KR20230144853A - 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 지상부 재분화 효율을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 유전자 및 이의 용도{Gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof}
본 발명은 식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물의 재분화(regeneration)는 작물의 게놈(genome) 편집, 형질전환 등 유전공학적 응용에 필수적인 기술로서, 낮은 재분화 효율은 게놈 편집의 주요한 허들로 알려져 있다. 고부가가치의 작물을 농생명공학적으로 육종하기 위해서는 게놈 편집 또는 형질전환후 조직의 탈분화(캘러스 형성, callus formation)와 지상부 재분화(shoot regeneration)가 순차적으로 수행된다. 이때 식물 재분화 과정의 효율이 매우 낮아 주요 작물의 형질개량이 매우 제한적으로 이루어지고 있는 상황이다.
최근 크리스퍼(CRISPR) 기술의 발전과 함께 정밀 육종의 수요와 시장이 폭발적으로 성장하고 있으며, 식물 재분화 기술은 해당 시장에서 필수적으로 요구되는 바, 혁신적인 문제점 개선을 위해 전세계적으로 노력이 집중되고 있다. 일반적으로, 식물의 재분화 효율 증진을 위해 재분화 유도배지에 다양한 호르몬과 첨가물을 배합하는 방식으로 재분화 증진을 도모하였으나, 뚜렷한 한계에 직면하고 있다.
식물의 낮은 재분화 효율은 유전적 장벽 때문인 것으로 알려져 있는데, 식물의 유전적인 요인에 의해 재분화 효율이 이미 결정되는 상황이기 때문에 재분화 과정을 방해하는 유전자의 제거가 재분화 증진을 가능하게 하는 핵심기술로 알려지고 있다. 따라서 재분화 효율 조절에 관여하는 유전자를 확보하고 해당 유전자의 발현 조절을 통해 작물의 재분화 효율을 증진하는 방법의 연구가 필요하다.
한편, 한국등록특허 제1898392호에는 '애기장대 유래 ATX4 유전자를 이용한 식물체의 재분화 효율 증가 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2125714호에는 '식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 DEMETER 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물체의 재분화 효율을 조절하는 애기장대 유래 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 지상부 재분화 과정에 관여할 것으로 예상되는 유전자들의 녹아웃(knock-out) 돌연변이체를 이용하여, 지상부 재분화 과정에 어떠한 영향이 있는지 분석한 결과, PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 유전자가 녹아웃된 돌연변이체의 재분화 효율이 야생형에 비해 현저하게 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 PRR9/7/5(Pseudo Response Regulator9/7/5), CCA1/LHY(Circadian Clock-Associated 1/Late Elongated Hypocotyl), FIP37(FKBP12 Interacting Protein 37), CML10(Calmodulin-Like Protein), PDAT1(Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase 1), SKM1/2(Sterility Rugulating Kinase Member1/2), CRY1(Cryptochrome 1), NUP160(Nucleoporin 160) 또는 NUP98a1/b1(Nucleoporin 98a1/b1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화(regeneration) 효율을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 야생형에 비해 재분화 효율이 감소된 돌연변이 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 유전자의 발현 조절을 통해 식물체의 재분화 효율을 조절할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 유전자들을 이용하면, 작물 형질전환 효율을 증진시킬 수 있을 것이며, 육종연한을 단축시키고 육종 과정의 효율화를 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 야생형(Col-0)과 각 유전자 녹아웃 돌연변이체의 하배축 절편체 유래 캘러스를 신초 유도배지에 동일기간 배양하였을 때 형성된 신초의 개수를 확인한 결과로, A는 PRR9/7/5 녹아웃 돌연변이체(prr975)의 결과이고, B는 CCA1/LHY 녹아웃 돌연변이체(cca1lhy)의 결과이고, C는 FIP37 녹아웃 돌연변이체(fip37-4/+LEC1:FIP37)의 결과이고, D는 CML10 녹아웃 돌연변이체(cml10-2)의 결과이고, E는 PDAT1 녹아웃 돌연변이체(pdat1-8)의 결과이고, F는 SKM1/2 녹아웃 돌연변이체(skm1 skm2)의 결과이고, G는 CRY1 녹아웃 돌연변이체(cry1-1)의 결과이고, H는 NUP160 녹아웃 돌연변이체(nup160-4)의 결과이며 I는 NUP98a1/b1 녹아웃 돌연변이체(nup98a1xnup98b1)의 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래 PRR9/7/5(Pseudo Response Regulator9/7/5), CCA1/LHY(Circadian Clock-Associated 1/Late Elongated Hypocotyl), FIP37(FKBP12 Interacting Protein 37), CML10(Calmodulin-Like Protein), PDAT1(Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase 1), SKM1/2(Sterility Rugulating Kinase Member1/2), CRY1(Cryptochrome 1), NUP160(Nucleoporin 160) 또는 NUP98a1/b1(Nucleoporin 98a1/b1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화(regeneration) 효율을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법에 있어서, 상기 PRR9/7/5 단백질은 각각 순서대로 PRR9, PRR7, PRR5 단백질을 의미하는 것이고, 상기 CCA1/LHY 단백질은 각각 CCA1, LHY 단백질을 의미하는 것이고, SKM1/2 단백질은 각각 SKM1, SKM2 단백질을 의미하는 것이며, NUP98a1/b1 단백질은 각각 NUP98a1, NUP98b1 단백질을 의미하는 것으로, 이들의 녹아웃 돌연변이체는 다중 돌연변이체이다.
