 아미노산 29-248, 아미노산 29-250, 또는 아미노산 29-252에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 이러한 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 29-235로 필수적으로 이루어지고, SEQ ID NO: 26의 아미노산 29-240으로 필수적으로 이루어지며, SEQ ID NO: 26의 아미노산 29-246으로 필수적으로 이루어지고, SEQ ID NO: 26의 아미노산 29-248로 필수적으로 이루어지며, SEQ ID NO: 26의 아미노산 29-250으로 필수적으로 이루어지고, SEQ ID NO: 26의 아미노산 29-252로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인 서열은 인간 GlyRα1 이외의 Cys-루프 수용체로부터 유래된다.
일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 니코틴 콜린성 수용체의 리간드 결합 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 니코틴 콜린성 수용체는 인간 α7-nAChR이다. 일부 이러한 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 대략 아미노산 23-220, 예를 들어, SEQ ID NO: 25의 아미노산 23-220, 아미노산 23-221, 아미노산 23-222, 아미노산 23-223, 아미노산 23-224, 아미노산 23-225, 아미노산 23-226, 아미노산 23-227, 아미노산 23-228, 아미노산 23-229, 아미노산 23-230 또는 아미노산 23-231을 포함한다. 특정의 이러한 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 23-220, 아미노산 23-221, 아미노산 23-222, 아미노산 23-223, 아미노산 23-224, 아미노산 23-225, 아미노산 23-226, 아미노산 23-227, 아미노산 23-228, 아미노산 23-229, 아미노산 23-230, 또는 아미노산 23-231로 필수적으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인 서열은 인간 α7-nAChR 수용체 이외의 Cys-루프 수용체로부터 유래된다.
일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 니코틴 콜린성 수용체의 리간드 결합 도메인 서열로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 인간 니코틴 콜린성 수용체는 인간 α7-nAChR이다. 일부 이러한 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 대략 아미노산 23-220, 예를 들어, SEQ ID NO: 25의 아미노산 23-220, 아미노산 23-221, 아미노산 23-222, 아미노산 23-223, 아미노산 23-224, 아미노산 23-225, 아미노산 23-226, 아미노산 23-227, 아미노산 23-228, 아미노산 23-229, 아미노산 23-230 또는 아미노산 23-231에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인 서열은 인간 α7-nAChR 수용체 이외의 Cys-루프 수용체로부터 유래된다.
일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 글리신 수용체의 이온 기공 도메인 서열로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 GlyRα1이다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 GlyRα1(SEQ ID NO: 26)의 대략 아미노산 245-457, 예를 들어, SEQ ID NO: 26의 아미노산 240-457, 아미노산 245-457, 아미노산 248-457, 아미노산 249-457, 아미노산 250-457, 아미노산 255-457, 또는 아미노산 260-457에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 245-457로 필수적으로 이루어지거나, SEQ ID NO: 26의 아미노산 248-457로 필수적으로 이루어지거나, SEQ ID NO: 26의 아미노산 249-457로 필수적으로 이루어지거나, SEQ ID NO: 26의 아미노산 250-457로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열(SEQ ID NO: 27)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열(SEQ ID NO: 27)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열(SEQ ID NO: 27)에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열(SEQ ID NO: 27)과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 27의 아미노산 254-452를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 27의 아미노산 254-452를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα2의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 27의 아미노산 260-452를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 L의 이온 기공 도메인 서열(SEQ ID NO: 28)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 L(SEQ ID NO: 28)의 이온 기공 도메인 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 L(SEQ ID NO: 28)의 이온 기공 도메인 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 L(SEQ ID NO: 28)의 이온 기공 도메인 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα3 아이소형 L의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 253-464를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα3 아이소형 L의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 257-464를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα3 아이소형 L의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 K의 이온 기공 도메인 서열(SEQ ID NO: 29)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 K(SEQ ID NO: 29)의 이온 기공 도메인 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 K(SEQ ID NO: 29)의 이온 기공 도메인 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인은 인간 GlyRα3 아이소형 K(SEQ ID NO: 29)의 이온 기공 도메인 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα3 아이소형 K의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 253-449를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα3 아이소형 K의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 257-449를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시태양에서, 인간 GlyRα3 아이소형 K의 이온 기공 도메인 서열은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 인간 니코틴 콜린성 수용체의 이온 기공 도메인 서열로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 인간 니코틴 콜린성 수용체는 인간 α7-nAChR이다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 대략 아미노산 230-502, 예를 들어, 아미노산 227-502, 아미노산 230-502, 아미노산 231-502, 아미노산 232-502, 또는 아미노산 235-502에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 이러한 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 227-502로 필수적으로 이루어지거나, SEQ ID NO: 25의 아미노산 230-502로 필수적으로 이루어지거나, SEQ ID NO: 25의 아미노산 231-502로 필수적으로 이루어지거나, SEQ ID NO: 25의 아미노산 232-502로 필수적으로 이루어지거나, 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 235 내지 502로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 대상 키메라 리간드-개폐 이온 통로의 이온 기공 도메인은 이온 기공 도메인의 M2-M3 링커 도메인에 대해 이종성인 M2-M3 링커 도메인을 포함한다. "M2-M3 링커 도메인", 또는 "M2-M3 링커"는 수용체의 막관통 도메인 2(M2)의 C-말단 단부에 의해 이의 아미노(N)말단에서 그리고 수용체의 막관통 도메인 3(M3)의 N-말단 단부에 의해 이의 카복시(C)말단에 플랭킹된 LGIC의 이온 기공 도메인 내의 서열을 의미한다. LGIC의 M2-M3 링커는 당업계로부터 용이하게 결정되고/되거나 임의의 공공연하게 이용 가능한 단백질 분석 툴, 예를 들어, Expasy, uniProt 등을 이용함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 키메라 수용체의 이온 기공 도메인이 이종성 M2-M3 링커를 포함할 때, M2-M3 링커는 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인과 동일한 수용체로부터 유래된다. 예를 들어, 대상 리간드-개폐 이온 통로가 AChR로부터의 리간드 결합 도메인 및 GlyR로부터의 이온 기공 도메인을 포함할 때, 이의 이온 기공 도메인 서열은 AChR로부터 유래된 M2-M3 링커 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 GlyRα1로부터 유래되고, M2-M3 링커는 α7-nAChR로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인으로부터 제거된 천연 M2-M3 링커 서열은 GlyRα1의 대략 아미노산 293-313(SEQ ID NO: 26), 예를 들어, 아미노산 304-310, 293-306, 298-310, 305-311, 302-313 등에 상응한다. 일부 이러한 실시태양에서, 삽입된 M2-M3 링커는 α7-nAChR의 대략 아미노산 281-295(SEQ ID NO: 25), 예를 들어, 아미노산 290-295, 281-290, 281-295, 283-295, 287-292 등 또는 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 아미노산 281-295 또는 283-295에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열로부터 유래된다.
일부 실시태양에서, 대상 키메라 리간드-개폐 이온 통로의 리간드 결합 도메인은 리간드 결합 도메인의 Cys-루프 서열에 대해 이종성인 Cys-루프 도메인 서열을 포함한다. "Cys-루프 도메인 서열" 또는 "Cys-루프 서열"은 N-말단 및 C-말단에서 시스테인에 플랭킹된 루프 구조를 형성하는 Cys-루프 LGIC의 리간드 결합 도메인 내의 도메인을 의미한다. 이론에 의해 구속되지 않고, 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합 시, Cys-루프는 M2-M3 루프에 매우 근접하게 구조적으로 이동하며, 이 움직임은 이온 기공 도메인 내 신호 전달에 대한 세포외 도메인 내 리간드 결합의 생물물리학적 번역을 매개하는 것으로 여겨진다(Miller and Smart, Trends in Pharmacological Sci 2009:31(4)에서 검토되는 바와 같음). 내인성 Cys-루프 서열의 이종성 Cys-루프 서열로의 치환은 1.5배 이상, 예를 들어, 적어도 2배, 3배 또는 4배, 일부 예에서 적어도 5배 또는 6배만큼, 그리고 특정 용량에서, 적어도 7배, 8배, 9배 또는 10배만큼 LGIC의 전도도를 증가시킬 수 있다. Cys-루프 수용체의 Cys-루프 도메인은 당업계로부터 그리고/또는 임의의 공공연하게 이용 가능한 단백질 분석 툴, 예를 들어, Expasy, uniProt 등을 이용함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인이 이종성 Cys-루프 서열을 포함할 때, Cys-루프 서열은 키메라 수용체의 이온 기공 도메인과 동일한 수용체로부터 유래된다. 예를 들어, 대상 키메라 리간드-개폐 이온 통로가 AChR로부터의 리간드 결합 도메인 및 GlyR로부터의 이온 기공 도메인을 포함할 때, 대상 리간드-개폐 이온 통로는, 대신에 GlyR로부터 유래된 Cys-루프 도메인의 서열을 제외하고, AChR로부터의 리간드 결합 도메인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 α7-nAChR로부터 유래되고, Cys-루프 서열은 GLyR로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인으로부터 제거된 Cys-루프 서열은 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 대략 아미노산 150-164, 예를 들어, α7-nAChR의 아미노산 150-157에 상응한다. 일부 실시태양에서, 삽입된 Cys 루프 서열은 GlyRα1(SEQ ID NO: 26)의 대략 아미노산 166-180, 예를 들어, GlyRα1의 아미노산 166-172, 또는 GlyRα1의 아미노산 166-180과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열로부터 유래된다.
일부 실시태양에서, 삽입된 Cys 루프 서열은 GlyRα2(SEQ ID NO: 27)의 대략 아미노산 172-186, 예를 들어 GlyRα2의 아미노산 172-178, 또는 GlyRα2의 아미노산 172-186과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 삽입된 Cys 루프 서열은 GlyRα3(SEQ ID NO: 28 또는 29)의 대략 아미노산 171-185, 예를 들어 GlyRα3의 아미노산 171-177, 또는 GlyRα3의 아미노산 171-185와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열로부터 유래된다.
일부 실시태양에서, 대상 키메라 리간드-개폐 이온 통로의 리간드 결합 도메인은 리간드 결합 도메인의 β1-2 루프 도메인 서열에 대해 이종성인 β1-2 루프 도메인 서열을 포함한다. "β1-2 루프 도메인 서열", 또는 "β1-2 루프, 또는 β1-β2 루프"는 β1 시트의 C-말단에 의해 이의 N-말단에서, 그리고 β2 시트의 N-말단에 의해 이의 C-말단에 플랭킹된 Cys-루프 LGIC의 리간드 결합 도메인 내의 도메인을 의미한다. 이론에 의해 구속되지 않고, β1-2 루프는 이온 기공 도메인에 대한 세포외 도메인 내 리간드 결합의 생물물리학적 번역 및 후속적 신호전달(즉, GlyR의 경우에 염화물 유입)을 매개하게 하는 것으로 여겨진다. 리간드의 결합 시 β1-2 루프는 Cys-루프와 함께, M2-M3 루프에 근접하게 되어, M2-M3 루프 잔기가 있는 이온 기공 도메인 내 신호 전달에 대한 세포외 도메인 내 리간드 결합의 생물물리학적 번역을 매개하는 것으로 여겨진다(상기 Miller and Smart에서 검토되는 바와 같음). 내인성 β1-2 루프 서열의 이종성 β1-2 루프 서열로의 치환은 LGIC의 전도도를 1.5배 이상, 예를 들어, 적어도 2배, 3배 또는 4배, 일부 예에서 적어도 5배 또는 6배, 특정 용량에서, 적어도 7배, 8배, 9배 또는 10배만큼 증가시킬 수 있다. Cys-루프 수용체의 β1-2 루프는 당업계로부터 그리고/또는 임의의 공공연하게 이용 가능한 단백질 분석 툴, 예를 들어, Expasy, uniProt 등을 이용함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인이 이종성 β1-2 루프 서열을 포함할 때, β1-2 루프 서열은 키메라 수용체의 이온 기공 도메인과 동일한 수용체로부터 유래된다. 예를 들어, 대상 키메라 리간드-개폐 이온 통로가 AChR로부터 유래된 리간드 결합 도메인 및 GlyR로부터 유래된 이온 기공 도메인을 포함할 때, 리간드 결합 도메인의 β1-2 루프 도메인의 서열은 GlyR로부터 유래될 수 있다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 α7-nAChR로부터 유래된다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인으로부터 제거된 β1-2 루프 서열은 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 대략 아미노산 67-72 또는 67-70, 예를 들어, α7-nACh의 아미노산 67-70, 66-71 또는 64-72에 상응한다. 일부 실시태양에서, 삽입된 β1-2 루프 서열은 최대 3개, 최대 2개, 최대 1개 아미노산 돌연변이를 갖거나 아미노산 돌연변이가 없는 GlyRα1(SEQ ID NO: 26)의 대략 아미노산 79-85, 예를 들어, GlyRα1의 아미노산 80-85, 81-84, 79-85, 또는 81-84이다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 GlyRα2로부터 유래되고 삽입된 β1-2 루프는 최대 3개, 최대 2개, 최대 1개 아미노산 돌연변이를 갖거나 아미노산 돌연변이가 없는 GlyRα2(SEQ ID NO: 27)의 대략 아미노산 86-91에 상응한다. 일부 실시태양에서, 이온 기공 도메인은 GlyRα3에서 유래되고 삽입된 β1-2 루프는 최대 3개, 최대 2개, 최대 1개 아미노산 돌연변이를 갖거나 아미노산 돌연변이가 없는 GlyRα3(SEQ ID NO: 28 또는 29)의 대략 아미노산 85-90에 상응한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 인간 α7-nAChR로부터 유래된 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 LGIC 수용체를 제공하며, 여기서 리간드 결합 도메인은 본 발명의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 인간 글리신 수용체로부터 유래된 이온 기공 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2 또는 인간 글리신 수용체 α3이다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유래된 Cys-루프 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유래된 β1-2 루프 도메인을 포함한다.
본 발명의 키메라 LGIC 수용체의 서열의 비제한적 예는 SEQ ID NO: 30-31 및 33으로 본 명세서에 개시된 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메라 LGIC 수용체는 본 명세서의 SEQ ID NO: 30-31 및 33에 제공된 서열에 대해 85% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 즉, SEQ ID NO: 30-31 및 33에 제공된 서열에 대해 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 서열에서, 신호 펩타이드는 이탤릭체로 표시하고, 리간드 결합 도메인은 굵게 표시하며, 이온 기공 도메인은 밑줄로 표시한다.
일부 실시태양에서, 키메라 LGIC 수용체는 인간 GlyRα1 이온 기공 도메인(밑줄 표시)에 인간 α7-nAChR 신호 펩타이드(이탤릭체) 및 GlyRα1 Cys-루프 서열(소문자)을 포함하는 리간드 결합 도메인(굵은체)을 포함하는 CHRNA7/GLRA1 키메라이다. 일부 실시태양에서, 키메라 LGIC 수용체는 SEQ ID NO: 33에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
(SEQ ID NO: 32에 의해 암호화된 SEQ ID NO: 33)
일부 실시태양에서, 키메라 LGIC 수용체는 인간 GlyRα1 이온 기공 도메인(밑줄 표시)에 융합된 인간 α7-nAChR 신호 펩타이드(이탤릭체) 및 GlyRα1 β1-2 루프 서열(소문자) 및 Cys-루프를 포함하는 리간드 결합 도메인(굵은 글씨체)을 포함하는 CHRNA7/GLRA1 키메라이다:
(SEQ ID NO: 30)
일부 실시태양에서, 키메라 LGIC 수용체는 인간 GlyRα1 이온 기공 도메인(밑줄 표시)에 융합된 인간 α7-nAChR 신호 펩타이드(이탤릭체) 및 리간드 결합 도메인(볼드체)를 포함하는 CHRNA7/GLRA1(R229 접합) 키메라이다:
(SEQ ID NO: 31).
리간드 개폐 이온 채널에서 아미노산 돌연변이
상기 논의한 바와 같이, 일부 양태에서, 주제 조작된 수용체는 돌연변이되지 않은 모 수용체 상에서의 효능에 비해 조작된 수용체 상의 리간드 효능을 변경시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 바꿔 말하면, 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 기능 상실 돌연변이 또는 기능 획득 돌연변이는 돌연변이되지 않은 모 수용체의 효능에 비해 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을 이동시킨다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 돌연변이는 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인에 있다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인이 Cys-루프 수용체 단백질일 때와 같이, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 W77, Y94, R101, W108, Y115, T128, N129, V130, L131, Q139, L141, Y151, S170, W171, S172, S188, Y190, Y210, C212, C213 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 잔기에 대응하는 잔기에서의 치환이다. 일부 실시태양에서, 하나의 잔기는 치환된다. 일부 실시태양에서, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 잔기가 치환되며, 예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잔기가 치환된다. 특정 실시태양에서, 잔기는 W77, R101, Y115, N129, L131, S170, S172 및 S188로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 잔기에 대응한다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 α7-nAChR 서열 내에 있다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 아세틸콜린 및 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을, 예를 들어, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상 또는 100배 감소시킨다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 α7-nAChR의 R101I, R101S, R101D, Y115L, Y115M, Y115D, Y115T, T128M, T128R, T128I, N129I, N129V, N129P, N129W, N129T, N129D, N129E, L131E, L131P, L131T, L131D, L131S, L141S, L141R, W171F, W171H, S172F, S172Y, S172R, S172D, C212A, C212L 또는 C213P에 대응하는 치환이다. 다른 예에서, 하나 이상의 치환은 조작된 수용체 상에서 선택적으로 아세틸콜린의 효능을 감소시킨다. 다시 말해서, 하나 이상의 치환은 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 반응성을 감소시키는 한편, 비천연 리간드에 대한 효능을 본질적으로 유지하거나, 다르게는 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을 감소시키는 것보다 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 효능을 2배 이상, 예를 들어, 3배, 4배, 5배 이상, 일부 예에서 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 치환은 α7-nAChR의 L131E, L131S, L131T, L131D 또는 S172D에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 조작된 수용체 상에서 선택적으로 비천연 리간드의 효능을 감소시킨다. 다시 말해서, 하나 이상의 치환은 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을 감소시키는 한편, 아세틸콜린에 대한 효능을 본질적으로 유지하거나 다르게는 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 효능을 감소시키는 것보다 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을 2배 이상, 예를 들어, 3배, 5배 이상, 일부 예에서 10배, 20배 또는 50배 이상 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 치환은 α7-nAChR의 W77M, Y115W, S172T 또는 S172C에 상응한다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 α7-nAChR 서열 내에 있다. 특정 실시태양에서, 비천연 리간드는 AZD-0328, TC6987, ABT-126 및 파시니클린/RG3487로부터 선택된다.
다른 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 아세틸콜린 및/또는 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을, 예를 들어, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상. 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 또는 100배 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 치환은 L131N, L141W, S170G, S170A, S170L, S170I, S170V, S170P, S170F, S170M, S170T, S170C, S172T, S172C, S188I, S188V, S188F, S188M, S188Q, S188T, S188P 또는 S188W에 상응한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 아세틸콜린과 비천연 리간드 둘 다의 효능을 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 치환은 α7-nAChR의 L131N, S170G, S170A, S170L, S170I, S170V, S170P, S170F, S170M, S170T, S170C, S172T, S188I, S188V, S188F, S188M, S188Q 또는 S188T에 상응한다. 다른 예에서, 하나 이상의 치환은 조작된 수용체 상에서 선택적으로 아세틸콜린의 효능을 증가시킨다. 다시 말해서, 하나 이상의 치환은 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을 증가시키는 것보다 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 반응성을 2배 이상, 예를 들어, 3배, 4배 또는 5배 이상, 일부 예에서 10배, 20배, 50배 또는 100배 증가시킨다. 일부 실시태양에서, 치환은 α7-nAChR의 L141W, S172T, S172C, S188P 또는 S188W에 상응한다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 α7-nAChR 서열 내에 있다. 특정 실시태양에서, 비천연 리간드는 AZD-0328, TC-5619, TC6987, ABT-126 및 파시니클린/RG3487로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 치환은 조작된 수용체 상에서 비천연 리간드의 효능을 선택적으로 증가시킨다. 다시 말해서, 하나 이상의 치환은 아세틸코린에 대한 조작된 수용체의 효능을 증가시키는 것보다 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능을 2배 이상, 예를 들어, 3배, 5배 이상, 일부 예에서 10배, 20배 또는 50배 이상 증가시킨다.
일부 실시태양에서, 주제 조작된 수용체에서 돌연변이된 아미노산 잔기는 야생형 a7 nAChR(SEQ ID NO: 25)의 R27, E41, Q79, Q139, L141, G175, Y210, P216, Y217 또는 D219에 대응하는 아미노산이 아니다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 일부 실시태양에서, 주제 조작된 수용체에서 돌연변이된 아미노산 잔기는 야생형 a7 nAChR(SEQ ID NO: 25)의 R27, E41, Q79, Q139, L141, G175, Y210, P216, Y217, 또는 D219에 상응하는 아미노산이다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 α7 nAChR에서 W77F, W77Y, W77M, Q79A, Q79Q, Q79S, Q79G, Y115F, L131A, L131G, L131M, L131N, L131Q, L131V, L131F, Q139G, Q139L, G175K, G175A, G175F, G175H, G175M, G175R, G175S, G175V, Y210F, P216I, Y217F 또는 D219A에 상응하는 치환이 아니다. 일부 실시태양에서, 치환은 야생형 α7 nAChR에서 W77F, W77Y, W77M, Q79A, Q79Q, Q79S, Q79G, Y115F, L131A, L131G, L131M, L131N, L131Q, L131V, L131F, Q139G, Q139L, G175K, G175A, G175F, G175H, G175M, G175R, G175S, G175V, Y210F, P216I, Y217F, 또는 D219A에 상응하는 치환이다. 일부 실시태양에서, 이런 치환이 조작된 수용체 내에 존재한다면, 본 명세서에 기술된 아미노산 돌연변이 중 하나 이상과 조합하여 존재한다.
