KR20230149241A - Il-32쎄타 뮤턴트를 포함하는 조성물 내지 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IL-32θ 뮤턴트(mutant)를 포함하는 염증성 질환 및/또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)는 염증성 사이토카인 및 케모카인, 염증 매개인자의 및 암의 전이와 증식을 세포 내 경로를 통해서 억제하고, 인간 제대정맥 내피세포 (HUVEC)의 세포내 접착 분자-1(ICAM-1) 및 혈관세포 접착분자-1(VCAM-1)의 발현을 억제하여 단핵구-혈관 내피세포의 접착 저해를 통한 죽상동맥경화증과 같은 염증성 질환의 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다. 또한 각종 암 및/또는 염증성 질환에 대한 연구 재료로도 활용될 수 있다.
본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)는 염증성 사이토카인 및 케모카인, 염증 매개인자의 및 암의 전이와 증식을 세포 내 경로를 통해서 억제하고, 인간 제대정맥 내피세포 (HUVEC)의 세포내 접착 분자-1(ICAM-1) 및 혈관세포 접착분자-1(VCAM-1)의 발현을 억제하여 단핵구-혈관 내피세포의 접착 저해를 통한 죽상동맥경화증과 같은 염증성 질환의 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다. 또한 각종 암 및/또는 염증성 질환에 대한 연구 재료로도 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 IL-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 암 및/또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
이전에 NK4로 알려진 IL-32는 미토겐(mitogen) 또는 IL-2에 의한 자극 후 활성화된 인간 T 세포 및 NK 세포에서 발현된다. 이전 연구에서는 NK4가 고전적인 사이토카인 신호 전달 경로를 통해 여러 면역 세포에서 IL-8, TNF-α 및 MIP-2와 같은 전염증성 사이토카인을 유도했지만 다른 사이토카인과의 서열 상동성이 결여되어 있음을 보여주었다. 따라서 인터루킨 계열 중 하나인 IL-32로 이름이 변경되었다. 수많은 연구에서 IL-32가 암 성장 및 발달, 바이러스 감염, 크론병, 염증성 장질환, 류마티스 관절염과 같은 만성 염증성 질환과 관련이 있다고 보고했으며, 이는 IL-32가 사이토카인으로서 기능하는 능력을 나타냈다. IL-32 유전자는 8개의 엑손을 포함하며 구조가 다른 몇 가지 스플라이스 변이체가 있다. IL-32α, IL-32β, IL-32γ 및 IL-32δ는 NK 세포에서 처음 발견되었으며 IL-32γ 는 IL-32 이소형 중에서 가장 긴 서열을 가지고 있다. IL-32ε, IL-32ζ, IL-32η, IL-32θ, IL-32sm이 추가로 동정되었으며 총 9종의 이소형이 보고되었다. IL-32에 대한 초기 연구는 그것이 전염증성 사이토카인 임을 시사한다. 그러나 개별 이소형에 대한 추가 연구는 그들이 다른 역할을 한다는 것을 보여준다.
IL-32 이소형 중 하나인 IL-32θ는 IL-32sm을 제외하고 엑손 6이 결실된 유일한 이소형이다. IL-32θ에 대한 이전 연구는 과발현에 국한되었고, 그 특정 수용체가 명확하게 확인되지 않았다. IL-32α 및 IL-32β는 인테그린 αVβ3 및 인테그린 αVβ6 에 결합하는 것으로 보고되었다.
유방암은 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 암(전체의 11.7%) 중 하나이며 사망의 주요 원인(모든 사망 원인의 6.9%)으로 나타났다. 이는 여성(24.5%)에서 가장 자주 진단되는 암이며 2020년에 암 관련 사망(15.5%)의 주요 원인 중 하나였다. 유방암의 세계적 발생률은 1980년대와 1990년대에 급격히 증가한 반면, 폐경기 호르몬 요법의 발달로 인해 2000년대 초반에는 발생률이 감소하였다. 그러나 유방암 아형은 세 종류의 수용체, 즉 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 인간 표피 성장인자 수용체 2의 부재 또는 존재에 의해 식별된다. 이러한 수용체가 유방암 세포의 표면에서 발현되기 때문에 삼중 음성 유방암(TNBC)은 호르몬 요법의 성공을 감소시키며 이는 대체 치료 전략을 개발할 필요성을 나타낸다. 암 면역학은 암 치료에서 가장 흥미로운 연구 주제 50개 중 하나로 부상했다. 여러 사이토카인, 케모카인 및 암 진행에서 염증 매개체의 역할이 염증, 혈관신생, 항 아폽토시스, 이동 및 증식과 관련하여 연구되었다. 특히, 종양 미세환경에서 가장 풍부한 세포 중 하나인 종양 관련 대식세포(TAM)는 혈관신생, 전이 및 증식을 유도한다. 종양 침윤 면역 세포는 암에서 여러 염증 분자를 자극한다. 2005년 염증성 사이토카인으로 발견된 이후 IL-32의 여러 이소형은 알레르기, 비만, 뇌 질환과 같은 다양한 암과 염증 및 면역 질환에서 서로 다른 비정규적 역할을 하는 것으로 나타났다. 특히, 새로운 이소형인 IL-32θ는 전염증성 사이토카인과 케모카인뿐만 아니라 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 마커를 상당히 억제하는 것으로 보고되었다. IL-32에 대한 수많은 연구가 전 세계적으로 수행되었지만 유방암에서 IL-32 이소형의 기능은 아직 알려지지 않았다.
심혈관 질환(CVD, Cardiovascular disease)은 매년 1,670만 명이 사망하는 전 세계적으로 주요 사망 원인이며, 2030년까지 매년 2,360만 명이 CVD로 사망할 것으로 예측된다. 관상동맥질환(CAD)과 관상동맥질환의 가장 흔한 형태인 뇌혈관질환은 개인의 건강을 넘어 사회적 문제로 인식되고 있다. 만성 염증성 질환인 죽상동맥경화증이 근본 원인으로 확인되었다. 죽상동맥경화증은 내피세포의 염증과 손상 및 산화된 저밀도 지단백(ox-LDL)의 축적으로 인해 발생하며, 주변 조직의 섬유화와 혈관 내피세포, 평활근 세포 및 거품 세포로 구성된 플라크 형성을 특징으로 한다. 지질 함유 대식세포로 알려져 있다. 플라크 발달은 신체 여러 부위의 혈관에서 혈류를 방해하여 치명적인 질병을 초래한다. 죽상동맥경화성 병변 형성 초기 단계에서 가장 중요한 단계는 TEM(trans-endothelial migration)으로 단핵구나 백혈구와 같은 면역세포가 내피세포에 부착되어 내피세포 사이로 침투하여 조직으로 이동하는 것을 말한다. 혈관 내피 손상 및 그에 따른 염증 반응은 IL-1β 및 TNF-α 과 같은 염증성 사이토카인에 의해 내피 세포에서 세포내 접착 분자-1(ICAM-1) 및 혈관세포 접착분자-1(VCAM-1)과 같은 세포 접착 분자의 발현을 증가시킨다. 자유 부동 및 혈관 내피 인접 혈액 단핵구는 내피 세포에서 발현되는 ICAM-1 및 VCAM-1에 의해 붙잡힌다. 이러한 접착 분자는 단핵구에서 발현되는 림프구 기능 관련 항원 1(LFA-1) 및 VLA-4(very late antigen-4)와의 각각의 상호작용에 의해 단핵구-내피 접착을 촉진하여 결과적으로 TEM을 촉진한다. 혈관 내피를 통과한 단핵구는 대식세포로 분화되고 대식세포는 ox-LDL의 흡수를 통해 거품 세포를 생성하여 궁극적으로 죽상동맥경화증 및 플라크 발달의 발병기전으로 이어진다. 이전 연구에서는 IL-32β와 IL-32γ가 ICAM-1과 VCAM-1의 상향 조절에 관여하는 전염증성 사이토카인으로 작용한다고 보고된 바 있다. 그러나, CVD 에서 IL-32θ 또는 이의 돌연변이의 기능은 아직 알려지지 않았다.
이에 본 발명자들은 효과적으로 암 및/또는 염증성 질환 억제 효과를 제공할 수 있는 사이토카인을 제공하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 IL-32쎄타 뮤턴트는 염증 반응을 억제하고 면역작용에 의해 암 및/또는 염증성 질환을 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 암 및/또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 서열번호 3의 염기서열로 암호화되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
또한, 본 발명은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염증성 질환은 관절염, 류마티스 관절, 통풍, 간염, 천식, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
또한, 본 발명은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 항암용 면역치료제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 항염증용 면역치료제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant) 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트{IL-32θ mutant, IL-32θ(281T) 또는 IL-32θ(A94V)}는 NF-κB 경로를 조절하여 염증 인자의 발현을 억제하고, FAK/PI3K/AKT 경로를 통해 EMT 마커 및 세포 주기 관련 인자를 억제함으로써 암, 특히 유방암의 진행을 조절할 수 있다. 또한 IL-32θ(281T) 가 세포 표면 수용체인 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 에 결합하고 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 단핵구-내피 접착을 약화시킴으로써 동맥경화증과 같은 만성 염증성 질환에서 항염증 효과를 제공할 수 있다. 또한 각종 암 및/또는 염증성 질환에 대한 연구 재료로도 활용될 수 있다.
도 1은 유방암 조직(조직번호 65~80)에서 IL-32θ및 IL-32β의 mRNA 발현에 대한 RT-PCR 결과 일부를 나타낸다. 엑손 5에서 엑손 7까지의 서열을 표적으로 하는 프라이머(정방향 프라이머: 5'-ACGTGGACAGGTGATGTCGA-3, 서열번호 7'; 역방향 프라이머: 5'-GAGCAGCAGAAACTCTGGAA-3', 서열번호 8)는 IL-32θ를 검출하도록 설계되었다(297 bp).
도 2a는 유방암 및 주변 정상 조직에서의 생어(Sanger) 시퀀싱 데이터 중 하나를 나타낸다. IL-32θ의 점 돌연변이는 유방 종양 조직(n = 16)과 인접한 정상 조직(n = 18)의 무작위로 선택된 34개의 샘플에서 발견되었다. IL-32θ mRNA를 RT-PCR로 증폭하고 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리하였다.
도 2b는 야생형 IL-32θ(서열번호 4) 및 돌연변이 IL-32θ(281T)(서열번호 2)의 서열을 나타낸다. 돌연변이 지점은 빨간색으로 강조 표시된다. 야생형 서열은 GenBank(FJ985780.1)에서 검색되었다.
도 3은 유방 종양 조직에서 IL-32θ(281T) 발현 유무에 따른 염증성 인자(IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2), EMT 인자(N-cadherin, vimentin) 및 증식인자(CDK2, PCNA)의 RT-qPCR 결과를 나타낸다. 상자를 가로지르는 선은 중앙값을 나타낸다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 분석하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 501 0.0001, n = 90).
도 4a는 MDA-MB-231 세포에서 염증 인자의 mRNA 수준에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (A) 리포펙타민을 사용하여 EV- 및 IL-32θ(281T)-과발현 MDA-MB-231 세포를 확립하였다. (B) 형질감염된 MDA-MB-231 세포의 세포 형태학적 변화를 나타낸다. 스케일 바, 50μm.