본 발명에 따른 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법에 있어서, 상기 PRR9/7/5 단백질은 각각 순서대로 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을, 상기 CCA1/LHY 단백질은 각각 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을, 상기 FIP37 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을, 상기 CML10 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을, 상기 PDAT1 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을, 상기 SKM1/2 단백질은 각각 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을, 상기 CRY1 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을, 상기 NUP160 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을, 상기 NUP98a1/b1 단백질은 각각 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 내지 14로 표시되는 아미노산 서열과 각각 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 14로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 재분화 효율을 조절하는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 애기장대 유래 PRR9/7/5 유전자는 각각 순서대로 서열번호 15 내지 17로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, CCA1/LHY 유전자는 각각 서열번호 18 내지 19로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, FIP37 유전자는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, CML10 유전자는 서열번호 21로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, PDAT1 유전자는 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, SKM1/2 유전자는 각각 서열번호 23 또는 24로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, CRY1 유전자는 서열번호 25로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, NUP160 유전자는 서열번호 26으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, NUP98a1/b1 유전자는 각각 서열번호 27 또는 28로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 15 내지 28의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 재분화 효율 조절 방법에 있어서, 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절은 바람직하게는 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해된 것으로, 식물세포에서 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율을 감소시켰다.
상기 PRR9/7/5, CCA1/LHY, SKM1/2 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 다중 돌연변이체를 이루는 각 유전자가 모두 발현이 저해되었을 때 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율을 감소시키는 것이 특징이다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 감소된 재분화 효율은 바람직하게는 지상부 재분화(shoot regeneration)를 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 저해는 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자에 T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), X-레이 또는 γ-레이 조사를 통한 돌연변이 유발, VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터, RNAi(RNA interference) 또는 안티센스 RNA, CRISPR/Cas9 유전자 교정 시스템을 이용하여 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해(억제)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.
본 발명은 또한, 애기장대 유래 PRR9/7/5(Pseudo Response Regulator9/7/5), CCA1/LHY(Circadian Clock-Associated 1/Late Elongated Hypocotyl), FIP37(FKBP12 Interacting Protein 37), CML10(Calmodulin-Like Protein), PDAT1(Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase 1), SKM1/2(Sterility Rugulating Kinase Member1/2), CRY1(Cryptochrome 1), NUP160(Nucleoporin 160) 또는 NUP98a1/b1(Nucleoporin 98a1/b1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 및 이의 유전자는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법은 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율을 감소시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터이다. VIGS는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물 유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS(Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(Nopaline synthase), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(Phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 전식물로 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 전식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 야생형에 비해 재분화 효율이 감소된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다.
상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 애기장대 유래 PRR9/7/5(Pseudo Response Regulator9/7/5), CCA1/LHY(Circadian Clock-Associated 1/Late Elongated Hypocotyl), FIP37(FKBP12 Interacting Protein 37), CML10(Calmodulin-Like Protein), PDAT1(Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase 1), SKM1/2(Sterility Rugulating Kinase Member1/2), CRY1(Cryptochrome 1), NUP160(Nucleoporin 160) 또는 NUP98a1/b1(Nucleoporin 98a1/b1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 재분화 효율을 조절할 수 있는 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 저해되면 식물체의 재분화 효율이 감소될 수 있다. 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질 코딩 유전자는 전술한 것과 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 식물 재료 및 성장 조건
본 발명에서는 Columbia-0 생태형 애기장대(Col-0)를 야생형으로 사용하였다. 애기장대 종자의 표면을 멸균한 후, 1/2 MS(Murashige and Skoog)를 포함하는 0.7% 아가 플레이트에 심었다. 식물은 22~23℃에서 백색 형광등(120 μmol photons·m-2·s-1)을 사용하여 장일조건(16 시간 광/8 시간 암주기)으로 재배되었다.
CML10 녹아웃 돌연변이체(cml10-2, stock number CS872725), CRY1 녹아웃 돌연변이체(cry1-1, stock number CS70) 또는 NUP160 녹아웃 돌연변이체(nup160-4, stock number CS69986)는 ABRC (https://abrc.osu.edu/)로부터 구매하여 사용하였고, FIP37 녹아웃 돌연변이체(fip37-4/+LEC1:FIP37), PRR9/7/5 녹아웃 돌연변이체(prr975), CCA1/LHY 녹아웃 돌연변이체(cca1lhy), SKM1/2 녹아웃 돌연변이체(skm1 skm2) 또는 NUP98a1/b1 녹아웃 돌연변이체(nup98a1xnup98b1)는 하기 표 1에 개시된 논문의 저자로부터 각각 제공받아 사용하였으며, PDAT1 녹아웃 돌연변이체(pdat1-8)는 세종대학교 김현욱 교수님 실험실로부터 제공받아 사용하였다.
녹아웃 돌연변이체를 제공받은 저자의 논문 정보
녹아웃 돌연변이체 논문 정보
FIP37 녹아웃 돌연변이체
(fip37-4/+LEC1:FIP37)
Lisha Shen et al.,
Developmental Cell.2016.38(2);186-200
PRR9/7/5 녹아웃 돌연변이체
(prr975)

Norihito Nakamichi et al.,
Plant Cell Physiol.2007.48(6):822-32
CCA1/LHY 녹아웃 돌연변이체
(cca1lhy)
SKM1/2 녹아웃 돌연변이체
(skm1 skm2)
Satoshi Endo et al.,
Curr Biol.2013.23(17):1670-6
NUP98a1/b1 녹아웃 돌연변이체
(nup98a1xnup98b1)
Long Xiao et al.,
BMC Plant Biol.2020.20(1):1-15
2. 지상부 재분화(shoot regeneration)
지상부 재분화를 위해, 7일령 식물체의 하배축 절편체를 캘러스 유도배지[callus-inducing medium(CIM); 0.5 ㎍/㎖ 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 및 0.05 ㎍/㎖ 키네틴이 보충된 MS 배지]에서 22℃의 조건으로 7일간 암배양하였다. 그 후, 상기 유도된 캘러스를 CIM에서 7일 동안 전배양한 후, 신초 유도배지[shoot-inducing medium(SIM); 0.9 μmol/L 3-인돌아세트산, 2.5 μmol/L 2-이소펜테닐아데닌이 보충된 MS 배지]에서 25℃, 연속광 조건 하에서 18일 동안 배양하였다.
