KR20230144757A - HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질을 이용한 대장암 예후 예측 방법 - Google Patents
HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질을 이용한 대장암 예후 예측 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질의 발현량 변화를 이용한 대장암의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이를 이용한 예후 예측 방법에 관한 것으로, HSPD1 유전자 또는 HSP60 단백질의 발현 수준을 분석하여 임상에서 대장암 환자의 예후를 예측 가능하며, TNM 분류와 결합하여 분석한 경우, 더욱 정교한 예측이 가능하여 개인별 맞춤형 전략을 설계할 수 있다.
Description
본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질을 이용한 대장암 예후 예측 방법에 관한 것이다.
우리 몸의 소화기관은 식도, 위, 소장, 대장으로 구분되는데 대장은 소화기관의 마지막 부위이며 주로 수분 및 전해질의 흡수가 일어난다. 대장은 크게 결장, 맹장 및 직장으로 구분되고 결장은 다시 상행결장 (ascending colon), 횡행결장 (transverse colon), 하행결장 (descending colon) 그리고 S자결장 (sigmoid colon)으로 나누어지는데, 암이 발생하는 위치에 따라 결장에 생기는 암을 결장암, 직장에 생기는 암을 직장암이라고 하고, 이를 통칭하여 대장암 (colorectal cancer)이라고 한다. 대략적인 대장의 각 부위 별 암 발생률은 맹장과 상행결장 25%, 횡행결장 15%, 하행결장 5%, S자결장 25%, 직장-S자결장 접합부 10%, 직장 20% 정도로 알려져 있다.
대장은 파이프 모양의 관으로 안쪽에서부터 점막층, 점막하층, 근육층, 장막층 등 4개의 층으로 나누어져 있다. 대부분의 대장암은 대장의 점막에서 발생하는 선암이며, 이 외에도 림프종, 육종, 편평상피암, 다른 암의 전이성 병변 등이 있다.
이러한 대장암의 원인은 크게 환경적인 요인과 유전적인 요인으로 나눌 수 있다. 대장암의 원인은 아직 불분명하지만 대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전 인자보다도 환경 인자의 비중이 크다고 여겨지고 있으며, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5% 전후의 대장암은 유전적인 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다.
식사와 대장암의 관련성은 가장 많이 연구된 분야로, 이민 등으로 거주 지역이 변하면 유전적 차이에 상관없이 지역적인 특성에 따라 대장암의 발생률이 달라진다. 특히 높은 열량의 섭취, 동물성 지방의 과도한 섭취, 고지방식이, 비만, 섬유소 섭취 부족, 체중증가, 염증성 장 질환, 대장 용종 등이 대장암의 위험률을 높이는 것으로 알려져 있다.
한편, 바이오마커는 맞춤형 의료를 앞당길 수 있는 주요 수단이 되고 있으며, DNA, RNA를 기반으로 하는 핵산 기반 바이오마커와 단백질 및 그 일부분 등을 기반으로 하는 단백질 기반 바이오마커 등으로 구분된다. 이러한 바이오마커는 최근 암, 감염성 질환, 심장혈관 질환, 뇌졸중, 치매 등 각종 난치병에 대한 조기진단용, 약물반응 진단 및 치료 진단용 등에 적용되고 있다.
