KR20230146368A - 어위니아 아밀로보라 및 어위니아 피리폴리애 구별용 재조합 레반슈크라제 항원 단백질 내지 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 내지 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질 내지 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명은 PCR 등 장비 없이도 과수화상병과 가지검은마름병을 간편하고신속하며 정확하게 구별 및 진단할 수 있으므로 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 내지 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 PCR 등 장비 없이도 과수화상병과 가지검은마름병을 간편하고신속하며 정확하게 구별 및 진단할 수 있으므로 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 내지 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 내지 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질 내지 이의 용도에 대한 것이다.
사과와 배 등 과수에서 발생하는 화상병은 대표적인 세균성 식물 검역병 중의 하나로, 병 발생국에 대해서는 관련 과수 및 농산물의 수출입이 제한된다. 발병 과수 농가의 경우, 기주 식물 제거 및 인근 발생지역의 범위 매몰, 과수원 폐원 등 농가에 경제적 손실을 야기함으로서 국가적으로 농업 및 경제에 파급효과를 야기 시킬 수 있는 식물 병이다. 사과와 배는 국내 생산 주요 농작물이고 과실류 가운데 주요 수출 품목에 속한다.
2015년 이후 국내 사과와 배에서 화상병 발병이 보고된 이래, 일본에서 수입금지 품목으로 지정되었다. 장미과(Rosaceae) 식물 가운데 사과, 배 등 Spiraeoideae(조팝나무아과)에 속하는 과수와 라즈베리 및 블랙베리 등의 Rubus 속에 속하는 작물들이 화상병 원인균의 기주 작물로 알려져 있으며, 곤충 매개 또는 농기구 접촉, 묘목 이동 등에 의해 전파되어 화상병이 발병될 수 있다. 화상병 원인균에 감염은 주로 개화시기인 것으로 알려져 있으며, 감염된 작물은 꽃, 줄기 및 잎 등이 시들고 갈색으로 변하여 불에 탄 것과 같은 증상을 보이면서 나무 전체를 고사시키게 된다.
최근 일본과 한국에서 화상병과 유사한 가지검은마름병(원인균: 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae, Ep))이 발견되었으나, 화상병은 현재까지 동북아시아 등 주변 국가에서 발견된 보고는 없었으며, 2015년 국내 배와 사과 과수원에서 과수화상병 발병이 최초로 보고되었고 원인균인 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora, Ea)가 분리되어 확인되었다. 이후 안성, 천안, 제천, 원주, 평창 및 충주 등의 과수 농가에서 지속적으로 발생이 확인되었다. 2015년부터 2020년까지 1,082 농가에 발생하여 1,234건 717.4ha의 과수원을 매몰처리하고, 109,682 백만원을 농가에 보상되었다. 또한 매몰지와 주변 구역 역시 확산방지를 위해 사후관리를 실시하여 많은 시간과 비용이 소모되었고, 과수나무 꽃의 급격한 감소로 인해 양봉 농가 등 타 농업에도 피해가 확대되었다.
과수화상병과 가지검은마름병의 조기 신속 진단은 식물 병원균의 확산뿐만 아니라 병 발생을 미연에 방지할 수 있기 때문에, 이는 농업 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 식물 병 발생을 미리 예방함으로써 과수화상병균의 신속 진단은 농업 생산량 증대와 직접적으로 연관되어 있다. 과수 산업의 특성상 현장에 즉각적으로 진단할 수 있는 간편 진단이 절대적으로 요구되고 있는 시점에서 분자진단시약은 현장적용이 상당히 힘들다. 이에 따라 현장에서 주기적으로 매우 손쉽게 진단할 수 있는 현장용 면역진단키트를 개발함으로써 비전문가에 의해서도 1차적인 질병 스크리닝이 필요하다고 할 수 있다.
과수화상병균 및 가지검은마름병균의 감염을 구분할 수 있는 현장적용 가능한 면역진단시약의 개발은 현재까지 국내외에서 상용화된 사례는 없다. 현재 국내외적으로 개발된 과수화상병균의 면역진단 키트는 Ea의 major outer membrane protein(Lpp)을 표적으로 개발되었는데 공교롭게도 가지마름병균을 일으키는 Ep의 major outer membrane protein 아미노산 서열과 100% 일치하기 때문에 Ep 와 Ea 를 구별할 수는 없다.