도 4b는 MDA-MB-231 세포에서 염증 인자의 mRNA 수준에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (C, D) 염증 인자의 mRNA 수준은 암 유래 마크로파지(Tumor-associated macrophage) 유사 M2 마크로파지 분비 조절 배지(CM) 유무에 관계없이 RT-qPCR에 의해 확인되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(Student's t-test 및 Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 3).
도 5a는 IL-32θ(281T)의 사이토카인 발현 및 NF-κB의 핵 전위에 대한 조절 효과를 나타낸다. (A) IL-1β, IL-6 및 IL-8의 분비 수준은 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포로부터 얻은 상등액을 사용하여 ELISA로 분석하였다. (B, C) COX-2의 단백질 수준은 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다. 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화되었다. (D) 경쟁 ELISA에 의해 PGE2 수준을 정량화하였다. 막대 그래프는 각 샘플에 대한 내부 통제로 정규화한 후 웨스턴 블롯팅 밴드의 강도를 보여준다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다(Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 3).
도 5b는 IL-32θ(281T)의 사이토카인 발현 및 NF-κB의 핵 전위에 대한 조절 효과를 나타낸다. (E, F) 웨스턴 블롯 분석으로 얻은 NF-κB의 핵 전위에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. 막대 그래프는 각 샘플에 대한 내부 통제로 정규화한 후 웨스턴 블롯팅 밴드의 강도를 보여준다. 강도는 Image J를 사용하여 정량화되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다(Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 3).
도 6a는 유방암 세포 이동에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. 상처 치유 분석을 위해 MDA-MB-231 세포(1.5 x 105 세포/웰) 및 MDA-MB-468 세포(3 x 105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 시딩했다. 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 긁고 PBS로 세척하고 CM이 있거나 없는 무혈청 배지를 24시간 동안 첨가했다. 스케일 바, 200μm. 상처 부위는 Image J를 사용하여 정량화되었다.
도 6b는 유방암 세포 이동에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. 상처 치유 분석을 위해 MDA-MB-231 세포(1.5 x 105 세포/웰) 및 MDA-MB-468 세포(3 x 105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 시딩했다. 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 긁고 PBS로 세척하고 CM이 있거나 없는 무혈청 배지를 24시간 동안 첨가했다. 상처 부위는 Image J를 사용하여 정량화되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n=3).
도 7a는 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 상피-중간엽 전이 표지자에 미치는 조절 효과를 나타낸다. 상피-중간엽 전이 관련 단백질(fibronectin, N-cadherin, vimentin, E-cadherin) 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
도 7b는 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 상피-중간엽 전이 표지자에 미치는 조절 효과를 나타낸다. E-카데린 및 N-카데린 발현을 면역형광으로 분석하였다.
도 8은 IL-32θ(281T)가 유방암 세포 내 신호 전달 경로(FAK, PI3K, AKT, GSK3β, β-카테닌)에 미치는 조절 효과의 웨스턴 블롯팅 분석결과를 나타낸다. EV- 및 IL-32θ형질감염된 유방암 세포(2 × 105개 세포/ml)를 60pi 접시에 파종하고 48시간 동안 배양하였다.
도 9a는 유방암 세포의 증식에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (A) EV- 및 IL-32θ(281T)-형질감염된 유방암 세포의 시간 의존적 세포 생존능 분석 결과를 나타낸다. (B) EV- 및 IL-32θ(281T)-형질감염된 유방암 세포의 세포 증식 분석 결과를 나타낸다. EV- 및 IL-32θ(281T)-형질감염된 유방암 세포를 72시간 동안 배양하였다. (C) 웨스턴 블롯팅으로 측정한 유방암 세포에서 세포 주기 관련 인자(cyclin A, Cdk2, PCNA, p21)의 발현에 대한 IL-32θ(281T)의 영향을 나타낸다.
도 9b는 유방암 세포의 증식에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (D) PI 염색 및 유동 세포 계측법으로 분석한 세포주기 정지를 나타낸다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(Student's t-test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n=3).
도 10은 돌연변이된 IL-32θ(281T)가 세포 내 경로에 미치는 조절 효과의 개략도를 나타낸다. IL-32θ(281T)는 FAK 및 IκBα의 인산화를 억제한다. IL-32θ(281T)는 인산화된 FAK를 억제하여 β-카테닌의 발현 및 전위를 억제한다. 또한 NF-κB는 인산화된 IκBα의 억제를 통해 IL-32θ(281T)에 의해 억제된다. 따라서 IL-32θ(281T)는 FAK-PI3K-GSK3 및 NF-κB 경로를 통해 유방암의 이동, 증식 및 염증을 감소시킨다.
도 11은 돌연변이 IL-32θ(281T) 발현 벡터 및 IL-32θ(281T) 정제의 개략도를 나타낸다. 단백질 발현벡터로는 pTH24를 백본으로 하는 TEVSH를 사용하였다. His 태그는 정화를 위해 포함되었다. Nde1, Age1 제한 효소를 사용하여 재조합 DNA를 구성하였다.
도 12는 SDS-PAGE(A) 및 KU32-52 mAb(B) 또는 항-His 태그 mAb(C)를 사용한 웨스턴 블롯을 사용하여 IL-32θ(281T)의 발현 및 정제를 수행한 결과를 나타낸다. 돌연변이 IL-32θ(281T)를 Ni-NTA 컬럼에 이어 IL-32mAb(KU32-52) 결합 CNBr-활성화 세파로스 4B로 2회 정제했다. Ni-NTA 컬럼에 결합된 IL-32θ(281T)를 500mM 이미다졸(imidazole)로 용출하고, 낮은 pH 트리스-글리신 완충액(pH 3.0)을 사용하여 IL-32 mAb(KU32-52)-커플링된 CNBr-활성화 세파로스 4B에 의해 추가 정제를 수행하였다(L, IL-32θ(281T) 발현 벡터를 포함하는 대장균의 용해물; FT, flow through; W, washing flow; E, 용출(elution); E2-E13, 낮은 pH 트리스-글리신 완충액(pH 3.0)을 사용하여 용출됨).
도 13은 IL-32θ(A94V) 및 IL-32θ(A94V)-인테그린 결합 예측의 3D 구조 모델링 결과를 나타낸다. 단백질-단백질 결합은 HDOCK 서버(IL-32θ(A94V): 노란색, 인테그린: 주황색)에 의해 예측되었다. IL-32θ(A94V)의 3차 구조는 I-TASSER에 의해 구축되었고 인테그린은 PDB에 의해 제공되었다.
도 14a는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V) 결합을 나타낸다. IL-32θ(A94V)는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 결합한다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합을 IL-32 mAb(KU32-52)를 사용하여 평가하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 14b는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V) 결합을 나타낸다. 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합에 대한 cyclo-(RGDfV) 의 효과를 나타낸다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합을 IL-32 mAb(KU32-52)를 사용하여 평가하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 14c는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V) 결합을 나타낸다. 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합에 대한 FBS의 효과를 나타낸다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합을 IL-32 mAb(KU32-52)를 사용하여 평가하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 15는 TNF-α 자극 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 mRNA 발현에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. 인테그린 αV, β3 및 β6 서브유닛의 발현은 HUVEC 세포에서 RT-PCR에 의해 확인되었지만 THP-1 인간 단핵구 세포에서는 그렇지 않았다(A). HUVEC를 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리하고 TNF-α(10ng/mL)로 4시간 동안 자극했다. 부착 분자의 mRNA 발현은 RT-PCR(A) 및 RT-qPCR(B) 분석에 의해 검출되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 16은 TNF-α 자극 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC)에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 단백질 발현에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. HUVEC를 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리하고 TNF-α(10ng/mL)로 6시간 동안 자극했다. 접착 분자의 단백질 발현은 특정 항체를 이용한 면역형광으로 분석하였다.
도 17은 IL-32θ(A94V)는 HUVEC에 대한 단핵구 부착을 약화시킨다. (A) HUVEC에 대한 calcein 665 AM 표지 THP-1 세포(녹색) 부착의 형광 사진을 나타낸다. HUVEC는 IL-32θ(A94V)(100ng/ml)로 1시간 동안 전처리한 후 TNF-α로 6시간 동안 자극했다. 그런 다음, HUVEC를 calcein-AM-labeled THP-1과 함께 30분 동안 배양하였다. (B) 정량화된 THP-1-HUVEC 접착 결과를 대조군으로 정규화 했다. Image J 소프트웨어를 사용하여 형광을 측정했다. 각 이미지의 눈금 막대는 650μm를 나타낸다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(**** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 18은 HUVEC 세포에서 FAK, JNK 및 AKT의 인산화 수준에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. HUVEC를 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리한 후 TNF-α로 10분(FAK) 또는 15분(JNK, AKT) 자극했다. FAK, AKT 및 JNK의 인산화 수준은 웨스턴 블롯으로 확인하였고, 밴드 강도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화 하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by one-way ANOVA).
도 19는 HUVEC 세포에서 IκB의 인산화 수준과 NF-κB(p65/p50), AP-1(c-Fos/c-Jun)의 핵 전위에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. HUVEC 세포를 IL-32θ(A94V)와 함께 1시간 동안 배양한 다음 TNF-α(10 ng/ml)로 10분(IκB) 또는 30분(전사 인자) 동안 자극했다. 수확된 세포를 핵분획화하였다. 인산화 및 전위 수준은 웨스턴 블롯으로 분석하고 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(*p < 0.05, *** p < 0.001 by one-way ANOVA).
도 20은 TNF-α 유도 ICAM-1 및 VCAM-1 발현과 인테그린-IL-32θ(A94V) 결합 효과에 관련된 신호전달 경로의 개략도를 나타낸다. FAK, AKT, JNK의 TNF-α 유도 인산화 및 NF-κB, AP-1의 핵 전위는 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 촉진한다. IL-32θ(A94V)는 이러한 세포내 신호 전달 경로를 억제함으로써 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제한다.
도 2a는 유방암 및 주변 정상 조직에서의 생어(Sanger) 시퀀싱 데이터 중 하나를 나타낸다. IL-32θ의 점 돌연변이는 유방 종양 조직(n = 16)과 인접한 정상 조직(n = 18)의 무작위로 선택된 34개의 샘플에서 발견되었다. IL-32θ mRNA를 RT-PCR로 증폭하고 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리하였다.
도 2b는 야생형 IL-32θ(서열번호 4) 및 돌연변이 IL-32θ(281T)(서열번호 2)의 서열을 나타낸다. 돌연변이 지점은 빨간색으로 강조 표시된다. 야생형 서열은 GenBank(FJ985780.1)에서 검색되었다.
도 3은 유방 종양 조직에서 IL-32θ(281T) 발현 유무에 따른 염증성 인자(IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2), EMT 인자(N-cadherin, vimentin) 및 증식인자(CDK2, PCNA)의 RT-qPCR 결과를 나타낸다. 상자를 가로지르는 선은 중앙값을 나타낸다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 분석하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 501 0.0001, n = 90).
도 4a는 MDA-MB-231 세포에서 염증 인자의 mRNA 수준에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (A) 리포펙타민을 사용하여 EV- 및 IL-32θ(281T)-과발현 MDA-MB-231 세포를 확립하였다. (B) 형질감염된 MDA-MB-231 세포의 세포 형태학적 변화를 나타낸다. 스케일 바, 50μm.
