KR20230140068A - 비축줄기세포 유도용 오가노이드 배양 조성물 및 이를 이용한 배양 방법 - Google Patents
비축줄기세포 유도용 오가노이드 배양 조성물 및 이를 이용한 배양 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SAG를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 조성물, 배양 첨가제 조성물, 상기 조성물을 포함하는 배지, 비축줄기세포 함유 오가노이드 제조 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 비축줄기세포 함유 오가노이드 및 상기 오가노이드 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 SAG를 유효성분으로 포함하는 배양 조성물로 오가노이드를 배양하여 비축줄기세포를 함유하는 오가노이드를 형성할 수 있으며, 상기 비축 줄기세포 함유 오가노이드는 방사선 조사 등 각종 위해 자극에 대항하는 저항능이 형성되어 방사선 조사가 예정된 환자 등에 안전하게 이식 및 생착이 가능하므로, 재생의학에 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 SAG를 유효성분으로 포함하는 배양 조성물로 오가노이드를 배양하여 비축줄기세포를 함유하는 오가노이드를 형성할 수 있으며, 상기 비축 줄기세포 함유 오가노이드는 방사선 조사 등 각종 위해 자극에 대항하는 저항능이 형성되어 방사선 조사가 예정된 환자 등에 안전하게 이식 및 생착이 가능하므로, 재생의학에 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 SAG를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 조성물, 배양 첨가제 조성물, 상기 배양 조성물을 포함하는 배지, 비축줄기세포 함유 오가노이드 제조 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 비축줄기세포 함유 오가노이드 및 상기 오가노이드의 배양 방법에 관한 것이다.
오가노이드(organoid)는 줄기세포 또는 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 3차원 배양하여 만들어지는 생체 외 장기모사체로서, 오가노이드 제작기술에 의해 이론적으로 거의 모든 종류의 장기를 줄기세포만으로 제작할 수 있기 때문에 다양한 질병에 이용 가능할 것으로 기대되고 있다. 오가노이드는 2차원에서 만든 세포 조직보다 신약의 안전성과 효능을 시험하는데 더 효과적일 수 있으며, 훼손되거나 제대로 발달하지 못한 장기에 오가노이드를 이식해 상태를 개선하는데 활용할 수 있다. 이에 따라 최근 재생의학 관점에서도 오가노이드 관련 연구가 더욱 활발해지는 추세에 있으며, 여러 분야에 오가노이드를 널리 이용할 수 있을 것으로 전망되고 있다.
오가노이드를 재생의학적으로 활용하는데 있어 가장 중요한 것은, 이식된 오가노이드가 수여자의 조직에서 장기간 생존하여 생착되는 것이다. 각종 위해 자극에 의해 조직 및 기관이 결손된 환자에 오가노이드를 적용하기 위해서는 이식될 오가노이드가 위해 자극에 대항한 저항능력을 가져야 한다.
한편, 성체줄기세포는 활성화된 세포주기를 지니는 성체줄기세포와, 평소 휴지기의 세포주기를 유지하다가 DNA 데미지를 야기하는 위해자극에 의해 성체줄기세포가 결핍될 경우 성체줄기세포의 역할을 할 수 있는 비축줄기세포 두 가지 종류가 있다. 비축줄기세포는 외부적 손상에 강한 특성을 지니고 있어, 비축줄기세포로 분화된 오가노이드는 각종 자극 및 환경적 요인에 대한 저항능이 향상될 수 있다.
종래 오가노이드 배양 기법을 통해 형성된 오가노이드는 비록 성체줄기세포는 포함하나 비축줄기세포가 현저히 적은 특성이 있어, 방사선 조사 등 각종 위해 자극에 대한 저항능이 떨어지기 때문에, 방사선 조사가 예정된 환자 등에 이러한 오가노이드를 이식 및 생착할 경우 실패할 가능성이 높다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 비축줄기세포가 풍부한 오가노이드를 배양하기 위해 예의 노력한 결과, SAG가 포함된 본 발명의 배지 조성물로 오가노이드를 배양하였을 때 비축줄기세포가 형성됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 SAG(Smoothened receptor agonist)를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 조성물을 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양용 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 SAG를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 성체줄기세포 유래 오가노이드를 상기 배양 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 제조방법으로 제조된, 비축줄기세포 함유 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 성체줄기세포 유래 오가노이드를 상기 배양 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 SAG(Smoothened receptor agonist)를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "줄기세포"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 용어 "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.