이에 본 발명자들은 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae)와 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 구분할 수 있는 신규 표적 단백질 항원을 제공하고자 예의 노력한 결과, 어위니아 피리폴리애와 어위니아 아밀로보라를 구별할 수 있는 바이오마커를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 내지 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질 내지 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 인식하는 항체를 제공한다.
본 발명은 상기 항체를 포함하는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 키트를 제공한다.
본 발명은 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 발현하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단백질은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 를 구별함으로써 과수화상병 및 가지검은마름병을 구별하는 것이다.
본 발명은 i) 레반슈크라제(Levansucrase, lsc) 특이적 프라이머로 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 유전자를 증폭하는 단계;
ii) 상기 lsc 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
iii) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 전환 시켜 형질 전환체를 제조하는 단계;
iv) 상기 형질 전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
v) 상기 배양물로부터 재조합 lsc 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 항원 단백질을 인식하는 항체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항체 제조방법은
vi) 상기 재조합 lsc 항원 단백질을 포함하는 항혈청에서 항체를 분리하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명은 PCR 등 장비 없이도 과수화상병과 가지검은마름병을 간편하고신속하며 정확하게 구별 및 진단할 수 있으므로 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 내지 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1 은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, E. amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, E. pyrifoliae)를 구분할 수 있는 마커(marker) 유전자를 나타낸다.
도 2은 표적항원 유전자 특이적 프라이머 제작을 위한 제한효소 절단부위를 나타낸다.
도 3 은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, E. amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, E. pyrifoliae)의 유전체 DNA로부터 PCR 반응을 통해 lpp 와 lsc 유전자 DNA를 증폭한 후 크기를 확인하기 위하여 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색한 아가로스젤(agarose gel) 사진을 나타낸다(M: DNA ladder).
도 4 는 pET-28a 벡터에 표적유전자 DNA를 삽입하여 표적단백질을 생산하기 위해 디자인된 재조합벡터 클로닝 전략을 나타낸다.
도 5 의 a 는 pET28a 벡터를 함유한 대장균(Escherichia coli-DH5α)을 배양한 후 분리정제한 pET28a DNA의 크기를 확인하기 위하여 전기영동한 아가로스젤 사진을 나타낸다(M: DNA ladder; lane 1: 분리정제한 pET28a DNA). b 는 벡터에 PCR 증폭한 산물을 ligation하기 위해 pET28a, lpp 유전자 DNA 및 lsc 유전자 DNA를 제한효소 SacI과 HindIII로 절단한 후 전기영동한 아가로스젤 사진을 나타낸다(M: DNA ladder; lane 1: 제한효소 SacI과 HindIII로 절단한 pET28a DNA; lane 2: Ea-lpp DNA; lane 3: Ea-lsc DNA; lane 4: Ep-lpp DNA).
도 6 는 재조합벡터 pET28a-Ea-lpp(lanes 1-4), pET28a-Ea-lsc(lanes 5-8) 및 pET28a-Ep-lpp(lanes 9-12) 내에 PCR 증폭한 산물인 lpp와 lsc 유전자 조각이 존재하는지를 확인하기 위해 각 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 후 전기영동한 아가로스젤 사진을 나타낸다.
도 7 는 배지에 2.5 mM IPTG를 처리한 후 37℃에서 4시간 배양하여 재조합단백질 rLpp(좌)와 rLsc(우)을 불용해성 분획(insoluble fraction)에서 발현을 각각 유도한 SDS-PAGE gel 사진을 나타낸다.
도 8 은 변성조건에서 Ni-NTA resin 크로마토그라피(chromatography)를 통해서 분리정제한 재조합단백질 Ea-rLpp(좌, 23 kDa)와 Ea-rLsc(우, 54 kDa) SDS-PAGE gel 사진을 나타낸다.