도 4b는 MDA-MB-231 세포에서 염증 인자의 mRNA 수준에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (C, D) 염증 인자의 mRNA 수준은 암 유래 마크로파지(Tumor-associated macrophage) 유사 M2 마크로파지 분비 조절 배지(CM) 유무에 관계없이 RT-qPCR에 의해 확인되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(Student's t-test 및 Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 3).
도 5a는 IL-32θ(281T)의 사이토카인 발현 및 NF-κB의 핵 전위에 대한 조절 효과를 나타낸다. (A) IL-1β, IL-6 및 IL-8의 분비 수준은 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포로부터 얻은 상등액을 사용하여 ELISA로 분석하였다. (B, C) COX-2의 단백질 수준은 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포에서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다. 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화되었다. (D) 경쟁 ELISA에 의해 PGE2 수준을 정량화하였다. 막대 그래프는 각 샘플에 대한 내부 통제로 정규화한 후 웨스턴 블롯팅 밴드의 강도를 보여준다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다(Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 3).
도 5b는 IL-32θ(281T)의 사이토카인 발현 및 NF-κB의 핵 전위에 대한 조절 효과를 나타낸다. (E, F) 웨스턴 블롯 분석으로 얻은 NF-κB의 핵 전위에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. 막대 그래프는 각 샘플에 대한 내부 통제로 정규화한 후 웨스턴 블롯팅 밴드의 강도를 보여준다. 강도는 Image J를 사용하여 정량화되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다(Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 3).
도 6a는 유방암 세포 이동에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. 상처 치유 분석을 위해 MDA-MB-231 세포(1.5 x 105 세포/웰) 및 MDA-MB-468 세포(3 x 105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 시딩했다. 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 긁고 PBS로 세척하고 CM이 있거나 없는 무혈청 배지를 24시간 동안 첨가했다. 스케일 바, 200μm. 상처 부위는 Image J를 사용하여 정량화되었다.
도 6b는 유방암 세포 이동에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. 상처 치유 분석을 위해 MDA-MB-231 세포(1.5 x 105 세포/웰) 및 MDA-MB-468 세포(3 x 105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 시딩했다. 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 긁고 PBS로 세척하고 CM이 있거나 없는 무혈청 배지를 24시간 동안 첨가했다. 상처 부위는 Image J를 사용하여 정량화되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(Tukey's honest test 를 통한 One-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n=3).
도 7a는 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 상피-중간엽 전이 표지자에 미치는 조절 효과를 나타낸다. 상피-중간엽 전이 관련 단백질(fibronectin, N-cadherin, vimentin, E-cadherin) 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
도 7b는 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 상피-중간엽 전이 표지자에 미치는 조절 효과를 나타낸다. E-카데린 및 N-카데린 발현을 면역형광으로 분석하였다.
도 8은 IL-32θ(281T)가 유방암 세포 내 신호 전달 경로(FAK, PI3K, AKT, GSK3β, β-카테닌)에 미치는 조절 효과의 웨스턴 블롯팅 분석결과를 나타낸다. EV- 및 IL-32θ형질감염된 유방암 세포(2 × 105개 세포/ml)를 60pi 접시에 파종하고 48시간 동안 배양하였다.
도 9a는 유방암 세포의 증식에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (A) EV- 및 IL-32θ(281T)-형질감염된 유방암 세포의 시간 의존적 세포 생존능 분석 결과를 나타낸다. (B) EV- 및 IL-32θ(281T)-형질감염된 유방암 세포의 세포 증식 분석 결과를 나타낸다. EV- 및 IL-32θ(281T)-형질감염된 유방암 세포를 72시간 동안 배양하였다. (C) 웨스턴 블롯팅으로 측정한 유방암 세포에서 세포 주기 관련 인자(cyclin A, Cdk2, PCNA, p21)의 발현에 대한 IL-32θ(281T)의 영향을 나타낸다.
도 9b는 유방암 세포의 증식에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과를 나타낸다. (D) PI 염색 및 유동 세포 계측법으로 분석한 세포주기 정지를 나타낸다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(Student's t-test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n=3).
도 10은 돌연변이된 IL-32θ(281T)가 세포 내 경로에 미치는 조절 효과의 개략도를 나타낸다. IL-32θ(281T)는 FAK 및 IκBα의 인산화를 억제한다. IL-32θ(281T)는 인산화된 FAK를 억제하여 β-카테닌의 발현 및 전위를 억제한다. 또한 NF-κB는 인산화된 IκBα의 억제를 통해 IL-32θ(281T)에 의해 억제된다. 따라서 IL-32θ(281T)는 FAK-PI3K-GSK3 및 NF-κB 경로를 통해 유방암의 이동, 증식 및 염증을 감소시킨다.
도 11은 돌연변이 IL-32θ(281T) 발현 벡터 및 IL-32θ(281T) 정제의 개략도를 나타낸다. 단백질 발현벡터로는 pTH24를 백본으로 하는 TEVSH를 사용하였다. His 태그는 정화를 위해 포함되었다. Nde1, Age1 제한 효소를 사용하여 재조합 DNA를 구성하였다.
도 12는 SDS-PAGE(A) 및 KU32-52 mAb(B) 또는 항-His 태그 mAb(C)를 사용한 웨스턴 블롯을 사용하여 IL-32θ(281T)의 발현 및 정제를 수행한 결과를 나타낸다. 돌연변이 IL-32θ(281T)를 Ni-NTA 컬럼에 이어 IL-32mAb(KU32-52) 결합 CNBr-활성화 세파로스 4B로 2회 정제했다. Ni-NTA 컬럼에 결합된 IL-32θ(281T)를 500mM 이미다졸(imidazole)로 용출하고, 낮은 pH 트리스-글리신 완충액(pH 3.0)을 사용하여 IL-32 mAb(KU32-52)-커플링된 CNBr-활성화 세파로스 4B에 의해 추가 정제를 수행하였다(L, IL-32θ(281T) 발현 벡터를 포함하는 대장균의 용해물; FT, flow through; W, washing flow; E, 용출(elution); E2-E13, 낮은 pH 트리스-글리신 완충액(pH 3.0)을 사용하여 용출됨).
도 13은 IL-32θ(A94V) 및 IL-32θ(A94V)-인테그린 결합 예측의 3D 구조 모델링 결과를 나타낸다. 단백질-단백질 결합은 HDOCK 서버(IL-32θ(A94V): 노란색, 인테그린: 주황색)에 의해 예측되었다. IL-32θ(A94V)의 3차 구조는 I-TASSER에 의해 구축되었고 인테그린은 PDB에 의해 제공되었다.
도 14a는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V) 결합을 나타낸다. IL-32θ(A94V)는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 결합한다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합을 IL-32 mAb(KU32-52)를 사용하여 평가하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 14b는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V) 결합을 나타낸다. 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합에 대한 cyclo-(RGDfV) 의 효과를 나타낸다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합을 IL-32 mAb(KU32-52)를 사용하여 평가하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 14c는 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V) 결합을 나타낸다. 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합에 대한 FBS의 효과를 나타낸다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합을 IL-32 mAb(KU32-52)를 사용하여 평가하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 15는 TNF-α 자극 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 mRNA 발현에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. 인테그린 αV, β3 및 β6 서브유닛의 발현은 HUVEC 세포에서 RT-PCR에 의해 확인되었지만 THP-1 인간 단핵구 세포에서는 그렇지 않았다(A). HUVEC를 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리하고 TNF-α(10ng/mL)로 4시간 동안 자극했다. 부착 분자의 mRNA 발현은 RT-PCR(A) 및 RT-qPCR(B) 분석에 의해 검출되었다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 16은 TNF-α 자극 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC)에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 단백질 발현에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. HUVEC를 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리하고 TNF-α(10ng/mL)로 6시간 동안 자극했다. 접착 분자의 단백질 발현은 특정 항체를 이용한 면역형광으로 분석하였다.
도 17은 IL-32θ(A94V)는 HUVEC에 대한 단핵구 부착을 약화시킨다. (A) HUVEC에 대한 calcein 665 AM 표지 THP-1 세포(녹색) 부착의 형광 사진을 나타낸다. HUVEC는 IL-32θ(A94V)(100ng/ml)로 1시간 동안 전처리한 후 TNF-α로 6시간 동안 자극했다. 그런 다음, HUVEC를 calcein-AM-labeled THP-1과 함께 30분 동안 배양하였다. (B) 정량화된 THP-1-HUVEC 접착 결과를 대조군으로 정규화 했다. Image J 소프트웨어를 사용하여 형광을 측정했다. 각 이미지의 눈금 막대는 650μm를 나타낸다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다(**** p < 0.0001 by one-way ANOVA).
도 18은 HUVEC 세포에서 FAK, JNK 및 AKT의 인산화 수준에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. HUVEC를 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리한 후 TNF-α로 10분(FAK) 또는 15분(JNK, AKT) 자극했다. FAK, AKT 및 JNK의 인산화 수준은 웨스턴 블롯으로 확인하였고, 밴드 강도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화 하였다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(*p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by one-way ANOVA).
도 19는 HUVEC 세포에서 IκB의 인산화 수준과 NF-κB(p65/p50), AP-1(c-Fos/c-Jun)의 핵 전위에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과를 나타낸다. HUVEC 세포를 IL-32θ(A94V)와 함께 1시간 동안 배양한 다음 TNF-α(10 ng/ml)로 10분(IκB) 또는 30분(전사 인자) 동안 자극했다. 수확된 세포를 핵분획화하였다. 인산화 및 전위 수준은 웨스턴 블롯으로 분석하고 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다(*p < 0.05, *** p < 0.001 by one-way ANOVA).
도 20은 TNF-α 유도 ICAM-1 및 VCAM-1 발현과 인테그린-IL-32θ(A94V) 결합 효과에 관련된 신호전달 경로의 개략도를 나타낸다. FAK, AKT, JNK의 TNF-α 유도 인산화 및 NF-κB, AP-1의 핵 전위는 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 촉진한다. IL-32θ(A94V)는 이러한 세포내 신호 전달 경로를 억제함으로써 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
1. 항암 효과
본 발명에서는 생어(Sanger) 시퀀싱을 사용하여 유방암 환자(n = 34)의 조직에서 281번째 점 돌연변이(C에서 T로)를 발견했다(IL-32θ(281T)). 생어 시퀀싱의 한계로 인해 시퀀싱을 위해 PCR 밴드의 강도를 기반으로 선별된 환자의 조직에서 34개의 IL-32θ RT-PCR 제품을 사용했다. 선택된 모든 RT-PCR 생성물 서열은 94번째 코돈에서 알라닌을 발린으로 변형시키는 281번째 C에서 T로의 점 돌연변이를 보유하였다(281C>T, Ala94Val; 도 2a). 또한 IL-32θ(281T)가 종양 염증 및 유방암 진행에 미치는 영향을 조사하기 위해 종양 조직에서 RT-qPCR 결과를 재배열했다. 특히 염증인자(IL-1β, IL-8, COX-2), 중간엽 표지자(vimentin, N-cadherin), 증식 관련 인자(PCNA, CDK2)는 IL-32θ(281T)발현 종양 조직에서 유의하게 억제되었다. 이러한 결과는 IL-32θ(281T)가 종양 진행 및 발달을 억제함을 시사한다(도 3).