대장암을 포함하는 대부분의 암환자는 현존하는 여러 치료방법 (수술, 항암제, 방사선 처리)을 이용하여도 암전이 (metastasis)의 발생결과로서 주로 사망하게 된다. 암 전이가 일어나기 전에 1차 종양이 관찰된 환자의 대부분은 치료 가능성이 상당히 높지만 이런 환자는 쉽게 발견하기 어려우며, 대부분의 환자에서는 1차 종양이 관찰된 시점에서 이미 암의 전이가 발견된다. 대부분의 암의 전이는 다발성, 전신성이며, 그 존재 여부의 판정도 어렵기 때문에 현재의 암 치료방법으로는 치료 효능이 만족스럽지 못하다. 하지만 암 전이는 1차 종양을 구성하는 암 세포의 극히 일부분만이 전이 과정의 여러 단계를 성공적으로 마치고 전이암으로 되는 비효율적인 과정이다. 따라서, 전이 과정을 잘 이해하고, 임상적, 생물학적으로 유용한 치료 표적을 발굴하고 이를 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하면 암 전이에 의한 사망을 효과적으로 제어할 수 있는 유용한 치료법의 개발이 가능하게 된다. 또한, 예후를 조기에 예측하고 암전이 고위험군을 조기에 진단할 수 있다면, 예후에 따른 향후 치료의 계획수립과 환자별 맞춤 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
종래 선행기술로서 대한민국 공개특허 제1020170089316호에는 암의 발병이 의심되는 환자로부터 분리된 시료에 존재하는 HSP60 단백질을 하이드록실아민과 반응시켜 HSP60 단백질이 분해되면 암으로 판단하는 방법이 기재되어 있고, 대한민국 등록특허 제101307132호에서는 HSP60을 억제하는 경우, HSP60와 IKK 복합체의 상호작용을 차단하여 NF-kB 경로를 불활성화시켜 세포사멸을 유도함으로써 암 또는 이상증식 혈관 질환과 같은 비정상적 세포 증식 질환 치료 효과가 있음을 기재하고 있다. 한편, 비특허문헌인 Ce´line Hamelin 등[FEBS Journal 278 (2011) 4845-4859]에는 정상인 대장 조직과 대장암 환자의 대장 조직에서 HSP60 단백질의 발현 정도를 측정하였고, 대장암 환자의 조직에서 HSP60 단백질의 발현이 유의적으로 증가함이 기재되어 있다.
이에 본 발명자들은 대장암의 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커를 찾고자 대장암 환자의 대장암조직으로부터 발현량에 차이가 있는 HSPD1 유전자 또는 HSP60 단백질을 확인하였고, 이들을 생존율 분석 (survival analysis)과 연계하여 분석한 결과, HSPD1 유전자 또는 HSP60 단백질을 대장암 환자의 예후 예측에 사용할 수 있음을 확인하였고, 상기 HSPD1 유전자 또는 HSP60 단백질의 발현과 TNM 분류 (tumor, node, metastasis stage; TNM stage)를 연계하면 대장암 환자의 예후를 더욱 정밀하게 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대장암 환자의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이를 이용한 예후 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 대장암 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 대장암 환자로부터 분리된 시료에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계
를 포함하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 대장암 환자로부터 분리된 시료에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계; 및
(c) TNM 분류에 따라 분류되는 정보를 결합하여 분석하는 단계;
를 포함하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질의 발현량 변화를 이용한 대장암의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이를 이용한 예후 예측 방법에 관한 것으로, HSPD1 유전자 또는 HSP60 단백질의 발현 수준을 분석하여 임상에서 대장암 환자의 예후를 예측 가능하며, TNM 분류와 결합하여 분석한 경우, 더욱 정교한 예측이 가능하여 개인별 맞춤형 전략을 설계할 수 있다.
도 1a는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량에 따른 전체 생존기간 (overall survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 1b는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량에 따른 무재발 생존 기간 (Relapse Free Survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 2a는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 전체 생존기간 생존율을 분석한 그래프이다.
도 2b는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 전체 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 2c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 TCGA COAD 데이터 세트의 HSPD1의 발현량에 따른 전체 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 3a은 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 무재발 생존 기간 생존율을 분석한 그래프이다.
도 3b는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 무재발 생존 기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 3c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 TCGA COAD 데이터 세트의 HSPD1의 발현량에 따른 무재발 생존 기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 4는 종양 세포에서 HSP60에 대한 면역화학염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다 (배율: 400배).
도 5a는 GMC (Gachon University Gil Medical Center) 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량에 따른 무사건 생존기간 (Event free survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 5b는 GMC 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량에 따른 질병특이 생존기간 (disease specific survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 6a는 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 무사건 생존기간 생존율을 분석한 그래프이다.
도 6b는 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 무사건 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 6c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 GMC 대장암 코호트의 HSP60 단백질 발현량에 따른 무사건 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 7a은 GMC 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 질병특이 생존기간 생존율 분석을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 GMC 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 질병특이 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 7c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 GMC 대장암 코호트의 HSP60 단백질 발현량에 따른 질병특이 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 1b는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량에 따른 무재발 생존 기간 (Relapse Free Survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 2a는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 전체 생존기간 생존율을 분석한 그래프이다.
도 2b는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 전체 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 2c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 TCGA COAD 데이터 세트의 HSPD1의 발현량에 따른 전체 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 3a은 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 무재발 생존 기간 생존율을 분석한 그래프이다.