도 9 은 재조합단백질 rLpp와 rLsc에 대한 마우스에 면역접종 6주 후에 항체(polyclonal antibody)를 생산한 후 제1차항체(1:2000, v/v)로 사용하여 각각의 재조합단백질에 대한 반응(reactivity)을 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 검정한 사진을 나타낸다. (좌) 항체: pAb-Ea-rLpp 및 이종항원: Ep-rLpp, (우) 항체: pAb-Ea-rLsc 및 동종항원: Ea-rLsc.
도 10 은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, Ea) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, Ep) 로부터 추출한 수용성 단백질(total soluble protein)에 대해 일차항체(1:2000, v/v)로 pAv-rLsc을 처리했고, 이차항체(1:20000, v/v)로 alkaline phosphatse-conjugate(상) 혹은 HRP-conjugate(하)를 처리하여 웨스턴 블롯 분석을 실시한 사진이다.
도 11 는 일차항체(pAb-rLsc, 1:2000, v/v) 및 이차항체(HRP-conjugate, 1:20000, v/v)의 탐색한계를 분리정제된 제조합단백질 rLsc에 대해 Western blot 분석을 실시한 결과(Lanes 1-4: 1000, 300, 100 및 10 ng; 상)와, 각 밴드의 강도를 Chemi-doc imaging system을 이용하여 정량 측정한 그래프(하)를 나타낸다.
도 2은 표적항원 유전자 특이적 프라이머 제작을 위한 제한효소 절단부위를 나타낸다.
도 3 은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, E. amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, E. pyrifoliae)의 유전체 DNA로부터 PCR 반응을 통해 lpp 와 lsc 유전자 DNA를 증폭한 후 크기를 확인하기 위하여 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색한 아가로스젤(agarose gel) 사진을 나타낸다(M: DNA ladder).
도 4 는 pET-28a 벡터에 표적유전자 DNA를 삽입하여 표적단백질을 생산하기 위해 디자인된 재조합벡터 클로닝 전략을 나타낸다.
도 5 의 a 는 pET28a 벡터를 함유한 대장균(Escherichia coli-DH5α)을 배양한 후 분리정제한 pET28a DNA의 크기를 확인하기 위하여 전기영동한 아가로스젤 사진을 나타낸다(M: DNA ladder; lane 1: 분리정제한 pET28a DNA). b 는 벡터에 PCR 증폭한 산물을 ligation하기 위해 pET28a, lpp 유전자 DNA 및 lsc 유전자 DNA를 제한효소 SacI과 HindIII로 절단한 후 전기영동한 아가로스젤 사진을 나타낸다(M: DNA ladder; lane 1: 제한효소 SacI과 HindIII로 절단한 pET28a DNA; lane 2: Ea-lpp DNA; lane 3: Ea-lsc DNA; lane 4: Ep-lpp DNA).
도 6 는 재조합벡터 pET28a-Ea-lpp(lanes 1-4), pET28a-Ea-lsc(lanes 5-8) 및 pET28a-Ep-lpp(lanes 9-12) 내에 PCR 증폭한 산물인 lpp와 lsc 유전자 조각이 존재하는지를 확인하기 위해 각 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 후 전기영동한 아가로스젤 사진을 나타낸다.
도 7 는 배지에 2.5 mM IPTG를 처리한 후 37℃에서 4시간 배양하여 재조합단백질 rLpp(좌)와 rLsc(우)을 불용해성 분획(insoluble fraction)에서 발현을 각각 유도한 SDS-PAGE gel 사진을 나타낸다.
도 8 은 변성조건에서 Ni-NTA resin 크로마토그라피(chromatography)를 통해서 분리정제한 재조합단백질 Ea-rLpp(좌, 23 kDa)와 Ea-rLsc(우, 54 kDa) SDS-PAGE gel 사진을 나타낸다.
도 9 은 재조합단백질 rLpp와 rLsc에 대한 마우스에 면역접종 6주 후에 항체(polyclonal antibody)를 생산한 후 제1차항체(1:2000, v/v)로 사용하여 각각의 재조합단백질에 대한 반응(reactivity)을 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 검정한 사진을 나타낸다. (좌) 항체: pAb-Ea-rLpp 및 이종항원: Ep-rLpp, (우) 항체: pAb-Ea-rLsc 및 동종항원: Ea-rLsc.
