CN116997647A - 用于治疗局灶性癫痫和神经性疼痛的腺相关病毒衣壳和工程化配体门控离子通道 - Google Patents

用于治疗局灶性癫痫和神经性疼痛的腺相关病毒衣壳和工程化配体门控离子通道 Download PDF

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CN116997647A CN202280022407.7A CN202280022407A CN116997647A CN 116997647 A CN116997647 A CN 116997647A CN 202280022407 A CN202280022407 A CN 202280022407A CN 116997647 A CN116997647 A CN 116997647A
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Abstract

本公开文本提供了用于治疗神经性疼痛或局灶性癫痫的组合物和方法。进一步提供了适合用于转导与神经性疼痛或局灶性癫痫相关的神经元的AAV衣壳多肽和/或核酸。本公开本文涉及包含特定衣壳多肽的AAV载体，所述AAV载体为负责神经性疼痛或局灶性癫痫管理的神经元提供希望的转导效率和/或向性。

Description

用于治疗局灶性癫痫和神经性疼痛的腺相关病毒衣壳和工程 化配体门控离子通道
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月25日提交的美国临时申请号63/141,124、2021年1月25日提交的美国临时申请号63/141,121和2021年12月3日提交的美国临时申请号63/285,929的权益，将每个文献的内容通过引用以其整体并入本文。
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背景技术
顽固性神经系统疾病经常与异常地起作用的神经元相关联。与该疾病相关联的易处理的靶蛋白的缺乏已经阻碍了开发用于治疗这些病症的疗法的尝试。
关于慢性疼痛最常用的疗法是应用阿片类镇痛剂和非甾体类抗炎药，但这些药物会导致成瘾并可能引起副作用，如药物依赖性、耐受性、呼吸抑制、镇静、认知失败、幻觉以及其他全身性副作用。尽管广泛使用药物，但其在缓解疼痛的有效性方面成功率非常低。用于治疗疼痛的侵入性更高的选择包括神经传导阻滞和电刺激。用于管理疼痛的侵入性最高且最不受欢迎的方法是通过手术完全去除引起疼痛的神经或其部分。
局灶性癫痫是一种慢性且使人衰弱的神经系统障碍，在美国影响超过2百万人，并且特征是从大脑中的特定位置开始的不可预测的癫痫发作。反复癫痫发作会导致认知和情绪缺陷，目前的干预措施功效有限，并且有多种副作用。局灶性癫痫发作源于神经元子集的异常放电，但大多数抗癫痫药物依赖于全身性化合物施用并改变全脑活动。因此，癫痫患者由于参与正常认知的神经元的无意调节和其他生物系统中不希望的脱靶变化而承受重大副作用。
理想的疼痛和局灶性癫痫治疗只会改变负责疼痛和/或癫痫发作产生的特定神经元的活动。因此，治疗疼痛或局灶性癫痫的新策略是将重组核酸编码的异源蛋白递送到神经元亚群中以控制异常活动。例如，可以用编码工程化配体门控离子通道(化学遗传受体)的腺相关病毒(AAV)载体来转导靶神经元，这些工程化配体门控离子通道对特定小分子配体高度响应但原本是无活性的，从而导致可调谐的功效。
这种策略可用于治疗神经性疼痛，特别是周围神经病和三叉神经痛。前者是由周围神经系统的损伤或功能障碍导致的常见神经系统障碍。其特征是麻木、刺痛和疼痛，通常始于手和脚，但也会影响身体的其他区域。三叉神经痛也称为自杀疾病，由保护三叉脑神经的髓鞘的损伤引起，会引起极端的、散发的休克样面部疼痛，可持续几秒钟到几分钟。当前的药理学和外科手术方法几乎没有缓解作用，并且有成瘾的可能，同时具有显著的副作用。由于背根神经节(DRG)和三叉神经节(TGG)是疼痛传递过程中的活性结构，因此工程化化学遗传受体可以通过AAV介导的基因转移在DRG和TGG的神经元中表达。
这种策略的一个考虑因素是AAV载体对靶神经元群体(例如，在DRG和TGG或海马体中)的转导效率和向性。本领域需要使用AAV载体有效地转导特定的神经元亚群的安全且高效的策略。
这种策略的另一个考虑因素是用于控制神经元活动的异源蛋白的选择。最近，改变癫痫发作活动的仅由设计药物激活的设计受体(DREADD)在动物癫痫模型中产生了有前景的结果。然而，抑制性DREADD依赖于通过第二信使间接激活离子通道的G蛋白偶联受体，并且会不一致地改变神经元电位。本领域需要用于控制神经元活动(例如，在DRG和TGG中)的替代蛋白(工程化配体门控离子通道)，以用于治疗神经性疼痛如周围神经病和三叉神经痛，或用于在局灶性癫痫治疗中控制神经元活动。
本公开文本提供了此类AAV载体、工程化配体门控离子通道等。
发明内容
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元，并且其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。在一些实施方案中，所述神经性疼痛是周围神经病。在一些实施方案中，所述神经性疼痛是三叉神经痛。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元。在一些实施方案中，所述神经系统疾病或障碍是神经性疼痛、痉挛状态、脊髓损伤或撕脱伤。
在一些实施方案中，所述AAV载体是包含衣壳多肽的AAV9-TV载体，所述衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
在一个方面，本公开文本提供了转导神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。在一些实施方案中，所述方法体外转导所述神经元。在一些实施方案中，所述方法体内转导所述神经元。
在一些实施方案中，所述AAV载体包含异源核酸。
在一个方面，本公开文本提供了将异源核酸递送至神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
在一些实施方案中，所述AAV载体是能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。在一些实施方案中，所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。
在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV2、AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF或AAV-PHP.S载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV9-TV载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV6载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV5载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV2.5-TV2YF载体。
在一些实施方案中，所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3和5-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:5-7和9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述衣壳多肽在对应于SEQ ID NO:8的T492的位置处包含非苏氨酸突变。在一些实施方案中，所述非苏氨酸突变是缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代。在一些实施方案中，所述非苏氨酸突变是缬氨酸取代。
在一些实施方案中，所述神经元是背根神经节神经元。在一些实施方案中，所述神经元是三叉神经节神经元。在一些实施方案中，所述神经元包含同工凝集素B4(IB4)阳性神经纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含NF200阳性神经纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含CGRP阳性神经纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含C纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含Aδ纤维。
在一些实施方案中，通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用所述AAV载体。在一些实施方案中，将所述AAV载体通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元，并且其中所述神经元是海马体神经元。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导海马体神经元。在一些实施方案中，所述神经系统疾病或障碍是局灶性癫痫、精神分裂症、孤独症谱系障碍、阿尔茨海默病、雷特综合征或脆性X综合征。
在一个方面，本公开文本提供了转导神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是海马体神经元。在一些实施方案中，所述方法体外转导所述神经元。在一些实施方案中，所述方法体内转导所述神经元。
在一些实施方案中，所述AAV载体包含异源核酸。
在一个方面，本公开文本提供了将异源核酸递送至神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是海马体神经元。
在一些实施方案中，所述AAV载体是能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。在一些实施方案中，所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。
在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV2、AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF或AAV-PHP.S载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV9载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV9-TV载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV6载体。在一些实施方案中，所述AAV载体是AAV5载体。
在一些实施方案中，所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3和5-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:6-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述神经元是兴奋性神经元。在一些实施方案中，所述神经元是CAMK2阳性神经元。在一些实施方案中，所述神经元是抑制性神经元。在一些实施方案中，所述神经元是GABA能神经元。
在一些实施方案中，所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
在一些实施方案中，通过颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体。在一些实施方案中，通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体。
在一些实施方案中，所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述配体门控离子通道包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含与SEQ ID NO:25的氨基酸残基23-220具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQ ID NO:25的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的残基的残基处的氨基酸突变。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含表3中列出的一个或多个氨基酸突变。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101W、Y115E和Y210W的突变。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101W和Y210V的突变。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101M和L131F的突变。
在一些实施方案中，所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。在一些实施方案中，所述离子孔结构域包含与SEQ ID NO:26的氨基酸255-457、SEQ ID NO:27的260-452、SEQ ID NO:28的氨基酸259-464或SEQ ID NO:29的氨基酸259-449具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述工程化受体的配体结合结构域包含源自人甘氨酸受体的Cys-环结构域。在一些实施方案中，所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-172。在一些实施方案中，所述Cys-环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸166-180。在一些实施方案中，所述工程化受体的配体结合结构域包含来自人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。在一些实施方案中，所述β1-2环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸81-84。
在一些实施方案中，所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1，并且其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述方法包括施用所述配体门控离子通道的配体。在一些实施方案中，所述配体选自AZD-0328、TC-6987、ABT-126、TC-5619、TC-6683、伐尼克兰和法西克兰/RG3487。在一些实施方案中，所述配体是TC-5619。在一些实施方案中，所述配体是ABT-126。
在一些实施方案中，所述受试者是灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是成年人。
在一个方面，本公开文本提供了试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；其中所述衣壳多肽包含与SEQID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
(b)用于施用所述AAV载体以转导背根神经节神经元或三叉神经节神经元的说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含适于经由鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用AAV载体的装置。在一些实施方案中，所述装置适于通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
在一个方面，本公开文本提供了试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；其中所述衣壳多肽包含与SEQID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
(b)用于施用所述AAV载体以转导海马体神经元的说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含适于经由颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体的装置。在一些实施方案中，所述装置适于通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用。
在一些实施方案中，所述AAV载体包含编码配体门控离子通道的异源核酸。在一些实施方案中，所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述试剂盒包含所述配体门控离子通道的配体。在一些实施方案中，所述配体是TC-5619。在一些实施方案中，所述配体是ABT-126。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的背根神经节神经元或三叉神经节神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述神经性疼痛是周围神经病。在一些实施方案中，所述神经性疼痛是三叉神经痛。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述神经系统疾病或障碍是神经性疼痛、痉挛状态、脊髓损伤或撕脱伤。
在一些实施方案中，通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用所述异源核酸。在一些实施方案中，将所述异源核酸通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
在一些实施方案中，所述异源核酸包含在载体内。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体转导所述背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
在一些实施方案中，所述神经元包含同工凝集素B4(IB4)阳性神经纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含NF200阳性神经纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含CGRP阳性神经纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含C纤维。在一些实施方案中，所述神经元包含Aδ纤维。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的海马体神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
在一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的海马体神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述神经系统疾病或障碍是局灶性癫痫、精神分裂症、孤独症谱系障碍、阿尔茨海默病、雷特综合征或脆性X综合征。
在一些实施方案中，通过颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述异源核酸。在一些实施方案中，通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述异源核酸。
在一些实施方案中，所述异源核酸包含在载体内。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体转导所述海马体神经元。
在一些实施方案中，所述神经元是兴奋性神经元。在一些实施方案中，所述神经元是CAMK2阳性神经元。在一些实施方案中，所述神经元是抑制性神经元。在一些实施方案中，所述神经元是GABA能神经元。
在一些实施方案中，所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
在一些实施方案中，所述配体门控离子通道包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含与SEQ ID NO:25的氨基酸残基23-220具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQ ID NO:25的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的残基的残基处的氨基酸突变。在一些实施方案中，所述配体结合结构域包含表3中列出的一个或多个氨基酸突变。在一些实施方案中，所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。在一些实施方案中，所述离子孔结构域包含与SEQ ID NO:26的氨基酸255-457、SEQ ID NO:27的260-452、SEQ ID NO:28的氨基酸259-464或SEQ ID NO:29的氨基酸259-449具有至少85％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述工程化受体的配体结合结构域包含源自人甘氨酸受体的Cys-环结构域。在一些实施方案中，所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-172。在一些实施方案中，所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-180。在一些实施方案中，所述工程化受体的配体结合结构域包含来自人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。在一些实施方案中，所述β1-2环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸81-84。在一些实施方案中，所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1，并且其中所述配体门控离子通道包含与SEQID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述方法包括施用所述配体门控离子通道的配体。在一些实施方案中，所述配体选自AZD-0328、TC-6987、ABT-126、TC-5619、TC-6683、伐尼克兰和法西克兰/RG3487。在一些实施方案中，所述配体是TC-5619。在一些实施方案中，所述配体是ABT-126。
在一些实施方案中，所述受试者是灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是成年人。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。
图1示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的iPSC来源的感觉祖神经元中GFP表达的细胞荧光图像。
图2示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的iPSC来源的感觉祖神经元中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图3示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的iPSC来源的感觉祖神经元中GFP表达的细胞荧光图像。
图4示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的iPSC来源的感觉祖神经元中GFP蛋白表达水平的ELISA结果。
图5示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的iPSC来源的感觉祖神经元中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图6示出了通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠DRG组织中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图7示出了通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠DRG组织中GFP蛋白表达水平的ELISA结果。
图8示出了在将AAV载体直接注射到大鼠DRG中之后分析AAV衣壳的向性的代表性免疫荧光图像。
图9示出了对用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠DRG组织的免疫荧光成像结果的定量分析。
图10示出了根据具有阳性GFP染色的大鼠DRG中各种感觉神经元的百分比表示包含所指示衣壳的AAV载体的向性的饼图。
图11示出了在研究V01220中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的非人灵长类动物(NHP)DRG组织中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图12A示出了在研究V01220中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的NHP DRG组织中GFP蛋白表达水平的ELISA结果。图12B示出了在研究V01331中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的NHP DRG组织中GFP蛋白表达水平的ELISA结果。
图13A示出了在研究V01220中在NHP DRG中直接注射后分析所指示AAV衣壳的向性的代表性免疫荧光图像。图13B示出了在研究V01220中在NHP DRG中直接注射后分析所指示AAV衣壳的向性的放大的免疫荧光图像。图13C示出了在研究V01331中在NHP DRG中直接注射后分析所指示AAV衣壳的向性的代表性免疫荧光图像。
图14示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的E18(胚胎第18天)大鼠混合海马体培养物中GFP表达的细胞荧光图像。
图15示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的E18大鼠混合海马体培养物中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图16示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的E18大鼠混合海马体培养物中GFP表达的细胞荧光图像。
图17示出了在转导后第5天，用包含所指示衣壳的AAV载体转导的E18大鼠混合海马体培养物中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图18示出了用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠海马体组织中GFP mRNA水平的ddPCR评估。每个数据点对应于单独动物的左半球或右半球。组中的每只动物都以独特的颜色表示。
图19示出了用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠海马体组织中GFP水平的ELISA结果。每个数据点对应于单独动物的左半球或右半球。组中的每只动物都以独特的颜色表示。
图20示出了用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠海马体的代表性免疫荧光图像。
图21A-21B示出了根据左半球和右半球的截面对用包含所指示衣壳的AAV载体转导的大鼠海马体的半定量免疫荧光分析。图21A示出了每个半球中海马体的每个截面中GFP覆盖的百分比。图21B示出了每个半球中每个海马体中每个正像素的GFP强度。
图22A示出了在研究V01220中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的非人灵长类动物(NHP)海马体组织中GFP mRNA水平的ddPCR评估。图22B示出了在研究V01331中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的非人灵长类动物(NHP)海马体组织中GFP mRNA水平的ddPCR评估。
图23A示出了在研究V01220中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的NHP海马体组织中GFP蛋白表达水平的ELISA结果。图23B示出了在研究V01331中通过体内直接注射用包含所指示衣壳的AAV载体转导的NHP海马体组织中GFP蛋白表达水平的ELISA结果。
图24A示出了在研究V01220中直接注射AAV9的小鼠的NHP海马体的代表性免疫荧光图像。图24B示出了在研究V01331中直接注射AAV5或AAV9的小鼠的NHP海马体的代表性免疫荧光图像。
图25含有示出初始注射后12周海马体AAV9-hSyn-CODA71-GFP(绿色)表达的图像。神经元细胞体用NeuN(蓝色)标记
图26示出了用CODA71或对照载体转导并用激动剂TC-5619浸浴的CA1神经元的动作电位。黑色迹线(底部)描绘了斜坡测试方案。
图27A示出了在应用激动剂TC-5619后神经元的RMP(mV)读出(上)和输入电阻(MΩ)读出(下)。图27B示出了在应用激动剂TC-5619后神经元的基强度(pA)读出(上)和AP计数(基线％)读出(下)。在图27A和图27B二者中，红线表示用CODA71载体转导的神经元，并且蓝线表示用对照(乱序)载体转导的神经元。
图28示出了在银环蛇毒素(BTX)的存在下在应用激动剂TC-5619后神经元的RMP(mV)读出(左上)、输入电阻(MΩ)读出(右上)、基强度(pA)读出(左下)和AP计数(基线％)读出(右下)。红线表示用CODA71载体转导的神经元，并且蓝线表示用对照(乱序)载体转导的神经元。
图29示出了小鼠的手术和电刺激程序的示意图。
图30示出了在注射TC-5619后45分钟，在CODA71转导的小鼠中以不同波幅以60Hz的前穿质途径输入刺激电诱发CA1响应的例子。
图31示出了注射CODA71载体(蓝线)或乱序对照载体(红线)的小鼠的癫痫发作阈值图。
图32示出了小鼠的手术和记录程序的示意图。
图33示出了在将红藻氨酸单侧注射入CA1中后小鼠自发性癫痫发作的记录。
图34A示出了在施用TC-5619或媒介物后注射CODA71载体(红线)或乱序对照载体(蓝线)的小鼠的癫痫发作密度图。图34B示出了在施用TC-5619或媒介物对照后注射CODA71载体或乱序对照载体的小鼠的癫痫发作密度图。
图35示出了用TC-5619或媒介物对照处理的指示小鼠的癫痫发作频率图。
图36示出了用TC-5619或媒介物对照处理的指示小鼠的癫痫发作持续时间图。
具体实施方式
在下面的所附说明书中阐述了本公开文本的细节。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但现在描述说明性方法和材料。根据说明书和权利要求，本公开文本的其他特征、目标和优点将清楚。在说明书和所附权利要求中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式还包括复数。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。将本说明书中引用的所有专利和出版物均通过引用以其整体并入本文。
将在下文更全面地描述根据本公开文本的实施方案。然而，本公开文本的各方面可以以不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开文本将是全面的和完整的，并且将向本领域技术人员充分传达本公开文本的范围。除非另有明确指示，否则所有指定的一些实施方案、特征和术语旨在包括所述的实施方案、特征或术语及其生物学等效物。本文说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本公开文本并不限于所描述的特定方法或组合物，因为此类方法和组合物当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的，因为本公开文本的范围将仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
在阅读本公开文本之后，如对于本领域技术人员应清楚的是，本文描述和说明的单独实施方案中的每个实施方案具有不连续的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开文本的范围或精神的情况下容易地与任何其他若干实施方案的特征分离或组合。可以按所叙述的事件的顺序或按逻辑上可能的任何其他顺序来执行所叙述的任何方法。
定义
贯穿本公开文本，除非内容明确指示其他含义，否则单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“肽”包括提及一种或多种肽及其本领域技术人员已知的等同物(例如多肽)，等等。
贯穿本说明书，除非另外说明，否则术语“和/或”在本公开文本中用于指“和”或“或”。
贯穿本公开文本，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或变体(如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)是指包括所陈述的要素或整数或者要素或整数的组，但不排除任何其他要素或整数或者要素或整数的组。另外，贯穿本说明书对数值范围的陈述明确包括在之间的所有整数和小数点。
贯穿本公开文本，除非上下文另外要求，否则短语“基本上由……组成”是指所描述的组合物、方法或试剂盒的范围限于不会实质上影响本主题公开内容的一种或多种基本和新颖特征的指定材料或步骤。例如，“基本上由所公开的序列组成”的多肽具有所公开的序列的氨基酸序列加上或减去在序列边界处的约5个氨基酸残基，例如比所叙述的边界氨基酸残基少约5个残基、4个残基、3个残基、2个残基或约1个残基，或比所叙述的边界氨基酸残基多约1个残基、2个残基、3个残基、4个残基或5个残基。
贯穿本公开文本，除非上下文另外要求，否则短语“由……组成”表示在组合物、方法或试剂盒中不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。例如，“由所公开的序列组成”的多肽仅由所公开的氨基酸序列组成。
术语“约”和“大约”作为等同词使用。在本申请中使用的具有或不具有约/大约的任何数值意味着覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，除非另外陈述或者上下文另有明确含义，否则术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％内的值的范围(这个数字会超过可能值的100％的情况除外)。
术语“分离的”意指实质上或基本上不含在其天然状态下发现通常伴随它的组分的材料。在一些实施方案中，术语“获得的”与分离的同义使用。
术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，以指代脊椎动物，如哺乳动物。哺乳动物可以是例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、马、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、黑猩猩)或人。还涵盖体内获得的或体外培养的受试者的组织、细胞或其衍生物。人受试者可以是成人、青少年、儿童(2岁至14岁)、婴儿(1个月至24个月)或新生儿(最大1个月)。在一些实施方案中，成人是约65岁或更老或约60岁或更老的老年人。
术语“样品”是指一定体积和/或质量的经历分析的生物学材料。在一些实施方案中，样品包括组织样品、细胞样品、流体样品等。在一些实施方案中，样品取自受试者(例如，人受试者)或由其提供。在一些实施方案中，样品包括取自任何内脏器官、癌性、癌前或非癌性肿瘤、脑、皮肤、毛发(包括毛根)、眼睛、肌肉、骨髓、软骨、白色脂肪组织和/或褐色脂肪组织的组织的一部分。在一些实施方案中，流体样品包括口腔拭子、血液、脐带血、唾液、精液、尿液、腹水液、胸膜液、脊髓液、肺灌洗液、泪液、汗液等。本领域普通技术人员将理解，在一些实施方案中，“样品”是“初始样品”，因为它是直接从来源(例如，受试者)获得的。在一些实施方案中，“样品”是加工初始样品的结果，加工例如去除某些潜在污染组分、分离某些组分和/或纯化某些目的组分。在一些实施方案中，样品是细胞或细胞群(例如，神经元细胞)。细胞样品可以直接源自受试者(例如，初始样品)或者可以是细胞系。细胞系可以包括非哺乳动物细胞(例如，昆虫细胞、酵母细胞和/或细菌细胞)或哺乳动物细胞(例如，永生化细胞系)。
本文所用的术语“治疗(treating或treatment)”及其语法等效词通常是指使用组合物或方法来减少、消除或预防疾病的症状，并且包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处意指减慢所治疗的障碍或病症的症状的进展、使其进展停止、逆转其进展或根除或减轻所述症状。治疗的预防益处包括降低病症的风险、延缓病症的进展、或减小病症发生的可能性。在一些实施方案中，治疗是指将组合物(例如，AAV载体)递送至受试者和/或细胞群以影响生理结局。在一些实施方案中，治疗导致一种或多种疾病症状的改善(例如，减少、减轻或修复)。改善可以是可观察的或可测量的改善，或者可以是受试者的健康状况的总体感受的改善。疾病的治疗可以指疾病症状的严重程度的降低。在一些实施方案中，治疗可以指将疾病症状的严重程度降低到与疾病发作前的水平可比的水平。在一些实施方案中，治疗可以指疾病症状的短期(例如，暂时或急性)和/或长期(例如，持续或慢性)减少。在一些实施方案中，治疗可以指疾病症状的缓解。在一些实施方案中，治疗可以指处于患上特定疾病的风险中的受试者的预防性治疗，以便预防疾病发展。预防疾病发展可以指完全预防疾病症状，延迟疾病发作，减轻随后发展的疾病的症状的严重程度，或减少疾病发展的可能性。
术语“管理”或“控制”是指使用本公开文本所设想的组合物或方法来改善患有特定疾病的个体的生活质量。
术语“有效量”是指可以实现所指示的结果(例如，转导靶神经元)的量。在一些实施方案中，用于体内施用的有效量是指可以实现希望的结果(例如，转导足够量的靶神经元以用于治疗目的)的剂量。
“治疗有效量”是达到期望的治疗结局所需的组合物的量。治疗有效量可以根据如但不限于疾病状态以及受试者的年龄、性别和体重的因素而变化。通常，治疗有效量也是组合物的治疗有益效果超过其任何毒性或有害影响的量。“治疗有效量”包括组合物有效治疗受试者的量。
“增加”是指与参考或对照水平相比至少5％的值的增加(例如，增加的转导效率)。例如，增加可以包括5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、500％、1000％或更多的增加。增加还意指比参考或对照水平高1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)的增加。
“降低”、“减小”、“减少”或其同义词是指与参考或对照水平相比至少5％的值的降低(例如，降低的转导效率)。例如，降低可以包括5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、500％、1000％或更多的降低。降低还意指比参考或对照水平低1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)的降低。
贯穿本公开文本，术语“参考”或“对照”水平可互换使用，并且是指在未用本公开文本的组合物治疗的受试者或样品中或在已经用媒介物对照治疗的受试者或样品中的特定生理学和/或治疗效果的值。在一些实施方案中，参考水平是指在施用本公开文本的组合物前作为受试者或样品中的量度的特定生理学和/或治疗效果的值(例如，基线水平)。
术语“配体”是指结合另一种较大分子的分子。在一些实施方案中，配体结合受体。在一些实施方案中，配体与受体的结合改变受体的功能，即激活或阻遏其功能。在一些实施方案中，配体与受体(如配体门控离子通道(LGIC))的结合导致离子通道的打开或关闭。术语“配体”可以指内源性的或天然存在的配体。例如，在一些实施方案中，配体是指神经递质(例如，λ-氨基丁酸(GABA)、乙酰胆碱、血清素等)和信号传导中间体(例如，磷脂酰肌醇4,5-双磷酸(PIP2))、氨基酸(例如，甘氨酸)或核苷酸(例如，ATP)。在一些实施方案中，配体可以指非天然的(即合成的或非天然存在的)配体(例如，结合剂)。例如，在一些实施方案中，配体是指小分子。配体结合可以通过本领域已知的多种方法(例如，检测与放射性标记的配体的缔合)来测量。贯穿本公开文本，“受体-配体结合”和“配体结合”可互换使用，并且是指受体(例如，LGIC)与配体之间的物理相互作用。
“结合亲和力”通常是指在受体的单个结合位点与配体之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如贯穿本公开文本所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，受体与配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以表示为解离常数(Kd)。亲和力可以通过本领域已知的常用方法(包括本公开文本所述的那些)测量。
术语“野生型”或“天然的”是技术人员理解的本领域的术语，并且意指生物体、菌株、基因、蛋白质或特征在自然界中存在的不同于突变体或变体形式的典型形式。例如，野生型蛋白质是该蛋白质在自然界中存在的典型形式。
术语“非天然的”、“变体”和“突变体”在整个说明书和权利要求中可互换使用，指代天然或野生型组成的突变体，例如与天然或野生型序列具有小于100％序列同一性的变体多肽。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸聚合物。术语还涵盖经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化、甲基化、羧基化、脱酰胺、乙酰化或与标记组分缀合。
氨基酸修饰可以是氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸插入。氨基酸取代可以是保守的氨基酸取代或非保守的氨基酸取代。保守替代(也称为保守突变、保守取代或保守变异)是蛋白质中这样的氨基酸替代：其将给定的氨基酸变成具有类似生化特性(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。如贯穿本公开文本所用，“保守变异”是指将一个氨基酸残基用另一个生物学上类似的残基替代。保守变异的例子包括：一个疏水残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个疏水残基；或一个极性残基取代另一个极性残基，如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。保守取代的其他说明性例子包括以下的变化：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸盐变为谷氨酸盐；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸盐变为天冬氨酸盐；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸盐；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸；亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸，等等。
术语“工程化”在整个说明书和权利要求中用于指非天然存在的组合物或蛋白质，其具有与其来源亲本组合物或蛋白质不同的特性。