일부 실시태양에서, α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 잔기 Y94, Y115, Y151 및 Y190은 천연 리간드 아세틸콜린의 결합을 매개한다. 일부 실시태양에서, 이들 잔기에서 돌연변이는 아세틸콜린의 결합을 감소시킬 수 있으며 따라서 기능 상실 돌연변이로 생각될 수 있다. 일부 실시태양에서, α7-nAChR의 잔기 W77, Y115, N129, V130, L131, Q139, L141, S170, Y210, C212, C213 및 Y217은 이 수용체에 대한 비천연 리간드 AZD0328의 결합을 매개할 수 있고 이들 잔기의 돌연변이는 수용체에 대한 AZD0328 및/또는 다른 리간드의 친화도를 증가시킬 수 있으며, 따라서 기능 획득 돌연변이로 생각될 수 있다. 일부 실시태양에서, 주제 조작된 수용체는 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 리간드 결합 도메인 영역 또는 α7-nAChR의 리간드 결합 도메인 영역을 포함하는 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 W77, Y94, Y115, N129, V130, L131, Q139, L141, Y151, S170, Y190, Y210, C212, C213 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 특정 실시태양에서, α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 리간드 결합 도메인 영역 또는 α7-nAChR의 리간드 결합 도메인 영역을 포함하는 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이는 W77, Y94, Y115, N129, V130, L131, Q139, L141, Y151, S170, Y190, Y210, C212, C213 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 치환이다.
일부 실시태양에서, α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 잔기 Y115, L131, L141, S170, W171, S172, C212 및 Y217은 아세틸콜린 및/또는 니코틴의 결합을 매개할 수 있고 이들 잔기 중 하나 이상에서 돌연변이는 아세틸콜린 및/또는 니코틴의 결합을 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, α7-nAChR의 R101, Y115, L131, L141, W171, S172, S188, Y210 및 Y217은 비천연 리간드 ABT126의 결합을 매개할 수 있고 이들 잔기 중 하나 이상의 돌연변이는 α7-nAChR에 대한 ABT126 및/또는 다른 리간드의 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, α7-nAChR의 R101, Y115, T128, N129, L131, L141, W171, S172, Y210, C212, C213 및 Y217은 비천연 리간드 TC6987의 결합을 매개할 수 있고 이들 잔기 중 하나 이상의 돌연변이는 α7-nAChR에 대한 TC6987 및/또는 다른 리간드의 친화도를 증가시킬 수 있다. α7-nAChR의 R101, N120, L131, L141, S170, W171, S172, Y210 및 Y217은 비천연 리간드 파시니클린/RG3487의 결합을 매개하고, 이들 잔기 중 하나 이상의 돌연변이는 α7-nAChR에 대한 파시니클린/RG3487 및/또는 다른 리간드의 친화도를 증가시키는 것으로 예상된다. 일부 실시태양에서, 주제 조작된 수용체는 α7-nAChR의 리간드 결합 도메인 영역 또는 α7-nAChR의 리간드 결합 도메인 영역을 포함하는 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하며, 여기서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 R101, Y115, T128, N120, N129, L131, L141, S170, W171, S172, S188, Y210, C212, C213 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 α7-nAChR에 대한 아세틸콜린 및/또는 니코틴의 결합을 변경시키며, 아미노산은 α7-nAChR의 Y115, L131, L141, S170, W171, S172, C212 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정의 이러한 실시태양에서, 아미노산은 C212 및 S170으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이는 α7-nAChR에 대한 ABT126의 결합을 변경시키며 하나 이상의 아미노산 잔기는 α7-nAChR의 R101, Y115, L131, L141, W171, S172, S188, Y210 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정의 이러한 실시태양에서, 아미노산은 R101, S188 및 Y210으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이는 α7-nAChR에 대한 TC6987의 결합을 변경시키며 하나 이상의 아미노산 잔기는 α7-nAChR의 R101, Y115, T128, N129, L131, L141, W171, S172, Y210, C212, C213 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정의 이러한 실시태양에서, 아미노산은 R101, T128, N129, Y210 및 C213으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 잔기에서 돌연변이는 α7-nAChR에 대한 파시니클린/RG3487의 결합을 변경시키며 하나 이상의 아미노산 잔기는 α7-nAChR의 R101, N120, L131, L141, S170, W171, S172, Y210 및 Y217로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정의 이러한 실시태양에서, 아미노산은 Y210, R101 및 N129로부터 선택된다.
본 발명은 모 수용체와 비교하여 아미노산 치환과 같은 2개 이상의 돌연변이를 갖는 조작된 수용체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 모 수용체는 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유래된 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 모 수용체는 키메라 수용체이다. 일부 실시태양에서, 모 수용체는 인간 글리신 수용체로부터 유래된 이온 기공 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3이다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유래된 Cys-루프 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 모 수용체는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 모 수용체와 비교하여 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 α7-nAChR(SEQ ID NO: 25)의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 것으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 2개의 아미노산 치환은 L131 및 S172, Y115 및 S170, 및 Y115 및 L131로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 쌍의 아미노산 잔기에 있다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 L131 및 S172, Y115 및 S170, 및 Y115 및 L131로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 쌍의 아미노산 잔기에서 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 잔기 L131에서 아미노산 치환 및 S172D의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 잔기 L131에서 아미노산 치환 및 Y115D의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 L131S 및 S172D, L131T 및 S172D, L131D 및 S172D, Y115D 및 S170T, Y115D 및 L131Q, 및 Y115D 및 L131E로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 쌍의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 L131E의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 Y140, R101, L131, Y115 및 Y210으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 α7-nAChR의 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 R101W 및/또는 Y210V의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 R101, L131, Y115, Y210 및 Y140으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 2개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 R101, L131, Y115, Y210 및 Y140으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 R101 및 L131, Y115 및 Y210, R101 및 Y210으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 쌍의 아미노산 잔기에서 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 R101F 및 L131G, R101F 및 L131D, Y115E 및 Y210W, R101W 및 Y210V, R101F 및 Y210V, R101F 및 Y210F, R101M 및 L131A, 및 R101M 및 L131F로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 쌍의 아미노산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 아미노산 잔기 R101, Y115 및 Y210에서 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 아미노산 치환 R101W, Y115E 및 Y210W, 또는 아미노산 치환 R101F, Y115E 및 Y210W를 포함한다.
일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 잔기 L131에서 아미노산 치환 및 R101F 또는 R101M의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 잔기 L131에서 아미노산 치환은 L131G, L131D, L131A, L131F 또는 L131N이다.
일부 실시태양에서, 리간드 결합 도메인은 잔기 Y210에서의 소수성 아미노산 치환 및 R101W 또는 R101F의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 잔기 Y210에서 아미노산 치환은 Y210V, Y210F 또는 Y210W이다.
당업자는 본 발명의 조작된 수용체와 비교하기 위해 적절한 대조군 수용체를 쉽게 인식할 것이다. 일부 실시태양에서, 대조군 수용체는 하나 이상의 구별되는 아미노산 돌연변이(예를 들어, 치환)를 제외하고 조작된 수용체와 서열이 동일하다. 모든 경우에, 대조군 수용체에 대한 언급은 인용된 특성의 변화(예를 들어, 리간드에 대한 효능)가 발명의 조작된 수용체의 아미노산 돌연변이(들)의 결과임을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명은 조작된 수용체를 제공하며, 여기서 조작된 수용체는 키메라 리간드-개폐 이온 채널(LGIC) 수용체이고 다음을 포함한다: (a) 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유도되고 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛의 Cys-루프 도메인을 포함하는 리간드 결합 도메인; 및 (b) 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터 유도된 이온 기공 도메인. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 모 조작된 수용체로부터 유도되고, 모 조작된 수용체에 기초한 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 효능은 아세틸콜린에 대한 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능보다 낮다. 일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 효능은 아세틸콜린에 대한 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능보다 적어도 약 1.5배(예를 들어, 그 사이에 있는 모든 하위 범위와 값을 포함하는 약 2배 낮음, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 12배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 또는 약 100배)이다. 일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 효능은 YFP 형광 소광을 사용하는 세포 리포터 분석에 기초한 아세틸콜린에 대한 EC50에 의해 평가된다. 일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 EC50은 적어도 100uM, 적어도 200uM, 적어도 300uM, 적어도 500uM, 적어도 700uM, 적어도 1mM, 적어도 2mM, 적어도 3mM, 적어도 4mM, 적어도 5mM, 적어도 6mM, 적어도 7mM, 적어도 8mM, 적어도 9mM 또는 적어도 10mM이다. 일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 EC50은 적어도 1mM이다. 일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 조작된 수용체의 EC50은 적어도 3mM이다. 일부 실시태양에서, 아세틸콜린에 대한 더 높은 EC50을 갖는 것은 아세틸콜린의 생리학적 농도의 존재에서 상당한 양의 전류를 세포로 통과시키지 않고 세포에서 또는 세포 표면에서 조작된 수용체의 더 높은 발현 수준을 허용한다.
일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능은 비천연 리간드에 대한 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능과 거의 동일하다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능은 비천연 리간드에 대한 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능보다 더 높다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 효능은 비천연 리간드에 대해 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능보다 적어도 약 1.5배이다. 일부 실시태양에서, 효능을 결정하는 것은 본 발명의 실시예 2에 기술된 바와 같이 YFP 형광 소광을 사용하는 세포 리포터 검정에 기초하여 EC50을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 EC50은 1nM 미만, 2nM 미만, 3nM 미만, 4nM 미만, 5nM 미만, 6nM 미만, 7nM 미만, 8nM 미만, 9nM 미만, 10nM 미만, 15nM 미만, 20nM 미만, 30nM 미만, 40nM 미만, 50nM 미만, 60nM 미만, 70nM 미만 nM, 80nM 미만, 90nM 미만, 100nM 미만, 150nM 미만, 200nM 미만, 300nM 미만, 400nM 미만, 500nM 미만, 600nM 미만, 700nM 미만, 800nM 미만, 900nM 미만, 1uM 미만, 2uM 미만, 3uM 미만, 4uM 미만, 5uM 미만, 6uM 미만, 7uM 미만, 8uM 미만, 9uM 미만 또는 10uM 미만이다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 EC50은 10nM 미만이다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 EC50은 100nM 미만이다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드에 대한 조작된 수용체의 EC50은 1uM 미만이다.
일부 실시태양에서, 비천연 리간드의 존재하에서 조작된 수용체의 효능은 비천연 리간드의 존재하에서 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능보다 더 높다. 일부 실시태양에서, 비천연 리간드의 존재하에서 조작된 수용체의 효능은 비천연 리간드의 존재하에서 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)의 효능보다 적어도 약 1.5배(예를 들어, 그 사이에 있는 모든 하위 범위와 값을 포함하는 약 2배 낮음, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 12배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배 또는 약 100배)이다. 일부 실시태양에서, 효능을 결정하는 것은 비천연 리간드의 존재하에서 시험관 내에서 조작된 수용체를 통과하는 전류의 양을 결정하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 대상 리간드-개폐 이온 통로는 하나 이상의 비-탈감작성 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 리간드-개폐 이온 통로와 관련하여 사용될 때, "탈감작화"는 효현제의 장기적 존재하에서 이온 흐름의 진행성 감소를 지칭한다. 이는 리간드에 대한 뉴런 효능의 진행성 상실을 초래한다. 비-탈감작성 돌연변이는 LGIC가 리간드에 대해 탈감작화되는 것을 방지함으로써, 뉴런이 리간드에 대해 덜 반응성 또는 비반응성이 되는 것을 방지하는 아미노산 돌연변이를 의미한다. 비-탈감작성 돌연변이는 돌연변이를 운반하는 LGIC를 뉴런 내로 도입함으로써 그리고 리간드에 대한 장기간의 노출 동안 시간에 따른 전류 흐름을 분석함으로써 용이하게 확인될 수 있다. LGIC가 비-탈감작성 돌연변이를 포함하지 않는다면, 전류는 연장기간의 노출 동안 피크로부터 정적 상태로 회복되는 반면, LGIC가 비-탈감작성 돌연변이를 포함한다면, 전류는 리간드에 대한 노출의 지속기간 동안 피크 흐름에 남아있을 것이다. 탈감작을 초래하는 예시적인 아미노산 돌연변이는 인간 GlyRα1에서의 V322L 돌연변이(신호 펩타이드를 제거하기 위해 전-단백질의 가공 후 V294L)를 포함한다. LGIC 탈감작화, LGIC의 탈감작화를 측정하는 방법, 및 비-탈감작성인 돌연변이는 당업계에 잘 공지되어 있다; 예를 들어, Gielen et al. Nat Commun 2015 Apr 20, 6:6829, 및 Keramidas et al. Cell Mol Life Sci. 2013 Apr;70(7):1241-53을 참조하고, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 양태에서, 대상 리간드-개폐 이온 통로는 하나 이상의 전환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 돌연변이는 아미노산 치환이다. 전환 돌연변이는 비천연 이온, 즉, 통과하는 것이 자연적으로 가능하게 되지 않는 이온의 전도도에 허용적이 되도록, LGIC의 이온 기공 도메인의 투과성을 변화시키는 돌연변이를 의미한다. 일부 경우에, 돌연변이는 양이온으로부터 음이온으로 투과성을 전환시키며, 예를 들어, 인간 α7-nAChR에서 아미노산 잔기 260 내지 281(CHRNA7)(EKISLGITVLLSLTVFMLLVAE, SEQ ID NO: 34) 또는 다른 양이온-허용적 LGIC에서 대응하는 아미노산의 펩타이드 서열 PAKIGLGITVLLSLTTFMSGVAN(SEQ ID NO: 35)로의 대체이다. 일부 경우에, 돌연변이는 양이온으로부터 음이온으로 투과성을 전환시키며, 예를 들어, GLRA1의 아미노산 잔기 279 또는 다른 음이온-허용적 LGIC에서 대응하는 아미노산의 글루탐산(E)으로의 치환, (GLRA1에서 A293E 치환은 LGIC를 음이온-허용적으로부터 칼슘-투과성으로 전환시킴), 또는 GLRA1의 아미노산 잔기 278 또는 다른 양이온-허용적 LGIC에서 대응하는 아미노산의 결실, GLRA1의 아미노산 잔기 279 또는 다른 음이온-허용적 LGIC에서 대응하는 아미노산의 글루탐산(E)으로의 치환, 및 GLRA1의 아미노산 잔기 293 또는 다른 음이온-허용적 LGIC에서 대응하는 아미노산의 발린(V)으로의 치환(GLRA1에서 P278, A279E, T293V는 LGIC를 음이온-허용적으로부터 양이온-허용적으로 전환시킴)이다.
본 명세서에 기술된 것 이상의 추가적인 조작된 수용체는 시험관 내 선별 및 검증 방법에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시태양에서, 모 수용체 돌연변이체의 라이브러리는 제한된 수의 모 수용체로부터 생성된다. 모 수용체는 오류 유발 PCR을 포함하는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 돌연변이될 수 있다. 일부 실시태양에서, 이어서, 모 수용체 돌연변이체의 라이브러리는 효모 또는 포유류 세포에 형질감염되고 기능성 수용체를 확인하기 위해(예를 들어, 리간드에 반응하여 신호전달할 수 있는 모 수용체를 확인하기 위해) 고속대량(high throughput)으로 선별된다. 일부 실시태양에서, 이어서, 이런 1차 선별에서 확인된 기능성 모 수용체 돌연변이체는 포유류 세포에서 발현되고, 예를 들어, 플레이트 판독기 및/또는 본 명세서에 기재된 전기생리학 분석에 의해 리간드에 대한 효능에 대해 선별된다. 이어서, 효현제 리간드에 대해 증가된 결합 친화도를 입증하거나, 제 2 선별에서 효현제로서 길항제 또는 조절제 리간드의 사용을 가능하게 하는 모 수용체 돌연변이체는 선별되고 추가적인 시험관 내 및/또는 생체내 검증 및 특성규명 분석을 통해 선택되고 운반될 수 있다. 이러한 선별 분석은 당업계에, 예를 들어 Armbruster, B.N. et al. (2007) PNAS, 104, 5163 내지 5168; Nichols, C.D. and Roth, B.L. (2009) Front. Mol. Neurosci. 2, 16; Dong, S. et al. (2010) Nat. Protoc. 5, 561-573; Alexander, G.M. et al. (2009) Neuron 63, 27-39; Guettier, J.M. et al. (2009) PNAS 106, 19197-19202; Ellefson J.W. et al. (2014) Nat Biotechnol. 32(1):97-101; Maranhao AC and Ellington AD. (2017) ACS Synth Biol. 20;6(1):108-119; Talwar S et al. (2013) PLoS One;8(3):e58479; Gilbert D.F. et al. (2009) Front Mol Neurosci. 30;2:17; Lynagh and Lynch, (2010), Biol Chem. 14:285(20), 14890-14897; Islam R. et al. (2016) ACS Chem Neurosci. 21;7(12):1647-1657; 및 Myers et al. (2008) Neuron. 8:58(3): 362-373에 공지되어 있다.
이들 예시적인 조작된 수용체의 요약은 하기 표 3에 제공된다. 이들 수용체 각각은 표시된 아미노산 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
예시적인 조작된 수용체
명칭 서열
CODA71 SEQ ID NO: 33
CODA536 L131D, S172D in SEQ ID NO: 33
CODA534 L131S, S172D in SEQ ID NO: 33
CODA535 L131T, S172D in SEQ ID NO: 33
CODA807 Y115D, L131E in SEQ ID NO: 33
CODA806 Y115D, L131Q in SEQ ID NO: 33
CODA805 Y115D, S170T in SEQ ID NO: 33
CODA952 Y140I in SEQ ID NO: 33
CODA1025 R101F, L131G in SEQ ID NO: 33
CODA1027 R101F, L131D in SEQ ID NO: 33
CODA1039 Y115E, Y210W in SEQ ID NO: 33
CODA1045 R101W, Y210V in SEQ ID NO: 33
CODA1047 R101F, Y210V in SEQ ID NO: 33
CODA1048 R101F, Y210F in SEQ ID NO: 33
CODA1053 R101M, L131A in SEQ ID NO: 33
CODA1054 R101M, L131F in SEQ ID NO: 33
CODA1055 R101W, Y115E, Y210W in SEQ ID NO: 33
CODA1056 R101F, Y115E, Y210W in SEQ ID NO: 33
CODA1138 W77F, R101F, L131D in SEQ ID NO: 33
CODA1140 R101F, L131N, S172D in SEQ ID NO: 33
CODA1157 Q139E, S172D in SEQ ID NO: 33
CODA1173 S172D, Y210W in SEQ ID NO: 33
CODA965 Y140C in SEQ ID NO: 33
리간드
일부 실시태양에서, 본 발명의 리간드는 포유류 세포 상에서 공지된 작용 메커니즘을 갖는 외인성 약물 또는 화합물을 지칭한다(예를 들어, 수용체의 효현제, 길항제 또는 조절제로서 작용하는 것으로 알려짐). 이런 리간드는 "결합제"로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 리간드는 단백질, 지질, 핵산 및/또는 소분자를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 리간드는 특정 질환(예를 들어, 신경학적 질환)의 치료에서 임상용으로 미국 식품 의약국(US Food and Drug Administration: FDA)에 의해 승인된 약물 또는 화합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 임상용으로 FDA에 의해 승인되지 않았지만, 한 가지 이상의 임상 시험에서 시험된 약물 또는 화합물을 포함하고, 현재 한 가지 이상의 임상 시험에 시험 중이고/이거나 한 가지 이상의 임상 시험에 시험될 것으로 예상된다. 일부 실시태양에서, 리간드는 임상용으로 FDA에 의해 승인되지 않았지만, 실험실 연구에서 일상적으로 사용되는 약물 또는 화합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 앞서 언급한 리간드 중 하나의 유사체이다. 일부 실시태양에서, 리간드는 AZD0328, ABT-126, AQW-051, 칸나비다이올, 실란세트론, PH-399733, 파시니클린/RG3487/MEM-3454, TC-6987, 및 TC-5619/AT-101로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 리간드는 ABT-126, AZD-0328, RG3487, TC-6987, TC-6683, 바레니클린 및 TC-5619로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 리간드는 TC-5619이다.
특정 실시태양에서, 리간드는 이하의 화학식 2 내지 7 중 하나가 R 또는 S 거울상이성질체로 기재되는 바와 같은, 실란세트론의 유사체이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 효현제로서 작용한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "효현제"는 신호전달 반응을 유도하는 리간드를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 리간드는 길항제로서 작용한다. 용어 길항제는 본 명세서에서 신호전달 반응을 저해하는 리간드를 지칭하기 위해 사용된다.
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 AZD-0328이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 TC-6987이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 ABT-126이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 TC-5619/브라다니클린이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 TC-6683이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 바레니클린이다:
일부 실시태양에서, 리간드는 하기 화학식에 따른 파시니클린/RG3487이다:
본 명세서에 기술된 조작된 수용체 및 비-천연 리간드의 예시적인 조합이 하기 표 4에 제공된다. 표 4의 조작된 수용체 각각은 단백질, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 인간 α7-nAChR로부터 유도된 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 인간 글리신 수용체로부터 유래된 이온 기공 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이다. 일부 실시태양에서, 조작된 수용체는 표 4에 표시된 돌연변이를 제외하고 SEQ ID NO: 33과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다.
조작된 수용체 및 비-천연 리간드 조합의 비제한적 예
SEQ ID NO: 25에서 표시된 위치(들)에 해당하는 아미노산 치환(들)을 갖는 조작된 수용체 비천연 리간드 조작된 수용체의 비제한적인 예
L131D_S172D AZD-0328 CODA536
L131D_S172D 파시니클린 CODA536
Y115D_S170T 파시니클린 CODA805
Y115D_S170T TC-6987 CODA805
Y115D_L131Q AZD-0328 CODA806
Y115D_L131Q 파시니클린 CODA806
Y115D_L131Q TC-6987 CODA806
Y115D_L131E TC-5619 CODA807
Y115D_L131E AZD-0328 CODA807
Y115D_L131E 파시니클린 CODA807
Y115D_L131E TC-6987 CODA807
Y140I TC-5619 CODA952
Y140I 파시니클린 CODA952
Y140C TC-5619 CODA965
Y140C ABT-126 CODA965
Y140C TC-6987 CODA965
R101F_L131G TC-5619 CODA1025
R101F_L131G AZD-0328 CODA1025
R101F_L131G TC-6987 CODA1025
R101F_L131G 바레니클린 CODA1025
R101F_L131D TC-5619 CODA1027
R101F_L131D TC-6987 CODA1027
Y115E_Y210W TC-5619 CODA1039
Y115E_Y210W ABT-126 CODA1039
R101W_Y210V TC-5619 CODA1045
R101F_Y210V TC-5619 CODA1047
R101F_Y210F TC-5619 CODA1048
R101M_L131A TC-5619 CODA1053
R101M_L131A 바레니클린 CODA1053
R101M_L131F TC-5619 CODA1054
R101M_L131F 바레니클린 CODA1054
R101W_Y115E_Y210W TC-5619 CODA1055
R101F_Y115E_Y210W TC-5619 CODA1056
W77F_R101F_L131D ABT-126 CODA1138
S172D_Y210W ABT-126 CODA1173
조성물
본 발명은 또한 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)을 제공한다. 일부 실시태양에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 본 발명의 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 본 발명의 조작된 수용체(예를 들어, 리간드 개폐 이온 채널)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조성물은 본 발명의 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하고 본 발명의 조작된 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 AAV 벡터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 33을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및/또는 완충제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및/또는 완충제는 인간에서 사용하기에 적합하다.