염증은 세균 및 바이러스 감염을 포함한 유해한 자극에 대한 면역계 반응이다. 그러나 염증에 의해 여러 질병이 유발된다. 다양한 염증 인자가 종양 형성을 진행시키는 것으로 밝혀졌다. IL-1β는 유방암에서 종양 증식, 혈관신생 및 이동을 시작하는 IL-1 계열의 주요 사이토카인이다. IL-6는 염증 반응, 혈관신생, 세포사멸 억제, 암 줄기세포 형성 및 유방암의 이동과 관련된 기능적 사이토카인이다. 마찬가지로 IL-8은 혈관신생, 종양 성장, 증식 및 전이와 관련이 있다. COX-2는 아라키돈산을 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 전구체인 프로스타글란딘 H2(PGH2)로 전이하도록 유도한다. PGE2는 종양 형성, 종양 진행, 혈관신생 및 유방암의 이동에 관여한다. 전사 인자 NF-κB는 IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2와 같은 염증 인자를 유도하는 것으로 보고되었다. IκBα는 단백질-단백질 상호작용을 통해 NF-κB의 전위를 조절하는 NF-κB 결합 단백질이다. NF-κB의 핵 전위는 AKT 인산화를 통한 IκBα의 분해에 의해 유발된다. 임상 결과를 바탕으로 매우 공격적인 삼중 음성 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 선택했다. RT-qPCR 분석은 염증 인자의 mRNA 수준이 MDA-MB-231 세포에서 IL-32θ(281T)에 의해 억제됨을 보여주었다(도 4b). 또한, COX-2의 단백질 발현량은 웨스턴 블롯팅으로 확인하였고, IL-1β, IL-6, IL-8, PGE2 등의 분비 단백질 발현량은 각각의 ELISA 키트를 이용하여 확인하였다(도 5a의 A, B, C). 이러한 결과는 IL-32θ(281T)가 EV 형질감염된 세포와 비교하여 CM-자극된 MDA-MB-231 세포에서 염증인자 및 PGE2의 수준을 감소시킴을 입증하였다(도 5a의 D). 또한, IL-32θ(281T)는 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포의 핵으로의 NF-κB의 전위를 억제하였다(도 5b). 이러한 데이터는 종양 진행 및 공격성과 관련된 염증 인자가 유방암 세포에서 IL-32θ(281T)에 의해 억제됨을 시사한다.
EMT는 다양한 단백질에 의해 조절되고 결정되는 전이 단계이다. 중간엽 세포는 세포골격과 관련된 높은 수준의 비멘틴과 피브로넥틴을 발현한다. 또한 세포 간 접착 매개체(E-cadherin, N-cadherin)는 상피 및 중간엽 유형을 결정하는 데 필수적인 단백질이다. 이러한 인자는 여러 신호 경로를 통해 염증 인자에 의해 조절된다. 본 발명자들은 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 이동을 조절할 수 있는지 여부를 조사했다. EV 형질감염된 세포와 비교하여, IL-32θ(281T)-발현 유방암 세포에서 이동 속도가 유의하게 감소하였다(도 6a, 6b). 또한, 웨스턴 블롯 분석은 중간엽 마커(N-cadherin, vimentin, fibronectin)가 IL-32θ(281T)에 의해 하향 조절되는 반면(도 7a, 7b), 상피 마커(E-cadherin)는 IL-32θ(281T)에 의해 상향 조절됨을 보여주었다. 또한, IF 분석은 세포 표면에서 IL-32θ(281T)에 의해 E-카데린이 증가한 반면 N-카데린은 감소되었음을 입증하였다(도 7a, 7b). 이러한 결과는 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 중간엽 전이를 억제한다는 사실을 뒷받침한다.
β-카테닌의 핵 전위는 암에서 간엽 및 염증 인자의 전사를 유도한다. β-카테닌 분해 및 전위는 글리코겐 신타제 키나아제 3β(GSK3β)와의 상호작용에 의해 조절된다. FAK/PI3K/AKT 경로는 인산화를 통해 GSK3β의 분해를 유도한다. 또한, FAK 경로는 단백질-단백질 상호작용을 통해 IL-32에 의해 조절된다고 보고되었다. 본 발명에서 웨스턴 블롯 분석은 FAK의 발현과 인산화가 IL-32θ(281T)에 의해 감소됨을 보여주었다. 또한 PI3K와 AKT의 인산화는 FAK 억제를 통해 IL-32θ(281T)에 의해 억제되었다. 마지막으로, β-카테닌의 분해는 GSK3β 분해의 억제를 통해 IL-32θ(281T)에 의해 증가되었다(도 8).
AKT는 암에서 세포 증식 및 생존의 잘 알려진 조절인자이다. CDK와 사이클린 복합체는 세포 주기 체크 포인트의 조절을 통해 증식을 유도한다. 특히, 사이클린 A/CDK2 복합체의 하향 조절은 S기 및 G2/M기 세포 주기 정지를 유도한다. PCNA는 DNA 복제를 지원하는 DNA 클램프이다. 사이클린 의존성 키나아제 억제제 1(p21)은 CDK/사이클린 복합체에 결합하여 세포주기를 억제한다. IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 증식을 조절할 수 있는지 여부를 조사했다. IL-32θ(281T)-발현 세포는 EV 형질감염된 세포보다 감소된 세포 증식을 보였다(도 9a). 또한, 웨스턴 블롯팅 분석 결과 세포주기 관련인자(PCNA, cyclin A, cdk2, p21)가 FAK/PI3K/AKT 경로를 통해 IL-32θ(281T)에 의해 조절됨이 밝혀졌다(도 9a 의 C). Flow cytometry 분석은 또한 유방암 세포에서 IL-32θ(281T)에 의해 S기 및 G2/M기 세포 주기 정지가 유도됨을 보여주었다. 이러한 데이터는 IL-32θ(281T)가 FAK/PI3K/AKT 경로를 통해 유방암 세포에서 세포 주기 관련 인자(PCNA, cyclin A, cdk2 및 p21)를 억제함으로써 유방암 증식을 억제한다는 생각을 뒷받침한다.
결론적으로 본 발명자들은 세포 내 NF-κB(p65/p50) 및 FAK/PI3K/AKT 경로를 조절하여 염증, EMT 및 유방암 세포 주기를 억제하는 IL-32θ의 새로운 돌연변이를 확인하였다(도 10). 본 발명의 IL-32θ(281T)는 염증, EMT 및 세포 주기 정지에 미치는 영향으로 인해 유방암의 진행을 억제하기 위한 잠재적인 치료 전략에 사용될 수 있다.
2. 항염증 효과
본 발명에서는 IL-32θ의 위치 281(281T)에서 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 대체된 IL-32θ(281T)의 세포 표면 수용체를 조사하고 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)에 미치는 영향을 평가했다. 재조합 인간 IL-32θ(281T)는 Ni-NTA 및 IL-32 mAb(KU32-52)-커플링된 아가로스 컬럼을 사용하여 발현, 분리 및 정제되었다. 본 발명자들은 IL-32θ(A94V)가 인테그린 αVβ3 및 αVβ6에 결합할 수 있음을 관찰했으며, 이는 인테그린이 IL-32θ(A94V)에 대한 세포 표면 수용체로 작용함을 시사한다. IL-32θ(A94V)는 IL-32β 및 IL-32γ와 같은 다른 이소형과 대조적으로 종양괴사인자(TNF)-α-자극된 HUVEC에서 세포내 세포접착분자-1(ICAM-1)과 혈관세포접착분자-1(VCAM-1)의 발현을 억제하여 단핵구-내피접착을 유의하게 약화시켰다. IL-32θ(A94V)는 또한 FAK(focal adhesion kinase)의 인산화를 억제함으로써 단백질 키나아제 B(AKT) 및 c-jun N-말단 키나아제(JNK)의 TNF-α 유도 인산화를 감소시켰다. 또한 IL-32θ(A94V)는 ICAM-1 및 VCAM-1 발현에 관여하는 NF-κB(nuclear factor kappa B) 및 AP-1(activator protein 1)의 핵 전위를 조절했다. ICAM-1 및 VCAM-1에 의해 매개되는 단핵구-내피 접착은 심혈관 질환의 주요 원인인 죽상동맥경화증의 중요한 초기 단계이다. 본 발명은 IL-32θ(A94V)가 세포 표면 수용체인 인테그린 αVβ3 및 αVβ6에 결합하고 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 단핵구-내피 접착을 약화시킨다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 IL-32θ(A94V)가 동맥경화증과 같은 만성 염증성 질환에서 항염증성 사이토카인으로 작용할 수 있음을 입증한다.
구체적으로, 본 발명자들은 Nde1과 Age1 제한 효소를 사용하여 재조합 벡터를 설계했다(도 11). 벡터를 열충격법으로 E.coli 균주 중 하나인 Rosetta에 형질전환시켰다. 삽입 DNA에는 정제를 위한 His-tag가 포함되어 있다. Ni-NTA 컬럼과 IL-32 mAb KU32-52 결합 CNBr-활성화 Sepharose 4B 컬럼의 순차 정제를 사용하여 순수한 IL-32θ(A94V)를 얻었다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 12).
IL-32θ(281T)를 포함한 대부분의 IL-32 이소형은 RGD 모티프를 가지며 인테그린 αVβ3 및 αVβ6은 RGD 모티프에 결합하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들 인테그린은 IL-32α 및 IL-32β와 결합하는 것으로 보고되었다. 따라서 IL-32θ(A94V)도 이러한 인테그린에 결합할 것이라는 가설을 세웠다. 단백질-단백질 결합 예측에서, IL-32는 인테그린 αVβ3보다 인테그린 αVβ6에서 더 높은 도킹 점수를 보였다(도 13). 그러나 IL-32θ(A94V)-인테그린 결합 분석에서는 유의한 차이가 확인되지 않았다. IL-32θ(A94V)는 용량 의존적 방식으로 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 모두에 결합하는 것으로 밝혀졌으며(도 14a), 이러한 인테그린이 IL-32θ(A94V)에 대한 수용체로 작용할 수 있음을 시사한다. 그러나 상호작용은 짧은 RGD 펩타이드를 포함하는 cyclo-(RGDfV)에 의해 차단되지 않았으며 이는 예상과 달리 IL-32θ(A94V)-인테그린 결합이 RGD 모티프에 의해 매개되지 않음을 나타낸다(도 14b). FBS에 포함된 파이브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 성장인자와 같은 세포외 기질은 인테그린에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이들은 인테그린에 결합하여 인테그린-IL-32θ(A94V) 상호작용을 차단할 수 있다. 예상대로 무혈청 배지와 비교하여 10% FBS 함유 배지에서 상호작용이 감소하는 것을 관찰했다(도 14c).
RT-PCR 분석은 HUVEC 세포에서 인테그린 αVβ3 및 αVβ6의 발현을 확인했지만 THP-1 인간 단핵구 세포에서는 발현하지 않았다. 본 발명자들은 또한 IL-32θ(A94V)-전처리된 HUVEC에서 TNF-α에 의해 유도된 ICAM-1 및 VCAM-1 발현의 상향조절이 유의하게 감소하였음을 입증하였다(도 15, 도 16). 이러한 결과는 이러한 세포 부착 분자의 발현을 유도하는 것으로 알려진 IL-32β 및 IL-32γ와 비교하여 IL-32θ(A94V)의 반대 역할을 보여준다.