通常，“序列同一性”或“序列同源性”是指两个多核苷酸或多肽序列各自的核苷酸与核苷酸的对应性或氨基酸与氨基酸对应性。典型地，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过确定它们的“同一性百分比”来比较。两个序列(核苷酸或氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并且乘以100。同一性百分比也可以例如通过使用可从国立卫生研究获得的高级BLAST计算机程序(包括2.2.9版)比较序列信息来确定。BLAST程序基于Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)以及如Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；以及Altschul等人,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402(1997)中所讨论的比对方法。简而言之，BLAST程序将同一性定义为相同比对符号(通常是核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列中的符号的总数。该程序可以用于确定在被比较的蛋白质的全长上的同一性百分比。提供默认参数以优化例如blast程序中用短查询序列的搜索。该程序还允许使用SEG过滤器以屏蔽查询序列的区段，如通过Wootton和Federhen,Computers and Chemistry 17:149-163(1993)的SEG程序所确定的。期望的序列同一性程度的范围是大约80％至100％以及其间的整数值。典型地，在公开的序列与要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
如贯穿本公开文本所用，“基本上相同的”是指具有85％或更多，例如90％或更多，例如，95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的序列同一性，其中组合物的活性不会被序列中导致序列同一性差异的修饰改变。
如贯穿本公开文本所用，“氨基酸突变”是指氨基酸序列相对于对应亲本序列的任何差异，例如，氨基酸取代、缺失和/或插入。
如贯穿本公开文本所用，术语“启动子”是指引导可操作地连接的核酸转录的一个或多个核酸控制序列。启动子可以包括靠近转录起始位点的核酸序列，如TATA元件。启动子还可以包括能够被转录因子结合的顺式作用多核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。
如贯穿本公开文本所用，术语“病毒载体(virus vector)”、“病毒载体(viralvector)”或“基因递送载体”是指病毒颗粒，其具有作为核酸递送媒介物的功能并且其包含包装在病毒粒子内的核酸(例如，AAV表达盒)。本公开文本的示例性病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体和逆转录病毒载体。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”或“AAV载体”是指包含至少一种AAV衣壳多肽和衣壳化多核苷酸(AAV载体基因组)的病毒颗粒。多核苷酸可包含异源核酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)。通常基于衣壳多肽的名称(血清型)来命名AAV载体。例如，AAV5载体指示AAV载体包含AAV5衣壳多肽。
如关于病毒滴度使用的术语“载体基因组单位”、“基因组单位”、“基因组颗粒(gp)”或“基因组拷贝(gc)”是指在病毒粒子中衣壳化的载体基因组的数量，与感染性或功能无关。通过本领域充分理解的方法，例如，基因组DNA的定量PCR，或例如在以下文献中的方法，可以测量在特定载体制剂中的基因组颗粒的数量：Clark等人(1999)Hum.GeneTher.,10:1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.,6:272-278。
如参考病毒滴度使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”是指具有感染和复制能力的重组AAV载体颗粒的数量，如通过感染中心测定(也称为复制中心测定)所测量，如例如在McLaughlin等人(1988)J.Virol.,62:1963-1973中描述的。
“感染性”病毒粒子、病毒或病毒颗粒是包含可递送至对病毒种类呈向性的细胞中的多核苷酸组分的病毒粒子、病毒或病毒颗粒。该术语不一定说明病毒的任何复制能力。如本文所用，“感染性”病毒或病毒颗粒是在接近靶细胞后可以感染靶细胞并且可以在靶细胞中表达异源核酸的病毒或病毒颗粒。因此，“感染性”是指病毒颗粒接近靶细胞、进入靶细胞并在靶细胞中表达异源核酸的能力。感染性可以指体外感染性或体内感染性。病毒感染性可以表示为感染性病毒颗粒与总病毒颗粒的比率。
如参考病毒滴度使用的术语“转导单位”(tu)”是指导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数量，如在功能测定中所测量的，如在例如以下文献中描述的：Xiao等人(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；或Fisher等人(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU测定)。
病毒颗粒在细胞中表达异源核酸的能力可以称为“转导”。可以使用多种技术测定病毒颗粒在细胞中表达异源核酸的能力，包括评估标记基因，如绿色荧光蛋白(GFP)测定(例如，其中病毒包含编码GFP的核苷酸序列)，其中GFP在感染病毒颗粒的细胞中产生并被检测和/或测量；或测量产生的蛋白质，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活细胞分选法(FACS)。
术语“向性”是指AAV载体感染一种或多种指定细胞类型的能力，但也可以涵盖载体发挥作用以在一种或多种指定细胞类型中转导细胞的方式；即，向性是指AAV病毒粒子优先进入一种或多种某些细胞或组织类型和/或与细胞表面优先相互作用以促进进入某些细胞或组织类型，任选地且优选地随后在细胞中表达(例如，转录和任选地翻译)AAV病毒粒子携带的序列，例如对于重组病毒而言表达一种或多种异源核苷酸序列。
术语“向性概况”是指通过本文所述的AAV载体转导一种或多种靶细胞、组织和/或器官的模式。
除非另有指示，否则“有效转导”或“有效向性”或类似术语可以通过参考合适的对照来确定(例如，分别是对照的转导或向性的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、100％、110％、125％、150％、175％或200％或更多)。合适的对照将取决于多种因素，包括所希望的向性概况。类似地，可以通过参考合适的对照来确定衣壳和/或病毒是否“不能有效转导”靶组织或对靶组织“不具有有效的向性”或类似术语。
如贯穿本公开文本所用，“神经元活动”、“神经元的活动”、“神经元放电”及其变体和同义词是指由神经元的刺激或兴奋引起的电活动。在一些实施方案中，神经元活动使用自动化的或手动的膜片钳技术测量。在一些实施方案中，确定神经元的活动包括确定兴奋性突触后电位(EPSP)、抑制性突触后电位(IPSP)和/或神经元的动作电位。在一些实施方案中，神经元的活动水平依赖于兴奋性突触后电位(EPSP)、抑制性突触后电位(IPSP)和/或动作电位，或者受其影响。
如贯穿本公开文本所用，“神经系统疾病”或“神经系统障碍”是指神经系统的疾病或障碍。在一些实施方案中，神经系统疾病与脑、脊髓、神经或神经系统的任何组分中的结构、生化和/或电异常相关，由这些异常造成，或起因于这些异常。
如贯穿本公开文本所用，疾病的“体征”是指被视为指示疾病状况的身体或心理特征。在一些实施方案中，体征是疾病的客观指征。在一些实施方案中，由患者以外的人(如医生)客观地评价、检查、观察或测量体征。
如贯穿本公开文本所用，疾病的“症状”是指被视为指示疾病状况的身体或心理特征，特别是对于患者明显的这样的特征。在一些实施方案中，症状由患者主观地评价。例如，在一些实施方案中，症状是疼痛；在一些实施方案中，症状是癫痫。
如贯穿本公开文本中关于氨基酸的位置所用，术语“对应于(corresponding to或correspond to)”是指当将第一多肽序列和参考多肽序列进行比对时，第一多肽序列中的氨基酸与参考多肽序列中的给定氨基酸对齐。本领域技术人员使用为此目的而设计的软件，例如Clustal Omega 1.2.4版和该版本的默认参数进行比对。
概述
本公开文本提供了腺相关病毒(AAV)载体，其包含用于转导背根神经节和/或三叉神经节神经元的特异性AAV衣壳多肽。与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，此类AAV载体展现出对背根神经节和/或三叉神经节神经元增强的转导和/或向性。在一些实施方案中，将包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体递送至DRG和/或TGG神经元以用于治疗神经性疼痛。在一些实施方案中，AAV载体进一步包含编码工程化配体门控离子通道(eLGIC)受体或其嵌合形式的多核苷酸。
在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出在背根神经节和/或三叉神经节神经元中增强的转导。在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对背根神经节和/或三叉神经节神经元增强的向性。
在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对人背根神经节和/或三叉神经节神经元增加的体内转导。在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对人背根神经节和/或三叉神经节神经元增加的体外转导。在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对人背根神经节和/或三叉神经节神经元增加的离体转导。
本公开文本还提供了腺相关病毒(AAV)载体，其包含用于转导海马体神经元的特异性AAV衣壳多肽。与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，此类AAV载体展现出对海马体神经元增强的转导和/或向性。在一些实施方案中，将包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体递送至海马体神经元以用于治疗局灶性癫痫。在一些实施方案中，AAV载体进一步包含编码工程化配体门控离子通道(eLGIC)受体或其嵌合形式的多核苷酸。
在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出在海马体神经元中增强的转导。在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对海马体神经元增强的向性。
在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对人海马体神经元增加的体内转导。在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对人海马体神经元增加的体外转导。在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体展现出对人海马体神经元增加的离体转导。
在一些实施方案中，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体是功能性AAV衣壳的一部分，其中所述功能性AAV衣壳包装重组核酸分子，该重组核酸分子包含选自以下的多核苷酸：非编码RNA、蛋白质编码序列、表达盒、多表达盒、用于同源重组的序列、基因靶向序列和治疗性表达盒。在一些实施方案中，功能性AAV衣壳包装包含编码工程化LGIC受体或其嵌合形式的多核苷酸的重组核酸分子。
在一些实施方案中，多核苷酸包含在AAV载体内。在一些实施方案中，多核苷酸是基因组靶向盒。在一些实施方案中，表达盒是CRISPR/CAS表达系统。在一些实施方案中，治疗性表达盒编码治疗性蛋白或抗体。
本公开文本提供了以治疗性治疗方案、疫苗或研究工具开发方式使用包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体的方法。
本公开文本还提供了使用包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体来减少施用于受试者的总核酸的量的方法。所述方法包括当使用这种AAV载体转导所述核酸时，与当使用包含对照衣壳多肽的AAV转导所述核酸时施用于所述受试者的核酸的量相比，向所述受试者施用更少的总核酸量，以获得相似的治疗效果。
本公开文本提供了一种包含本公开文本的AAV衣壳多肽的AAV载体，其中该衣壳多肽与对照衣壳多肽相比，使得AAV载体在人背根神经节和/或三叉神经节神经元中展现出增加的转导和/或向性。
本公开文本还提供了治疗有需要的受试者的神经性疼痛如周围神经病和三叉神经痛的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中异源核酸包含编码配体门控离子通道或其嵌合形式的多核苷酸序列。
本公开文本还提供了一种包含本公开文本的AAV衣壳多肽的AAV载体，其中该衣壳多肽与对照衣壳多肽相比，使得AAV载体在人海马体神经元中展现出增加的转导和/或向性。
本公开文本还提供了治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道或其嵌合形式的多核苷酸序列。
腺相关病毒(AAV)载体
细小病毒科成员腺相关病毒(AAV)是一种小的无包膜二十面体病毒，具有约4.7千碱基(kb)的单链线性DNA基因组。AAV被分配到依赖病毒属中，因为该病毒被发现是纯化的腺病毒原液中的污染物(D.M.Knipe、P.M.Howley,Field's Virology,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,第六版,2013)。在其野生型状态下，AAV依赖于辅助病毒(通常是腺病毒)来提供用于复制的必需蛋白因子，因为AAV天然是复制缺陷的。AAV的4.7-kb基因组的两侧是两个折叠成对于复制重要的发夹形状的反向末端重复(ITR)。AAV具有天然的复制缺陷，并且能够转导人体中几乎所有细胞类型，是用于基因疗法中的治疗用途或疫苗递送的理想载体。在野生型状态下，AAV的生命周期包括潜伏期和感染期，在潜伏期期间，AAV基因组在感染后被位点特异性地整合到宿主染色体中，在感染期期间，在腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，经整合的基因组随后获救、复制并包装进感染性病毒中。当载体化时，AAV的病毒Rep和Cap基因在病毒生产过程中被除去并以反式方式提供，使ITR成为唯一剩余的病毒DNA(A.Vasileva，R.Jessberger,Nature reviews.Microbiology,3,837-847(2005))。然后将Rep和Cap用一系列可能的转移载体配置替代，以进行基因添加或基因靶向。这些载体化的AAV转导分裂和非分裂的细胞，并在静止组织中显示出强劲的稳定表达。多个已公布的美国申请描述了AAV载体和病毒粒子，包括美国公开号2015/0176027、2015/0023924、2014/0348794、2014/0242031和2012/0164106；所有这些文献通过引用以其整体并入本文。
然而，尽管AAV载体具有令人印象深刻的转导各种组织和细胞类型的能力，但本领域仍然需要具有在转导效率和希望的向性两者方面改进的对特定神经元细胞的转导的AAV载体。此外，施用方法还可影响被转导的细胞的位置、量和类型。递送到神经元需要高水平的转导和正确的向性，因为在单次注射中可以递送多少AAV存在物理限制，并且希望的结果(例如，治疗结果)与刺激或抑制受试者中正确的神经元组的活动有关。
本公开文本提供了AAV衣壳多肽，其展现出对受试者中神经元亚群的显著改进的体内、体外和/或离体转导。
所有已知AAV血清型的基因组结构是类似的。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复(ITR)侧接非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳并且有助于病毒的向性。末端145nt ITR是自互补的，并且被组织化使得可以形成能量上稳定的分子内双链体，该双链体形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA的复制起点起作用，从而充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中的野生型(wt)AAV感染后，Rep基因被表达并且在病毒基因组的复制中起作用。
在一些实施方案中，病毒载体的外部蛋白“衣壳”存在于自然界中，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10。在一些实施方案中，衣壳被合成工程化(例如，通过定向进化或合理设计)以具有在自然界中不存在的某些独特特性，如改变的向性、增加的转导效率和/或免疫逃避。合理设计的衣壳的例子是在VP3病毒衣壳多肽上一个或多个表面暴露的酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和赖氨酸(K)残基的突变。
可以用于AAV载体中的AAV ITR的非限制性例子包括来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的ITR。
包含两个ITR的AAV载体具有约4.4kB的有效载荷容量。自互补的AAV(scAAV)载体含有第三ITR并且包装该载体的重组部分的两条链，为本文考虑的多核苷酸仅留下约2.1kB。在一个实施方案中，AAV载体是scAAV载体。
已经使用双AAV载体策略实现了扩展包装容量，其为AAV的包装容量的大约两倍(约9kB)。可用于产生本文考虑的AAV的双载体策略包括但不限于剪接(反式剪接)、同源重组(重叠)或两者的组合(杂合)。在双AAV反式剪接策略中，将剪接供体(SD)信号放置于5'半部分载体的3'端处，并且将剪接接纳体(SA)信号放置于3'半部分载体的5'端处。在双AAV载体对同一细胞的共感染和反向末端重复(ITR)介导的两个半部分的头尾相接连环化后，反式剪接导致产生成熟的mRNA和全尺寸蛋白(Yan等人,2000)。反式剪接已成功用于在肌肉和视网膜中表达大基因(Reich等人,2003；Lai等人,2005)。可替代地，在双AAV载体中所含的大转基因表达盒的两个半部分可以含有同源重叠序列(在5'半部分载体的3'端和在3'半部分载体的5'端，双AAV重叠)，同源重叠序列将介导通过同源重组对单个大基因组的重构(Duan等人,2001)。此策略依赖于转基因重叠序列的重组发生特性(Ghosh等人,2006)。第三种双AAV策略(杂合)是基于将来自外源基因(即，碱性磷酸酶；Ghosh等人,2008；Ghosh等人,2011))的高重组发生区添加到反式剪接载体中。为了增加在双AAV之间的重组，将添加的区域放置在5'半部分载体中的SD信号的下游且在3'半部分载体中的SA信号的上游。
“杂合AAV”是指用不同AAV血清型(以及优选地，与一个或多个AAV ITR不同的血清型)的衣壳包装的AAV基因组，并且另外可以称为假型化AAV。例如，AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV 14型、AAV 15型或AAV 16型基因组可以被AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV 14型、AAV 15型或AAV 16型衣壳或其变体包衣壳，条件是AAV衣壳和基因组(以及优选地，一个或多个AAV ITR)属于不同的血清型。在某些实施方案中，假型化AAV颗粒可以称为属于“x/y”型，其中“x”指示ITR的来源，并且“y”指示衣壳的血清型，例如2/5AAV颗粒具有来自AAV2的ITR和来自AAV5的衣壳。
“宿主细胞”包括用本公开文本的重组载体或多核苷酸体内、离体或体外转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包括产生病毒的细胞和用病毒载体感染的细胞。在一些实施方案中，用本文考虑的病毒载体体内感染宿主细胞。在某些实施方案中，术语“靶细胞”与宿主细胞可互换使用并且是指期望细胞类型的受感染细胞。
高滴度AAV制剂可以使用本领域已知的技术生产，例如，如以下文献中所述：美国专利号5,658,776；6,566,118；6,989,264；和6,995,006；美国2006/0188484；WO 98/22607；WO 2005/072364；和WO/1999/011764；以及Viral Vectors for Gene Therapy:Methodsand Protocols,Machida编,Humana Press,2003；Samulski等人,(1989)J.Virology 63,3822；Xiao等人,(1998)J.Virology 72,2224；lnoue等人,(1998)J.Virol.72,7024。还已经报道了生产假型化AAV载体的方法(例如，WO 00/28004)，以及AAV载体的各种修饰或配制品，以减少其在体内施用后的免疫原性(参见例如，WO 01/23001；WO 00/73316；WO 04/112727；WO 05/005610；WO 99/06562)。
在一些实施方案中，包含AAV衣壳多肽(或本公开文本的突变体)的AAV载体有助于工程化受体对于受试者中的细胞或神经元亚群的靶向表达。在一些实施方案中，神经元是伤害性感受器。
衣壳多肽
在一些实施方案中，本公开文本提供了衣壳多肽，其使得对应的衣壳化AAV载体实现对至少一个神经元细胞亚群的增强的转导和/或向性。本公开文本的说明性衣壳多肽列于下表1中：
表1.说明性衣壳多肽
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV2。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:1的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQID NO:1的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV2.5。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:2的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:2的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV2.5-TV。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的T492的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:2的T492V的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:3的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:3的V492的位置处的缬氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于在SEQID NO:3的V492的位置处的缬氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV2.5-2YF。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的Y705和/或Y731的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:2的Y705F和/或Y731F的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:4的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:4的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:4的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于在SEQ ID NO:4的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV2.5-TV2YF。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的T492、Y705和/或Y731的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:2的T492V、Y705F和/或Y731F的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQID NO:5的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:5的V492的位置处的缬氨酸，并且其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:5的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:5的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:5的V492的位置处的缬氨酸，并且其中衣壳多肽包含在对应于在SEQ ID NO:5的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV5。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:6的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQID NO:6的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV6。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:7的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQID NO:7的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV9。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:8的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQID NO:8的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV9-TV。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:8的T492的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:8的T492V的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:9的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQID NO:9的V492的位置处的缬氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQID NO:9的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于在SEQ ID NO:9的V492的位置处的缬氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ IDNO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV9-2YF。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:8的Y705和/或Y731的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:8的Y705F和/或Y731F的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:10的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:10的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:10的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于在SEQ ID NO:10的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV9-TV2YF。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:8的T492、Y705和/或Y731的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:8的T492V、Y705F和/或Y731F的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ IDNO:11的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:11的V492的位置处的缬氨酸，并且其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:11的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:11的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:11的V492的位置处的缬氨酸，并且其中衣壳多肽包含在对应于在SEQ ID NO:11的F705和/或F731的一个或多个位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽是AAV-PHP.S。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:12的序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:12的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含由与SEQ ID NO:24具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，AAV载体包含AAV衣壳多肽，该AAV衣壳多肽包含在对应于AAV9衣壳多肽(SEQ ID NO:8)的T492、Y705和/或Y731的一个或多个位置处的氨基酸突变，其中AAV衣壳多肽为血清型AAV2、AAV2.5、AVV5、AAV6、AAV9、AAV-PHP.S或另一种AAV血清型的AAV衣壳多肽。在一些实施方案中，该一个或多个位置是两个或更多个位置、两个位置或三个位置。在一些实施方案中，病毒载体包含AAV衣壳多肽，该AAV衣壳多肽包含对应于AAV9衣壳多肽(SEQ ID NO:8)的T492V、Y705F和/或Y731F或其任何组合的一个或多个氨基酸取代，其中AAV衣壳多肽为血清型AAV2、AAV2.5、AVV5，AAV6、AAV9、AAV-PHP.S或另一种AAV血清型的AAV衣壳多肽。在一些实施方案中，所述一个或多个取代是两个或更多个取代、两个取代或三个取代。
如本文所用，“T492、Y705和/或Y731”是指例如T492+Y705、T492+Y731、T492+Y705+Y731或其任何其他可能的组合。类似地，“T492V、Y705F和/或Y731F”是指例如T492V+Y705F、T492V+Y731F、T492V+Y705F+Y731F或其任何其他可能的组合。
在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或99.7％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于SEQ ID NO:8的T492的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，本公开文本的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8的序列相比具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(取代、缺失和/或添加)氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，其中衣壳多肽包含在对应于在SEQ ID NO:8的T492的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该取代是T492V。在一些实施方案中，该取代是T492I。在一些实施方案中，该取代是T492L。在一些实施方案中，T492残基被选自缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的疏水性氨基酸取代。在一些实施方案中，T492残基被选自甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)的疏水性氨基酸取代。
神经元和神经纤维
在一些实施方案中，本公开文本提供了转导位于海马体中的靶神经元(即海马体神经元)的方法。
在一些实施方案中，海马体神经元是兴奋性神经元。在一些实施方案中，海马体神经元是Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)阳性神经元。在一些实施方案中，海马体神经元是抑制性神经元。在一些实施方案中，海马体神经元是GABA能神经元。
在一些实施方案中，本公开文本提供了转导位于背根神经节(或脊神经节；也称为后根神经节)中的靶神经元的方法。背根神经节(DRG)是脊神经背根中的神经元簇(神经节)。称为一级神经元的感觉神经元的细胞体位于背根神经节中。背根神经节神经元的轴突称为传入。在周围神经系统中，传入是指将感觉信息传递到中枢神经系统(即脑和脊髓)的轴突。
在一些实施方案中，本公开文本提供了转导位于三叉神经节(或加塞神经节、或半月神经节、或加塞氏神经节)中的靶神经元的方法。三叉神经节(TGG)是三叉神经(CN V)的感觉神经节，在硬膜中占据一个腔(麦氏腔)，覆盖颞骨岩部尖附近的三叉神经压迹。
轴突(也称为神经纤维)是脊椎动物神经元细胞的细长突起，通常将电脉冲(称为动作电位)传导远离神经细胞体。每个神经元只有一个轴突。因此，神经元细胞可以通过其轴突(神经纤维)分类。
Erlanger和Gasser将神经纤维分为三个一般类别(A、B和C组)。A组神经纤维有高度髓鞘，B组神经纤维有中度髓鞘，并且C组神经纤维无髓鞘。
A组神经纤维(A纤维)有四个细分：阿尔法(α)、贝塔(β)、伽马(γ)和德尔塔(δ)。这些细分具有不同量的髓鞘形成和轴突厚度，并且因此以不同的速度传送信号。Aα型纤维包括替代性分类系统的Ia型和Ib型感觉纤维，并且分别是来自肌梭末梢和高尔基腱的纤维。Aβ型纤维和Aγ型是来自牵张感受器的II型传入纤维。来自皮肤的Aβ型纤维大多专用于触摸。Aδ型纤维是伤害性感受器的传入纤维。Aδ纤维将信息从周围机械感受器和温度感受器传递到脊髓背角。Aδ纤维用于接收和传送主要与急性疼痛(尖锐、立刻且持续时间相对较短)有关的信息。这种类型的疼痛可能是由以下几种刺激物导致的：温度诱导的、机械的和化学的。这可能是由激活回缩反应的反射弧中的Aδ纤维引发的回缩反射的一部分。Aδ纤维传递冷、压力和急性疼痛信号；因为Aδ纤维很薄(直径为2-5μm)并且有髓鞘，所以Aδ纤维比无髓鞘的C纤维更快地发出冲动，但比其他更厚的有髓鞘的A组神经纤维更慢。Aδ纤维的传导速度适中。
B组神经纤维(B纤维)为轴突，有中度髓鞘，这表示比A组神经纤维的髓鞘更少，并且比C组神经纤维的髓鞘更多。B组神经纤维通常是自主神经系统的一般内脏传入纤维和节前神经纤维。
C组神经纤维(C纤维)无髓鞘并且直径小并且传导速度慢。C组纤维包括自主神经系统(ANS)中的节后纤维和背根处的神经纤维(IV纤维)。这些纤维传递感觉信息。这些神经纤维的损伤或损害会引起神经性疼痛。
成熟伤害性感受器的周围末端是检测刺激并将刺激转换为电能的地方。当电能达到阈值时，动作电位被诱导并被驱向中枢神经系统(CNS)。这导致一系列事件，使得自觉意识到疼痛。通过高阈值确定伤害性感受器仅对刺激的特定特征具有感觉特异性。仅当化学、温度或机械环境达到高阈值时，才会触发伤害性感受器。大多数伤害性感受器根据其作出反应的环境形态来分类。一些伤害性感受器对这些形态中的多于一种有反应，并且因此被指定为多觉型。其他伤害性感受器对这些形态都没有反应(尽管其可能在炎症条件下对刺激有反应)，并且称为睡眠或沉默。
伤害性感受器有两种不同类型的轴突。第一种是Aδ纤维轴突。Aδ纤维轴突有髓鞘，并且可以使动作电位以约20米/秒的速率向CNS行进。另一种类型是更慢的传导C纤维轴突。它们仅在约2米/秒的速度下传导。这是由于该轴突有轻度髓鞘或无髓鞘。因此，疼痛分为两个阶段。第一阶段由快速传导Aδ纤维介导，并且第二阶段由(多觉型)C纤维介导。与Aδ纤维相关的疼痛可能与最初的极端尖锐疼痛有关。第二阶段是由急性损伤导致的疼痛的时间更长、强度稍低的感觉。如果大量或长时间向C纤维输入，则会在脊髓背角中逐渐积聚；这种现象类似于肌肉中的破伤风，但称为缠绕(wind-up)。如果发生缠绕，则存在增加对疼痛敏感性的可能性。
可以通过生物标记物如神经丝200(NF200，也称为神经丝重多肽)、降钙素基因相关肽(CGRP)和同工凝集素B4(IB4)来区分不同类别的神经纤维。Aα和Aβ纤维通常为NF200阳性但IB4阴性。Aδ纤维通常为NF200和IB4阳性。C纤维通常为IB4阳性但NF200阴性。因此，NF200+神经元主要包含有高度髓鞘的Aα纤维或有中度髓鞘的Aβ纤维。在一些情况下，这些神经元介导轻触和本体感受的信号。但是一些NF200+神经元也可介导伤害性感受的信号。IB4+神经元主要包含用于伤害性感受的无髓鞘的C纤维或Aδ纤维。并且CGRP+神经元主要包含用于伤害性感受的无髓鞘的C纤维或有轻度髓鞘的Aδ纤维。
衣壳多肽的特性
在本公开文本的一个方面，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体在一个或多个神经元中展现出增加的转导和/或向性。在一些实施方案中，对照衣壳多肽是AAV2衣壳多肽(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，对照衣壳多肽是AAV2.5衣壳多肽(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，对照衣壳多肽是AAV9衣壳多肽(SEQID NO:8)。在一些实施方案中，对照衣壳多肽是AAV5衣壳多肽(SEQ ID NO:6)。本领域技术人员将容易地在研究中认识到适当的对照衣壳多肽，例如，如在本公开文本的实施例部分中所示。
可以通过本领域已知的技术来测量转导/向性，这些技术包括：例如ELISA、ddPCR和/或免疫荧光分析，包括在本公开文本的实施例部分中描述的那些，以及本领域已知的其他方法。
在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体在一个或多个靶神经元中展现出增加的转导。在一些实施方案中，转导增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约7倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约70倍、或约100倍，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，转导增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少70倍或至少100倍，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，与包含对照衣壳多肽的AAV载体相比，包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体在一个或多个靶神经元中展现出增加的向性。在一些实施方案中，通过在受试者的特定位置中经转导的靶神经元占总经转导的神经元的百分比测量向性。在一些实施方案中，向性增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或多于95％，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，向性增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，靶神经元是海马体神经元。在一些实施方案中，靶神经元是兴奋性神经元。
在一些实施方案中，靶神经元是DRG或TGG神经元。
在一些实施方案中，靶神经元包含A纤维。在一些实施方案中，靶神经元包含Aα或Aβ纤维。在一些实施方案中，靶神经元包含Aδ纤维。在一些实施方案中，靶神经元包含C纤维。
在一些实施方案中，靶神经元包含NF200阳性和IB4阴性的神经纤维。在一些实施方案中，靶神经元包含NF200阳性和IB4阳性的神经纤维。在一些实施方案中，靶神经元包含NF200阴性和IB4阳性的神经纤维。在一些实施方案中，靶神经元包含CGRP阳性的神经纤维。
异源核酸
在一些实施方案中，本公开文本的AAV载体进一步包含异源核酸，其中异源核酸包含编码受体的核苷酸序列。在一些实施方案中，受体是工程化配体门控离子通道(LGIC)或其嵌合形式。在一些实施方案中，工程化LGIC可以被小分子配体激活。在一些实施方案中，施用AAV载体将编码eLGIC的异源核酸递送到受试者的神经元细胞的亚群中，并引起eLGIC在神经元内的表达。在一些实施方案中，eLGIC的表达使得通过施用对应的小分子配体来调节这些神经元的活动。
在一些实施方案中，异源核酸可操作地连接至引导其转录或表达的一种或多种控制元件。控制元件包括：适当的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；高效RNA加工信号，如剪接信号和聚腺苷酸化(聚A)信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码产物的分泌的序列。大量的表达控制序列(包括选自天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子)在本领域中是已知的并且可以被利用。
此类控制元件可包含通常与所选基因相关的控制序列(例如，内源细胞控制元件)。可替代地，可以采用异源控制序列。有用的异源控制序列一般包括源自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。例子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、与目的基因异源的内源细胞启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV即时早期启动子区(CMV-IE))、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。另外，也可以使用源自非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)的序列。
在一些实施方案中，细胞类型特异性或组织特异性启动子可以可操作地连接至异源核酸，并且允许在特定的一种或多种细胞类型或一种或多种组织中选择性地或优选地产生由异源核酸编码的对应基因产物。在一些实施方案中，诱导型启动子可操作地连接至异源核酸。