이러한 부형제, 담체, 희석제 및/또는 완충제(함께 "약학적 비히클")는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 이들은 미연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 인간과 같은 포유류에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 비히클일 수 있다. 이러한 약학적 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일 및 물과 같은 액체일 수 있다. 약학적 비히클은 식염수, 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 유레아 등일 수 있다. 추가로, 보조제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 포유류에게 투여될 때, 본 발명의 화합물 및 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 비히클, 부형제 또는 희석제는 멸균일 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 화합물이 정맥내로 투여될 때 비히클로서 수성 매질, 예컨대 물, 식염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 사용된다.
약학적 조성물은 캡슐, 정제, 알약, 펠릿, 로젠지, 분말, 과립, 시럽, 엘릭시르, 용액, 현탁액, 에멀션, 좌약 또는 이들의 지속-방출 제형의 형태, 또는 포유류에 대한 투여에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 일부 예에서, 약학적 조성물은 인간에 대한 경구 또는 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 투여를 위해 제형화된다. 적합한 약학적 비히클 및 이의 제제화 방법의 예는 본 명세서에 참고로 포함되는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19th ed., 1995, Chapters 86, 87, 88, 91 및 92에 기술되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염을 포함한다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 공지되어 있으며 여기서 상세히 논의할 필요는 없다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 예를 들어, A. Gennaro, (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc를 포함하는 다양한 간행물에 충분히 기술되어 있다.
일부 실시태양에서, 약학적 조성물은 AAV 캡시드 폴리펩타이드 또는 AAV 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 액체를 용액, 현탁액 또는 둘 다에 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 액체 조성물은 겔을 포함한다. 일부 실시태양에서, 액체 조성물은 수성이다. 일부 실시태양에서, 조성물은 제자리 겔화가능한 수성 조성물, 예를 들어, 제자리 겔화가능한 수용액이다.
조성물의 비제한적 예는 약학적 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달과 양립가능한 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르, 분산 및 현탁 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보조 활성 화합물(예를 들어, 방부제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)도 조성물에 포함될 수 있다.
일부 실시태양에서, 약학적 조성물은 특정 투여 또는 전달 경로와 양립되도록 제제화된다. 따라서, 약학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
부형제의 선택은 특정 벡터에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제제가 있다.
예를 들어, 벡터는 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 보다 고차의 지방족 산의 에스터 또는 프로필렌 글리콜에서; 필요하다면, 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제와 함께 이들을 용해시키거나, 현탁시키거나, 유화시킴으로써 주사용 제제로 제제화될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 활성 화합물의 수성 및 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함한다. 제제는 일반적으로 무균이며 의도된 수용자의 혈액과 등장성일 수 있다. 비제한적인 예시적 예는 물, 식염수, 덱스트로스, 프룩토오스, 에탄올, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다.
공용매 및 보조제가 제제에 첨가될 수 있다. 공용매의 비제한적 예는 하이드록실 그룹 또는 다른 극성 그룹, 예를 들어 알코올, 예컨대 아이소프로필 알코올; 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 글리콜에터 등의 글리콜류; 글리세린; 폴리옥시에틸렌 알코올 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터를 포함한다. 보조제는 예를 들어 대두 레시틴 및 올레산과 같은 계면활성제; 소르비탄 트라이올레이트와 같은 소르비탄 에스터; 및 폴리바이닐피롤리돈을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어, 항산화제, 완충제, 정균제 및 의도된 수용인의 혈액과 등장성인 제제를 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액과 같이 비경구 투여에 적합하다. 제제는 단일-용량 또는 다회-용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에서 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 부형제, 예를 들어, 물, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 즉시 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 이전에 기재한 종류의 정제로부터 제조될 수 있다.
다른 예로서, 화합물은 (a) 액체 용액, 예컨대 물 또는 식염수와 같은 희석제에 용해된 유효량의 화합물; (b) 고체 또는 과립으로서, 사전결정된 양의 활성 성분을 각각 함유하는 캡슐, 향주머니 또는 정제; (c) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀션을 포함하는 경구 투여에 적합한 제제로 제제화될 수 있다. 정제 형태는 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 다른 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 향미제 및 약학적으로 적합한 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 박하 드롭스 제형은 향미제, 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트에 활성 성분뿐만 아니라 활성 성분 이외에 본 명세서에 기술된 부형제를 함유하는 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아와 같은 불활성 베이스, 에멀젼, 겔 등을 포함하는 향정을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단위 제형"은 인간 및 동물 대상에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 사전 결정된 양의 본 발명의 화합물을 함유한다. 본 발명의 신규한 단위 제형에 대한 세부사항은 사용되는 특정 화합물 및 달성되는 효과, 및 숙주에서 각각의 화합물과 연관된 약력학에 의존한다.
방법
본 발명의 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 이를 필요로 하는 대상에서 신경계 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 뉴런을 형질도입하기 위해 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 이종 핵산을 뉴런에 전달하기 위해 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 분석법에서 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 연구 도구로서 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 핵산 전달 도구로서 이용될 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 해마 뉴런을 형질도입한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입한다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터는 이종 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이종 핵산은 조작된 LGIC를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 조작된 LGIC를 활성화시키고, 차례로 표적 뉴런의 활성을 조절하고, 이에 따라 대상에서 신경 질환 또는 장애(예를 들어, 통증 또는 간질)를 치료하는 소분자 리간드/약물/효현제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, AAV 벡터는 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 유효량의 핵산을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 핵산은 본 발명의 조작된 LGIC 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 해마 뉴런으로 전달된다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 조작된 LGIC를 활성화시키고 차례로 표적 뉴런의 활성을 조절하고, 이에 따라 대상에서 초점 간질을 치료하는 소분자 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산 또는 조성물은 신경계 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 초점 간질, 정신분열증, 자폐증 스펙트럼 장애, 알츠하이머병, 레트 증후군 및 취약 X 증후군과 같은 해마 뉴런 조절장애와 관련된 신경계 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 초점 간질을 치료하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 정신분열증을 치료하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산 또는 조성물은 알츠하이머병을 치료하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 레트 증후군을 치료하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 취약 X 증후군을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명은 대상에서 간질을 제어, 관리, 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법을 부분적으로 고려한다. 일부 실시태양에서, 간질은 초점 간질이다. 일부 실시태양에서, 초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상에서 간질 발작의 수준을 개선하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상에서 간질 발작의 수준을 예방하거나 제어하기 위해 사용될 수 있다. 간질 발작은 강직-간대 발작, 강직 발작, 간대 발작, 근간대 발작, 결신 발작 또는 무긴장 발작으로 분류될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상이 경험한 간질 발작의 횟수 또는 주기를 이 사이의 모든 범위와 하위 범위를 포함하는 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상이 경험한 간질 발작의 횟수 또는 주기를 이 사이의 모든 범위와 하위 범위를 포함하는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상이 경험한 간질 발작의 수준 및/또는 지속기간을 이 사이의 모든 범위와 하위 범위를 포함하는 약 5%, 약 10%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대상이 경험한 간질 발작의 수준 및/또는 지속기간을 이 사이의 모든 범위와 하위 범위를 포함하는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다.
다양한 실시태양에서, 대상에서 간질(예를 들어, 초점 간질)을 제어, 관리, 예방 또는 치료하는 방법은 조작된 LGIC를 암호화하는 AAV 벡터 및/또는 핵산의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 대상의 간질을 완화시키기 위해 신경 활성을 조절하기 위해 본 발명에 개시된 조작된 LGIC를 암호화하는 벡터 및/또는 핵산을 사용하는 것을 고려한다.
다양한 실시태양에서, 신경 세포를 활성화시키거나 탈분극시키는 조작된 수용체를 암호화하는 조작된 LGIC를 암호화하는 벡터 및/또는 핵산은 간질을 조절하는 하나 이상의 신경 세포에 투여(또는 도입)된다. 리간드가 있는 경우 조작된 수용체를 발현하는 신경 세포가 활성화되어 간질에 대한 민감성을 감소시킨다.
일부 실시태양에서, 간질은 초점 간질(초점 간질 발작)이다. 초점 간질은 우세한 증상이 뇌의 한쪽 반구(절반)에 영향을 미치는 재발성 발작인 신경학적 상태이다.
초점 간질은 4가지 범주로 나뉜다: (a) 대상이 발작 동안 무슨 일이 일어나고 있는지 알고 있는 초점 인식 발작; (b) 대상이 혼란스러워하거나 발작 중에 무슨 일이 일어나고 있는지 모르거나 기억하지 못하는 초점 장애 인식 발작; (c) 경련, 경련, 손 비비기, 걸어다니기 등 대상이 어느 정도 움직이는 국소 운동 발작; 및 (d) 발작 중에 대상이 경련을 일으키거나 다른 움직임을 보이지 않는 국소 비운동 발작. 대신, 대상이 느끼거나 생각하는 방식에 변화를 일으킨다(예를 들어, 격렬한 감정, 이상한 느낌 또는 심장이 뛰는 느낌, 소름이 돋거나 열파 또는 한파와 같은 증상).
초점 간질은 뇌의 특정 부분(엽)에서 발생하는 발작을 특징으로 한다. 초점 간질은 특발성 위치 관련 간질(ILRE), 전두엽 간질, 측두엽 간질, 두정엽 간질 및 후두엽 간질을 포함한다.
특발성 국소화 관련 간질(ILRE)은 알려지지 않은 요인에 의해 유발된다.
전두엽 간질은 이마 뒤의 뇌 영역인 전두엽에서 시작되는 재발성 발작에 대한 용어이다.
측두엽 간질은 관자놀이와 광대뼈 뒤의 머리 측면에 위치한 뇌의 부분인 측두엽에서 시작되는 재발성 발작에 대한 용어이다. 측두엽 간질은 가장 일반적으로 발작을 일으키는 뇌 영역이다. 두 측두엽 간질의 근심 부분(중간)은 주로 발작의 원인인 간질에서 매우 중요하며 손상이나 흉터가 생기기 쉽다. 근심 측두엽 간질은 인간 간질의 가장 흔한 형태이다. 종종 병태생리학적 기질은 해마 경화증이다.
두정엽 간질. 두정엽은 머리의 상단과 측면에 있는 뇌의 부분이다. "연관 피질"로 알려진 두정엽은 뇌의 기능에 의미를 연결하는 역할을 한다. 뇌가 시각적 이미지를 생성하고, 소리가 단어로 인식되고, 촉각이 특정 대상과 연결되는 곳이 바로 두정엽이다. 어떤 면에서, 두정엽은 지각이 물리적 현실과 맞물리는 곳이다.
후두엽 간질. 후두엽 간질은 주로 시력을 담당하는 후두엽의 뇌 부분인 후두엽에서 시작되는 재발성 발작을 일컫는 용어이다.
본 발명의 일부 양태에서, AAV 벡터는 시험관 내에서 iPSC 유래 뉴런을 형질도입할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 시험관 내에서 iPSC 유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 대상에서 신경병성 통증, 예컨대 말초 신경병성 및 삼차 신경통을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상에게 유효량의 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 핵산은 본 발명의 조작된 LGIC 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 DRG 또는 TGG 뉴런으로 전달된다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 조작된 LGIC를 활성화시키고 차례로 표적 뉴런의 활성을 조절하고, 이에 따라 대상에서 말초 신경병성 및 삼차 신경통과 같은 신경병성 통증을 치료하는 소분자 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 신경 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산 또는 조성물은 신경병성 통증과 같은 DRG/TGG 신경 조절 이상과 관련된 신경 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 경직, 척수 손상 및 견열 손상과 같은 척수 관련 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 경직을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시태양에서, 경직을 치료하는 것은 척주에서 뉴런을 형질도입하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 척수 손상을 치료하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 벡터, 핵산, 또는 조성물은 견열 손상을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시태양에서, 척수 손상 또는 견열 손상을 치료하는 것은 후각에서 뉴런을 형질도입하는 것을 포함한다.
본 발명은 대상에서 통증을 제어하거나, 관리하거나, 예방하거나, 치료하기 위한 조성물 및 방법을 부분적으로 고려한다. 일부 실시태양에서, 통증은 신경병성 통증이다. "통증"은 대상 신체에서의 불편한 느낌 및/또는 불쾌한 감각을 지칭한다. 통증의 느낌은 경증으로부터, 때때로 중증이며 변함없는 범위일 수 있다. 통증은 급성 통증 또는 만성 통증으로서 분류될 수 있다. 통증은 통각 수용 통증(즉, 조직 손상에 의해 야기되는 통증), 신경병성 통증 또는 심인성 통증일 수 있다. 일부 경우에, 통증은 질환(예를 들어, 암, 관절염, 당뇨병)에 의해 야기되거나 연관된다. 다른 경우에, 통증은 손상(예를 들어, 스포츠 상해, 외상)에 의해 야기된다. 본 명세서의 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 통증의 비제한적 예는 말초 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, 삼차 신경병증, 요통, 암과 연관된 신경병증, HIV/AIDS와 연관된 신경병증, 환각지 통증, 수근관 증후군, 뇌졸중 후 중추성 통증, 만성 알코올 사용 장애와 연관된 통증, 갑상선기능저하증, 요독증, 다발성 경화증과 연관된 통증, 척수손상과 연관된 통증, 파킨슨병과 연관된 통증, 간질, 골관절염 통증, 류머티즘성 관절염 통증, 내장 통증, 및 비타민 결핍증과 연관된 통증을 포함하는 신경병성 통증; 및 중추 신경계 외상과 연관된 통증을 포함하는 통각 수용 통증, 좌상/염좌, 및 화상; 심근경색증, 급성 췌장염, 수술 후 통증, 외상 후 통증, 신산통, 암과 연관된 통증, 섬유근육통과 연관된 통증, 수근관 증후군과 연관된 통증 및 요통을 포함한다.
본 명세서의 조성물 및 방법은 대상에서의 통증 수준을 개선시키는 데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 대상에서의 통증 수준은 이 사이의 모든 범위와 하위 범위를 포함하는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%만큼 개선된다. 대상에서의 통증 수준은 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 경우에, 통증 수준은 자기 보고에 의해 평가된다(즉, 인간 대상는 그/그녀가 경험 중인 통증 수준의 언어적 보고를 표현한다). 일부 경우에, 통증 수준은, 예를 들어, 얼굴 표정, 사지 운동증, 발성, 안절부절 및 가딩(guarding)의 통증 거동 지표에 의해 평가된다. 이런 유형의 평가는, 예를 들어, 대상가 자기 보고를 할 수 없을 때(예를 들어, 영어, 무의식 대상, 비인간 대상), 유용할 수 있다. 통증 수준은 본 발명의 조성물로 치료 후의 통증 수준을 본 발명의 조성물로 치료 전에 대상가 경험한 통증 수준에 비교하여 평가될 수 있다.
다양한 실시태양에서, 대상에서의 통증을 제어하거나, 관리하거나, 예방하거나, 치료하기 위한 방법은 대상에게 유효량의 본 발명의 조작된 LGIC를 암호화하는 AAV 벡터 및/또는 핵산을 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되는 것을 원하는 일 없이, 본 발명은 대상에서 통증을 완화시키는 뉴런 활성을 조절하기 위해 본 명세서에 개시된 조작된 LGIC를 암호화하는 벡터 및/또는 핵산을 사용하는 것을 고려한다.
다양한 실시태양에서, 뉴런 세포를 활성화시키거나 탈분극화시키는 조작된 수용체를 암호화하는 벡터 및/또는 조작된 LGIC를 암호화하는 핵산은 통증감각을 감소시키는 하나 이상의 뉴런 세포, 예를 들어, 저해 개재뉴런에 투여된다(또는 이에 도입된다). 리간드의 존재하에서, 조작된 수용체를 발현시키는 뉴런 세포는 활성화되고, 이들 뉴런 세포를 자극하는 진통 효과를 강화시키는 통증에 대한 민감도를 감소시킨다.
다양한 실시태양에서, 뉴런 세포를 비활성화시키거나 과분극화시키는 조작된 수용체를 암호화시키는 벡터는 통증감각 또는 통증에 대한 민감도, 예를 들어, 통증수용체, 말초 감각 뉴런, C-섬유, Aδ 섬유, Aβ 섬유, DRG 뉴런, TGG 뉴런 등을 증가시키는 하나 이상의 뉴런 세포에 투여된다(또는 도입된다). 리간드의 존재하에서, 조작된 수용체를 발현시키는 뉴런 세포는 비활성화되고 통증에 대한 민감도를 감소시키며 진통 효과를 강력하게 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 통증을 감소시키는 데 효과적이다. 본 발명의 벡터, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 통증의 예시적인 예는 급성 통증, 만성 통증, 신경병성 통증, 통각 수용 통증, 이질통, 염증성 통증, 염증성 통각과민, 신경병증, 신경통, 당뇨병성 신경병증, 인간 면역결핍 바이러스-관련 신경병증, 신경손상, 류머티즘성 관절염 통증, 골관절염 통증, 화상, 요통, 눈 통증, 내장 통증, 암 통증(예를 들어, 골암 통증), 치통, 두통, 편두통, 수근관 증후군, 섬유근육통, 신경통, 좌골신경통, 골반 과민성, 골반 통증, 대상포진 후 신경통, 수술 후 통증, 뇌졸중 후 통증 및 월경통을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
통증은 급성 또는 만성으로서 분류될 수 있다. "급성 통증"은 갑자기 시작되며 보통 성질이 급격한 통증을 지칭한다. 급성 통증은 경증이고 잠시 동안 지속될 수 있거나, 중증이고 몇 주 또는 몇 개월 동안 지속될 수 있다. 대부분의 경우에, 급성 통증은 3개월 이상 지속되지 않으며, 통증의 기저 원인이 치료되거나 치유될 때 사라진다. 그러나, 변함없이 계속되는 급성 통증은 만성 통증을 야기할 수 있다. "만성 통증"은 급성 질병 또는 손상의 보통의 과정을 지나서 지속되거나 또는 3개월 초과 내지 6개월 동안 지속되고, 개인의 웰빙에 유해하게 영향을 미치는, 진행성 또는 재발성 통증을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 용어 "만성 통증"은 통증이 지속되어서는 안 될 때 지속되는 통증을 지칭한다. 만성 통증은 통각 수용 통증 또는 신경병성 통증일 수 있다.
일부 실시태양에서, 통증은 손상, 감염 또는 의학적 개입과 관련하여 또는 그 결과로서 발생할 것으로 예상되거나 예측된다. 일부 실시태양에서, 감염은 신경 손상을 야기한다. 일부 실시태양에서, 의학적 개입은 신체의 중앙 코어에 대한 수술과 같은 수술이다. 일부 실시태양에서, 의학적 개입은 신체의 하나 이상의 조직, 종양 또는 기관의 일부 또는 전체를 제거하기 위한 수술이다. 일부 실시태양에서, 의학적 개입은 절단이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 급성 통증을 감소시키는 데 효과적이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 만성 통증을 감소시키는 데 효과적이다.
임상 통증은 환자의 증상 중에 불편함 및 비정상적 민감도를 특징으로 할 때 존재한다. 개체는 다양한 통증 증상이 존재할 수 있다. 이러한 증상은 1) 둔탁함, 작열감 또는 찌름통일 수 있는 자발적 통증; 2) 유해 자극(통각과민)에 반응한 지나친 통증; 및 3) 정상적으로는 무해한 자극에 의해 생성된 통증을 포함한다(allodynia-Meyer et al., 1994, Textbook of Pain, 13-44). 다양한 형태의 급성 및 만성 통증을 앓고 있는 통증이 유사한 증상을 가질 수 있지만, 기저 메커니즘은 상이할 수 있고, 따라서, 상이한 치료 전략이 필요할 수 있다. 따라서 통증은 또한 통각 수용 통증, 염증성 통증, 및 신경병성 통증을 비롯한 상이한 병리 생리학에 따른 다수의 상이한 하위유형으로 나누어질 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 유해수용성 통증을 감소시키는 데 효과적이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 염증성 통증을 감소시키는 데 효과적이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신경병성 통증을 감소시키는 데 효과적이다.
유해수용성 통증은 조직 손상에 의해 또는 손상을 야기할 가능성이 있는 강한 자극에 의해 유도된다. 중등증 내지 중증의 급성 통각 수용 통증은 중추 신경계 외상, 좌상/염좌, 화상, 심근경색증 및 급성 췌장염으로부터의 통증, 수술 후 통증(임의의 유형의 수술적 절차 후의 통증), 외상 후 통증, 신산통, 암 통증 및 요통의 두드러진 특징이다. 암 통증은 만성 통증, 예컨대 종양 관련 통증(예를 들어, 뼈 통증, 두통, 안면통 또는 내장 통증) 또는 암요법과 연관된 통증(예를 들어, 화학요법 후 증후군, 만성 수술 후 통증 증후군 또는 방사선 치료 후 증후군)일 수 있다. 암 통증은 또한 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 방사선요법에 반응하여 생길 수 있다. 요통은 헤르니아 또는 파열된 추간판 탈출증 또는 허리뼈면관절의 이상, 천장 관절, 척추주위근 또는 후종인대에 기인할 수 있다. 요통은 자연적으로 해결될 수도 있지만, 일부 환자에서, 12주 이상 지속되는 경우, 특히 쇠약하게 될 수 있는 만성 병태가 될 수 있다.
신경병성 통증은 신경계에서 원발진 또는 기능장애에 의해 개시되거나 야기되는 통증으로서 정의될 수 있다. 신경병성 통증의 병인은, 예를 들어, 말초 신경병증, 당뇨병성 신경병증, 대상포진 후 신경통, 삼차 신경병증, 요통, 암 신경병증, HIV 신경병증, 환각지 통증, 수근관 증후군, 뇌졸중 후 중추성 통증 및 만성 알코올 사용 장애와 연관된 통증, 갑상선기능저하증, 요독증, 다발성 경화증, 척수손상, 파킨슨병, 간질 및 비타민 결핍증을 포함한다.
