KR20230134138A - 변형된 알파바이러스 벡터 - Google Patents

변형된 알파바이러스 벡터 Download PDF

Info

Publication number
KR20230134138A
KR20230134138A KR1020237027790A KR20237027790A KR20230134138A KR 20230134138 A KR20230134138 A KR 20230134138A KR 1020237027790 A KR1020237027790 A KR 1020237027790A KR 20237027790 A KR20237027790 A KR 20237027790A KR 20230134138 A KR20230134138 A KR 20230134138A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
composition
promoter
nucleic acid
antigen
Prior art date
Application number
KR1020237027790A
Other languages
English (en)
Inventor
수-진 홍
Original Assignee
그릿스톤 바이오, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 filed Critical 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드
Publication of KR20230134138A publication Critical patent/KR20230134138A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

다중 서브게놈 프로모터에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 갖는 알파바이러스 유래 벡터를 포함하는 백신 조성물이 본원에 개시된다.

Description

변형된 알파바이러스 벡터
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 2021년 1월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/139,297의 이익을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2020년 5월 19일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 GSO_101_sequencelisting.txt이며 크기는 10,142,330바이트이다.
알파바이러스는 인간과 다른 동물의 많은 질환에 관여하는 작은 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스 그룹이다. 예를 들어, 문헌("The Alphaviruses: Gene Expression, Replication and Evolution," Microbiological Reviews, Sept. 1994, p. 491-562; Jose et al., "A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly," Future Micriobol., 2009, v.4:837-856)을 참고한다. 이의 높은 복제 효율과 특이성으로 인해 알파바이러스는 포유동물 세포에서 이종 단백질의 발현을 위한 자가 복제 RNA 벡터의 조작에 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌(Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications", PNAS, 1996, v. 93, pp. 11371-11377; Young Kim, et al., "Enhancement of protein expression by alphavirus replicons by designing self-replicating subgenomic RNAs", PNAS, 2014, v.11:29, pp. 10708-10713)을 참고한다. 이 분야에서 약간의 진전이 있었지만 RNA 벡터의 표적 세포로의 전달 효율성, RNA 벡터로부터 이종 단백질의 발현 효율성, RNA 벡터로부터 발현될 단백질의 "맞춤화" 용이성, 특정 이종 단백질(예를 들어, 신생항원)이 RNA 벡터로부터 발현될 때 면역 반응의 개선, 및/또는 이러한 RNA 벡터의 제조 효율의 개선을 포함하는 분야에서 개선이 필요하다.
자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하는 항원 발현 시스템 전달용 조성물이 본원에 제공되며, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템 전달용 조성물은 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하고; 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함하고, 하나 이상의 벡터는 (a) RNA 알파바이러스 골격으로서, (i) 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, RNA 알파바이러스 골격; 및 (b) 적어도 2개의 카세트로서, 각각의 카세트는 독립적으로 (i) a. 에피토프-암호화 핵산 서열, b. 임의로 5' 링커 서열, 및 c. 임의로 3' 링커 서열을 포함하는 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열; 및 (ii) 임의로, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열로서, 제2 폴리(A) 서열은 알파바이러스에 대해 천연 폴리(A) 서열 또는 외인성 폴리(A) 서열이고, 5'에서 3'으로 배향된 적어도 2개의 카세트 중 제1 카세트는 폴리뉴클레오티드 서열 ctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제1 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터(SGP1)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 적어도 2개의 카세트 중 적어도 제2 카세트는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제2 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터(SGP2)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되며, SGP1 및/또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하는, 적어도 2개의 카세트를 포함한다.
또한, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하는 페이로드 전달용 조성물이 본원에 제공되며, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템 전달용 조성물은 (A) 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하고, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함하고, 하나 이상의 벡터는 (a) RNA 알파바이러스 골격으로서, (i) 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, RNA 알파바이러스 골격; 및 (b) 적어도 2개의 카세트로서, 각각의 카세트는 독립적으로 (i) 적어도 하나의 페이로드-암호화 핵산 서열; 및 (ii) 임의로, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열을 포함하고, 제2 폴리(A) 서열은 알파바이러스에 대해 천연 폴리(A) 서열 또는 외인성 폴리(A) 서열이고, 5'에서 3'으로 배향된 적어도 2개의 카세트 중 제1 카세트는 폴리뉴클레오티드 서열 ctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제1 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터(SGP1)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 적어도 2개의 카세트 중 적어도 제2 카세트는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제2 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터(SGP2)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되며, SGP1 및/또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하는, 적어도 2개의 카세트를 포함한다.
일부 측면에서, SGP1의 연장된 3' 프로모터 영역은 SGP2의 연장된 3' 프로모터 영역과 상이하다.
일부 측면에서, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터 중 하나는 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함한다.
일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함한다. 일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT로 구성된다. 일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된다. 일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다.
일부 측면에서, (a) 각각의 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하고; (b) 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터 중 하나만 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 추가로 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하고, 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG는 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT의 3'에 암호화된다.
일부 측면에서, SGP1 서브게놈 프로모터, SGP2 서브게놈 프로모터, 또는 둘 모두는 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 5' 프로모터 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 알파바이러스 비구조 단백질 4(nsp4)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 암호화된다. 일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된다. 일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 ctct를 포함한다.
일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함한다. 일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함한다. 일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함한다. 일부 측면에서, 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성된다.
일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함한다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함한다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함한다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성된다.
일부 측면에서, RNA 알파바이러스 골격의 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열은 SGP1 서브게놈 프로모터를 포함한다.
일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 동일한 알파바이러스로부터 유래된다.
일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역은 SGP1과 SGP2 서브게놈 프로모터 사이의 재조합을 감소시키거나 제거할 수 있다. 일부 측면에서, 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역은 하나 이상의 전사 인핸서 요소를 포함한다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터는 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 카세트의 발현을 적어도 2배 더 크게 촉진할 수 있다. 일부 측면에서, SGP2의 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역은 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 카세트의 발현을 적어도 2배 더 크게 촉진할 수 있다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터는 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 대상체에 대한 투여 후 SGP2 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 카세트에 의해 암호화된 에피토프에 대해 더 강한 면역 반응을 자극할 수 있다. 일부 측면에서, SGP2의 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역은 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 대상체에 대한 투여 후 SGP2 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 카세트에 의해 암호화된 에피토프에 대해 더 강한 면역 반응을 자극할 수 있다.
일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터는 제2 카세트의 5'에 바로, 임의로 제2 카세트의 코작 서열의 5'에 바로 암호화된다.
일부 측면에서, SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 측면에서, SGP1 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함한다.
일부 측면에서, (a) SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하고; (b) 다른 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하지만 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG는 포함하지 않는다. 일부 측면에서, SGP2 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하고 SGP1 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하며, SGP1 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하지 않는다.
일부 측면에서, 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열의 구성된 서열은 다음을 포함하는, 5'에서 3'으로의 화학식으로 기재된다:
P1-(L5b-Nc-L3d)X-P2-(L5b-Nc-L3d)X-Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
식 중, P1은 SGP1 서브게놈 프로모터를 포함하고, P2는 SGP2 서브게놈 프로모터를 포함하며, 추가 카세트의 경우 Pa에 대해 a = 0 또는 1이고, N은 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, c = 1이고, L5는 5' 링커 서열을 포함하고, b = 0 또는 1, L3은 3' 링커 서열을 포함하고, d = 0 또는 1이고, G5는 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, e = 0 또는 1이고, G3은 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, g = 0 또는 1이고, U는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열 중 하나를 포함하고, f = 1이고, X = 1 내지 400이고, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 상응하는 에피토프-암호화 핵산 서열이고, Y = 0, 1 또는 2이고, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이며, 임의로 적어도 하나의 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 측면에서, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 별개의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 각각의 N은 7-15개의 아미노산 길이의 MHC 클래스 I 에피토프, MHC 클래스 II 에피토프, B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프, 또는 이의 조합을 암호화하고, L5는 에피토프의 천연 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 5' 링커 서열이고, 5' 링커 서열은 적어도 2개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하고, L3은 에피토프의 천연 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 3' 링커 서열이고, 3' 링커 서열은 적어도 2개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화한다.
일부 측면에서, 에피토프-암호화 핵산 서열은 암호화된 에피토프 서열을 야생형 핵산 서열에 의해 암호화된 상응하는 펩티드 서열과 구별되게 만드는 적어도 하나의 변경; 병원체 유래 펩티드, 바이러스 유래 펩티드, 박테리아 유래 펩티드, 진균 유래 펩티드 및 기생충 유래 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 감염성 질환 유기체 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 임의로 에피토프-암호화 핵산 서열은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 에피토프; 또는 이의 조합을 암호화한다.
일부 측면에서, 조성물은 나노미립자 전달 비히클을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 나노미립자 전달 비히클은 지질 나노입자(LNP)이다. 일부 측면에서, LNP는 이온화 가능 아미노 지질을 포함한다. 일부 측면에서, 이온화 가능 아미노 지질은 MC3-유사(디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트) 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 나노미립자 전달 비히클은 항원 발현 시스템을 캡슐화한다.
일부 측면에서, 골격은 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 골격은 베네수엘라 말 뇌염 바이러스의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 골격은 적어도 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 비구조 단백질-매개 증폭을 위한 서열, 26S 프로모터 서열, 폴리(A) 서열, 비구조 단백질 1(nsP1) 유전자, nsP2 유전자, nsP3 유전자 및 nsP4 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 골격은 적어도 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 비구조 단백질-매개 증폭을 위한 서열, 26S 프로모터 서열, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 비구조 단백질 매개 증폭을 위한 서열은 알파바이러스 5' UTR, 51-nt CSE, 24-nt CSE, 26S 서브게놈 프로모터 서열, 19-nt CSE, 알파바이러스 3' UTR, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 골격은 구조적 비리온 단백질 캡시드, E2 및 E1을 암호화하지 않는다. 일부 측면에서, 카세트는 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 뉴클레오티드 서열 내 구조적 비리온 단백질 대신에 삽입된다. 일부 측면에서, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스는 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스는 염기쌍 7544와 11176 사이의 결실을 추가로 포함하는 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 골격은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7에 제시된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 카세트는 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열에 제시된 바와 같은 위치 7544에 삽입되어 염기쌍 7544와 11176 사이의 결실을 대체한다.