在一些实施方案中，可以使用非AAV方法(例如，使用非AAV病毒载体、非病毒载体、合成纳米颗粒等)将本公开文本的异源核酸递送至神经元。
在一些实施方案中，将本公开文本的异源核酸并入载体中。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体源自复制缺陷型病毒。在一些实施方案中，病毒载体是腺病毒、逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺相关病毒(AAV)、痘病毒、甲病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒(例如，HSV-1)。
工程化配体门控离子通道(eLGIC)
本公开文本描述了受体、其突变体以及其用于在治疗局灶性癫痫和/或神经性疼痛(如周围神经病和三叉神经痛)中的用途的方法。在一些实施方案中，受体是工程化配体门控离子通道(LGIC)。在一些实施方案中，受体是嵌合eLGIC。
在一些实施方案中，受体是工程化受体(例如，eLGIC)。术语“工程化受体”在本文中用于指已经经过实验改变使得其在物理上和/或在功能上不同于对应的亲本受体的受体。在一些实施方案中，亲本受体是野生型受体。术语“野生型受体”在本文中用于指具有与在自然界中发现的蛋白质的多肽序列相同的多肽序列的受体。野生型受体包括天然存在于人中的受体以及天然存在于其他真核生物(例如原生生物、真菌、植物或动物，例如酵母、昆虫、线虫、海绵、哺乳动物、非哺乳动物脊椎动物)中的直系同源物。在一些实施方案中，亲本受体是非天然受体；也就是说，它是在自然界中不存在的受体，例如，从野生型受体工程化的受体。例如，亲本受体可以是工程化受体，其包含来自一种野生型受体的一个或多个亚基和来自第二种野生型受体的一个或多个亚基。因此，所得蛋白质由来自两种或更多种野生型受体的亚基构成。因此，在一些实施方案中，亲本受体是嵌合受体。本公开文本的工程化受体包括例如亲本受体突变体和开关受体。
在一些方面，本公开文本的工程化受体包含相对于对应的亲本受体的至少一个氨基酸突变，例如，在野生型受体的一个或多个结构域中的一个或多个突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化受体与对应的亲本受体共享约99％、约98％、约95％、约90％、约85％、约80％、约70％、约60％、约50％或更少的序列同一性，包括位于其间的所有值和子范围。在一些实施方案中，亲本受体突变体与对应的亲本受体具有85％或更多的序列同一性，例如，与对应的亲本受体具有90％或更多或95％或更多，例如约96％、约97％、约98％或约99％同一性，包括位于其间的所有值和子范围。在一些实施方案中，工程化受体(例如，亲本受体突变体)通过易错PCR产生。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化受体的配体结合结构域(LBD)包含相对于亲本受体的对应配体结合结构域的至少一个氨基酸突变，例如野生型受体的配体结合结构域中的一个或多个突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化受体的配体结合结构域与亲本受体的对应配体结合结构域具有85％或更多的序列同一性，例如与亲本受体的对应配体结合结构域具有90％或更多或95％或更多，例如约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或100％同一性，包括位于其间的所有值和子范围。在一些实施方案中，工程化受体的配体结合结构域与亲本受体的对应配体结合结构域共享至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列同一性，包括位于其间的所有值和子范围。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化受体的离子孔结构域(IPD)包含相对于亲本受体的对应离子孔结构域的至少一个氨基酸突变，例如野生型受体的离子孔结构域中的一个或多个突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化受体的离子孔结构域与亲本受体的对应离子孔结构域具有85％或更多的序列同一性，例如与亲本受体的对应离子孔结构域具有90％或更多或95％或更多，例如约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％同一性或100％同一性，包括位于其间的所有值和子范围。在一些实施方案中，工程化受体的离子孔结构域与亲本受体的对应离子孔结构域共享至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列同一性，包括位于其间的所有值和子范围。
在一些实施方案中，氨基酸突变是相对于对应亲本受体的功能丧失性氨基酸突变。“功能丧失性”氨基酸突变是指这样的一个或多个突变：其相对于亲本受体降低、显著减少或消除工程化受体的功能，例如通过相对于内源性配体与亲本受体的结合降低内源性配体与工程化受体的结合，或通过降低在工程化受体下游的一个或多个信号传导途径的活性，所述信号传导途径典型地响应于配体与对应亲本受体的结合而被激活。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。
在一些实施方案中，氨基酸突变是相对于对应亲本受体的功能获得性氨基酸突变。“功能获得性”氨基酸突变是指这样的一个或多个突变：其相对于亲本受体改变工程化受体的功能，例如通过相对于内源性配体与亲本受体的结合改变或增强工程化受体对配体的亲和力，或通过相对于内源性配体与对应亲本受体的结合改变或增强信号传导途径的活性，所述信号传导途径响应于配体与工程化受体的结合而被激活。在一些实施方案中，功能获得性突变导致工程化受体对配体的亲和力增加。在特定实施方案中，功能获得性突变导致工程化受体对激动剂配体的亲和力增加。在一些实施方案中，功能获得性突变导致拮抗剂配体在与工程化受体结合后充当激动剂配体(例如，导致激动剂信号传导途径而不是拮抗剂信号传导途径的激活)。在一些实施方案中，功能获得性突变导致调节剂配体在与工程化受体结合后充当激动剂配体。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开文本的主题工程化受体或其配体结合结构域和/或离子孔结构域包含相对于对应亲本受体的一个或多个功能丧失性氨基酸突变和一个或多个功能获得性氨基酸突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。
在一些实施方案中，功能丧失性突变和功能获得性突变处于相同残基处，即它们是相同突变。在其他实施方案中，功能丧失性突变和功能获得性突变是在不同氨基酸残基处的突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，包含功能丧失性突变和/或功能获得性突变的主题工程化受体(或其配体结合结构域和/或离子孔结构域)与对应的亲本受体(例如野生型受体或非天然受体)(或其配体结合结构域和/或离子孔结构域)共享约99％、约98％、约95％、约90％、约85％、约80％、约70％、约60％、约50％(包括其间的所有范围和子范围)或更少的序列同一性。在一些实施方案中，主题工程化受体(或其配体结合结构域和/或离子孔结构域)与对应的亲本受体(或其配体结合结构域和/或离子孔结构域)共享85％或更多的序列同一性，例如85％、90％或95％或更多的序列同一性，在一些情况下96％、97％、98％或更多的序列同一性，例如99％或99.5％或更多的序列同一性，包括位于其间的所有值和子范围。
在一些方面，本公开文本的工程化受体包括由源自一种野生型受体的一个或多个氨基酸序列(例如亚基)与源自第二种野生型受体的一个或多个氨基酸序列(例如亚基)的组合产生的受体。换言之，所述工程化受体包含彼此异源的氨基酸序列，其中“异源的”意指不在自然界中一起出现。此类受体在本文中称为“嵌合受体”。在一些实施方案中，嵌合受体充当从其产生本公开文本的工程化受体的亲本受体。在一些实施方案中，嵌合受体包含来自第一LGIC的配体结合结构域和来自第二LGIC的离子孔结构域。
在一些实施方案中，亲本受体突变体对激动剂配体展示出增加的亲和力。在一些实施方案中，在与野生型受体结合时具有拮抗剂或调节剂的功能的配体在与亲本受体突变体结合时具有激动剂的功能。
在一些实施方案中，工程化受体是“配体门控离子通道”或LGIC。LGIC是指在被特定配体激活后允许离子穿过的一大组跨膜蛋白。LGIC由至少两个结构域构成：配体结合结构域和跨膜离子孔结构域。配体与LGIC的结合导致LGIC的激活和离子孔的打开。配体结合引起通道对一种或多种特定离子的通透性的剧烈变化；当通道无活性或关闭时，实际上没有离子可以穿过通道，但是在配体结合后每秒多达107个离子可以穿过。在一些实施方案中，LGIC对胞外配体(例如，神经递质)反应并且促进离子流入到胞质溶胶中。在一些实施方案中，LGIC对胞内配体(例如，核苷酸(如ATP)和信号传导中间体(如PIP2))反应并促进离子从胞质溶胶流出到胞外环境中。重要的是，LGIC的激活导致离子(例如，Ca2+、Na+、K+、Cl-等)跨细胞膜的转运，并且不导致配体本身的转运。
LGIC受体由多个亚基构成并且可以是同聚体受体或异聚体受体。同聚体受体由全部是相同类型的亚基构成。异聚体受体由这样的亚基构成：其中至少一个亚基不同于在所述受体内包含的至少一个其他亚基。例如，甘氨酸受体由5个亚基构成，其中有两种类型：α亚基，其中有四种亚型(α1-α4)；和β亚基，其中有单一已知亚型。一种示例性的同聚体GlyR是由5个α1-GlyR亚基构成的GlyR。类似地，同聚体GABAA受体可以由β3-GABAA亚基构成，并且nAchR受体可以由α7-nAchR亚基构成。一种示例性的异聚体GlyR可以由一个或多个α亚基和一个或多个β亚基构成(例如，α1β-GlyR)。示例性LGIC受体的亚基示于表2中。
表2：LGIC受体和亚基
适合用于特定实施方案中的LGIC家族的说明性例子包括但不限于Cys-环受体，如甘氨酸受体(GlyR)、血清素受体(例如，5-HT3受体)、λ-氨基丁酸A(GABA-A)受体和烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)；以及酸敏感(质子门控的)离子通道(ASIC)、上皮钠通道(ENaC)、促离子型谷氨酸受体、IP3受体、P2X受体、雷诺丁受体和锌激活通道(ZAC)。
适合于与本文所述的方法一起使用的LGIC的具体非限制性例子包括：HTR3A；HTR3B；HTR3C；HTR3D；HTR3E；ASIC1；ASIC2；ASIC3；SCNN1A；SCNN1B；SCNN1D；SCNN1G；GABRA1；GABRA2；GABRA3；GABRA4；GABRA5；GABRA6；GABRB1；GABRB2；GABRB3；GABRG1；GABRG2；GABRG3；GABRD；GABRE；GABRQ；GABRP；GABRR1；GABRR2；GABRR3；GLRA1；GLRA2；GLRA3；GLRA4；GLRB；GRIA1；GRIA2；GRIA3；GRIA4；GRID1；GRID2；GRIK1；GRIK2；GRIK3；GRIK4；GRIK5；GRIN1；GRIN2A；GRIN2B；GRIN2C；GRIN2D；GRIN3A；GRIN3B；ITPR1；ITPR2；ITPR3；CHRNA1；CHRNA2；CHRNA3；CHRNA4；CHRNA5；CHRNA6；CHRNA7；CHRNA9；CHRNA10；CHRNB1；CHRNB2；CHRNB3；CHRNB4；CHRNG；CHRND；CHRNE；P2RX1；P2RX2；P2RX3；P2RX4；P2RX5；P2RX6；P2RX7；RYR1；RYR2；RYR3；和ZACN。
可用于产生本公开文本的工程化受体的野生型LGIC受体的序列的非限制性例子包括以下。在该序列中，信号肽是斜体，配体结合结构域是粗体，并且离子孔结构域带下划线：
在一些实施方案中，野生型LGIC受体是人烟碱型胆碱能受体α7亚基(α7-nAchR)(GenBank登录号NP_000737.1，SEQ ID NO:25)，其由CHRNA7基因(GenBank登录号NM_000746.5))编码：
(SEQ ID NO:25)。
在一些实施方案中，野生型LGIC受体是人α1甘氨酸受体(GlyRα1)(GenBank登录号NP_001139512.1，SEQ ID NO:26)，其由GLRA1基因(GenBank登录号NM_001146040.1)编码：
(SEQ ID NO:26)。
在一些实施方案中，野生型LGIC受体是人α2甘氨酸受体(GlyRα2)(GenBank登录号NP_001112357.1，SEQ ID NO:27)，其由GLRA2基因(GenBank登录号NM_001118885.1)编码：
(SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，野生型LGIC受体是人α3甘氨酸受体(GlyRα3)亚型L(GenBank登录号NP_006520.2，SEQ ID NO:28)，其由GLRA3基因(GenBank登录号NM_006529.3)编码：
在一些实施方案中，野生型LGIC受体是人α3甘氨酸受体(GlyRα3)亚型K(GenBank登录号NP_001036008.1，SEQ ID NO:29)，其由GLRA3基因(GenBank登录号NM_001042543.3)编码：
在一些实施方案中，工程化受体是嵌合LGIC受体。在一些实施方案中，嵌合受体包含源自至少第一LGIC的配体结合结构域序列和源自至少第二LGIC的离子孔传导结构域序列(或更简单地，“离子孔结构域序列”)。在一些实施方案中，衍生的氨基酸序列与其来源的LGIC的对应区域相同。在一些实施方案中，与其来源的LGIC的对应区域相比，衍生的氨基酸序列可以在至少一个氨基酸位置含有改变。在一些实施方案中，源自LGIC序列的氨基酸序列与原始氨基酸序列的对应区域相差最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。在一些实施方案中，衍生的氨基酸序列与LGIC氨基酸序列的对应区域具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％(包括其间的所有范围和子范围)序列同一性。
在一些实施方案中，第一LGIC和第二LGIC是Cys-环受体。Cys-环受体的配体结合结构域序列和离子孔结构域序列是本领域熟知的，并且可以通过使用公众可得到的软件(例如PubMed、Genbank、Uniprot等)从文献中容易地鉴别。在一些实施方案中，嵌合受体的配体结合结构域与第一LGIC的配体结合结构域具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域与第二LGIC的离子孔结构域具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。在上文描述的序列中，配体结合结构域是粗体，并且离子孔结构域带下划线。
在一些实施方案中，嵌合受体的配体结合结构域源自人甘氨酸受体的配体结合结构域序列。在一些实施方案中，人甘氨酸受体是人GlyRα1(SEQ ID NO:26)。在一些实施方案中，配体结合结构域包含与GlyRα1的约氨基酸29-235(例如SEQ ID NO:26的氨基酸29-235、氨基酸29-240、氨基酸29-246、氨基酸29-248、氨基酸29-250或氨基酸29-252)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些此类实施方案中，配体结合结构域基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸29-235组成，基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸29-240组成，基本上由SEQ IDNO:26的氨基酸29-246组成，基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸29-248组成，基本上由SEQ IDNO:26的氨基酸29-250组成，基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸29-252组成。在一些实施方案中，离子孔结构域序列源自除人GlyRα1以外的Cys-环受体。
在一些实施方案中，嵌合受体的配体结合结构域包含人烟碱型胆碱能受体的配体结合结构域序列。在一些实施方案中，人烟碱型胆碱能受体是人α7-nAChR。在一些实施方案中，配体结合结构域包含人α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的约氨基酸23-220，例如SEQ ID NO:25的氨基酸23-220、氨基酸23-221、氨基酸23-222、氨基酸23-223、氨基酸23-224、氨基酸23-225、氨基酸23-226、氨基酸23-227、氨基酸23-228、氨基酸23-229、氨基酸23-230或氨基酸23-231。在一些实施方案中，配体结合结构域基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸23-220、氨基酸23-221、氨基酸23-222、氨基酸23-223、氨基酸23-224、氨基酸23-225、氨基酸23-226、氨基酸23-227、氨基酸23-228、氨基酸23-229、氨基酸23-230或氨基酸23-231组成。在一些实施方案中，离子孔结构域序列源自除人α7-nAChR以外的Cys-环受体。
在一些实施方案中，嵌合受体的配体结合结构域源自人烟碱型胆碱能受体的配体结合结构域序列。在一些实施方案中，人烟碱型胆碱能受体是人α7-nAChR。在一些实施方案中，配体结合结构域包含与人α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的约氨基酸23-220(例如SEQ IDNO:25的氨基酸23-220、氨基酸23-221、氨基酸23-222、氨基酸23-223、氨基酸23-224、氨基酸23-225、氨基酸23-226、氨基酸23-227、氨基酸23-228、氨基酸23-229、氨基酸23-230或氨基酸23-231)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，离子孔结构域序列源自除人α7-nAChR以外的Cys-环受体。
在一些实施方案中，工程化受体的离子孔结构域源自人甘氨酸受体的离子孔结构域序列。在一些实施方案中，人甘氨酸受体是人GlyRα1。在一些实施方案中，离子孔结构域包含与GlyRα1(SEQ ID No:26)的约氨基酸245-457(例如SEQ ID NO:26的氨基酸240-457、氨基酸245-457、氨基酸248-457、氨基酸249-457、氨基酸250-457、氨基酸255-457或氨基酸260-457)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，离子孔结构域基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸245-457组成，基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸248-457组成，基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸249-457组成，或基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸250-457组成。
在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含人GlyRα2(SEQ ID NO:27)的离子孔结构域序列。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含源自人GlyRα2(SEQ IDNO:27)的离子孔结构域序列的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含与人GlyRα2(SEQ ID NO:27)的离子孔结构域序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含与人GlyRα2(SEQ ID NO:27)的离子孔结构域序列相同的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα2的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸254-452，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα2的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸254-452，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα2的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸258-452，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα2的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸260-452，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含人GlyRα3亚型L(SEQ ID NO:28)的离子孔结构域序列。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含源自人GlyRα3亚型L(SEQ ID NO:28)的离子孔结构域序列的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含与人GlyRα3亚型L(SEQ ID NO:28)的离子孔结构域序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含与人GlyRα3亚型L(SEQ ID NO:28)的离子孔结构域序列相同的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα3亚型L的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸253-464，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα3亚型L的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸257-464，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα3亚型L的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸259-464，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含人GlyRα3亚型K(SEQ ID NO:29)的离子孔结构域序列。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含源自人GlyRα3亚型K(SEQ ID NO:29)的离子孔结构域序列的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含与人GlyRα3亚型K(SEQ ID NO:29)的离子孔结构域序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，嵌合受体的离子孔结构域包含与人GlyRα3亚型K(SEQ ID NO:29)的离子孔结构域序列相同的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα3亚型K的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸253-449，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα3亚型K的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸257-449，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，人GlyRα3亚型K的离子孔结构域序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸259-449，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施方案中，离子孔结构域源自人烟碱型胆碱能受体的离子孔结构域序列。在一些实施方案中，人烟碱型胆碱能受体是人α7-nAChR。在一些实施方案中，离子孔结构域包含与α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的约氨基酸230-502(例如氨基酸227-502、氨基酸230-502、氨基酸231-502、氨基酸232-502或氨基酸235-502)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些此类实施方案中，离子孔结构域基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸227-502组成，基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸230-502组成，基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸231-502组成，基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸232-502组成，或基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸235-502组成。
在一些实施方案中，主题嵌合配体门控离子通道的离子孔结构域包含与离子孔结构域的M2-M3接头结构域异源的M2-M3接头结构域。“M2-M3接头结构域”或“M2-M3接头”意指在LGIC的离子孔结构域内的序列，该序列在其氨基(N)末端侧接受体的跨膜结构域2(M2)的C末端并且在其羧基(C)末端侧接受体的跨膜结构域3(M3)的N末端。LGIC的M2-M3接头可以从本领域和/或通过使用任何公众可得到的蛋白质分析工具(例如Expasy、uniProt等)容易地确定。在一些实施方案中，当嵌合受体的离子孔结构域包含异源M2-M3接头时，M2-M3接头与嵌合受体的配体结合结构域源自相同的受体。例如，当主题配体门控的离子通道包含来自AChR的配体结合结构域和来自GlyR的离子孔结构域时，其离子孔结构域序列可以包含源自AChR的M2-M3接头序列。在一些实施方案中，离子孔结构域源自GlyRα1，并且M2-M3接头源自α7-nAChR。在一些实施方案中，从离子孔结构域去除的天然M2-M3接头序列对应于GlyRα1(SEQ ID NO:26)的约氨基酸293-313，例如氨基酸304-310、293-306、298-310、305-311、302-313等。在一些这样的实施方案中，插入的M2-M3接头源自α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的约氨基酸281-295，例如氨基酸290-295、281-290、281-295、283-295、287-292等，或与α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的氨基酸281-295或283-295至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，主题嵌合配体门控离子通道的配体结合结构域包含与配体结合结构域的Cys-环序列异源的Cys-环结构域序列。“Cys-环结构域序列”或“Cys-环序列”意指在Cys-环LGIC的配体结合结构域内的结构域，该结构域形成在N末端和C末端侧接半胱氨酸的环结构。不希望受理论的约束，认为在配体与配体结合结构域结合后，Cys-环在结构上移动到与M2-M3环非常接近，此移动介导胞外结构域中的配体结合生物物理转换为离子孔结构域中的信号转导(如在Miller和Smart,Trends in Pharmacological Sci2009:31(4)中所综述的)。用异源Cys-环序列取代内源Cys-环序列可以使LGIC的电导率增加1.5倍或更多，例如至少2倍、3倍或4倍，在一些情况下，至少5倍或6倍，并且在某些剂量下，至少7倍、8倍、9倍或10倍。Cys-环受体的Cys-环结构域可以从本领域和/或通过使用任何公众可得到的蛋白质分析工具(例如Expasy、uniProt等)容易地确定。典型地，当嵌合受体的配体结合结构域包含异源Cys-环序列时，该Cys-环序列与嵌合受体的离子孔结构域源自相同的受体。例如，当主题嵌合配体门控离子通道包含来自AChR的配体结合结构域和来自GlyR的离子孔结构域时，主题配体门控的离子通道可以包含来自AChR的配体结合结构域序列，但是Cys-环结构域的序列除外，其替代性地源自GlyR。在一些实施方案中，配体结合结构域源自α7-nAChR并且Cys-环序列源自GLyR。在一些实施方案中，从配体结合结构域去除的Cys-环序列对应于α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的约氨基酸150-164，例如α7-nAChR的氨基酸150-157。在一些实施方案中，插入的Cys环序列源自GlyRα1(SEQ ID NO:26)的约氨基酸166-180，例如GlyRα1的氨基酸166-172，或与GlyRα1的氨基酸166-180至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。在一些实施方案中，插入的Cys环序列源自GlyRα2(SEQ IDNO:27)的约氨基酸172-186，例如GlyRα2的氨基酸172-178，或与GlyRα2的氨基酸172-186至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。在一些实施方案中，插入的Cys环序列源自GlyRα3(SEQ ID NO:28或29)的大约氨基酸171-185，例如GlyRα3的氨基酸171-177，或与GlyRα3的氨基酸171-185至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。
在一些实施方案中，主题嵌合配体门控离子通道的配体结合结构域包含与配体结合结构域的β1-2环结构域序列异源的β1-2环结构域序列。“β1-2环结构域序列”或“β1-2环或β1-β2环”意指在Cys-环LGIC的配体结合结构域内的结构域，该结构域在其N末端侧接β1折叠的C末端且在其C末端侧接β2折叠的N末端。不希望受理论的约束，认为β1-2环有助于介导胞外结构域中的配体结合生物物理转换至离子孔结构域和随后的信号转导(即，在GlyR的情况下的氯离子流入)。认为在配体结合后，β1-2环与Cys-环一起非常接近M2-M3环，以介导胞外结构域中的配体结合生物物理转换为M2-M3环所在的离子孔结构域中的信号转导(如在Miller和Smart，同上中所综述的)。用异源β1-2环序列取代内源β1-2环序列可以使LGIC的电导率增加1.5倍或更多，例如至少2倍、3倍或4倍，在一些情况下，至少5倍或6倍，并且在某些剂量下，至少7倍、8倍、9倍或10倍。Cys-环受体的β1-2环可以从本领域和/或通过使用任何公众可得到的蛋白质分析工具(例如Expasy、uniProt等)容易地确定。典型地，当嵌合受体的配体结合结构域包含异源β1-2环序列时，该β1-2环序列与嵌合受体的离子孔结构域源自相同的受体。例如，当主题嵌合配体门控离子通道包含源自AChR的配体结合结构域和源自GlyR的离子孔结构域时，该配体结合结构域的β1-2环结构域的序列可以源自GlyR。在一些实施方案中，配体结合结构域源自α7-nAChR。在一些实施方案中，从配体结合结构域去除的β1-2环序列对应于α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的约氨基酸64-72或67-70，例如α7-nAChR的氨基酸67-70、66-71或64-72。在一些实施方案中，插入的β1-2环序列是GlyRα1(SEQ ID NO:26)的约氨基酸79-85，例如GlyRα1的氨基酸80-85、81-84、79-85或81-84，具有至多3个、至多2个、至多1个或没有氨基酸突变。在一些实施方案中，离子孔结构域源自GlyRα2，并且插入的β1-2环对应于GlyRα2(SEQ ID NO:27)的约氨基酸86-91，具有至多3个、至多2个、至多1个或没有氨基酸突变。在一些实施方案中，离子孔结构域源自GlyRα3，并且插入的β1-2环对应于GlyRα3(SEQ ID NO:28或29)的约氨基酸85-90，具有至多3个、至多2个、至多1个或没有氨基酸突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开文本提供了嵌合LGIC受体，嵌合LGIC受体包含源自人α7-nAChR的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域，其中配体结合结构域包含本公开文本的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。在一些实施方案中，配体结合结构域包含源自人甘氨酸受体的Cys-环结构域。在一些实施方案中，配体结合结构域包含源自人甘氨酸受体的β1-2环结构域。
本公开文本的嵌合LGIC受体的序列的非限制性例子包括在本文中公开为SEQ IDNO:30-31和33的序列。在一些实施方案中，嵌合LGIC受体与本文在SEQ ID NO:30-31和33中提供的序列具有85％或更多的序列同一性，例如，与SEQ ID NO:30-31和33中提供的序列具有90％或更多、93％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多或100％的序列同一性。在该序列中，信号肽是斜体，配体结合结构域是粗体，并且离子孔结构域带下划线。
在一些实施方案中，嵌合LGIC受体是CHRNA7/GLRA1嵌合体，包含人α7-nAChR信号肽(斜体)和包含GlyRα1Cys-环序列(小写字母)的配体结合结构域(粗体)；其与人GlyRα1离子孔结构域(带下划线)融合。在一些实施方案中，嵌合LGIC受体包含与SEQ ID NO:33具有80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多或100％的序列同一性的氨基酸序列：
(SEQ ID NO:33，由SEQ ID NO:32编码)。
在一些实施方案中，嵌合LGIC受体是CHRNA7/GLRA1嵌合体，包含人α7-nAChR信号肽(斜体)以及包含GlyRα1β1-2环序列(小写字母)和Cys-环序列(小写字母)的配体结合结构域(粗体)；其与人GlyRα1离子孔结构域(带下划线)融合：
在一些实施方案中，嵌合LGIC受体是CHRNA7/GLRA1嵌合体(R229连接部)，包含人α7-nAChR信号肽(斜体)和配体结合结构域(粗体)，其与人GlyRα1离子孔结构域(带下划线)融合：
配体门控离子通道中的氨基酸突变
如上文所讨论的，在一些方面，主题工程化受体包含至少一个氨基酸突变，相对于配体在未突变的亲本受体上的效力，氨基酸突变改变了配体在工程化受体上的效力。换句话说，相对于未突变的亲本受体的效力，一个或多个氨基酸突变(例如功能丧失性突变或功能获得性突变)转变工程化受体对配体的效力。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，该一个或多个突变位于工程化受体的配体结合结构域中。在一些实施方案中，当工程化受体的配体结合结构域是Cys-环受体蛋白时，该一个或多个氨基酸突变是在与α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的选自W77、Y94、R101、W108、Y115、T128、N129、V130、L131、Q139、L141、Y151、S170、W171、S172、S188、Y190、Y210、C212、C213和Y217的残基相对应的残基处的取代。在一些实施方案中，一个残基被取代。在一些实施方案中，2、3、4或5个或更多个残基被取代，例如6、7、8、9或10个残基被取代。在某些实施方案中，残基对应于α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的选自W77、R101、Y115、N129、L131、S170、S172和S188的残基。在某些实施方案中，该一个或多个取代是在α7-nAChR序列内。
在一些实施方案中，该一个或多个取代降低工程化受体对乙酰胆碱和非天然配体的效力，例如降低2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、20倍或更多、30倍或更多、50倍或更多、或100倍。在某些实施方案中，该一个或多个取代是对应于α7-nAChR的R101I、R101S、R101D、Y115L、Y115M、Y115D、Y115T、T128M、T128R、T128I、N129I、N129V、N129P、N129W、N129T、N129D、N129E、L131E、L131P、L131T、L131D、L131S、L141S、L141R、W171F、W171H、S172F、S172Y、S172R、S172D、C212A、C212L或C213P的取代。在其他情况下，该一个或多个取代选择性地降低乙酰胆碱在工程化受体上的效力。换言之，该一个或多个取代降低工程化受体对乙酰胆碱的效力，同时基本上维持对非天然配体的效力，或者不然，一个或多个取代降低工程化受体对乙酰胆碱的效力比其降低工程化受体对非天然配体的效力多2倍或更多，例如3倍、4倍、5倍或更多，在一些情况下10倍、20倍、50倍或100倍或更多。在一些实施方案中，取代对应于α7-nAChR的L131E、L131S、L131T、L131D或S172D。在又其他实施方案中，该一个或多个取代选择性地降低非天然配体在工程化受体上的效力。换言之，该一个或多个取代降低工程化受体对非天然配体的效力，同时基本上维持对乙酰胆碱的效力，或者不然，该一个或多个取代降低工程化受体对非天然配体的效力比其降低工程化受体对乙酰胆碱的效力多2倍或更多，例如3倍、5倍或更多，在一些情况下10倍、20倍或50倍或更多。在一些实施方案中，取代对应于α7-nAChR的W77M、Y115W、S172T或S172C。在某些实施方案中，该一个或多个取代是在α7-nAChR序列内。在某些实施方案中，非天然配体选自AZD-0328、TC6987、ABT-126和法西克兰/RG3487。
在其他实施方案中，该一个或多个取代增加工程化受体对乙酰胆碱和/或非天然配体的效力，例如增加2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、20倍或更多、30倍或更多、50倍或更多、或100倍。在一些实施方案中，取代对应于L131N、L141W、S170G、S170A、S170L、S170I、S170V、S170P、S170F、S170M、S170T、S170C、S172T、S172C、S188I、S188V、S188F、S188M、S188Q、S188T、S188P或S188W。在一些实施方案中，该一个或多个取代增加乙酰胆碱和非天然配体两者的效力。在一些实施方案中，取代对应于α7-nAChR的L131N、S170G、S170A、S170L、S170I、S170V、S170P、S170F、S170M、S170T、S170C、S172T、S188I、S188V、S188F、S188M、S188Q或S188T。在其他情况下，该一个或多个取代选择性地增加乙酰胆碱在工程化受体上的效力。换言之，该一个或多个取代增加工程化受体对乙酰胆碱的效力比其增加工程化受体对非天然配体的效力多2倍或更多，例如3倍、4倍或5倍或更多，在一些情况下10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施方案中，取代对应于α7-nAChR的L141W、S172T、S172C、S188P或S188W。在某些实施方案中，该一个或多个取代是在α7-nAChR序列内。在某些实施方案中，非天然配体选自AZD-0328、TC-5619、TC6987、ABT-126和法西克兰/RG3487。在又其他情况下，该一个或多个取代选择性地增加非天然配体对工程化受体的效力。换言之，该一个或多个取代增加工程化受体对非天然配体的效力比其增加工程化受体对乙酰胆碱的效力多2倍或更多，例如3倍、5倍或更多，在一些情况下10倍、20倍或50倍或更多。
在一些实施方案中，在主题工程化受体中被突变的氨基酸残基不是对应于野生型a7 nAChR(SEQ ID NO:25)的R27、E41、Q79、Q139、L141、G175、Y210、P216、Y217或D219的氨基酸。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，在主题工程化受体中被突变的氨基酸残基是对应于野生型a7 nAChR(SEQ ID NO:25)的R27、E41、Q79、Q139、L141、G175、Y210、P216、Y217或D219的氨基酸。在一些实施方案中，取代不是对应于野生型α7nAChR中的W77F、W77Y、W77M、Q79A、Q79Q、Q79S、Q79G、Y115F、L131A、L131G、L131M、L131N、L131Q、L131V、L131F、Q139G、Q139L、G175K、G175A、G175F、G175H、G175M、G175R、G175S、G175V、Y210F、P216I、Y217F或D219A的取代。在一些实施方案中，取代是对应于野生型α7nAChR中的W77F、W77Y、W77M、Q79A、Q79Q、Q79S、Q79G、Y115F、L131A、L131G、L131M、L131N、L131Q、L131V、L131F、Q139G、Q139L、G175K、G175A、G175F、G175H、G175M、G175R、G175S、G175V、Y210F、P216I、Y217F或D219A的取代。在一些实施方案中，当这样的取代存在于工程化受体内时，其与本文所述的氨基酸突变中的一个或多个组合存在。
在一些实施方案中，α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的残基Y94、Y115、Y151和Y190介导天然配体乙酰胆碱的结合。在一些实施方案中，在这些残基处的突变可以减少乙酰胆碱的结合，并且因此被认为是功能丧失性突变。在一些实施方案中，α7-nAChR的残基W77、Y115、N129、V130、L131、Q139、L141、S170、Y210、C212、C213和Y217可以介导非天然配体AZD0328与此受体的结合，并且这些残基的突变可以增加AZD0328和/或其他配体对此受体的亲和力，并且因此被认为是功能获得性突变。在一些实施方案中，主题工程化受体包含在α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的配体结合结构域区或包含α7-nAChR的配体结合结构域区的嵌合受体的配体结合结构域的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中一个或多个氨基酸残基选自W77、Y94、Y115、N129、V130、L131、Q139、L141、Y151、S170、Y190、Y210、C212、C213和Y217。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在某些实施方案中，在α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的配体结合结构域区或包含α7-nAChR的配体结合结构域区的嵌合受体的配体结合结构域的一个或多个氨基酸残基中的突变是在选自W77、Y94、Y115、N129、V130、L131、Q139、L141、Y151、S170、Y190、Y210、C212、C213和Y217的一个或多个氨基酸残基处的取代。