신경병성 통증은 통증 장애, 질환에 관한 용어, 통증과 연관되거나 통증에 의해 야기되는 장애 또는 병태와 관련될 수 있다. 통증 장애의 예시적인 예는 관절염, 이질통, 전형적인 삼차 신경병증, 삼차 신경병증, 신체형 장애, 감각저항, 통각과민, 신경통, 신경통, 신경원성 통증, 무통증, 유통성 지각마비, 작열통, 궁둥신경 통증 장애, 퇴행성 관절 장애, 섬유근육통, 내장 질환, 만성 통증 장애, 편두통/두통 통증, 만성 피로 증후군, 복합부위 통증 증후군, 신경영양장애, 족저 근막염 또는 암과 연관된 통증을 포함한다.
일부 실시태양에서, 신경병성 통증은 말초 신경병증이다. 말초신경병증은 메시지를 뇌와 척수로부터 신체의 나머지 부분에 전달하는 신경이 손상되거나 질병에 걸린 상태를 지칭한다. 다양한 종류의 말초 신경병증은 수근관 증후군(컴퓨터 사용과 같이 손과 손목을 만성적으로 반복적으로 사용한 후 흔히 발생하는 외상성 손상)에서 당뇨병과 관련된 신경 손상에 이르기까지 다양하다. 일반적으로, 말초신경병증은 단일신경병증과 다발신경병증으로 분류할 수 있다. 단일 신경병증은 수근관 증후군, 척골 신경 마비, 요골 신경 마비 및 비골 신경 마비를 포함한다. 다발신경병증은 몸 전체의 여러 말초 신경이 동시에 기능 장애를 일으킬 때 발생한다. 다발신경병증은 알코올 남용, 영양 부족(특히 비타민 B 결핍), 암이나 신부전과 같은 질병으로 인한 합병증과 같은 특정 독소에 대한 노출을 포함하여 매우 다양한 원인을 가질 수 있다. 만성 다발신경병증의 가장 흔한 형태 중 하나는 당뇨병 환자에게 발생하는 상태인 당뇨병성 신경병증이다. 혈당 수치가 잘 조절되지 않는 사람들에게 더 심각하다. 흔하지는 않지만, 당뇨병은 또한 단일신경병증을 유발할 수 있다. 가장 심각한 다발신경병증 중 하나는 길랭-바레 증후군으로, 신체의 면역 체계가 척수를 떠나는 즉시 신체의 신경을 공격할 때 갑자기 발생하는 희귀 질환이다. 증상은 빠르게 나타나고 빠르게 악화되는 경향이 있으며 때로는 마비로 이어진다. 초기 증상은 쇠약과 따끔거림을 포함하며 결국에는 팔 위쪽으로 퍼질 수 있다. 혈압 문제, 심장 박동 문제 및 호흡 곤란이 더 심한 경우에 발생할 수 있다. 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP)은 증상이 수개월, 심지어 수년 동안 지속되는 만성 형태의 길랭-바레이다. 조기 진단 및 치료는 CIDP 환자에게 매우 중요하며, 그 중 30%는 결국 휠체어에 갇힐 위험이 있다.
일부 실시태양에서, 신경병성 통증은 삼차 신경통이다. 유통성 틱(tic douloureux)이라고도 하는 삼차 신경통(TN)은 머리에서 가장 널리 분포하는 신경 중 하나인 삼차 신경 또는 제5 뇌신경에 영향을 미치는 만성 통증 상태이다. 삼차신경은 머리에 있는 뇌신경의 한 세트이다. 얼굴에 감각을 전달하는 신경이다. 하나의 삼차 신경은 머리의 오른쪽으로 지나고 다른 하나는 왼쪽으로 지난다. 이 신경들 각각은 세 개의 뚜렷한 가지가 있다. 삼차 신경은 뇌를 떠나 두개골 내부로 이동한 후 얼굴 전체의 감각을 조절하는 세 개의 작은 가지로 나뉜다: 안신경(V1): 첫 번째 가지는 사람의 눈, 윗 눈꺼풀 및 이마의 감각을 조절한다. 상악신경(V2): 두 번째 가지는 아래 눈꺼풀, 뺨, 콧구멍, 윗입술 및 윗잇몸의 감각을 조절한다. 하악 신경(V3): 세 번째 분지는 턱, 아랫입술, 아랫 잇몸 및 씹는 데 사용되는 일부 근육의 감각을 조절한다.
TN은 신경병성 통증의 한 형태이다. 장애의 전형적인 또는 "고전적인" 형태("유형 1" 또는 TN1이라고 함)는 에피소드당 몇 초에서 길게는 2분까지 지속되는 극심한, 산발적, 갑작스러운 작열감 또는 쇼크와 같은 안면 통증을 유발한다. 이러한 발작은 2시간 동안 지속되게 일제히 빠르게 연속적으로 발생할 수 있다. 장애의 "비정형" 형태("유형 2" 또는 TN2라고 함)는 유형 1보다 다소 낮은 강도의 지속적인 쑤심, 작열감, 찌르는 듯한 통증을 특징으로 한다. 두 형태의 통증은 같은 사람에게 때로는 동시에 발생할 수 있다. 통증의 강도는 육체적으로나 정신적으로 무력화시킬 수 있다. TN은 다양한 조건과 관련이 있다. TN은 삼차 신경이 뇌간을 나갈 때 혈관이 삼차 신경을 압박하여 발생할 수 있다. 이 압박이 신경 주변의 보호 코팅(수초)을 마모시키거나 손상시킨다. TN 증상은 삼차 신경의 수초를 악화시키는 질환인 다발성 경화증 환자에게서도 발생할 수 있다. 드물게 TN의 증상은 종양으로 인한 신경 압박 또는 동정맥 기형이라고 하는 동맥과 정맥의 엉킴으로 인해 발생할 수 있다. 삼차 신경 손상(아마도 부비동 수술, 구강 수술, 뇌졸중 또는 안면 외상의 결과)도 신경병성 안면 통증을 유발할 수 있다.
염증 과정은 조직손상 또는 종창 및 통증을 초래하는 외래 물질의 존재에 반응하여 활성화된 복잡한 일련의 생화학적 및 세포의 사건이다. 관절 통증은 통상적인 염증성 통증이다.
본 발명의 벡터, 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 다른 유형의 통증은 근육통, 섬유근육통, 척추염, 혈청-음성(비-류머티즘성) 관절병증, 관절주위 류머티즘, 근이영양증, 글리코겐 분해, 다발근염 및 화농성근염을 포함하는 근골격 장애; 협심증, 심근경색증, 승모판막 협착증, 심낭염, 레이노 현상, 경화부종 및 골격근 허혈에 의해 야기된 통증을 포함하는 심장 및 혈관 통증; 두통, 예컨대 편두통(전구증을 동반한 편두통 및 전구증이 없는 편두통을 포함), 군발성 두통, 긴장성 두통 혼합 두통 및 혈관 장애와 연관된 두통; 및 치통, 귀 통증, 구강 작열감 증후군, 및 턱관절 근막통증을 포함하는 구강안면 통증으로부터 초래된 통증을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
인간 대상에 의해 경험된 통증의 양을 감소시키기 위한 본 발명의 유효량의 조성물 및 방법은 다양한 통증 척도를 이용하여 결정될 수 있다. 환자 자신의 보고는 통증이 감소되는지의 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있다; 예를 들어, Katz and Melzack (1999) Surg. Clin. North Am. 79:231 참조. 대안적으로, 관찰 통증 척도가 사용될 수 있다. LANSS 통증 척도는 통증이 감소되는지의 여부를 평가하기 위해 사용될 수 있다; 예를 들어, Bennett (2001) Pain 92:147 참조. 시각 아날로그 통증 척도가 사용될 수 있다; 예를 들어, Schmader (2002) Clin. J. Pain 18:350 참조. 리커트(Likert) 통증 척도가 사용될 수 있으며; 예를 들어, 0은 통증 없음이며, 5는 중등증의 통증이고, 10은 가능한 최악의 통증이다. 아동에 대한 자기-보고 통증 척도는, 예를 들어, 안면 통증 척도; 왕-베이커(Wong-Baker) 안면 통증 평정 척도; 및 색 아날로그 척도(Colored Analog Scale)를 포함한다. 성인에 대한 자기-보고 통증 척도는, 예를 들어, 시각 아날로그 척도; 언어 수치 평정척도; 언어 기술자 척도; 및 통증 평가 설문지를 포함한다. 통증 측정 척도는, 예를 들어, 앨더 헤이 환자분류 통증 스코어(Alder Hey Triage Pain Score)(Stewart et al. (2004) Arch. Dis. Child. 89:625); 행동 통증 척도(Payen et al. (2001) Critical Care Medicine 29:2258); 통증 평가 설문지(Cleeland and Ryan (1994) Ann. Acad. Med. Singapore 23: 129); 비언어적 통증 지표의 체크리스트(Feldt (2000) Pain Manag. Nurs. 1 : 13); 집중 치료 시 통증 관찰 점수(Critical-Care Pain Observation Tool)(Gelinas et al. (2006) Am. J. Crit. Care 15:420); COMFORT 척도(Ambuel et al. (1992) J. Pediatric Psychol. 17:95); 댈러스 통증 설문지(Dallas Pain Questionnaire)(Ozguler et al. (2002) Spine 27:1783); 통각계 통증 지표(Hardy et al. (1952) Pain Sensations and Reactions Baltimore: The Williams & Wilkins Co.); 안면 통증 척도 - 수정(Hicks et al. (2001) Pain 93:173); 얼굴 다리 활동 울음 마음 안정도 척도(Face Legs Activity Cry Consolability Scale); McGill Pain Questionnaire (Melzack (1975) Pain 1 :277); 기술자 차별 척도(Descriptor Differential Scale)(Gracely and Kwilosz (1988) Pain 35:279); 수치적 1 1점 박스(Jensen et al. (1989) Clin. J. Pain 5: 153); 수치적 평정 척도(Hartrick et al. (2003) Pain Pract. 3:310); 왕-베이커 얼굴 통증 평정 척도; 및 시각 아날로그 척도(Huskisson (1982) J. Rheumatol. 9:768)를 포함한다.
일부 실시태양에서, 대상의 통증을 완화하는 방법이 제공되며, 이 방법은 AAV 벡터에 의해 암호화되는 조작된 LGIC를 뉴런 세포에 도입하는 본 발명의 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV 벡터를 투여하고 조작된 수용체를 활성화하는 유효량의 리간드를 제공함으로써 세포의 활성을 제어하여, 대상의 통증을 완화시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 비표적(off-target) 효과, 예컨대 일반적 중추 신경계 우울증이 없는 통증에 대한 상당한 무통증을 제공한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 비치료 대상에 비해 대상에서의 신경병성 통증의 이 사이의 모든 범위와 하위 범위 포함하는 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 감소를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 리간드의 투여 전에 및 후에 대상에서의 통증을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 대상의 통증은 모든 범위와 그 사이의 하위 범위 포함하는 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 감소된다. 이러한 예에서, 측정하는 단계는 리간드 투여 4시간 이상 후에, 예를 들어, 리간드 투여 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일 또는 4일 이상 후에 일어날 수 있다.
일부 경우에, 조성물 및 방법은 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 위식도 역류병(GERD), 중독(예를 들어, 알코올, 약물), 불안, 우울증, 기억 상실, 치매, 수면 무호흡증, 뇌졸중, 요실금, 기면증, 수전증, 운동장애, 심방 세동, 암(예를 들어, 뇌종양), 파킨슨병, 또는 알츠하이머병을 치료하는 데 이용된다. 본 명세서의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 신경학적 질환 또는 장애의 다른 비제한적 예는 무의지증, 실서증, 알코올 사용 장애, 난독증, 동맥류, 일과성 흑암시, 기억상실증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 엔젤만 증후군, 실어증, 실행증, 거미막염, 아놀드키아리 기형, 아스퍼거 증후군, 운동실조, 운동실조-모세혈관확장증, 주의력 결핍 과잉행동장애, 청각 정보 처리 장애, 자폐 스펙트럼, 조울증, 벨마비, 상완신경총손상, 뇌손상, 뇌 상해, 뇌 종양, 카나반 병, 카크라스 망상, 수근관 증후군, 작열통, 중추 통증 증후군, 중심뇌교수초용해, 중심핵근육병증, 뇌장애, 뇌l 동맥류, 뇌동맥 경화증, 뇌 위축증, 피질하 경색과 백질뇌증을 동반하는 상염색체 우성 뇌동맥질환(CADASIL), 대뇌성 거인증, 뇌성마비, 대뇌의 혈관염, 경추관 협착증, 샤르코마리투스병, 키아리 기형, 무도병, 만성 피로 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 통증, 코핀-루우리 증후군, 혼수, 복합부위 통증 증후군, 압박 신경병증, 선천성 안면마비, 피질기저퇴화, 측두동맥염, 두개골유합증, 크로이츠펠트-야콥병, 누적 외상성 질환, 쿠싱 증후군, 순환성 장애, 거세포봉입체증(CIBD), 사이토메갈로바이러스 감염, 댄디-워커 증후군, 도슨병, 드 모르시에르 증후군(De Morsier's 증후군), 데저린-클룸프케 마비, 데제린-소타스병, 수면위상지연 증후군, 치매, 피부근육염, 발달성 운동조절장애, 당뇨병성 신경병증, 광범위경화증, 복시, 다운 증후군, 드라베 증후군, 뒤쉔 근육 영양장애, 마비성 말장애, 자율신경 실조증, 난산증, 난필증, 이상운동증, 난독증, 근긴장이상, 빈안장 증후군, 뇌염, 뇌류, 뇌삼차신경 혈관종증, 유분증, 야뇨증, 간질, 여성에서의 간질-지적장애, 에르브 마비, 피부홍통증, 폭발성 머리 증후군, 파브리병, 파르 증후군, 실신발작, 가족성 경련성 마비, 열성 발작, 피셔 증후군, 프레드릭 운동실조, 섬유근육통, 포비유 증후군, 태아 알코올 증후군, 취약 X 증후군, 취약 X-연관 떨림/운동실조 증후군(FXTAS), 고셰병, 열성 경련 플러스를 동반한 전신 간질, 게르스트만 증후군, 거대세포성 동맥염, 거대세포 봉입체병, 글로보이드 세포 로이코디스트로피, 회백질 이소성, 길랑-바레 증후군, 전신 불안 장애, HTLV-1 연관 척수병, 할러포르덴-스파츠병, 두부외상, 두통, 얼굴떨림, 유전성 강직성 하반신마비, 유전성 혈관운동 신경성 유종, 귀 대상포진, 대상포진, 히라야마 증후군, 히르슈슈프룽병, 홀메스-아디 증후군, 전전뇌증, 헌팅턴병, 수두무뇌증, 수두증, 고코티솔증, 저산소증, 면역-매개 뇌척수염, 봉입체 근염, 색소실조증, 영아 레프섬병, 소아경련, 염증성 근육병증, 두개내 낭종, 두개내압 항진, 쌍중심절 15, 쥬베르 증후군, 카락 증후군, 컨스-세이어 증후군, 킨스본 증후군, 클라인-레빈 증후군, 클리펠 파일 증후군, 크라베병, 라포라병, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 랜도-클레프너 증후군, 측두외측(발렌베르크) 증후군, 학습장애, 라이병, 레녹스-가스토 증후군, 레쉬-니한 증후군, 백색질형성장애, 백질퇴행성백질뇌증, 루이소체 치매, 뇌회결손, 락트-인 증후군, 허리원반질환, 요추관협착증, 라임병 - 신경성 후유증, 마카도-조셉병(척수소뇌 운동실조 3형), 큰뇌증, 대시증, 상륙증후군, 피질 낭종을 동반한 거대뇌성 백질뇌병증, 대뇌증, 육아종성 구순염 증후군, 메니에르병, 뇌수막염, 멩케증후군, 이염소체 백색질형성장애, 소두증, 소시증, 편두통, 밀러 피셔 증후군, 미니-뇌졸중(일과성 허혈성 발작), 청각과민증, 사립체성 근육병증, 뫼비우스 증후군, 단지 근위축증, 운동 기술 장애, 모야모야병, 뮤코다당증, 다발-경색성 치매, 다초점성 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다계통 위축, 근이영양증, 근육통성 뇌척수염, 중증근무력증, 수초탈락성 광범위경화증, 영아의 근간대성 뇌병증, 근육간대경련, 근육병, 근세관성 근육병, 선천성 근강직증, 기면증, 뉴로-베체트병, 신경섬유종증, 신경이완제 악성 증후군, AIDS의 신경학적 증상, 루푸스의 신경성 후유증, 신경근육긴장증, 신경지방갈색소증, 신경세포이동장애, 신경병증, 신경증, 니만-픽병, 비-24시간 수면각성장애, 비언어적 학습장애, 오셜리반-맥러드 증후군, 후두신경통, 척추 잠재 유합부전 연쇄, 오타하라 증후군, 척수소뇌 변성증, 안구운동 근육간대경련 증후군, 시신경염, 기립성 저혈압, 귀경화증, 과용 증후군, 반복시, 지각이상증, 파킨슨병, 선천성 이상근긴장증, 방종양성 질환, 발작성 공격, 페리-롬버그 증후군, PANDAS, 펠리제우스-메르츠바하병, 주기성 마비, 말초 신경병증, 전반적 발달장애, 빛 재채기 반사, 피탄산축적병, 픽병, 신경압박, 뇌하수체 종양, PMG, 다발신경병증, 소아마비, 다왜소뇌회증, 다발근염, 공뇌증, 소아마비후 증후군, 대상포진 후 신경통(PHN), 기립성 저혈압, 프래더-윌리 증후군, 원발성 측삭 경화증, 프리온병, 진행성 반얼굴 위축, 진행성 다초점 백질뇌병증, 진행성 핵상성 마비, 안면실인증, 가뇌종양, 사분맹, 사지마비, 광견병, 신경근병증, 램지 헌트 증후군 I형, 램지 헌트 증후군 II형, 램지 헌트 증후군 III형, 라스무센 뇌염, 반사성 신경혈관 위축증, 레프섬병, 렘수면행동장애, 반복성 긴장 손상, 하지 불안 증후군, 레트로바이러스-연관 척수병, 레트 증후군, 레이 증후군, 규칙적 행동 장애, 롬베르그 증후군, 무도병, 샌드호프병, 쉴더병, 분열뇌증, 감각처리장애, 중격-시신경형성이상, 흔들린 아이 증후군, 대상 포진, 샤이-드래거 증후군, 쇼그렌 증후군, 수면무호흡증, 수면병, 배부름 재채기(Snatiation), 소토스 증후군, 경직, 이분척추, 척수손상, 척추종양, 척수성 근위축, 척추와 숨뇌근육 위축, 척수소뇌 운동실조, 분할, 스틸-리처드슨-올스제브스키 증후군, 전신근강직 증후군, 뇌졸증, 스터지-웨버 증후군, 말더듬, 아급성 경화성 범뇌염, 피질하 동맥경화 뇌병증, 표재성 철색소침착증, 시데남 무도병, 실신, 공감각, 척수공동증, 족근관 증후군, 만발성 이상운동증, 만발성 정신이상, 탈로프씨 낭종, 테이삭스병, 측두동맥염, 측두엽 간질, 파상풍, 척수 결박 증후군, 톰슨병, 흉곽출구 증후군, 삼차신경통, 토트마비, 투렛 증후군, 독성 뇌병증, 일과성 허혈성 발작, 해면체성 뇌병증, 횡단척수염, 외상성 뇌 상해, 떨림, 발모광, 삼차 신경병증, 열대성경성대마비, 트리파노소마증, 결절성 경화증, 운베리히트 룬드보그 라프병, 폰힙펠 린도우병(VHL), 빌리우이스크 뇌척수염(Viliuisk Encephalomyelitis: VE), 발렌베르크 증후군, 웨스트 증후군, 위플래쉬, 윌리엄 증후군, 윌슨병 또는 젤위거 증후군을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료되는 대상은 인간 또는 인간이 아닌 동물일 수 있다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간이다. 일부 실시태양에서, 인간은 성인(≥ 18세)이다. 비인간 동물의 비제한적 예는 비인간 영장류, 가축 동물, 집안 반려동물 및 실험실 동물을 포함한다. 예를 들어, 비인간 동물은 유인원(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 고릴라 또는 오랑우탄), 구대륙 원숭이(예를 들어, 레서스 원숭이), 신대륙 원숭이, 개, 고양이, 들소, 낙타, 소, 사슴, 돼지, 당나귀, 말, 노새, 라마, 양, 염소, 버팔로, 순록, 야크, 마우스, 래트, 토끼, 또는 임의의 다른 비인간 동물일 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 조성물 및 방법은 수의학적 동물을 치료할 수 있다. 수의학적 동물은 개, 고양이, 말, 소, 양, 마우스, 래트, 기니픽, 햄스터, 토끼, 뱀, 거북이 및 도마뱀을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 조직 또는 세포 집단을 조성물과 접촉시키는 것은 조성물을 세포 집단 또는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 투여는 시험관 내에서, 예를 들어, 조성물을 세포 배양 시스템에 첨가함으로써 일어난다. 일부 양태에서, 투여는 생체내에서, 예를 들어, 특정 경로를 통한 투여에 의해 일어난다. 1종 초과의 조성물이 투여되는 경우에, 조성물은 동시에(예를 들어, 동일한 날에) 동일한 경로를 통해, 또는 상이한 시간에 동일한 경로를 통해 투여될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 동시에(예를 들어, 동일한 날에) 상이한 경로를 통해 또는 상이한 시간에 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다.
투여
본 발명은 본 발명의 AAV 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하기 위한 투약 요법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 약학적 조성물은 본 발명의 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 약학적 조성물은 본 발명의 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 AAV를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 하나 이상의 뉴런 세포에 투여되거나 도입된다. 신경 세포는 동일한 유형의 신경 세포이거나 상이한 유형의 신경 세포의 혼합 집단일 수 있다.
일부 실시태양에서, 뉴런 세포는 해마 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 뉴런 세포는 흥분성 뉴런이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 해마 뉴런 세포 내로 투여되거나 도입된다.
일부 실시태양에서, 뉴런 세포는 통증수용체 또는 말초 감각 뉴런이다. 감각 뉴런의 예시적 예는 후근 신경절(DRG) 뉴런 및 삼차 신경절(TGG) 뉴런을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 뉴런 세포는 뉴런 통증 순환에 연루된 저해 개재뉴런이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 하나 이상의 DRG 뉴런 세포에 투여되거나 도입된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 하나 이상의 TGG 뉴런 세포에 투여되거나 도입된다.