도 3b는 TCGA COAD 데이터 세트에서 HSPD1의 발현량과 TNM 분류를 결합한 무재발 생존 기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 3c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 TCGA COAD 데이터 세트의 HSPD1의 발현량에 따른 무재발 생존 기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 4는 종양 세포에서 HSP60에 대한 면역화학염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다 (배율: 400배).
도 5a는 GMC (Gachon University Gil Medical Center) 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량에 따른 무사건 생존기간 (Event free survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 5b는 GMC 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량에 따른 질병특이 생존기간 (disease specific survival) 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 6a는 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 무사건 생존기간 생존율을 분석한 그래프이다.
도 6b는 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 무사건 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 6c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 GMC 대장암 코호트의 HSP60 단백질 발현량에 따른 무사건 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 7a은 GMC 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 질병특이 생존기간 생존율 분석을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 GMC 대장암 코호트에서의 HSP60 단백질 발현량과 TNM 분류를 결합한 질병특이 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 7c는 TNM 후기 스테이지 (3기 및 4기)에서 GMC 대장암 코호트의 HSP60 단백질 발현량에 따른 질병특이 생존기간 생존율 분석을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 HSPD1 (Heat Shock Protein Family D (Hsp60) Member 1)은 일반적으로 Cpn60이라고도 하는 HSP60로 알려진 단백질을 암호화한다. 상기 단백질은 미토콘드리아 단백질로 고온(heat)에 반응하여 세포의 손상을 억제하는 열충격단백질(heat shock protein)의 종류이며, 상기 열충격단백질은 샤페론 (chaperone)으로써 완성된 입체구조를 나타내지 않는 단백질에 결합하여 분자 간 회합형성을 방지함과 동시에 재생을 촉진하는 기능을 갖는다. 또한, 합성 직후의 미성숙한 단백질과 결합하여 이들의 고차구조 형성, 세포 내 수송, 세포소기관의 막투과 등에서 중요한 역할을 수행하며, 변성된 단백질에 공유결합하여 프로테아솜 (proteasome)에 의한 분해를 매개하는 기능을 한다고 알려져 있다.
상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나 이에 특별히 제한되지는 않는다.
상기 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 주형 (template)과 상보적인 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
상기 프로브는 표적 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction), 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RTPCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northernblotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있다.
상기 항체는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
상기 앱타머는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏 (Western blot), ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 대장암 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드 (rapid) 키트 또는 MRM (Multiple reaction monitoring) 키트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 대장암 환자로부터 분리된 시료에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계;
를 포함하는 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
상기 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 발현 수준이 대조군보다 높을 경우 예후가 좋을 것이라고 판단할 수 있다.
상기 예후가 좋을 것이라는 판단은 전체 생존기간, 무재발 생존기간, 무사건 생존기간 및 질병특이 생존기간이 예후가 나쁜 군보다 높다는 것을 의미할 수 있다.
상기 단계 (a)의 시료는 대장 조직일 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 대장암 환자로부터 분리된 시료에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계; 및
(c) TNM 분류에 따라 분류되는 정보를 결합하여 분석하는 단계; 를 포함하는 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
TNM 분류는 종양의 병기 (stage)를 결정하는 한 방법이다. T는 Tumor (종양)를 뜻하며 장기의 벽에 침윤의 깊이 등에 따라 TO (원발종양 없음), Tis (상피내암), T1 내지 T4 (숫자가 높을 수록 주위로 침윤이 많다) 등으로 나눈다. N은 Node (림프절)를 뜻하며 침범된 림프절의 갯수, 크기, 위치 등에 따라 N0 (림프절 전이 없음), N1 내지 N3 등으로 나눈다. M은 Metastasis (전이)를 뜻하며 원격 전이의 유무에 따라 M0 (전이 없음), M1 (전이됨) 등으로 나눈다. 이상의 방법으로 T, N, M이 결정되면 이들을 조합하여 최종적인 병기를 결정한다. 이렇게 결정된 병기는 치료 방침 결정과 예후 판단에 매우 중요하다.
상기 TNM 분류에 따라 분류되는 정보는 암의 예후 예측 정보를 제공하는 가장 일반적인 방법으로 1기에서 4기까지로 나눌 수 있다. 그러나 환자 개개인의 예후를 예측하는 데 있어 TNM 분류는 단계 설정의 단순화를 위해 예후에 영향을 미치는 중요한 변수들을 모두 포함하지 못하므로, TNM 분류 단독으로 예후 예측하는 것은 불완전한 문제점이 있다.