본 발명자들은 이러한 세포 접착 분자에 의해 매개되는 단핵구-내피 접착이 IL-32θ(A94V)에 의해 약화되는지 여부를 조사했다. THP-1 단핵구는 형광 염료 calcein-AM으로 염색하고 HUVEC와 공동 배양했다. 몇 번의 세척 후, TNF-α 처리된 THP-1 세포의 녹색 염색 형광 강도는 상당히 강화된 반면, 단핵구의 형광 강도는 IL-32θ(A94V)에 의해 감소되었다(도 17). 이러한 결과는 IL-32θ(A94V)가 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 세포 부착 분자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 단핵구 내피 부착을 약화시킨다는 것을 입증했다.
FAK는 잘 알려진 인테그린 매개 신호 분자로 다양한 사이토카인과 성장 인자에 의해 유도되는 세포 내 신호에 밀접하게 관여한다. 이들 분자에 의해 유도된 인산화된 FAK는 AKT 및 JNK 신호 경로를 활성화시킨다. AKT의 활성화는 NF-κB의 핵 전위를 촉진하는 IκB의 인산화를 유도한다. JNK는 또한 AP-1의 핵 전위를 유발한다. HUVEC에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현은 전사 인자 AP-1 및 NF-κB에 의해 가속화된다. IL-32θ(A94V)는 JNK 및 AKT의 상류에 있는 FAK의 TNF-α 유도 인산화를 억제함으로써 이 신호 전달 경로를 하향 조절하여 ICAM-1 및 VCAM-1 발현을 약화시킨다.
종합하면, 본 발명의 IL-32θ(A94V)는 HUVEC에서 인테그린-매개 신호전달을 통해 죽상경화증의 핵심 인자인 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제함으로써 단핵구-내피 유착을 약화시켰다(도 17). 이 증거는 죽상경화증과 같은 만성 염증성 질환의 치료에서 IL-32θ(A94V)의 잠재적인 역할을 입증한다.
따라서, 본 발명은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 IL-32θ뮤턴트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 일부 또는 전부 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트의 유전자는 기존의 인터루킨-32 쎄타의 일부 염기서열이 결실되고, 바람직하게는 6번 엑손의 일부 염기서열이 결실되며, 보다 바람직하게는 상기 6번 엑손의 144번 염기부터 203번 염기가 결실되어 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 IL-32θ뮤턴트는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 IL-32θ뮤턴트는 서열번호 3의 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다.
상기 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 2의 염기서열보다 효율적으로 재조합 IL-32θ뮤턴트 단백질을 제조 내지 발현시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 '예방'이란, 본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트로 인해 암 내지 염증성 질환 관련 질환이 억제되거나 그 발병이 지연되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 '개선' 또는 '치료'란, 본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트로 인해 암 내지 염증성 질환 관련 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화 할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부외용, 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화 할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질 일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
*또한, 본 발명은 IL-32θ뮤턴트(mutant)를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트 및 상기 약학적 조성물은 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 염증성 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 통풍, 간염, 천식, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 항암용 면역치료제 조성물 또는 항염증용 면역치료제 조성물을 제공할 수 있다.
상기 면역치료제는 체내 면역세포의 특성을 이용해 부작용을 최대로 줄이면서 인체의 면역반응을 증진 또는 억제해 질병을 치료하는 치료제를 의미할 수 있다.
본 발명의 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 다른 IL-32들과는 차별화된 전혀 새로운 기능을 가지는 새로운 염증 억제성 사이토카인으로서, 각종 암 내지 염증성 질환을 예방 및 치료하는 면역치료제로서 사용될 수 있다. 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 염증성 질환에는 관절염, 류마티스 관절, 통풍, 간염, 천식, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant) 발현용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
상기 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 2의 염기서열보다 효율적으로 재조합 IL-32θ뮤턴트 단백질을 제조 내지 발현시키는데 사용될 수 있다.
상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
1. 항암효과
환자 샘플
본 발명의 생체 표본에는 유방 종양(n = 90)과 인접한 정상 조직(n = 90)이 포함되었다. 본 발명에 사용된 유방암 환자의 생체 시료는 전남대학교 화순병원 바이오뱅크(Hwasun-gun, Korea)와 고려대학교 구로병원(Seoul, Korea)에서 제공받았다. 이 연구는 건국대학교 임상심사위원회(Institutional Review Board, 7001355-201704-E-047)의 승인을 받았으며, 모든 피험자는 정보에 입각한 동의를 받았다. mRNA는 homogenizer와 TRI Reagent®(Ambion, Austin, TX, USA)를 사용하여 동결된 조직에서 추출되었고 cDNA는 M-MuLV 역전사 효소(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 합성되었다.
유방 조직에서 돌연변이된 IL-32θ의 발견
유방암 환자의 조직에서 IL-32θ의 mRNA 발현은 크기 차이에 기초한 특정 프라이머 세트를 사용하여 확인되었다(도 1). 본 발명자들은 PCR 산물의 크기에 따라 동형을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 사용했다. ABI 3730XL(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 BigDye®Terminator v3.1 주기 시퀀싱 키트(Thermo Fisher Scientific)와 함께 생어(Sanger) 방법을 사용하여 Bionics(Seoul, Korea)에서 유전자를 강력하게 발현하는 샘플에서 IL-32θ의 시퀀싱을 수행했다(n = 34). IL-32θ서열에서 점 돌연변이를 검출했다(도 2a). 점 돌연변이는 스플라이스 부위 외부의 IL-32θ의 엑손 7과 8 사이에 위치했다. 점돌연변이 부위는 개시코돈부터 세어보니 94번째 코돈이었다(도 2b). 또한 IL-32θ의 무작위로 선택된 34개 샘플의 시퀀싱 데이터는 94번째 아미노산이 알라닌에서 발린으로 돌연변이된 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 이 돌연변이를 IL-32θ(281T)또는 IL-32θ(A94V) 라고 명명했다(n = 34).
종양 조직에서 염증, 이동 및 증식 인자의 mRNA 발현
RT-qPCR(Reverse transcription quantitative PCR)을 이용하여 유방 종양 조직 내 염증인자(IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2), 중간엽표지자(vimentin, N-cadherin), 증식인자(PCNA, CDK2)의 mRNA 수준을 측정하였다. RT-PCR로 얻은 IL-32θ(281T) 발현에 따라 유방 종양 조직을 두 그룹으로 나누었다(표 1).
| IL-32θ 발현 여부 | 유방 종양 조직(n=90) | 정상 조직(n=90) |
| IL-32θ- | 50 | 40 |
| IL-32θ+ | 40 | 50 |
구체적으로, RT-qPCR은 BioFact™2X Real-time PCR Kit(BioFact, Daejeon, Korea)와 Rotor-Gene 6000 시리즈 소프트웨어 1.7(Qiagen, Venlo, Netherlands)을 사용하여 상대 정량화 프로토콜로 수행되었다. 프라이머 서열은 [표 2]에 나열되어 있다. 전사 수준은 ΔΔCt 또는 ΔCt 방법을 사용하여 계산되었다.
| 유전자 | 방향 | 프라이머 서열(5'→3') | 서열번호 |
| GAPDH | 정방향 | AGAACATCATCCCTGCCTCT | 5 6 |
| 역방향 | CTGCTTCACCACCTTCTTGA | ||
| IL-32θ | 정방향 | ACGTGGACAGGTGATGTCGA | 7 8 |
| 역방향 | GAGCAGCAGAAACTCTGGAA | ||
| IL-1β | 정방향 | CGACAGACCTTCCAGGAGAATC | 9 10 |
| 역방향 | GTGCAGTTCAGT GATCGTACACC | ||
| IL-6 | 정방향 | AGACAGCCACTCACCTCTTCAG | 11 12 |
| 역방향 | TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG | ||
| IL-8 | 정방향 | GGTCTGTGTGAAGGTGCAGT | 13 14 |
| 역방향 | GTTTTCCTTGGGGTCCAGAC | ||
| COX-2 | 정방향 | CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG | 15 16 |
| 역방향 | GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA | ||
| N-cadherin | 정방향 | CCT CCA GAG TTT ACT GCC ATG AC | 17 18 |
| 역방향 | GTA GGA TCT CCG CCA CTG ATT C | ||
| Vimentin | 정방향 | AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA | 19 20 |
| 역방향 | ATCTGGCGTTCCAGGGACTCAT | ||
| PCNA | 정방향 | CAAGTAATGTCGATAAAGAGGAGG | 21 22 |
| 역방향 | GTGTCACCGTTGAAGAGAGTGG | ||
| CDK2 | 정방향 | ATGGATGCCTCTGCTCTCACTG | 23 24 |
| 역방향 | CCCGATGAGAATGGCAGAAAGC |
그 결과, mRNA 수준은 IL-6을 제외한 IL-32θ(281T)-발현(IL-32θ+) 유방 종양 조직에서 유의하게 감소하였다(도 3).
IL-32θ(281T)가 염증 인자 발현에 미치는 영향
인간 유방암 세포의 염증 인자 수준에 대한 IL-32θ(281T)의 효과를 확인하기 위해 EV와 IL-32θ(281T)로 형질감염된 MDA-MB-231 유방암 세포를 사용했다. 과발현된 세포주는 리포펙타민을 사용하여 평가하였다(도 4a 의 A). MDA-MB-231 세포를 발현하는 IL-32θ(281T)의 형태학적 변화를 [도 4a 의 B]에 나타내었다.
구체적으로, 세포 배양은 MDA-MB-231(ATCC®HTB-26™, Manassas, VA, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)에서 배양했다. MDA-MB-468 세포(ATCC® HTB-132™)를 RPMI-1640 (HyClone Laboratories)에서 배양했다. 두 배지 모두 37℃ 및 5% CO2에서 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충되었다.
IL-32 과발현 세포의 생성을 위해서, 유방암 세포는 pcDNA3.1(+)-6x Myc 빈 벡터(EV) 및 pcDNA3.1(+)-6x Myc IL-32θ(281T) 벡터로 형질감염되었다. pcDNA3.1(+)-6x Myc IL-32θ(281T) 벡터는 야생형 Myc-IL-32θ 벡터로부터 Muta-Direct™Site-Directed Mutagenesis Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 준비되었다. 간략하게, 세포를 60 Pi 접시(3 x 105 세포/웰)에 시딩하고 Lipofectamine®2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 3 μg의 벡터로 형질감염시켰다. 그 후, 유방암 세포를 900 μg/mL G-418 (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands)이 포함된 배지를 사용하여 2주 동안 선별하였다. G-418 내성 콜로니만 배양하였다.
컨디셔닝 배지(CM)의 경우 THP-1 세포를 T-75 플라스크(3 x 106 세포)에 시딩하고 100nM PMA (Millipore Sigma, Burlington, MA)로 72시간 동안 자극했다. 24시간 동안 PMA로 처리한 후, 세포를 20ng/mL의 IL-4 (PeproTech, Philadelphia, PA) 및 IL-13 (PeproTech)으로 48시간 더 배양하여 M2-분극 THP-1 대식세포를 유도했다. 그런 다음 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척하고 24시간 후에 새로운 배양 배지를 첨가하였다. CM을 수집하고 원심분리하여 나머지 세포를 제거했다.