투여 방법의 비제한적 예는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 진피내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 주입, 두개내 투여, 초내 투여, 비강내 투여, 신경절내 투여, 척수내 투여, 대조 투여 및 신경내 투여를 포함한다. 일부 실시태양에서, 투여는 벡터 및/또는 핵산의 액체 제제 주사를 수반할 수 있다. 일부 실시태양에서, 투여는 벡터 및/또는 핵산의 고체 제제의 경구 전달을 수반할 수 있다. 일부 실시태양에서, 경구 제제는 식품과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 벡터 및/또는 핵산을 하나 이상의 뉴런 세포에 도입하기 위해 대상에게 비경구로, 정맥내로, 근육내, 복강내, 초내로, 신경내로, 신경절내로, 척수내로 또는 뇌실내로 투여된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 AAV이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 및/또는 핵산은 두개내, 척수강내(IT), 뇌내, 심실내 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사를 통해 뉴런에 투여된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 및/또는 핵산은 초내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 감각 뉴런 또는 통증수용체, 예를 들어, DRG 뉴런, TGG 뉴런 등에 투여된다.
초내(IT) 투여는 척추 또는 대수조를 통한 전달을 포함한다. IT 경로는 AAV 및/또는 핵산을 뇌척수액(CSF)에 전달한다. 이런 투여 경로는, 예를 들어, 만성 통증 또는 다른 말초 신경계(PNS) 또는 중추 신경계(CNS) 적응증의 치료에 적합할 수 있다. 동물에서, IT 투여는 대조를 통해 IT 카테터를 삽입함으로써 그리고 이를 요추 수준까지 꼬리쪽으로 전진시킴으로써 달성되었다. 인간에서, IT 전달은 우수한 안전성 프로파일을 갖는 일상적인 침상옆 처치인 요추 천자(LP)에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 및/또는 핵산은 신경절내 투여에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 신경절내 투여는 하나 이상의 신경절에의 직접 주사를 수반할 수 있다. IG 경로는 DRG 또는 TGG 실질 내로 직접적으로 AAV 및/또는 핵산을전달할 수 있다. 일부 실시태양에서, 개방적 신경수술적 절차는 침습적이고 인간에서 바람직하지 않다. 일부 실시태양에서, DRG를 안전하게 표적화하는 최소 침습적, CT 영상-유도 기법은, 예를 들어, 인간 대상을 위해 사용될 수 있다. 전도 촉진 투여(convection enhanced delivery: CED)를 위한 맞춤형 바늘 조립기는 AAV 및/또는 핵산을 DRG 실질 내로 전달하는 데 사용될 수 있다. 비제한적 예에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 만성 통증의 치료를 위한 하나 이상의 배근 신경절 및/또는 삼차 신경절에 전달될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 간질을 치료하기 위해 결절신경절(미주신경)에 전달될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 두개내 투여에 의해(즉, 뇌 내로 직접적으로) 대상에게 투여된다. 두개내 투여의 비제한적 예에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은, 예를 들어, 간질 발작 병소를 치료하기 위해 뇌의 피질 내로, 예를 들어, 포만 장애를 치료하기 위해 뇌 시상 하부 내로, 또는 예를 들어, 포만 장애를 치료하기 위해 편도체 중심핵 내로 전달될 수 있다. 다른 특정 경우에, 벡터 및/또는 핵산은 신경내 주사에 의해 (즉, 신경 내로 직접적으로) 대상에게 투여될 수 있다. 신경은 치료될 적응증, 예를 들어, 만성 통증을 치료하기 위해 궁둥신경 내로 주사 또는 간질 또는 포만 장애를 치료하기 위해 미주신경 내로 주사에 기반하여 선택될 수 있다. 일부 실시태양에서, 벡터 및/또는 핵산은 주사에 의해, 예를 들어, 만성 통증을 치료하기 위해 감각 신경 말단에 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 대상에게 투여된다.
용량은 치료가 예방적 또는 치료적인지, 질환 치료의 유형, 발병, 진행, 중증도, 빈도, 지속 기간 또는 가능성이 원하는 임상 종점을 향하는지, 이전 또는 동시 치료, 대상의 일반적인 건강, 연령, 성별, 인종 또는 면역학적 능력 및 당업자가 인지할 기타 요인에 따라 변하고 달라질 수 있다. 투여량, 횟수, 빈도 또는 기간은 부작용, 합병증 또는 치료 또는 요법의 기타 위험 요인 및 대상의 상태에 따라 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 당업자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양을 제공하는 데 필요한 투여량 및 시간에 영향을 미칠 수 있는 요인을 인식할 것이다.
벡터 용량은 대상에게 전달되는 벡터 게놈 단위의 수로서 표현될 수 있다. 개개 벡터 게놈의 크기는 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터의 유형에 따를 것이다. 본 발명의 벡터 게놈은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 1.0 킬로베이스, 1.5 킬로베이스, 2.0 킬로베이스, 2.5 킬로베이스, 3.0 킬로베이스, 3.5 킬로베이스, 4.0 킬로베이스, 4.5 킬로베이스, 5.0 킬로베이스, 또는 5.0 킬로베이스 초과일 수 있다.
일부 실시태양에, 투여의 벡터 용량은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 1 x 106, 약 2 x 106, 약 3 x 106, 약 4 x 106, 약 5 x 106, 약 6 x 106, 약 7 x 106, 약 8 x 106, 약 9 x 106, 약 1 x 107, 약 2 x 107, 약 3 x 107, 약 4 x 107, 약 5 x 107, 약 6 x 107, 약 7 x 107, 약 8 x 107, 약 9 x 107, 약 1 x 108, 약 2 x 108, 약 3 x 108, 약 4 x 108, 약 5 x 108, 약 6 x 108, 약 7 x 108, 약 8 x 108, 약 9 x 108, 약 1 x 109, 약 2 x 109, 약 3 x 109, 약 4 x 109, 약 5 x 109, 약 6 x 109, 약 7 x 109, 약 8 x 109, 약 9 x 109, 약 1 x 1010, 약 2 x 1010, 약 3 x 1010, 약 4 x 1010, 약 5 x 1010, 약 6 x 1010, 약 7 x 1010, 약 8 x 1010, 약 9 x 1010, 약 1 x 1011, 약 2 x 1011, 약 3 x 1011, 약 4 x 1011, 약 5 x 1011, 약 6 x 1011, 약 7 x 1011, 약 8 x 1011, 약 9 x 1011, 약 1 x 1012, 약 2 x 1012, 약 3 x 1012, 약 4 x 1012, 약 5 x 1012, 약 6 x 1012, 약 7 x 1012, 약 8 x 1012, 약 9 x 1012, 약 1 x 1013, 약 2 x 1013, 약 3 x 1013, 약 4 x 1013, 약 5 x 1013, 약 6 x 1013, 약 7 x 1013, 약 8 x 1013, 약 9 x 1013, 약 1 x 1014, 약 2 x 1014, 약 3 x 1014, 약 4 x 1014, 약 5 x 1014, 약 6 x 1014, 약 7 x 1014, 약 8 x 1014, 약 9 x 1014, 약 1 x 1015, 약 2 x 1015, 약 3 x 1015, 약 4 x 1015, 약 5 x 1015, 약 6 x 1015, 약 7 x 1015, 약 8 x 1015, 약 9 x 1015, 약 1 x 1016, 약 2 x 1016, 약 3 x 1016, 약 4 x 1016, 약 5 x 1016, 약 6 x 1016, 약 7 x 1016, 약 8 x 1016, 약 9 x 1016, 약 1 x 1017 이상 벡터 게놈 단위를 가진다.
일부 실시태양에서, 투여의 벡터 용량은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 적어도 1 x 106, 적어도 2 x 106, 적어도 3 x 106, 적어도 4 x 106, 적어도 5 x 106, 적어도 6 x 106, 적어도 7 x 106, 적어도 8 x 106, 적어도 9 x 106, 적어도 1 x 107, 적어도 2 x 107, 적어도 3 x 107, 적어도 4 x 107, 적어도 5 x 107, 적어도 6 x 107, 적어도 7 x 107, 적어도 8 x 107, 적어도 9 x 107, 적어도 1 x 108, 적어도 2 x 108, 적어도 3 x 108, 적어도 4 x 108, 적어도 5 x 108, 적어도 6 x 108, 적어도 7 x 108, 적어도 8 x 108, 적어도 9 x 108, 적어도 1 x 109, 적어도 2 x 109, 적어도 3 x 109, 적어도 4 x 109, 적어도 5 x 109, 적어도 6 x 109, 적어도 7 x 109, 적어도 8 x 109, 적어도 9 x 109, 적어도 1 x 1010, 적어도 2 x 1010, 적어도 3 x 1010, 적어도 4 x 1010, 적어도 5 x 1010, 적어도 6 x 1010, 적어도 7 x 1010, 적어도 8 x 1010, 적어도 9 x 1010, 적어도 1 x 1011, 적어도 2 x 1011, 적어도 3 x 1011, 적어도 4 x 1011, 적어도 5 x 1011, 적어도 6 x 1011, 적어도 7 x 1011, 적어도 8 x 1011, 적어도 9 x 1011, 적어도 1 x 1012, 적어도 2 x 1012, 적어도 3 x 1012, 적어도 4 x 1012, 적어도 5 x 1012, 적어도 6 x 1012, 적어도 7 x 1012, 적어도 8 x 1012, 적어도 9 x 1012, 적어도 1 x 1013, 적어도 2 x 1013, 적어도 3 x 1013, 적어도 4 x 1013, 적어도 5 x 1013, 적어도 6 x 1013, 적어도 7 x 1013, 적어도 8 x 1013, 적어도 9 x 1013, 적어도 1 x 1014, 적어도 2 x 1014, 적어도 3 x 1014, 적어도 4 x 1014, 적어도 5 x 1014, 적어도 6 x 1014, 적어도 7 x 1014, 적어도 8 x 1014, 적어도 9 x 1014, 적어도 1 x 1015, 적어도 2 x 1015, 적어도 3 x 1015, 적어도 4 x 1015, 적어도 5 x 1015, 적어도 6 x 1015, 적어도 7 x 1015, 적어도 8 x 1015, 적어도 9 x 1015, 적어도 1 x 1016, 적어도 2 x 1016, 적어도 3 x 1016, 적어도 4 x 1016, 적어도 5 x 1016, 적어도 6 x 1016, 적어도 7 x 1016, 적어도 8 x 1016, 적어도 9 x 1016, 또는 적어도 1 x 1017 벡터 게놈 단위를 가진다.
일부 실시태양에서, 투여의 벡터 용량은 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 1 x 106 이하, 2 x 106 이하, 3 x 106 이하, 4 x 106 이하, 5 x 106 이하, 6 x 106 이하, 7 x 106 이하, 8 x 106 이하, 9 x 106 이하, 1 x 107 이하, 2 x 107 이하, 3 x 107 이하, 4 x 107 이하, 5 x 107 이하, 6 x 107 이하, 7 x 107 이하, 8 x 107 이하, 9 x 107 이하, 1 x 108 이하, 2 x 108 이하, 3 x 108 이하, 4 x 108 이하, 5 x 108 이하, 6 x 108 이하, 7 x 108 이하, 8 x 108 이하, 9 x 108 이하, 1 x 109 이하, 2 x 109 이하, 3 x 109 이하, 4 x 109 이하, 5 x 109 이하, 6 x 109 이하, 7 x 109 이하, 8 x 109 이하, 9 x 109 이하, 1 x 1010 이하, 2 x 1010 이하, 3 x 1010 이하, 4 x 1010 이하, 5 x 1010 이하, 6 x 1010 이하, 7 x 1010 이하, 8 x 1010 이하, 9 x 1010 이하, 1 x 1011 이하, 2 x 1011 이하, 3 x 1011 이하, 4 x 1011 이하, 5 x 1011 이하, 6 x 1011 이하, 7 x 1011 이하, 8 x 1011 이하, 9 x 1011 이하, 1 x 1012 이하, 2 x 1012 이하, 3 x 1012 이하, 4 x 1012 이하, 5 x 1012 이하, 6 x 1012 이하, 7 x 1012 이하, 8 x 1012 이하, 9 x 1012 이하, 1 x 1013 이하, 2 x 1013 이하, 3 x 1013 이하, 4 x 1013 이하, 5 x 1013 이하, 6 x 1013 이하, 7 x 1013 이하, 8 x 1013 이하, 9 x 1013 이하, 1 x 1014 이하, 2 x 1014 이하, 3 x 1014 이하, 4 x 1014 이하, 5 x 1014 이하, 6 x 1014 이하, 7 x 1014 이하, 8 x 1014 이하, 9 x 1014 이하, 1 x 1015 이하, 2 x 1015 이하, 3 x 1015 이하, 4 x 1015 이하, 5 x 1015 이하, 6 x 1015 이하, 7 x 1015 이하, 8 x 1015 이하, 9 x 1015 이하, 1 x 1016 이하, 2 x 1016 이하, 3 x 1016 이하, 4 x 1016 이하, 5 x 1016 이하, 6 x 1016 이하, 7 x 1016 이하, 8 x 1016 이하, 9 x 1016 이하, 또는 1 x 1017 이하의 벡터 게놈 단위를 가진다.
일부 실시태양에서, 벡터 용량은 대상체의 체중 킬로그램당 벡터 게놈 단위(vg/kg)로 표현된다. 일부 실시태양에서, 위에 기술된 벡터 용량 수치는 체중 50kg의 대상을 기준으로 하고, 용량은 그에 따라 vg/kg으로 변환되어 대상의 체중을 기준으로 다른 대상에게 적용될 수 있다. 예를 들어, 체중이 50kg인 대상에 대한 약 5 x 1014 벡터 게놈 단위의 용량은 약 1 x 1013 벡터 게놈 단위/킬로그램(vg/kg)으로 변환될 수 있다.
일부 실시태양에서, 벡터 용량은 대상에게 투여된 벡터의 농도 또는 역가에 따라 표현된다. 일부 실시태양에서, 벡터 용량은 부피(예를 들어, 게놈 단위/부피)당 단위의 수 곱하기 부피로 표현될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 일정 부피의 유체로 투여된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 0.01mL, 약 0.02mL, 약 0.03mL, 약 0.04mL, 약 0.05mL, 약 0.06mL, 약 0.07mL, 약 0.08mL, 약 0.09mL, 약 0.1mL, 약 0.15mL, 약 0.2mL, 약 0.25mL, 약 0.3mL, 약 0.4mL, 약 0.5mL, 약 0.6mL, 약 0.7mL, 약 0.8mL, 약 0.9mL, 약 1.0mL, 약 2.0mL, 약 3.0mL, 약 4.0mL, 약 5.0mL, 약 6.0mL, 약 7.0mL, 약 8.0mL, 약 9.0mL, 약 10.0mL, 약 11.0mL, 약 12.0mL, 약 13.0mL, 약 14.0mL, 약 15.0mL mL, 약 16.0mL, 약 17.0mL, 약 18.0mL, 약 19.0mL, 약 20.0mL, 약 25.0mL, 또는 25.0mL 초과의 부피로 투여된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 적어도 0.01mL, 적어도 0.02mL, 적어도 0.03mL, 적어도 0.04mL, 적어도 0.05mL, 적어도 0.06mL, 적어도 0.07mL, 적어도 0.08mL, 적어도 0.09mL, 적어도 0.1mL, 적어도 0.15mL, 적어도 0.2mL, 적어도 0.25mL, 적어도 0.3mL, 적어도 0.4mL, 적어도 0.5mL, 적어도 0.6mL, 적어도 0.7mL, 적어도 0.8mL, 적어도 0.9mL, 적어도 1.0mL, 적어도 2.0mL, 적어도 3.0mL, 적어도 4.0mL, 적어도 5.0mL, 적어도 6.0mL, 적어도 7.0mL, 적어도 8.0mL, 적어도 9.0mL, 적어도 10.0mL, 적어도 11.0mL, 적어도 12.0mL, 적어도 13.0mL, 적어도 14.0mL, 적어도 15.0mL, 적어도 16.0mL, 적어도 17.0mL, 적어도 18.0mL, 적어도 19.0mL, 적어도 20.0mL 또는 적어도 25.0mL의 부피로 투여된다. 일부 실시태양에서, 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 0.01mL 이하, 0.02mL 이하, 0.03mL 이하, 0.04mL 이하, 0.05mL 이하, 0.06mL 이하, 0.07mL 이하, 0.08mL 이하, 0.09mL 이하, 0.1mL 이하, 0.15mL 이하, 0.2mL 이하, 0.25mL 이하, 0.3mL 이하, 0.4mL 이하, 0.5mL 이하, 0.6mL 이하, 0.7mL 이하, 0.8mL 이하, 0.9mL 이하, 1.0mL 이하, 2.0mL 이하, 3.0mL 이하, 4.0mL 이하, 5.0mL 이하, 6.0mL 이하, 7.0mL 이하, 8.0mL 이하, 9.0mL 이하, 10.0mL 이하, 11.0mL 이하, 12.0mL 이하, 13.0mL 이하, 14.0mL 이하, 15.0mL 이하, 16.0mL 이하, 17.0mL 이하, 18.0mL 이하, 19.0mL 이하, 20.0mL 이하, 또는 25.0mL 이하의 부피로 투여된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에서 고려된 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 적어도 1 x 109 게놈 유닛/mL, 적어도 1 x 1010 게놈 유닛/mL, 적어도 5 x 1010 게놈 유닛/mL, 적어도 1 x 1011 게놈 유닛/mL, 적어도 5 x 1011 게놈 유닛/mL, 적어도 1 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 5 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 6 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 7 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 8 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 9 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 10 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 15 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 20 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 25 x 1012 게놈 유닛/mL, 적어도 50 x 1012 게놈 유닛/mL, 또는 적어도 100 x 1012 게놈 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 1 x 109 게놈 유닛/mL, 약 1 x 1010 게놈 유닛/mL, 약 5 x 1010 게놈 유닛/mL, 약 1 x 1011 게놈 유닛/mL, 약 5 x 1011 게놈 유닛/mL, 약 1 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 5 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 6 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 7 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 8 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 9 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 10 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 15 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 20 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 25 x 1012 게놈 유닛/mL, 약 50 x 1012 게놈 유닛/mL, 또는 약 100 x 1012 게놈 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 1 x 109 이하 게놈 유닛/mL, 1 x 1010 이하 게놈 유닛/mL, 5 x 1010 이하 게놈 유닛/mL, 1 x 1011 이하 게놈 유닛/mL, 5 x 1011 이하 게놈 유닛/mL, 1 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 5 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 6 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 7 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 8 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 9 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 10 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 15 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 20 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 25 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 50 x 1012 이하 게놈 유닛/mL, 또는 100 x 1012 이하 게놈 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 5 x 109 감염 유닛/mL, 약 6 x 109 감염 유닛/mL, 약 7 x 109 감염 유닛/mL, 약 8 x 109 감염 유닛/mL, 약 9 x 109 감염 유닛/mL, 약 1 x 1010 감염 유닛/mL, 약 1.5 x 1010 감염 유닛/mL, 약 2 x 1010 감염 유닛/mL, 약 2.5 x 1010 감염 유닛/mL, 약 5 x 1010 감염 유닛/mL, 약 1 x 1011 감염 유닛/mL, 약 2.5 x 1011 감염 유닛/mL, 약 5 x 1011 감염 유닛/mL, 약 1 x 1012 감염 유닛/mL, 약 2.5 x 1012 감염 유닛/mL, 약 5 x 1012 감염 유닛/mL, 약 1 x 1013 감염 유닛/mL, 약 5 x 1013 감염 유닛/mL, 또는 약 1 x 1014 감염 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 적어도 5 x 109 감염 유닛/mL, 적어도 6 x 109 감염 유닛/mL, 적어도 7 x 109 감염 유닛/mL, 적어도 8 x 109 감염 유닛/mL, 적어도 9 x 109 감염 유닛/mL, 적어도 1 x 1010 감염 유닛/mL, 적어도 1.5 x 1010 감염 유닛/mL, 적어도 2 x 1010 감염 유닛/mL, 적어도 2.5 x 1010 감염 유닛/mL, 적어도 5 x 1010 감염 유닛/mL, 적어도 1 x 1011 감염 유닛/mL, 적어도 2.5 x 1011 감염 유닛/mL, 적어도 5 x 1011 감염 유닛/mL, 적어도 1 x 1012 감염 유닛/mL, 적어도 2.5 x 1012 감염 유닛/mL, 적어도 5 x 1012 감염 유닛/mL, 적어도 1 x 1013 감염 유닛/mL, 적어도 5 x 1013 감염 유닛/mL, 또는 적어도 1 x 1014 감염 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 5 x 109 이하 감염 유닛/mL, 6 x 109 이하 감염 유닛/mL, 7 x 109 이하 감염 유닛/mL, 8 x 109 이하 감염 유닛/mL, 9 x 109 이하 감염 유닛/mL, 1 x 1010 이하 감염 유닛/mL, 1.5 x 1010 이하 감염 유닛/mL, 2 x 1010 이하 감염 유닛/mL, 2.5 x 1010 이하 감염 유닛/mL, 5 x 1010 이하 감염 유닛/mL, 1 x 1011 이하 감염 유닛/mL, 2.5 x 1011 이하 감염 유닛/mL, 5 x 1011 이하 감염 유닛/mL, 1 x 1012 이하 감염 유닛/mL, 2.5 x 1012 이하 감염 유닛/mL, 5 x 1012 이하 감염 유닛/mL, 1 x 1013 이하 감염 유닛/mL, 5 x 1013 이하 감염 유닛/mL, 또는 1 x 1014 이하 감염 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 약 5 x 1010 형질도입 유닛/mL, 약 1 x 1011 형질도입 유닛/mL, 약 2.5 x 1011 형질도입 유닛/mL, 약 5 x 1011 형질도입 유닛/mL, 약 1 x 1012 형질도입 유닛/mL, 약 2.5 x 1012 형질도입 유닛/mL, 약 5 x 1012 형질도입 유닛/mL, 약 1 x 1013 형질도입 유닛/mL, 약 5 x 1013 형질도입 유닛/mL, 또는 약 1 x 1014 형질도입 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 적어도 5 x 1010 형질도입 유닛/mL, 적어도 1 x 1011 형질도입 유닛/mL, 적어도 2.5 x 1011 형질도입 유닛/mL, 적어도 5 x 1011 형질도입 유닛/mL, 적어도 1 x 1012 형질도입 유닛/mL, 적어도 2.5 x 1012 형질도입 유닛/mL, 적어도 5 x 1012 형질도입 유닛/mL, 적어도 1 x 1013 형질도입 유닛/mL, 적어도 5 x 1013 형질도입 유닛/mL, 또는 적어도 1 x 1014 형질도입 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 이 사이의 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 5 x 1010 이하 형질도입 유닛/mL, 1 x 1011 이하 형질도입 유닛/mL, 2.5 x 1011 이하 형질도입 유닛/mL, 5 x 1011 이하 형질도입 유닛/mL, 1 x 1012 이하 형질도입 유닛/mL, 2.5 x 1012 이하 형질도입 유닛/mL, 5 x 1012 이하 형질도입 유닛/mL, 1 x 1013 이하 형질도입 유닛/mL, 5 x 1013 이하 형질도입 유닛/mL, 또는 1 x 1014 이하 형질도입 유닛/mL의 역가로 대상에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 벡터 용량은 투여 경로에 의해 결정된다. 일부 실시태양에서, 신경절내 주사는 약 0.1mL 내지 약 1.0mL 부피의 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 경막내 주사는 약 1.0 mL 내지 약 12.0 mL 부피의 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 두개내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL 부피의 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 신경내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL 부피의 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 척수내 주사는 약 0.1 mL 내지 약 1.0 mL 부피의 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 시스테나 마그나 주입은 약 0.5 mL 내지 약 5.0 mL 부피에 약 5 x 109 내지 약 5 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 피하 주사는 약 0.1mL 내지 약 1.0mL 부피의 약 1 x 109 내지 약 1 x 1013 벡터 게놈을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 벡터 용량은 단일 투여의 총 용량이다. 일부 실시태양에서, 벡터 용량은 일정 기간 동안의 총 용량이다. 일부 실시태양에서, 기간은 약 3시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 12개월 또는 12개월 초과이다. 일부 실시태양에서, 기간은 3시간 이내, 6시간 이내, 12시간 이내, 1일 이내, 2일 이내, 3일 이내, 4일 이내, 5일 이내, 6일 이내, 1주 이내, 2일 이내, 3주 이내, 4주 이내, 1개월 이내, 2개월 이내, 3개월 이내, 4개월 이내, 5개월 이내, 6개월 이내, 또는 12개월 이내이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터 및/또는 핵산은 주입에 의해 대상에게 전달된다. 주입에 의해 대상에게 전달되는 용량은 주입 속도로 측정될 수 있다. 주입 속도의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 신경절내, 척수내, 두개내 또는 신경내 투여의 경우 1-10μL/min; 척수강내 또는 시스터나 마그나 투여의 경우 10-1000μL/min. 일부 경우에, 벡터 및/또는 핵산은 MRI 유도 대류 강화 전달(CED)에 의해 대상에게 전달된다. 이 기술은 뇌의 많은 양에 걸쳐 분산된 바이러스 확산 및 형질도입을 증가시킬 뿐만 아니라 바늘 경로를 따라 벡터 및/또는 핵산의 역류를 감소시킨다.