실시예 1. 야생형과 돌연변이체의 지상부 재분화능 분석
식물체의 재분화는 캘러스 유도와 de novo 지상부 기관형성(organogenesis)을 포함하는 두 단계 과정을 포함한다. 먼저 조직 절편체는 옥신이 풍부한 캘러스 유도배지(CIM)에 배양하여 분화된 체세포로부터 캘러스 형성을 자극시킨다. 옥신 생합성과 캘러스 형성 과정에는 많은 유전자들이 관여하는데, 그 중 대표적인 유전자가 ARFs(AUXIN RESPONSE FACTORs)와 LBDs(LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAINs)이다. 다능성(pluripotent)의 캘러스는 그 후 옥신 대비 시토키닌(cytokinin)의 높은 비율을 포함하는 신초 유도배지(SIM)로 옮겨 de novo 신초 형성을 유도하게 되고, 특히, 시토키닌 신호전달의 양성 조절자인 type B-ARR(ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR) 단백질에 의해 주로 조절된다. in vitro 식물의 재분화에는 많은 유전적 요소들이 관여한다는 연구가 보고되고 있으며, 재분화능은 주로 유전적 배경에 의해 결정되므로 본 발명자는 식물의 재분화에 관여하는 유전자를 스크리닝하고자, 다양한 녹아웃 돌연변이체를 이용하여 식물의 재분화능을 확인하였다.
야생형 애기장대와 각 녹아웃 돌연변이체의 하배축 절편체를 캘러스 유도배지에서 7일 동안 배양하여 유래한 캘러스를 신초 유도배지로 옮겨 18일 동안 배양한 후, 지상부 재분화능을 평가하기 위하여 캘러스로부터 형성된 신초의 개수를 확인하였다.
그 결과, PRR9/7/5 녹아웃 돌연변이체(prr975), CCA1/LHY 녹아웃 돌연변이체(cca1lhy), FIP37 녹아웃 돌연변이체(fip37-4/+LEC1:FIP37), CML10 녹아웃 돌연변이체(cml10-2), PDAT1 녹아웃 돌연변이체(pdat1-8), SKM1/2 녹아웃 돌연변이체(skm1 skm2), CRY1 녹아웃 돌연변이체(cry1-1), NUP160 녹아웃 돌연변이체(nup160-4) 또는 NUP98a1/b1 녹아웃 돌연변이체(nup98a1xnup98b1) 유래 캘러스에서 형성된 신초의 개수가 야생형에 비해 현저히 적은 것을 확인하였다(도 1).
상기 결과를 통해, PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 유전자를 과발현시킨다면 식물의 재분화 효율을 증진시킬 수 있음을 유추할 수 있었다.
본 결과물은 삼성미래기술육성사업(SSTF-BA2001-10)의 지원을 받아 연구되었습니다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Gene from Arabidopsis thaliana for regulating regeneration efficiency of plant and uses thereof <130> PN22093 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Gly Glu Ile Val Val Leu Ser Ser Asp Asp Gly Met Glu Thr Ile 1 5 10 15 Lys Asn Arg Val Lys Ser Ser Glu Val Val Gln Trp Glu Lys Tyr Leu 20 25 30 Pro Lys Thr Val Leu Arg Val Leu Leu Val Glu Ser Asp Tyr Ser Thr 35 40 45 Arg Gln Ile Ile Thr Ala Leu Leu Arg Lys Cys Cys Tyr Lys Val Val 50 55 60 Ala Val Ser Asp Gly Leu Ala Ala Trp Glu Val Leu Lys Glu Lys Ser 65 70 75 80 His Asn Ile Asp Leu Ile Leu Thr Glu Leu Asp Leu Pro Ser Ile Ser 85 90 95 Gly Phe Ala Leu Leu Ala Leu Val Met Glu His Glu Ala Cys Lys Asn 100 105 110 Ile Pro Val Ile Met Met Ser Ser Gln Asp Ser Ile Lys Met Val Leu 115 120 125 Lys Cys Met Leu Arg Gly Ala Ala Asp Tyr Leu Ile Lys Pro Met Arg 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Lys Asn Leu Trp Gln His Val Trp Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 Leu Arg Asp Asp Pro Thr Ala His Ala Gln Ser Leu Pro Ala Ser Gln 165 170 175 His Asn Leu Glu Asp Thr Asp Glu Thr Cys Glu Asp Ser Arg Tyr His 180 185 190 Ser Asp Gln Gly Ser Gly Ala Gln Ala Ile Asn Tyr Asn Gly His Asn 195 200 205 Lys Leu Met Glu Asn Gly Lys Ser Val Asp Glu Arg Asp Glu Phe Lys 210 215 220 Glu Thr Phe Asp Val Thr Met Asp Leu Ile Gly Gly Ile Asp Lys Arg 225 230 235 240 Pro Asp Ser Ile Tyr Lys Asp Lys Ser Arg Asp Glu Cys Val Gly Pro 245 250 255 Glu Leu Gly Leu Ser Leu Lys Arg Ser Cys Ser Val Ser Phe Glu Asn 260 265 270 Gln Asp Glu Ser Lys His Gln Lys Leu Ser Leu Ser Asp Ala Ser Ala 275 280 285 Phe Ser Arg Phe Glu Glu Ser Lys Ser Ala Glu Lys Ala Val Val Ala 290 295 300 Leu Glu Glu Ser Thr Ser Gly Glu Pro Lys Thr Pro Thr Glu Ser His 305 310 315 320 Glu Lys Leu Arg Lys Val Thr Ser Asp Gln Gly Ser Ala Thr Thr Ser 325 330 335 Ser Asn Gln Glu Asn Ile Gly Ser Ser Ser Val Ser Phe Arg Asn Gln 340 345 350 Val Leu Gln Ser Thr Val Thr Asn Gln Lys Gln Asp Ser Pro Ile Pro 355 360 365 Val Glu Ser Asn Arg Glu Lys Ala Ala Ser Lys Glu Val Glu Ala Gly 370 375 380 Ser Gln Ser Thr Asn Glu Gly Ile Ala Gly Gln Ser Ser Ser Thr Glu 385 390 395 400 Lys Pro Lys Glu Glu Glu Ser Ala Lys Gln Arg Trp Ser Arg Ser Gln 405 410 415 Arg Glu Ala Ala Leu Met Lys Phe Arg Leu Lys Arg Lys Asp Arg Cys 420 425 430 Phe Asp Lys Lys Val Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Lys Leu Ala Glu Gln 435 440 445 Arg Pro Arg Val Lys Gly Gln Phe Val Arg Thr Val Asn Ser Asp Ala 450 455 460 Ser