상기 성체줄기세포는 크게 활성화 성체줄기세포와 비축줄기세포로 나뉠 수 있다. 상기 비축줄기세포는 휴면줄기세포(Reserve stem cell)이라고도 하며, 활성화된 세포주기를 지니는 활성화 성체줄기세포와 다르게 평소 휴지기의 세포주기를 유지하다가 DNA 손상을 야기하는 각종 위해자극에 의해 활성화 줄기세포가 결핍되면 조직항상성 유지를 위해 성체줄기세포의 역할을 할 수 있고, 외부 손상에 강한 특성을 지니고 있다.
본 발명의 용어 "배양"은 생체로부터 분리된 세포, 이들의 2차원 또는 3차원적 집합체, 조직 또는 조직의 일부를 체외에서 증식, 성장, 유지 및 분화시키는 것을 의미한다. 따라서, "배양"은 출발 물질(세포, 조직 또는 조직 유사체인 오가노이드)을 이용하여 인공적인 환경 하에서 목적 물질을 수득하는 전 과정을 포괄하는 것을 말한다.
본 발명의 용어 "SAG(Smoothened receptor agonist)"는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로, 헤지호그 신호전달경로의 핵심적인 부분으로서 약물로 인한 뇌 손상을 예방하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 조성물은 0.1 내지 2 μM의 SAG를 포함할 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 1.5 μM의 SAG를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 1 μM의 SAG를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "오가노이드(organoid)"는 1차 조직(primary tissue), 조직 하위단위 또는 단일세포(예를 들어 줄기세포)로 구성된 생체 외 3차원 세포 집합체(3D cellular cluster)를 의미한다. 오가노이드는 자가재생(self-renewal)과 자가조직화(self-organization)가 가능하며 본래 조직과 유사한 표현형 및 기능을 재연하므로, 소형 유사 장기 또는 장기 유사체로도 명명될 수 있다.
상기 오가노이드를 재생의학적으로 활용하기 위해서는, 인체에 이식된 오가노이드가 수여자의 조직에서 장기간 생존하여 생착되어야 한다. 따라서 각종 위해 자극에 의해 조직 및 기관이 결손된 환자에게 오가노이드를 적용하기 위해서는 이식될 오가노이드가 방사선 등의 위해 자극에 대항하는 특성을 가져야 한다. 이와 관련하여, 전술한 비축줄기세포는 외부적 손상에 강한 특성을 지니고 있어, 비축줄기세포를 함유하는 오가노이드는 각종 자극 및 환경적 요인에 대한 저항능이 향상될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물로 배양된 오가노이드는 비축줄기세포를 함유하여 방사선 저항능을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물로 배양된 오가노이드는 TERT 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량이 배양 전보다 높을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 오가노이드는 소장 또는 대장으로부터 유래한 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 advanced DMEM F/12배지에 HEPES 완충액, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, RSPO(R-spodin), 노긴(Noggin), EGF 및 Y-27632를 보충하여 오가노이드를 접종 및 배양한 뒤 CHIR99021 및 발프로산을 추가하여 배양한 후, SAG를 처리하고 다시 배양하여 비축줄기세포 함유 오가노이드를 제조하였으며, 상기 비축줄기세포 함유 오가노이드가 방사선에 대한 저항능이 있으며 대조군 대비 현저히 높은 수준으로 세포 증식 표지인자(Ki-76)를 발현함을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 조성물은 CHIR99021 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 발프로산(valproic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 배양 조성물은 1 내지 10 μM의 CHIR99021를 포함할 수 있고, 구체적으로 2 내지 8 μM의 CHIR99021를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 3 μM의 CHIR99021를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 배양 조성물은 0.1 내지 2mM 발프로산을 포함할 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 1.5 mM 발프로산을 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 1 mM 발프로산을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 HEPES, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, R-스포딘(R-spodin), 노긴(noggin), EGF 및 Y-27632 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 조성물은 기본 배지(basal media)를 포함할 수 있으며, 상기 기본배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, advanced DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, Chang's Medium 및 MesemCult-XF Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으며, 구체적으로 advanced DMEM/F12일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 배양 조성물을 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양용 배지를 제공한다.