본 발명은 또한 투여된 AAV 벡터 및/또는 핵산이 조작된 LGIC를 암호화하는 경우에 리간드(예를 들어, 소분자 LGIC 효현제)를 투여하기 위한 투약 섭생을 제공한다.
치료적 유효량의 리간드는 매일 1회 또는 1회 초과 또는 장기간 동안 투여될 수 있다. 일부 경우에, 치료적 유효량의 리간드는 필요한 대로(예를 들어, 통증 경감 또는 간질의 제어가 필요할 때) 투여된다. 리간드는 연속으로 (예를 들어, 치료 요법의 지속기간 동안 중단 없이 매일) 투여될 수 있다. 일부 경우에, 치료 요법은 1주 미만, 1주, 2주, 3주, 1개월 또는 1개월 초과일 수 있다. 일부 경우에, 치료적 유효량의 리간드는 1일, 적어도 2 연속일, 적어도 3 연속일, 적어도 4 연속일, 적어도 5 연속일, 적어도 6 연속일, 적어도 7 연속일, 적어도 8 연속일, 적어도 9 연속일, 적어도 10 연속일, 또는 적어도 10 연속일 초과 동안 투여된다. 특정 경우에, 치료적 유효량의 리간드는 3 연속일 동안 투여된다. 일부 경우에, 치료적 유효량의 리간드는 1주당 1회, 1주당 2회, 1주당 3회, 1주당 4회, 1주당 5회, 1주당 6회, 1주당 7회, 1주당 8회, 1주당 9회, 1주당 10회, 1주당 11회, 1주당 12회, 1주당 13회, 1주당 14회, 1주당 15회, 1주당 16회, 1주당 17회, 1주당 18회, 1주당 19회, 1주당 20회, 1주당 25회, 1주당 30회, 1주당 35회, 1주당 40회 또는 1주당 40회 초과로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 치료적 유효량의 리간드는 1일당 1회, 1일당 2회, 1일당 3회, 1일당 4회, 1일당 5회, 1일당 6회, 1일당 7회, 1일당 8회, 1일당 9회, 1일당 10회 또는 1일당 10회 초과로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 치료적 유효량의 리간드는 적어도 1시간마다, 적어도 2시간마다, 적어도 3시간마다, 적어도 4시간마다, 적어도 5시간마다, 적어도 6시간마다, 적어도 7시간마다, 적어도 8시간마다, 적어도 9시간마다, 적어도 10시간마다, 적어도 11시간마다, 적어도 12시간마다, 적어도 13시간마다, 적어도 14시간마다, 적어도 15시간마다, 적어도 16시간마다, 적어도 17시간마다, 적어도 18시간마다, 적어도 19시간마다, 적어도 20시간마다, 적어도 21시간마다, 적어도 22시간마다, 적어도 23시간, 또는 적어도 1일마다 투여된다. 리간드의 용량은 대상에게 지속적으로, 또는 1일당 1, 2, 3, 4 또는 5회; 1주당 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회, 1개월당 1, 2, 3 또는 4회, 2, 3, 4, 5 또는 6개월마다 1회, 또는 1년 1회, 또는 훨씬 더 긴 간격으로 대상에게 투여될 수 있다. 치료의 지속기간은 1일, 1, 2 또는 3주, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 또는 11개월, 1, 2, 3, 4, 5년 이상, 또는 더 길게 지속될 수 있다.
조성물이 필요한 대상에게 투여되는 횟수는 의학 전문가의 재량, 장애, 장애의 중증도 및 제형에 대한 대상의 반응에 의존한다. 일부 실시태양에서, 조성물의 투여는 적어도 1회 일어난다. 일부 실시태양에서, 투여는 주어진 기간에 1회 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 초과로 일어난다. 각각의 투여의 투여량 및/또는 투여 빈도는 환자의 병태 및 생리학적 반응에 기반하여 필요하다면 조절될 수 있다.
AAV 비리온 생성 방법
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 AAV 비리온을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 AAV 벡터를 AAV 비리온으로 패키징할 수 있는 숙주 세포로 본 발명의 AAV 벡터를 삽입 또는 형질도입하는 것을 수반한다. 예시적인 방법이 아래에 기술되고 참조된다; 그러나, 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 AAV 비리온을 생성할 수 있다.
이종 핵산을 포함하고 AAV 비리온을 생성하는 데 사용되는 AAV 벡터는 당업계에 주지된 방법을 사용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, Koerber et al. (2009) Mol. Ther., 17:2088; Koerber et al. (2008) Mol Ther., 16: 1703-1709; 미국 특허 7,439,065, 6,951,758 및 6,491,907 참조. 예를 들어, 이종 서열(들)은 주요 AAV 오픈 리딩 프레임("ORF")이 절단된 AAV 게놈에 직접 삽입될 수 있다. 복제 및 패키징 기능을 허용하도록 ITR의 충분한 부분이 남아 있는 한 AAV 게놈의 다른 부분도 결실될 수 있다.
AAV 비리온을 생산하기 위해, AAV 벡터는 형질감염과 같은 공지된 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포에 도입된다. AAV 비리온 생산에 적합한 숙주 세포는 이종 AAV DNA 분자의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용되어 왔으며 헬퍼 바이러스로부터 필요한 AAV 생산 보조 인자의 발현을 지원할 수 있는 임의의 종 및/또는 유형의 세포를 포함한다. 그러한 숙주 세포는 이종 DNA 분자의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 의미한다. 안정한 인간 세포주 HEK293(예를 들어, 수탁 번호 ATCC CRL1573으로 American Type Culture Collection을 통해 쉽게 구할 수 있음)의 세포가 사용될 수 있다.
곤충 세포에서 AAV 비리온을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 대상 AAV 비리온을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0203071; 미국 특허 7,271,002; 및 Chen (2008) Mol. Ther. 16:924.
키트
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 수용체를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시태양에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시태양에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 실시태양에서, 벡터는 본 발명의 AAV이다. 일부 실시태양에서, 키트는 본 발명의 비-천연 리간드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 및 (b) 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키트는 AAV 벡터의 투여에 적합한 장치를 포함한다. 일부 실시태양에서, 장치는 척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 적합하다.
일부 실시태양에서, 키트는 (a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 및 (b) 해마 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키트는 AAV 벡터의 투여에 적합한 장치를 포함한다. 일부 실시태양에서, 장치는 두개내 투여에 적합하다.
일부 실시태양에서, 키트는 포장 재료 및 내부의 하나 이상의 구성요소를 추가로 포함한다. 키트는 전형적으로 구성요소의 설명 또는 구성요소의 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 사용 지침을 포함하는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 구성요소, 예를 들어 AAV 캡시드 폴리펩타이드, AAV 벡터 또는 AAV 비리온 및 선택적으로 또 다른 화합물, 작용제, 약물 또는 조성물과 같은 제 2 활성제의 집합체를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, AAV 벡터 게놈은 LGIC(예를 들어, 조작된 LGIC)를 암호화하고 제 2 활성제는 LGIC에 대한 리간드(예를 들어, 소분자 약물)이다.
키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 수용하는 물리적 구조를 의미한다. 포장 재료는 구성 요소를 무균 상태로 유지할 수 있으며 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
표지 또는 삽입물은 그 안의 하나 이상의 성분, 투여량, 작용 기전을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학, 약동학 및 약력학의 식별 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜, 만료 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 키트 구성요소가 사용될 수 있는 질환에 대한 정보를 포함할 수 있다. 포지 또는 삽입물은 방법, 사용 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 하나 이상의 키트 구성요소를 사용하기 위해 임상의 또는 대상을 위한 지침을 포함할 수 있다. 지침은 본 명세서에 기술된 임의의 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방적 또는 치료적 섭생을 실시하기 위한 투여량, 빈도 또는 기간 및 지침을 포함할 수 있다.
표지 또는 삽입물은 예방적 또는 치료적 이점과 같이 구성요소가 제공할 수 있는 모든 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 대해 대상 또는 임상의에게 경고하는 것과 같은 잠재적 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보를 포함할 수 있다. 부작용 또는 합병증은 또한 대상이 조성물과 부적합할 수 있는 하나 이상의 다른 약물을 가지고 있거나 현재 복용 중이거나 현재 복용 중일 때, 또는 대상이 또 다른 부적합한 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나 받을 예정이거나 현재 진행 중일 때 발생할 수 있다. 따라서 지침은 그러한 비호환성에 관한 정보를 포함할 수 있다.
추가의 번호가 매겨진 실시태양
본 발명의 추가의 번호가 매겨진 실시태양은 다음과 같이 제공된다:
실시태양 1. 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 신경병성 통증을 치료하는 방법으로서, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하고, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런인 신경병성 통증을 치료하는 방법.
실시태양 1.1. 실시태양 1에서, 신경병성 통증은 말초 신경병증인 방법.
실시태양 1.2. 실시태양 1에서, 신경병성 통증은 삼차 신경통인 방법.
실시태양 2. 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하는 것인 방법.
실시태양 3. 실시태양 2에 있어서, 신경계 질환 또는 장애는 신경병성 통증, 경직, 척수 손상 또는 견열 손상인 방법.
실시태양 4. 실시태양 1-3 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9에 따른 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV9-TV 벡터인 방법.
실시태양 5. 뉴런을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 뉴런을 형질도입하는 방법으로서, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런인 방법.
실시태양 6. 실시태양 1-5 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 이종 핵산을 포함하는 것인 방법.
실시태양 7. 뉴런을 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 이종 핵산을 뉴런에 전달하는 방법으로서, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런인 방법.
실시태양 8. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 시험관 내에서 iPSC 유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터인 방법.
실시태양 9. 실시태양 1-8 중 어느 하나에 있어서, 방법은 시험관 내에서 iPSC-유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
실시태양 10. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV2, AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF 또는 AAV-PHP.S 벡터인 방법.
실시태양 11. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV9-TV 벡터인 방법.
실시태양 12. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV6 벡터인 방법.
실시태양 13. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV5 벡터인 방법.
실시태양 14. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV2.5-TV2YF 벡터인 방법.
실시태양 15. 실시태양 1-14 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
실시태양 16. 실시태양 1-14 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 3 및 5-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
실시태양 17. 실시태양 1-14 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 5-7 및 9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
실시태양 18. 실시태양 1-14 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하고, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492에 상응하는 위치에 비-트레오닌 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 19. 실시태양 18에 있어서, 비-트레오닌 돌연변이는 발린, 아이소류신 또는 류신 치환인 방법.
실시태양 20. 실시태양 18에 있어서, 비-트레오닌 돌연변이는 발린 치환인 방법.
실시태양 21. 실시태양 1-20 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 후근 신경절 뉴런인 방법.
실시태양 22. 실시태양 1-20 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 삼차 신경절 뉴런인 방법.
실시태양 23. 실시태양 1-22 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 아이소렉틴 B4(IB4) 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 24. 실시태양 1-23 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 NF200 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 25. 실시태양 1-24 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 CGRP 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 26. 실시태양 1-25 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 C 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 27. 실시태양 1-25 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 Aδ 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 28. 실시태양 1-27 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 경막내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
실시태양 29. 실시태양 28에 있어서, AAV 벡터는 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 투여되는 것인 방법.
실시태양 30. 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법으로서, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하고, 뉴런은 해마 뉴런인 방법.
실시태양 30.1 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하여, 치료가 필요로 하는 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, AAV 벡터는 대상에서 해마 뉴런을 형질도입하는 것인 방법.
실시태양 30.2 실시태양 30.1에 있어서, 신경계 질환 또는 장애는 초점 간질, 정신분열증, 자폐 스펙트럼 장애, 알츠하이머병, 레트 증후군 또는 취약 X 증후군인 방법.
실시태양 31. 뉴런을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 뉴런을 형질도입하는 방법으로서, 뉴런은 해마 뉴런인 방법.
실시태양 32. 실시태양 30-31 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 이종 핵산을 포함하는 것인 방법.
실시태양 33. 뉴런을 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 이종 핵산을 뉴런에 전달하는 방법으로서, 뉴런은 해마 뉴런인 방법.
실시태양 34. 실시태양 30-33 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터인 방법.
실시태양 35. 실시태양 30-34 중 어느 하나에 있어서, 방법은 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시태양 36. 실시태양 30-35 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV2, AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF 또는 AAV-PHP.S 벡터인 방법.
실시태양 37. 실시태양 30-36 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV9 벡터인 방법.
실시태양 38. 실시태양 30-36 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV9-TV 벡터인 방법.
실시태양 39. 실시태양 30-36 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV6 벡터인 방법.
실시태양 40. 실시태양 30-36 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV5 벡터인 방법.
실시태양 41. 실시태양 30-40 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
실시태양 42. 실시태양 1-14 중 어느 하나에 있어서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 및 5-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
실시태양 43. 실시태양 30-40 중 어느 하나에 있어서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 6-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
실시태양 44. 실시태양 30-40 중 어느 하나에 있어서, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
실시태양 45. 실시태양 30-44 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 흥분성 뉴런인 방법.
실시태양 46. 실시태양 45에 있어서, 뉴런은 CAMK2 양성 뉴런인 방법.
실시태양 47. 실시태양 30-44 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 억제성 뉴런인 방법.
실시태양 48. 실시태양 47에 있어서, 뉴런은 GABAergic 뉴런인 방법.
실시태양 49. 실시태양 30-48 중 어느 하나에 있어서, 초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)인 방법.
실시태양 50. 실시태양 30 내지 49 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(시스테나 마그나) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
실시태양 51. 실시태양 50에 있어서, AAV 벡터는 해마의 간질 초점에 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
실시태양 52. 실시태양 6-29 및 32-51 중 어느 하나에 있어서, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 53. 실시태양 52의 방법에 있어서, 리간드 개폐 이온 채널은 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유도된 리간드 결합 도메인 및 인간 글리신 수용체로부터 유도된 이온 기공 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시태양 54. 실시태양 52 또는 53에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 23-220과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 55. 실시태양 54에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 잔기로부터 선택된 잔기에 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 56. 실시태양 54 또는 55에 있어서, 리간드 결합 도메인은 표 3에 열거된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 57. 실시태양 56에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101W, Y115E 및 Y210W에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 58. 실시태양 56에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101W 및 Y210V에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 59. 실시태양 56에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101M 및 L131F에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 60. 실시태양 53-59 중 어느 하나에 있어서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3인 방법.
실시태양 61. 실시태양 60에 있어서, 이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 255-457, SEQ ID NO: 27의 260-452, SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 62. 실시태양 53-61 중 어느 하나에 있어서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유도된 Cys-루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시태양 63. 실시태양 62에 있어서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-172를 포함하는 것인 방법.
실시태양 64. 실시태양 62에 있어서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-180을 포함하는 것인 방법.
실시태양 65. 실시태양 53-64 중 어느 하나에 있어서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시태양 66. 실시태양 65에 있어서, β1-2 루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 81-84를 포함하는 것인 방법.
실시태양 67. 실시태양 53 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이고, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 68. 실시태양 52-67 중 어느 하나에 있어서, 방법은 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시태양 69. 실시태양 68에 있어서, 리간드는 AZD-0328, TC-6987, ABT-126, TC-5619, TC-6683, 바레니클린, 및 파시니클린/RG3487로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
실시태양 70. 실시태양 68에 있어서, 리간드는 TC-5619인 방법.
실시예 70.1. 실시태양 68에 있어서, 리간드는 ABT-126인 방법.
실시태양 71. 실시태양 1-70.1 중 어느 하나에 있어서, 대상은 영장류인 방법.
실시태양 72. 실시태양 71에 있어서, 대상은 인간, 선택적으로 성인 인간인 방법.
실시태양 73. 다음을 포함하는 키트:
(a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
(b) 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침.
실시태양 74. 실시태양 73에 있어서, 척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여를 통한 AAV 벡터의 투여에 적합한 장치를 추가로 포함하는 것인 키트.
실시태양 75. 실시태양 74에 있어서, 장치는 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 투여하기에 적합한 것인 키트.
실시태양 76. 다음을 포함하는 키트:
(a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
(b) 해마 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침.
실시태양 77. 실시태양 76에 있어서, 두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(시스테나 마그나) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사를 통한 AAV 벡터의 투여에 적합한 장치를 추가로 포함하는 것인 키트.
실시태양 78. 실시태양 77에 있어서, 장치는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의한 투여에 적합한 것인 키트.
실시태양 79. 실시태양 73-78 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 것인 키트.
실시태양 80. 실시태양 79에 있어서, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
실시태양 81. 실시태양 79 또는 80에 있어서, 키트는 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 포함하는 것인 키트.
실시태양 82. 실시태양 81에 있어서, 리간드는 TC-5619인 키트.
실시태양 82.1. 실시태양 81에 있어서, 리간드는 ABT-126인 키트.
실시태양 83. 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 신경병증성 통증을 치료하는 방법으로서, 이종 핵산은 대상의 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런에 전달되며, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 83.1. 실시태양 83에 있어서, 신경병성 통증은 말초 신경병증인 방법.
실시태양 83.2. 실시태양 83에 있어서, 신경병성 통증은 삼차 신경통인 방법.
실시태양 84. 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 85. 실시태양 84에 있어서, 신경계 질환 또는 장애는 신경병성 통증, 경직, 척수 손상, 또는 견열 손상인 방법.
실시태양 86. 실시태양 83-85 중 어느 하나에 있어서, 이종 핵산은 경막내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
실시태양 87. 실시태양 86에 있어서, 이종 핵산은 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절에 직접 투여되는 것인 방법.
실시태양 88. 실시태양 83-87 중 어느 하나에 있어서, 이종 핵산은 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
실시태양 89. 실시태양 88에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하는 것인 방법.
실시태양 90. 실시태양 83-89 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 아이소렉틴 B4(IB4) 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 91. 실시태양 83-90 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 NF200 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 92. 실시태양 83-91 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 CGRP 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 93. 실시태양 83-92 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 C 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 94. 실시태양 83-92 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 Aδ 섬유를 포함하는 것인 방법.
실시태양 95. 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법으로서, 이종 핵산은 대상의 해마 뉴런으로 전달되고, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 95.1 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 이종 핵산은 대상의 해마 뉴런으로 전달되고, 이종 핵산은 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 95.2 실시태양 95.1에 있어서, 신경계 질환 또는 장애는 초점 간질, 정신분열증, 자폐 스펙트럼 장애, 알츠하이머병, 레트 증후군 또는 취약 X 증후군인 방법.
실시태양 96. 실시태양 95-95.2 중 어느 하나에 있어서, 이종 핵산은 두개내 투여, 경막내(척추) 투여, 척수강내(시스테나 마그나) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
실시태양 97. 실시태양 96에 있어서, 이종 핵산은 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
실시태양 98. 실시태양 95-97 중 어느 하나에 있어서, 이종 핵산은 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
실시태양 99. 실시태양 98에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 해마 뉴런을 형질도입하는 것인 방법.
실시태양 100. 실시태양 95-99 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 흥분성 뉴런인 방법.
실시태양 101. 실시태양 100에 있어서, 뉴런은 CAMK2 양성 뉴런인 방법.
실시태양 102. 실시태양 95-99 중 어느 하나에 있어서, 뉴런은 억제성 뉴런인 방법.
실시태양 103. 실시태양 102에 있어서, 뉴런은 GABAergic 뉴런인 방법.
실시태양 104. 실시태양 95-103 중 어느 하나에 있어서, 초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)인 방법.
실시태양 105. 실시태양 83 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 리간드 개폐 이온 채널은 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유도된 리간드 결합 도메인 및 인간 글리신 수용체로부터 유도된 이온 기공 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시태양 106. 실시태양 105에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 23-220과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 107. 실시태양 106에 있어서, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 잔기로부터 선택되는 잔기에 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 108. 실시태양 105 또는 106에 있어서, 리간드 결합 도메인은 표 3에 열거된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
실시태양 109. 실시태양 105-108 중 어느 하나에 있어서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3인 방법.