Thr Lys Ser 465 <210> 2 <211> 727 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Asn Ala Asn Glu Glu Gly Glu Gly Ser Arg Tyr Pro Ile Thr Asp 1 5 10 15 Arg Lys Thr Gly Glu Thr Lys Phe Asp Arg Val Glu Ser Arg Thr Glu 20 25 30 Lys His Ser Glu Glu Glu Lys Thr Asn Gly Ile Thr Met Asp Val Arg 35 40 45 Asn Gly Ser Ser Gly Gly Leu Gln Ile Pro Leu Ser Gln Gln Thr Ala 50 55 60 Ala Thr Val Cys Trp Glu Arg Phe Leu His Val Arg Thr Ile Arg Val 65 70 75 80 Leu Leu Val Glu Asn Asp Asp Cys Thr Arg Tyr Ile Val Thr Ala Leu 85 90 95 Leu Arg Asn Cys Ser Tyr Glu Val Val Glu Ala Ser Asn Gly Ile Gln 100 105 110 Ala Trp Lys Val Leu Glu Asp Leu Asn Asn His Ile Asp Ile Val Leu 115 120 125 Thr Glu Val Ile Met Pro Tyr Leu Ser Gly Ile Gly Leu Leu Cys Lys 130 135 140 Ile Leu Asn His Lys Ser Arg Arg Asn Ile Pro Val Ile Met Met Ser 145 150 155 160 Ser His Asp Ser Met Gly Leu Val Phe Lys Cys Leu Ser Lys Gly Ala 165 170 175 Val Asp Phe Leu Val Lys Pro Ile Arg Lys Asn Glu Leu Lys Ile Leu 180 185 190 Trp Gln His Val Trp Arg Arg Cys Gln Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Glu Ser Gly Thr His Gln Thr Gln Lys Ser Val Lys Ser Lys Ser Ile 210 215 220 Lys Lys Ser Asp Gln Asp Ser Gly Ser Ser Asp Glu Asn Glu Asn Gly 225 230 235 240 Ser Ile Gly Leu Asn Ala Ser Asp Gly Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ala 245 250 255 Gln Ser Ser Trp Thr Lys Lys Ala Val Asp Val Asp Asp Ser Pro Arg 260 265 270 Ala Val Ser Leu Trp Asp Arg Val Asp Ser Thr Cys Ala Gln Val Val 275 280 285 His Ser Asn Pro Glu Phe Pro Ser Asn Gln Leu Val Ala Pro Pro Ala 290 295 300 Glu Lys Glu Thr Gln Glu His Asp Asp Lys Phe Glu Asp Val Thr Met 305 310 315 320 Gly Arg Asp Leu Glu Ile Ser Ile Arg Arg Asn Cys Asp Leu Ala Leu 325 330 335 Glu Pro Lys Asp Glu Pro Leu Ser Lys Thr Thr Gly Ile Met Arg Gln 340 345 350 Asp Asn Ser Phe Glu Lys Ser Ser Ser Lys Trp Lys Met Lys Val Gly 355 360 365 Lys Gly Pro Leu Asp Leu Ser Ser Glu Ser Pro Ser Ser Lys Gln Met 370 375 380 His Glu Asp Gly Gly Ser Ser Phe Lys Ala Met Ser Ser His Leu Gln 385 390 395 400 Asp Asn Arg Glu Pro Glu Ala Pro Asn Thr His Leu Lys Thr Leu Asp 405 410 415 Thr Asn Glu Ala Ser Val Lys Ile Ser Glu Glu Leu Met His Val Glu 420 425 430 His Ser Ser Lys Arg His Arg Gly Thr Lys Asp Asp Gly Thr Leu Val 435 440 445 Arg Asp Asp Arg Asn Val Leu Arg Arg Ser Glu Gly Ser Ala Phe Ser 450 455 460 Arg Tyr Asn Pro Ala Ser Asn Ala Asn Lys Ile Ser Gly Gly Asn Leu 465 470 475 480 Gly Ser Thr Ser Leu Gln Asp Asn Asn Ser Gln Asp Leu Ile Lys Lys 485 490 495 Thr Glu Ala Ala Tyr Asp Cys His Ser Asn Met Asn Glu Ser Leu Pro 500 505 510 His Asn His Arg Ser His Val Gly Ser Asn Asn Phe Asp Met Ser Ser 515 520 525 Thr Thr Glu Asn Asn Ala Phe Thr Lys Pro Gly Ala Pro Lys Val Ser 530 535 540 Ser Ala Gly Ser Ser Ser Val Lys His Ser Ser Phe Gln Pro Leu Pro 545 550 555 560 Cys Asp His His Asn Asn His Ala Ser Tyr Asn Leu Val His Val Ala 565 570 575 Glu Arg Lys Lys Leu Pro Pro Gln Cys Gly Ser Ser Asn Val Tyr Asn 580 585 590 Glu Thr Ile Glu Gly Asn Asn Asn Thr Val Asn Tyr Ser Val Asn Gly 595 600 605 Ser Val Ser Gly Ser Gly His Gly Ser Asn Gly Pro Tyr Gly Ser Ser 610 615 620 Asn Gly Met Asn Ala Gly Gly Met Asn Met Gly Ser Asp Asn Gly Ala 625 630 635 640 Gly Lys Asn Gly Asn Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 645 650 655 Ser Gly Asn Leu Ala Asp Glu Asn Lys Ile Ser Gln Arg Glu Ala Ala 660 665 670 Leu Thr Lys Phe Arg Gln Lys Arg Lys Glu Arg Cys Phe Arg Lys Lys 675 680 685 Val Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Lys Leu Ala Glu Gln Arg Pro Arg Val 690 695 700 Arg Gly Gln Phe Val Arg Lys Thr Ala Ala Ala Thr Asp Asp Asn Asp 705 710 715 720 Ile Lys Asn Ile 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actcacctgg tccaccgttt agtaatcagc tgaattcttg gccgggacag 1200 agttcatacc ctacgccaac ccctatcaac aatatacagt tcagagatcc caacacagct 