본 발명에서 무사건 생존기간에서 사건은 암 진행, 암 재발 및 대장암으로 인한 사망으로 정의되었다.
본 발명에서 질병특이 생존기간은 대장암으로 사망한 경우를 사망 (event)으로 분류하였으며, 대장암이 아닌 다른 원인으로 사망한 중도절단 (censored)의 경우는 생존으로 분류하였다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> HSPD1 유전자를 이용한
대장암 환자의 생존 예측
<1-1> 대장암과 HSPD1 유전자 발현량의 상관관계 확인
유전체 데이터베이스를 이용하여 대장암과 HSPD1 유전자 발현량의 상관관계를 확인하기 위한 분석을 수행하였다.
구체적으로, 대장암 환자의 HSP60 발현량에 따른 생존 분석을 위해 The Cancer Genome Atlas(이하 TCGA이라 함) 프로젝트의 colon adenocarcinoma (이하 COAD라 함) 데이터 세트 중 유전자 발현량 데이터 세트와 임상정보 데이터 세트를 UCSC Cancer Genomics Browser1 (마지막 접속 2017년 12월 03일)에서 내려받았다. HSP60의 코딩 유전자인 HSPD1의 발현량이 있는 원발생암 (primary tumor) 샘플 중 5년간 전체 생존기간 (overall survival; OS) 및 무재발 생존기간(replase free survival;RFS) 데이터가 있는 272 샘플을 대상으로 생존 분석을 수행하였다.
R 소프트웨어의 MaxStat function2를 사용하여 HSPD1의 유전자 발현 수준에 대한 최적의 컷 포인트(cut point)를 결정하였다. 전체 생존 (overall survival; OS) 분석을 위해 HSPD1(HSP60)High (HSPD1의 발현 수준이 14.1791 보다 높은 경우) 그룹 또는 HSPD1(HSP60)Low (HSPD1의 발현 수준이 14.1791보다 작거나 같은 경우) 그룹으로 분류하였다. 무재발 생존 (replase free survival;RFS)분석을 위해서는 HSPD1(HSP60)High (HSPD1의 발현 수준이 14.1211 보다 높은 경우) 그룹 또는 HSPD1(HSP60)Low (HSPD1의 발현 수준이 14.1211 보다 작거나 같은 경우) 그룹으로 분류하였다. HSPD1 발현량에 따른 생존율 분석은 단변량 분석 (univariate analysis)인 log-rank test를 통하여 검정하였다. 다변량 분석 (multivariate analysis)은 Cox proportional hazard (CPH) 모델을 이용하여, 나이 및 성별로 보정하였다. 생존율 분석을 위한 log-rank test 및 CPH 모델은 R version 4.0의 survival 패키지를 이용하였다. CPH 모델을 통해 구한 각 변수의 위험율은 forestmodel 패키지를 R version 4.0 하에서 이용하였다.
그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, HSPD1 유전자의 발현량이 낮은 그룹의 전체 생존기간 위험율은 1.87 (95% 신뢰 구간 [이하 CI라 함]: 0.95-3.69)로 그 발현량이 높은 그룹보다 나쁜 예후를 보이는 경향이 있었다. 또한, 도 1b에 나타난 바와 같이, HSPD1 유전자의 발현량이 낮은 그룹의 무재발 생존 기간 위험률은 1.87 (95% 신뢰 구간 [이하 CI라 함]: 0.94-3.73)로 그 발현량이 높은 그룹보다 통계적으로 유의하게 나쁜 예후를 보이고 있음(p=0.04)을 확인하였다.
상기의 결과는 HSPD1 발현량이 높은 환자군은 그 발현량이 낮은 환자군에 비해 생존에 유리함을 시사한다.
<1-2> TNM 분류와 HSPD1 유전자 발현량을 결합한 대장암 환자의 생존 예측
대장암 환자 생존 예측에 가장 좋은 성과를 보이는 바이오마커로 받아들여지는 TNM 분류 (tumor, node, metastasis stage; TNM stage)와 HSPD1 유전자 발현량을 결합하여 생존 예측을 분석하였다.