在一些实施方案中，α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的残基Y115、L131、L141、S170、W171、S172、C212和Y217可以介导乙酰胆碱和/或烟碱的结合，并且在这些残基中的一个或多个处的突变可以减少乙酰胆碱和/或烟碱的结合。在一些实施方案中，α7-nAChR的R101、Y115、L131、L141、W171、S172、S188、Y210和Y217可以介导非天然配体ABT126的结合，并且这些残基中的一个或多个的突变可以增加ABT126和/或其他配体对α7-nAChR的亲和力。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。在一些实施方案中，α7-nAChR的R101、Y115、T128、N129、L131、L141、W171、S172、Y210、C212、C213和Y217可以介导非天然配体TC6987的结合，并且这些残基中的一个或多个的突变可以增加TC6987和/或其他配体对α7-nAChR的亲和力。在一些实施方案中，α7-nAChR的R101、N120、L131、L141、S170、W171、S172、Y210和Y217可以介导非天然配体法西克兰/RG3487的结合，并且这些残基中的一个或多个的突变可以增加法西克兰/RG3487和/或其他配体对α7-nAChR的亲和力。在一些实施方案中，主题工程化受体包含在α7-nAChR的配体结合结构域区或包含α7-nAChR的配体结合结构域区的嵌合受体的配体结合结构域的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中该一个或多个氨基酸残基选自R101、Y115、T128、N120、N129、L131、L141、S170、W171、S172、S188、Y210、C212、C213和Y217。在一些实施方案中，该一个或多个氨基酸残基改变乙酰胆碱和/或烟碱与α7-nAChR的结合，其中氨基酸选自α7-nAChR的Y115、L131、L141、S170、W171、S172、C212和Y217。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自C212和S170。在一些实施方案中，在该一个或多个氨基酸残基中的突变改变ABT126与α7-nAChR的结合，其中一个或多个氨基酸残基选自α7-nAChR的R101、Y115、L131、L141、W171、S172、S188、Y210和Y217。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自R101、S188和Y210。在一些实施方案中，在该一个或多个氨基酸残基中的突变改变TC6987与α7-nAChR的结合，其中一个或多个氨基酸残基选自α7-nAChR的R101、Y115、T128、N129、L131、L141、W171、S172、Y210、C212、C213和Y217。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自R101、T128、N129、Y210和C213。在一些实施方案中，在一个或多个氨基酸残基中的突变改变法西克兰/RG3487与α7-nAChR的结合，其中一个或多个氨基酸残基选自α7-nAChR的R101、N120、L131、L141、S170、W171、S172、Y210和Y217。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自Y210、R101和N129。
本公开文本提供了工程化受体，其与亲本受体相比具有两个或更多个突变，如氨基酸取代。在一些实施方案中，亲本受体包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域。在一些实施方案中，亲本受体是嵌合受体。在一些实施方案中，亲本受体包含源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。在一些实施方案中，所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。在一些实施方案中，所述工程化受体的配体结合结构域包含源自人甘氨酸受体的Cys-环结构域。在一些实施方案中，亲本受体包含SEQID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的亲本受体相比，工程化受体包含两个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述工程化受体的配体结合结构域包含来自人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。
在一些实施方案中，工程化受体的配体结合结构域包含在选自对应于人α7-nAChR(SEQ ID NO:25)的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的那些氨基酸残基的两个或更多个氨基酸残基处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，两个氨基酸取代位于选自L131和S172、Y115和S170、以及Y115和L131的一对氨基酸残基处。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在选自L131和S172、Y115和S170、以及Y115和L131的一对氨基酸残基处的两个氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在残基L131处的氨基酸取代和S172D氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在残基L131处的氨基酸取代和Y115D氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含选自L131S和S172D、L131T和S172D、L131D和S172D、Y115D和S170T、Y115D和L131Q、以及Y115D和L131E的一对氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含L131E氨基酸取代。
在一些实施方案中，配体结合结构域包含在选自Y140、R101、L131、Y115和Y210的氨基酸残基处的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸残基对应于α7-nAChR的氨基酸残基。在一些实施方案中，配体结合结构域包含R101W和/或Y210V氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在选自R101、L131、Y115、Y210和Y140的氨基酸残基处的两个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在选自R101、L131、Y115、Y210和Y140的氨基酸残基处的两个氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在选自R101和L131、Y115和Y210、R101和Y210的一对氨基酸残基处的两个氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含选自R101F和L131G、R101F和L131D、Y115E和Y210W、R101W和Y210V、R101F和Y210V、R101F和Y210F、R101M和L131A、以及R101M和L131F的一对氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含在氨基酸残基R101、Y115和Y210处的三个氨基酸取代。在一些实施方案中，配体结合结构域包含氨基酸取代R101W、Y115E和Y210W，或氨基酸取代R101F、Y115E和Y210W。
在一些实施方案中，配体结合结构域包含在残基L131处的氨基酸取代和R101F或R101M氨基酸取代。在一些实施方案中，在残基L131处的氨基酸取代是L131G、L131D、L131A、L131F或L131N。
在一些实施方案中，配体结合结构域包含在残基Y210处的疏水性氨基酸取代和R101W或R101F氨基酸取代。在一些实施方案中，在残基Y210处的氨基酸取代是Y210V、Y210F或Y210W。
本领域技术人员将容易地识别用于与本公开文本的工程化受体比较的适当的对照受体。在一些实施方案中，除了一个或多个有区别的氨基酸突变(例如，取代)之外，对照受体在序列上与工程化受体相同。在所有情况下，提及对照受体意欲表明，所列举的特性(例如，对配体的效力)的变化是本公开文本的工程化受体的一个或多个氨基酸突变的结果。
本公开文本提供了工程化受体，其中工程化受体是嵌合配体门控离子通道(LGIC)受体并且包含：(a)源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)并包含来自人甘氨酸受体α1亚基的Cys-环结构域的配体结合结构域；和(b)源自人甘氨酸受体α1亚基的离子孔结构域。在一些实施方案中，工程化受体源自包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成的亲本工程化受体，并且进一步包含基于亲本工程化受体的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方案中，工程化受体对乙酰胆碱的效力低于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)对乙酰胆碱的效力。在一些实施方案中，工程化受体对乙酰胆碱的效力比人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)对乙酰胆碱的效力低至少约1.5倍(例如，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍或约100倍，包括位于其间的所有子范围和值)。在一些实施方案中，基于使用YFP荧光淬灭的细胞报告物测定，通过工程化受体对乙酰胆碱的EC50评价工程化受体对乙酰胆碱的效力。在一些实施方案中，工程化受体对乙酰胆碱的EC50为至少100uM、至少200uM、至少300uM、至少500uM、至少700uM、至少1mM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM或至少10mM。在一些实施方案中，工程化受体对乙酰胆碱的EC50为至少1mM。在一些实施方案中，工程化受体对乙酰胆碱的EC50为至少3mM。在一些实施方案中，对乙酰胆碱具有更高EC50允许工程化受体在细胞中或在细胞表面上具有更高的表达水平，而在存在生理浓度的乙酰胆碱的情况下不会有大量电流流入细胞中。
在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的效力与人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)对非天然配体的效力大致相同。在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的效力高于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)对非天然配体的效力。在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的效力比人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)对非天然配体的效力高至少约1.5倍(例如，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍或约100倍，包括位于其间的所有子范围和值)。在一些实施方案中，确定效力包括如本公开文本的实施例2中所述基于使用YFP荧光淬灭的细胞报告物测定来确定EC50。在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的EC50小于1nM、小于2nM、小于3nM、小于4nM、小于5nM、小于6nM、小于7nM、小于8nM、小于9nM、小于10nM、小于15nM、小于20nM、小于30nM、小于40nM、小于50nM、小于60nM、小于70nM、小于80nM、小于90nM、小于100nM、小于150nM、小于200nM、小于300nM、小于400nM、小于500nM、小于600nM、小于700nM、小于800nM、小于900nM、小于1uM、小于2uM、小于3uM、小于4uM、小于5uM、小于6uM、小于7uM、小于8uM、小于9uM或小于10uM。在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的EC50小于10nM。在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的EC50小于100nM。在一些实施方案中，工程化受体对非天然配体的EC50小于1uM。
在一些实施方案中，工程化受体在存在非天然配体的情况下的功效高于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)在存在非天然配体的情况下的功效。在一些实施方案中，工程化受体在存在非天然配体的情况下的功效比人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)在存在非天然配体的情况下的功效高至少约1.5倍(例如，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍或约100倍，包括位于其间的所有子范围和值)。在一些实施方案中，确定功效包括在存在非天然配体的情况下体外确定穿过工程化受体的电流量。
在一些方面，主题配体门控离子通道包含一个或多个非脱敏突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。当在配体门控离子通道的情境中使用时，“脱敏”是指在激动剂的长期存在下离子通量的逐渐减小。这导致神经元对配体的功效逐渐丧失。非脱敏突变意指阻止LGIC变得对配体脱敏，从而阻止神经元变得对配体反应低或无反应的氨基酸突变。通过将携带突变的LGIC引入神经元中并分析在长期暴露于配体期间随时间变化的电流通量，可以容易地鉴定非脱敏突变。如果LGIC不包含非脱敏突变，则电流将在长期暴露期间从峰值恢复到稳态，而如果LGIC包含非脱敏突变，则电流将在暴露于配体的持续时间内保持峰值通量。导致脱敏的示例性氨基酸突变包括人GlyRα1中的V322L突变(蛋白质原的V294L后加工以除去信号肽)。LGIC脱敏、用于测量LGIC脱敏的方法和非脱敏的突变是本领域熟知的；参见例如Gielen等人Nat Commun 2015年4月20,6:6829和Keramidas等人Cell MolLife Sci.2013年4月；70(7):1241-53，其全部公开内容通过引用并入本文。
在一些方面，主题配体门控离子通道包含一个或多个转化突变。在一些实施方案中，突变是氨基酸取代。转化突变意指这样的突变：其改变了LGIC的离子孔结构域的通透性，使它变得允许传导非天然离子，即，天然地不允许穿过的离子。在一些情况下，突变将通透性从阳离子转化为阴离子，例如用肽序列PAKIGLGITVLLSLTTFMSGVAN(SEQ ID NO:35)替代人α7-nAChR(CHRNA7)中的氨基酸残基260-281(EKISLGITVLLSLTVFMLLVAE，SEQ ID NO:34)或另一种阳离子透过性LGIC中的对应氨基酸。在一些情况下，突变将通透性从阴离子转化为阳离子，例如，将GLRA1的氨基酸残基279或另一种阴离子透过性LGIC中的对应氨基酸取代为谷氨酸(E)(如同GLRA1中的A293E取代那样，其将LGIC从允许阴离子转化为允许钙)、或GLRA1的氨基酸残基278或另一种阴离子透过性LGIC中的对应氨基酸的缺失、将GLRA1的氨基酸残基279或另一种阴离子透过性LGIC中的对应氨基酸取代为谷氨酸(E)，以及将GLRA1的氨基酸残基293或另一种阴离子透过性LGIC中的对应氨基酸取代为缬氨酸(V)(如同GLRA1中的P278Δ、A279E、T293V那样，其将LGIC从允许阴离子转化为允许阳离子)。
通过体外筛选和验证方法，可以鉴定除了本文描述的那些以外的另外的工程化受体。在一些实施方案中，从有限数量的亲本受体产生亲本受体突变体的文库。使用本领域已知的方法，包括易错PCR，可以使亲本受体发生突变。在一些实施方案中，然后将亲本受体突变体的文库转染到酵母或哺乳动物细胞中，并且以高通量筛选以鉴定功能性受体(例如，以鉴定能够响应于配体而进行信号传导的亲本受体突变体)。在一些实施方案中，然后将在此初步筛选中鉴定的功能性亲本受体突变体在哺乳动物细胞中表达，并且针对对配体的效力进行筛选，例如通过本文描述的酶标仪和/或电生理学测定来进行。然后可以选择对激动剂配体展示出增加的结合亲和力或使得能够在二次筛选中使用拮抗剂或调节剂配体作为激动剂的亲本受体突变体，并且完成进一步的体外和/或体内验证和表征测定。此类筛选测定是本领域已知的，例如Armbruster,B.N.等人(2007)PNAS,104,5163-5168；Nichols,C.D.和Roth,B.L.(2009)Front.Mol.Neurosci.2,16；Dong,S.等人(2010)Nat.Protoc.5,561-573；Alexander,G.M.等人(2009)Neuron 63,27-39；Guettier,J.M.等人(2009)PNAS106,19197-19202；Ellefson J.W.等人(2014)Nat Biotechnol.32(1):97-101；Maranhao AC和Ellington AD.(2017)ACS Synth Biol.20；6(1):108-119；Talwar S等人(2013)PLoS One；8(3):e58479；Gilbert D.F.等人(2009)Front Mol Neurosci.30；2:17；Lynagh和Lynch,(2010),Biol Chem.14:285(20),14890-14897；Islam R.等人(2016)ACS ChemNeurosci.21；7(12):1647-1657；以及Myers等人(2008)Neuron.8:58(3):362-373。
这些示例性工程化受体的总结提供于下表3中。除指示的氨基酸突变之外，这些受体中的每一个包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成。
表3：示例性工程化受体
配体
在一些实施方案中，本公开文本的配体是指对哺乳动物细胞具有已知作用机制的外源性药物或化合物(例如，已知充当受体的激动剂、拮抗剂或调节剂)。此类配体也可以称为“结合剂”。本公开文本的配体可以包括蛋白质、脂质、核酸和/或小分子。在一些实施方案中，配体包括已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床应用以治疗特定疾病(例如，神经系统疾病)的药物或化合物。在一些实施方案中，配体包括尚未被FDA批准用于临床应用的药物或化合物，但该药物或化合物已在一项或多项临床试验中进行过测试，当前正在一项或多项临床试验中进行测试，和/或预期会在一项或多项临床试验中进行测试。在一些实施方案中，配体包括尚未被FDA批准用于临床应用，但常规地用在实验室研究中的药物或化合物。在一些实施方案中，配体是上述配体之一的类似物。在一些实施方案中，配体选自AZD0328、ABT-126、AQW-051、大麻二酚、西兰司琼、PH-399733、法西克兰/RG3487/MEM-3454、TC-6987和TC-5619/AT-101。在一些实施方案中，配体选自ABT-126、AZD-0328、RG3487、TC-6987、TC-6683、伐尼克兰和TC-5619。在一些实施方案中，所述配体是TC-5619。
在特定的实施方案中，配体是西兰司琼的类似物，例如如以下化合物式2-7之一所描述，呈其R或S对映异构体：
在一些实施方案中，配体充当激动剂。如本文所用的术语“激动剂”是指诱导信号传导反应的配体。在一些实施方案中，配体充当拮抗剂。术语拮抗剂在本文中用于指抑制信号传导反应的配体。
在一些实施方案中，配体是根据下式的AZD-0328：
在一些实施方案中，配体是根据下式的TC-6987：
在一些实施方案中，配体是根据下式的ABT-126：
在一些实施方案中，配体是根据下式的TC-5619/布瑞克兰：
在一些实施方案中，配体是根据下式的TC-6683：
在一些实施方案中，配体是根据下式的伐尼克兰：
在一些实施方案中，配体是根据下式的法西克兰/RG3487：
本文所述的工程化受体和非天然配体的示例性组合提供于下表4中。表4中的每种工程化受体可以作为蛋白质、编码蛋白质的多核苷酸或包含编码蛋白质的多核苷酸的载体存在。在一些实施方案中，工程化受体包含源自人α7-nAChR的配体结合结构域。在一些实施方案中，工程化受体包含源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。在一些实施方案中，人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1。在一些实施方案中，工程化受体除了表4中的指示突变之外包含与SEQ ID NO:33至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的多肽序列。
表4：工程化受体和非天然配体组合的非限制性例子
组合物
本公开文本还提供了组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，组合物或药物组合物包含含有本公开文本的AAV衣壳多肽的AAV载体。在一些实施方案中，组合物或药物组合物包含核酸，该核酸包含编码本公开文本的工程化受体(例如，配体门控离子通道)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包含AAV载体，该AAV载体包含本公开文本的AAV衣壳多肽，并且进一步包含编码本公开文本的工程化受体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，组合物或药物组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或缓冲液。在一些实施方案中，药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或缓冲液适合于在人中使用。
此类赋形剂、载体、稀释剂和/或缓冲液(一起作为“药物媒介物”)包括可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药剂。其可以由联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出用于在哺乳动物如人中使用。此类药物媒介物可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物媒介物可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当施用于哺乳动物时，本公开文本的化合物和组合物以及药学上可接受的媒介物、赋形剂或稀释剂可以是无菌的。在一些情况下，当将本公开文本的化合物静脉内施用时，采用水性介质作为媒介物，该水性介质如水、盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液。
药物组合物可以采取胶囊、片剂、丸剂、团粒剂、锭剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、酏剂、溶液、混悬剂、乳剂、栓剂或其持续释放配制品的形式，或适合施用于哺乳动物的任何其他形式。在一些情况下，将药物组合物配制成用于作为适于口服或静脉内施用于人的药物组合物根据常规程序施用。合适药物媒介物及其配制方法的例子描述在以下文献中：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro编,MackPublishing Co.Easton,Pa.,第19版,1995,第86、87、88、91和92章，所述文献通过引用并入本文。
药学上可接受的赋形剂包括但不限于如水、盐水、甘油和乙醇等液体。其中可以包括药学上可接受的盐，例如矿物酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等辅助物质可以存在于此类媒介物中。多种药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，并且不需要在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中充分描述，包括例如A.Gennaro,(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(1999)H.C.Ansel等人,编,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；以及Handbookof Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人,编,第3版Amer.PharmaceuticalAssoc。
在一些实施方案中，药物组合物包含在溶液中、悬浮液中或两者中包含AAV衣壳多肽或包含含有AAV衣壳多肽的AAV载体的液体。如本文所用，液体组合物包括凝胶。在一些实施方案中，液体组合物是水性的。在一些实施方案中，组合物是原位可胶凝水性组合物，例如原位可胶凝水溶液。
组合物的非限制性例子包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如，水包油或油包水)、混悬剂、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和混悬剂可包括助悬剂和增稠剂。此类药学上可接受的载体包括片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬或软)、微珠、粉末、颗粒和晶体。补充活性化合物(例如，防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可掺入组合物中。
在一些实施方案中，药物组合物被配制成与特定的施用或递送途径相容。因此，药物组合物包括适合于通过各种途径施用的载体、稀释剂和/或赋形剂。
赋形剂的选择将部分地取决于特定载体以及用于施用组合物的特定方法。因此，存在本公开文本的药物组合物的多种合适配制品。
例如，可以通过以下方式将载体配制成注射用制剂：将载体溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(如植物油或其他类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高碳脂肪酸酯或丙二醇)中；并且如果期望的话，具有常规添加剂(如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)。
适合于肠胃外施用的组合物包括活性化合物的水溶液和非水溶液、混悬剂或乳剂。制剂通常是无菌的，并且可以与预期接受者的血液等渗。非限制性说明性例子包括水、盐水、右旋糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。
可以将助溶剂和佐剂添加至配制品中。助溶剂的非限制性例子包括羟基或其他极性基团，例如醇，如异丙醇；二醇，如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。佐剂包括，例如，表面活性剂，如大豆卵磷脂和油酸；脱水山梨醇酯，如脱水山梨醇三油酸酯；以及聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物适合于肠胃外施用，例如水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌混悬剂，其可以包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。配制品能以单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)呈现，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体赋形剂(例如，水)以供注射。临时注射溶液和混悬剂可以由前述种类的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
作为另一个例子，可以将化合物配制成适合口服施用的制剂，包括(a)液体溶液，如溶解在稀释剂(如水或盐水)中的有效量的化合物；(b)胶囊、囊剂或片剂，其各自含有预定量的作为固体或颗粒的活性成分；(c)在适当液体中的混悬剂；和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包括以下中的一种或多种：乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学上相容的赋形剂。锭剂形式可以包含在调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分，以及包含在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分的糖锭剂、乳剂、凝胶等，除了活性成分之外，其还含有如本文所述的此类赋形剂。
如本文所用，术语“单位剂型”是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理离散的单元，每个单元含有与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物联合的预定量的本公开文本的化合物，该预定量计算为足以产生期望作用的量。本公开文本的新型单位剂型的规格取决于所采用的特定化合物和待实现的效果以及在宿主中与每种化合物相关的药效学。
方法
在本公开文本的一些方面，本文公开的组合物和方法可用于治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用于转导神经元。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用于将异源核酸递送至神经元。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用于测定中。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用作研究工具。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用作核酸递送工具。
在本公开文本的一些方面，提供了一种治疗受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含本公开文本的衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体转导海马体神经元。在一些实施方案中，AAV载体转导背根神经节神经元或三叉神经节神经元。在一些实施方案中，所述AAV载体包含异源核酸。在一些实施方案中，异源核酸编码工程化LGIC。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用激活工程化LGIC的小分子配体/药物/激动剂，工程化LGIC进而调节靶神经元的活动，从而治疗受试者的神经系统疾病或障碍(例如，疼痛或癫痫)。
在本公开文本的一些方面，AAV载体能够体外转导胚胎海马体神经元。在一些实施方案中，所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。
在本公开文本的一些方面，提供了一种治疗受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的核酸，其中核酸包含编码本公开文本的工程化LGIC受体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸被递送至海马体神经元中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用激活工程化LGIC的小分子配体，工程化LGIC进而调节靶神经元的活动，从而治疗受试者的局灶性癫痫。
在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于制造用于治疗神经系统疾病或障碍的药物。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于制造用于治疗与海马体神经元失调相关的神经系统疾病或障碍(如局灶性癫痫、精神分裂症、孤独症谱系障碍、阿尔茨海默病、雷特综合征和脆性X综合征)的药物。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗局灶性癫痫。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗精神分裂症。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗孤独症谱系障碍。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗阿尔茨海默病。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗雷特综合征。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗脆性X综合征。
本公开文本部分地考虑了用于控制、管理、预防或治疗受试者的癫痫的组合物和方法。在一些实施方案中，癫痫是局灶性癫痫。在一些实施方案中，所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
在一些实施方案中，本文的组合物和方法可以用于减轻受试者癫痫发作的水平。在一些实施方案中，本文的组合物和方法可以用于预防或控制受试者癫痫发作的水平。癫痫发作可以分类为强直性-阵挛性、强直性、阵挛性、肌阵挛性、失神性或失张力性发作。
在一些实施方案中，本文的组合物和方法可将受试者经历的癫痫发作的数量或频率降低约5％、约10％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，本文的组合物和方法可将受试者经历的癫痫发作的数量或频率降低至少5％、至少10％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，本文的组合物和方法可将受试者经历的癫痫发作的水平和/或持续时间降低约5％、约10％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，本文的组合物和方法可将受试者经历的癫痫发作的水平和/或持续时间降低至少5％、至少10％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。
在各种实施方案中，用于控制、管理、预防或治疗受试者的癫痫(例如，局灶性癫痫)的方法包括向受试者施用有效量的编码本公开文本的工程化LGIC的AAV载体和/或核酸。不希望受任何特定理论约束，本公开文本考虑了使用编码本文公开的工程化LGIC的载体和/或核酸调节神经元活动以缓解受试者的癫痫。
在各种实施方案中，将编码工程化LGIC(其编码激活神经元细胞或使神经元细胞去极化的工程化受体)的载体和/或核酸施用于(或引入)控制癫痫的一个或多个神经元细胞中。在存在配体的情况下，使表达工程化受体的神经元细胞失活并且减少对癫痫的敏感性。
在一些实施方案中，癫痫是局灶性癫痫(局灶性癫痫发作)。局灶性癫痫是神经系统病症，其中主要症状是影响脑的一半球(一半)的反复癫痫发作。
局灶性癫痫分为四类：(a)局灶性知觉保留癫痫发作，其中受试者知道癫痫发作期间发生了什么；(b)局灶性知觉受损癫痫发作，其中受试者感到困惑或不知道癫痫发作期间发生了什么或不记得癫痫发作；(c)局灶性运动性癫痫发作，其中受试者在某种程度上运动-从抽搐、痉挛、到摩擦手到四处走动等；以及(d)局灶性非运动性癫痫发作，其中受试者在癫痫发作期间不会抽搐或进行其他运动。替代性地，它会引起受试者的感觉或思维方式发生变化(例如，感到强烈的情绪，奇怪的感觉或如心跳加速、起鸡皮疙瘩或感到热或冷的症状)。
局灶性癫痫的特征是癫痫发作源于脑的特定部分(叶)。局灶性癫痫包括特发性位置相关癫痫(ILRE)、额叶癫痫、颞叶癫痫、顶叶癫痫和枕叶癫痫。
特发性位置相关癫痫(ILRE)是由未知因素引起的。
额叶癫痫是关于从额叶-前额后面的脑区域开始的反复癫痫发作的术语。
颞叶癫痫是关于从颞叶-位于太阳穴和颧骨后面的头两侧的脑的部分开始的反复癫痫发作的术语。颞叶是脑中最常引起癫痫发作的区域。两个颞叶的近中部分(中间)在癫痫中非常重要-其经常是癫痫发作的来源，并且容易损伤或留下瘢痕。内侧颞叶癫痫是人癫痫最常见的形式。通常，其病理生理基础是海马体硬化。
顶叶癫痫.顶叶是在头顶部和两侧的脑的部分。顶叶称为“联络皮质”，负责将意义与脑功能联系起来。正是在这里，脑创造视觉图像，声音被识别为语言，并且触觉与特定对象相关联。在一些方面，顶叶是感知与物理现实相吻合的地方。
枕叶癫痫.枕叶癫痫是关于从枕叶(在脑中主要负责视力的头后部的部分)开始的反复癫痫发作的术语。
在本公开文本的一些方面，AAV载体能够体外转导iPSC来源的神经元。在一些实施方案中，所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。
在本公开文本的一些方面，提供了一种治疗受试者的神经性疼痛(如周围神经病和三叉神经痛)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的核酸，其中核酸包含编码本公开文本的工程化LGIC受体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸被递送至DRG或TGG神经元中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用激活工程化LGIC的小分子配体，工程化LGIC进而调节靶神经元的活动，从而治疗受试者的神经性疼痛，如周围神经病和三叉神经痛。
在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于制造用于治疗神经系统疾病或障碍的药物。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于制造用于治疗与DRG/TGG神经元失调相关的神经系统疾病或障碍如神经性疼痛的药物。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于制造用于治疗脊髓相关疾病(如痉挛状态、脊髓损伤和撕脱伤)的药物。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗痉挛状态。在一些实施方案中，治疗痉挛状态包括转导脊柱中的神经元。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗脊髓损伤。在一些方面，将本文公开的载体、核酸或组合物用于治疗撕脱伤。在一些实施方案中，治疗脊髓损伤或撕脱伤包括转导在背角中的神经元。
本公开文本部分地考虑了用于控制、管理、预防或治疗受试者的疼痛的组合物和方法。在一些实施方案中，疼痛是神经性疼痛。“疼痛”是指受试者身体的不舒服的感受和/或不愉快的感觉。疼痛感的范围可以是从轻度且偶发的到重度且持续的。疼痛可以分类为急性疼痛或慢性疼痛。疼痛可以是伤害性疼痛(即，由组织损伤造成的疼痛)、神经性疼痛或心因性疼痛。在一些情况下，疼痛是由疾病(例如，癌症、关节炎、糖尿病)造成的或与该疾病相关。在其他情况下，疼痛是由损伤(例如，运动损伤、创伤)造成的。适于用本文的组合物和方法治疗的疼痛的非限制性例子包括：神经性疼痛，包括周围神经病、糖尿病性神经病变、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、与癌症相关的神经病变、与HIV/AIDS相关的神经病变、幻肢痛、腕管综合征、中枢性中风后疼痛、与慢性酒精中毒相关的疼痛、甲状腺功能减退、尿毒症、与多发性硬化相关的疼痛、与脊髓损伤相关的疼痛、与帕金森病相关的疼痛、癫痫、骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、内脏痛以及与维生素缺乏症相关的疼痛；以及伤害性疼痛，包括与中枢神经系统创伤、劳损/扭伤和烧伤相关的疼痛；心肌梗塞、急性胰腺炎、手术后疼痛、创伤后疼痛、肾绞痛、与癌症相关的疼痛、与纤维肌痛相关的疼痛、与腕管综合征相关的疼痛以及背痛。
本文的组合物和方法可以用于减轻受试者的疼痛水平。在一些情况下，将受试者的疼痛水平减轻至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％，包括其间的所有范围和子范围。可以通过多种方法来评估受试者的疼痛水平。在一些情况下，通过自我报告(即，人受试者表达他/她正在经历的疼痛水平的口头报告)来评估疼痛水平。在一些情况下，通过疼痛的行为指标来评估疼痛水平，这些指标例如面部表情、肢体活动、发声、躁动和防卫。例如，当受试者不能自我报告(例如，婴儿、无意识的受试者、非人受试者)时，这些类型的评估可能是有用的。可以在用本公开文本的组合物治疗之后，与用组合物治疗之前受试者正经历的疼痛水平相比，评估疼痛水平。
在各种实施方案中，用于控制、管理、预防或治疗受试者的疼痛的方法包括向受试者施用有效量的编码本公开文本的工程化LGIC的AAV载体和/或核酸。不希望受任何特定理论约束，本公开文本考虑了使用编码本文公开的工程化LGIC的载体和/或核酸调节神经元活动以缓解受试者的疼痛。
在各种实施方案中，将编码工程化受体的载体和/或编码工程化LGIC(其激活神经元细胞或使神经元细胞去极化)的核酸施用于(或引入)减少痛觉的一个或多个神经元细胞(例如，抑制性中间神经元)中。在存在配体的情况下，表达工程化受体的神经元细胞被激活并且减少对疼痛的敏感性，从而加强刺激这些神经元细胞的镇痛作用。
在各种实施方案中，将编码工程化受体(其使神经元细胞失活或超极化)的载体施用于(或引入)增加痛觉或对疼痛的敏感性的一个或多个神经元细胞(例如，伤害性感受器、周围感觉神经元、C纤维、Aδ纤维、Aβ纤维、DRG神经元、TGG神经元等)中。在存在配体的情况下，表达所述工程化受体的神经元细胞失活并且减少对疼痛的敏感性，并且加强镇痛作用。
在一些实施方案中，本公开文本的组合物和方法有效减轻疼痛。适于用本公开文本的载体、组合物和方法治疗的疼痛的说明性例子包括但不限于急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、痛觉超敏、炎症性疼痛、炎症性痛觉过敏、神经病、神经痛、糖尿病性神经病变、人免疫缺陷病毒相关的神经病变、神经损伤、类风湿性关节炎疼痛、骨关节炎疼痛、烧伤、背痛、眼痛、内脏痛、癌痛(例如，骨癌痛)、牙痛、头痛、偏头痛、腕管综合征、纤维肌痛、神经炎、坐骨神经痛、骨盆超敏性、骨盆痛、疱疹后神经痛、手术后疼痛、中风后疼痛和月经痛。
疼痛可以分类为急性的或慢性的。“急性疼痛”是指突然开始并且通常在程度上尖锐的疼痛。急性疼痛可能是轻度的并且仅持续片刻，或者可能是重度的并且持续数周或数月。在大多数情况下，急性疼痛不会持续超过三个月，并且当疼痛的根本原因已经得到治疗或已经治愈时，它会消失。然而，未缓解的急性疼痛可能导致慢性疼痛。“慢性疼痛”是指持续的或复发的疼痛，其持续超过急性疾病或损伤的常见病程或持续超过三至六个月，并且其不利地影响个体的健康状况。在一些实施方案中，术语“慢性疼痛”是指在不应持续时持续的疼痛。慢性疼痛可以是伤害性疼痛或神经性疼痛。
在一些实施方案中，预料或预期疼痛的发展与损伤、感染或医学干预相关或由其所致。在一些实施方案中，感染引起神经损伤。在一些实施方案中，医学干预是手术，如对身体的中央核心的手术。在一些实施方案中，医学干预是去除体内的一个或多个组织、肿瘤或器官的部分或全部的手术。在一些实施方案中，医学干预是截肢。在一些实施方案中，本公开文本的组合物和方法有效减轻急性疼痛。在一些实施方案中，本公开文本的组合物和方法有效减轻慢性疼痛。