1260 tatacatctg caatggctcc tgcttcactc tccccaagcc ctagttccgt tagcccgcat 1320 gagtacagtt ccatgtttca cccattcaac agtaaacccg aggggttaca agaccgggat 1380 tgttccatgg atgtagatga gaggagatac gtctcttctg caaccgaaca tagtgcaata 1440 ggcaatcaca ttgatcagct tattgagaag aagaacgaag atggctattc attatccgtc 1500 gggaaaattc agcaatctct tcaacgagaa gccgctttaa ccaaattccg aatgaagcga 1560 aaggacagat gttatgagaa aaaggttcgt tacgagagcc ggaagaaatt agcagagcaa 1620 cgaccacgaa tcaaaggcca attcgttcgt caagtccaat ccacacaagc tccatag 1677 <210> 18 <211> 1827 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 18 atggagacaa attcgtctgg agaagatctg gttattaaga ctcggaagcc atatacgata 60 acaaagcaac gtgaaaggtg gactgaggaa gaacataata gattcattga agctttgagg 120 ctttatggta gagcatggca gaagattgaa gaacatgtag caacaaaaac tgctgtccag 180 ataagaagtc acgctcagaa atttttctcc aaggtagaga aagaggctga agctaaaggt 240 gtagctatgg gtcaagcgct 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gagagcgatg gactgaggat gagcatgaga ggtttctaga agccttgagg 120 ctttatggaa gagcttggca acgaattgaa gaacatattg ggacaaagac tgctgttcag 180 atcagaagtc atgcacaaaa gttcttcaca aagttggaga aagaggctga agttaaaggc 240 atccctgttt gccaagcttt ggacatagaa attccgcctc ctcgtcctaa acgaaaaccc 300 aatactcctt atcctcgaaa gcctgggaac aacggtacat cttcctctca agtatcatca 360 gcaaaagatg caaaacttgt ttcatcggcc tcttcttcac agttgaatca ggcgttcttg 420 gatttggaaa aaatgccgtt ctctgagaaa acatcaactg gaaaagaaaa tcaagatgag 480 aattgctcgg gtgtttctac tgtgaacaag tatcccttac caacgaaaca ggtaagtggc 540 gacattgaaa caagtaagac ctcaactgtg gacaacgcgg ttcaagatgt tcccaagaag 600 aacaaagaca aagatggtaa cgatggtact actgtgcaca gcatgcaaaa ctacccttgg 660 catttccacg cagatattgt gaacgggaat atagcaaaat gccctcaaaa tcatccctca 720 ggtatggtat ctcaagactt catgtttcat cctatgagag aagaaactca cgggcacgca 780 aatcttcaag ctacaacagc atctgctact actacagctt ctcatcaagc gtttccagct 840 tgtcattcac aggatgatta ccgttcgttt ctccagatat catctacttt ctccaatctt 900 attatgtcaa ctctcctaca gaatcctgca gctcatgctg cagctacatt cgctgcttcg 960 gtctggcctt atgcgagtgt cgggaattct ggtgattcat caaccccaat gagctcttct 1020 cctccaagta taactgccat tgccgctgct acagtagctg ctgcaactgc ttggtgggct 1080 tctcatggac ttcttcctgt atgcgctcca gctccaataa catgtgttcc attctcaact 1140 gttgcagttc caactccagc aatgactgaa atggataccg ttgaaaatac tcaaccgttt 1200 gagaaacaaa acacagctct gcaagatcaa aacttggctt cgaaatctcc agcttcatca 1260 tctgatgatt cagatgagac tggagtaacc aagctaaatg ccgactcaaa aaccaatgat 1320 gataaaattg aggaggttgt tgttactgcc gctgtgcatg actcaaacac tgcccagaag 1380 aaaaatcttg tggaccgctc atcctgtggc tcaaatacac cttcagggag tgacgcagaa 1440 actgatgcat tagataaaat ggagaaagat aaagaggatg tgaaggagac agatgagaat 1500 cagccagatg ttattgagtt aaataaccgt aagattaaaa tgagagacaa caacagcaac 1560 aacaatgcaa ctactgattc gtggaaggaa gtctccgaag agggtcgtat agcgtttcag 1620 gctctctttg caagagaaag attgcctcaa agcttttcgc ctcctcaagt ggcagagaat 1680 gtgaatagaa aacaaagtga cacgtcaatg ccattggctc ctaatttcaa aagccaggat 1740 tcttgtgctg cagaccaaga 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atctatgcag 2040 aaaaatgatg gtgaggcatt atctgatatc tgtagttcta tcctcgtcca agccacttct 2100 cagtttgtaa aggtgatgtt tgagtcggca tttgacatct tcctactcat cagctatctg 2160 cttaacatcg ctgggcaggt taatatgtca cagcaagaca tatgcaagct acggcttgag 2220 ttgcttccaa tgatccaaga tattgtctca gagtggctca tcatcctttt ctttgttacc 2280 actccagctg agtcaacttc tatggaagat ttcagcttga aactttcatc tctacagatt 2340 gatagcagca ttgacaaaag atcatggaac gcaatgctag ggaaatgtgg tttctcactg 2400 gcgtttattc ttctctttag tgaccgaagt tgcattgtgg atggccgctt taacttgaga 2460 tatcttccga gttcacaaat cattacaagt ttggtgcaaa actttatcag ctggattcgg 2520 tatagtaaaa caggagatga ctcttcttca ctgctaagac gctccacgga acttagtctt 2580 aggttgattc ggaatggaca atctgatgct gttgagcgaa tccttgtggt tgtggaggca 2640 agtttacgtg gggagaaaac atttggatgt tctcaagata ctagtggaga ttggtgtctt 2700 cttcaacatc tccgtggttg