구체적으로, TCGA 데이터 베이스에서 얻은 HSPD1 유전자 발현이 높으면서 (이하 HSPD1(HSP60)High라 함) TNM 분류 1/2기인 환자들을 그룹 1, HSPD1 유전자 발현량이 낮으면서 (이하 HSPD1(HSP60)Low라 함) TNM 분류 1/2기인 환자들을 그룹 2, HSPD1(HSP60)High에 TNM 분류 3/4기인 환자들을 그룹 3, HSPD1(HSP60)Low에 TNM 분류 3/4기인 환자들을 그룹 4로 그룹화하여 5년간 전체 생존기간 및 무재발 생존 기간 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2a 내지 2b에 나타난 바와 같이, HSPD1과 TNM 분류를 결합하여 전체 생존기간을 분석한 경우, 그룹 1 대비 그룹 2의 전체 생존기간 위험율은 1.04배 (95% CI: 0.35-3.10) 이었으며, 그룹 3의 전체 생존기간 위험율은 2.02배 (95% CI: 0.61-9.69) 이었으며, 그룹 4의 전체 생존기간 위험율은 5.00배 (95% CI: 1.85-13.52, log-rank test p-value: 0.002)였다. 도 2c에 나타난 바와 같이, 동일한 단계 (TNM 분류 3/4기)의 환자에서 HSPD1 발현이 낮은 그룹(그룹 4)의 전체 생존기간 위험율은 2.21로 HSPD1 발현이 높은 그룹(그룹 3)보다 나쁜 예후를 보이는 경향이 있음을 확인하였다.
또한, 도 3a 내지 3b에 나타난 바와 같이, HSPD1과 TNM 분류를 결합하여 무재발 생존 기간 분석을 수행 경우, 그룹 1 대비 그룹 2의 무재발 생존기간 위험율은 1.10배 (95% CI: 0.40-3.04)이었으며, 그룹 3의 무재발 생존기간 위험율은 1.45배 (95% CI: 0.44-4.75)이었으며, 그룹 4의 무재발 생존기간 위험율은 3.76배 (95% CI: 1.49-9.53, log-rank test p-value: 0.005)였다. 도 3c에 나타난 바와 같이, 동일한 단계 (TNM 분류 3/4기)의 환자에서 HSPD1 발현이 낮은 그룹(그룹 4)의 무재발 생존기간 위험율은 2.48로 HSPD1 발현이 높은 그룹(그룹 3)보다 나쁜 예후를 보이는 경향이 있음을 확인하였다.
<실험예 2> HSP60 단백질을 이용한 대장암 환자의 생존 예측
<2-1> HSP60 단백질 발현량에 따른 생존율 분석
HSPD1 유전자를 대상으로 해당 유전자들이 코딩하는 HSP60 단백질의 발현량에 따른 생존율 분석을 수행하기 위하여, 대장암 환자에게서 도래한 종양 조직으로부터 조직 마이크로어레이 (Tissue Microarray)를 구축하였고, 면역 조직 화학 염색을 수행한 후 HSP60 단백질 발현량을 정량화하였다.
구체적으로, 2010년 4월부터 2013년 1월까지 가천대 길병원 (Gachon University Gil Medical Center; GMC)에서 대장암 수술을 받은 환자를 대상으로 연구를 진행하였다. 포함한 대상의 기준은 원발성 대장암으로 수술을 받은 환자 및 환자 종양의 파라핀 블록이 보존된 경우이며, 총 456명의 환자를 분석하였다. 재발성 대장암 환자, 과거 수술로 인하여 대장의 정상 구조가 변경된 환자, 대장암 수술 이전에 화학요법 또는 복부 방사선 요법을 받은 이력이 있는 환자, 대장암 수술 이전의 기타 암을 치료받은 환자는 대상에서 제외되었다. 파라핀 블록을 미세절단 후 H&E (Hematoxyling and Eosin) 염색을 수행하고, 병리소견 검토를 시행한 후, 대응되는 파라핀 블록에 2개의 종양 코어를 표시하였다. 조직 마이크로어레이 기계를 사용하여 직경 2mm의 원통형 종양 조직을 추출하고 새로운 파라핀 블록으로 옮겼다. 하나의 파라핀 블록에 69명의 환자로부터 얻은 각 원통형 조직을 삽입하여 새로운 미세조직배열 (tissue microarray, TMA) 블록을 만들었다. 상기 TMA 블록을 마이크로톰 (microtome)으로 4μm 두께로 절단하고 주름을 잡아당겨 슬라이드에 일정 방향으로 부착시켜 건조시켰다. 그 다음, 건조된 슬라이드를 이용하여 면역조직화학염색을 수행하였다. 