도 10 은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, Ea) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, Ep) 로부터 추출한 수용성 단백질(total soluble protein)에 대해 일차항체(1:2000, v/v)로 pAv-rLsc을 처리했고, 이차항체(1:20000, v/v)로 alkaline phosphatse-conjugate(상) 혹은 HRP-conjugate(하)를 처리하여 웨스턴 블롯 분석을 실시한 사진이다.
도 11 는 일차항체(pAb-rLsc, 1:2000, v/v) 및 이차항체(HRP-conjugate, 1:20000, v/v)의 탐색한계를 분리정제된 제조합단백질 rLsc에 대해 Western blot 분석을 실시한 결과(Lanes 1-4: 1000, 300, 100 및 10 ng; 상)와, 각 밴드의 강도를 Chemi-doc imaging system을 이용하여 정량 측정한 그래프(하)를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, Ea) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, Ep) 의 유전체 분석을 통해 두 균을 구분할 수 있는 마커(marker) 유전자를 발굴하였다(도 1). 레반슈크라제(levansucrase; Lsc)의 lsc 유전자는 Ea에서는 존재하였으나, Ep의 경우 lsc 유전자가 존재하지 않았다. 따라서 두 균으로부터 유전체 DNA를 추출하고, lsc 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 이용하여 PCR 증폭하고 이를 pET28a 벡터에 클로닝(cloning)한 후 대장균에 형질전환(transformation)시켰다. 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 콜로니(colony)를 선발하여 배양한 후 재조합단백질(rLsc)을 발현시키기 위해 다양한 농도의 IPTG를 첨가하고 최적조건을 결정하였다. rLsc에 대한 항체를 제조하기 위해 재조합단백질을 분리정제하였다. 이를 위해 변성조건에서 Ni-NTA resin 크로마토그래피(chromatography)를 실시하여 rLsc-6X His 융합단백질(fusion protein)을 용리(elution)하였다.
상기와 같은 방법으로 획득된 rLsc를 실험동물용 쥐에 3회 주사하여 채혈한 후 항혈청(antiserum)을 분리하고 이로부터 면역글로블린(immunoglobulin G; IgG)을 순수 분리정제하여 다클론항체를 획득하여 Ea 균과 Ep 균의 total protein에 대한 특이적반응을 검증하였다.
그 결과, 본 발명은 과수화상병(fire blight)을 일으키는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 와 가지검은마름병(black shoot blight)을 일으키는 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae)을 구분하기 위한 현장 진단용 조성물로서 효과적으로 활요될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 발현하는 벡터를 제공할 수 있다(도 4).
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공할 수 있다.
본 발명은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 인식하는 항체를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 항체를 포함하는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 발현하는 벡터를 제공할 수 있다(도 4).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단백질은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 를 구별함으로써 과수화상병 및 가지검은마름병을 구별하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공할 수 있다.
본 발명은 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 인식하는 항체를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 항체를 포함하는 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 i) 레반슈크라제(Levansucrase, lsc) 특이적 프라이머로 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 유전자를 증폭하는 단계;
ii) 상기 lsc 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
iii) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 전환 시켜 형질 전환체를 제조하는 단계;
iv) 상기 형질 전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
v) 상기 배양물로부터 재조합 lsc 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 항원 단백질을 인식하는 항체 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항체 제조방법은
vi) 상기 재조합 lsc 항원 단백질을 포함하는 항혈청에서 항체를 분리하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
표적항원 유전자 합성
<1-1> 유전체 DNA 추출
AccuPrep®DNA Extraction Kit(Bioneer Co., Korea)를 사용하여 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora, Ea) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae, Ep) 두 균주로부터 유전체(genomic) DNA를 추출하였다.