웨스턴 블로팅은 전체 세포 용해물을 1X 완전 프로테아제 억제제 칵테일 및 1X PhosSTOP (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 함유하는 방사면역침전 분석(RIPA) 완충액(iNtRON Biotechnology)에서 제조하였다. 핵 및 세포질 단백질을 얻기 위해 제조사의 지침에 따라 세포를 수집하고 NE-PER 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 핵 분획화했다. 샘플을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용한 후 0.2 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Amersham Biosciences, Amersham, UK)으로 옮겼다. 멤브레인은 4℃에서 밤새 적절한 1차 항체와 혼성화되었다. 항체는 [표 3]에 나열되어 있다. 웨스턴 블롯팅은 chemiluminescence detection kit (Advanstar, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 수행하였고 단백질 밴드는 EZ-capture MG protein imaging system (ATTO, Tokyo, Japan)을 이용하여 캡쳐하였다. 웨스턴 블롯팅 밴드는 Image J 오픈 소스 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 정량화되었다.
| 항체 | 종 | 희석 | Cat# | 구입처 |
| Myc-tag | 사람 | 1:5000 | 05-724 | Millipore |
| β-catenin | 사람 | 1:5000 | C2206 | |
| p-FAK | 사람 | 1:5000 | 700255 | Invitrogen |
| PARP | 사람 | 1:5000 | 9542s | Cell Signaling Technology |
| p50 | 사람 | 1:5000 | 3035s | |
| p-PI3K | 사람 | 1:5000 | 4228s | |
| p-GSK3 | 사람 | 1:5000 | 9331s | |
| p-IκBα | 사람 | 1:5000 | 2859s | |
| IκBα | 사람 | 1:5000 | 4812s | |
| p-AKT | 사람 | 1:5000 | 9271s | |
| p21 | 사람 | 1:5000 | 2947T | |
| PCNA | 사람 | 1:5000 | 2856s | |
| CDK2 | 사람 | 1:5000 | 2546T | |
| COX-2 | 사람 | 1:5000 | AF4198 | R&D Systems |
| GAPDH | 사람 | 1:5000 | sc-47724 | Santa Cruz Biotechnology |
| p65 | 사람 | 1:5000 | sc-8008 | |
| α-tubulin | 사람 | 1:5000 | sc-5286 | |
| Fibronectin | 사람 | 1:5000 | sc-9068 | |
| Vimentin | 사람 | 1:5000 | sc-66002 | |
| Cyclin A | 사람 | 1:5000 | sc-751 | |
| N-cadherin | 사람 | 1:5000 | ab18203 | Abcam |
| E-cadherin | 사람 | 1:5000 | ab1416 |
효소면역측정법(ELISA)은 MDA-MB-231 세포를 CM으로 24시간 동안 배양한 후, 배양 배지를 새로운 배양배지로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 세포 배양 상청액을 수집하고 인간 IL-1β, IL-6, IL-8 및 PGE2 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 용 ELISA 키트(R&D systems)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분석했다.
그 결과, RT-qPCR 분석은 염증 인자의 mRNA 수준이 MDA-MB-231 세포에서 IL-32θ(281T)에 의해 억제됨을 보여주었다(도 4b 의 C). CM 처리된 MDA-MB-231 세포는 IL-32θ(281T)에 의해 염증 인자의 증가된 mRNA 수준이 억제됨을 밝혔다(도 4b 의 D). IL-1β, IL-6, IL-8 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 분비 단백질 수준을 ELISA로 확인하여, IL-32θ(281T)가 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포에서 IL-1β, IL-6, IL-8 및 PGE2 수준을 억제함을 입증했다(도 5a). 핵 분획 후 웨스턴 블롯 분석은 IL-32θ(281T)가 CM으로 자극된 MDA-MB-231 세포에서 핵으로의 NF-κB 전위를 억제함을 보여주었다(도 5b 의 E). 또한, 면역형광(IF) 분석은 핵 NF-κB 가 CM으로 자극된 IL-32θ(281T)-발현 MDA-MB-231 세포에서 약화됨을 입증했다(도 5b 의 F).
인간 유방암 세포의 이동에 대한 IL-32θ(281T)의 조절 효과
염증 인자는 IL-32θ(281T)에 의해 억제됨이 밝혀졌다. IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 이동에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
면역형광(IF) 분석을 위해, 유방암 세포를 세포 배양 슬라이드(SPL, Pocheon, Korea)에 파종하고 밤새 배양하였다. 부착된 세포를 고정하고, 파라포름알데히드 및 메탄올로 투과화한 다음 실온에서 PBS 중 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 1차 항체(1% BSA로 희석된 1:200)를 슬라이드에 추가하고 4℃에서 밤새 배양했다. PBS로 세척한 후 슬라이드를 2차 항체(1:400 희석)와 함께 배양했다. 항체는 상기 [표 3]에 나열되어 있다. 세포를 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(PBS로 1:1000 희석) (Millipore Sigma)에 15초 동안 노출시켜 핵 염색을 수행하였다. EVOS M7000 이미징 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 세포를 시각화했다.
상처 치유 분석(Wound healing assay)을 위해 유방암 세포(1.5 x 105개 세포/웰)를 24웰 플레이트에 시딩하고 100% 컨플루언스까지 배양했다. 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 긁고, 분리된 세포를 제거하기 위해 PBS로 세척하고, 24시간 후에 새로운 무혈청 배지를 첨가했다. 플레이트를 0 및 24시간에 현미경으로 촬영하였다. ImageJ로 스크래치 영역을 사용하여 세포 이동을 측정했다.
상처 치유 분석은 EV로 형질감염된 세포와 비교하여 IL-32θ(281T)-발현 유방암 세포의 이동에서 현저한 감소를 나타냈다(도 6a, 6b). 또한, 웨스턴 블롯 분석은 IL-32θ(281T) 가 중간엽 마커(피브로넥틴(fibronectin), 비멘틴(vimentin), N-카데린(N-cadherin))를 억제하고 유방암 세포에서 상피 마커 E-카데린을 상향조절함을 보여주었다(도 7a). IF 분석은 E-카데린의 형광이 IL-32θ(281T)-발현 세포에서 증가한 반면, N-카데린의 형광은 IL-32θ(281T)-발현 세포에서 감소되었음을 보여주었다(도 7b).
인간 유방암 세포에서 IL-32θ(281T)의 세포내 신호 전달 경로
본 발명은 염증 인자와 EMT 마커가 IL-32θ(281T)에 의해 조절된다는 것을 보여준다. 또한, NF-κB 전위가 IL-32θ(281T)에 의해 억제됨을 밝혔다. 본 발명자들은 IL-32θ(281T)가 유방암 세포의 세포내 신호 전달 경로에 영향을 미치는지 여부를 확인했다.
웨스턴 블롯 분석은 IL-32θ(281T)가 EV 형질감염된 유방암 세포와 비교하여 p-FAK, p-PI3K, p-AKT 및 p-GSK3를 억제함을 보여주었다. 또한, β-카테닌의 분해는 유방암 세포에서 IL-32θ(281T)에 의해 유도되었다(도 8).
IL-32θ(281T)의 세포 주기 정지를 통한 인간 유방암 세포의 증식 억제
본 발명에서 FAK/PI3K/AKT 경로는 IL-32θ(281T)에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다. IL-32θ(281T)가 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTS 및 BrdU 분석을 수행했다(도 9a).
세포 생존율 분석은, CellTiter 96®One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 세포 생존력을 평가했다. 유방암 세포(1 x 104개 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 시딩하고 매 시간 배양하고 신선한 배지로 세척했다. 그런 다음 세포를 100 μL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 및 전자 커플링 시약 페나진 메토설페이트(phenazine methosulfate)로 1시간 동안 배양했다. 광학 밀도(OD)는 492nm에서 측정되었다. 대조군 OD로 정규화하여 상대적 생존력을 정량화했다.
세포증식 분석은, 세포 증식은 제조업체의 프로토콜에 따라 Cell Proliferation Assay Kits (Cell Signaling Technology)를 사용하여 DNA에 BrdU (5'-bromo-2'-deoxyuridine) 통합을 기반으로 결정되었다. 유방암 세포(5 × 102 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 72시간 동안 배양하고, 24시간 동안 BrdU로 표지하였다. 세포를 고정하고 검출 항체 및 HRP 연결 항체를 BrdU 검출에 사용하였다. 발색은 HRP 기질인 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)을 이용하여 발색하였으며 450 nm에서 OD를 측정하였다.
유세포분석을 위해 MDA-MB-231(2 × 105개 세포/mL) 및 MDA-MB-468(4 × 105개 세포/mL) 세포를 60 pi 접시에 48시간 동안 시딩하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 70% 에틸 알코올로 30분 동안 고정시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고 요오드화 프로피듐을 함유하는 PBS를 30분 동안 보충하였다. FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 형광 방출을 측정하고 분석했다.
세포 생존력 및 증식분석은 IL-32θ(281T)-발현 유방암 세포가 EV 형질감염된 세포보다 상당히 더 느린 성장을 가짐을 나타냈다(도 9a). 조절 세포주기(CDK2, 사이클린 A) 및 증식세포 핵 항원(PCNA) 단백질은 IL-32θ(281T)에 의해 억제되었다(도 9a 의 C). 더욱이, 증식억제 단백질 p21은 유방암 세포에서 IL-32θ(281T)에 의해 상향조절되었다(도 9a 의 C). IL-32θ(281T)가 세포주기 정지에 미치는 영향을 밝히기 위해 유세포 분석법을 사용하여 PI 염색을 수행했다. 유세포분석 결과는 EV 형질감염 유방암 세포보다 IL-32θ(281T)를 발현하는 유방암 세포에서 S기 및 G2/M기 정지의 비율이 더 높다는 것을 보여주었다(도 9b).
[통계 분석]
Student's t-test는 유방 환자 샘플 분석에서 그룹을 비교하는 데 사용되었다. Student's t-test 및 Tukey's honest test를 사용한 일원분산 분석(ANOVA)을 사용하여 시험관 내 실험에서 그룹을 비교했다. GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9.0을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 모든 p-값은 양면이었고 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 및 ****p<0.0001이었다.
2. 항염증 효과
재조합 인간 IL-32θ(A94V)의 발현 및 정제
<8-1> 인간 IL-32θ(A94V)의 발현
IL-32θ(A94V)의 발현을 위해 TEVSH 벡터를 사용하였고 재조합 IL-32θ(281T) DNA를 Nde1 및 Age1 제한 효소에 의해 벡터에 삽입하였다. TEVSH 벡터에는 단백질 정제를 위한 His 태그가 포함되어 있다. 재조합 벡터의 개략도는 [도 11]에 나와 있다.