ttgccttctt gatcaagtac aacgtggtgc aagtggcata 2760 ttaagagaga gaaagattat tgatgccatc cgctgcttct tcagagcttc atcaggtgaa 2820 ggatcttgga aggctttgca cagcttgtct aaagaagcag gattttcacc tgccacaacg 2880 ggtccaagta ttttagatgg ttctacgtct tctgcagcat ggaaacttca ttactatgag 2940 tgggctatgc aaatttttga acggtacaat ataagtgaag gagcttgtca gtttgcctat 3000 gcagcccttg agcaagtaga tgatgcctat aatttcatag agatgactga ggaattcgat 3060 ccaactaaag cagccaccta cactagagga cgactgtggg caaatgtttt caagttcacc 3120 ttagatctca atctcttgaa tgatgcctac tgtgctataa tttcaaaccc tgatgaggag 3180 attaagcgca tctgtttgag gcgcttcata atagttctat ttgaatgtgg caaaacgaag 3240 atcctcagtg atggacatct acctttcatc ggcttaacag agaagatcac ccaagagctt 3300 ttttggaagg ccggacgttc tgatataatg atgaagccaa atccatacaa gctgctttat 3360 gcttatgaga tgagacgaca caattggcga atggcggcaa gttacatgta tcagttttct 3420 gcccgtttga gaagcgaggg agcatgcaag gattacaaac acatgtccct agttttgcaa 3480 gagaggctta atggactttc tgctgctatg aatgcattag cccttgttca tcctgggtat 3540 gcttggattg atccagtacc agaagaaacc acacgttatc cggttaaaaa ggctagaaga 3600 gcagaagaag aacaattaag gagtaatgac cagcccaaag gggagaagag ttgcattgat 3660 atcgagaaac tccaaaacga gtttgttttt actactgctg aatatatgct ttctctgaaa 3720 aatttcgggt ggacatattc aggactcgaa aagccaccat cagatttggt tgaccttctt 3780 gtccaggcaa acttgtatga catggcattc actgttgttt tgaaattttg gaggggctcc 3840 gctttgaaaa gggagctgga aaagatattt gagaatatgg caattaaatg ttgccctgct 3900 aaaggaactc tgtggtcatc gcctaatctt atgttaacat ctaacgatga agaagttact 3960 cattcgcctg atagaagccc tgctgatcag ggctctaagt tggctggtga ttgggaaatt 4020 cttgaggttt atctgaagag gtacatagac atacacgcta gactaccggt ttctgttgct 4080 tcaacccttc ttcaagcaga ttcttgtatc gaattgcctc tctggctgat tcaaatgttc 4140 aaggatggtc agaaggaaaa agctttggga atggctgggc aagaagcaag tcctgcttcc 4200 ttgtttcagt tatatgttga ttatgggcgt cttacagagg caactaattt gctacttgag 4260 tacatggaat catttgcttc atcgaaacca gcagaggtat tgaagaggaa aaaggtatcc 4320 ggagtttggt ttccgtacac aacagtagaa agactatggt gggagctaga gaaaacaatg 4380 aactcaggac gaatggtgga gcaatgccat aagctgaagg aacaacttca tcatgcatta 4440 ctcaatcact taaaactgct taaggtggac tcaaatgatg ctgtatcctc tgcaaccggt 4500 taa 4503 <210> 27 <211> 3126 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 27 atgtttggct catctaatcc ttttggacag tcatctggta ccagcccatt tgggtctcaa 60 tctttgtttg gtcagaccag caatacaagt agtaataatc cctttgctcc agctacaccg 120 tttggcacgt ctgctccttt tgctgcacag tcgggaagtt caatattcgg aagcacttca 180 accggtgttt ttggtgcacc tcaaacatcc tctccctttg cctccacccc aacttttgga 240 gcttcttcat caccagcatt tgggaattct actccggcct ttggagcatc tccagcatct 300 tcaccttttg gtggatcttc tggttttggg cagaaacctt tgggattttc aacgcctcag 360 tcaaatcctt ttggaaactc cacgcagcaa tcccaacctg catttggaaa cacctctttt 420 ggttcgtcta caccttttgg tgccactaac acgcctgcct ttggcgctcc aagcacgcct 480 tcttttggcg ccacaagcac accctcgttt ggtgcatcaa gcacgcctgc ctttggtgcc 540 acaaacacgc ctgccttcgg tgcctcaaac tctccctcct ttggcgccac aaacacacct 600 gcatttggcg cgtcaccgac tccagctttt ggtagcactg gcaccacgtt tggtaacact 660 ggctttggtt ctggaggtgc ttttggagct tcaaacaccc ctgcttttgg tgcatcaggc 720 actccggctt ttggtgcatc aggcactcct gccttcggtg catcaagtac tcctgccttt 780 ggggcatcca gtactcctgc ctttggggca tccagtactc ctgcctttgg gggatctagt 840 actccttctt ttggtgcgtc aaatacctca tcctttagtt ttggctcgtc tccagctttt 900 ggccagtcta catcagcctt tggtagcagc gcctttggct ctacaccatc tccctttgga 960 ggtgcgcagg cttcaacccc tacatttggg ggttctggtt ttggtcaatc aactttcggt 1020 ggtcaacaag ggggcagtcg agctgtgcct tatgcaccaa ctgttgaggc agacacaggg 1080 accggcactc agcctgctgg aaagttggaa tctatttctg ccatgccagc atacaaagag 1140 aaaaactatg aggagctgag gtgggaagat taccagcgag gagataaagg tggaccactt 1200 cctgctggcc agtctcctgg caatgccgga tttggtatat caccttctca accaaatcca 1260 ttttctccat caccggcgtt tggtcagaca tcagcaaatc caacaaaccc tttttcgagc 1320 tcaacatcta ccaacccttt tgcccctcaa accccaacaa ttgctagttc