구체적으로, Ea 균과 Ep 균을 8000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액을 제거하고, 침전물을 TL 용액(tissue lysis buffer) 180 ㎕로 현탁한 후 20 ㎕의 Proteinase K 와 10 ㎕의 RNase A를 추가한 후 60℃에서 1시간 배양하였다. 그리고 200 ㎕의 GC 용액(binding buffer)을 넣고 혼합한 후 400 ㎕의 absolute 에탄올을 추가해 잘 혼합하였다. 용해물을 Binding column tube에 옮겨 담고 8000 rpm에서 1분 원심분리한 후 500 ㎕의 W1 용액(washing buffer)를 첨가하고 8000 rpm에서 1분 원심분리 하였다. 그리고 500 ㎕의 W2 용액(washing buffer)으로 세척하고 13000 rpm에서 1분 원심분리를 수행하였다. Binding column tube을 새로운 튜브에 옮긴 후 50 ㎕의 EA Buffer를 넣고 실온에서 5분 정치하였다. 최종적으로 8000 rpm에서 1분 원심분리를 수행하여 유전체 DNA를 획득하였다.
<1-2> 표적항원 유전자 특이적 프라이머(primer) 제작
제한효소 절단부위 포함하여 표적항원 유전자 특이적인 프라이머를 제작하였다 (도 2).
<1-3> PCR 반응
표적 1 및 표적 2와 공통된 조건으로서, 상기 실시예 <1-1> 에서 추출한 Ea와 Ep 유전체 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. 20 ㎕ PCR 반응액은 2 ㎕ 10X 완충액(Takara Bio., Japan), 1 ㎕ DNA(최종농도: 1 ng/㎕), 2 ㎕ 각각 2.5 mM dNTPs, 1 ㎕ 각각 forward 및 reverse 프라이머(10 pmol), 3-9 ㎕ 25 mM MgCl2(최종농도: 1.5-4.5 mM), 0.4 ㎕(1U) Taq 중합효소로 구성되었다. PCR 반응은 DNA를 95℃에서 2분간 1 사이클 변성(denaturation)시키고, 25 사이클 연속 반응(변성: 95℃에서 30초, annealing: 56℃에서 30초, 증폭: 72℃에서 1분)을 거친 후 마지막으로 72℃에서 5분 동안 처리하였다.
그 결과, 표적항원 유전자 1은 Ea와 Ep의 유전체 DNA로부터 234 bp가 합성되었다. 그러나 표적항원 유전자 2는 Ea의 유전체 DNA로부터 1248 bp가 합성되었으나, Ep의 유전체 DNA로부터 합성되지 않았다(도 3).
<1-4> 표적항원 유전자 pET28a 벡터 클로닝
상기 실시예 <1-3> 에 제시한 PCR 반응으로 증폭한 Erwinia spp. lpp 유전자 및 Ea 특이적 lsc 유전자 DNA를 각각 pET28a 벡터에 클로닝하고자 하였다(도 4).
구체적으로, pET28a 벡터를 함유한 대장균(Escherichia coli-DH5α)을 배양한 후 상업용 플라스미드 정제키트를 이용하여 분리정제하였다(도 5 a). 표적항원 유전자 클로닝을 위해 분리정제한 pET28a 벡터와 상기 실시예 <1-3> 에서 합성한 lpp 유전자 DNA와 lsc 유전자 2가지 제한효소 DNA를 SacI과 HindIII로 37℃에서 1시간 처리하여 절단하였다(SacI: 0.5 ㎕, HindIII: 0.5 ㎕, 10x buffer(Takara Bio., Japan), purified vector 4 ㎕, distilled water: 4 ㎕; ligation: In-Fusion HD multiple cloning(Takara Bio., Japan); 도 5 b).
상기와 같이 절단한 후, 항원유전자와 pET28a 벡터를 다음과 같이 혼합하여 50℃에서 30분간 ligation을 실시하였다.