当不适和异常敏感性成为患者症状中的特征时，存在临床疼痛。个体可以呈现各种疼痛症状。此类症状包括：1)自发性疼痛，其可以是钝痛、灼痛或刺痛；2)对有害刺激过度的疼痛反应(痛觉过敏)；以及3)由通常无害的刺激产生的疼痛(痛觉超敏-Meyer等人,1994,Textbook of Pain,13-44)。尽管患有各种形式的急性和慢性疼痛的患者可能具有类似的症状，但是根本机制可能不同，并且可能因此需要不同的治疗策略。因此，还可以根据不同的病理生理学将疼痛分成许多不同的亚型，包括伤害性疼痛、炎症性疼痛和神经性疼痛。
在一些实施方案中，本公开文本的组合物和方法有效减轻伤害性疼痛。在一些实施方案中，本公开文本的组合物和方法有效减轻炎性疼痛。在一些实施方案中，本公开文本的组合物和方法有效减轻神经性疼痛。
伤害性疼痛是由组织损伤或由可能引起损伤的强烈刺激诱导的。中度至重度急性伤害性疼痛是来自中枢神经系统创伤、劳损/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎、手术后疼痛(任何类型的外科手术后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌痛和背痛的疼痛的突出特征。癌痛可以是慢性疼痛，如肿瘤相关的疼痛(例如，骨痛、头痛、面部疼痛或内脏痛)或与癌症疗法相关的疼痛(例如，化学疗法后综合征、慢性手术后疼痛综合征或辐射后综合征)。癌痛还可以响应于化学疗法、免疫疗法、激素疗法或放射疗法而发生。背痛可能是由于椎间盘突出或破裂，或腰椎椎间小关节、骶髂关节、椎旁肌或后纵韧带的异常所致。背痛可以自然消退，但在一些患者中，在背痛持续超过12周的情况下，背痛变成可能使人特别虚弱的慢性病症。
神经性疼痛可以定义为由神经系统中的原发性病变或功能障碍引发或造成的疼痛。神经性疼痛的病因包括例如周围神经病、糖尿病性神经病变、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、癌症神经病变、HIV神经病变、幻肢痛、腕管综合征、中枢性中风后疼痛以及与慢性酒精中毒、甲状腺功能减退、尿毒症、多发性硬化、脊髓损伤、帕金森病、癫痫和维生素缺乏相关的疼痛。
神经性疼痛可以与疼痛障碍有关，术语疼痛障碍是指与疼痛相关或由疼痛造成的疾病、障碍或病症。疼痛障碍的说明性例子包括关节炎、痛觉超敏、典型三叉神经痛、三叉神经痛、躯体形式障碍、感觉减退、痛觉过敏、神经痛、神经炎、神经源性疼痛、痛觉缺失、痛性感觉缺失、灼性神经痛、坐骨神经疼痛障碍、退化性关节病、纤维肌痛、内脏性疾病、慢性疼痛障碍、偏头痛/头痛、慢性疲劳综合征、复杂性局部疼痛综合征、神经营养不良、跖筋膜炎或与癌症相关的疼痛。
在一些实施方案中，所述神经性疼痛是周围神经病。周围神经病是指在脑和脊髓与身体其他部位之间来回携带信息的神经受损或患病时导致的病症。各种周围神经病的范围为从腕管综合征(长期重复使用手和手腕如使用计算机后常见的创伤性损伤)到与糖尿病有关的神经损伤。通常，周围神经病可分为单神经病和多发性神经病。单神经病包括腕管综合征、尺神经麻痹、桡神经麻痹和腓神经麻痹。当全身多个周围神经同时出现故障时，就会出现多发性神经病。多发性神经病可能有多种原因，包括暴露于某些如与酒精滥用相关的毒素、营养不良(特别是维生素B缺乏症)以及如癌症或肾衰竭等疾病引起的并发症。慢性多发性神经病的最常见形式之一是糖尿病性神经病(发生在糖尿病患者中的病症)。血糖水平控制不佳的人更严重。虽然不太常见，但糖尿病也会引起单神经病。最严重的多发性神经病之一是吉兰-巴雷综合征，这是一种当身体免疫系统在神经离开脊髓时攻击体内神经时突发的罕见疾病。症状往往会迅速出现并迅速恶化，有时会导致瘫痪。早期症状包括虚弱和刺痛，最终可能向上扩散到手臂。在更严重的情况下，可能会出现血压问题、心律问题和呼吸困难。慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)是吉兰-巴雷的一种慢性形式，其症状持续数月甚至数年。早期诊断和治疗对于CIDP患者至关重要，30％的CIDP患者有最终被限制在轮椅上的风险。
在一些实施方案中，所述神经性疼痛是三叉神经痛。三叉神经痛(TN)，也称为痛性痉挛，是一种影响在头部分布最广泛的神经之一即三叉神经或第5脑神经的慢性疼痛病症。三叉神经是一组头部脑神经。三叉神经是负责向面部提供感觉的神经。一根三叉神经延伸到头部的右侧，而另一根则延伸到左侧。这些神经中的每一个都有三个不同的分支。在三叉神经离开脑并进入头骨后，三叉神经分为三个更小的分支，控制整个面部的感觉：眼神经(V1)：第一分支控制人的眼睛、上睑和前额的感觉。上颌神经(V2)：第二分支控制下睑、颊部、鼻孔、上唇和上龈的感觉。下颌神经(V3)：第三分支控制颚、下唇、下龈和用于咀嚼的一些肌肉的感觉。
TN是神经性疼痛的一种形式。这种障碍的典型或“经典”形式(称为“1型”或TN1)会引起极端、散发、突然的灼痛或休克样面部疼痛，每次发作持续数秒至长达两分钟。这些发作可以连续快速发生，连发持续长达两小时。这种障碍的“非典型”形式(称为“2型”或TN2)的特征是持续的疼痛、灼痛、刺痛，其强度稍微比1型低。两种形式的疼痛可出现在同一个人身上，有时同时出现。疼痛的强度可能是身体和精神上丧失能力。TN与多种病症相关。TN可能是在三叉神经出脑干时由血管压迫在三叉神经上引起的。这种压迫会引起神经周围保护层(髓鞘)的磨损或损坏。TN症状也可出现在多发性硬化患者中，多发性硬化是会引起三叉神经的髓鞘退化的疾病。罕见地，TN的症状可由肿瘤引起的神经压迫或称为动静脉畸形的动脉和静脉缠结引起。三叉神经损伤(可能是鼻窦手术、口腔手术、中风或面部创伤的结果)也可产生神经性面部疼痛。
炎症性过程是复杂的一系列生化和细胞事件，它们响应于组织损伤或外来物质的存在而被激活，这导致了肿胀和疼痛。关节炎疼痛是常见的炎症性疼痛。
适于用本公开文本的载体、组合物和方法治疗的其他疼痛类型包括但不限于由肌肉骨骼障碍引起的疼痛，包括肌痛、纤维肌痛、脊柱炎、血清阴性的(非类风湿性)关节病、非关节风湿病、抗肌萎缩蛋白病、糖原分解、多肌炎和脓性肌炎；心脏和血管疼痛，包括由心绞痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺现象、硬肿病(scleredoma)和骨骼肌缺血引起的疼痛；头痛，如偏头痛(包括先兆偏头痛和无先兆偏头痛)、丛集性头痛、紧张型头痛、混合型头痛和与血管障碍相关的头痛；以及颌面部痛，包括牙痛、耳痛、灼口综合征和颞下颌肌筋膜疼痛。
可以使用多种疼痛量表来确定本公开文本的组合物和方法减少人受试者经历的疼痛量的有效量。可以使用患者自我报告来评估疼痛是否减少；参见例如，Katz和Melzack(1999)Surg.Clin.North Am.79:231。可替代地，可以使用观察性疼痛量表。可以使用LANSS疼痛量表来评估疼痛是否减少；参见例如，Bennett(2001)Pain 92:147。可以使用视觉模拟疼痛量表；参见例如，Schmader(2002)Clin.J.Pain 18:350。可以使用Likert疼痛量表；例如，其中0为无疼痛，5为中度疼痛，并且10为可能最严重的疼痛。用于儿童的自我报告疼痛量表包括例如面部表情疼痛量表；Wong-Baker面部表情疼痛评级量表；以及彩色模拟量表。用于成人的自我报告疼痛量表包括例如视觉模拟量表；言语数值评级量表；言语描述符量表；以及简易疼痛调查表。疼痛测量量表包括例如Alder Hey分诊疼痛评分(Stewart等人(2004)Arch.Dis.Child.89:625)；行为疼痛量表(Payen等人(2001)Critical CareMedicine 29:2258)；简明疼痛量表(Cleeland和Ryan(1994)Ann.Acad.Med.Singapore 23:129)；非言语性疼痛指标检查表(Feldt(2000)Pain Manag.Nurs.1:13)；重症监护疼痛观察工具(Gelinas等人(2006)Am.J.Crit.Care 15:420)；舒适量表(Ambuel等人(1992)J.Pediatric Psychol.17:95)；达拉斯疼痛问卷(Ozguler等人(2002)Spine27:1783)；测痛计疼痛指数(Hardy等人(1952)Pain Sensations and Reactions Baltimore:TheWilliams&Wilkins Co.)；修订版面部表情疼痛量表(Hicks等人(2001)Pain 93:173)；表情、腿部、活动、哭闹、可抚慰性量表；麦吉尔疼痛问卷(Melzack(1975)Pain 1:277)；描述语区分量表(Gracely和Kwilosz(1988)Pain 35:279)；数值1 1分盒(Jensen等人(1989)Clin.J.Pain 5:153)；数字评定量表(Hartrick等人(2003)Pain Pract.3:310)；Wong-Baker面部表情疼痛评定量表；以及视觉模拟量表(Huskisson(1982)J.Rheumatol.9:768)。
在一些实施方案中，提供了缓解受试者疼痛的方法，所述方法包括施用包含本公开文本的衣壳多肽的AAV载体(AAV载体将由AAV载体编码的工程化LGIC引入神经元细胞)，并通过提供有效量的激活工程化受体的配体来控制细胞的活性，从而减轻受试者的疼痛。所述方法针对疼痛提供了显著的镇痛，而无脱靶效应，如一般的中枢神经系统抑制。在某些实施方案中，与未治疗的受试者相比，所述方法提供至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(包括其间的所有范围和子范围)的受试者神经性疼痛减少。在一些实施方案中，所述方法包括在施用配体之前和之后测量受试者的疼痛的步骤，其中受试者的疼痛减少至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(包括其间的所有范围和子范围)。在这样的情况下，测量可以在施用所述配体之后4小时或更长时间进行，例如在施用配体之后8小时、12小时、16小时、24小时、36小时、48小时、3天、或4天或更长时间进行。
在一些情况下，组合物和方法用于治疗创伤后应激障碍(PTSD)、胃食管返流疾病(GERD)、成瘾(例如，酒精、药物)、焦虑症、抑郁症、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、发作性睡病、特发性震颤、运动障碍、心房颤动、癌症(例如，脑瘤)、帕金森病或阿尔茨海默病。可以通过本文的组合物和方法治疗的神经系统疾病或障碍的其他非限制性例子包括：意志缺失、失写症、酒精中毒、失读症、动脉瘤、一过性黑矇、健忘症、肌萎缩侧索硬化(ALS)、快乐木偶综合征、失语症、失用症、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形、阿斯佩格综合征、共济失调、共济失调-毛细血管扩张症、注意缺陷多动障碍、听觉处理障碍、孤独症谱系、双相障碍、贝尔麻痹、臂丛损伤、脑损害、脑损伤、脑肿瘤、卡纳万病、卡普格拉妄想症、腕管综合征、灼性神经痛、中枢神经痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解、中央核肌病、头部障碍、脑动脉瘤、脑动脉硬化症、脑萎缩、伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)、脑性巨人症、脑性瘫痪、脑血管炎、颈椎管狭窄、腓骨肌萎缩病、基亚里畸形、舞蹈症、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、慢性疼痛、科芬-劳里综合征、昏迷、复杂性区域疼痛综合征、压迫性神经病、先天性双侧面瘫、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克罗伊茨费尔特-雅各布病、劳损性功能障碍、库欣综合征、循环性情绪障碍、巨细胞包涵体病(CIBD)、巨细胞病毒感染、丹迪-沃克综合征、道森病、德莫尔斯综合征、德热里纳-克隆普克麻痹、德热里纳-索塔斯病、睡眠时相延迟综合征、痴呆、皮肌炎、发展性协调障碍、糖尿病性神经病、弥漫性硬化、复视、唐氏综合征、德拉韦综合征、迪谢内肌营养不良、构音障碍、自主神经功能障碍、计算困难、书写困难、运动障碍、失读症、肌张力障碍、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、遗粪症、遗尿、癫痫、女性癫痫智力障碍、厄尔布氏麻痹、红斑性肢痛症、头部爆炸感综合征、法布里病、法尔综合征、昏厥、家族性痉挛性瘫痪、热性惊厥、费希尔综合征、弗里德赖希共济失调、纤维肌痛、福维尔综合征、胎儿酒精综合征、脆性X综合征、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、戈谢病、全面性癫痫伴热性惊厥附加症、格斯特曼综合征、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、灰质异位症、吉兰-巴雷综合征、广泛性焦虑症、HTLV-1相关脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病、头部损伤、头痛、偏侧面肌痉挛、遗传性痉挛性截瘫、遗传性共济失调性多发性神经炎样病、耳带状疱疹、带状疱疹、平山综合征、希尔施普龙病、霍-艾(Holmes-Adie)综合征、前脑无裂畸形、亨廷顿病、积水性无脑畸形、脑积水、皮质醇增多症、缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿雷夫叙姆病、婴儿痉挛、炎性肌病、颅内囊肿、高颅压、等臂双着丝粒15、朱伯特综合征、Karak综合征、卡恩斯-塞尔综合征、Kinsbourne综合征、克莱恩-莱文综合征、克利佩尔-费尔综合征、克拉伯病、拉福拉病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、兰道-克勒夫纳综合征、延髓背外侧(瓦伦贝格)综合征、学习无能、利氏病、伦诺克斯-加斯托综合征、莱施-奈恩综合征、脑白质营养不良、白质消融性白质脑病、路易体痴呆、无脑回畸形、闭锁综合征、腰椎间盘疾病、腰椎管狭窄症、莱姆病-神经系统后遗症、马查多-约瑟夫病(3型脊髓小脑性共济失调)、巨脑、视物显大症、登陆病综合征、伴皮层下囊肿的巨脑性白质脑病、巨脑畸形、梅-罗综合征、梅尼埃病、脑膜炎、门克斯病、异染性脑白质营养不良、小头畸形、视物显小症、偏头痛、米-费综合征、小中风(短暂性脑缺血发作)、恐音症、线粒体肌病、莫比斯综合征、单肢肌萎缩、运动技能障碍、烟雾病、黏多糖贮积症、多发性脑梗死性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩、肌营养不良、肌痛性脑脊髓炎、重症肌无力、髓鞘破坏性弥漫性硬化、婴儿肌阵挛脑病、肌阵挛、肌病、肌管性肌病、先天性肌强直、发作性睡病、神经白塞病、神经纤维瘤病、神经阻滞剂恶性综合征、AIDS的神经系统表现、狼疮神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元迁移障碍、神经病、神经症、尼曼-皮克病、非24小时睡眠-觉醒障碍、非言语学习障碍、O’Sullivan-McLeod综合征、枕神经痛、隐性脊柱闭合不全序列、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视性眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、直立性低血压、耳硬化、过用综合征、持续后像、感觉异常、帕金森病、先天性副肌强直症、副肿瘤病、阵发性发作、帕里-龙贝格综合征、PANDAS、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、周期性麻痹、周围神经病、广泛性发育障碍、强光喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克病、神经受压、垂体瘤、PMG、多发性神经病、脊髓灰质炎、多小脑回畸形、多肌炎、脑穿通畸形、脊髓灰质炎后综合征、疱疹后神经痛(PHN)、体位性低血压、普拉德-威利综合征、原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性半侧颜面萎缩、进行性多灶性白质脑病、进行性核上性麻痹、面容失认症、假性脑瘤、象限盲、四肢瘫痪、狂犬病、神经根病变、I型拉姆齐-亨特综合征、II型拉姆齐-亨特综合征、III型拉姆齐-亨特综合征、拉斯马森脑炎、反射神经血管营养不良、雷夫叙姆病、快速眼动睡眠行为障碍、重复性应激损伤、下肢不宁综合征、逆转录病毒相关脊髓病、雷特综合征、瑞氏综合征、节律性运动障碍、龙贝格综合征、圣维特斯舞蹈症、桑德霍夫病、希尔德病、脑裂畸形、感觉处理障碍、隔-视发育不良、摇晃婴儿综合征、带状疱疹、夏-德综合征、干燥综合征、睡眠呼吸暂停、睡眠病、打喷嚏饱和、小儿巨脑畸形综合征、痉挛状态、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓延髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、裂脑、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基综合征、僵人综合征、中风、斯德奇-韦伯综合征、口吃、亚急性硬化性全脑炎、皮质下动脉硬化性脑病、表面铁沉积症、小舞蹈症、晕厥、通感、脊髓空洞症、跗管综合征、迟发性运动障碍、迟发性精神障碍、Tarlov囊肿、泰-萨克斯病、颞动脉炎、颞叶癫痫、破伤风、脊髓栓系综合征、汤姆森病、胸廓出口综合征、痛性痉挛、托德瘫痪、图雷特综合征、中毒性脑病、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、颅脑损伤、震颤、拔毛狂、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、锥体虫病、结节性硬化症、肌阵挛癫痫(Unverricht-Lundborg disease)、希佩尔-林道病(VHL)、Viliuisk脑脊髓炎(VE)、瓦伦贝格综合征、韦斯特综合征、挥鞭伤、威廉姆斯综合征、威尔逊氏症或脑肝肾综合征。
通过本文公开的方法和组合物治疗的受试者可以是人，或非人动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，人是成年人(≥18岁)。非人动物的非限制性例子包括非人灵长类动物、家畜动物、家养宠物和实验室动物。例如，非人动物可以是猿(例如，黑猩猩、狒狒、大猩猩或猩猩)、旧大陆猴(例如，恒河猴)、新大陆猴、狗、猫、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、驴、马、骡、美洲驼、绵羊、山羊、水牛、驯鹿、牦牛、小鼠、大鼠、兔或任何其他非人动物。如本文所述的组合物和方法适于治疗兽医动物。兽医动物可以包括而不限于狗、猫、马、牛、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、蛇、乌龟和蜥蜴。在一些方面，使组织或细胞群与组合物接触包括向细胞群或受试者施用组合物。在一些实施方案中，施用在体外进行，例如通过将组合物添加到细胞培养系统中。在一些方面，施用在体内进行，例如通过经由特定途径施用。在要施用超过一种组合物的情况下，该组合物可以在相同时间(例如，在同一天)经由相同途径施用，或在不同的时间经由相同途径施用。可替代地，该组合物可以在相同时间(例如，在同一天)经由不同的途径施用，或在不同的时间经由不同的途径施用。
施用
本公开文本提供了用于施用本公开文本的AAV或本公开文本的药物组合物的给药方案。在一些实施方案中，药物组合物包含编码本公开文本的配体门控离子通道的核酸序列。在一些实施方案中，药物组合物包含含有编码本公开文本的配体门控离子通道的核酸序列的本公开文本的AAV。
在一些实施方案中，本公开文本的载体和/或核酸被施用或引入至一个或多个神经元细胞中。神经元细胞可以是相同类型的神经元细胞，或不同类型的神经元细胞的混合群体。
在一些实施方案中，神经元细胞是海马体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞是兴奋性神经元。在一些实施方案中，本公开文本的载体被施用或引入至一个或多个海马体神经元细胞中。
在一些实施方案中，神经元细胞是伤害性感受器或周围感觉神经元。感觉神经元的说明性例子包括但不限于背根神经节(DRG)神经元和三叉神经节(TGG)神经元。在一些实施方案中，神经元细胞是参与神经元疼痛回路的抑制性中间神经元。在一些实施方案中，本公开文本的载体和/或核酸被施用或引入至一个或多个DRG神经元细胞中。在一些实施方案中，本公开文本的载体和/或核酸被施用或引入至一个或多个TGG神经元细胞中。
施用方法的非限制性例子包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、皮内施用、腹膜内施用、口服施用、输注、颅内施用、鞘内施用、鼻内施用、神经节内施用、椎管内施用、小脑延髓池施用和神经内施用。在一些实施方案中，施用可以涉及注射载体和/或核酸的液体配制品。在一些实施方案中，施用可以涉及载体和/或核酸的固体配制品的口服递送。在一些实施方案中，可以将口服配制品与食物一起施用。在一些实施方案中，将本公开文本的载体和/或核酸肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、神经内、神经节内、椎管内或脑室内施用于受试者，以便将载体和/或核酸引入一个或多个神经元细胞中。在一些实施方案中，载体是AAV。
在一些实施方案中，将本公开文本的AAV和/或核酸颅内、鞘内(IT)、脑内、脑室内或经由直接注射到海马体中的癫痫灶中施用于神经元。
在一些实施方案中，通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用将本公开文本的AAV和/或核酸施用于感觉神经元或伤害性感受器，例如DRG神经元、TGG神经元等。
鞘内(IT)施用包括通过脊髓或通过小脑延髓池递送。IT途径将AAV和/或核酸递送至脑脊液(CSF)。此施用途径可以适合用于治疗例如慢性疼痛或其他周围神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS)适应证。在动物中，通过将IT导管穿过小脑延髓池插入并将其尾端推进到腰椎水平，已经实现了IT施用。在人中，通过腰椎穿刺术(LP)(一种具有优异安全性概况的常规床边程序)可以容易地进行IT递送。
在一些实施方案中，将本公开文本的AAV和/或核酸通过神经节内施用而施用于受试者。神经节内施用可以涉及直接注射到一个或多个神经节中。IG途径可以将AAV和/或核酸直接递送至DRG或TGG实质中。在一些实施方案中，通过开放神经外科手术进行对DRG的IG施用。在一些实施方案中，开放神经外科手术是侵入性的，并且在人中是不希望的。在一些实施方案中，可以使用微创CT成像引导的技术来安全地靶向DRG，例如用于人受试者。可以使用用于对流增强递送(CED)的定制针组件将AAV和/或核酸递送至DRG实质中。在非限制性例子中，可以将本公开文本的载体和/或核酸递送至一个或多个背根神经节和/或三叉神经节以用于治疗慢性疼痛。在另一个非限制性例子中，可以将本公开文本的载体和/或核酸递送至结状神经节(迷走神经)以治疗癫痫。
在一些实施方案中，将本公开文本的载体和/或核酸通过颅内施用(即，直接进入脑)施用于受试者。在颅内施用的非限制性例子中，可以将本公开文本的载体和/或核酸递送至脑皮质中以治疗例如癫痫发作病灶，递送至室旁下丘脑中以治疗例如饱腹感障碍，或递送至杏仁中央核中以治疗例如饱腹感障碍。在另一种特定情况下，可以通过神经内注射(即，直接注射到神经中)将载体和/或核酸施用于受试者。可以基于待治疗的适应证来选择神经，例如，注射到坐骨神经中以治疗慢性疼痛，或注射到迷走神经中以治疗癫痫或饱腹感障碍。在一些实施方案中，可以通过注射将载体和/或核酸施用于受试者，例如注射到感觉神经末梢中以治疗慢性疼痛。在一些实施方案中，将本公开文本的载体和/或核酸通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用于受试者。
剂量可以变化，并取决于治疗是预防性的还是治疗性的，所涉及的疾病治疗的类型、开始、进展、严重程度、频率、持续时间或概率，所需临床终点，先前或同时治疗，受试者的一般健康状况、年龄、性别、种族或免疫能力，以及熟练技术人员将理解的其他因素。如治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其他风险因素以及受试者的状态所指示的，剂量、数量、频率或持续时间可以成比例地增加或减少。熟练技术人员将理解可能影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
载体剂量可以表示为递送至受试者的载体基因组单位的数量。单个载体基因组的大小通常取决于所用病毒载体的类型。本公开文本的载体基因组可为约1.0千碱基、1.5千碱基、2.0千碱基、2.5千碱基、3.0千碱基、3.5千碱基、4.0千碱基、4.5千碱基至5.0千碱基、或多于5.0千碱基，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，施用的载体剂量具有约1x 106、约2x 106、约3x 106、约4x106、约5x 106、约6x 106、约7x 106、约8x 106、约9x 106、约1x 107、约2x 107、约3x 107、约4x107、约5x 107、约6x 107、约7x 107、约8x 107、约9x 107、约1x 108、约2x 108、约3x 108、约4x108、约5x 108、约6x 108、约7x 108、约8x 108、约9x 108、约1x 109、约2x 109、约3x 109、约4x109、约5x 109、约6x 109、约7x 109、约8x 109、约9x 109、约1x 1010、约2x 1010、约3x 1010、约4x 1010、约5x 1010、约6x 1010、约7x 1010、约8x 1010、约9x 1010、约1x 1011、约2x 1011、约3x1011、约4x 1011、约5x 1011、约6x1011、约7x 1011、约8x 1011、约9x 1011、约1x 1012、约2x1012、约3x 1012、约4x 1012、约5x 1012、约6x 1012、约7x 1012、约8x 1012、约9x 1012、约1x1013、约2x 1013、约3x1013、约4x 1013、约5x 1013、约6x 1013、约7x 1013、约8x 1013、约9x1013、约1x 1014、约2x 1014、约3x 1014、约4x 1014、约5x 1014、约6x 1014、约7x 1014、约8x1014、约9x1014、约1x 1015、约2x 1015、约3x 1015、约4x 1015、约5x 1015、约6x 1015、约7x1015、约8x 1015、约9x 1015、约1x 1016、约2x 1016、约3x 1016、约4x 1016、约5x 1016、约6x1016、约7x 1016、约8x 1016、约9x 1016、约1x 1017或更多个载体基因组单位，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，施用的载体剂量具有至少1x 106、至少2x 106、至少3x 106、至少4x 106、至少5x 106、至少6x 106、至少7x 106、至少8x 106、至少9x 106、至少1x 107、至少2x 107、至少3x 107、至少4x 107、至少5x 107、至少6x 107、至少7x 107、至少8x 107、至少9x107、至少1x 108、至少2x 108、至少3x 108、至少4x 108、至少5x 108、至少6x 108、至少7x108、至少8x 108、至少9x 108、至少1x 109、至少2x 109、至少3x 109、至少4x 109、至少5x109、至少6x 109、至少7x 109、至少8x 109、至少9x 109、至少1x 1010、至少2x1010、至少3x1010、至少4x 1010、至少5x 1010、至少6x 1010、至少7x 1010、至少8x 1010、至少9x 1010、至少1x 1011、至少2x 1011、至少3x 1011、至少4x 1011、至少5x 1011、至少6x 1011、至少7x 1011、至少8x 1011、至少9x 1011、至少1x 1012、至少2x 1012、至少3x 1012、至少4x 1012、至少5x 1012、至少6x 1012、至少7x 1012、至少8x 1012、至少9x 1012、至少1x 1013、至少2x 1013、至少3x1013、至少4x 1013、至少5x 1013、至少6x 1013、至少7x 1013、至少8x 1013、至少9x 1013、至少1x 1014、至少2x 1014、至少3x 1014、至少4x 1014、至少5x 1014、至少6x 1014、至少7x 1014、至少8x 1014、至少9x 1014、至少1x 1015、至少2x 1015、至少3x 1015、至少4x 1015、至少5x 1015、至少6x 1015、至少7x 1015、至少8x 1015、至少9x 1015、至少1x 1016、至少2x 1016、至少3x1016、至少4x 1016、至少5x 1016、至少6x 1016、至少7x 1016、至少8x 1016、至少9x 1016或至少1x 1017个载体基因组单位，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，施用的载体剂量具有不多于1x 106、不多于2x 106、不多于3x106、不多于4x 106、不多于5x 106、不多于6x 106、不多于7x 106、不多于8x 106、不多于9x106、不多于1x 107、不多于2x 107、不多于3x 107、不多于4x 107、不多于5x107、不多于6x107、不多于7x 107、不多于8x 107、不多于9x 107、不多于1x 108、不多于2x 108、不多于3x108、不多于4x 108、不多于5x 108、不多于6x 108、不多于7x 108、不多于8x 108、不多于9x108、不多于1x 109、不多于2x 109、不多于3x 109、不多于4x109、不多于5x 109、不多于6x109、不多于7x 109、不多于8x 109、不多于9x 109、不多于1x 1010、不多于2x 1010、不多于3x1010、不多于4x 1010、不多于5x 1010、不多于6x 1010、不多于7x 1010、不多于8x 1010、不多于9x 1010、不多于1x 1011、不多于2x 1011、不多于3x 1011、不多于4x 1011、不多于5x 1011、不多于6x 1011、不多于7x 1011、不多于8x 1011、不多于9x 1011、不多于1x 1012、不多于2x1012、不多于3x 1012、不多于4x 1012、不多于5x 1012、不多于6x 1012、不多于7x 1012、不多于8x 1012、不多于9x 1012、不多于1x 1013、不多于2x 1013、不多于3x 1013、不多于4x 1013、不多于5x 1013、不多于6x 1013、不多于7x 1013、不多于8x 1013、不多于9x 1013、不多于1x1014、不多于2x 1014、不多于3x 1014、不多于4x 1014、不多于5x 1014、不多于6x 1014、不多于7x 1014、不多于8x 1014、不多于9x 1014、不多于1x 1015、不多于2x 1015、不多于3x 1015、不多于4x 1015、不多于5x 1015、不多于6x 1015、不多于7x 1015、不多于8x 1015、不多于9x1015、不多于1x 1016、不多于2x 1016、不多于3x 1016、不多于4x 1016、不多于5x 1016、不多于6x 1016、不多于7x 1016、不多于8x 1016、不多于9x 1016、or不多于1x 1017个载体基因组单位，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，载体剂量表示为每公斤受试者体重的载体基因组单位(vg/kg)。在一些实施方案中，以上描述的载体剂量数量基于体重50kg的受试者，并且剂量可以相应地转换为vg/kg并基于受试者的体重应用于另一受试者。例如，用于体重50kg的受试者的约5x 1014个载体基因组单位的剂量可以转换为每千克约1x 1013个载体基因组单位(vg/kg)。
在一些实施方案中，可以根据施用于受试者的载体的浓度或滴度来表示载体剂量。在一些实施方案中，载体剂量可以表示为每体积的单位数(例如，基因组单位/体积)乘以体积。
在一些实施方案中，以一定流体体积施用本公开文本的载体。在一些实施方案中，按以下的体积施用载体：约0.01mL、约0.02mL、约0.03mL、约0.04mL、约0.05mL、约0.06mL、约0.07mL、约0.08mL、约0.09mL、约0.1mL、约0.15mL、约0.2mL、约0.25mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1.0mL、约2.0mL、约3.0mL、约4.0mL、约5.0mL、约6.0mL、约7.0mL、约8.0mL、约9.0mL、约10.0mL、约11.0mL、约12.0mL、约13.0mL、约14.0mL、约15.0mL、约16.0mL、约17.0mL、约18.0mL、约19.0mL、约20.0mL、约25.0mL、或大于25.0mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，按以下的体积施用载体：至少0.01mL、至少0.02mL、至少0.03mL、至少0.04mL、至少0.05mL、至少0.06mL、至少0.07mL、至少0.08mL、至少0.09mL、至少0.1mL、至少0.15mL、至少0.2mL、至少0.25mL、至少0.3mL、至少0.4mL、至少0.5mL、至少0.6mL、至少0.7mL、至少0.8mL、至少0.9mL、至少1.0mL、至少2.0mL、至少3.0mL、至少4.0mL、至少5.0mL、至少6.0mL、至少7.0mL、至少8.0mL、至少9.0mL、至少10.0mL、至少11.0mL、至少12.0mL、至少13.0mL、至少14.0mL、至少15.0mL、至少16.0mL、至少17.0mL、至少18.0mL、至少19.0mL、至少20.0mL、或至少25.0mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，按以下的体积施用载体：不多于0.01mL、不多于0.02mL、不多于0.03mL、不多于0.04mL、不多于0.05mL、不多于0.06mL、不多于0.07mL、不多于0.08mL、不多于0.09mL、不多于0.1mL、不多于0.15mL、不多于0.2mL、不多于0.25mL、不多于0.3mL、不多于0.4mL、不多于0.5mL、不多于0.6mL、不多于0.7mL、不多于0.8mL、不多于0.9mL、不多于1.0mL、不多于2.0mL、不多于3.0mL、不多于4.0mL、不多于5.0mL、不多于6.0mL、不多于7.0mL、不多于8.0mL、不多于9.0mL、不多于10.0mL、不多于11.0mL、不多于12.0mL、不多于13.0mL、不多于14.0mL、不多于15.0mL、不多于16.0mL、不多于17.0mL、不多于18.0mL、不多于19.0mL、不多于20.0mL、或不多于25.0mL，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，将本文考虑的载体按以下的滴度施用于受试者：至少1x109个基因组单位/mL、至少1x 1010个基因组单位/mL、至少5x 1010个基因组单位/mL、至少1x 1011个基因组单位/mL、至少5x 1011个基因组单位/mL、至少1x 1012个基因组单位/mL、至少5x1012个基因组单位/mL、至少6x 1012个基因组单位/mL、至少7x 1012个基因组单位/mL、至少8x 1012个基因组单位/mL、至少9x 1012个基因组单位/mL、至少10x 1012个基因组单位/mL、至少15x 1012个基因组单位/mL、至少20x 1012个基因组单位/mL、至少25x 1012个基因组单位/mL、至少50x 1012个基因组单位/mL、或至少100x 1012个基因组单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，将本公开文本的载体按以下的滴度施用于受试者：约1x 109个基因组单位/mL、约1x 1010个基因组单位/mL、约5x 1010个基因组单位/mL、约1x1011个基因组单位/mL、约5x 1011个基因组单位/mL、约1x 1012个基因组单位/mL、约5x 1012个基因组单位/mL、约6x 1012个基因组单位/mL、约7x 1012个基因组单位/mL、约8x 1012个基因组单位/mL、约9x 1012个基因组单位/mL、约10x 1012个基因组单位/mL、约15x 1012个基因组单位/mL、约20x 1012个基因组单位/mL、约25x 1012个基因组单位/mL、约50x 1012个基因组单位/mL、或约100x 1012个基因组单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，将本公开文本的载体按以下的滴度施用于受试者：不多于1x 109个基因组单位/mL、不多于1x 1010个基因组单位/mL、不多于5x 1010个基因组单位/mL、不多于1x 1011个基因组单位/mL、不多于5x 1011个基因组单位/mL、不多于1x 1012个基因组单位/mL、不多于5x 1012个基因组单位/mL、不多于6x 1012个基因组单位/mL、不多于7x 1012个基因组单位/mL、不多于8x 1012个基因组单位/mL、不多于9x 1012个基因组单位/mL、不多于10x 1012个基因组单位/mL、不多于15x 1012个基因组单位/mL、不多于20x 1012个基因组单位/mL、不多于25x1012个基因组单位/mL、不多于50x 1012个基因组单位/mL、或不多于100x 1012个基因组单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，将本文考虑的载体按以下的滴度施用于受试者：约5x 109个感染单位/mL、约6x 109个感染单位/mL、约7x 109个感染单位/mL、约8x 109个感染单位/mL、约9x 109个感染单位/mL、约1x 1010个感染单位/mL、约1.5x 1010个感染单位/mL、约2x 1010个感染单位/mL、约2.5x 1010个感染单位/mL、约5x 1010个感染单位/mL、约1x1011个感染单位/mL、约2.5x 1011个感染单位/mL、约5x 1011个感染单位/mL、约1x 1012个感染单位/mL、约2.5x 1012个感染单位/mL、约5x 1012个感染单位/mL、约1x 1013个感染单位/mL、约5x 1013个感染单位/mL、或约1x 1014个感染单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，将本文考虑的载体按以下的滴度施用于受试者：至少5x 109个感染单位/mL、至少6x 109个感染单位/mL、至少7x 109个感染单位/mL、至少8x 109个感染单位/mL、至少9x 109个感染单位/mL、至少1x 1010个感染单位/mL、至少1.5x 1010个感染单位/mL、至少2x 1010个感染单位/mL、至少2.5x 1010个感染单位/mL、至少5x 1010个感染单位/mL、至少1x 1011个感染单位/mL、至少2.5x 1011个感染单位/mL、至少5x 1011个感染单位/mL、至少1x 1012个感染单位/mL、至少2.5x 1012个感染单位/mL、至少5x 1012个感染单位/mL、至少1x 1013个感染单位/mL、至少5x 1013个感染单位/mL、或至少1x 1014个感染单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，将本文考虑的载体按以下的滴度施用于受试者：不多于5x 109个感染单位/mL、不多于6x 109个感染单位/mL、不多于7x 109个感染单位/mL、不多于8x 109个感染单位/mL、不多于9x 109个感染单位/mL、不多于1x 1010个感染单位/mL、不多于1.5x1010个感染单位/mL、不多于2x 1010个感染单位/mL、不多于2.5x 1010个感染单位/mL、不多于5x 1010个感染单位/mL、不多于1x 1011个感染单位/mL、不多于2.5x 1011个感染单位/mL、不多于5x 1011个感染单位/mL、不多于1x 1012个感染单位/mL、不多于2.5x 1012个感染单位/mL、不多于5x 1012个感染单位/mL、不多于1x 1013个感染单位/mL、不多于5x 1013个感染单位/mL、或不多于1x 1014个感染单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，将本公开文本的载体按以下的滴度施用于受试者：约5x1010个转导单位/mL、约1x 1011个转导单位/mL、约2.5x 1011个转导单位/mL、约5x 1011个转导单位/mL、约1x 1012个转导单位/mL、约2.5x 1012个转导单位/mL、约5x 1012个转导单位/mL、约1x 1013个转导单位/mL、约5x 1013个转导单位/mL、或约1x 1014个转导单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，将本公开文本的载体按以下的滴度施用于受试者：至少5x 1010个转导单位/mL、至少1x 1011个转导单位/mL、至少2.5x 1011个转导单位/mL、至少5x 1011个转导单位/mL、至少1x 1012个转导单位/mL、至少2.5x 1012个转导单位/mL、至少5x 1012个转导单位/mL、至少1x 1013个转导单位/mL、至少5x1013个转导单位/mL、或至少1x1014个转导单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，将本公开文本的载体按以下的滴度施用于受试者：不多于5x 1010个转导单位/mL、不多于1x 1011个转导单位/mL、不多于2.5x 1011个转导单位/mL、不多于5x1011个转导单位/mL、不多于1x 1012个转导单位/mL、不多于2.5x 1012个转导单位/mL、不多于5x 1012个转导单位/mL、不多于1x 1013个转导单位/mL、不多于5x 1013个转导单位/mL、或不多于1x 1014个转导单位/mL，包括其间的所有范围和子范围。
在一些实施方案中，通过施用途径确定载体剂量。在一些实施方案中，神经节内注射可以包括在约0.1mL至约1.0mL的体积中的约1x 109至约1x 1013个载体基因组。在一些实施方案中，鞘内注射可以包括在约1.0mL至约12.0mL的体积中的约1x 1010至约1x 1015个载体基因组。在一些实施方案中，颅内注射可以包括在约0.1mL至约1.0mL的体积中的约1x109至约1x 1013个载体基因组。在一些实施方案中，神经内注射可以包括在约0.1mL至约1.0mL的体积中的约1x 109至约1x 1013个载体基因组。在一些实施方案中，脊柱内注射可以包括在约0.1mL至约1.0mL的体积中的约1x 109至约1x 1013个载体基因组。在一些实施方案中，小脑延髓池输注可以包括在约0.5mL至约5.0mL的体积中的约5x 109至约5x 1013个载体基因组。在一些实施方案中，皮下注射可以包括在约0.1mL至约1.0mL的体积中的约1x 109至约1x 1013个载体基因组。
在一些实施方案中，载体剂量是单次施用的总剂量。在一些实施方案中，载体剂量是在一个时间段内的总剂量。在一些实施方案中，该时间段为约3小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约一周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约12个月或长于12个月。在一些实施方案中，该时间段在3小时内、6小时内、12小时内、1天内、2天内、3天内、4天内、5天内、6天内、一周内、2周内、3周内、4周内、1个月内、2个月内、3个月内、4个月内、5个月内、6个月内或12个月内。