일부 측면에서, 하나 이상의 카세트는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 카세트는 적어도 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 벡터는 적어도 3500개의 뉴클레오티드 길이인 카세트의 발현을 구동할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 벡터는 적어도 6000개의 뉴클레오티드 길이인 카세트의 발현을 구동할 수 있다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나는 MHC 클래스 I에 의해 제시되는 에피토프를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나는 MHC 클래스 II에 의해 제시되는 에피토프를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나는 B 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, 임의로 B 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부는 항체에 의해 결합될 수 있는 것으로 예측되거나 알려진 전장 단백질, 단백질 도메인, 단백질 서브유닛, 또는 항원성 단편을 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열은 2개 이상의 항원-암호화 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 항원-암호화 핵산 서열은 서로 직접 연결된다. 일부 측면에서, 각각의 항원-암호화 핵산 서열은 링커를 암호화하는 핵산 서열로 별개의 항원-암호화 핵산 서열에 연결된다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나는 적어도 하나의 HLA 대립유전자에 의해 제시될 수 있는 것으로 예측되거나 검증된 2개 이상의 별개의 에피토프를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열은 적어도 2-10, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열은 적어도 11-20, 15-20, 11-100, 11-200, 11-300, 11-400, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 최대 400개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열은 적어도 2-400개의 핵산 서열을 포함하고, 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 2개는 (1) MHC 클래스 I에 의해 제시되고/되거나, (2) MHC 클래스 II에 의해 제시되고/되거나, (3) B 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 2개는 (1) MHC 클래스 I에 의해 제시되고/되거나, (2) MHC 클래스 II에 의해 제시되고/되거나, (3) B 세포 반응 클래스를 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 대상체에 투여되고 번역될 때, 적어도 하나의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 암호화되는 적어도 하나의 에피토프는 항원 제시 세포 상에 제시되어 세포 표면 상에 적어도 하나의 항원을 표적화하는 면역 반응을 초래한다. 일부 측면에서, 대상체에 투여되고 번역될 때, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열에 의해 암호화되는 적어도 하나의 항원은 적어도 하나의 항원을 표적화하는 항체 반응을 초래한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열은 대상체에 투여되고 번역될 때, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 항원 중 적어도 하나는 항원 제시 세포 상에 제시되어 세포 표면 상 항원 중 적어도 하나를 표적화하는 면역 반응을 초래하고, 임의로 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 각각의 발현은 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열에 의해 구동된다.
일부 측면에서, 각각의 MHC 클래스 I 에피토프-암호화 핵산 서열은 8 내지 35개의 아미노산 길이, 임의로 9-17, 9-25, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열을 암호화한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재하고 적어도 하나의 MHC 클래스 II 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열은 12-20, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 20-40개의 아미노산 길이이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재하고 적어도 하나의 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하며, 임의로 적어도 하나의 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나, 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 제2 프로모터 뉴클레오티드 서열은 유도성이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 제2 프로모터 뉴클레오티드 서열은 비-유도성이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열은 골격에 대해 천연인 폴리(A) 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열은 골격에 대해 외인성인 폴리(A) 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열은 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나에 작동 가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열은 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개 또는 적어도 90개의 연속 A 뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열은 적어도 80개의 연속 A 뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열이 존재한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열은 SV40 폴리(A) 신호 서열 또는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 신호 서열, 또는 2개 이상의 SV40 폴리(A) 신호 서열 또는 BGH 폴리(A) 신호 서열의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열은 2개 이상의 제2 폴리(A) 서열을 포함하고, 임의로 2개 이상의 제2 폴리(A) 서열은 2개 이상의 SV40 폴리(A) 신호 서열 2개 이상의 BGH 폴리(A) 신호 서열, 또는 SV40 폴리(A) 신호 서열과 BGH 폴리(A) 신호 서열의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 항원 카세트는 인트론 서열, 외인성 인트론 서열, 구성적 수송 요소(CTE), RNA 수송 요소(RTE), 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE) 서열, 내부 리보솜 진입 서열(IRES) 서열, 2A 자가 절단 펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 퓨린 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나에 작동 가능하게 연결된 mRNA의 핵 외수송, 안정성 또는 번역 효율을 향상시키는 것으로 알려진 5' 또는 3' 비코딩 영역의 서열 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 항원 카세트는 녹색 형광 단백질(GFP), GFP 변이체, 분비된 알칼리 포스파타제, 루시퍼라제, 루시퍼라제 변이체, 또는 검출 가능한 펩티드 또는 에피토프를 포함하지만 이에 제한되지 않는 리포터 유전자를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 검출 가능한 펩티드 또는 에피토프는 HA 태그, 플래그 태그, His-태그 또는 V5 태그로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 하나 이상의 벡터는 적어도 하나의 면역 조절제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 면역 조절제는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-4-1BB 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 측면에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), 함께 연결된 단일 특이적 또는 다중 특이성으로서의 단일 도메인 항체(sdAb)(예를 들어, 낙타류 항체 도메인), 또는 전장 단일 사슬 항체(예를 들어, 유연한 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄가 있는 전장 IgG)이다. 일부 측면에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 2A 또는 IRES와 같은 자가 절단 서열에 의해 분리된 인접 서열이거나; 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 연속 글리신 잔기와 같은 유연한 링커에 의해 연결된다. 일부 측면에서, 면역 조절제는 사이토카인이다. 일부 측면에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-21 또는 각각의 이의 변이체 중 적어도 하나이다.
또한 본원에 기재된 임의의 조성물의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 벡터 세트가 본원에 제공된다.
또한 본원에 기재된 임의의 조성물의 뉴클레오티드 서열 또는 단리된 뉴클레오티드 서열의 세트를 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공되며, 임의로 세포는 BHK-21, CHO, HEK293 또는 이의 변이체, 911, HeLa, A549, LP-293, PER.C6, 또는 AE1-2a 세포이다.
또한 본원에 기재된 임의의 조성물의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또한, 대상체에 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
대상체에 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 대상체는 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 암호화된 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 에피토프를 제시하는 것으로 예측되거나 알려진 적어도 하나의 HLA 대립유전자를 발현한다.
일부 측면에서, 임의의 상기 조성물은 나노미립자 전달 비히클을 추가로 포함한다. 나노미립자 전달 비히클은 일부 측면에서 지질 나노입자(LNP)일 수 있다. 일부 측면에서, LNP는 이온화 가능 아미노 지질을 포함한다. 일부 측면에서, 이온화 가능 아미노 지질은 MC3-유사(디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트) 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 나노미립자 전달 비히클은 항원 발현 시스템을 캡슐화한다.
일부 측면에서, 임의의 상기 조성물은 추가로 복수의 LNP를 포함하고, LNP는 항원 발현 시스템; 양이온성 지질; 비양이온성 지질; 및 LNP의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함하며, 복수의 LNP 중 LNP의 적어도 약 95%는 비-층판 형태를 갖거나; 전자가 조밀하다.
일부 측면에서, 비양이온성 지질은 (1) 인지질 및 (2) 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물이다.
일부 측면에서, LNP의 응집을 억제하는 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체이다. 일부 측면에서, PEG-지질 접합체는 PEG-디아실글리세롤(PEG-DAG) 접합체, PEG 디알킬옥시프로필(PEG-DAA) 접합체, PEG-인지질 접합체, PEG-세라미드(PEG-Cer) 접합체, 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서 PEG-DAA 접합체는 PEG-디데실옥시프로필(C10) 접합체, PEG-디라우릴옥시프로필(C12) 접합체, PEG-디미리스틸옥시프로필(C14) 접합체, PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 접합체, PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 접합체 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 구성원이다.
일부 측면에서, 항원 발현 시스템은 LNP에 완전히 캡슐화된다.
일부 측면에서, LNP의 비-층판 형태는 역육방정계(H II ) 또는 입방정계 상 구조를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 10몰% 내지 약 50몰%를 차지한다. 일부 측면에서, 양이온성 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 20몰% 내지 약 50몰%를 차지한다. 일부 측면에서, 양이온성 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 20몰% 내지 약 40몰%를 차지한다.
일부 측면에서, 비양이온성 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 10몰% 내지 약 60몰%를 차지한다. 일부 측면에서, 비양이온성 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 20몰% 내지 약 55몰%를 차지한다. 일부 측면에서, 비양이온성 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 25몰% 내지 약 50몰%를 차지한다.
일부 측면에서, 접합된 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 0.5몰% 내지 약 20몰%를 차지한다. 일부 측면에서, 접합된 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 2몰% 내지 약 20몰%를 차지한다. 일부 측면에서, 접합된 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 약 1.5몰% 내지 약 18몰%를 차지한다.
일부 측면에서, LNP의 95% 초과는 비-층판 형태를 갖는다. 일부 측면에서, LNP의 95% 초과는 전자가 조밀하다.
일부 측면에서, 임의의 상기 조성물은 복수의 LNP를 추가로 포함하며, LNP는 LNP에 존재하는 전체 지질의 50몰% 내지 65몰%를 차지하는 양이온성 지질; LNP에 존재하는 전체 지질의 0.5몰% 내지 2몰%를 차지하는 LNP의 응집을 억제하는 접합된 지질; 및 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물로서, 인지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 4몰% 내지 10몰%를 차지하고 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 LNP에 존재하는 전체 지질의 30몰% 내지 40몰%를 차지하는, 혼합물; 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물로서, 인지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 3몰% 내지 15몰%를 차지하고 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 LNP에 존재하는 전체 지질의 30몰% 내지 40몰%를 차지하는, 혼합물 중 하나를 포함하는 비-양이온성 지질을 포함하거나; LNP에 존재하는 전체 지질의 최대 49.5몰%이고 인지질 및 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물을 포함하며, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 LNP에 존재하는 전체 지질의 30몰% 내지 40몰%를 차지한다.
일부 측면에서, 임의의 상기 조성물은 복수의 LNP를 추가로 포함하며, LNP는 LNP에 존재하는 전체 지질의 50몰% 내지 85몰%를 차지하는 양이온성 지질; LNP에 존재하는 전체 지질의 0.5몰% 내지 2몰%를 차지하는 LNP의 응집을 억제하는 접합된 지질; 및 LNP에 존재하는 전체 지질의 13몰% 내지 49.5몰%를 차지하는 비-양이온성 지질을 포함한다.