실시태양 110. 실시태양 109에 있어서, 이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 255-457, SEQ ID NO: 27의 260-452, SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 111. 실시태양 105-110 중 어느 하나에 있어서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유도된 Cys-루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시태양 112. 실시태양 111에 있어서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-172를 포함하는 것인 방법.
실시태양 113. 실시태양 111에 있어서, Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-180을 포함하는 것인 방법.
실시태양 114. 실시태양 105-113 중 어느 하나에 있어서, 조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
실시태양 115. 실시태양 114에 있어서, β1-2 루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 81-84를 포함하는 것인 방법.
실시태양 116. 실시태양 105 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이고, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
실시태양 117. 실시태양 83-116 중 어느 하나에 있어서, 방법은 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시태양 118. 실시태양 117에 있어서, 리간드는 AZD-0328, TC-6987, ABT-126, TC-5619, TC-6683, 바레니클린, 및 파시니클린/RG3487로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
실시태양 119. 실시태양 117에 있어서, 리간드는 TC-5619인 방법.
실시태양 119.1. 리간드는 ABT-126인 방법.
실시태양 120. 실시태양 83-119.1 중 어느 하나에 있어서, 대상은 영장류인 방법.
실시태양 121. 실시태양 120에 있어서, 대상은 인간, 선택적으로 성인 인간인 방법.
본 발명의 서열
실시예
본 발명의 바람직한 실시태양이 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 수많은 변형, 변경 및 대체가 일어날 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시태양에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 및 그 등가물 범위 내의 방법 및 구조를 포함하도록 의도된다.
실시예 1: 인간 iPSC 유래 감각 전구 뉴런을 사용하는 AAV 캡시드 선택
iPSC 유래 감각 뉴런 배양 및 AAV 형질도입: Axol Bio의 인간 iPSC 감각 뉴런 전구세포는 통합이 없는 iPSC(유도 다능성 줄기 세포)에서 유래되었으며 소분자를 사용하여 뉴런으로 분화하였다. 세포를 추가로 배양하고, 뉴런을 강화하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 우리 실험실에서 5일 동안 분화하였다. 배양 5일째에 신경돌기가 더 두꺼워지고 길어졌으며, 세포체의 간격이 더 벌어졌다. 표시된 캡시드를 포함하고 3e5의 MOI(감염 다중도)에서 CMV 프로모터하에서 GFP 이식유전자를 암호화하는 다양한 AAV로 세포를 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일 및 5일에 세포를 이미지화하고 5일차에 RNA 및 단백질 발현 분석을 위해 수집하였다. 동일한 용해된 혼합물을 두 가지 분석에 사용하였다.
ELISA 평가: 샘플을 Abcam GFP ELISA 키트(ab171581) 세포 추출 완충액에서 용해시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Pierce Micro BCA 단백질 분석 키트(23235)를 사용하여 샘플당 총 단백질 농도를 결정하였다. 동시에, 제조업체의 프로토콜에 따라 Abcam GFP ELISA 키트(ab171581)를 사용하여 샘플당 GFP 농도를 결정하였다. 또한, 총 단백질(mg)당 GFP의 양(ng)을 샘플별로 결정하였다.
ddPCR 평가: Qiagen Inc의 RNeasy Plus Mini Kit cat# 74134 및 Fisher Scientific의 PURELINK DNAse Set, cat# 12185010에 대한 제조업체의 프로토콜을 사용하여 RNA를 분리하였다. Fisher Scientific의 SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50 키트, cat# 11766050을 사용하여 cDNA를 합성하였다. ddPCR 반응은 Integrated DNA Technologies에서 구입한 맞춤형 프라이머를 사용하여 수행하였고, Taqman 프로브는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했으며, 나머지 시약과 기기는 Bio-Rad에서 구입하였다. 이식유전자의 발현은 동일한 반응에서 하우스키핑 유전자와 비교되었으며 둘의 비율로 표시되었다.
첫 번째 세트의 시험관 내 실험에서, 우리는 12개의 AAV 캡시드 혈청형(AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV2, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF 및 AAV-PHP.S)을 테스트하였다. 세포 이미징 결과는 도 1에 도시되었고 ddPCR 평가 결과는 도 2에 도시되었다. 시험관 내 결과는 각 캡시드 혈청형에 의해 매개되는 다양한 수준의 GFP 발현을 입증하였다.
위 결과에 따르면, 7개의 AAV 캡시드 혈청형(AAV2.5-TV, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV 및 AAV-PHP.S)이 유망한 결과를 나타내었고 시험관 내 실험의 제 2 세트에서 테스트하였다. 첫 번째 테스트 세트와 유사하게, 두 번째 세트에서는 GFP 형광 수준의 세포 이미징(도 3), GFP 단백질 발현의 ELISA(도 4) 및 mRNA 수준의 ddPCR 평가(도 5)를 기반으로 형질도입 효율을 평가하였다. 결과는 AAV5 및 AAV6 혈청형이 mRNA의 경우 ddPCR 및 단백질의 경우 ELISA로 평가한 바와 같이 시험관 내에서 가장 높은 수준의 형질도입을 매개한다는 것을 보여주었으며, 7가지 혈청형 모두 후속 생체 내 실험에서 테스트하였다.
실시예 2: 쥐 후근 신경절(DRG)을 사용하는 신경병성 통증에 대한 AAV 캡시드 선택
ELISA 평가: 샘플을 Abcam GFP ELISA 키트(ab171581) 세포 추출 완충액에서 용해시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Pierce Micro BCA 단백질 분석 키트(23235)를 사용하여 샘플당 총 단백질 농도를 결정하였다. 동시에, 제조업체의 프로토콜에 따라 Abcam GFP ELISA 키트(ab171581)를 사용하여 샘플당 GFP 농도를 결정하였다. 또한, 총 단백질(mg)당 GFP의 양(ng)을 샘플별로 결정하였다.
ddPCR 평가: 조직은 Fisher Scientific의 Pink Rino RNA Lysis Kit cat# NC1307305를 사용하여 균질화하였으며, RNA는 Qiagen Inc의 RNeasy Plus Mini Kit 카탈로그 # 74134 및 Fisher Scientific의 PURELINK DNAse Set, cat# 12185010에 대한 제조업체의 프로토콜을 사용하여 분리하였다. Fisher Scientific의 SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50 키트, cat# 11766050을 사용하여 cDNA를 합성하였다. ddPR 반응은 통합 DNA 기술에서 구입한 맞춤형 프라이머를 사용하여 수행하였으며, Taqman 프로브는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했으며, 나머지 시약과 기기는 Bio-Rad에서 구입하였다. 이식유전자의 발현은 동일한 반응에서 하우스키핑 유전자와 비교되었으며 둘의 비율로 표시되었다.
면역형광 및 분석: (1) 조직 준비: 새로 해부된 DRG를 PBS 중 4% PFA에서 4시간 동안 고정하고 PBS 중 30% 수크로스에서 동결 보호하고 10μM로 절단하였다. (2) IHC 처리: 1차 항체를 4℃에서 밤새 배양하고, 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 적용하였다. DAPI 핵 염색은 조직 슬라이드 밀봉 시약에 포함되었다. 사용된 항체는 다음을 포함한다: (a) 1:250으로 희석된 당나귀 항-닭 488, Jackson Immunoresearch의 cat# 703-545-155와 결합된 1:1000으로 희석된 닭 항-GFP, Abcam의 cat# AB13970; (b) 1:250으로 희석된 당나귀 항-마우스 568, Thermo Fischer의 cat# A10037과 결합된 1:500으로 희석된 마우스 항-NeuN, Millipore Sigma의 cat# MAB377. (3) 이미징 및 정량화: Leica Application Suite X 하드웨어를 갖춘 Leica Thunder 현미경이 사용되었다. 각 DRG 전체의 NeuN 양성 세포 밀도 영역에서 20배 확대 이미지를 얻었다. GFP 양성 세포는 배경 신호 제거 시 수동으로 계산되고 표시되었다. GFP 양성 세포는 NeuN 신호와의 중첩에 대해 평가되었다. 실험 그룹에 대한 지식 없이 맹목적으로 단면을 세었다.
시험관 내 연구에 이어, 표시된 캡시드(AAV2.5-TV, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV 및 AAV-PHP.S)를 포함하고 GFP를 암호화하는 AAV를 5-6주령 수컷 스프라그-달리 쥐의 L3, L4 및 L5 DRG에 1e10 vg/DRG의 용량으로 일측으로 주사하였다. 4주 후, 이들 동물을 희생시키고, ddPCR(도 6), ELISA(도 7) 및 면역형광(도 8)에 의한 조직 평가를 위해 동측 및 주사되지 않은 반대측 L3, L4 및 L5 DRG를 절제하여 GFP mRNA, 단백질 및 세포 향성의 수준을 각각 측정하였다.
ddPCR 및 ELISA 결과에 따르면, 4가지 혈청형(AAV6, AAV5, AAV9-TV 및 AAV2.5-TV2YF)은 더 높은 수준의 이식유전자 발현을 나타냈으며, AAV5 및 AAV6 혈청형은 DRG 뉴런에서 가장 높은 수준의 형질도입을 매개하였다. 면역형광 분석을 통해 이들 두 가지 혈청형(AAV5 및 AAV6)이 뉴런을 형질전환하는 데 가장 효율적이라는 것이 확인되었다(도 8 및 도 9, 뉴런 마커 NeuN에 대해 공동 염색된 세포). 추가 세포 마커 염색은 테스트된 혈청형 중에서 추가의 세포 친화성을 나타내었다(도 10). NF200+ 뉴런은 가벼운 촉각 및 고유 감각을 위한 대부분 많이 수초화된 Aα 섬유와 적당히 수초화된 Aβ 섬유이다. IB4+ 뉴런은 통각을 위한 대부분 무수초화된 C 섬유 또는 Aδ 섬유이다. 그리고 CGRP+ 뉴런은 통각에 있어서 대부분 무수초화된 C 섬유이거나 약간 수초화된 Aδ 섬유이다. AAV9 및 AAV9-TV는 더 큰 수초화된 A 섬유 뉴런을 나타내는 하위 집단인 NF200(무거운 신경필라멘트) +ve 뉴런의 최고 비율을 형질도입하였다. 이러한 연구에 기초하여, CMV-GFP를 운반하는 AAV 캡시드의 하위 집합을 아프리카 녹색 원숭이의 DRG에 일측으로 직접 투여하여 신경병증성 통증 치료에 대한 추가 연구를 위해 DRG 및 TGG의 형질도입을 위한 최적의 캡시드를 최종 선택하였다.
실시예 3: 후근 신경절(DRG) 또는 삼차 신경절 형질도입을 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 선택 및 NHP 모델을 사용하는 신경병성 통증 치료
치료 및 조직 수집: 시험관 내 연구에 이어, 지정된 캡시드(AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6 및 AAV9-TV)를 포함하고 GFP를 암호화하는 AAV를 두 개의 개별 실험에서 수컷 녹색 원숭이(Chlorocebus sabaeus)의 L2, L3 및 L4 DRG에 일측으로 주사하였다: 연구 1(V01220)은 L2 DRG에서 3x1010 벡터 게놈(vg)의 용량 및 L3 및 L4 DRG에서 4.5x1010vg에서 AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6 및 AAV9-TV를 비교하였고 연구 2(V01331)는 L2 DRG에서 5x1010 vg의 용량 및 L3 및 L4 DRG에서 7.5x1010vg에서 AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6 및 AAV9-TV를 추가로 비교하였다. 두 연구 모두에서, AAV 치료 28일 후에, 동물을 희생시키고 L2, L3 및 L4 DRG(동측 및 반대측)를 각각 추출하고 즉시 세로로 절반으로 자른다. ddPCR mRNA 분석(도 11) 및 GFP 단백질 정량화(도 12a 및 도 12b)를 위해 절반을 급속 동결시켰다. 나머지 DRG 절반(동측 및 반대측)을 4% 파라포름알데하이드에 후고정하고 조직학 및/또는 면역조직화학 분석에 사용하여 캡시드의 GFP 및 세포 친화성 수준을 측정하였다(도 13a, 도 13b 및 도 13c).
ddPCR 평가: Pink RINO RNA 용해 키트(Thermo Fisher Scientific, Cat# NC1307305)를 사용하여 조직을 균질화하였다. RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Cat# 74134) 및 PureLink™ DNase Set(Thermo Fisher Scientific, Cat# 12185010)에 대한 제조업체의 프로토콜을 사용하여 RNA를 분리하였다. cDNA는 ezDNase™ 효소 키트(Thermo Fisher Scientific, Cat# 11766050)와 함께 SuperScript™ IV VILO™ Master Mix를 사용하여 합성하였다. ddPCR 반응은 Integrated DNA Technologies에서 구입한 맞춤형 프라이머, Thermo Fisher Scientific의 TaqMan™ 프로브, Bio-Rad의 나머지 시약 및 기기를 사용하여 수행되었다. 이식유전자의 발현은 동일한 반응에서 하우스키핑 유전자와 비교되었으며 둘의 비율로 표시되었다.
ELISA 평가: 제조업체의 프로토콜에 따라 GFP SimpleStep ELISA 키트(Abcam, Cat# ab171581)를 사용하여 샘플을 처리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Micro BCA™ Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat# 23235)를 사용하여 샘플당 총 단백질 농도를 측정하였다. 동시에, 제조업체의 프로토콜에 따라 샘플당 GFP 농도를 결정하였다. 또한, 총 단백질(mg)당 GFP의 양(ng)을 샘플별로 결정하였다.
면역형광 평가: L2, L3 및 L4 DRG는 Tissue-Tek OCT 화합물(Sakura Finetek, Cat# 4583)에서 차단되었다. 이 블록은 -80℃에서 동결된 후 Leica CM3050 저온 유지 장치에서 35μM 두께로 동결 절편되었으며 절편은 슬라이드에 직접 장착되었다. 그런 다음 표준 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 염색하였다. 선택된 슬라이드는 처음에 NeuN(Millipore, Cat# MAB377, 1:500), GFP(Abcam, Cat# 13970, 1:1000), 글루타민 합성효소(Abcam, Cat# 176562, 1:100) 및 DAPI(Roche, Cat# 10236276001, 1:1000)로 염색하였다. 이 패널에 사용된 보조 장치는 염소 항토끼 AlexaFluor750(Invitrogen, Cat# A21039, 1:1000), 염소 항닭 FITC(BioLegend, Cat# 410802, 1:500) 및 염소 항마우스 AlexaFluor647(Invitrogen, Cat# A21236, 1:500)를 포함하였다. 슬라이드는 Zeiss Zen 소프트웨어를 사용하여 Zeiss Axioscan.Z1에서 20x 배율로 이미지화되었다. 이미지는 피지 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 분석하였다.
데이터 분석/해석: 연구 1(V01220)의 ddPCR 결과에 따르면(도 11), AAV5, AAV6 및 AAV9-TV는 NHP DRG에서 비슷한 수준의 이식유전자 발현을 가졌고, 이는 AAV2.5-TV2YF를 사용하는 이식유전자 발현보다 더 높았다. 단백질 발현 수준이 연구 1(V01220)에서 ELISA로 측정된 경우(도 12a), 전달된 AAV9-TV가 전달된 이식유전자가 가장 높은 단백질 발현 수준을 가졌고, AAV6, AAV5, AAV2.5-TV2YF가 그 뒤를 이었다. 연구 1(V01220)(도 13a 및 도 13b)에서의 면역조직학적 분석은 혈청형 AAV5, AAV6 및 AAV9TV가 등근 신경절 내의 뉴런을 형질전환하는 데 더 효율적이라는 것을 확인시켜 주었다. AAV6 처리 그룹은 발현 측면에서 매우 다양하였다. 추가적으로, 글루타민 합성효소(위성 신경교 마커)와의 GFP 공동화에 의해 볼 수 있듯이, AAV6 혈청형은 신경교 세포를 자주 형질도입하는 것처럼 보인다. 따라서, 혈청형 AAV5 및 AAV9-TV를 연구 2(V01331)의 추가 평가를 위해 선택하였다. GFP를 보유하는 AAV5 및 AAV9-TV 캡시드로 형질도입된 NHP DRG 샘플에 대한 직교 테스트는 ELISA(도 12b) 및 면역조직학적 분석(도 13c)에 의해 측정된 바와 같이 AAV9-TV 혈청형을 갖는 DRG 뉴런에서 높은 수준의 발현을 보여주었다. 이러한 결과는 AAV9-TV가 직접 주사 후 DRG 뉴런의 형질도입에 사용하기 위한 최적의 캡시드임을 시사하였다.
실시예 4: 신생아 래트 혼합 해마 배양물을 사용하는 AAV 캡시드 선택
혼합 E18 해마 배양 및 AAV 형질도입: 배아 18일째에 래트 해마를 분리하고 더 작은 조각으로 절단한 다음 부드럽게 트립신 처리하고 기계적으로 해리하였다. 단일 세포 현탁액을 성장 인자가 있는 배지에 플레이팅하고 분열(비-뉴런 세포)의 생존을 억제하는 시약으로 처리하여 뉴런에 대한 배양을 풍부하게 하였다. 배양 1일째에, 표시된 캡시드를 포함하고 1e5 또는 3e5의 MOI(감염 다중도)에서 CMV 프로모터 하에 GFP 이식유전자를 암호화하는 다양한 AAV로 세포를 형질도입하였다. 형질도입 후 3일 및 5일에 세포를 이미지화하고 5일에 RNA 발현 분석을 위해 수집하였다.
mRNA 수준의 ddPCR 평가: Qiagen Inc의 RNeasy Plus Mini Kit cat# 74134 및 Fisher Scientific의 PURELINK DNase Set, cat# 12185010에 대한 제조업체의 프로토콜을 사용하여 RNA를 분리하였다. Fisher Scientific의 SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50 키트, cat# 11766050을 사용하여 cDNA를 합성하였다. ddPR 반응은 Integrated DNA Technologies에서 구입한 맞춤형 프라이머를 사용하여 수행하였고, Taqman 프로브는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했으며, 나머지 시약과 기기는 Bio-Rad에서 구입하였다. 이식유전자의 발현은 동일한 반응에서 하우스키핑 유전자와 비교되었으며 둘의 비율로 표시되었다.
시험관 내 실험의 첫 번째 세트에서, 12개의 AAV 캡시드 혈청형(AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV2, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF 및 AAV-PHP.S)를 테스트하였다. 세포 이미징 결과는 도 14(MOI 1e5)에 나타내었고 ddPCR 평가 결과를 도 15(MOI 1e5)에 나타내었다. 시험관 내 결과는 각 캡시드 혈청형에 의해 매개되는 다양한 수준의 GFP 발현을 입증하였다.
상기 결과에 따르면, 7개의 AAV 캡시드 혈청형(AAV2.5-TV, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV 및 AAV-PHP.S)이 유망한 결과를 나타냈고 시험관 내 실험의 첫 번째 세트에서 테스트되었다. 첫 번째 테스트 세트와 유사하게, 두 번째 세트에서는 3e5의 MOI에서 GFP 형광 수준의 세포 영상화(도 16) 및 mRNA 수준의 ddPCR 평가(도 17)를 기반으로 형질도입 효율을 평가하였다.
실시예 5: 쥐 해마의 초점 간질에 대한 AAV 캡시드 선택
ELISA 평가: 샘플을 Abcam GFP ELISA 키트(ab171581) 세포 추출 완충액에서 용해시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Pierce Micro BCA 단백질 분석 키트(23235)를 사용하여 샘플당 총 단백질 농도를 결정하였다. 동시에, 제조업체의 프로토콜에 따라 Abcam GFP ELISA 키트(ab171581)를 사용하여 샘플당 GFP 농도를 결정하였다. 또한, 총 단백질(mg)당 GFP의 양(ng)을 샘플별로 결정하였다.
ddPCR 평가: 조직은 Fisher Scientific의 Pink Rino RNA Lysis Kit cat# NC1307305를 사용하여 균질화하였으며, RNA는 Qiagen Inc의 RNeasy Plus Mini Kit cat# 74134 및 Fisher Scientific의 PURELINK DNase Set, cat# 12185010에 대한 제조업체의 프로토콜을 사용하여 분리하였다. Fisher Scientific의 SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50 키트, cat# 11766050을 사용하여 cDNA를 합성하였다. ddPCR 반응은 Integrated DNA Technologies에서 구입한 맞춤형 프라이머를 사용하여 수행되었고, Taqman 프로브는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했으며, 나머지 시약과 기기는 Bio-Rad에서 구입하였다. 이식유전자의 발현을 동일한 반응에서 하우스키핑 유전자와 비교하여 둘의 비율로 표현하였다.
면역형광 염색 및 분석: (1) 조직 준비: 새로 해부된 DRG를 PBS 중 4% PFA에서 24시간 동안 고정하고 PBS 중 30% 수크로스에서 동결 보호하고 10μM로 절단하였다. (2) IHC 처리: 1차 항체를 4℃에서 밤새 배양하고, 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 적용하였다. DAPI 핵 염색은 조직 슬라이드 밀봉 시약에 포함되었다. 사용된 항체는 다음을 포함한다: (a) 1:250으로 희석된 당나귀 항-닭 488, Jackson Immunoresearch의 cat# 703-545-155와 결합된 1:1000으로 희석된 닭 항-GFP, Abcam의 cat# AB13970; (b) 1:250으로 희석된 당나귀 항-마우스 568, Thermo Fischer의 cat# A10037과 결합된 1:500으로 희석된 마우스 항-NeuN, Millipore Sigma의 cat# MAB377; (c) 1:250으로 희석된 당나귀 항-토끼 647, BioLegend의 cat# 406414와 결합된 1:500으로 희석된 토끼 항-GFAP, Agilent Z033429-2의 cat# Z033429-2. (3) 이미징 및 분석: Zen 3.1 블루 에디션이 포함된 Zeiss Axioscan.Z1을 사용하여 이미징하였다. 확대된 이미지는 독점 코드를 사용하여 처리되어 양성 신호의 확산과 강도를 평가하였다.