| Gene | Vector(25 ng) | insert(50 ng) | 5x infusion | distilled water | total |
| lpp | 1.5 ㎕ | 3.5 ㎕ | 2.0 ㎕ | 3.0 ㎕ | 10 ㎕ |
| lsc | 1.5 ㎕ | 3.9 ㎕ | 2.0 ㎕ | 2.6 ㎕ | 10 ㎕ |
Competent cell 준비 및 재조합벡터 클로닝은, 50 ㎖ Luria-Berani(LB) 배지에 선배양한 Escherichia coli-BL21(DE3) 1 ㎖를 접종하고 37℃에서 2시간 진탕배양한 후 4℃8000 rpm에서 5분간 저속 원심분리하였다. 침전물을 필터링한 CaCl2 용액 10 ㎖로 현탁하고 얼음위에서 30분간 정치한 후 4℃8000 rpm에서 5분간 저속 원심분리하였다. 침전물을 필터링한 CaCl2 용액 2 ㎖로 현탁하고 얼음위에서 정치하였다. 현탁액 200 ㎕ 에 infusion product 10 ㎕ 섞고 얼음 위에서 30분 정치하였다. 항온수조 42℃에서 1분 열충격(heat shock) 후 얼음 위에서 2분 정치한 후 LB 800 ㎕ 첨가하고 37℃진탕배양기에서 1-3시간 배양하였다. kanamycin(50 ㎍/㎖)을 함유한 LB 아가배지에 대장균을 도말한 후 형질전환된 콜로니를 선발한 후 이를 LB(+kanamycin) 액체배지에 접종하여 37℃ 온도에서 배양하였다. 저속 원심분리하여 상층액은 제거하고 침전물을 수확한 후 EZ-Pure™ Plasmid Prep Kit Ver.2(Enzynomics Inc., Korea)를 이용하여 제조사의 지침에 따라서 재조합 플라스미드를 분리하고 pET-Erwinia-lpp 및 pEt-Ea-lsc라고 명명하였다.
상기와 같이 획득된 각각의 재조합 플라스미드에 표적유전자가 제대로 삽입되었는가를 검정하기 위해 각각의 재조합 플라스미드 DNA를 주형으로 상기 실시예<1-2>에 명시한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과, 각 표정항원 DNA가 합성되었다(도 6). 또한, 염기서열을 결정하여(outsourcing) 표적유전자가 벡터에 제대로 삽입되어 코돈 프레임(codon frame)에 문제가 없음을 확인하였다.
<1-5> 재조합단백질 발현
항원유전자 대장균 내 발현을 유도하기 위해 재조합 플라스미드(pET-Erwinia-lpp 및 pEt-Ea-lsc)를 함유한 대장균을 LB(+kanamycin) 액체배지에 OD600nm 값이 0.6이 될 때까지 배양한 후 2.5 mM(최종농도) IPTG(Isopropyl-β를 배지에 첨가하고 37℃에서 4시간 배양하였다. 시료별로 저속원심분리를 하고 침전된 대장균을 수확하고 이를 용해완충액{20 mM Tris-HCl (PH 6.8)}에 현탁한 후 초음파분해를 4회(1분/1회 및 1분 간격) 실시하였다. 분해된 시료는 저속 원심분리한 후 상층액과 침전물 분획으로 각각 수확하였다. 또한, 상층액에 존재하는 총단백질은 수용성 분획(soluble fraction), 침전물은 불용성 분획(insoluble fraction)이라 명명하고, 불용성분획은 20 mM Tris-HCl(PH 6.8)에 녹인 후 SDS-PAGE 분석하였다. 용해완충액은, Buffer B- 7M Urea, 100 mM Tris, 100 mM NaH2PO4, pH8.0; Buffer C- 8M Urea, 100 mM Tris, 100 mM NaH2PO4, pH6.3; Buffer C- 8M Urea, 100 mM Tris, 100 mM NaH2PO4, pH4.5 이었다.
분자량 및 과대발현을 조사하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 상기와 같이 추출된 분획물 뿐만 아니라 분리정제 과정의 각 단계가 완료될 때 마다 시료를 확보하여 변성완충액을 첨가하고 3-5분간 가열한 후 변성된 시료를 준비된 젤에 적재하여 15% SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 젤은 Coomassie blue 용액(methanol: glacial acetic acid: water, 5:1:5, v/v/v 혼합액에 0.05% Coommasie brilliant blue R-250를 용해시킴)으로 염색하여 단백질을 분석하였다.
상기와 같은 방법으로 SDS-PAGE 분석한 결과, 재조합단백질 Ep-rLPP는 Escherichia coli 용해물의 불용성 분획에서 과대발현(overexpression)되었고, 분자량은 약 23 kDa으로 관찰되었다(도 7). 그리고 재조합단백질 Ea-rLPP도 Escherichia coli 용해물의 불용성 분획에서 같은 크기의 밴드로 과대발현됨이 관찰되었다.