일부 측면에서, 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 이의 혼합물을 포함한다.
일부 측면에서, 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 포함한다. 일부 측면에서, PEG-지질 접합체는 PEG-디아실글리세롤(PEG-DAG) 접합체, PEG-디알킬옥시프로필(PEG-DAA) 접합체 또는 이의 혼합물을 포함한다. 일부 측면에서, PEG-DAA 접합체는 PEG-디미리스틸옥시프로필(PEG-DMA) 접합체, PEG-디스테아릴옥시프로필(PEG-DSA) 접합체 또는 이의 혼합물을 포함한다. 일부 측면에서, 접합체의 PEG 부분은 약 2,000달톤의 평균 분자량을 갖는다.
일부 측면에서, 접합된 지질은 LNP에 존재하는 전체 지질의 1몰% 내지 2몰%를 차지한다.
일부 측면에서, LNP는 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변이체, 전구약물 또는 입체이성질체를 포함한다:
[화학식 I]
식 중, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -0(C=0)-, -(C=0)0-, -C(=0)-, -0-, -S(0)x-, -S-S-, -C(=0)S-, -SC(=0)-, -RaC(=0)-, -C(=0)Ra-, -RaC(=0)Ra-, -OC(=0)Ra-, -RaC(=0)0- 또는 직접 결합이고; G1은 Ci-C2 알킬렌, -(C=0)-, -0(C=0)-, -SC(=0)-, -RaC(=0)- 또는 직접 결합: -C(=0)-, -(C=0)0-, -C(=0)S-, -C(=0)Ra- 또는 직접 결합이고; G는 Ci-C6 알킬렌이고; Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고; R1a 및 R1b는 각각의 경우에 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R2a 및 R2b는 각각의 경우에 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R2b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R3a 및 R3b는 각각의 경우에 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R4a 및 R4b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R5 및 R6은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고; R7은 C4-C20 알킬이고; R8 및 R9는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬이거나; R8 및 R9는 부착된 질소 원자와 함께 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고; x는 0, 1 또는 2이다.
일부 측면에서, LNP는 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변이체, 전구약물 또는 입체이성질체를 포함한다:
[화학식 II]
　
식 중, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -0(C=0)-, -(C=0)0- 또는 탄소-탄소 이중 결합이고; R1a 및 R1b는 각각의 경우에 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R1a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R1b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R2a 및 R2b는 각각의 경우에 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R2a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R2b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R2b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R3a 및 R3b는 각각의 경우에 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R3a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R3b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R3b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R4a 및 R4b는 각각의 경우 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나; (b) R4a는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R4b는 결합된 탄소 원자와 함께 취해져서 인접한 R4b 및 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하고; R5 및 R6은 각각 독립적으로 메틸 또는 사이클로알킬이고; R7은 각각의 경우에 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고; R8 및 R9는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬이거나; R8 및 R9는 부착된 질소 원자와 함께 1개의 질소 원자를 포함하는 5원, 6원 또는 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 24의 정수이고; b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수이고; e는 1 또는 2이고, 단 R1a, R2a, R3a　또는 R4a 중 적어도 하나는 C1-C12 알킬이거나, L1 또는 L2 중 적어도 하나는 -0(C=0)- 또는 -(C=0)0-이고; R1a 및 R1b는 a가 6일 때 이소프로필이 아니거나, a가 8일 때 n-부틸이 아니다.
일부 측면에서, 임의의 상기 조성물은 중성 지질, 스테로이드 및 중합체 접합된 지질을 포함하는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 측면에서, 중성 지질은 DSPC이다.
일부 측면에서, 화합물 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
일부 측면에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 측면에서, 화합물 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 1:1 범위이다.
일부 측면에서, 중합체 접합된 지질은 peg화된 지질이다. 일부 측면에서, 화합물 대 peg화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1 범위이다. 일부 측면에서, peg화된 지질은 PEG-DAG, PEG 폴리에틸렌(PEG-PE), PEG-숙시노일-디아실글리세롤(PEG-S-DAG), PEG-cer 또는 PEG 디알콕시프로필카바메이트이다. 일부 측면에서, peg화된 지질은 하기 구조 III을 갖거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 호변이체 또는 입체이성질체이다:
[화학식 III]
식 중, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬 사슬이고, 알킬 사슬은 임의로 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 단속되고; z는 30 내지 60 범위의 평균값을 갖는다. 일부 측면에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 포화 알킬 사슬이다. 일부 측면에서 평균 z는 약 45이다.
여기서 시작한다
일부 측면에서, LNP는 다중음이온 핵산과 혼합될 때 비-이중층 구조로 자가 조립된다. 일부 측면에서, 비-이중층 구조는 60 nm 내지 120 nm의 지름을 갖는다. 일부 측면에서, 비-이중층 구조는 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm 또는 약 100 nm의 지름을 갖는다. 일부 측면에서, 나노미립자 전달 비히클은 약 100 nm의 지름을 갖는다.
또한 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 벡터 세트가 본원에 제공된다. 또한 본원에 개시된 단리된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다.
또한 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 단리된 뉴클레오티드 서열 세트를 포함하는 단리된 세포가 본원에 제공되며, 임의로 세포는 BHK-21, CHO, HEK293 또는 이의 변이체, 911, HeLa, A549, LP-293, PER.C6 또는 AE1-2a 세포이다.
또한 본원에 기재된 임의의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 또한 본원에 개시된 벡터 또는 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트가 본원에 개시된다.
또한 대상체에 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, Covid-19를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또한 대상체에 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또한 대상체에 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공된다.
또한 대상체에 본원에 개시된 벡터 또는 본원에 개시된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 임의의 상기 조성물의 하나 이상의 벡터를 제조하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 본원에 개시된 임의의 조성물을 제조하는 방법이 본원에 개시된다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 측면 및 장점은 하기 설명 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 단일 알파바이러스-유래 서브게놈 프로모터(SGP)를 특징으로 하는 자가 증폭 mRNA(SAM) 시스템을 예시한다.
도 2는 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 특징으로 하는 SAM 시스템을 예시한다.
도 3은 별도의 알파바이러스 유래 서브게놈 프로모터(SGP)에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대해 ELISpot을 사용하여 측정된 항원 특이적 세포 면역 반응을 제시한다. 면역화 2주 후의 IFNγ ELISpot 결과를 나타낸다. 스파이크(Spike), 뉴클레오캡시드 또는 Orf3a에 걸친 중첩 펩티드 풀에 대한 T 세포 반응을 나타낸다.
도 4는 별도의 CMV 프로모터에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 특징으로 하는 ChAdV 시스템으로 백신접종된 마우스에 대해 ELISpot을 사용하여 측정된 항원 특이적 세포 면역 반응을 제시한다. 면역화 2주 후의 IFNγ ELISpot 결과를 나타낸다. 스파이크, 뉴클레오캡시드 또는 Orf3a에 걸친 중첩 펩티드 풀에 대한 T 세포 반응을 나타낸다.
도 5는 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "IDT-스파이크" 및 T 세포 에피토프 카세트 5 "TCE5")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대해 ELISpot을 사용하여 측정된 항원 특이적 세포 면역 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. 왼쪽 패널은 스파이크 항원에 걸친 8개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 오른쪽 패널은 NCap, 막 및 Orf3a에 걸친 3개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 데이터는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화된 Balb/c 마우스(n = 6/그룹) 및 면역화 2주 후 비장세포 단리에 대한 것이다.
도 6은 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "IDT-스파이크" 및 T 세포 에피토프 카세트 5 "TCE5")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대한 스파이크-특이적 IgG 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. Balb/c 마우스가 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화되었다(n = 4/그룹). 면역화 4주 후 혈청이 수집되고 분석되었다. S1 IgG 결합은 MSD ELISA로 측정되었다. 종결점 역가는 보간되었다. Geomean, 기하학적 SD.
도 7은 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "IDT-스파이크" 및 T 세포 에피토프 카세트 6 또는 7 "TCE6/7")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대해 ELISpot을 사용하여 측정된 항원 특이적 세포 면역 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. 상단 패널은 스파이크 항원에 걸친 8개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 하단 패널은 NCap, 막 및 Orf3a에 걸친 3개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 데이터는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화된 Balb/c 마우스(n = 6/그룹) 및 면역화 2주 후 비장세포 단리에 대한 것이다.
도 8은 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "IDT-스파이크" 및 T 세포 에피토프 카세트 6 또는 7 "TCE6/7")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대한 스파이크-특이적 IgG 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. Balb/c 마우스는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화되었다(n = 4/그룹). 면역화 4주 후 혈청이 수집되고 분석되었다. S1 IgG 결합은 MSD ELISA로 측정되었다. 종결점 역가는 보간되었다. Geomean, 기하학적 SD.
도 9는 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "IDT-스파이크" 및 T 세포 에피토프 카세트 5 또는 8 "TCE5/8")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대해 ELISpot을 사용하여 측정된 항원 특이적 세포 면역 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. 상단 패널은 스파이크 항원에 걸친 8개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 하단 패널은 NCap, 막 및 Orf3a에 걸친 3개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 데이터는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화된 Balb/c 마우스(n = 6/그룹) 및 면역화 2주 후 비장세포 단리에 대한 것이다.
도 10은 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "IDT-스파이크" 및 T 세포 에피토프 카세트 5 또는 8 "TCE5/8")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대한 스파이크-특이적 IgG 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. Balb/c 마우스는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화되었다(n = 4/그룹). 면역화 4주 후 혈청이 수집되고 분석되었다. S1 IgG 결합은 MSD ELISA로 측정되었다. 종결점 역가는 보간되었다. Geomean, 기하학적 SD.