시험관 내 연구에 이어, AAV2.5-TV, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV 또는 AAV-PHP.S 캡시드를 포함하고 GFP를 암호화하는 AAV를 5-6주령 수컷 스프라그-달리 쥐의 해마에 양측으로 직접 투여하였다. 4주 후, 이들 동물을 희생시키고, 이들의 우뇌 및 좌뇌 반구를 절제하고 ddPCR(도 18), ELISA(도 19) 및 면역형광(도 20)에 의한 조직 평가를 위해 추가로 해부하여 각각 GFP mRNA, 단백질 및 세포 향성 수준을 측정하였다.
ddPCR 및 ELISA 결과는 AAV6이 가장 강한 발현을 매개했으며, AAV9 및 AAV9-TV가 바로 그 뒤를 이었다는 것을 나타내었다. 다양한 세포 마커와 함께 GFP 발현의 면역형광 분석은 모든 혈청형이 주로 뉴런을 형질도입하는 반면, AAV5, AAV6 및 AAV-PHP.S도 일부 성상교세포를 형질도입한다는 것을 나타내었다. 해마의 GFP 적용 범위 백분율을 보여주는 도 21a에 따르면, AAV9 및 AAV9TV 캡시드가 가장 많은 적용 범위를 매개하였다. 양성 픽셀당 GFP 강도를 나타낸 도 21b에 따르면, AAV9와 AAV6이 가장 높은 강도를 매개하였다.
이들 연구에 기초하여, AAV 캡시드의 서브세트를 아프리카 녹색 원숭이의 해마에 직접 투여하여 초점 간질 치료를 위한 해마에서의 신경 전달을 위한 최적의 캡시드를 최종 선택하였다.
실시예 6: 해마 뉴런 형질도입을 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 캡시드 선택 및 NHP 모델을 사용하는 초점 간질 치료
치료 및 조직 수집: 시험관 내 연구에 이어, 지정된 캡시드(AAV5, AAV6, AAV9 및 AAV9-TV)를 포함하고 GFP를 암호화하는 AAV를 두 개의 개별 실험에서 수컷 녹색 원숭이(Chlorocebus sabaeus)의 해마에 양측으로 주사하였다: 연구 1(V01220)은 L2 DRG에서 6x1010 벡터 게놈(vg)의 용량에서 AAV5, AAV6, AAV9 및 AAV9-TV를 비교하였고 연구 2(V01331)는 1x1011 vg의 용량에서 AAV5 및 AAV9를 추가로 비교하였다. 두 연구 모두에서, AAV 치료 28일 후에, 동물을 희생시키고 오른쪽 해마를 분리한 후 뇌의 오른쪽 반구를 추가로 해부하고 단백질 및 mRNA 분석을 위해 급속 냉동하였다. 뇌의 왼쪽 반구 전체를 4% 파라포름알데하이드에 후고정하고 조직학 및/또는 면역조직화학 분석에 사용하여 GFP 및 세포 향성 수준을 측정하였다.
ddPCR 평가: Pink RINO RNA 용해 키트(Thermo Fisher Scientific, Cat# NC1307305)를 사용하여 조직을 균질화하였다. RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Cat# 74134) 및 PureLink™ DNase Set(Thermo Fisher Scientific, Cat# 12185010)에 대한 제조업체의 프로토콜을 사용하여 RNA를 분리하였다. cDNA는 ezDNase™ 효소 키트(Thermo Fisher Scientific, Cat# 11766050)와 함께 SuperScript™ IV VILO™ Master Mix를 사용하여 합성하였다. ddPCR 반응은 Integrated DNA Technologies에서 구입한 맞춤형 프라이머, Thermo Fisher Scientific의 TaqMan™ 프로브, Bio-Rad의 나머지 시약 및 기기를 사용하여 수행하였다. 이식유전자의 발현은 동일한 반응에서 하우스키핑 유전자와 비교되었으며 둘의 비율로 표시되었다.
ELISA 평가: 제조업체의 프로토콜에 따라 GFP SimpleStep ELISA 키트(Abcam, Cat# ab171581)를 사용하여 샘플을 처리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Micro BCA™ Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat# 23235)를 사용하여 샘플당 총 단백질 농도를 측정하였다. 동시에, 제조업체의 프로토콜에 따라 샘플당 GFP 농도를 결정하였다. 또한, 총 단백질(mg)당 GFP의 양(ng)을 샘플별로 결정하였다.
면역형광 평가: 블록당 총 2개의 뇌 반구가 있는 Tissue-Tek OCT 화합물(Sakura Finetek, Cat# 4583)의 블록에 뇌 조직 샘플을 매립하였다. 블록을 -80℃에서 동결한 다음 슬라이딩 마이크로톰에서 40μM 두께로 동결 절편하였다. 절편을 수집하여 항원 보존 용액에 보관하였다. 선택된 섹션을 장착하고 NeuN(EnCor Biotechnology, Cat# MCA-1B7), GFAP(Dako, Cat# Z0334), GFP(Abcam, Cat# ab13970) 및 Hoechst로 염색하였다. 정량적/정성적 분석을 위해 Olympus VS200 Research Slide Scanner에서 단면을 20배 확대하여 이미지화하였다.
데이터 분석/해석: 연구 1(V01220)의 ddPCR 및 ELISA 결과에 따르면, AAV5 및 AAV9는 NHP 해마에서 AAV6 및 AAV9-TV에 비해 이식유전자(도 22a) 및 단백질(도 23a) 발현 수준이 더 높았다. 면역-조직학적 분석은 AAV5 및 AAV9가 전체적으로 가장 높은 형질도입을 나타냄을 확인시켜 주었다(도 24a). 따라서 이 두 캡시드는 후속 연구 2(V01331)에서 추가 평가를 위해 선택되었다. ddPCR(도 22b), ELISA(도 23b) 및 면역형광(도 24b)에 기초한 직교 결과는 AAV9가 직접 주사 후 해마에서 뉴런의 형질도입에 사용하기 위한 최적의 캡시드임을 시사하였다.
실시예 7: 초점 간질 치료를 위한 조작된 리간드 개폐 이온 채널
방법: 성체 수컷 C57BL/6 마우스에게 AAV9 구조체를 해마에 양측으로 주사하여 CODA71 키메라 수용체(SEQ ID NO: 33) 또는 스크램블된 대조 벡터를 발현시켰다. 천공 경로 전기 자극에 반응하여 유발된 해마 발작 역치의 변화를 측정하였다. 자발적 발작 실험을 위해, AAV9 주사 및 EEG 전극 이식 3주 전에 마우스에게 카이닉산(KA)을 해마내로 일측으로 주사하여 간질을 유도하였다.
결과: CODA71 키메라 염화물 채널은 해마 뉴런에서 잘 발현되며 선택적 작용제 TC-5619 적용(TC-5619 레오베이스: 368±39.7 pA; 비히클 레오베이스: 80±15.4 pA; p =0.002) 후 급성 절편에서 뉴런 발화를 효과적으로 억제한다. 유발된 국소적 해마 전기적 발작에 대한 생체 내 민감성을 변경하는 능력이 평가되었다. 심전성 발작을 유발하는 최소 역치 잠재력은 스크램블된 대조군(-10±13.2%; p=0.0166)보다 CODA71 동물(139±48.0%)에서 i.p. TC-5619(100mg/kg) 이후 훨씬 더 증가하였다. 많은 인간 측두엽 간질 특징을 복제하는 해마내 KA 초점 간질 모델에서 자발적 발작을 제어하는 효능을 테스트하기 위해 추가 실험이 수행되었다. 전기적 발작 기간과 빈도 모두 간질 마우스에서 i.p. TC-5619 주사에 의해 크게 감소하였다(p=0.0011; p=0.0325). 이러한 결과는 AAV9에 의한 CODA71 LGIC 수용체의 표적화된 전달이 국소 발작을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증하였다. 이러한 실험의 결과는 아래에 기술되어 있다.
도 25에 도시된 바와 같이, 인간 시냅신 1 유전자 프로모터(hSyn)에 작동 가능하게 연결된 CODA71 LGIC 수용체를 암호화하는 핵산의 AAV9 전달은 CA1 뉴런에서 CODA71 수용체의 효과적인 발현을 유도하였다.
도 26에 도시된 바와 같이, α7 nAchR 효현제 TC-5619를 사용하는 CODA71의 활성화는 급성 절편에서 CA1 활동 전위 발화를 억제하였다. 여기서, CA1 뉴런의 반응은 전체 세포 전류 클램프 기록 중에 150nM TC-5619를 1분간 적용하여 기록되었다. 모든 시간은 녹음 시작을 기준으로 하며 TC-5619 적용은 1분에 시작된다. 유지 전류는 모든 기록이 기준선에서 -65mV 휴지 막 전위에 있도록 조정되었다.
도 27a 및 27b에 도시된 바와 같이, 기록된 CA1 뉴런 전체 세포의 고유 특성은 150nM TC-5619를 1분 적용한 후 빠르게 변화하였다.
도 28에 도시된 바와 같이, 효현제 TC-5619가 뉴런 특성에 영향을 미치기 위해서는 CODA71 수용체의 활성화가 필요하였다. α7-nAChR 리간드 결합 도메인이 분가로톡신(BTX)에 의해 억제된 경우, TC-5619를 첨가하면 스크램블된 대조군 벡터와 비교하여 CODA71 벡터로 형질도입된 뉴런의 특성 변화가 거의 발생하지 않았다.
한 세트의 동물 연구에서, 발작 역치 테스트 2주 전에, CODA71은 CA1 및 천공 경로의 양극 전극 배치와 함께 CA1/DG에서 양측으로 발현되었다. 역치 테스트 45분 전에, 마우스에게, i.p. 주사를 통해 100mg/kg TC-5619 또는 식염수를 투여하였다. 증가하는 진폭의 전기 자극(60Hz에서 1초, 1ms 펄스)은 전기적 발작이 유발될 때까지 100초마다 전달되었다(도 29).
도 30에 도시된 바와 같이, CODA71 활성화에 따라 전기 유발 발작 역치가 증가하였다. 여기에서 유발된 발작 역치는 증가하는 진폭 전기 자극에 대한 반응을 모니터링하고 각 시험에서 지속적인 간질 형태 활동을 유발하는 데 필요한 최소 자극 진폭으로 결정되었다.
도 31에 도시된 바와 같이, TC-5619로 처리된 CODA71 벡터 주입 마우스에서 발작 역치가 더 증가한 반면, TC-5619는 스크램블 대조군 벡터 주입 마우스에서 발작 역치를 변화시키지 않았다.
한 세트의 동물 연구에서, 뉴런 활동을 테스트하기 7주 전에 카이닉산을 CA1에 일측으로 주사하여 자발적인 발작을 유발하였다. 5주 후, CODA71 수용체는 EEG 기록을 위해 CA1에 양극 전극 배치와 함께 CA1/DG에서 양측으로 발현되었다(도 32). 자발적 발작은 만성 뇌파 기록을 통해 추적하였다. 격일로 생쥐는 100mg/kg TC-5619 또는 식염수를 2시간 간격으로 2회 i.p. 주사하였다. 결과는 CODA71 벡터 또는 스크램블된 대조군 벡터가 주입된 마우스에서 유사한 기준선 발작을 보여주었다(도 33). 그러나, TC-5619 투여 후 CODA71 벡터를 주사한 마우스에서는 자발적 발작 빈도가 급격하게 감소한 반면, 스크램블된 대조군 벡터를 주사한 마우스에서는 거의 변화가 없었다. 그리고 이러한 효과는 TC-5619 투여 시 CODA71 벡터가 형질도입된 마우스에서만 관찰되었고, 비히클 대조군 투여 시에는 관찰되지 않았다. 도 34a 및 34b 참조. 따라서, CODA71 수용체와 TC-5619 효현제의 조합은 자발성 국소 발작을 개선할 수 있었다.
도 35에 도시된 바와 같이, CODA71 벡터를 주사한 마우스는 TC-5619 투여 후 발작 빈도의 장기간 감소를 보였지만 비히클 대조군에서는 그렇지 않았다. 그리고 도 36에 도시된 바와 같이, CODA71 벡터를 주사한 생쥐 역시 TC-5619 투여 후 발작 기간이 크게 감소한 것으로 나타났으나, 비히클 대조군에서는 그렇지 않았다. 스크램블된 대조 벡터를 주사한 마우스에서는 그러한 효과가 관찰되지 않았다.
본 연구의 결과는 CODA71 수용체 암호화 핵산의 AAV9에 의한 해마 형질도입이 해마 신경 흥분성을 성공적으로 억제하고, 유발 및 자발적 국소 발작을 모두 예방하고, 초점 간질 치료를 위한 특정 뉴런 집단에 대한 표적화를 개선했음을 보여주었다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참고로 포함된다. 그러나, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 어느 나라의 공통적인 일반 지식의 일부를 구성한다는 것을 인정하거나 어떤 형태의 제안으로 간주되어서는 안 된다.

Claims (121)

  1. 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여 치료가 필요한 대상에서 신경병성 통증을 치료하는 방법으로서, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하고, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런인 신경병성 통증을 치료하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    신경병성 통증은 말초 신경병증인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    신경병성 통증은 삼차 신경통인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 9에 따른 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 AAV9-TV 벡터인 방법.
  5. 뉴런을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여 뉴런을 형질도입하는 방법으로서, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 이종 핵산을 포함하는 것인 방법.
  7. 뉴런을 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 이종 핵산을 뉴런에 전달하는 방법으로서, 뉴런은 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 시험관 내에서 iPSC 유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 시험관 내에서 iPSC-유래 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV2, AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AA9-2YF, AAV9-TV2YF 또는 AAV-PHP.S 벡터인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV9-TV 벡터인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV6 벡터인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV5 벡터인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV2.5-TV2YF 벡터인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 3 및 5-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 5-7 및 9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하고, 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 T492에 상응하는 위치에 비-트레오닌 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    비-트레오닌 돌연변이는 발린, 아이소류신 또는 류신 치환인 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    비-트레오닌 돌연변이는 발린 치환인 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 후근 신경절 뉴런인 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 삼차 신경절 뉴런인 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 아이소렉틴 B4(IB4) 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 NF200 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 CGRP 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 C 섬유를 포함하는 것인 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 Aδ 섬유를 포함하는 것인 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 경막내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    AAV 벡터는 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 투여되는 것인 방법.
  30. 대상에게 유효량의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법으로서, AAV 벡터는 대상에서 뉴런을 형질도입하고, 뉴런은 해마 뉴런인 방법.
  31. 뉴런을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 뉴런을 형질도입하는 방법으로서, 뉴런은 해마 뉴런인 방법.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    AAV 벡터는 이종 핵산을 포함하는 것인 방법.
  33. 뉴런을 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 이종 핵산을 뉴런에 전달하는 방법으로서, 뉴런은 해마 뉴런인 방법.
  34. 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터인 방법.
  35. 제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 시험관 내에서 배아 해마 뉴런을 형질도입할 수 있는 AAV 벡터로서 AAV 벡터를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  36. 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV2, AAV2.5, AAV2.5-TV, AAV2.5-2YF, AAV2.5-TV2YF, AAV5, AAV6, AAV9, AAV9-TV, AAV9-2YF, AAV9-TV2YF, 또는 AAV-PHP.S 벡터인 방법.
  37. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV9 벡터인 방법.
  38. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV9-TV 벡터인 방법.
  39. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV6 벡터인 방법.
  40. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 AAV5 벡터인 방법.
  41. 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  42. 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 3 및 5-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  43. 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 6-9 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  44. 제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 SEQ ID NO: 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  45. 제 30 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 흥분성 뉴런인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    뉴런은 CAMK2 양성 뉴런인 방법.
  47. 제 30 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 억제성 뉴런인 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    뉴런은 GABAergic 뉴런인 방법.
  49. 제 30 항 내지 제 48 항 중 어느 하나에 있어서,
    초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)인 방법.
  50. 제 30 항 내지 제 49 항 중 어느 하나에 있어서,
    AAV 벡터는 두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(시스테나 마그나) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    AAV 벡터는 해마의 간질 초점에 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  52. 제 6 항 내지 제 29 항 및 제 32 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    리간드 개폐 이온 채널은 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유도된 리간드 결합 도메인 및 인간 글리신 수용체로부터 유도된 이온 기공 도메인을 포함하는 것인 방법.
  54. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 23-220과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 잔기로부터 선택된 잔기에 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  56. 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 표 3에 열거된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101W, Y115E 및 Y210W에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  58. 제 56 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101W 및 Y210V에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  59. 제 56 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33에서 R101M 및 L131F에 상응하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  60. 제 53 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 255-457, SEQ ID NO: 27의 260-452, SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  62. 제 53 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유도된 Cys-루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-172를 포함하는 것인 방법.
  64. 제 62 항에 있어서,
    Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-180을 포함하는 것인 방법.
  65. 제 53 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
  66. 제 65 항에 있어서,
    β1-2 루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 81-84를 포함하는 것인 방법.
  67. 제 53 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이고, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  68. 제 52 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  69. 제 68 항에 있어서,
    리간드는 AZD-0328, TC-6987, ABT-126, TC-5619, TC-6683, 바레니클린, 및 파시니클린/RG3487로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제 68 항에 있어서,
    리간드는 TC-5619 또는 ABT-126인 방법.
  71. 제 1 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 영장류인 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    대상은 인간, 선택적으로 성인 인간인 방법.
  73. 다음을 포함하는 키트:
    (a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
    (b) 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침.
  74. 제 73 항에 있어서,
    척수강내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여를 통한 AAV 벡터의 투여에 적합한 장치를 추가로 포함하는 것인 키트.
  75. 제 74 항에 있어서,
    장치는 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절로 직접 투여에 적합한 것인 키트.
  76. 다음을 포함하는 키트:
    (a) 캡시드 폴리펩타이드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 캡시드 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1-12 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
    (b) 해마 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV 벡터를 투여하기 위한 지침.
  77. 제 76 항에 있어서,
    두개내 투여, 척수강내(척추) 투여, 척수강내(시스테나 마그나) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사를 통한 AAV 벡터의 투여에 적합한 장치를 추가로 포함하는 것인 키트.
  78. 제 77 항에 있어서,
    장치는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의한 투여에 적합한 것인 키트.
  79. 제 73 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 벡터는 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 것인 키트.
  80. 제 79 항에 있어서,
    리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  81. 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서,
    키트는 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 포함하는 것인 키트.
  82. 제 81 항에 있어서,
    리간드는 TC-5619 또는 ABT-126인 키트.
  83. 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 신경병증성 통증을 치료하는 방법으로서, 이종 핵산은 대상의 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런에 전달되며, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  84. 제 83 항에 있어서,
    신경병성 통증은 말초 신경병증인 방법.
  85. 제 83 항에 있어서,
    신경병성 통증은 삼차 신경통인 방법.
  86. 제 83 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산은 경막내(IT) 또는 신경절내(IG) 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  87. 제 86 항에 있어서,
    이종 핵산은 신경절내(IG) 투여에 의해 후근 신경절 또는 삼차 신경절에 직접 투여되는 것인 방법.
  88. 제 83 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산은 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
  89. 제 88 항에 있어서,
    벡터는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 후근 신경절 뉴런 또는 삼차 신경절 뉴런을 형질도입하는 것인 방법.
  90. 제 83 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 아이소렉틴 B4(IB4) 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
  91. 제 83 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 NF200 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
  92. 제 83 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 CGRP 양성 신경 섬유를 포함하는 것인 방법.
  93. 제 83 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 C 섬유를 포함하는 것인 방법.
  94. 제 83 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 Aδ 섬유를 포함하는 것인 방법.
  95. 유효량의 이종 핵산을 투여하는 단계를 포함하여, 치료가 필요한 대상에서 초점 간질을 치료하는 방법으로서, 이종 핵산은 대상의 해마 뉴런으로 전달되고, 이종 핵산은 리간드 개폐 이온 채널을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  96. 제 95 항에 있어서,
    이종 핵산은 두개내 투여, 경막내(척추) 투여, 척수강내(시스테나 마그나) 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여 또는 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  97. 제 96 항에 있어서,
    이종 핵산은 해마의 간질 초점으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
  98. 제 95 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산은 벡터 내에 포함되는 것인 방법.
  99. 제 98 항에 있어서,
    벡터는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 해마 뉴런을 형질도입하는 것인 방법.
  100. 제 95 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 흥분성 뉴런인 방법.
  101. 제 100 항에 있어서,
    뉴런은 CAMK2 양성 뉴런인 방법.
  102. 제 95 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴런은 억제성 뉴런인 방법.
  103. 제 102 항에 있어서,
    뉴런은 GABAergic 뉴런인 방법.
  104. 제 95 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 있어서,
    초점 간질은 근심 측두엽 간질(mTLE)인 방법.
  105. 제 83 항 내지 제 104 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드 개폐 이온 채널은 인간 α7 니코틴성 아세틸콜린 수용체(α7-nAChR)로부터 유도된 리간드 결합 도메인 및 인간 글리신 수용체로부터 유도된 이온 기공 도메인을 포함하는 것인 방법.
  106. 제 105 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 잔기 23-220과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  107. 제 106 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 W77, R101, Y115, L131, Q139, Y140, S170, S172 및 Y210에 상응하는 잔기로부터 선택되는 잔기에 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  108. 제 105 항 또는 제 106 항에 있어서,
    리간드 결합 도메인은 표 3에 열거된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  109. 제 105 항 내지 제 108 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1, 인간 글리신 수용체 α2, 또는 인간 글리신 수용체 α3인 방법.
  110. 제 109 항에 있어서,
    이온 기공 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 255-457, SEQ ID NO: 27의 260-452, SEQ ID NO: 28의 아미노산 259-464, 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 259-449와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  111. 제 105 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체로부터 유도된 Cys-루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
  112. 제 111 항에 있어서,
    Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-172를 포함하는 것인 방법.
  113. 제 111 항에 있어서,
    Cys-루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 166-180을 포함하는 것인 방법.
  114. 제 105 항 내지 제 113 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작된 수용체의 리간드 결합 도메인은 인간 글리신 수용체 α1 서브유닛으로부터의 β1-2 루프 도메인을 포함하는 것인 방법.
  115. 제 114 항에 있어서,
    β1-2 루프 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 81-84를 포함하는 것인 방법.
  116. 제 105 항 내지 제 115 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 글리신 수용체는 인간 글리신 수용체 α1이고, 리간드 개폐 이온 채널은 SEQ ID NO: 33에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  117. 제 83 항 내지 제 116 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 리간드 개폐 이온 채널의 리간드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  118. 제 117 항에 있어서,
    리간드는 AZD-0328, TC-6987, ABT-126, TC-5619, TC-6683, 바레니클린, 및 파시니클린/RG3487로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  119. 제 117 항에 있어서,
    리간드는 TC-5619 또는 ABT-126인 방법.
  120. 제 83 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 영장류인 방법.
  121. 제 120 항에 있어서,
    대상은 인간, 선택적으로 성인 인간인 방법.
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