在一些实施方案中，通过输注将本公开文本的载体和/或核酸递送至受试者。通过输注递送至受试者的剂量可以测量为输注速率。输注速率的非限制性例子包括：对于神经节内、椎管内、颅内或神经内施用，1-10μL/min；和对于鞘内或小脑延髓池施用，10-1000μL/min。在一些情况下，通过MRI引导的对流增强递送(CED)将载体和/或核酸递送至受试者。此技术使得能够增加分布在脑部的整个大体积中的病毒扩散和转导以及减少载体和/或核酸沿针路径的回流。
本公开文本还提供了用于在所施用的AAV载体和/或核酸编码工程化LGIC的情况下施用配体(例如，小分子LGIC激动剂)的给药方案。
可以每天或在更长时间段内施用治疗有效量的配体一次或多于一次。在一些情况下，根据需要(例如，当需要缓解疼痛或控制癫痫时)施用治疗有效量的配体。可以连续地施用配体(例如，在治疗方案的持续时间内每天不间断地施用)。在一些情况下，治疗方案可以是小于一周、一周、两周、三周、一个月或大于一个月。在一些情况下，施用治疗有效量的配体一天、至少连续两天、至少连续三天、至少连续四天、至少连续五天、至少连续六天、至少连续七天、至少连续八天、至少连续九天、至少连续十天或至少连续大于十天。在特定情况下，施用治疗有效量的配体连续三天。在一些情况下，可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每周七次、每周八次、每周九次、每周10次、每周11次、每周12次、每周13次、每周14次、每周15次、每周16次、每周17次、每周18次、每周19次、每周20次、每周25次、每周30次、每周35次、每周40次、或每周大于40次施用治疗有效量的配体。在一些情况下，可以每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天10次或每天大于10次施用治疗有效量的配体。在一些情况下，至少每小时、至少每两小时、至少每三小时、至少每四小时、至少每五小时、至少每六小时、至少每七小时、至少每八小时、至少每九小时、至少每10小时、至少每11小时、至少每12小时、至少每13小时、至少每14小时、至少每15小时、至少每16小时、至少每17小时、至少每18小时、至少每19小时、至少每20小时、至少每21小时、至少每22小时、至少每23小时或至少每天施用治疗有效量的配体。可以如下将所述剂量的配体施用于受试者：连续地，或每天1次、2次、3次、4次或5次；每周1次、2次、3次、4次、5次、6次或7次，每月1次、2次、3次或4次，每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次，或一年一次，或以甚至更长的间隔。治疗的持续时间可以持续一天，1、2或3周，1、2、3、4、5、7、8、9、10或11个月，1、2、3、4、5年或更多年或更长时间。
将组合物施用于有需要的受试者的次数取决于医学专业人员的判断、障碍、障碍的严重程度以及受试者对配制品的反应。在一些实施方案中，组合物的施用进行至少一次。在一些实施方案中，施用在给定阶段内进行多于一次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。每次施用的剂量和/或施用的频率可以基于患者的病症和生理学反应根据需要进行调整。
用于产生AAV病毒粒子的方法
在一个方面，本公开文本提供了用于产生本公开文本的AAV病毒粒子的方法。通常，这些方法涉及将本公开文本的AAV载体插入或转导到能够将AAV载体包装到AAV病毒粒子中的宿主细胞中。下面描述和引用示例性方法；然而，本领域技术人员已知的任何方法可用于产生本公开文本的AAV病毒粒子。
可以使用本领域熟知的方法构建包含异源核酸并用于产生AAV病毒粒子的AAV载体。参见例如Koerber等人(2009)Mol.Ther.,17:2088；Koerber等人(2008)Mol Ther.,16:1703-1709；以及美国专利号7,439,065、6,951,758和6,491,907。例如，可以将一个或多个异源序列直接插入AAV基因组中，并从中切除主要AAV开放阅读框(“ORF”)。AAV基因组的其他部分也可以删除，只要保留足够的ITR的部分以允许复制和包装功能。
为了产生AAV病毒粒子，使用已知技术如通过转染将AAV载体引入到合适的宿主细胞中。用于产生AAV病毒粒子的合适的宿主细胞包括可以或已经用作异源AAV DNA分子的接受者并且可以支持来自辅助病毒的所需AAV产生辅因子的表达的任何种类和/或类型的细胞。此类宿主细胞可以包括但不限于可以或已经用作异源DNA分子的接受者的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括经转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”一般是指用外源性DNA序列转染的细胞。可以使用来自稳定的人细胞系HEK293(通过例如美国典型培养物保藏中心在保藏号ATCC CRL1573下可容易获得)的细胞。
在昆虫细胞中产生AAV病毒粒子的方法是本领域已知的，并且可用于产生主题AAV病毒粒子。参见例如美国专利公开号2009/0203071；美国专利号7,271,002；和Chen(2008)Mol.Ther.16:924。
试剂盒
在一个方面，本公开文本提供了试剂盒，该试剂盒包含含有编码本公开文本的工程化受体的多核苷酸的载体。在一个方面，本公开文本提供了试剂盒，该试剂盒包含本公开文本的工程化受体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是AAV载体。在一些实施方案中，载体是本公开文本的AAV。在一些实施方案中，试剂盒包含本公开文本的非天然配体。
在一些实施方案中，试剂盒包含(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；和(b)用于施用AAV载体以转导背根神经节神经元或三叉神经节神经元的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含适于施用AAV载体的装置。在一些实施方案中，该装置适于鞘内(IT)或神经节内(IG)施用。
在一些实施方案中，试剂盒包含(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；和(b)用于施用AAV载体以转导海马体神经元的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含适于施用AAV载体的装置。在一些实施方案中，该装置适于颅内施用。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含包装材料和其中的一种或多种组分。试剂盒典型地包括标签或包装插页，标签或包装插页包括对组分的描述或其中的组分的体外、体内或离体使用说明书。试剂盒可包含例如以下的此类组分的集合：AAV衣壳多肽、AAV载体或AAV病毒粒子和任选的第二活性(如另一种)化合物、药剂、药物或组合物。在一些实施方案中，AAV载体基因组编码LGIC(例如，工程化LGIC)，并且第二活性药剂是LGIC的配体(例如，小分子药物)。
试剂盒是指容纳试剂盒的一种或多种组分的物理结构。包装材料可以保持组分无菌，并且可以由通常用于此类目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
标签或插页可以包括其中的一种或多种组分的标识信息、剂量、一种或多种活性成分的临床药理学(包括作用机制)、药代动力学和药效学。标签或插页可以包括标识制造商、批号、制造商位置和日期、到期日的信息。标签或插页可以包括标识制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插页可以包括关于试剂盒组分可被用于的疾病的信息。标签或插页可以包括临床医生或受试者在方法、用途或治疗方案(treatment protocol)或治疗方案(therapeutic regimen)中使用试剂盒组分中的一种或多种的说明书。说明书可以包括剂量、频率或持续时间、以及用于实施本文所述的方法、用途、治疗方案或预防性或治疗性方案中的任一种的说明书。
标签或插页可以包括关于组分可以提供的任何益处(如预防性或治疗性益处)的信息。标签或插页可以包括关于潜在的不良副作用、并发症或反应的信息，如关于将不适合使用特定组合物的情况对受试者或临床医生的警告。当受试者已经、将要或正在服用一种或多种可能与组合物不相容的其他药物，或者受试者已经、将要或正在经历另一种不相容的治疗方案(treatment protocol)或治疗方案(therapeutic regimen)时，也可能发生不良副作用或并发症，并且因此，说明书可以包括关于此类不相容性的信息。
另外编号的实施方案
本公开文本的另外编号的实施方案提供如下：
实施方案1.一种治疗有需要的受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元，并且其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
实施方案1.1.根据实施方案1所述的方法，其中所述神经性疼痛是周围神经病。
实施方案1.2.根据实施方案1所述的方法，其中所述神经性疼痛是三叉神经痛。
实施方案2.一种治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元。
实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中所述神经系统疾病或障碍是神经性疼痛、痉挛状态、脊髓损伤或撕脱伤。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是包含衣壳多肽的AAV9-TV载体，所述衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
实施方案5.一种转导神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含异源核酸。
实施方案7.一种将异源核酸递送至神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。
实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2、AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF或AAV-PHP.S载体。
实施方案11.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV9-TV载体。
实施方案12.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
实施方案13.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV5载体。
实施方案14.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2.5-TV2YF载体。
实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案16.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3和5-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案17.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:5-7和9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案18.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述衣壳多肽在对应于SEQ ID NO:8的T492的位置处包含非苏氨酸突变。
实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中所述非苏氨酸突变是缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代。
实施方案20.根据实施方案18所述的方法，其中所述非苏氨酸突变是缬氨酸取代。
实施方案21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述神经元是背根神经节神经元。
实施方案22.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述神经元是三叉神经节神经元。
实施方案23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述神经元包含同工凝集素B4(IB4)阳性神经纤维。
实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述神经元包含NF200阳性神经纤维。
实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述神经元包含CGRP阳性神经纤维。
实施方案26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述神经元包含C纤维。
实施方案27.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述神经元包含Aδ纤维。
实施方案28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中将所述AAV载体通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用。
实施方案29.根据实施方案28所述的方法，其中将所述AAV载体通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
实施方案30.一种治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元，并且其中所述神经元是海马体神经元。
实施方案30.1.一种治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导海马体神经元。
实施方案30.2.根据实施方案30.1所述的方法，其中所述神经系统疾病或障碍是局灶性癫痫、精神分裂症、孤独症谱系障碍、阿尔茨海默病、雷特综合征或脆性X综合征。
实施方案31.一种转导神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是海马体神经元。
实施方案32.根据实施方案30-31中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含异源核酸。
实施方案33.一种将异源核酸递送至神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是海马体神经元。
实施方案34.根据实施方案30-33中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。
实施方案35.根据实施方案30-34中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。
实施方案36.根据实施方案30-35中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2、AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF或AAV-PHP.S载体。
实施方案37.根据实施方案30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV9载体。
实施方案38.根据实施方案30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV9-TV载体。
实施方案39.根据实施方案30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
实施方案40.根据实施方案30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV5载体。
实施方案41.根据实施方案30-40中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案42.根据实施方案30-40中任一项所述的方法，其中所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3和5-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案43.根据实施方案30-40中任一项所述的方法，其中所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:6-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案44.根据实施方案30-40中任一项所述的方法，其中所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方案45.根据实施方案30-44中任一项所述的方法，其中所述神经元是兴奋性神经元。
实施方案46.根据实施方案45所述的方法，其中所述神经元是CAMK2阳性神经元。
实施方案47.根据实施方案30-44中任一项所述的方法，其中所述神经元是抑制性神经元。
实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中所述神经元是GABA能神经元。
实施方案49.根据实施方案30-48中任一项所述的方法，其中所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
实施方案50.根据实施方案30-49中任一项所述的方法，其中通过颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体。
实施方案51.根据实施方案50所述的方法，其中通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用AAV载体。
实施方案52.根据实施方案6-29和32-51中任一项所述的方法，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
实施方案53.根据实施方案52所述的方法，其中所述配体门控离子通道包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。
实施方案54.根据实施方案52或53所述的方法，其中所述配体结合结构域包含与SEQ ID NO:25的氨基酸残基23-220具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方案55.根据实施方案54所述的方法，其中所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQ ID NO:25的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的残基的残基处的氨基酸突变。
实施方案56.根据实施方案54或55所述的方法，其中所述配体结合结构域包含表3中列出的一个或多个氨基酸突变。
实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101W、Y115E和Y210W的突变。
实施方案58.根据实施方案56所述的方法，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101W和Y210V的突变。
实施方案59.根据实施方案56所述的方法，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101M和L131F的突变。
实施方案60.根据实施方案53-59中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。
实施方案61.根据实施方案60所述的方法，其中所述离子孔结构域包含与SEQ IDNO:26的氨基酸255-457、SEQ ID NO:27的260-452、SEQ ID NO:28的氨基酸259-464或SEQID NO:29的氨基酸259-449具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方案62.根据实施方案53-61中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含源自所述人甘氨酸受体的Cys-环结构域。
实施方案63.根据实施方案62所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸166-172。
实施方案64.根据实施方案62所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸166-180。
实施方案65.根据实施方案53-64中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含来自所述人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。
实施方案66.根据实施方案65所述的方法，其中所述β1-2环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸81-84。
实施方案67.根据实施方案53-66中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1，并且其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案68.根据实施方案52-67中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用所述配体门控离子通道的配体。
实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中所述配体选自AZD-0328、TC-6987、ABT-126、TC-5619、TC-6683、伐尼克兰和法西克兰/RG3487。
实施方案70.根据实施方案68所述的方法，其中所述配体是TC-5619。
实施方案70.1.根据实施方案68所述的方法，其中所述配体是ABT-126。
实施方案71.根据实施方案1-70.1中任一项所述的方法，其中所述受试者是灵长类动物。
实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中所述受试者是人，任选地是成年人。
实施方案73.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；其中所述衣壳多肽包含与SEQID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
(b)用于施用所述AAV载体以转导背根神经节神经元或三叉神经节神经元的说明书。
实施方案74.根据实施方案73所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适于经由鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用所述AAV载体的装置。
实施方案75.根据实施方案74所述的试剂盒，其中所述装置适于通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
实施方案76.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；其中所述衣壳多肽包含与SEQID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
(b)用于施用所述AAV载体以转导海马体神经元的说明书。
实施方案77.根据实施方案76所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适于经由颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体的装置。
实施方案78.根据实施方案77所述的试剂盒，其中所述装置适于通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用。
实施方案79.根据实施方案73-78中任一项所述的试剂盒，其中所述AAV载体包含编码配体门控离子通道的异源核酸。
实施方案80.根据实施方案79所述的试剂盒，其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案81.根据实施方案79或80所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含所述配体门控离子通道的配体。
实施方案82.根据实施方案81所述的试剂盒，其中所述配体是TC-5619。
实施方案82.1.根据实施方案81所述的方法，其中所述配体是ABT-126。
实施方案83.一种治疗有需要的受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的背根神经节神经元或三叉神经节神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
实施方案83.1.根据实施方案83所述的方法，其中所述神经性疼痛是周围神经病。
实施方案83.2.根据实施方案83所述的方法，其中所述神经性疼痛是三叉神经痛。
实施方案84.一种治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
实施方案85.根据实施方案84所述的方法，其中所述神经系统疾病或障碍是神经性疼痛、痉挛状态、脊髓损伤或撕脱伤。
实施方案86.根据实施方案83-85中任一项所述的方法，其中将所述异源核酸通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用。
实施方案87.根据实施方案86所述的方法，其中将所述异源核酸通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
实施方案88.根据实施方案83-87中任一项所述的方法，其中所述异源核酸包含在载体内。
实施方案89.根据实施方案88所述的方法，其中所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体转导所述背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
实施方案90.根据实施方案83-89中任一项所述的方法，其中所述神经元包含同工凝集素B4(IB4)阳性神经纤维。
实施方案91.根据实施方案83-90中任一项所述的方法，其中所述神经元包含NF200阳性神经纤维。
实施方案92.根据实施方案83-91中任一项所述的方法，其中所述神经元包含CGRP阳性神经纤维。
实施方案93.根据实施方案83-92中任一项所述的方法，其中所述神经元包含C纤维。
实施方案94.根据实施方案83-92中任一项所述的方法，其中所述神经元包含Aδ纤维。
实施方案95.一种治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的海马体神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
实施方案95.1.一种治疗有需要的受试者的神经系统疾病或障碍的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的海马体神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
实施方案95.2.根据实施方案95.1所述的方法，其中所述神经系统疾病或障碍是局灶性癫痫、精神分裂症、孤独症谱系障碍、阿尔茨海默病、雷特综合征或脆性X综合征。
实施方案96.根据实施方案95-95.2中任一项所述的方法，其中通过颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述异源核酸。
实施方案97.根据实施方案96所述的方法，其中通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述异源核酸。
实施方案98.根据实施方案95-97中任一项所述的方法，其中所述异源核酸包含在载体内。
实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体转导所述海马体神经元。
实施方案100.根据实施方案95-99中任一项所述的方法，其中所述神经元是兴奋性神经元。
实施方案101.根据实施方案100所述的方法，其中所述神经元是CAMK2阳性神经元。
实施方案102.根据实施方案95-99中任一项所述的方法，其中所述神经元是抑制性神经元。
实施方案103.根据实施方案102所述的方法，其中所述神经元是GABA能神经元。
实施方案104.根据实施方案95-103中任一项所述的方法，其中所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
实施方案105.根据实施方案83-104中任一项所述的方法，其中所述配体门控离子通道包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。
实施方案106.根据实施方案105所述的方法，其中所述配体结合结构域包含与SEQID NO:25的氨基酸残基23-220具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方案107.根据实施方案106所述的方法，其中所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQ ID NO:25的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的残基的残基处的氨基酸突变。
实施方案108.根据实施方案105或106所述的方法，其中所述配体结合结构域包含表3中列出的一个或多个氨基酸突变。
实施方案109.根据实施方案105-108中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。
实施方案110.根据实施方案109所述的方法，其中所述离子孔结构域包含与SEQID NO:26的氨基酸255-457、SEQ ID NO:27的260-452、SEQ ID NO:28的氨基酸259-464或SEQ ID NO:29的氨基酸259-449具有至少85％同一性的氨基酸序列。
实施方案111.根据实施方案105-110中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含源自所述人甘氨酸受体的Cys-环结构域。
实施方案112.根据实施方案111所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸166-172。
实施方案113.根据实施方案111所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸166-180。
实施方案114.根据实施方案105-113中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含来自所述人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。
实施方案115.根据实施方案114所述的方法，其中所述β1-2环结构域包含SEQ IDNO:26的氨基酸81-84。
实施方案116.根据实施方案105-115中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1，并且其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案117.根据实施方案83-116中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用所述配体门控离子通道的配体。
实施方案118.根据实施方案117所述的方法，其中所述配体选自AZD-0328、TC-6987、ABT-126、TC-5619、TC-6683、伐尼克兰和法西克兰/RG3487。
实施方案119.根据实施方案117所述的方法，其中所述配体是TC-5619。
实施方案119.1.根据实施方案117所述的方法，其中所述配体是ABT-126。
实施方案120.根据实施方案83-119.1中任一项所述的方法，其中所述受试者是灵长类动物。
实施方案121.根据实施方案120所述的方法，其中所述受试者是人，任选地是成年人。
本公开文本的序列
实施例
虽然已经在此示出并描述了本公开文本的优选实施方案，但是对本领域的普通技术人员而言应显而易见的是这样的实施方案仅以举例方式提供。在不偏离本公开文本的情况下，许多变化、改变和替换将是本领域的技术人员能想到的。应理解的是，在此描述的本公开文本的实施方案的不同替代方案可以用于实施本公开。以下权利要求旨在限定本公开文本的范围，并且在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构涵盖在其中。
实施例1：使用人iPSC来源的感觉祖神经元的AAV衣壳选择
iPSC来源的感觉神经元培养和AAV转导：Axol Bio的人iPSC感觉神经元祖细胞源自无整合的iPSC(诱导多能干细胞)，并已使用小分子分化为神经元。进一步培养细胞，富集得到神经元，并根据制造商的方案在实验室中分化5天。在培养的第5天，神经突显得更厚且更长，并且胞体的间隔也变得更大。用各种AAV转导细胞，所述各种AAV包含所指示衣壳并在3e5的MOI(感染复数)下在CMV启动子下编码GFP转基因。在转导后3天和5天对细胞成像，并在第5天收集用于RNA和蛋白质表达分析。在两种测定中使用相同的裂解混合物。
ELISA评估：在Abcam GFP ELISA试剂盒(ab171581)细胞提取缓冲液中裂解样品。按照制造商方案使用Pierce Micro BCA蛋白测定试剂盒(23235)测定每个样品的总蛋白浓度。并行地，按照制造商方案使用Abcam GFP ELISA试剂盒(ab171581)测定每个样品的GFP浓度。共同地，测定每个样品中每总蛋白(mg)中GFP(ng)的量。
ddPCR评估：使用来自Qiagen Inc的RNeasy Plus Mini试剂盒(目录号74134)和来自Fisher Scientific的PURELINK DNAse Set(目录号12185010)的制造商方案分离RNA。使用来自Fisher Scientific的SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50试剂盒(目录号11766050)合成cDNA。使用购自Integrated DNA Technologies的定制引物进行ddPCR反应，Taqman探针获自Thermo Fisher Scientific，并且其余的试剂和仪器购自Bio-Rad。在相同的反应中，将转基因的表达与管家基因比较，并以两者的比率呈现。
在第一组体外实验中，测试12种AAV衣壳血清型(AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV2、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF和AAV-PHP.S)。细胞成像结果示于图1中，并且ddPCR评估的结果示于图2中。体外结果表明，每种衣壳血清型介导的GFP表达水平不同。
根据上述结果，七种AAV衣壳血清型(AAV2.5-TV、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV和AAV-PHP.S)显示出有前景的结果，并在第二组体外实验中测试。类似于第一测试组，在第二组中，基于GFP荧光水平的细胞成像(图3)、GFP蛋白表达的ELISA(图4)和mRNA水平的ddPCR评估(图5)来评价转导效率。结果显示，如通过对mRNA的ddPCR和对蛋白质的ELISA所评估的，AAV5和AAV6血清型介导最高水平的体外转导，并且在随后的体内实验中测试所有七种血清型。
实施例2：使用大鼠背根神经节(DRG)对针对神经性疼痛的AAV衣壳选择
ELISA评估：在Abcam GFP ELISA试剂盒(ab171581)细胞提取缓冲液中裂解样品。按照制造商方案使用Pierce Micro BCA蛋白测定试剂盒(23235)测定每个样品的总蛋白浓度。并行地，按照制造商方案使用Abcam GFP ELISA试剂盒(ab171581)测定每个样品的GFP浓度。共同地，测定每个样品中每总蛋白(mg)中GFP(ng)的量。
ddPCR评估：使用来自Fisher Scientific的Pink Rino RNA Lysis试剂盒(目录号NC1307305)将组织匀浆，使用来自Qiagen Inc的RNeasy Plus Mini试剂盒(目录号74134)和来自Fisher Scientific的PURELINK DNAse Set(目录号12185010)的制造商方案分离RNA。使用来自Fisher Scientific的SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50试剂盒(目录号11766050)合成cDNA。使用购自Integrated DNA Technologies的定制引物进行ddPR反应，Taqman探针获自Thermo Fisher Scientific，并且其余的试剂和仪器购自Bio-Rad。在相同的反应中，将转基因的表达与管家基因比较，并以两者的比率呈现。
免疫荧光和分析：(1)组织制备：将新鲜切割的DRG在PBS中的4％PFA中固定4小时，在PBS中的30％蔗糖中冷冻保护，并以10μM切片。(2)IHC处理：将一抗在4℃下孵育过夜，而在室温下应用二抗，保持一小时。DAPI核染色包括在组织载玻片密封试剂中。使用的抗体包括：(a)来自Abcam的1:1000稀释的鸡抗GFP(目录号AB13970)与来自JacksonImmunoresearch的1:250稀释的驴抗鸡488(目录号703-545-155)的组合；(b)来自Millipore Sigma的1:500稀释的小鼠抗NeuN(目录号MAB377)与来自Thermo Fischer的1:250稀释的驴抗小鼠568(目录号A10037)的组合。(3)成像和定量：使用带有LeicaApplication Suite X硬件的Leica Thunder显微镜。从遍及每个DRG的NeuN阳性细胞密集区域获得20x放大图像。在除去背景信号后，对GFP阳性细胞计数并手动标记。评估GFP阳性细胞与NeuN信号的重叠。在不知实验组的情况下以盲法对切片计数。
在体外研究之后，将包含所指示衣壳(AAV2.5-TV、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV和AAV-PHP.S)并编码GFP的AAV以1e10 vg/DRG的剂量单侧注射到5-6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠的L3、L4和L5 DRG中。在4周后，处死这些动物，并将同侧以及未注射的对侧L3、L4和L5 DRG切除，以通过ddPCR(图6)、ELISA(图7)和免疫荧光(图8)进行组织评估，以分别测量GFP mRNA、蛋白质和细胞向性的水平。
根据ddPCR和ELISA结果，四种血清型(AAV6、AAV5、AAV9-TV和AAV2.5-TV2YF)具有更高水平的转基因表达，AAV5和AAV6血清型介导最高水平的DRG神经元转导。免疫荧光分析证实，这两种血清型(AAV5和AAV6)在转导神经元方面最高效(图8和图9，针对神经元标记物NeuN对细胞共染色)。另外的细胞标记物染色揭示所测试的血清型之间另外的细胞向性(图10)。NF200+神经元主要为用于轻触和本体感受的有高度髓鞘的Aα和有中度髓鞘的Aβ纤维。IB4+神经元主要为用于伤害性感受的无髓鞘的C纤维或Aδ纤维。并且CGRP+神经元主要是用于伤害性感受的无髓鞘的C纤维或有轻度髓鞘的Aδ纤维。AAV9和AAV9-TV转导最高百分比的NF200(重神经丝)+ve神经元，该亚群指示较大的有髓鞘的A纤维神经元。基于这些研究，将携带CMV-GFP的AAV衣壳的子集直接单侧施用到非洲绿猴的DRG中，以最终选择用于在DRG和TGG中转导的最优衣壳，以用于进一步研究神经性疼痛治疗。
实施例3：使用NHP模型用于背根神经节(DRG)或三叉神经节转导和神经性疼痛治疗的腺相关病毒(AAV)衣壳选择
处理和组织收集：在体外研究之后，在两个单独的实验中将包含所指示衣壳(AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6和AAV9-TV)并编码GFP的AAV单侧注射到成年雄性绿猴(黑脸绿猴(Chlorocebus sabaeus))的L2、L3和L4 DRG中：研究1(V01220)在L2 DRG中以3×1010个载体基因组(vg)的剂量和在L3和L4 DRG中以4.5×1010vg的剂量比较AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6和AAV9-TV；以及研究2(V01331)在L2 DRG中以5×1010vg的剂量和在L3和L4 DRG中以7.5×1010vg的剂量进一步比较AAV5和AAV9-TV。在两项研究中，在用AAV处理28天后，处死动物，并分别提取L2、L3和L4 DRG(同侧和对侧)，并立即纵向切成两半。将一半快速冷冻用于ddPCR mRNA分析(图11)和GFP蛋白定量(图12A和图12B)。将剩余的DRG半部(同侧和对侧)在4％多聚甲醛中后固定，并用于组织学和/或免疫组织化学分析，以测量衣壳的GFP和细胞向性水平(图13A、图13B和图13C)。
ddPCR评估：使用Pink RINO RNA Lysis试剂盒(Thermo Fisher Scientific，目录号NC1307305)将组织匀浆。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，目录号74134)和PureLinkTM DNase Set(Thermo Fisher Scientific，目录号12185010)的制造商方案分离RNA。使用带有ezDNaseTM Enzyme试剂盒的SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix(ThermoFisher Scientific，目录号11766050)合成cDNA。使用购自Integrated DNA Technologies的定制引物进行ddPCR反应，TaqmanTM探针获自Thermo Fisher Scientific，并且其余的试剂和仪器来自Bio-Rad。在相同的反应中，将转基因的表达与管家基因比较，并以两者的比率呈现。
ELISA评估：根据制造商的方案使用GFP SimpleStep ELISA试剂盒(Abcam，目录号ab171581)处理样品。按照制造商方案使用Micro BCATM Protein Assay试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号23235)测定每个样品的总蛋白浓度。并行地，根据制造商的方案测定每个样品的GFP浓度。共同地，测定每个样品中每总蛋白(mg)中GFP(ng)的量。