도 11은 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "SA-스파이크"; 및 T 세포 에피토프 카세트 9 "TCE9" 또는 뉴클레오캡시드와 TCE11의 조합 "Nuc-TCE11")를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대해 ELISpot을 사용하여 측정된 항원 특이적 세포 면역 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. 왼쪽 패널은 스파이크 항원에 걸친 8개의 중첩 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 중간 패널은 TCE(Orf3a, 막 및 NSP 3, 4, 6 및 12 유전자)에 대한 단백질 특이적 펩티드 풀을 사용하여 ELISpot에 의해 검출된 T 세포 반응의 합을 나타낸다. 오른쪽 패널은 뉴클레오캡시드에 걸친 펩티드 풀에 대한 반응의 합을 나타낸다. 데이터는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화된 Balb/c 마우스(n = 6/그룹) 및 면역화 2주 후 비장세포 단리에 대한 것이다. T 세포 분석을 위해 d14에 각각의 그룹의 6마리 마우스로부터 비장이 수확되었다. 나머지 마우스(n=6)로부터의 혈청이 0, 4, 8 및 12에 항-IgG MSD ELISA로 IgG 반응에 대해 분석되었다. 4주 IgG 데이터를 나타낸다.
도 12는 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트(스파이크 "SA-스파이크"; 및 T 세포 에피토프 카세트 9 "TCE9" 또는 뉴클레오캡시드와 TCE11의 조합 "Nuc-TCE11)를 특징으로 하는 SAM 시스템으로 백신접종된 마우스에 대한 스파이크-특이적 IgG 반응을 제시한다. 다양한 카세트 구성에 대한 개략도를 상단에 나타낸다. Balb/c 마우스는 10 ug의 각각의 SAM 백신으로 면역화되었다(n = 6/그룹). 면역화 0, 4, 8 및 12주 후 혈청이 수집되고 분석되었다. 면역화 4주 후를 나타낸다. S1 IgG 결합은 MSD ELISA로 측정되었다. 종결점 역가는 보간되었다. Geomean, 기하학적 SD.
본원에 기재된 페이로드/항원 발현 시스템의 전달을 위한 다중시스트론 알파바이러스 유래 자가 증폭 mRNA(SAM) 벡터 및 조성물이 본원에 기재된다. 다중시스트론 SAM 작제물은 (A) 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하며, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함하고, 하나 이상의 벡터는 (a) RNA 알파바이러스 골격으로서, (i) 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, RNA 알파바이러스 골격; 및 (b) 페이로드 서열을 발현하는 적어도 2개의 카세트로서, 5'에서 3'으로 배향된 적어도 2개의 카세트 중 제1 카세트는 폴리뉴클레오티드 서열 ctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제1 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터(SGP1)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 적어도 2개의 카세트 중 적어도 제2 카세트는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제2 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터(SGP2)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, SGP1 및/또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하는, 적어도 2개의 카세트를 포함한다.
일반적으로 이론에 얽매이지 않고, 다중시스트론 SAM 벡터는 (1) 큰 카세트(예를 들어, 대략 4 kb 이상인 길이의 카세트와 같은 천연 알파바이러스 서브게놈 프로모터로부터 발현된 천연 카세트의 크기보다 큼); (2) 다중 페이로드의 개선된 발현 제어, 예를 들어 상이한 페이로드의 상대적 발현 제어; 및 (3) 벡터 재조합 이벤트(예를 들어, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 사이의 벡터내 프로모터 재조합)를 감소시키는 것과 같은 개선된 벡터 안정성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당분야에 존재하는 잠재적인 기술적 한계를 해결한다.
예시적인 백신 맥락에서, 각각의 카세트는 독립적으로 (i) a. 에피토프-암호화 핵산 서열, b. 임의로 5' 링커 서열, 및 c. 임의로 3' 링커 서열을 포함하는 적어도 하나의 항원 암호화 핵산 서열을 포함할 수 있다.
카세트는 임의로 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열을 포함할 수 있으며, 제2 폴리(A) 서열은 알파바이러스 골격에 대해 천연 폴리(A) 서열 또는 외인성 폴리(A) 서열이다.
본원에서 다중시스트론 SAM 벡터는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 다중 서브게놈 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 최소 "보존된" 프로모터 서열은 폴리뉴클레오티드 서열 ctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하며, "+1"은 서브게놈 프로모터의 추정 전사 시작 부위를 표시한다. 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 추가적인 측면 서열은 프로모터 활성에 영향을 미칠 수 있으며 코어 프로모터의 일부로 간주될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 검출 가능한 발현 및/또는 생체내 유효성(예를 들어, 면역 반응을 자극하는 유효성)을 생성하기 위해 추가적인 측면 서열이 필요할 수 있다.
서브게놈 프로모터(SGP1, SGP2 또는 둘 모두)는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 동일한 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 상이한 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함할 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT 및 알파바이러스, 예를 들어 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 동일한 알파바이러스로부터 유래된 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 AGTCTAGTCCGCCAAG를 포함할 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함할 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함할 수 있고 코어 보존된 프로모터 서열의 바로 3'에 암호화되어(즉, 코어 보존된 프로모터와 연장된 3' 프로모터 영역 사이에 개재 뉴클레오티드가 포함되지 않음) 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACAT 또는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACAT를 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다. 연장된 3' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함할 수 있고 코어 보존된 프로모터 서열의 바로 3'에 암호화되어 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG 또는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나는(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나만) 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터 중 하나는 다른 연장된 3' 프로모터 영역과 상이한 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다(예를 들어, SGP1 및 SGP2는 상이한 연장된 3' 프로모터 영역을 가짐). 예를 들어, 그리고 이론에 얽매이지 않고, 연장된 3' 프로모터 영역은 서브게놈 프로모터 중 하나(둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2)에서만 연장된 3' 프로모터 영역을 포함함으로써 벡터 재조합 이벤트(예를 들어, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 사이의 벡터내 프로모터 재조합)을 감소시키는 것과 같이, 벡터 안정성을 향상시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 그리고 이론에 얽매이지 않고, 연장된 3' 프로모터 영역은 서브게놈 프로모터 중 하나(둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2)에서만 연장된 3' 프로모터 영역을 포함함으로써 다양한 서브게놈 프로모터로부터의 카세트 발현의 상대 강도를 제어하는 것과 같이, 발현의 제어를 개선할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT 및 알파바이러스, 예를 들어 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용되는 동일한 알파바이러스로부터 유래된 추가적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2)만 폴리뉴클레오티드 서열 AGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역 서열을 포함할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나 또는 모두는 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있지만, 서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 알파바이러스, 예를 들어 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 것과 동일한 알파바이러스로부터 유래된 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터 중 하나 또는 모두는 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있지만, 서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 폴리뉴클레오티드 서열 AGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역 서열을 포함할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터 중 하나 또는 모두는 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있지만, 서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있고 코어 보존된 프로모터 서열의 바로 3'에 암호화되어 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACAT 또는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACAT를 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있고 코어 보존된 프로모터 서열의 바로 3'에 암호화되어 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG 또는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다.
서브게놈 프로모터 중 하나 또는 모두는 코어 보존된 프로모터 서열의 바로 3'에 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있지만, 서브게놈 프로모터 중 하나(즉, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나)만 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함할 수 있고 코어 보존된 프로모터 서열의 바로 3'에 암호화될 수 있다.
일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC 또는 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC와 쌍을 이루는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG 또는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTACGGCTAACCTGAATGGA 또는 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA와 쌍을 이루는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG 또는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다.
일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC와 쌍을 이루는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC와 쌍을 이루는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다.
일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTCTCTACGGCTAACCT와 쌍을 이루는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA와 쌍을 이루는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다.
일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC와 쌍을 이루는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC와 쌍을 이루는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다.
일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTACGGCTAACCTGAATGGA와 쌍을 이루는 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다. 일부 경우에, 쌍을 이루는 서브게놈 프로모터 서열(즉, SGP1 및 SGP2)은 추가적인 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하지 않는 CTACGGCTAACCTGAATGGA와 쌍을 이루는 CTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함한다.
서브게놈 프로모터(SGP1, SGP2 또는 둘 모두)는 연장된 5' 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 연장된 5' 프로모터 영역은 연장된 5' 프로모터 영역을 포함함으로써 다양한 서브게놈 프로모터로부터 카세트 발현의 상대 강도를 제어하는 것과 같이 발현 제어를 개선할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 동일한 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 상이한 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로(즉, 코어 보존된 프로모터와 연장된 5' 프로모터 영역 사이에 개재 뉴클레오티드가 포함되지 않음) 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 ctct를 포함한다. 한 구현예에서, 하나 이상의 서브게놈 프로모터 각각은 최소 서열 ctctctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함한다.
연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 ggggcccctataactct를 포함할 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 ggggcccctataactct를 포함할 수 있다.
연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성될 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성될 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 ggggcccctataactct로 구성될 수 있다. 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 ggggcccctataactct로 구성될 수 있다.
SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함할 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성될 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성될 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 폴리뉴클레오티드 서열 ggggcccctataactct로 구성될 수 있다. SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역은 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 ggggcccctataactct로 구성될 수 있다.
연장된 프로모터 영역은 하나 이상의 전사 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 코어 프로모터 서열(들)의 3' 또는 5'에 암호화될 수 있다. SGP1, SGP2 또는 둘 모두 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 동일한 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 인핸서 요소는 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 상이한 알파바이러스로부터 유래될 수 있다. 특히, 천연 알파바이러스에서 nsp4 유전자의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 천연 26S 서브게놈 전사 프로모터의 맥락에서 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 코어 보존된 프로모터 서열과 중첩된다. 따라서, SGP1, SGP2 또는 둘 모두는 알파바이러스 비구조 단백질 4(nsp4)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 요소를 포함할 수 있으며, 이는 일반적으로 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 암호화되며, 예를 들어, 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된다. nsp4의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 추가적인 서열 GGGCCCCTATAA를 포함하여 서브게놈 프로모터가 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하도록 초래할 수 있다. SGP1, SGP2 또는 둘 모두는 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함할 수 있다. 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 nsp4의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG의 연장된 3' 프로모터 영역의 포함은 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG(이는 일반적으로 둘 모두가 아닌, SGP1 또는 SGP2 중 하나로 제한됨)를 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다. nsp4의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 추가적인 서열 GGGGCCCCTATAA를 포함하여 서브게놈 프로모터에서 서열 GGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함할 수 있도록 초래할 수 있다. SGP1, SGP2 또는 둘 모두는 서열 GGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함할 수 있다. 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 nsp4의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG의 연장된 프로모터 영역의 포함은 서열 GGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG(일반적으로 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 중 하나로 제한됨)를 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다.