gagttttgga 1380 acggctacct caaattttgg ttcctcgccc tttggtgtaa catcttcttc caatcttttt 1440 ggttcaggtt catcaactac cacatccgtt tttggatcat cctccgcttt tggaacaacg 1500 acaccatcac cgttatttgg ttcatcaagc actcctggat ttggctcttc ttcatcaatc 1560 tttggttcag ctcctggtca gggggcaact ccagcatttg gcaacagtca gccatctact 1620 ctgttcaatt caaccccttc gaccgggcag actggttctg cgtttggaca gactggttct 1680 gcttttggac agttcggaca gagtagtgct cctgcatttg gccaaaatag catttttaat 1740 aaaccttcca ctggatttgg aaacatgttt tccagttctt caacattaac cacgtctagc 1800 agctctccct ttggacaaac aatgcctgct ggtgtgacac cctttcaatc agctcagcca 1860 ggtcaagcat caaatggttt tggtttcaac aacttcggtc aaaatcaagc agctaatact 1920 actggaaatg ctggtggact ggggattttt ggtcaaggca acttcgggca atcgcctgct 1980 ccgctgaact ctgttgtttt gcaaccagtt gctgtgacaa acccatttgg aacacttcct 2040 gctatgcctc agatttcaat aaatcaaggt ggaaattcac cttccattca atatggaatc 2100 tccagcatgc ctgttgttga caaacctgct cctgttagaa tatcatctct cctgacttct 2160 cgacacctat tacacaggcg ggtcaggctg ccggcaagaa agtaccgtcc tggcgagaat 2220 ggtccaaagg ttccattttt cactgatgac gaagagagct caagtacacc aaaggcggat 2280 gctcttttca ttccaaggga gaaccctaga gctctagtta tacgcccagt tcaacagtgg 2340 tcttcaaggg ataaatcaat acttccaaag gaacaacgcc cgactgctcc attacatgac 2400 aatgggaaga gtcccgacat ggccactgat gcagcaaacc atgacagaaa tggtaacgga 2460 gaacttggtg ctactgggga aagaattcat acatcagtca atgcaaatca gaaaccgaat 2520 ggcacaacac gctcagatca ggctagcgag aaagagcgtc cctacaaaac tctaagtgga 2580 cacagagcag gagaagccgc aattgtttat gagcacggtg cagatatcga ggctcttatg 2640 ccgaagctac gacaatctga ttatttcaca gagccacgta tccaagaact agcagctaag 2700 gaaagagcgg atccgggtta ctgcaggcgg gtaagagact ttgtagtggg acgacacggt 2760 tatggtagca taaagttcat gggagagaca gatgtgcgta ggctagactt ggaatcactg 2820 gttcagttca atacacggga agtgattgta tacatggacg agagcaagaa accggctgtt 2880 gggcaaggtt tgaataaacc ggcggaagta acgttgctga acataaaatg tattgacaag 2940 aagacaggga aacagtttac tgaaggagag agagtggaga agtataagat gatgcttaag 3000 aagaaagctg aggcacaagg agctgagttt gtgtcatttg atccagtgaa aggcgaatgg 3060 aagtttcggg tcgagcattt tagttcgtat aagctgggcg acgaagatga agaagatgga 3120 gtttag 3126 <210> 28 <211> 2994 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 28 atgttcggtt cttctaataa taatcctttt ggacagtcat ctataagcag tccttttggg 60 acccaaactc attctttgtt cggacagacc aataataacg cgagcaataa tccttttgct 120 acgaaacctt ttggtacttc tactcctttt ggcgcacaga cagggagttc tatgtttggg 180 ggcacttcaa ctggtgtgtt tggtgcacct caaacttctt caccttttgg tgcttcacca 240 caagcgtttg ggagctctac tcaggctttt ggagcatctt ctaccccttc atttggcagt 300 tcaaattcac cttttggtgg cacctctacg tttggtcaga agtcttttgg cctctcaaca 360 cctcagtcaa gtccttttgg aagcaccaca caacaatcac agcctgcctt tggaaacagc 420 acttttggtt catcaacacc ttttggtgcc tcaaccacgc ctgcctttgg tgcctctagc 480 acgcctgcct ttggtgtctc aaacacttcc gggtttggag ccacaaacac acccggattt 540 ggtgccacaa acacaacagg gtttggtggc agtagcacac ctgggtttgg ggcatcaagc 600 acgcctgcct ttggctccac aaacacgcct gcttttggtg cttcaagtac tcctttattc 660 ggctcctcga gctcacctgc atttggtgcg tcacctgctc cagcctttgg tagctctggc 720 aatgcatttg gcaacaatac cttcagttct ggaggtgctt ttggttcatc aagcactcct 780 acgtttgggg catctaacac ttctgccttt ggggcatcaa gttccccatc ttttaatttc 840 ggttcttccc cagcttttgg acagtctacc tcagcatttg gtagcagttc ctttggttct 900 acacaatctt ccttaggttc tacaccatct cccttcggag cccaaggtgc acaggcttcg 960 acttcaacat ttgggggtca atcaactatc gggggtcaac aaggggggag tagggttatt 1020 ccttatgcac ctacaactga cacagcgtca ggcactgaaa gcaagtctga aagactacaa 1080 tctatatctg ccatgcctgc acacaaaggg aaaaacatgg aggagcttag gtgggaggac 1140 taccagcgag gagataaagg aggacaacgt tctactggtc aatctcctga aggtgctgga 1200 tttggtgtaa caaattctca gccaagtata ttctctacgt caccagcgtt tagccagaca 1260 cctgtgaatc caacaaaccc tttttcacag acgactccaa caagtaacac aaatttttcc 1320 ccctccttta gtcaacccac taccccatcc tttggtcaac ccactacccc atcctttagg 1380 tcaactgtat