구체적으로, HT-oligoTM 합성을 사용하여 Bioneer (Daejeon, Korea)에 의해 단백질 발현 효율 제고용으로 IL-32θ(281T) 코딩 서열(서열번호 3)을 합성하였다. 합성된 DNA 서열을 NdeⅠ 및 AgeⅠ 제한 부위와 신속한 DNA 결찰 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 pTH24 기반 TEVSH 벡터(Addgene, Watertown, MA, USA)에 클로닝하였다. TEVSH는 Helena Berglund (Addgene 플라스미드 #125194; http://n2t.net/addgene:125194; RRID:Addgene 125194)로 부터 제공받았으며 DNA 시퀀싱(Bionics, Seoul, Korea)으로 확인되었다. 재조합 TEVSH 벡터는 열충격에 의해 DH5α로 형질전환되었고, mini prep kit (Intron Biotechnology, Sungnam, Korea)를 사용하여 정제되었다. IL-32θ(281T) 발현 벡터를 열 충격 형질전환에 의해 대장균의 로제타 균주로 형질전환시켰다. 성공적으로 형질전환된 단일 콜로니를 픽업하여 암피실린(100 μg/mL)이 포함된 Luria-Bertani (LB) 배지에서 200-rpm 인큐베이터에서 4시간 동안 37℃에서 배양했다. 배양된 혼합물을 암피실린(ampicillin, 100 μg/mL)이 포함된 2.4 L의 신선한 LB 배지에 옮기고 OD600이 0.6이 될 때까지 37℃에서 200 rpm 배양기에서 성장시켰다. 0.5mM IPTG를 첨가하여 IL-32θ(A94V)를 유도하였다. 세포는 16℃에서 16시간 동안 200rpm 인큐베이터에서 성장시켰다.
<8-2> Ni-NTA 및 CNBr-활성 세파로스 4B 컬럼을 사용한 IL-32θ(A94V)의 정제
IL-32θ(A94V)의 순도를 향상시키기 위해 연속 정제를 수행했다. IL-32θ(A94V)는 Ni-NTA 컬럼과 His tag에 결합하여 분리하고, 분리된 IL-32θ(281T)를 IL-32mAb KU32와 결합된 CNBr-활성화된 Sepharose 4B 컬럼으로 한 번 더 정제하였다.
구체적으로, 16시간 후, 4℃에서 10분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 세포를 수확하였다. 상청액을 버리고 펠릿을 용해 완충액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.1% Triton X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일, 2mM MgCl2, 0.1mg 라이소자임)을 사용하여 용해하고 얼음 위에서 배양했다. 30분 동안 용해된 세포를 초음파 처리기(Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA)를 사용하여 1분 동안 초음파 처리(진폭 35%, 10초 켜기, 10초 끄기)했다. 용해된 세포를 4℃에서 30분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 모았다. Ni-NTA 수지(Thermo Fisher Scientific)를 PD-10 컬럼에 넣고 평형 완충액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 200mM NaCl)으로 균형을 맞췄다. 용해물을 10mL의 평형 완충액과 혼합하고 컬럼에 로딩하고 세척 완충액(20mM Tris-HCl pH 8.0, 200mM NaCl, 25mM 이미다졸)으로 세척했다. 세척 후 용출 버퍼(20mM Tris-HCl pH 8.0, 500mM NaCl, 500mM 이미다졸)를 컬럼에 로딩하고 IL-32θ를 포함하는 플로우-쓰루 버퍼(flow-through buffer)를 CNBr-활성화 Sepharose 4B 컬럼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States) 및 단클론 항체 IL-32 mAb KU32-52를 사용하여 제조된 IL-32mAb(KU32-52)-커플링된 CNBr-활성화 Sepharose 4B 컬럼에 다시 로딩했다. Tris(pH 8.0)로 여러 번 세척한 후 IL-32θ(A94V)를 100mM 글리신(pH 3.0)으로 용출했다. 용출된 용액을 받는 튜브는 전체 부피의 10분의 1인 1M의 트리스(pH 8.0)를 함유하였다. 정제된 IL-32θ(A94V)를 spectra/Por 멤브레인(Spectrum Laboratories, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 PBS (phosphate-buffered saline)로 2시간씩 3회 투석하였다. 폴리믹신 B(Sigma-Aldrich)를 사용하여 내독소의 부재를 평가하였다.
정제된 IL-32θ(A94V)를 SDS-PAGE(도 12A) 및 웨스턴 블롯(도 12B, 11C)을 사용하여 분석하였다. SDS-PAGE 분석에서는 Ni-NTA 컬럼의 용출액에서 IL-32θ(A94V)를 제외하고는 눈에 띄는 다른 단백질 밴드가 검출되지 않았으나 western blotting을 통해 다른 여러 단백질이 관찰되었다. 이러한 비표적 단백질은 KU32-52에 결합된 CNBr-활성화 Sepharose 4B 컬럼을 사용한 추가 정제에 의해 제거되었다. 결국, 고순도 IL-32θ(A94V) 단백질은 다른 단백질이 거의 없이 얻어졌다.
인테그린 αVβ3 및 αVβ6 에 대한 IL-32θ(A94V)의 결합
HDOCK 서버를 사용하여 IL-32θ(A94V)와 인테그린의 결합을 예측했다. 구조 기반 결합 예측 외에도 IL-32θ(A94V)-인테그린 결합 분석도 수행했다.
구체적으로, IL-32θ(A94V)의 3차 구조는 단백질 구조 예측 및 구조 기반 기능 주석에 대한 계층적 접근 방식인 I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement)에 의해 분석되었다. I-TASSER는 템플릿 기반 조각 조립 시뮬레이션으로 구성된 전체 길이 모델로 구조 템플릿을 식별한다. 그런 다음 단백질 기능 데이터베이스를 통해 3D 모델을 다시 스레드하여 대상의 기능 통찰력을 도출한다. 단백질-단백질 도킹 예측은 I-TASSER(34-36)에서 도출된 모델 중 신뢰도가 가장 높은 모델을 이용하여 수행하였다. 인테그린-IL-32θ(A94V) 결합은 단백질-단백질 결합예측 도구인 HDOCK 서버(http://hdock.phys.hust.edu.cn)를 이용하여 분석하였다. HDOCK은 하이브리드 도킹 전략을 사용하여 두 단백질 간의 결합 복합체를 예측한다. 인테그린 αVβ3 (PDB ID: 1JV2) 및 αVβ6 (PDB ID: 5FFG)의 세포외 세그먼트 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 제공되었다.
IL-32θ(A94V)는 나선 구조를 포함하는 노란색 분자로 표시하였고, PDB에서 제공하는 인테그린 αVβ3 및 αVβ6의 세포외 도메인은 주황색 분자로 표시하였다. IL-32θ(A94V)-인테그린 αVβ3의 결합 점수는 -304.56이었고, 신뢰도 점수는 0.9565였다. IL-32θ(A94V)-인테그린 αVβ6의 결합점수는 -358.20이었고, confidence score는 0.9847로 IL-32θ(A94V)-integrin αVβ3보다 높았다(도 13). 이러한 결과는 IL-32θ(A94V)가 이들 인테그린과의 결합 가능성 및 인테그린 αVβ3보다 인테그린 αVβ6과 더 강한 상호작용을 갖는다는 것을 시사한다.
IL-32θ(A94V)-인테그린 결합 검정을 위하여, 인테그린 αVβ3 및 αVβ6으로 96-웰 플레이트를 코팅한 후, IL-32θ(A94V)를 [도 14a]에 나타낸 농도로 첨가하였다. 인테그린의 RGD 결합부위에 결합하는 것으로 알려진 Cyclo-RGDfV를 96-웰 플레이트에서 전처리하고 PBS를 대조군으로 사용하였다. 또한, 웰을 인테그린 αVβ3 및 αVβ6으로 코팅하였다. IL-32θ(A94V)를 [도 14b]에 나타낸 농도로 처리하였다. 다른 그룹에서는 10% FBS를 포함하는 배지를 96-웰 플레이트에서 전처리하였다. 이어서 인테그린 αVβ3 및 αVβ6을 첨가하고 대조군을 무혈청 배지로 전처리하였다. IL-32θ(A94V)를 [도 14c]에 나타낸 농도로 처리하였다.
구체적으로, MaxiSorp 평평한 바닥 96-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)를 PBS에 희석된 1 μg/mL의 재조합 αVβ3 및 αVβ6 인테그린(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)으로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양했다. 다음으로 웰을 37℃에서 1시간 동안 PBS에 녹인 1% BSA(Invitrogen, Waltham, MA, USA)로 차단한 후 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 세 번 세척했다. cyclo-RGDfV 펩타이드(Peptide Institute Inc, Osaka, Japan) 또는 10% fetal bovine serum(FBS), 나머지는 PBS와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음으로, 웰을 PBS에 희석된 다양한 농도의 돌연변이 IL-32θ(A94V), 10 μM cyclo-(RGDfV) 또는 10% FBS를 포함하거나 포함하지 않고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하고 PBS에 희석된 IL-32 mAb KU32-52와 0.2 μg/mL 농도로 25℃에서 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하고 HRP에 접합된 마우스-IgGκ 경쇄 결합 단백질(m-IgGκ BP-HRP)(BETHYL, Waltham, MA USA)과 함께 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음으로, 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하고 TMB 기질과 함께 25℃에서 20분 동안 인큐베이션하고, 발색 반응을 2.5 N H2SO4로 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Apollo LB 9110, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 450 nm에서 흡광도/광학 밀도를 측정하였다.
인테그린이 있는 경우 흡광도는 IL-32θ(A94V)의 농도 의존적으로 증가했지만 BSA에서는 그렇지 않았고(도 14a), IL-32θ(A94V)가 다른 이소형과 유사한 인테그린 αVβ3 및 αVβ6에도 결합함을 나타낸다. 인테그린 αVβ3 및 αVβ6 모두에서, 인테그린-IL-32θ(A94V) 결합은 cyclo(RGDfV)에 의해 유의하게 감소되지 않았으며(도 14b), 이는 IL-32θ(A94V)가 비-RGD 결합 부위에 결합함을 시사한다. cyclo-(RGDfV)와 대조적으로, 인테그린-IL-32θ(A94V) 결합은 FBS에 의해 상당히 억제되었다(도 14c). 이러한 결과는 IL-32β와 같은 다른 이소형과 유사하게 IL-32θ(A94V)가 인테그린 αVβ3 및 αVβ6의 비-RGD 결합 부위에 결합하고 이러한 인테그린이 IL-32θ(A94V)에 대한 세포 표면 수용체로 작용할 수 있음을 시사한다.
IL-32θ(A94V)가 TNF-α로 자극된 HUVEC 세포에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현에 미치는 영향
IL-32θ(A94V)가 세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 HUVEC에서 인테그린의 발현을 확인했다. THP-1 단핵구는 표면에 인테그린 αVβ3 및 αVβ6을 발현하지 않는 음성 대조군으로 사용되었다(도 15A). 그리고 IL-32θ(A94V)가 TNF-α로 자극된 HUVEC 세포에서 ICAM-1과 VCAM-1의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. HUVEC는 FBS에 의한 간섭을 최소화하기 위해 4시간 동안 기아처리하였고, IL-32θ(A94V)는 1시간 동안 전처리하고 4시간 또는 6시간 동안 TNF-α로 자극하였다. ICAM-1 및 VCAM-1의 mRNA 수준은 RT-PCR(도 15B) 및 RT-qPCR(도 15C)을 사용하여 측정하였다.
구체적으로, HUVEC 세포는 10%(v/v) 열 불활성화 태아 소 혈청(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 Dulbecco modified Eagle 배지(Welgene Incorporation, Daegu, Korea)에서 배양되었다. 세포는 37℃의 5% CO2 함유 챔버에서 배양되었다.