또한, 재조합단백질 Ea-rLsc도 불용성 분획에서 과대발현(overexpression)되었고, 분자량은 약 54 kDa으로 관찰되었다(도 7).
재조합 단백질 rLPP-6x His 융합단백질 및 rLsc-6x His 융합단백질의 분리정제는 Ni-NTA resin spin kit(Qiagen, USA)를 이용하여 제조사 지침에 따라 분리정제하였다.
다단계의 세척을 통해 분리정제된 Ea-rLPP와 Ea-rLsc 재조합단백질을 상기와 같은 방법으로 SDS-PAGE 분석한 후(도 8), 실험동물에 주사하기 위한 항원으로 준비하기 위해 농도를 측정하였다.
재조합단백질(Ea-rLPP와 Ea-rLsc)에 대한 항혈청 생산 및 다클론항체 정제
<2-1> 항혈청 생산
BALB/c mouse (5주령) 수컷에 항원(분리정제된 표적항원 재조합단백질)을 투여하여 항혈청 pAb-Ea-rLpp와 pAb-Ea-rLsc 를 생산하고자 하였다.
구체적으로, 항원은 2주 간격으로 3회 주사하였으며 주사 후 1주일 후 채혈하였다(1차 주사: 재조합단백질 (농도 100 ㎍) + complete adjuvant; 2차 주사: 재조합단백질 (농도 70 ㎍) + complete adjuvant; 3차 주사: 재조합단백질 (농도 50 ㎍))
<2-2> 항혈청의 항원탐색: Western blot
재조합단백질 Ep-rLpp와 Ea-rLsc을 1X PBS 완충액으로 희석(10 ㎍, 5 ㎍, 1 ㎍, 0.5 ㎍)하여 변성완충액을 첨가하고 3-5분간 가열한 후 변성된 시료를 준비된 젤에 적재하여 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 젤은 염색하지 않고 면역학적 분석을 위해 전기이동법(electro-transfer)으로 단백질을 nitrocellulose membrane(NCM)으로 이동시켰다. NCM은 비특이적 반응을 억제하기 위해 5% 무지방 분유(nonfat milk)를 0.1% Tween-20이 함유된 1x TBS 완충액에 녹인 블로킹 용액(blocking solution)에 담가 교반기 위에서 1시간 동안 처리한 후 0.1% Tween-20이 함유된 1x TBS 완충액으로 세척하였다. 일차항체(primary antibody)는 항혈청 pAb-Ea-rLpp와 pAb-Ea-rLsc를 1x PBS로 희석(1:2,000, V/V)한 후 사용하였다.
이차항체는 goat anti-rat alkaline phosphatase conjugate(Sigma Co., USA)를 희석 (1: 20,000, v/v)한 후 사용하였다. 일차 및 이차항체는 각각 1시간씩 반응시켰고, 각 단계 후 3회 세척하였다. 마지막으로 항원-항체반응을 육안으로 관찰하기 위해 NCM은 nitroblue tetrazoilium(NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate(BCIP)가 함유된 발색완충액(100 mM Tris, 100mM NaCl, 5mM MgCl2, pH 9.5)에 처리하여 발색시켰다.
다른 이차항체로 사용된 goat anti-mouse IgG(whole molecule)-peroxidase antibody (SIGMA, USA)로서 1: 20,000(v/v)으로 희석하고 1시간 반응시킨 후 3회 세척하였다. 항원-항체반응을 관찰하기 위해 SuperSignal™West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific™)을 기질로 사용했다. Stable Peroxide Buffer와 Luminol/Enhancer를 각각 1:1로 혼합하여 1분 동안 반응시켰고 Chemidoc Alliance Q9 Advanced(UVITEC)을 사용하여 관찰하였다.
각각의 항혈청을 이용하여 상기 실시예 <2-2> 방법으로 각각의 재조합단백질을 탐색한 결과, 다클론항체 pAb-Ea-rLpp는 이종항원 Ep-rLpp(표적 밴드: 23 kDa)에 대한 강한 반응을 나타내었다. 이 결과는 rLpp가 과수화상병과 가지검은마름병을 구분할 수 있는 특이성이 없다는 것을 암시하여 표적항원 후보에서 제외하였다.