caaatactac atccgttttt ggatcatcct ctagtttaac aacaaacaca 1440 tcgcagccac ttggttcatc aatatttggt tctactcctg cacatgggtc aactccagga 1500 tttagcattg gtggatttaa caacagtcag tcatctccgc tgtttggttc aaacccctca 1560 tttgcacaaa ataccactcc tgcattcagc cagactagtc ctttgtttgg acagaatacc 1620 actcctgcat taggacagtc tagttctgtg tttggacaga ataccaatcc tgcacttgta 1680 cagagcaaca ctttcagtac accttccact ggctttggga acacgttttc aagctcttca 1740 tccttaacta caagcatctc cccctttggt caaataacgc ctgctgttac gccctttcaa 1800 tcagctcagc caactcaacc attaggtgct tttggtttca acaactttgg tcaaacccaa 1860 atagctaata caactgacat tgcaggtgca atgggaactt ttagccaagg aaactttaag 1920 caacagcctg cattgggtaa ctctgctgtt atgcaaccaa ctcctgttac aaacccattt 1980 ggaacacttc ctgctttgcc tcagatttca attgctcaag gtggaaattc accttcgatt 2040 cagtatggta tctccagcat gcctgtcgtt gataagcctg ctcctgttag agtatcacca 2100 ctcctaactt ctcgacacct tttacaaagg cgggtcaggc taccaacaag aaagtaccgt 2160 cctagtgatg atggtccaaa ggttccattc ttcagcgatg aagaggagaa ttccagtaca 2220 ccaaaggctg atgcgttttt cattccaagg gagaacccta gagctttatt tatacgccca 2280 gttgaaaggg taaaatcaga acatccaaag gatagcccga ccccactgca ggagaacggt 2340 aagaggtcga atggggttac taatggagcc aaccatgaga ctaaggataa cggtgcaatt 2400 cgtgaagctc ccccggtaaa agtcaatcag aaacagaacg ggacacatga aaatcacgga 2460 ggcgacaaaa acggttcaca cagttcacca agtggagcag atattgagtc attaatgccg 2520 aagttgcatc actctgaata tttcacagag cctcggatcc aagaactggc tgcaaaagaa 2580 agggttgaac agggttattg caagcgggta aaggactttg ttgttgggag acacggttac 2640 gggagcataa agtttctagg agagacggat gtgtgtagac tcgacctgga aatggtggtt 2700 cagttcaaaa accgggaagt gaatgtgtac atggacgaga gcaaaaaacc gccggtgggt 2760 caaggattga ataagcctgc ggtggtaact ttgctgaaca taaaatgtat ggacaagaag 2820 accggcacgc aagtgatgga aggcgagaga ttggacaagt acaaggaaat gctcaagagg 2880 aaagctgggg aacaaggagc tcagtttgtg tcttatgatc ctgtgaatgg cgagtggact 2940 ttcaaggtcg aacatttcag ttcctacaag cttggagatg aatatgatgt gtag 2994

Claims (10)

  1. 애기장대 유래 PRR9/7/5(Pseudo Response Regulator9/7/5), CCA1/LHY(Circadian Clock-Associated 1/Late Elongated Hypocotyl), FIP37(FKBP12 Interacting Protein 37), CML10(Calmodulin-Like Protein), PDAT1(Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase 1), SKM1/2(Sterility Rugulating Kinase Member1/2), CRY1(Cryptochrome 1), NUP160(Nucleoporin 160) 또는 NUP98a1/b1(Nucleoporin 98a1/b1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화(regeneration) 효율을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PRR9/7/5 단백질은 각각 순서대로 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 CCA1/LHY 단백질은 각각 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 FIP37 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 CML10 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 PDAT1 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 SKM1/2 단백질은 각각 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 CRY1 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 NUP160 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 NUP98a1/b1 단백질은 각각 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 재분화 효율을 감소시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 저해는 VIGS (Virus-induced gene silencing), RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), 방사선 조사 또는 유전자 교정 시스템을 통한 돌연변이 유발을 이용하여 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 식물체의 재분화 효율을 조절하는 방법.
  5. 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 재분화 효율이 감소된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  7. 제5항 또는 제6항의 방법에 의해 제조된 재분화 효율이 조절된 형질전환 식물체.
  8. 제7의 식물체의 형질전환된 종자.
  9. 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어, 야생형에 비해 재분화 효율이 감소된 돌연변이 식물체.
  10. 애기장대 유래 PRR9/7/5, CCA1/LHY, FIP37, CML10, PDAT1, SKM1/2, CRY1, NUP160 또는 NUP98a1/b1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화 효율 조절용 조성물.
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