슬라이드를 60℃에서 10분 동안 처리하고, 자일렌으로 탈파라핀화한 다음, 각각 다른 농도의 알코올 (100% 알코올, 95% 알코올, 80% 알코올 및 70% 알코올)을 사용하여 재수화 (rehydrate)한 후 증류수로 수세하였다. 그런 다음 항원 회복을 위해 10mM 시트레이트 완충 용액 (citrate acid 2.1 g in H2O 1 L, pH 6.0)을 가온하여 끓기 시작할 때 슬라이드를 넣고 10분간 더 끓이고 찬물에 10분 수세 후 슬라이드를 꺼내 PBS 완충 용액 (NaCl 8 g, KCl 200mg, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 24mg in 1 L H2O)에 수세하였다. 이 후, 3% 과산화수소로 10분 동안 처리하여 내인성 과산화효소 활성을 억제하고, 항원을 마이크로웨이브 오븐을 사용하여 0.01M 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.0)에서 회수하였다. 비특이적 반응을 막기 위해 차단 항체 (DAKO #X0909; Glostrup,. Denmark)를 실온에서 10분간 반응시키고, 샘플을 항-HSP60 (rabbit monoclonal, 1:200, D6F1, Cell signaling technology, USA)가 있는 4℃의 가습 용기에서 반응시켰다. 조직 슬라이드는 제조업체의 지침 (Gene Tech)에 따라 비-비오틴 HRP (horseradish-peroxidase) 검출 시스템으로 처리되었다.
한편, 통계학적 분석은 다음과 같이 수행하였다. 본 발명에서는 대장암 수술 후 5년 시점에서 생존 관련 인자와 생존율을 무사건 생존기간 및 질병특이 생존기간에 초점을 맞추었다. 무사건 생존기간에서 사건은 암 진행, 암 재발 및 대장암으로 인한 사망으로 정의되었다. 질병특이 생존기간은 수술 후 대장암으로 인한 사망까지의 시간으로 정의하였고, 대장암 이외의 질병으로 사망한 경우는 제외하였다. 생존율 분석을 위한 log-rank test 및 CPH (Cox proportional hazard) 모델은 R version 4.0의 survival 패키지를 이용하였다. CPH 모델을 통해 구한 각 변수의 위험율은 forestmodel 패키지로 시각화 하였고 R version 4.0 하에서 이용하였다.
정상 결장 상피 세포 및 종양 세포에서 HSP60에 대한 면역화학염색을 수행한 결과는 도 4에 나타나 있으며, a)는 염색되지 않은 종양 세포를 대표하는 도이고, b)는 약한 세포질 염색을 나타내는 종양 세포를 대표하는 도이고, c)는 중간 정도의 세포질 염색을 나타내는 종양 세포를 대표하는 도이고, d)는 강한 세포질 염색을 나타내는 종양 세포를 대표하는 도이다.
통계적 분석 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, HSP60 단백질의 발현량에 따라 대장암 환자의 무사건 생존이 유의하게 차이남을 확인하였다. HSP60 단백질의 발현량이 낮은 그룹은 그 발현량이 높은 환자군에 비해 무사건 생존기간 위험율이 1.42배 (95% CI: 1.01-2.00)이었다. 성별과 연령으로 보정한 CPH 모델의 p-value는 0.04로 통계적으로 유의하였다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, HSP60 단백질의 발현량에 따라 대장암 환자의 질병특이 생존도 유의하게 차이남을 확인하였다. HSP60 단백질의 발현량이 낮은 그룹은 그 발현량이 높은 환자군에 비해 질병특이 생존기간 위험율이 1.69배 (95% CI: 1.17-2.44)이였으며, 성별과 연령으로 보정한 CPH 모델의 p-value는 0.005로 통계적으로 유의하였다.
상기의 결과는 HSP60 단백질의 발현량이 낮은 그룹에 비해 그 발현량이 높은 그룹의 생존이 더 유리함을 시사한다.
<2-2> TNM 분류와 HSP60 단백질 발현량을 결합한 대장암 환자의 생존 예측
TNM 분류와 HSP60 단백질 발현량을 결합하여 생존 예측을 분석하였다.