코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 nsp4의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG의 연장된 프로모터 영역의 포함은 하기 서열 쌍을 포함하는 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다:
(1) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는 SGP1 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 SGP2;
(2) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는 SGP2 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 SGP1;
(3) CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는 SGP1 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 SGP2;
(4) CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는 SGP2 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 SGP1;
(5) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는 SGP1 및 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 SGP2;
(6) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는 SGP2 및 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는 SGP1.
코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 nsp4의 C-말단 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 atagtctagtccgccaag의 연장된 프로모터 영역의 포함은 하기 서열 쌍으로 구성된 서브게놈 프로모터를 생성할 수 있다:
(1) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC로 구성된 SGP1 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된 SGP2;
(2) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC로 구성된 SGP2 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된 SGP1;
(3) CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC로 구성된 SGP1 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된 SGP2;
(4) CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC로 구성된 SGP2 및 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된 SGP1;
(5) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC로 구성된 SGP1 및 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된 SGP2;
(6) GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC로 구성된 SGP2 및 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된 SGP1.
RNA 알파바이러스 골격의 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열은 SGP1 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, SGP1은 알파바이러스 골격에 의해 제공되는 "천연" 서브게놈 프로모터를 지칭할 수 있다.
발현 수준의 제어를 제공하기 위해 카세트가 구성될 수 있다. 예를 들어, 이론에 얽매이지 않고 도 2가 예시한 바와 같이, 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 특징으로 하는 SAM 시스템은 SGP1 및 SGP2 둘 모두가 제2 유전자를 암호화하는 전사체를 생성할 것이라는 점에서 제2 SGP(SGP2)의 제어 하에 유전자의 더 높은 발현을 구동할 수 있다. 따라서, 다중시스트론 SAM 벡터는 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 카세트의 발현을 적어도 2배 더 크게 촉진할 수 있는 SGP2 서브게놈 프로모터를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 연장된 프로모터 영역(예를 들어, 상술된 5' nsp4 폴리뉴클레오티드 및/또는 atagtctagtccgccaag)은 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 카세트의 발현을 적어도 2배 더 크게 촉진할 수 있는 SGP2에 포함된다.
카세트는 카세트가 카세트로부터 페이로드의 발현을 구동할 수 있는 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 서브게놈 프로모터는 카세트의 코작 서열의 바로 5'를 포함하여 카세트의 5'에 바로 있을 수 있다.
I. 정의
일반적으로 청구범위 및 명세서에서 사용된 용어는 당업자가 이해하는 일반적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 추가 명확성을 제공하기 위해 특정 용어가 아래에 정의되어 있다. 일반 의미와 제공된 정의가 상충하는 경우 제공된 정의를 사용해야 한다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 면역 반응을 자극하는 물질이다. 항원은 신생항원일 수 있다. 항원은 특정 집단, 예를 들어 특정 암 환자 집단 사이에서 발견되는 항원인 "공유 항원"일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "신생항원"은 예를 들어 종양 세포에서의 돌연변이 또는 종양 세포에 특이적인 번역 후 변형을 통해, 이를 상응하는 야생형 항원과 구별되게 만드는 적어도 하나의 변경을 갖는 항원이다. 신생항원은 폴리펩티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 돌연변이는 프레임이동 또는 비-프레임이동 삽입결실, 미스센스 또는 논센스 치환, 스플라이스 부위 변경, 게놈 재배열 또는 유전자 융합, 또는 neoORF를 발생시키는 임의의 게놈 또는 발현 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이는 또한 스플라이스 변이체를 포함할 수 있다. 종양 세포에 특이적인 번역 후 변형은 비정상적 인산화를 포함할 수 있다. 종양 세포에 특이적인 번역 후 변형은 또한 프로테아좀-생성 스플라이싱된 항원을 포함할 수 있다. 문헌(Liepe et al., A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016 Oct 21;354(6310):354-358)을 참고한다. 대상체는 다양한 진단 방법, 예를 들어 아래에 추가로 기재된 환자 선택 방법의 사용을 통해 투여를 위해 확인될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양 항원"은 대상체의 종양 세포 또는 조직에 존재하지만 대상체의 상응하는 정상 세포 또는 조직에는 존재하지 않거나, 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포에서 또는 암성 조직에서 변경된 발현을 갖는 것으로 알려졌거나 발견된 폴리펩티드로부터 유래된 항원이다.
본원에 사용된 용어 "항원 기반 백신"은 하나 이상의 항원, 예를 들어 복수의 항원에 기반하는 백신 조성물이다. 백신은 뉴클레오티드 기반(예를 들어, 바이러스 기반, RNA 기반 또는 DNA 기반), 단백질 기반(예를 들어, 펩티드 기반) 또는 이의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "후보 항원"은 항원을 나타낼 수 있는 서열을 발생시키는 돌연변이 또는 다른 이상이다.
본원에 사용된 용어 "코딩 영역"은 단백질을 암호화하는 유전자 부분(들)이다.
본원에 사용된 용어 "코딩 돌연변이"는 코딩 영역에서 발생하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "ORF"는 개방 판독 프레임을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "NEO-ORF"는 돌연변이 또는 스플라이싱과 같은 다른 이상으로부터 발생하는 종양 특이적 ORF이다.
본원에 사용된 용어 "미스센스 돌연변이"는 하나의 아미노산에서 또 다른 아미노산으로의 치환을 유발하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "논센스 돌연변이"는 아미노산에서 정지 코돈으로의 치환을 유발하거나 정규 시작 코돈의 제거를 유발하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "프레임이동 돌연변이"는 단백질의 프레임에서 변화를 유발하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "삽입결실"은 하나 이상의 핵산의 삽입 또는 결실이다.
본원에 사용된 용어 "동일성" 백분율은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여, 후술된 서열 비교 알고리즘(예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 일치를 위해 비교되고 정렬될 때, 동일한 특정 백분율의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라, "동일성" 백분율은 비교되는 서열의 영역에 걸쳐, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로 비교될 2개 서열의 전장에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 컴퓨터에 시험 및 참조 서열이 입력되고, 필요에 따라 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수에 기반하여 참조 서열 대비 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.　대안적으로, 서열 유사성 또는 비유사성은 특정 뉴클레오티드, 또는 번역된 서열의 경우, 선택된 서열 위치(예를 들어, 서열 모티프)에서 아미노산의 조합된 존재 또는 부재에 의해 확립될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))의 국소 상동성 알고리즘, 문헌(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌(Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))의 상동성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 육안 검사(일반적으로 하기 문헌(Ausubel et al.) 참고)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기 적합한 알고리즘의 한 예는 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))에 기재되어 있는, BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용 가능하다.　
본원에 사용된 용어 "논스톱 또는 판독-통과"는 천연 정지 코돈의 제거를 유발하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 전형적으로 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 결합되는 항원의 특정 부분이다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 예를 들어 T 세포, B 세포 또는 둘 모두를 통해, 면역 반응을 자극하는 능력이다.
본원에 사용된 용어 "HLA 결합 친화도" "MHC 결합 친화도"는 특정 항원과 특정 MHC 대립유전자 사이의 결합 친화도를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "미끼(bait)"는 샘플로부터 DNA 또는 RNA의 특정 서열을 풍부하게 만들기 위해 사용되는 핵산 탐침이다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 대상체의 핵산과 대조군으로 사용되는 참조 인간 게놈 사이의 차이이다.
본원에 사용된 용어 "변이체 호출"은 전형적으로 시퀀싱으로부터의, 변이체 존재의 알고리즘적 결정이다.
본원에 사용된 용어 "다형성"은 생식계열 변이체, 즉 개체의 모든 DNA 보유 세포에서 발견되는 변이체이다.
본원에 사용된 용어 "체세포 변이체"는 개체의 비-생식계열 세포에서 발생하는 변이체이다.
본원에 사용된 용어 "대립유전자"는 유전자의 버전 또는 유전자 서열의 버전 또는 단백질의 버전이다.
본원에 사용된 용어 "HLA 유형"은 HLA 유전자 대립유전자의 상보체이다.
본원에 사용된 용어 "논센스-매개 붕괴" 또는 "NMD"는 미성숙 정지 코돈으로 인한 세포에 의한 mRNA의 분해이다.
본원에 사용된 용어 "절단 돌연변이"는 종양 발생 초기에 발생하고 종양 세포의 상당 부분에 존재하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "서브클론 돌연변이"는 종양 발생에서 후기에 발생하고 종양 세포의 하위세트에만 존재하는 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "엑솜"은 단백질을 코딩하는 게놈의 하위세트이다. 엑솜은 게놈의 집합적 엑손일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "로지스틱 회귀"는 종속 변수가 1일 확률의 로짓(logit)이 종속 변수의 선형 함수로 모델링되는 통계로부터의 이원 데이터에 대한 회귀 모델이다.
본원에 사용된 용어 "신경망"은 전형적으로 확률적 경사 하강법 및 역전파를 통해 훈련된 요소별 비선형이 뒤따르는 다층 선형 변환으로 구성된 분류 또는 회귀를 위한 기계 학습 모델이다.
본원에 사용된 용어 "프로테옴"은 세포, 세포 그룹 또는 개체에 의해 발현 및/또는 번역되는 모든 단백질 세트이다.
본원에 사용된 용어 "펩티돔"은 세포 표면 상에서 MHC-I 또는 MHC-II에 의해 제시되는 모든 펩티드 세트이다. 펩티돔은 세포 또는 세포 집합의 특성을 지칭할 수 있다(예를 들어, 종양을 이루는 모든 세포의 펩티돔 연합을 의미하는 종양 펩티돔, 또는 감염성 질환에 의해 감염될 모든 세포의 펩티돔 연합을 의미하는 감염성 질환 펩티돔).
본원에 사용된 용어 "ELISPOT"은 인간 및 동물에서 면역 반응을 모니터링하기 위한 일반적인 방법인 효소 결합 면역흡착 스팟 검정을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "덱스트라머"는 유세포 분석에서 항원 특이적 T 세포 염색에 사용되는 덱스트란 기반 펩티드-MHC 다량체이다.