그 후, RNA 추출 및 RT-PCR을 위하여 HUVEC 세포(3 × 105개 세포/웰)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고 무혈청 배지에서 4시간 동안 기아처리(starve) 하였다. 이어서, 세포를 IL-32θ(A94V) (100 ng/ml)로 1시간 동안 전처리하고, TNF-α (10ng/mL)로 4시간 더 처리하였다. 제조사의 지침에 따라 easy-BLUE™ Total RNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, Seoul, South Korea)를 사용하여 처리된 세포를 수집하고 용해시켰다. 역전사(RT) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위해 올리고(dT) 프라이머와 M-MuLV 역전사효소(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 RNA(1μg)를 cDNA로 역전사했다. 합성된 cDNA는 PCR Thermal Cycler Dice 장비(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 증폭되었다. 다음 프라이머 세트가 사용되었다: 인테그린 αV, 5'-AGGAGAAGGTGCCTACGAAGCT-3'(정방향, 서열번호 25) 및 5'-GCACAGGAAAGTCTTGCTAAGGC-3'(역방향, 서열번호 26); 인테그린 β3, 5'-CATGGATTCCAGCAATGTCCTCC-3'(정방향, 서열번호 27) 및 5'-TTGAGGCAGGTGGCATTGAAGG-3'(역방향, 서열번호 28); 인테그린 β6, 5'-TCTCCTGCGTGAGACACAAAGG-3'(정방향, 서열번호 29) 및 5'-GAGCACTCCATCTTCAGAGACG-3'(역방향, 서열번호 30); ICAM-1, 5'-AGCGGCTGACGTGTGCAGTAAT-3'(정방향, 서열번호 31), 5'-TCTGAGACCTCTGGCTTCGTCA-3'(역방향, 서열번호 32); VCAM-1, 5'-GATTCTGTGCCCACAGTAAGGC-3'(정방향, 서열번호 33) 및 5'-TGGTCACAGAGC CACCTTCTTG-3'(역방향, 서열번호 34); 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(GAPDH), 5'-AGAACATCATCCCTGCCTCT-3'(정방향, 서열번호 5), 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'(역방향, 서열번호 6). GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다. PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 분리하였다.
RT-qPCR 을 위하여, HUVEC는 IL-32θ(A94V) 및 TNF-α의 유무에 관계없이 처리 후 수득되었다. mRNA 추출 및 cDNA 합성은 전술한 바와 같이 수행하였다. RT-PCR은 Rotor-Gene 6000 시리즈 소프트웨어 1.7(Qiagen, Hilden, Germany) 및 Sensi FAST™ SYBR NO-ROX Kit (BIOLINE, London, UK)를 사용하여 상대 정량화 프로토콜로 수행되었다. 모든 표적 유전자의 발현은 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 발현으로 정상화되었다. 각 샘플은 ICAM-1, 5'-AGCGGCTGACGTGTGCAGTAAT-3'(정방향, 서열번호 31), 5'-TCTGAGACCTCT GGCTTCGTCA-3'(역방향, 서열번호 32); VCAM-1, 5'-GATTCTGTGCCCACAGTAAGGC-3'(정방향, 서열번호 33), 5'-TGGTCACAGAGCCACCTTCTTG-3'(역방향, 서열번호 34); GAPDH, 5'-AGAACATCATCCCTGCCTCT-3'(정방향, 서열번호 5), 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'(역방향, 서열번호 6). GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다. 비교 Ct 방법을 사용하여 각 유전자의 mRNA 수준을 내부 참조인 GAPDH의 상대적 수준으로 계산했다.
면역블롯팅은, HUVEC 세포(3 × 105개 세포/웰)를 6웰 플레이트에 24시간 동안 시딩하고 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리한 후 TNF-α(10 ng/mL) 처리하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 50mM Tris(pH 7.4), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate), 0.25% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 1mM EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid), 1mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid), 1mM 오르토바나데이트(orthovanadate), 아프로티닌(aprotinin, 10μg/mL) 및 0.4mM PMSF(phenyl methylsulfonyl fluoride)를 포함하는 버퍼로 용해되었다. 세포를 용해시키고 단백질 함량을 Bradford 분석 시약(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 및 UV 분광광도계를 사용하여 추정하였다. 단백질(30μg)을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 막을 25℃에서 1시간 동안 5% 탈지유로 차단하고, 25℃에서 1시간 동안 IL-32, His-tag (Sigma-Aldrich), FAK (Thermo Fisher Scientific), AKT (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), JNK (Cell Signaling), IκB (Cell Signaling), p65 (Cell Signaling), p50 (Cell Signaling), PARP (Cell Signaling), c-Jun (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), c-Fos (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 1차 항체와 함께 배양했다. 배양 후, 막을 25℃에서 1시간 동안 2차 항체(항토끼 또는 항마우스 IgG 항체)(BETHYL)와 함께 배양하였다. 마지막으로, 강화된 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 키트(Advansta, San Jose, CA USA)를 사용하여 단백질 밴드를 가시화하였다.
면역형광은, HUVEC 세포(1.0 × 105개 세포/웰)를 8웰 슬라이드 챔버에 24시간 동안 시딩하고 밤새 기아처리한 후 IL-32θ(A94V)(100 ng/mL) 및 6 h TNF-α(10ng/mL)로 처리하였다. 처리 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 10분 동안 고정한 다음 얼음처럼 차가운 메탄올로 인큐베이션하고 PBS 중 1% BSA를 사용하여 25℃에서 1시간 동안 차단했다. 그런 다음 세포를 ICAM-1 및 VCAM-1에 대한 1차 항체(Beijing Solarbio Science & Technology Co., Beijing, China)와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, Cy3에 접합된 2차 항체(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)와 함께 세포를 배양하였다. 25℃에서 1시간 후 DAPI 염색. 각 단계 사이에 PBS로 두 번의 세척 단계를 수행했다. 그 후 세포를 마운팅 버퍼(시그마-알드리치)에 마운팅하고 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, ICAM-1 및 VCAM-1의 mRNA 발현 수준은 TNF-α에 의해 증가되었고 IL-32θ(A94V)에 의해 상당히 감소되었다. 단백질 발현은 또한 면역형광을 사용하여 분석하였다. ICAM-1과 VCAM-1의 형광 강도는 예상대로 TNF-α 자극 시 증가했으며 IL-32θ(A94V)에 의해 억제되었다(도 16).
IL-32θ(A94V)가 단핵구-내피세포 부착에 미치는 영향
TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인에 의해 자극된 내피세포에서 발현되는 ICAM-1과 VCAM-1은 혈관 염증의 한 단계인 단핵구-내피세포 부착에 중요한 역할을 한다.
단핵구-내피 세포 부착 검정을 위해, HUVEC 세포(1.5 × 104 세포/웰)를 4-웰 슬라이드 챔버에 24시간 동안 시딩하고 밤새 기아처리하여 IL-32θ(A94V)(100 ng/mL)로 1시간 동안 전처리한 후 6시간 동안 TNF-α(10ng/mL)로 처리하였다. THP-1 세포를 FBS 없이 RPMI-1640에서 30분 동안 5 μM calcein-AM(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 표지하였다. calcein-AM으로 표지된 THP-1 세포를 HUVEC가 들어 있는 4-웰 슬라이드 챔버에 추가하고 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640에서 30분 동안 배양했다. 이어서, 미결합 단핵구를 PBS로 3회 세척하여 제거하였다. 나머지 단핵구는 형광 현미경을 사용하여 결정되었다. ImageJ 소프트웨어 버전 1.5를 사용하여 형광 강도를 측정했다.
그 결과, IL-32θ(A94V)는 내피세포에서 단핵구-내피세포 부착 분자의 발현을 억제하여 단핵구-내피세포 부착을 감소시켰다(도 15 ~ 도 17). calcein-AM-표지된 THP-1(녹색)의 HUVEC에 대한 부착은 HUVEC와 THP-1 세포의 공동 배양에서 TNF-α에 의해 증가되었다. HUVEC와 THP-1 세포 사이의 부착은 IL-32θ(A94V)에 의해 상당히 감소하였다(도 17A). Image J 소프트웨어를 사용하여 형광을 측정했다(도 17B).
TNF-α 로 자극된 HUVEC 세포에서 FAK, AKT 및 JNK의 인산화 수준에 대한 IL-32θ(A94V)의 영향
본 발명자들은 IL-32θ(A94V)가 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제한다는 것을 밝혔다. 본 발명자들은 IL-32θ (A94V)에 의해 매개되는 ICAM-1 및 VCAM-1 발현의 조절의 기본이 되는 세포내 신호전달 경로를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행했다.
그 결과, IL-32θ(A94V)는 단백질 키나아제 B(AKT) 및 c-Jun의 업스트림 분자인 잘 알려진 인테그린 매개 신호 분자인 TNF-α 유도 초점 접착 키나아제(FAK)의 인산화 수준을 유의하게 감소시켰다. N-말단 키나제(JNK). IL-32θ(A94V)도 예상대로 FAK를 억제함으로써 AKT와 JNK의 인산화 수준을 하향 조절했다(도 18).
TNF-α 로 자극된 HUVEC 세포에서 NF-κ및 AP-1의 핵 전위에 대한 IL-32θ(A94V)의 효과
TNF-α 자극은 FAK/AKT 신호 전달 경로를 활성화하여 IκB의 인산화를 통해 NF-κB (p65/p50)의 핵 전위를 유도한다. 또한 JNK의 활성화는 AP-1 (c-fos/c-jun)의 핵 전위를 가속화한다. 이러한 전사 인자는 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 촉진한다. 본 발명자들은 IκB의 인산화 수준과 NF-κB (p65/p50) 및 AP-1 (c-Fos/c-Jun)의 핵 전위를 확인했다.
세포질 및 핵 추출물을 제조하고자, HUVEC 세포(2.5 × 105개 세포/웰)를 24시간 동안 세포 배양 접시에 시딩하고 IL-32θ(A94V)(100ng/mL)로 1시간 동안 전처리한 다음 제조업체의 지침에 따라 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수확 및 분획하기 전 TNF-α(10ng/mL)로 30분 동안 처리했다. 이 추출물(50μg)에서 동량의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 절차의 후속 단계는 위의 웨스턴 블롯팅에 대해 설명된 대로 따랐다. PARP는 핵 단백질 마커로 사용되었다.
그 결과, IL-32θ(A94V)는 TNF-α 유도 IκB 인산화를 약간 약화시켰다(도 19A). AP-1 (c-Fos/c-Jun) 및 NF-κB (p65/p50)의 핵 전위는 TNF-α 자극에 의해 증가되었고 IL-32θ(A94V)에 의해 억제되었다(도 19B). 이러한 결과는 IL-32θ(A94V)가 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 AP-1 (c-Fos/c-Jun) 및 NF-κB (p65/p50)의 핵 전위를 조절하고, 결과적으로 ICAM-1 및 VCAM-1 발현이 감쇠한다는 것을 보여준다.
Claims (10)
- 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 인터루킨-32쎄타 뮤턴트는 서열번호 3의 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 통풍, 간염, 천식, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 항암용 면역치료제 조성물.
- 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant)를 포함하는 항염증용 면역치료제 조성물.
- 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 인터루킨-32쎄타 뮤턴트(IL-32θ mutant) 발현용 재조합 벡터.
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