상기 비축줄기세포, 오가노이드 및 배양은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "배지"는 오가노이드의 증식, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 말하며, 해당 분야에서 사용되는 오가노이드의 배양 및 분화에 적합한 통상의 배지를 모두 포함한다. 오가노이드의 종류에 따라 배지의 종류와 배양 조건이 적절히 선택될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 SAG를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 첨가제 조성물을 제공한다.
상기 SAG, 비축줄기세포, 오가노이드 및 배양은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "배양 첨가제"는 배양 배지의 성분이 되는 것을 의미하고, 일 태양에서는 본 발명에 따라 SAG를 필요한 농도로 본 발명의 배양 배지에 제공하도록, 통상적인 상태의 배양 배지에 다량으로 첨가될 수 있다. 아울러, 본 발명의 배양 첨가제에 다양한 성분을 첨가함으로써 본 발명의 배양 배지를 형성하도록, 본 발명의 배양 배지를 제조하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 첨가제 조성물은 CHIR99021 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 발프로산(valproic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 첨가제 조성물은 HEPES, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, R-스포딘(R-spodin), 노긴(noggin), EGF 및 Y-27632 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 성체줄기세포 유래 오가노이드를 상기 배양 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드 제조방법을 제공한다.
상기 비축줄기세포, 오가노이드 및 배양은 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 성체줄기세포는 소장 또는 대장으로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로 소장으로부터 유래한 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법으로 제조된, 비축줄기세포 함유 오가노이드를 제공한다.
상기 비축줄기세포 및 오가노이드는 전술한 바와 같다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 성체줄기세포 유래 오가노이드를 상기 배양 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드 배양 방법을 제공한다.
상기 비축줄기세포, 오가노이드 및 배양은 전술한 바와 같다.
상기 배양 방법은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
(a) advanced DMEM/F12 배지에 오가노이드를 접종하는 단계;
(b) 상기 오가노이드를 접종한 배지에 CHIR99021 및 발프로산을 추가하여 배양하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 배양된 배양물에 SAG를 처리하여 배양하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 advanced DMEM/F12 배지는 HEPES, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, R-스포딘(R-spodin), 노긴(noggin), EGF 및 Y-27632 중 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 SAG의 농도는 0.1 내지 2 μM일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 1.5 μM일 수 있으며, 더욱 구체적으로 1 μM일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CHIR99021의 농도는 1 내지 10 μM일 수 있고, 구체적으로 2 내지 8 μM일 수 있으며, 더욱 구체적으로 3 μM일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 발프로산의 농도는 0.1 내지 2mM일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 1.5 mM일 수 있으며, 더욱 구체적으로 1 mM일 수 있다.
본 발명의 SAG를 유효성분으로 포함하는 배양 조성물로 오가노이드를 배양하여 비축줄기세포를 함유하는 오가노이드를 형성할 수 있으며, 상기 비축 줄기세포 함유 오가노이드는 방사선 조사 등 각종 위해 자극에 대항하는 저항능이 형성되어 방사선 조사가 예정된 환자 등에 안전하게 이식 및 생착이 가능하므로, 재생의학에 다양하게 활용될 수 있다.
다만, 본 명세서에 개시된 기술의 일 실시예에 따른 효과는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 비축줄기세포 표지인자 TERT 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 방사선 저항능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 세포 증식 표지인자 Ki-67 활성을 통한 방사선 저항능을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 분화기능을 확인한 결과이다.
도 1은 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 비축줄기세포 표지인자 TERT 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 방사선 저항능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 세포 증식 표지인자 Ki-67 활성을 통한 방사선 저항능을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 비축줄기세포 함유 오가노이드의 분화기능을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:
비축줄기세포 함유 오가노이드 제조
1-1. 오가노이드 준비
소장 유래 오가노이드를 제작하기 위하여, 4 내지 8주령 C57Bl/6 마우스에서 소장 조직을 분리하여 PBS로 관류시킨 후, 2 내지 4 mm 사이의 크기로 잘게 자른 조직을 PBS에 넣고 10차례 정도 깨끗하게 씻었다. 이후, 200 mM EDTA 함유 PBS에 조직을 넣고, 4℃에서 1시간 동안 흔들어 인큐베이션하였다. 이후, 조직으로부터 떨어져 나온 세포를 70 um cell strainer에 통과시킨 후, 200g로 원심분리 하였다. 가라 앉은 소장 크립트를 포함한 배양액에 마트리겔을 부피비 1:1로 혼합한 후 삼차원 배양을 통해 오가노이드를 제조하였다.