본원에 사용된 용어 "관용성 또는 면역 관용성"은 하나 이상의 항원, 예를 들어 자가-항원에 대한 면역 비반응성 상태이다.
본원에 사용된 용어 "중추 관용성"은 자가 반응성 T 세포 클론을 삭제하거나 자가 반응성 T 세포 클론이 면역억제 조절 T 세포(Treg)로 분화하도록 촉진함으로써 가슴샘에서 영향을 받는 관용성이다.
본원에 사용된 용어 "말초 관용성"은 중추 관용성에서 살아남는 자가 반응성 T-세포를 하향조절 또는 무력화하거나 이러한 T 세포가 Treg로 분화하도록 촉진함으로써 말초에서 영향을 받는 관용성이다.
용어 "샘플"은 정맥 천자, 배설, 사정, 마사지, 생검, 바늘 흡인, 세척액 샘플, 긁기, 외과적 절개, 또는 중재를 포함하는 수단 또는 당분야에 알려진 다른 수단에 의해 대상체로부터 채취된, 단일 세포 또는 다중 세포 또는 세포의 단편 또는 체액의 분취물을 포함할 수 있다.
용어 "대상체"는 인간 또는 비인간, 생체내, 생체외 또는 시험관내, 남성 또는 여성 세포, 조직 또는 유기체를 포함한다. 용어 대상체는 인간을 포함하는 포유동물을 포함한다.
용어 "포유동물"은 인간 및 비인간을 모두 포괄하고 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 쥐, 소, 말 및 돼지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "임상적 요인"은 대상체의 병태, 예를 들어 질환 활성 또는 중증도의 척도를 지칭한다. "임상적 요인"은 비샘플 마커를 포함하는 대상체의 건강 상태의 모든 마커 및/또는 연령 및 성별과 같은 대상체의 다른 특성을 비제한적으로 포괄한다. 임상적 요인은 대상체 또는 결정된 조건 하의 대상체로부터의 샘플(또는 샘플 집단)의 평가에서 얻을 수 있는 점수, 값 또는 값 세트일 수 있다. 임상적 요인은 또한 유전자 발현 대리물과 같은 마커 및/또는 다른 매개변수에 의해 예측될 수 있다. 임상적 요인은 종양 유형, 종양 하위유형, 감염 유형, 감염 하위유형 및 흡연 이력을 포함할 수 있다.
용어 "종양으로부터 유래된 항원-암호화 핵산 서열"은 예를 들어 RT-PCR을 통해, 종양으로부터 얻은 핵산 서열; 또는 종양을 시퀀싱한 다음 예를 들어 당분야에 알려진 다양한 합성 또는 PCR 기반 방법을 통해 시퀀싱 데이터를 사용하여 핵산 서열을 합성함으로써 얻은 서열 데이터를 지칭한다. 유래된 서열은 종양으로부터 얻은 상응하는 천연 핵산 서열과 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는, 서열-최적화 핵산 서열 변이체(예를 들어, 코돈-최적화 및/또는 달리 발현을 위해 최적화됨)와 같은 핵산 서열 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "감염으로부터 유래된 항원-암호화 핵산 서열"은 예를 들어 RT-PCR을 통해, 감염된 세포 또는 감염성 질환 유기체로부터 얻은 핵산 서열; 또는 감염된 세포 또는 감염성 질환 유기체를 시퀀싱한 다음, 예를 들어 당분야에 알려진 다양한 합성 또는 PCR 기반 방법을 통해, 시퀀싱 데이터를 사용하여 핵산 서열을 합성함으로써 얻은 서열 데이터를 지칭한다. 유래된 서열은 상응하는 천연 감염성 질환 유기체 핵산 서열과 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는, 서열-최적화 핵산 서열 변이체(예를 들어, 코돈-최적화 및/또는 달리 발현을 위해 최적화됨)와 같은 핵산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 유래된 서열은 천연 감염성 질환 유기체 폴리펩티드 서열에 비해 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 돌연변이를 갖는 변형된 감염성 질환 유기체 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드 서열은 감염성 질환 유기체 단백질의 천연 폴리펩티드 서열에 비해 하나 이상의 미스센스 돌연변이를 가질 수 있다.
용어 "알파바이러스"는 토가비리대(Togaviridae)과의 구성원을 지칭하며 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 알파바이러스는 전형적으로 신드비스, 로스 리버, 마야로, 치쿤군야 및 셈리키 포레스트 바이러스와 같은 구세계 또는 동부 말 뇌염, 아우라, 포트 모건 또는 베네수엘라 말 뇌염 및 그 유도체 균주 TC-83과 같은 신세계로 분류된다. 알파바이러스는 전형적으로 자가 복제 RNA 바이러스이다.
용어 "알파바이러스 골격"은 바이러스 게놈의 자가 복제를 허용하는 알파바이러스의 최소 서열(들)을 지칭한다. 최소 서열은 비구조 단백질 매개 증폭을 위한 보존된 서열, 비구조 단백질 1(nsP1) 유전자, nsP2 유전자, nsP3 유전자, nsP4 유전자 및 폴리A 서열뿐만 아니라 서브게놈(예를 들어, 26S) 프로모터 요소를 포함하는 서브게놈 바이러스 RNA의 발현을 위한 서열을 포함할 수 있다.
용어 "비구조 단백질-매개 증폭을 위한 서열"은 당업자에게 잘 알려진 알파바이러스 보존된 서열 요소(CSE)를 포함한다. CSE는 알파바이러스 5' UTR, 51-nt CSE, 24-nt CSE, 서브게놈 프로모터 서열(예를 들어, 26S 서브게놈 프로모터 서열), 19-nt CSE 및 알파바이러스 3' UTR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "RNA 폴리머라제"는 DNA 주형으로부터 RNA 폴리뉴클레오티드의 생산을 촉매하는 폴리머라제를 포함한다. RNA 폴리머라제는 T3, T7 및 SP6을 포함하는 박테리오파지 유래 폴리머라제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "지질"은 소수성 및/또는 양친매성 분자를 포함한다. 지질은 양이온성, 음이온성 또는 중성일 수 있다. 지질은 합성 또는 천연 유래일 수 있으며, 일부 경우에 생분해성일 수 있다. 지질은 콜레스테롤, 인지질, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 접합체(PEG화 지질)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 지질 접합체, 왁스, 오일, 글리세리드, 지방 및 지용성 비타민을 포함할 수 있다. 지질은 또한 디리놀레일메틸-4-디메티틸아미노부티레이트(MC3) 및 MC3 유사 분자를 포함할 수 있다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 리포좀으로도 지칭되는 수성 내부를 둘러싸는 지질 함유 막을 사용하여 형성된 소포 유사 구조를 포함한다. 지질 나노입자는 계면활성제에 의해 안정화된 고체 지질 코어를 갖는 지질 기반 조성물을 포함한다. 코어 지질은 지방산, 아실글리세롤, 왁스 및 이들 계면활성제의 혼합물일 수 있다. 인지질,　스핑고미엘린,　담즙염(타우로콜산나트륨), 및　스테롤(콜레스테롤)과 같은 생물학적 막 지질은 안정제로 이용될 수 있다. 지질 나노입자는 정의된 비의 하나 이상의 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 정의된 비의 상이한 지질 분자를 사용하여 형성될 수 있다. 지질 나노입자는 외부 막 쉘 내에 분자를 캡슐화할 수 있고 이어서 표적 세포와 접촉되어 캡슐화된 분자를 숙주 세포 세포질로 전달할 수 있다. 지질 나노입자는 이의 표면을 포함하여 비지질 분자로 변형되거나 기능화될 수 있다. 지질 나노입자는 단일층(단층판) 또는 다층(다층판)일 수 있다. 지질 나노입자는 핵산과 복합체화될 수 있다. 단층판 지질 나노입자는 핵산과 복합체화될 수 있으며, 핵산은 수성 내부에 있다. 다층판 지질 나노입자는 핵산과 복합체화될 수 있으며, 핵산은 수성 내부에 있거나 이들 사이에 형성되거나 샌드위치된다.
약어: MHC: 주조직 적합성 복합체; HLA: 인간 백혈구 항원 또는 인간 MHC 유전자 유전자좌; NGS: 차세대 시퀀싱; PPV: 양성 예측값; TSNA: 종양 특이적 신생항원; FFPE: 포르말린 고정, 파라핀 포매; NMD: 논센스 매개 붕괴; NSCLC: 비소세포 폐암; DC: 수지상 세포.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 맥락상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것이 주지되어야 한다.
구체적으로 언급되거나 맥락상 달리 명백하지 않은 한, 본원에 사용된 용어 "약"은 당분야의 일반적인 오차 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내로 이해될 수 있다. 맥락상 달리 명확하지 않은 한, 본원에 제공된 모든 수치값은 용어 약으로 수식된다.
본원에 직접 정의되지 않은 임의의 용어는 본 발명의 기술 내에서 이해되는 바와 같이 이들과 일반적으로 관련된 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 특정 용어가 본 발명의 측면의 조성물, 장치, 방법 등 및 이들을 제조하거나 사용하는 방법을 설명함에 있어서 실무자에게 추가적인 안내를 제공하기 위해 본원에서 논의된다. 동일한 내용이 하나 초과의 방식으로 언급될 수 있음이 이해될 것이다. 결과적으로 본원에 논의된 용어 중 임의의 하나 이상에 대해 대안적 언어 및 동의어가 사용될 수 있다. 용어가 본원에 설명되거나 논의되는지 여부는 중요하지 않다. 일부 동의어 또는 치환 가능한 방법, 물질 등이 제공된다. 명시적으로 언급되지 않는 한, 하나 또는 몇 개의 동의어 또는 등가물에 대한 상술은 다른 동의어 또는 등가물의 사용을 배제하지 않다. 용어의 예를 포함하는 예의 사용은 단지 예시적 목적을 위한 것이며 본원에서 본 발명의 측면의 범위 및 의미를 제한하지 않는다.