免疫荧光评估：将L2、L3和L4 DRG包在组织-Tek OCT化合物(Sakura Finetek，目录号4583)中。将这些块在-80℃下冷冻，然后在Leica CM3050低温恒温器上以35μM的厚度冷冻切片，将切片直接固定在载玻片上。然后使用标准方案对载玻片染色。最初用NeuN(Millipore，目录号MAB377，以1:500)、GFP(Abcam，目录号13970，以1:1000)、谷氨酰胺合成酶(Abcam，目录号176562，以1:100)和DAPI(Roche，目录号10236276001，以1:1000)对选定的载玻片染色。用于此小组的二抗包括山羊抗兔AlexaFluor750(Invitrogen，目录号A21039，以1:1000)、山羊抗鸡FITC(BioLegend，目录号410802，以1:500)和山羊抗小鼠AlexaFluor647(Invitrogen，目录号A21236，以1:500)。使用Zeiss Zen软件在ZeissAxioscan.Z1上以20x放大倍数对载玻片成像。使用Fiji图像分析软件(ImageJ；马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院)分析图像。
数据分析/解释：根据研究1(V01220)中的ddPCR结果(图11)，AAV5、AAV6和AAV9-TV在NHP DRG中具有可比水平的转基因表达，这高于使用AAV2.5-TV2YF的转基因表达。当在研究1(V01220)中通过ELISA测量蛋白质表达水平时(图12A)，AAV9-TV递送的转基因具有最高的蛋白质表达水平，其次是AAV6、AAV5，然后是AAV2.5-TV2YF。研究1(V01220)中的免疫组织学分析(图13A和图13B)证实，血清型AAV5、AAV6和AAV9TV在转导背根神经节内的神经元方面更高效。AAV6处理组在表达方面变化很大。此外，如GFP与谷氨酰胺合成酶(卫星胶质细胞标记物)共定位所见，显现好像AAV6血清型频繁转导胶质细胞。因此，在研究2(V01331)中选择血清型AAV5和AAV9-TV用于进一步评估。如通过ELISA(图12B)和免疫组织学分析(图13C)测量的，对用携带GFP的AAV5和AAV9-TV衣壳转导的NHP DRG样品的正交测试显示AAV9-TV血清型在DRG神经元中高水平的表达。这些结果表明，AAV9-TV是直接注射后用于转导DRG神经元的最优衣壳。
实施例4：使用新生大鼠混合海马体培养物的AAV衣壳选择
混合E18海马体培养和AAV转导：在胚胎第18天将大鼠海马体分离，切成小块，然后使其缓慢胰蛋白酶化并机械解离。将单细胞悬浮液铺板在具有生长因子的培养基中，并用抑制分裂(非神经元细胞)存活的试剂处理，以从培养物富集得到神经元。在培养的第1天，用各种AAV转导细胞，所述各种AAV包含所指示衣壳并在1e5或3e5的MOI(感染复数)下在CMV启动子下编码GFP转基因。在转导后3天和5天对细胞成像，并在第5天收集用于RNA表达分析。
mRNA水平的ddPCR评估：使用来自Qiagen Inc的RNeasy Plus Mini试剂盒(目录号74134)和来自Fisher Scientific的PURELINK DNase Set(目录号12185010)的制造商方案分离RNA。使用来自Fisher Scientific的SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50试剂盒(目录号11766050)合成cDNA。使用购自Integrated DNA Technologies的定制引物进行ddPR反应，Taqman探针获自Thermo Fisher Scientific，并且其余的试剂和仪器购自Bio-Rad。在相同的反应中，将转基因的表达与管家基因比较，并以两者的比率呈现。
在第一组体外实验中，测试12种AAV衣壳血清型(AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV2、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF和AAV-PHP.S)。细胞成像结果示于图14中(MOI为1e5)，并且ddPCR评估的结果示于图15中(MOI为1e5)。体外结果表明，每种衣壳血清型介导的GFP表达水平不同。
根据上述结果，七种AAV衣壳血清型(AAV2.5-TV、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV和AAV-PHP.S)显示出有前景的结果，并在第二组体外实验中测试。类似于第一测试组，在第二组中，在3e5的MOI下基于GFP荧光水平的细胞成像(图16)和mRNA水平的ddPCR评估(图17)来评价转导效率。
实施例5：用于大鼠海马体中局灶性癫痫的AAV衣壳选择
ELISA评估：在Abcam GFP ELISA试剂盒(ab171581)细胞提取缓冲液中裂解样品。按照制造商方案使用Pierce Micro BCA蛋白测定试剂盒(23235)测定每个样品的总蛋白浓度。并行地，按照制造商方案使用Abcam GFP ELISA试剂盒(ab171581)测定每个样品的GFP浓度。共同地，测定每个样品中每总蛋白(mg)中GFP(ng)的量。
ddPCR评估：使用来自Fisher Scientific的Pink Rino RNA Lysis试剂盒(目录号NC1307305)将组织匀浆，使用来自Qiagen Inc的RNeasy Plus Mini试剂盒(目录号74134)和来自Fisher Scientific的PURELINK DNase Set(目录号12185010)的制造商方案分离RNA。使用来自Fisher Scientific的SUPERSCRIPT IV VILO EZDNASE 50试剂盒(目录号11766050)合成cDNA。使用购自Integrated DNA Technologies的定制引物进行ddPCR反应，Taqman探针获自Thermo Fisher Scientific，并且其余的试剂和仪器购自Bio-Rad。在相同的反应中，将转基因的表达与管家基因比较，并以两者的比率表示。
免疫荧光染色和分析：(1)组织制备：将新鲜切除的大鼠海马体在PBS中的4％PFA中固定24小时，在PBS中的30％蔗糖中冷冻保护，并以10μM切片。(2)IHC：将一抗在4℃下孵育过夜，而在室温下应用二抗，保持一小时。DAPI核染色包括在组织载玻片密封试剂中。使用的抗体包括：(a)来自Abcam的1:500稀释的鸡抗GFP(目录号AB13970)与来自JacksonImmunoresearch的1:250稀释的驴抗鸡488(目录号703-545-155)的组合；(b)来自Millipore Sigma的1:500稀释的小鼠抗NeuN(目录号MAB377)与来自Thermo Fischer的1:250稀释的驴抗小鼠568(目录号A10037)的组合；(c)来自Agilent Z033429-2的1:500稀释的兔抗GFAP(目录号Z033429-2)与来自BioLegend的1:250稀释的驴抗兔647(目录号406414)的组合。(3)成像和分析：使用具有Zen 3.1蓝色版本的Zeiss Axioscan.Z1成像。使用专有代码处理放大的图像，以评估阳性信号的传播和强度。
在体外研究之后，将包含AAV2.5-TV、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV或AAV-PHP.S衣壳并编码GFP的AAV直接双侧给药至5-6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠的海马体中。在4周后，处死这些动物，并将其右和左脑半球切除并进一步切割，以通过ddPCR(图18)、ELISA(图19)和免疫荧光(图20)进行组织评估，以分别测量GFP mRNA、蛋白质和细胞向性的水平。
ddPCR和ELISA结果指示，AAV6介导最强的表达，紧随其后的是AAV9和AAV9-TV。GFP表达以及各种细胞标记物的免疫荧光分析指示，所有血清型主要转导神经元，而AAV5、AAV6和AAV-PHP.S还转导一些星形胶质细胞。根据示出海马体GFP覆盖区域的百分比的图21A，AAV9和AAV9TV衣壳介导最多的覆盖区域。根据示出每个正像素的GFP强度的图21B，AAV9和AAV6介导最高强度。
基于这些研究，在非洲绿猴的海马体中直接施用AAV衣壳子集，最终选择用于在海马体中转导神经元的最优衣壳，以用于局灶性癫痫治疗。
实施例6：使用NHP模型用于海马体神经元转导和局灶性癫痫治疗的腺相关病毒(AAV)衣壳选择
处理和组织收集：在体外研究之后，在两个单独的实验中将包含所指示衣壳(AAV5、AAV6、AAV9和AAV9-TV)并编码GFP的AAV双侧注射到成年雄性绿猴(黑脸绿猴)的海马体中：研究1(V01220)以6×1010个病毒基因组(vg)的剂量比较AAV5、AAV6、AAV9和AAV9-TV；以及研究2(V01331)以1×1011vg的剂量比较AAV5和AAV9。在两项研究中，在用AAV处理28天后，处死动物并进一步切除脑的右半球，分离右海马体并快速冷冻以用于蛋白质和mRNA分析。将脑的整个左半球在4％多聚甲醛中后固定，并用于组织学和/或免疫组织化学分析，以测量GFP和细胞向性的水平。
ddPCR评估：使用Pink RINO RNA Lysis试剂盒(Thermo Fisher Scientific，目录号NC1307305)将组织匀浆。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，目录号74134)和PureLinkTM DNase Set(Thermo Fisher Scientific，目录号12185010)的制造商方案分离RNA。使用带有ezDNaseTM Enzyme试剂盒的SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix(ThermoFisher Scientific，目录号11766050)合成cDNA。使用购自Integrated DNA Technologies的定制引物进行ddPCR反应，TaqmanTM探针获自Thermo Fisher Scientific，并且其余的试剂和仪器来自Bio-Rad。在相同的反应中，将转基因的表达与管家基因比较，并以两者的比率呈现。
ELISA评估：根据制造商的方案使用GFP SimpleStep ELISA试剂盒(Abcam，目录号ab171581)处理样品。按照制造商方案使用Micro BCATM Protein Assay试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号23235)测定每个样品的总蛋白浓度。并行地，根据制造商的方案测定每个样品的GFP浓度。共同地，测定每个样品中每总蛋白(mg)中GFP(ng)的量。
免疫荧光评估：将脑组织样品包埋入组织-Tek OCT化合物(Sakura Finetek，目录号4583)的块中，每个块总共有两个脑半球。将块在-80℃下冷冻，然后以40μM的厚度在滑动超薄切片机上冷冻切片。收集切片并储存在抗原保存溶液中。固定所选切片，并用NeuN(EnCor Biotechnology，目录号MCA-1B7)、GFAP(Dako，目录号Z0334)、GFP(Abcam，目录号ab13970)和Hoechst染色。在Olympus VS200研究载玻片扫描仪上以20x放大倍数对切片成像，以进行定量/定性分析。
数据分析/解读：根据来自研究1(V01220)的ddPCR和ELISA结果，与NHP海马体中的AAV6和AAV9-TV相比，AAV5和AAV9具有更高水平的转基因(图22A)和蛋白质(图23A)表达。免疫组织学分析证实，AAV5和AAV9总体上展现出最高的转导(图24A)。因此，在后续研究2(V01331)中选择这两个衣壳用于进一步评估。基于ddPCR(图22B)、ELISA(图23B)和免疫荧光(图24B)的正交结果表明，AAV9是用于直接注射后在海马体中转导神经元的最优衣壳。
实施例7：用于治疗局灶性癫痫的工程化配体门控离子通道
方法：将AAV9构建体双侧注射到成年雄性C57BL/6小鼠的海马体中，以表达CODA71嵌合受体(SEQ ID NO:33)或乱序对照载体。测量响应于前穿质途径电刺激的经诱发海马体癫痫发作阈值的变化。对于自发性癫痫发作实验，在AAV9注射和EEG电极植入之前3周，将小鼠单侧海马体内注射红藻氨酸(KA)以诱导癫痫。
结果：在应用选择性激动剂TC-5619之后，CODA71嵌合氯通道在海马体神经元中表达良好，并在急性切片中有效抑制神经元放电(TC-5619基强度：368±39.7pA；媒介物基强度：80±15.4pA；p＝0.002)。评估其改变电图记录的经诱发局灶性海马体癫痫发作的体内易感性的能力。在CODA71动物中腹膜内施用TC-5619(100mg/kg)之后，诱发电图记录的癫痫发作的最小阈值电位(139±48.0％)比乱序对照(-10±13.2％；p＝0.0166)增加更多。进行另外的实验，以测试其在海马体内KA局灶性癫痫模型中控制自发性癫痫发作的功效，该模型复制了许多人颞叶癫痫特征。在癫痫小鼠中腹膜内注射TC-5619显著降低电图记录的癫痫发作的持续时间和频率(p＝0.0011；p＝0.0325)。这些结果证明，AAV9靶向递送CODA71LGIC受体可以有效抑制局灶性癫痫发作。这些实验的结果描述于下文。
如图25所示，AAV9递送可操作地连接至人突触素1基因启动子(hSyn)的编码CODA71 LGIC受体的核酸导致CODA71受体在CA1神经元中的有效表达。
如图26所示，用α7nAchR激动剂TC-5619激活CODA71抑制急性切片中的CA1动作电位放电。此时，在整个细胞电流钳记录期间，记录CA1神经元对应用150nM TC-5619的1分钟浸浴的反应。所有时间都相对于记录的开始，应用TC-5619从1分钟处开始。调整维持电流，使所有记录在基线时处于-65mV的静息膜电位。
如图27A和图27B所示，全细胞记录的CA1神经元的内在特性在应用150nM TC-56191分钟后迅速改变。
如图28中所示，需要激活CODA71受体，以使激动剂TC-5619对神经元特性产生效应。当α7-nAChR配体结合域被银环蛇毒素(BTX)抑制时，与乱序对照载体相比，添加TC-5619几乎没有引起用CODA71载体转导的神经元的特性变化。
在一组动物研究中，在癫痫发作阈值测试之前两周，CODA71在CA1/DG中双侧表达，并在CA1和前穿质途径中放置双极电极。在阈值测试之前45分钟，小鼠经由腹膜内注射接受100mg/kg TC-5619或盐水。每100秒递送渐增波幅的电刺激(在60Hz下1秒，1ms脉冲)，直到诱发电图记录的癫痫发作(图29)。
如图30所示，电诱发癫痫发作阈值随着CODA71激活而增加。在此处，通过监测对渐增波幅的电刺激的反应来测定诱发的癫痫发作阈值，并测定为在每个试验中诱发持续癫痫形式活动所需的最小刺激波幅。
如图31所示，在用TC-5619处理的注射CODA71载体的小鼠中，癫痫发作阈值增加得更多，而在注射乱序对照载体的小鼠中，TC-5619没有改变癫痫发作阈值。
在一组动物研究中，在测试神经元活动之前七周，将红藻氨酸单侧注射至CA1中，以诱发自发性癫痫发作。五周后，CODA71受体在CA1/DG中双侧表达，同时在CA1中放置双极电极，以记录EEG(图32)。通过长期EEG记录跟踪自发性癫痫发作。每隔一天，小鼠间隔2小时接受两次腹膜内注射100mg/kg TC-5619或盐水。结果显示，在注射CODA71载体或乱序对照载体的小鼠中的基线癫痫发作类似(图33)。然而，在施用TC-5619后，注射CODA71载体的小鼠中的自发性癫痫发作频率明显下降，而注射乱序对照载体的小鼠中几乎没有变化。并且这种效应仅在施用TC-5619后在CODA71载体转导的小鼠中观察到，而在媒介物对照中未观察到。参见图34A和图34B。因此，CODA71受体和TC-5619激动剂的组合能够缓解自发性局灶性癫痫发作。
如图35所示，注射CODA71载体的小鼠在施用TC-5619后显示癫痫发作频率的长时间的降低，但媒介物对照则不能。并且如图36所示，注射CODA71载体的小鼠在施用TC-5619后还显示癫痫发作持续时间的明显降低，但媒介物对照则不能。在注射乱序对照载体的小鼠中未观察到这种效应。
这项研究的结果表明，通过AAV9将编码CODA71受体的核酸转导到海马体中成功抑制海马体神经元兴奋性，预防诱发和自发性局灶性癫痫发作，并改善对特定神经元群体的靶向以治疗局灶性癫痫。
通过引用并入
将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开案和专利申请都出于所有目的通过引用以其整体而并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开案和专利申请并非并且不应当被视为承认或以任何形式暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家公知常识的一部分。
序列表
<110> 特拉梅斯生物公司
<120> 用于治疗局灶性癫痫和神经性疼痛的腺相关病毒衣壳和工程化配体门控离子通道
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<150> US 63/141,121
<151> 2021-01-25
<150> US 63/141,124
<151> 2021-01-25
<150> US 63/285,929
<151> 2021-12-03
<160> 35
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<210> 11
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
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<211> 2208
<212> DNA
<213> 依赖病毒腺相关病毒 2
<400> 13
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<210> 14
<211> 2211
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<213> 依赖病毒腺相关病毒 2
<400> 14
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<220>
<223> 合成构建体
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aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980
gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040
gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100
tacacttcca acttctacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160
tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tttctgactc gtaatctgta a 2211
<210> 23
<211> 2211
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
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gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420
ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480
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tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600
cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660
gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720
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tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900
ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960
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acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080
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aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920
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tacacttcca acttctacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160
tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tttctgactc gtaatctgta a 2211
<210> 24
<211> 2232
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
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accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780
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ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960
caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020
acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080
gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140
acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200
ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260
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gaccaatact tgtactatct ctctagaact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380
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ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500
tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560
ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620
ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680
accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740
gccacaaacc accagagtgc ccaacaggcg gttaggacgt ctttggcaca ggcgcagacc 1800
ggttgggttc aaaaccaagg aatacttccg ggtatggttt ggcaggacag agatgtgtac 1860
ctgcaaggac ccatttgggc caaaattcct cacacggacg gcaactttca cccttctccg 1920
ctgatgggag ggtttggaat gaagcacccg cctcctcaga tcctcatcaa aaacacacct 1980
gtacctgcgg atcctccaac ggccttcaac aaggacaagc tgaactcttt catcacccag 2040
tattctactg gccaagtcag cgtggagatc gagtgggagc tgcagaagga aaacagcaag 2100
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cgtaatctgt aa 2232
<210> 25
<211> 502
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 25
Met Arg Cys Ser Pro Gly Gly Val Trp Leu Ala Leu Ala Ala Ser Leu
1 5 10 15
Leu His Val Ser Leu Gln Gly Glu Phe Gln Arg Lys Leu Tyr Lys Glu
20 25 30
Leu Val Lys Asn Tyr Asn Pro Leu Glu Arg Pro Val Ala Asn Asp Ser
35 40 45
Gln Pro Leu Thr Val Tyr Phe Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ile Met Asp
50 55 60
Val Asp Glu Lys Asn Gln Val Leu Thr Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met
65 70 75 80
Ser Trp Thr Asp His Tyr Leu Gln Trp Asn Val Ser Glu Tyr Pro Gly
85 90 95
Val Lys Thr Val Arg Phe Pro Asp Gly Gln Ile Trp Lys Pro Asp Ile
100 105 110
Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Arg Phe Asp Ala Thr Phe His Thr
115 120 125
Asn Val Leu Val Asn Ser Ser Gly His Cys Gln Tyr Leu Pro Pro Gly
130 135 140
Ile Phe Lys Ser Ser Cys Tyr Ile Asp Val Arg Trp Phe Pro Phe Asp
145 150 155 160
Val Gln His Cys Lys Leu Lys Phe Gly Ser Trp Ser Tyr Gly Gly Trp
165 170 175
Ser Leu Asp Leu Gln Met Gln Glu Ala Asp Ile Ser Gly Tyr Ile Pro
180 185 190
Asn Gly Glu Trp Asp Leu Val Gly Ile Pro Gly Lys Arg Ser Glu Arg
195 200 205
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210 215 220
Thr Met Arg Arg Arg Thr Leu Tyr Tyr Gly Leu Asn Leu Leu Ile Pro
225 230 235 240
Cys Val Leu Ile Ser Ala Leu Ala Leu Leu Val Phe Leu Leu Pro Ala
245 250 255
Asp Ser Gly Glu Lys Ile Ser Leu Gly Ile Thr Val Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Thr Val Phe Met Leu Leu Val Ala Glu Ile Met Pro Ala Thr Ser Asp
275 280 285
Ser Val Pro Leu Ile Ala Gln Tyr Phe Ala Ser Thr Met Ile Ile Val
290 295 300
Gly Leu Ser Val Val Val Thr Val Ile Val Leu Gln Tyr His His His
305 310 315 320
Asp Pro Asp Gly Gly Lys Met Pro Lys Trp Thr Arg Val Ile Leu Leu
325 330 335
Asn Trp Cys Ala Trp Phe Leu Arg Met Lys Arg Pro Gly Glu Asp Lys
340 345 350
Val Arg Pro Ala Cys Gln His Lys Gln Arg Arg Cys Ser Leu Ala Ser
355 360 365
Val Glu Met Ser Ala Val Ala Pro Pro Pro Ala Ser Asn Gly Asn Leu
370 375 380
Leu Tyr Ile Gly Phe Arg Gly Leu Asp Gly Val His Cys Val Pro Thr
385 390 395 400
Pro Asp Ser Gly Val Val Cys Gly Arg Met Ala Cys Ser Pro Thr His
405 410 415
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Leu Ala Lys Ile Leu Glu Glu Val Arg Tyr Ile Ala Asn Arg Phe Arg
435 440 445
Cys Gln Asp Glu Ser Glu Ala Val Cys Ser Glu Trp Lys Phe Ala Ala
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Cys Val Val Asp Arg Leu Cys Leu Met Ala Phe Ser Val Phe Thr Ile
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Ile Cys Thr Ile Gly Ile Leu Met Ser Ala Pro Asn Phe Val Glu Ala
485 490 495
Val Ser Lys Asp Phe Ala
500
<210> 26
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 26
Met Tyr Ser Phe Asn Thr Leu Arg Leu Tyr Leu Trp Glu Thr Ile Val
1 5 10 15
Phe Phe Ser Leu Ala Ala Ser Lys Glu Ala Glu Ala Ala Arg Ser Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Met Ser Pro Ser Asp Phe Leu Asp Lys Leu Met Gly Arg
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Thr Ser Gly Tyr Asp Ala Arg Ile Arg Pro Asn Phe Lys Gly Pro Pro
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65 70 75 80
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Asn Met Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Gly Leu Gly Ile Thr Thr Val
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Phe Val Phe Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Val Asn Phe Val Ser
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<210> 27
<211> 452
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 27
Met Asn Arg Gln Leu Val Asn Ile Leu Thr Ala Leu Phe Ala Phe Phe
1 5 10 15
Leu Glu Thr Asn His Phe Arg Thr Ala Phe Cys Lys Asp His Asp Ser
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Lys Pro Asp Leu Phe Phe Ala Asn Glu Lys Gly Ala Asn Phe His Asp
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Val Thr Thr Asp Asn Lys Leu Leu Arg Ile Ser Lys Asn Gly Lys Val
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Glu Glu Lys Glu Leu Gly Tyr Cys Thr Lys His Tyr Asn Thr Gly Lys
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Phe Thr Cys Ile Glu Val Lys Phe His Leu Glu Arg Gln Met Gly Tyr
245 250 255
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Trp Val Ser Phe Trp Ile Asn Met Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Ala
275 280 285
Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Gln Ser Ser Gly Ser
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Arg Ala Ser Leu Pro Lys Val Ser Tyr Val Lys Ala Ile Asp Ile Trp
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Met Ala Val Cys Leu Leu Phe Val Phe Ala Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
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Arg Arg Gln Lys Arg Gln Asn Lys Glu Glu Asp Val Thr Arg Glu Ser
355 360 365
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Phe Asn Ile Phe Tyr Trp Ile Thr Tyr Lys Ile Ile Arg His Glu Asp
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Val His Lys Lys
450
<210> 28
<211> 464
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 28
Met Ala His Val Arg His Phe Arg Thr Leu Val Ser Gly Phe Tyr Phe
1 5 10 15
Trp Glu Ala Ala Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Thr Lys Glu Thr Asp
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Ser Ala Arg Ser Arg Ser Ala Pro Met Ser Pro Ser Asp Phe Leu Asp
35 40 45
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50 55 60
Phe Lys Gly Pro Pro Val Asn Val Thr Cys Asn Ile Phe Ile Asn Ser
65 70 75 80
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Asp Asp Ser Leu Asp Leu Asp Pro Ser Met Leu Asp Ser Ile Trp Lys
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Pro Asp Leu Phe Phe Ala Asn Glu Lys Gly Ala Asn Phe His Glu Val
130 135 140
Thr Thr Asp Asn Lys Leu Leu Arg Ile Phe Lys Asn Gly Asn Val Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Arg Leu Thr Leu Thr Leu Ser Cys Pro Met Asp Leu Lys
165 170 175
Asn Phe Pro Met Asp Val Gln Thr Cys Ile Met Gln Leu Glu Ser Phe
180 185 190
Gly Tyr Thr Met Asn Asp Leu Ile Phe Glu Trp Gln Asp Glu Ala Pro
195 200 205
Val Gln Val Ala Glu Gly Leu Thr Leu Pro Gln Phe Leu Leu Lys Glu
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Glu Lys Asp Leu Arg Tyr Cys Thr Lys His Tyr Asn Thr Gly Lys Phe
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Thr Cys Ile Glu Val Arg Phe His Leu Glu Arg Gln Met Gly Tyr Tyr
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Leu Ile Gln Met Tyr Ile Pro Ser Leu Leu Ile Val Ile Leu Ser Trp
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Val Ser Phe Trp Ile Asn Met Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Ala Leu
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Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Gln Ser Ser Gly Ser Arg
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Ala Ser Leu Pro Lys Val Ser Tyr Val Lys Ala Ile Asp Ile Trp Met
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Ala Val Cys Leu Leu Phe Val Phe Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Ala
325 330 335
Val Asn Phe Val Ser Arg Gln His Lys Glu Leu Leu Arg Phe Arg Arg
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Lys Arg Lys Asn Lys Thr Glu Ala Phe Ala Leu Glu Lys Phe Tyr Arg
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Ala Tyr Gly Met Gly Pro Cys Leu Gln Ala Lys Asp Gly Met Thr Pro
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Lys Gly Pro Asn His Pro Val Gln Val Met Pro Lys Ser Pro Asp Glu
405 410 415
Met Arg Lys Val Phe Ile Asp Arg Ala Lys Lys Ile Asp Thr Ile Ser
420 425 430
Arg Ala Cys Phe Pro Leu Ala Phe Leu Ile Phe Asn Ile Phe Tyr Trp
435 440 445
Val Ile Tyr Lys Ile Leu Arg His Glu Asp Ile His Gln Gln Gln Asp
450 455 460
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 29
Met Ala His Val Arg His Phe Arg Thr Leu Val Ser Gly Phe Tyr Phe
1 5 10 15
Trp Glu Ala Ala Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Thr Lys Glu Thr Asp
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Ser Ala Arg Ser Arg Ser Ala Pro Met Ser Pro Ser Asp Phe Leu Asp
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50 55 60
Phe Lys Gly Pro Pro Val Asn Val Thr Cys Asn Ile Phe Ile Asn Ser
65 70 75 80
Phe Gly Ser Ile Ala Glu Thr Thr Met Asp Tyr Arg Val Asn Ile Phe
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Leu Arg Gln Lys Trp Asn Asp Pro Arg Leu Ala Tyr Ser Glu Tyr Pro
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Asp Asp Ser Leu Asp Leu Asp Pro Ser Met Leu Asp Ser Ile Trp Lys
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Pro Asp Leu Phe Phe Ala Asn Glu Lys Gly Ala Asn Phe His Glu Val
130 135 140