1-2. 비축줄기세포 분화 유도 배양
소장 오가노이드 기본 배지로 advanced DMEM F/12 배지(GibcoTM, Cat. No 12634010)에 10mM HEPES 완충액, 1X 글루타맥스(glutamax), 1mM N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), 전체 배지 부피 100 당 1 부피비의 N2. 2 부피비의 B-27, 20 부피비의 RSPO(R-spodin), 10 부피비의 노긴(Noggin) 및 50 ng/ml EGF를 추가하여 배지를 준비하였다.
이후, 상기 배지에 10 μM Y-27632를 추가한 뒤 실시예 1-1에서 제조한 오가노이드를 접종하여 3일간 배양하고, 다시 3 μM CHIR99021(Sigma-Aldrich, Cat. No SML1046-5MG) 및 1 mM 발프로산(Valproic acid, Sigma-Aldrich, Cat. No P4543-10G)을 추가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4일간 배양한 후, 다시 1 μM SAG(Abcam, Cat. No ab142160)를 처리하고 배양하여 비축줄기세포 유도 오가노이드를 배양하였다.
대조군으로서 상기 과정에서 SAG의 처리를 제외하여 오가노이드를 배양하였다.
실험예 1:
오가노이드 내 분화된
비축줄기세포 검증
실시예 1에서 배양한 비축줄기세포 유도 오가노이드에 비축줄기세포가 형성되었는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 오가노이드는 4% PFA로 고정하였고, PBS에 0.1% Triton X-100을 이용하여, 오가노이드의 투과성을 증가시켰다. 그 후 1시간 동안 3% BSA 및 0.1% Triton X-100을 PBS에 희석한 용액에 넣어 오가노이드의 막을 차단시키고 1차 항체 (anti-hTERT (ab32020, abcam), anti-Ki67 (ab16667, abcam), anti-Green Fluorescent Protein (GFP-1020, aveslabs), anti-Dclk1 (ab31704, abcam), anti-UEA 1 (RL-1062-2, Vector Laboratories))와 함께 4℃에서 하루동안 배양하였다. PBS로 상온에서 10분씩 3번 세척한 후 각 1차 항체와 상응하는 형광 2차 항체들과 함께 2시간동안 배양하였다. 다시 PBS로 상온에서 10분씩 3번 세척한 후 DAPI (4',6-Diamidino-2- Phenylindole, Dihydrochloride)로 상온에서 5분간 오가노이드 핵을 염색하였다.
그 결과, SAG를 처리하여 오가노이드를 배양한 후 시간이 지남에 따라 TERT의 활성이 현저히 증가하는 것을 확인하여, SAG가 비축세포 분화에 관여한다는 것을 확인하였다(도 1).
실험예 2: 비축줄기세포 함유 오가노이드의 방사선 저항능 분석
실시예 1에서 제조한 비축줄기세포 유도 오가노이드의 방사선 저항능을 확인하기 위하여, 방사선 조사 후 소장 움의 형성 및 세포 증식 표지인자 Ki-67의 발현을 확인하였다.
구체적으로, HEPES, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, R-스포딘(R-spodin), 노긴(noggin) 및 EGF를 첨가한 advanced DMEM F/12배지에 3 μM CHIR99021 및 1 mM Valproic acid를 추가한 후 실시예 1-1에서 제조한 오가노이드를 접종하여 6일간 배양한 후, 하기 표와 같은 조건으로 각각 3일간 배양하였다.
| 번호 | 배양 조건 | 구분 |
| ① | HEPES, 글루타맥스, N-아세틸시스테인, N2, B-27, R-스포딘, 노긴 및 EGF를 첨가한 advanced DMEM F/12배지 | 대조군 1 |
| ② | ① + 3 μM CHIR99021 및 1 mM Valproic acid | 대조군 2 |
| ③ | ② + 1 μM SAG | 실험군 |
그 후 각 배양조건으로 배양한 오가노이드를 방사선 조사기 (rs-320)를 이용하여 x-ray 6 Gy로 1회 조사한 후 72시간 경과 뒤 소장 움의 형성을 확인하였다.