본 명세서 본문 내에서 인용된 모든 참고문헌, 허여된 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
II. 항원 확인
종양 및 정상 엑솜 및 트랜스크립톰의 NGS 분석을 위한 연구 방법이 기재되었고 항원 확인 공간에서 적용되었다.6,14,15 임상 환경에서 항원 확인을 위한 더 큰 민감도 및 특이성을 위한 특정 최적화가 고려될 수 있다. 이러한 최적화는 실험실 과정과 관련된 영역과 NGS 데이터 분석과 관련된 영역의 2개 영역으로 그룹화될 수 있다. 기재된 연구 방법은 감염성 질환 유기체, 대상체에서의 감염 또는 대상체의 감염된 세포로부터의 항원 확인 또는 확인하기와 같은 다른 설정에서 항원의 확인에도 적용될 수 있다. 최적화의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 방법은 각각 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 특허 번호 10,055,540, US 출원 공개 번호 US20200010849A1, US 출원 번호 16/606,577, 및 국제 특허 출원 공개 WO2020181240A1, WO/2018/195357 및 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다.
항원(예를 들어, 종양 또는 감염성 질환 유기체로부터 유래된 항원)을 확인하는 방법은 세포 표면 상에 제시될 가능성이 있는(예를 들어, 종양 세포, 감염된 세포 또는 수지상 세포와 같은 전문 항원 제시 세포를 포함하는, 면역 세포 상의 MHC에 의해 제시됨) 및/또는 면역원성일 가능성이 있는 항원을 확인하는 단계를 포함한다. 한 예로서, 이러한 방법 중 하나는 종양, 감염된 세포 또는 감염성 질환 유기체로부터 엑솜, 트랜스크립톰 또는 전체 게놈 뉴클레오티드 시퀀싱 및/또는 발현 데이터 중 적어도 하나를 얻는 단계로서, 뉴클레오티드 시퀀싱 데이터 및/또는 발현 데이터는 각각의 항원 세트(예를 들어, 종양 또는 감염성 질환 유기체로부터 유래된 항원)의 펩티드 서열을 나타내는 데이터를 얻기 위해 사용되는, 단계; 각각의 항원의 펩티드 서열을 하나 이상의 제시 모델에 입력하여 각각의 항원이 대상체의 종양 세포 또는 감염된 세포와 같은 세포 표면 상의 하나 이상의 MHC 대립유전자에 의해 제시될 수치적 가능성 세트를 생성하는 단계로서, 수치적 가능성 세트는 적어도 수신된 질량 분광측정 데이터에 기반하여 확인되는, 단계; 및 수치적 가능성 세트에 기반하여 항원 세트의 하위세트를 선택하여 선택된 항원 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
II.B. 신생항원에서 종양 특이적 돌연변이의 확인
또한 특정 돌연변이(예를 들어, 암 세포에 존재하는 변이체 또는 대립유전자)의 확인 방법이 본원에 개시된다. 특히, 이들 돌연변이는 암을 갖는 대상체의 암 세포의 게놈, 트랜스크립톰, 프로테옴 또는 엑솜에 존재할 수 있지만 대상로부터의 정상 조직에는 존재할 수 없다.　종양에 특이적인 공유 신생항원을 포함하여 신생항원을 확인하기 위한 구체적 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 방법은 각각 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 특허 번호 10,055,540, US 출원 공개 번호 US20200010849A1, 및 국제 특허 출원 공개 WO/2018/195357 및 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다. 종양에 특이적인 공유 신생항원의 예는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 국제 특허 출원 공개 WO2019226941A1에 보다 상세히 기재되어 있다. 공유 신생항원은 KRAS 관련 돌연변이(예를 들어, KRAS G12C, KRAS G12V, KRAS G12D, 및/또는 KRAS Q61H 돌연변이)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, KRAS-관련 MHC 클래스 I 신생에피토프는 하기 예시적인 아미노산 서열을 참조하는 것과 같이 야생형(WT) 인간 KRAS를 참조하여 돌연변이를 포함할 수 있다: MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM.
종양의 유전적 돌연변이는 종양에서만 독점적으로 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 경우 종양의 면역학적 표적화에 유용한 것으로 간주될 수 있다. 유용한 돌연변이는 (1) 단백질에서 상이한 아미노산을 생성하는 비동의 돌연변이; (2) 정지 코돈이 변형되거나 결실되어 C-말단에서 새로운 종양 특이적 서열을 갖는 더 긴 단백질의 번역을 야기하는 판독-통과 돌연변이; (3) 성숙 mRNA에 인트론을 포함시켜 독특한 종양 특이적 단백질 서열을 만드는 스플라이스 부위 돌연변이; (4) 2개 단백질의 접합부에서 종양 특이적 서열을 갖는 키메라 단백질을 발생시키는 염색체 재배열(즉, 유전자 융합); (5) 새로운 종양 특이적 단백질 서열을 가진 새로운 개방 해독 프레임을 야기하는 프레임이동 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 돌연변이는 또한 하나 이상의 비-프레임이동 삽입결실, 미스센스 또는 논센스 치환, 스플라이스 부위 변경, 게놈 재배열 또는 유전자 융합, 또는 neoORF를 발생시키는 임의의 게놈 또는 발현 변경을 포함할 수 있다.
예를 들어, 종양 세포에서 스플라이스 부위, 프레임이동, 판독통과 또는 유전자 융합 돌연변이로부터 발생하는 돌연변이 또는 돌연변이된 폴리펩티드를 갖는 펩티드는 정상 세포 대비 종양에서 DNA, RNA 또는 단백질을 시퀀싱함으로써 확인될 수 있다.　
또한 돌연변이는 이전에 확인된 종양 특이적 돌연변이를 포함할 수 있다. 알려진 종양 돌연변이는 암에서의 체세포 돌연변이 카탈로그(Catalog of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC) 데이터베이스에서 찾을 수 있다.　
개체의 DNA 또는 RNA에서 특정 돌연변이 또는 대립유전자의 존재를 검출하기 위해 다양한 방법이 이용 가능하다. 이 분야의 발전은 정확하고 쉬우며 저렴한 대규모 SNP 유전형분석을 제공하였다. 예를 들어 동적 대립유전자 특이적 혼성화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동(MADGE), 파이로시퀀싱, 올리고뉴클레오티드 특이적 결찰, TaqMan 시스템뿐만 아니라 Affymetrix SNP 칩과 같은 다양한 DNA "칩" 기술을 포함한 여러 기술이 기재되었다. 이들 방법은 전형적으로 PCR에 의한, 표적 유전자 영역의 증폭을 이용한다. 또 다른 방법은 침습적 절단에 의한 작은 신호 분자의 생성에 이어 질량 분광측정 또는 고정화된 패드락 탐침 및 롤링 서클 증폭에 기반한다. 특정 돌연변이를 검출하기 위한 당분야에 알려진 몇몇 방법이 아래에 요약되어 있다.
PCR 기반 검출 수단은 복수의 마커의 동시 다중 증폭을 포함할 수 있다. 예를 들어, 크기가 중첩되지 않고 동시에 분석될 수 있는 PCR 산물을 생성하기 위해 PCR 프라이머를 선택하는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 차별적으로 표지되어 각각 차별적으로 검출될 수 있는 프라이머로 상이한 마커를 증폭하는 것이 가능하다. 물론 혼성화 기반 검출 수단은 샘플에서 여러 PCR 산물의 차별적 검출을 허용한다. 복수의 마커의 다중 분석을 허용하는 다른 기술이 당분야에 알려져 있다.
게놈 DNA 또는 세포 RNA에서 단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 용이하게 하기 위해 몇몇 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌(Mundy, C. R. (U.S. 특허 번호 4,656,127))에 개시된 바와 같이, 특화된 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드를 사용하여 단일 염기 다형성이 검출될 수 있다. 이 방법에 따르면, 다형성 부위의 바로 3'에 있는 대립유전자 서열과 상보적인 프라이머가 특정 동물 또는 인간으로부터 얻은 표적 분자와 혼성화하는 것이 허용된다. 표적 분자 상의 다형성 부위가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드 유도체와 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 그 유도체는 혼성화된 프라이머의 말단 상으로 혼입될 것이다. 이러한 혼입은 프라이머가 엑소뉴클레아제에 내성이도록 하여 그 검출을 허용한다. 샘플의 엑소뉴클레아제 내성 유도체의 정체가 알려져 있으므로, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 내성이 있다는 발견은 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드(들)가 반응에서 사용된 뉴클레오티드 유도체의 다형성 부위와 상보적임을 드러낸다. 이 방법은 많은 양의 외부 서열 데이터를 결정할 필요가 없다는 장점을 갖는다.
용액 기반 방법은 다형성 부위의 뉴클레오티드의 정체를 결정하기 위해 사용될 수 있다(Cohen, D. et al. (프랑스 특허 2,650,840; PCT 출원 번호 WO91/02087)). U.S. 특허 번호 4,656,127의 Mundy 방법에서와 같이, 다형성 부위의 바로 3'에 있는 대립유전자 서열과 상보적인 프라이머가 사용된다. 이 방법은 다형성 부위의 뉴클레오티드와 상보적인 경우 프라이머의 말단 상으로 혼입될, 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 그 부위의 뉴클레오티드의 정체를 결정한다.　
유전자 비트 분석(Genetic Bit Analysis) 또는 GBA로 알려진 대안적 방법이 문헌(Goelet, P. et al. (PCT 출원 번호 92/15712))에 기재되어 있다. Goelet, P. 등의 방법은 표지된 종결인자와 다형성 부위의 3' 서열과 상보적인 프라이머의 혼합물을 사용한다. 따라서 혼입되는 표지된 종결인자는 평가되는 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 의해 결정되고 이와 상보적이다. 문헌(Cohen et al. (프랑스 특허 2,650,840; PCT 출원 번호 WO91/02087))의 방법과는 대조적으로, Goelet, P. 등의 방법은 프라이머 또는 표적 분자가 고상에 고정화되는, 이종 상 검정일 수 있다.　
DNA에서 다형성 부위를 검정하기 위한 몇몇 프라이머-안내 뉴클레오티드 혼입 절차가 기재되었다(Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). 이러한 방법은 다형성 부위에서 염기를 구별하기 위해 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입을 이용한다는 점에서 GBA와 상이하다. 이러한 형식에서, 신호는 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하므로 동일한 뉴클레오티드의 진행에서 발생하는 다형성은 진행의 길이에 비례하는 신호를 초래할 수 있다(Syvanen, A.-C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).　