Thr Thr Asp Asn Lys Leu Leu Arg Ile Phe Lys Asn Gly Asn Val Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Arg Leu Thr Leu Thr Leu Ser Cys Pro Met Asp Leu Lys
165 170 175
Asn Phe Pro Met Asp Val Gln Thr Cys Ile Met Gln Leu Glu Ser Phe
180 185 190
Gly Tyr Thr Met Asn Asp Leu Ile Phe Glu Trp Gln Asp Glu Ala Pro
195 200 205
Val Gln Val Ala Glu Gly Leu Thr Leu Pro Gln Phe Leu Leu Lys Glu
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Glu Lys Asp Leu Arg Tyr Cys Thr Lys His Tyr Asn Thr Gly Lys Phe
225 230 235 240
Thr Cys Ile Glu Val Arg Phe His Leu Glu Arg Gln Met Gly Tyr Tyr
245 250 255
Leu Ile Gln Met Tyr Ile Pro Ser Leu Leu Ile Val Ile Leu Ser Trp
260 265 270
Val Ser Phe Trp Ile Asn Met Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Ala Leu
275 280 285
Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr Met Thr Thr Gln Ser Ser Gly Ser Arg
290 295 300
Ala Ser Leu Pro Lys Val Ser Tyr Val Lys Ala Ile Asp Ile Trp Met
305 310 315 320
Ala Val Cys Leu Leu Phe Val Phe Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Ala
325 330 335
Val Asn Phe Val Ser Arg Gln His Lys Glu Leu Leu Arg Phe Arg Arg
340 345 350
Lys Arg Lys Asn Lys Asp Asp Glu Val Arg Glu Ser Arg Phe Ser Phe
355 360 365
Thr Ala Tyr Gly Met Gly Pro Cys Leu Gln Ala Lys Asp Gly Met Thr
370 375 380
Pro Lys Gly Pro Asn His Pro Val Gln Val Met Pro Lys Ser Pro Asp
385 390 395 400
Glu Met Arg Lys Val Phe Ile Asp Arg Ala Lys Lys Ile Asp Thr Ile
405 410 415
Ser Arg Ala Cys Phe Pro Leu Ala Phe Leu Ile Phe Asn Ile Phe Tyr
420 425 430
Trp Val Ile Tyr Lys Ile Leu Arg His Glu Asp Ile His Gln Gln Gln
435 440 445
Asp
<210> 30
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Met Arg Cys Ser Pro Gly Gly Val Trp Leu Ala Leu Ala Ala Ser Leu
1 5 10 15
Leu His Val Ser Leu Gln Gly Glu Phe Gln Arg Lys Leu Tyr Lys Glu
20 25 30
Leu Val Lys Asn Tyr Asn Pro Leu Glu Arg Pro Val Ala Asn Asp Ser
35 40 45
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50 55 60
Val Asp Glu Thr Thr Met Val Leu Thr Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met
65 70 75 80
Ser Trp Thr Asp His Tyr Leu Gln Trp Asn Val Ser Glu Tyr Pro Gly
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100 105 110
Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Arg Phe Asp Ala Thr Phe His Thr
115 120 125
Asn Val Leu Val Asn Ser Ser Gly His Cys Gln Tyr Leu Pro Pro Gly
130 135 140
Ile Phe Lys Ser Ser Cys Pro Met Asp Leu Lys Asn Phe Pro Met Asp
145 150 155 160
Val Gln Thr Cys Lys Leu Lys Phe Gly Ser Trp Ser Tyr Gly Gly Trp
165 170 175
Ser Leu Asp Leu Gln Met Gln Glu Ala Asp Ile Ser Gly Tyr Ile Pro
180 185 190
Asn Gly Glu Trp Asp Leu Val Gly Ile Pro Gly Lys Arg Ser Glu Arg
195 200 205
Phe Tyr Glu Cys Cys Lys Glu Pro Tyr Pro Asp Val Thr Phe Thr Val
210 215 220
Thr Met Arg Arg Arg Met Gly Tyr Tyr Leu Ile Gln Met Tyr Ile Pro
225 230 235 240
Ser Leu Leu Ile Val Ile Leu Ser Trp Ile Ser Phe Trp Ile Asn Met
245 250 255
Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Gly Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr
260 265 270
Met Thr Thr Gln Ser Ser Gly Ser Arg Ala Ser Leu Pro Lys Val Ser
275 280 285
Tyr Val Lys Ala Ile Asp Ile Trp Met Ala Val Cys Leu Leu Phe Val
290 295 300
Phe Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Val Asn Phe Val Ser Arg Gln
305 310 315 320
His Lys Glu Leu Leu Arg Phe Arg Arg Lys Arg Arg His His Lys Ser
325 330 335
Pro Met Leu Asn Leu Phe Gln Glu Asp Glu Ala Gly Glu Gly Arg Phe
340 345 350
Asn Phe Ser Ala Tyr Gly Met Gly Pro Ala Cys Leu Gln Ala Lys Asp
355 360 365
Gly Ile Ser Val Lys Gly Ala Asn Asn Ser Asn Thr Thr Asn Pro Pro
370 375 380
Pro Ala Pro Ser Lys Ser Pro Glu Glu Met Arg Lys Leu Phe Ile Gln
385 390 395 400
Arg Ala Lys Lys Ile Asp Lys Ile Ser Arg Ile Gly Phe Pro Met Ala
405 410 415
Phe Leu Ile Phe Asn Met Phe Tyr Trp Ile Ile Tyr Lys Ile Val Arg
420 425 430
Arg Glu Asp Val His Asn Gln
435
<210> 31
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Met Arg Cys Ser Pro Gly Gly Val Trp Leu Ala Leu Ala Ala Ser Leu
1 5 10 15
Leu His Val Ser Leu Gln Gly Glu Phe Gln Arg Lys Leu Tyr Lys Glu
20 25 30
Leu Val Lys Asn Tyr Asn Pro Leu Glu Arg Pro Val Ala Asn Asp Ser
35 40 45
Gln Pro Leu Thr Val Tyr Phe Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ile Met Asp
50 55 60
Val Asp Glu Lys Asn Gln Val Leu Thr Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met
65 70 75 80
Ser Trp Thr Asp His Tyr Leu Gln Trp Asn Val Ser Glu Tyr Pro Gly
85 90 95
Val Lys Thr Val Arg Phe Pro Asp Gly Gln Ile Trp Lys Pro Asp Ile
100 105 110
Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Arg Phe Asp Ala Thr Phe His Thr
115 120 125
Asn Val Leu Val Asn Ser Ser Gly His Cys Gln Tyr Leu Pro Pro Gly
130 135 140
Ile Phe Lys Ser Ser Cys Tyr Ile Asp Val Arg Trp Phe Pro Phe Asp
145 150 155 160
Val Gln His Cys Lys Leu Lys Phe Gly Ser Trp Ser Tyr Gly Gly Trp
165 170 175
Ser Leu Asp Leu Gln Met Gln Glu Ala Asp Ile Ser Gly Tyr Ile Pro
180 185 190
Asn Gly Glu Trp Asp Leu Val Gly Ile Pro Gly Lys Arg Ser Glu Arg
195 200 205
Phe Tyr Glu Cys Cys Lys Glu Pro Tyr Pro Asp Val Thr Phe Thr Val
210 215 220
Thr Met Arg Arg Arg Met Gly Tyr Tyr Leu Ile Gln Met Tyr Ile Pro
225 230 235 240
Ser Leu Leu Ile Val Ile Leu Ser Trp Ile Ser Phe Trp Ile Asn Met
245 250 255
Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Gly Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr
260 265 270
Met Thr Thr Gln Ser Ser Gly Ser Arg Ala Ser Leu Pro Lys Val Ser
275 280 285
Tyr Val Lys Ala Ile Asp Ile Trp Met Ala Val Cys Leu Leu Phe Val
290 295 300
Phe Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Val Asn Phe Val Ser Arg Gln
305 310 315 320
His Lys Glu Leu Leu Arg Phe Arg Arg Lys Arg Arg His His Lys Ser
325 330 335
Pro Met Leu Asn Leu Phe Gln Glu Asp Glu Ala Gly Glu Gly Arg Phe
340 345 350
Asn Phe Ser Ala Tyr Gly Met Gly Pro Ala Cys Leu Gln Ala Lys Asp
355 360 365
Gly Ile Ser Val Lys Gly Ala Asn Asn Ser Asn Thr Thr Asn Pro Pro
370 375 380
Pro Ala Pro Ser Lys Ser Pro Glu Glu Met Arg Lys Leu Phe Ile Gln
385 390 395 400
Arg Ala Lys Lys Ile Asp Lys Ile Ser Arg Ile Gly Phe Pro Met Ala
405 410 415
Phe Leu Ile Phe Asn Met Phe Tyr Trp Ile Ile Tyr Lys Ile Val Arg
420 425 430
Arg Glu Asp Val His Asn Gln
435
<210> 32
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
atgcgctgct cgccgggagg cgtctggctg gcgctggccg cgtcgctcct gcacgtgtcc 60
ctgcaaggcg agttccagag gaagctttac aaggagctgg tcaagaacta caatcccttg 120
gagaggcccg tggccaatga ctcgcaacca ctcaccgtct acttctccct gagcctcctg 180
cagatcatgg acgtggatga gaagaaccaa gttttaacca ccaacatttg gctgcaaatg 240
tcttggacag atcactattt acagtggaat gtgtcagaat atccaggggt gaagactgtt 300
cgtttcccag atggccagat ttggaaacca gacattcttc tctataacag tgctgatgag 360
cgctttgacg ccacattcca cactaacgtg ttggtgaact cttctgggca ttgccagtac 420
ctgcctccag gcatattcaa gagttcctgc cccatggact tgaagaattt ccccatggat 480
gtccagacat gcaaactgaa gtttgggtcc tggtcttacg gaggctggtc cttggatctg 540
cagatgcagg aggcagatat cagtggctat atccccaatg gagaatggga cctagtggga 600
atccccggca agaggagtga aaggttctat gagtgctgca aagagcccta ccccgatgtc 660
accttcacag tgaccatgcg ccgcaggatg ggttactacc tgattcagat gtatattccc 720
agcctgctca ttgtcatcct ctcatggatc tccttctgga tcaacatgga tgctgcacct 780
gctcgtgtgg gcctaggcat caccactgtg ctcaccatga ccacccagag ctccggctct 840
cgagcatctc tgcccaaggt gtcctatgtg aaagccattg acatttggat ggcagtttgc 900
ctgctctttg tgttctcagc cctattagaa tatgctgccg ttaactttgt gtctcggcaa 960
cataaggagc tgctccgatt caggaggaag cggagacatc acaagagccc catgttgaat 1020
ctattccagg aggatgaagc tggagaaggc cgctttaact tctctgccta tgggatgggc 1080
ccagcctgtc tacaggccaa ggatggcatc tcagtcaagg gcgccaacaa cagtaacacc 1140
accaaccccc ctcctgcacc atctaagtcc ccagaggaga tgcgaaaact cttcatccag 1200
agggccaaga agatcgacaa aatatcccgc attggcttcc ccatggcctt cctcattttc 1260
aacatgttct actggatcat ctacaagatt gtccgtagag aggacgtcca caaccagtga 1320
<210> 33
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Met Arg Cys Ser Pro Gly Gly Val Trp Leu Ala Leu Ala Ala Ser Leu
1 5 10 15
Leu His Val Ser Leu Gln Gly Glu Phe Gln Arg Lys Leu Tyr Lys Glu
20 25 30
Leu Val Lys Asn Tyr Asn Pro Leu Glu Arg Pro Val Ala Asn Asp Ser
35 40 45
Gln Pro Leu Thr Val Tyr Phe Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ile Met Asp
50 55 60
Val Asp Glu Lys Asn Gln Val Leu Thr Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met
65 70 75 80
Ser Trp Thr Asp His Tyr Leu Gln Trp Asn Val Ser Glu Tyr Pro Gly
85 90 95
Val Lys Thr Val Arg Phe Pro Asp Gly Gln Ile Trp Lys Pro Asp Ile
100 105 110
Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Arg Phe Asp Ala Thr Phe His Thr
115 120 125
Asn Val Leu Val Asn Ser Ser Gly His Cys Gln Tyr Leu Pro Pro Gly
130 135 140
Ile Phe Lys Ser Ser Cys Pro Met Asp Leu Lys Asn Phe Pro Met Asp
145 150 155 160
Val Gln Thr Cys Lys Leu Lys Phe Gly Ser Trp Ser Tyr Gly Gly Trp
165 170 175
Ser Leu Asp Leu Gln Met Gln Glu Ala Asp Ile Ser Gly Tyr Ile Pro
180 185 190
Asn Gly Glu Trp Asp Leu Val Gly Ile Pro Gly Lys Arg Ser Glu Arg
195 200 205
Phe Tyr Glu Cys Cys Lys Glu Pro Tyr Pro Asp Val Thr Phe Thr Val
210 215 220
Thr Met Arg Arg Arg Met Gly Tyr Tyr Leu Ile Gln Met Tyr Ile Pro
225 230 235 240
Ser Leu Leu Ile Val Ile Leu Ser Trp Ile Ser Phe Trp Ile Asn Met
245 250 255
Asp Ala Ala Pro Ala Arg Val Gly Leu Gly Ile Thr Thr Val Leu Thr
260 265 270
Met Thr Thr Gln Ser Ser Gly Ser Arg Ala Ser Leu Pro Lys Val Ser
275 280 285
Tyr Val Lys Ala Ile Asp Ile Trp Met Ala Val Cys Leu Leu Phe Val
290 295 300
Phe Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Val Asn Phe Val Ser Arg Gln
305 310 315 320
His Lys Glu Leu Leu Arg Phe Arg Arg Lys Arg Arg His His Lys Ser
325 330 335
Pro Met Leu Asn Leu Phe Gln Glu Asp Glu Ala Gly Glu Gly Arg Phe
340 345 350
Asn Phe Ser Ala Tyr Gly Met Gly Pro Ala Cys Leu Gln Ala Lys Asp
355 360 365
Gly Ile Ser Val Lys Gly Ala Asn Asn Ser Asn Thr Thr Asn Pro Pro
370 375 380
Pro Ala Pro Ser Lys Ser Pro Glu Glu Met Arg Lys Leu Phe Ile Gln
385 390 395 400
Arg Ala Lys Lys Ile Asp Lys Ile Ser Arg Ile Gly Phe Pro Met Ala
405 410 415
Phe Leu Ile Phe Asn Met Phe Tyr Trp Ile Ile Tyr Lys Ile Val Arg
420 425 430
Arg Glu Asp Val His Asn Gln
435
<210> 34
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Glu Lys Ile Ser Leu Gly Ile Thr Val Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe
1 5 10 15
Met Leu Leu Val Ala Glu
20
<210> 35
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Pro Ala Lys Ile Gly Leu Gly Ile Thr Val Leu Leu Ser Leu Thr Thr
1 5 10 15
Phe Met Ser Gly Val Ala Asn
20

Claims (121)

1.一种治疗有需要的受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元，并且其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经性疼痛是周围神经病。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经性疼痛是三叉神经痛。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是包含衣壳多肽的AAV9-TV载体，所述衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
5.一种转导神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含异源核酸。
7.一种将异源核酸递送至神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导iPSC来源的神经元的AAV载体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2、AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF或AAV-PHP.S载体。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV9-TV载体。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV5载体。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2.5-TV2YF载体。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3和5-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:5-7和9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述衣壳多肽在对应于SEQ ID NO:8的T492的位置处包含非苏氨酸突变。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述非苏氨酸突变是缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述非苏氨酸突变是缬氨酸取代。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述神经元是背根神经节神经元。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述神经元是三叉神经节神经元。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述神经元包含同工凝集素B4(IB4)阳性神经纤维。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述神经元包含NF200阳性神经纤维。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述神经元包含CGRP阳性神经纤维。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述神经元包含C纤维。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述神经元包含Aδ纤维。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用所述AAV载体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中将所述AAV载体通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
30.一种治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体在所述受试者中转导神经元，并且其中所述神经元是海马体神经元。
31.一种转导神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是海马体神经元。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述AAV载体包含异源核酸。
33.一种将异源核酸递送至神经元的方法，所述方法包括使所述神经元与包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体接触，其中所述神经元是海马体神经元。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择所述AAV载体作为能够体外转导胚胎海马体神经元的AAV载体。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2、AAV2.5、AAV2.5-TV、AAV2.5-2YF、AAV2.5-TV2YF、AAV5、AAV6、AAV9、AAV9-TV、AAV9-2YF、AAV9-TV2YF或AAV-PHP.S载体。
37.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV9载体。
38.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV9-TV载体。
39.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6载体。
40.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV5载体。
41.根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
42.根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:3和5-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
43.根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:6-9中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
44.根据权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含衣壳多肽，所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述神经元是兴奋性神经元。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述神经元是CAMK2阳性神经元。
47.根据权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述神经元是抑制性神经元。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经元是GABA能神经元。
49.根据权利要求30-48中任一项所述的方法，其中所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
50.根据权利要求30-49中任一项所述的方法，其中通过颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体。
52.根据权利要求6-29和32-51中任一项所述的方法，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述配体门控离子通道包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述配体结合结构域包含与SEQ ID NO:25的氨基酸残基23-220具有至少85％同一性的氨基酸序列。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQ IDNO:25的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的残基的残基处的氨基酸突变。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述配体结合结构域包含表3中列出的一个或多个氨基酸突变。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101W、Y115E和Y210W的突变。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101W和Y210V的突变。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:33中的R101M和L131F的突变。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述离子孔结构域包含与SEQ ID NO:26的氨基酸255-457、SEQ ID NO:27的260-452、SEQ ID NO:28的氨基酸259-464或SEQ ID NO:29的氨基酸259-449具有至少85％同一性的氨基酸序列。
62.根据权利要求53-61中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含源自所述人甘氨酸受体的Cys-环结构域。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-172。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-180。
65.根据权利要求53-64中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含来自人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述β1-2环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸81-84。
67.根据权利要求53-66中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1，并且其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
68.根据权利要求52-67中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用所述配体门控离子通道的配体。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述配体选自AZD-0328、TC-6987、ABT-126、TC-5619、TC-6683、伐尼克兰和法西克兰/RG3487。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述配体是TC-5619或ABT-126。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述受试者是灵长类动物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述受试者是人，任选地是成年人。
73.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；其中所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
(b)用于施用所述AAV载体以转导背根神经节神经元或三叉神经节神经元的说明书。
74.根据权利要求73所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适于经由鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用所述AAV载体的装置。
75.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述装置适于通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
76.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)包含衣壳多肽的腺相关病毒(AAV)载体；其中所述衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1-12中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；
(b)用于施用所述AAV载体以转导海马体神经元的说明书。
77.根据权利要求76所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适于经由颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述AAV载体的装置。
78.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述装置适于通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用。
79.根据权利要求73-78中任一项所述的试剂盒，其中所述AAV载体包含编码配体门控离子通道的异源核酸。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
81.根据权利要求79或80所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含所述配体门控离子通道的配体。
82.根据权利要求81所述的试剂盒，其中所述配体是TC-5619或ABT-126。
83.一种治疗有需要的受试者的神经性疼痛的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的背根神经节神经元或三叉神经节神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述神经性疼痛是周围神经病。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述神经性疼痛是三叉神经痛。
86.根据权利要求83-85中任一项所述的方法，其中通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用来施用所述异源核酸。
87.根据权利要求86所述的方法，其中将所述异源核酸通过神经节内(IG)施用直接施用至背根神经节或三叉神经节中。
88.根据权利要求83-87中任一项所述的方法，其中所述异源核酸包含在载体内。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体转导所述背根神经节神经元或三叉神经节神经元。
90.根据权利要求83-89中任一项所述的方法，其中所述神经元包含同工凝集素B4(IB4)阳性神经纤维。
91.根据权利要求83-90中任一项所述的方法，其中所述神经元包含NF200阳性神经纤维。
92.根据权利要求83-91中任一项所述的方法，其中所述神经元包含CGRP阳性神经纤维。
93.根据权利要求83-92中任一项所述的方法，其中所述神经元包含C纤维。
94.根据权利要求83-92中任一项所述的方法，其中所述神经元包含Aδ纤维。
95.一种治疗有需要的受试者的局灶性癫痫的方法，所述方法包括施用有效量的异源核酸，其中所述异源核酸被递送至所述受试者的海马体神经元，其中所述异源核酸包含编码配体门控离子通道的多核苷酸序列。
96.根据权利要求95所述的方法，其中通过颅内施用、鞘内(脊髓)施用、鞘内(小脑延髓池)施用、脑内施用、脑室内施用或直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述异源核酸。
97.根据权利要求96所述的方法，其中通过直接注射到海马体中的癫痫灶中来施用所述异源核酸。
98.根据权利要求95-97中任一项所述的方法，其中所述异源核酸包含在载体内。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述载体是病毒载体，并且其中所述病毒载体转导所述海马体神经元。
100.根据权利要求95-99中任一项所述的方法，其中所述神经元是兴奋性神经元。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述神经元是CAMK2阳性神经元。
102.根据权利要求95-99中任一项所述的方法，其中所述神经元是抑制性神经元。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述神经元是GABA能神经元。
104.根据权利要求95-103中任一项所述的方法，其中所述局灶性癫痫是内侧颞叶癫痫(mTLE)。
105.根据权利要求83-104中任一项所述的方法，其中所述配体门控离子通道包含源自人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7-nAChR)的配体结合结构域和源自人甘氨酸受体的离子孔结构域。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述配体结合结构域包含与SEQ ID NO:25的氨基酸残基23-220具有至少85％同一性的氨基酸序列。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQID NO:25的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的残基的残基处的氨基酸突变。
108.根据权利要求105或106所述的方法，其中所述配体结合结构域包含表3中列出的一个或多个氨基酸突变。
109.根据权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述离子孔结构域包含与SEQ ID NO:26的氨基酸255-457、SEQ ID NO:27的260-452、SEQ ID NO:28的氨基酸259-464或SEQ ID NO:29的氨基酸259-449具有至少85％同一性的氨基酸序列。
111.根据权利要求105-110中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含源自所述人甘氨酸受体的Cys-环结构域。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-172。
113.根据权利要求111所述的方法，其中所述Cys-环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸166-180。
114.根据权利要求105-113中任一项所述的方法，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含来自人甘氨酸受体α1亚基的β1-2环结构域。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述β1-2环结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸81-84。
116.根据权利要求105-115中任一项所述的方法，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1，并且其中所述配体门控离子通道包含与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
117.根据权利要求83-116中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用所述配体门控离子通道的配体。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述配体选自AZD-0328、TC-6987、ABT-126、TC-5619、TC-6683、伐尼克兰和法西克兰/RG3487。
119.根据权利要求117所述的方法，其中所述配体是TC-5619或ABT-126。
120.根据权利要求83-119中任一项所述的方法，其中所述受试者是灵长类动物。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述受试者是人，任选地是成年人。
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