또한, 다클론항체 pAb-Ea-rLsc는 동종항원 Ea-rLsc(표적 밴드: 54 kDa)에 대한 강한 반응을 나타내었다(도 9). 그리고 가지검은마름병균인 Ea와 Ep를 배양한 후 총단백질을 추출하여 다클론항체 pAb-Ea-rLsc에 대해 Western blot 분석을 실시한 결과 Ea의 총단백질에서는 밴드가 관찰되었으나, Ep의 총단백질에서는 밴드가 탐색되지 않았다. 두 가지 이차항체 alkaline phosphatase-conjugate와 HRP-conjugate를 비교한 결과 일치된 결과를 나타내었다(도 10). 이러한 결과는 pAb-Ea-rLsc가 과수화상병과 가지검은마름병을 판별할 수 있는 진단용 항체로 활용될 수 있음을 제시하였다.
<2-3> 다클론항체 IgG 분리정제
각 항혈청으로부터 rLpp-IgG와 rLsc-IgG를 분리정제하기 위하여 Mouse Antibody Purification Kit(Abcam Inc., England)를 구입하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 시도하였다. 먼저 항혈청에 1/10 양 만큼의 10ⅩBinding Buffer를 추가해준다. 실온에서 2시간 혹은 4℃ 에서 철야 진탕배양한 후 30초 원심분리한 후 결합되지 않은 단백질들을 제거하였다. Wash Buffer(0.5 ㎖)를 넣은 후 원심분리하는 과정을 3번 반복하였다. 카트리지를 새로운 튜브로 옮겨 Elution Buffer(100 ㎕)를 넣고 2분 동안 정치하였다. 30초 원심분리한 후 항체를 모아 Neutralization Buffer(25 ㎕)를 첨가하였다.
상기의 명시된 방법으로 항혈청으로부터 IgG를 분리하여 동질적인 rLsc 재조합단백질을 탐색한 결과, 탐색의 한계는 항원 100 ng까지 가능하였다(도 11).
Claims (8)
- 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 발현하는 재조합 벡터.
- 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
- 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 인식하는 항체.
- 제3항의 항체를 포함하는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 키트.
- 과수화상병 및 가지검은마름병 구별용 재조합 레반슈크라제(Levansucrase) 항원 단백질을 발현하는 재조합 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 단백질은 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 를 구별함으로써 과수화상병 및 가지검은마름병을 구별하는 것을 특징으로 하는 항원 단백질.
- i) 레반슈크라제(Levansucrase, lsc) 특이적 프라이머로 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 유전자를 증폭하는 단계;
ii) 상기 lsc 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
iii) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 전환 시켜 형질 전환체를 제조하는 단계;
iv) 상기 형질 전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
v) 상기 배양물로부터 재조합 lsc 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 및 어위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 구별용 재조합 항원 단백질을 인식하는 항체 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항체 제조방법은
vi) 상기 재조합 lsc 항원 단백질을 포함하는 항혈청에서 항체를 분리하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 제조방법.
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| KR20020048074A (ko) | 2000-12-15 | 2002-06-22 | 이계안 | 자동차의 러기지 네트 장착구조 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020048074A (ko) | 2000-12-15 | 2002-06-22 | 이계안 | 자동차의 러기지 네트 장착구조 |
| KR20110003280A (ko) | 2009-07-03 | 2011-01-11 | 캐논 가부시끼가이샤 | 정보처리장치, 정보처리방법, 기억매체 |
| KR20170064995A (ko) | 2015-12-02 | 2017-06-12 | 주식회사 엘지생활건강 | 화장용 퍼프 |
| KR20180124643A (ko) | 2017-05-11 | 2018-11-21 | 엄재풍 | 공기 열과 중력을 이용한 발전장치 |
| KR20210101357A (ko) | 2020-02-07 | 2021-08-19 | 삼성전자주식회사 | 볼 배치 시스템 및 기판 상에 볼을 배치하는 방법 |
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