그 결과, SAG를 처리한 실험군의 경우 다른 대조군에 비해 소장 움의 형성이 현저히 우수하여, 다른 대조군 대비 현저하게 높은 방사선 저항성을 가짐을 확인하였다(도 2). 따라서, SAG를 포함한 본 발명의 배양액으로 배양한 비축줄기세포 유도 오가노이드는 장기이식시 방사선 조사에 따른 세포 사멸 감소에 대한 보호 효과를 가짐을 알 수 있다.
아울러, 각 배양조건으로 배양한 오가노이드의 배양 완료 후 0시간, 24시간 및 48시간 경과 뒤 실험예 1과 동일한 방법으로 표적단백질의 항원 결정기에 대한 첫 번째 항체를 붙이고, 다음으로 첫번째 항체에 달라붙을 수 있는 형광발현 이차 항체를 붙여 표적 단백질의 발현량을 확인하는 면역형광법으로 세포 증식 표지인자 Ki-67의 발현을 확인한 결과, SAG를 포함한 본 발명의 배양액을 적용한 실험군의 경우 각 시간대에서 대조군 대비 Ki-67이 현저히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
실험예 3: 비축줄기세포 함유 오가노이드의 분화 가능성 검증
실시예 1에서 배양한 비축줄기세포 함유 오가노이드가 분비세포로써의 분화가 가능한지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 소장 오가노이드를 배양한 후 소장 줄기세포 표지인자인 Dclk1(술 세포)과 UEA-1(배상 세포)을 면역형광법을 이용하여 검증하였다. 대조군으로는 HEPES, 글루타맥스, N-아세틸시스테인, N2, B-27, R-스포딘, 노긴 및 EGF를 첨가한 advanced DMEM F/12배지만을 이용하여 배양한 소장 오가노이드를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, SAG를 포함한 본 발명의 배양액으로 배양할 경우(실험군), 그렇지 않은 대조군에 비해 Dclk1 및 UAE-1가 현저히 증가하는 것으로 나타나, 본 발명의 배양 조성물로 배양된 오가노이드 내 비축세포가 각종 성숙 세포들로 정상적으로 분화할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (22)
- SAG(Smoothened receptor agonist)를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 CHIR99021 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 발프로산(valproic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 배양 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, R-스포딘(R-spodin), 노긴(noggin), EGF 및 Y-27632 중 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물로 배양된 오가노이드는 방사선 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는, 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물로 배양된 오가노이드는 TERT 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량이 배양 전보다 높은 것을 특징으로 하는, 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 기본 배지(basal media)를 포함하는 것인, 배양 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 기본 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, advanced DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, Chang's Medium 및 MesemCult-XF Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인, 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 오가노이드는 소장 또는 대장으로부터 유래한 것인, 배양 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양용 배지.
- SAG를 유효성분으로 포함하는, 비축줄기세포 유도용 세포 또는 오가노이드 배양 첨가제 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 조성물은 CHIR99021 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 발프로산(valproic acid) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 중 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 배양 첨가제 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 조성물은 HEPES, 글루타맥스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), N2, B-27, R-스포딘(R-spodin), 노긴(noggin), EGF 및 Y-27632 중 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 배양 첨가제 조성물.
- 성체줄기세포 유래 오가노이드를 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 배양 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드 제조방법.
- 제13항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 소장 또는 대장으로부터 유래한 것인, 오가노이드 제조방법.
- 제13항에 있어서,
상기 비축줄기세포 함유 오가노이드는 방사선 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는, 오가노이드 제조방법.
- 제13항의 제조방법으로 제조된, 비축줄기세포 함유 오가노이드.
- 제16항에 있어서,
상기 오가노이드는 소장 또는 대장 오가노이드인 것인, 비축줄기세포 함유 오가노이드.
- 제16항에 있어서,
상기 오가노이드는 방사선 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드.
- 성체줄기세포 유래 오가노이드를 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 배양 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 비축줄기세포 함유 오가노이드 배양 방법.
- 제19항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 소장 또는 대장으로부터 유래한 것인, 오가노이드 배양 방법.
- 제19항에 있어서,
상기 비축줄기세포 함유 오가노이드는 방사선 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는, 오가노이드 배양 방법.
- 제19항에 있어서,
상기 비축줄기세포 함유 오가노이드는 TERT 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량이 배양 전보다 높은 것을 특징으로 하는, 오가노이드 배양 방법.
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| WO2023191494A1 (ko) | 2023-10-05 |
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