구체적으로, 해당 단백질 발현량에 따른 생존율 분석은 HSP60 단백질 발현이 높으면서 (이하 HSP60High라 함) TNM 분류 1/2기인 환자들을 그룹 1, HSP60 단백질 발현량이 낮으면서 (이하 HSP60Low라 함) TNM 분류 1/2기인 환자들을 그룹 2, HSP60High에 TNM 분류 3/4기인 환자들을 그룹 3, HSP60Low에 TNM 분류 3/4기인 환자들을 그룹 4로 그룹화하여 5년간 무사건 생존기간 및 질병특이 생존기간 분석을 수행하였다. 또한, 생존율 분석은 단변량 분석인 log-rank test 및 다변량 분석인 CPH 모델을 이용하여 검정하였다. 생존율 분석을 위한 log-rank test 및 CPH 모델은 R version 4.0의 survival 패키지를 이용하였다. CPH 모델을 통해 구한 각 변수의 위험율은 forestmodel 패키지로 시각화하였고 R version 4.0 하에서 이용하였다.
그 결과, 도 6a 내지 6b에 나타난 바와 같이, HSP60과 TNM 분류를 결합하여 무사건 생존기간을 분석한 경우, 그룹 1 대비 그룹 3의 무사건 생존기간 위험율은 4.18배 (95% CI: 2.33-7.49, p-value: <0.001) 이었으며, 그룹 4의 무사건 생존기간 위험율은 7.21배 (95% CI: 4.05-12.83, p-value: <0.001)였다. 또한, 도 6c에 나타난 바와 같이, 동일한 단계 (TNM 분류 3/4기)의 환자에서 HSP60 발현이 낮은 그룹의 무사건 생존기간 위험율은 1.70으로 HSP60 발현이 높은 그룹보다 통계적으로 유의하게 나쁜 예후(p-value=0.009)를 보이고 있음을 확인하였다. 상기의 결과들은 TNM 분류만으로 생존 예측을 하는 것보다 HSP60과 TNM 분류를 결합하여 분석할 경우 더 좋은 성능의 생존 예측이 가능함을 시사한다.
또한, 도 7a 내지 7b에 나타난 바와 같이, 질병특이 생존기간 분석에서 HSP60와 TNM 분류를 결합하여 분석한 경우, 그룹 1 대비 그룹 3의 질병특이 생존기간 위험율은 4.52배 (95% CI: 2.31-8.83, p-value: <0.001)이고, 그룹 1 대비 그룹 4의 질병특이 생존기간 위험율은 9.40배 (95% CI: 4.89-18.07, p-value: <0.001)이었다. 도 7c에 나타난 바와 같이, 동일한 단계 (TNM 분류 3/4기)의 환자에서 HSP60 발현이 낮은 그룹의 질병특이 생존기간 위험율은 2.02로 HSP60 발현이 높은 그룹보다 통계적으로 유의하게 나쁜 예후(p-value=0.001)를 보임을 확인하였다.
상기의 결과를 통하여, TNM 분류와 HSP60 발현량을 결합하여 생존을 예측한 경우, TNM 분류만 단독으로 사용하여 생존을 예측한 경우보다 더 좋은 생존 예측이 가능함을 확인하였다. 이는 HSP60 발현량을 TNM 분류와 결합하여 바이오마커로 활용할 경우 더 좋은 성능의 생존 예측이 가능함을 시사한다.
Claims (11)
- HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후 예측용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후 예측용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후 예측용 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후 예측용 키트.
- (a) 대장암 환자로부터 분리된 시료에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하여 분석하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준이 대조군보다 높을 경우 예후가 좋을 것이라고 판단하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준이 대조군보다 낮을 경우 예후가 나쁠 것이라고 판단하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 단계 (a)의 시료는 대장 조직인 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
- (a) 대장암 환자로부터 분리된 시료에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계; 및
(c) TNM 분류 (tumor, node, metastasis stage; TNM stage)에 따라 분류되는 정보를 결합하여 분석하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
- 제9항에 있어서,
동일한 TNM 분류에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준이 대조군보다 높은 경우 예후가 좋을 것이라고 판단하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
- 제9항에 있어서,
동일한 TNM 분류에서 HSPD1 유전자의 mRNA 또는 이들의 유전자에 의해 코딩되는 HSP60 단백질 수준이 대조군보다 낮은 경우 예후가 나쁠 것이라고 판단하는 것을 특징으로 하는, 대장암 환자의 예후를 예측하는 방법.
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