많은 이니셔티브가 병렬로 수백만 개의 개별 DNA 또는 RNA 분자로부터 직접 서열 정보를 얻는다. 합성에 의한 실시간 단일 분자 시퀀싱 기술은 시퀀싱되는 주형과 상보적인 신생 DNA 가닥에 혼입되는 형광 뉴클레오티드의 검출에 의존한다. 한 방법에서, 30-50개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드가 5' 말단에서 유리 커버 슬립에 공유 부착된다. 이 부착된 가닥은 두 가지 기능을 수행한다. 첫째, 이들은 주형이 표면 결합 올리고뉴클레오티드와 상보적인 포획 꼬리로 구성된 경우 표적 주형 가닥에 대한 포획 부위로 역할한다. 이들은 또한 서열 판독의 기초를 형성하는 주형 유도 프라이머 연장을 위한 프라이머로 역할한다. 포획 프라이머는 염료를 제거하기 위해 염료-링커의 여러 주기의 합성, 검출 및 화학적 절단을 사용하여 서열 결정을 위한 고정된 위치 부위로 기능한다. 각각의 주기는 폴리머라제/표지된 뉴클레오티드 혼합물 첨가, 헹굼, 이미지화 및 염료 절단을 포함한다. 대안적인 방법에서, 폴리머라제는 형광 공여체 분자로 변형되고 유리 슬라이드 상에 고정화되는 반면, 각각의 뉴클레오티드는 감마-포스페이트에 부착된 수신체 형광 모이어티로 색상 코드화된다. 이 시스템은 뉴클레오티드가 새로운 사슬에 혼입됨에 따라 형광 태그화 폴리머라제와 형광 변형된 뉴클레오티드 사이의 상호작용을 검출한다. 다른 합성에 의한 시퀀싱 기술도 존재한다.　
임의의 적합한 합성에 의한 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 돌연변이를 확인할 수 있다. 상술된 바와 같이, 4개의 주요한 합성에 의한 시퀀싱 플랫폼: Roche/454 Life Sciences의 Genome Sequencers, Illumina/Solexa의 1G Analyzer, Applied BioSystems의 SOLiD 시스템, 및 Helicos Biosciences의 Heliscope가 현재 이용 가능하다. 합성에 의한 시퀀싱 플랫폼은 또한 Pacific BioSciences 및 VisiGen Biotechnologies에 의해 기재되었다. 일부 구현예에서, 시퀀싱되는 복수의 핵산 분자는 지지체(예를 들어, 고체 지지체)에 결합된다. 지지체 상에 핵산을 고정화하기 위해 포획 서열/범용 프라이밍 부위가 주형의 3' 및/또는 5' 말단에 부가될 수 있다. 핵산은 포획 서열을 지지체에 공유 부착된 상보적 서열에 혼성화함으로써 지지체에 결합될 수 있다. 포획 서열(범용 포획 서열로도 지칭됨)은 범용 프라이머로서 이중으로 역할할 수 있는 지지체에 부착된 서열과 상보적인 핵산 서열이다.　
포획 서열에 대한 대안으로서, 커플링 쌍(예를 들어, 항체/항원, 수용체/리간드, 또는 예를 들어 미국 특허 출원 번호 2006/0252077에 기재된 바와 같은 아비딘-비오틴 쌍)의 구성원이 커플링 쌍의 각각의 제2 구성원으로 코팅된 표면 상에 포획될 각각의 단편에 결합될 수 있다.　
포획 후, 서열은 예를 들어 합성에 의한 주형 의존 시퀀싱을 포함하는 실시예 및 U.S. 특허 번호 7,283,337에 기재된 바와 같이, 예를 들어 단일 분자 검출/시퀀싱에 의해 분석될 수 있다. 합성에 의한 시퀀싱에서, 표면 결합 분자는 폴리머라제의 존재 하에 복수의 표지된 뉴클레오티드 트리포스페이트에 노출된다. 주형의 서열은 성장 사슬의 3' 말단에 혼입된 표지된 뉴클레오티드의 순서에 의해 결정된다. 이는 실시간으로 수행될 수 있거나 단계-반복 모드로 수행될 수 있다. 실시간 분석을 위해 각각의 뉴클레오티드에 대해 상이한 광학 표지가 혼입될 수 있으며 혼입된 뉴클레오티드의 자극을 위해 다중 레이저가 이용될 수 있다.　
시퀀싱은 다른 대량 병렬 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱(NGS) 기술 및 플랫폼도 포함할 수 있다. 대량 병렬 시퀀싱 기술 및 플랫폼의 추가 예는 Illumina HiSeq 또는 MiSeq, Thermo PGM 또는 Proton, Pac Bio RS II 또는 Sequel, Qiagen의 Gene Reader, 및 Oxford Nanopore MinION이다. 추가적인 유사한 현재의 대량 병렬 시퀀싱 기술뿐만 아니라 이러한 기술의 미래 세대가 사용될 수 있다.
임의의 세포 유형 또는 조직이 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 핵산 샘플을 얻기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 샘플은 종양 또는 체액, 예를 들어 알려진 기술(예를 들어, 정맥천자)에 의해 얻은 혈액 또는 타액으로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 핵산 시험이 건조한 샘플(예를 들어, 모발 또는 피부) 상에서 수행될 수 있다. 또한, 종양으로부터 시퀀싱을 위한 샘플을 얻을 수 있고 정상 조직이 종양과 동일한 조직 유형인 시퀀싱을 위한 정상 조직으로부터 또 다른 샘플을 얻을 수 있다. 종양으로부터 시퀀싱을 위한 샘플을 얻을 수 있고 정상 조직이 종양에 비해 별개의 조직 유형인 시퀀싱을 위한 정상 조직으로부터 또 다른 샘플을 얻을 수 있다.
종양은 폐암, 흑색종, 유방암, 난소암, 전립샘암, 신장암, 위암, 결장암, 정소암, 두경부암, 췌장암, 뇌암, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 T 세포 림프구성 백혈병, 비소세포 폐암 및 소세포 폐암 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
대안적으로 단백질 질량 분광측정이 종양 세포 상에서 MHC 단백질에 결합된 돌연변이된 펩티드의 존재를 확인하거나 검증하기 위해 사용될 수 있다. 펩티드는 종양 세포 또는 종양으로부터 면역침전된 HLA 분자로부터 산-용출에 이어 질량 분광측정을 사용하여 확인될 수 있다.　
III. 면역 조절제
본원에 기재된 ChAdV 벡터 또는 본원에 기재된 알파바이러스 벡터와 같은 본원에 기재된 벡터는 적어도 하나의 항원을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있고, 동일하거나 별개의 벡터는 적어도 하나의 면역 조절제를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 면역 조절제는 면역 체크포인트 분자에 결합하여 그 활성을 차단하는 결합 분자(예를 들어, scFv와 같은 항체)를 포함할 수 있다. 면역 조절제는 IL-2, IL-7, IL-12(IL-12 p35, p40, p70 및/또는 p70-융합 작제물 포함), IL-15 또는 IL-21과 같은 사이토카인을 포함할 수 있다. 면역 조절제는 변형된 사이토카인(예를 들어, pegIL-2)을 포함할 수 있다. 벡터는 항원 카세트 및 면역 조절제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
차단 또는 억제를 위해 표적화될 수 있는 예시적인 면역 체크포인트 분자는 CTLA-4, 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4(CD2 패밀리 분자에 속하며 모든 NK, γδ 및 기억 CD8+(αβ) T 세포 상에서 발현됨), CD160(BY55로도 지칭됨) 및 CGEN-15049를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160 및 CGEN-15049 중 하나 이상에 결합하여 이의 활성을 차단하거나 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다른 결합 단백질을 포함한다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 트레멜리무맙(CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체(항-B7-H1; MEDI4736), 이필리무맙, MK-3475(PD-1 차단제), 니볼루맙(항-PD1 항체), CT-011(항-PD1 항체), BY55 모노클로날 항체, AMP224(항-PDL1 항체), BMS-936559(항-PDL1 항체), MPLDL3280A(항-PDL1 항체), MSB0010718C(항-PDL1 항체) 및 Yervoy/이필리무맙(항-CTLA-4 체크포인트 억제제)을 포함한다. 항체-암호화 서열은 당분야의 일상적 기술을 사용하여 C68과 같은 벡터로 조작될 수 있다. 예시적인 방법은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Fang et al., Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide. Nat Biotechnol.　2005 May;23(5):584-90. Epub 2005 Apr 17)에 기재되어 있다.　
IV. 페이로드 및 항원
페이로드 핵산 서열은 관심 세포로 전달되기 원하는 임의의 핵산 서열일 수 있다. 일반적으로 페이로드는 핵산 서열의 발현을 구동하기 위해 프로모터에 연결된 핵산 서열이다. 페이로드 핵산 서열은 폴리펩티드(즉, 전사되고 단백질로 번역될 수 있는 핵산 서열)를 암호화할 수 있다. 일반적으로, 펩티드를 암호화하는 페이로드 핵산 서열은 세포에서 발현되기 원하는 임의의 단백질을 암호화할 수 있다. 단백질의 예는 항원(예를 들어, MHC 클래스 I 에피토프, MHC 클래스 II 에피토프, 또는 B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프), 항체, 사이토카인, 키메라 항원 수용체(CAR), T-세포 수용체, 또는 게놈 편집 시스템 성분(예를 들어, 게놈 편집 시스템에서 사용되는 뉴클레아제)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 게놈 편집 시스템은 CRISPR 시스템, 징크 핑거 시스템, 메가뉴클레아제 시스템 또는 TALEN 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 페이로드 핵산 서열은 비코딩일 수 있다(즉, 전사될 수 있지만 단백질로 번역되지 않는 핵산 서열). 일반적으로, 비코딩 페이로드 핵산 서열은 세포에서 발현되기 원하는 임의의 비코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 비코딩 폴리뉴클레오티드의 예는 RNA 간섭(RNAi) 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, siRNA, miRNA 등) 또는 게놈 편집 시스템 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA[gRNA], 단일 가이드 RNA[sgRNA], 트랜스 활성화 CRISPR[tracrRNA] 및/또는 CRISPR RNA[crRNA])을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 페이로드 핵산 서열은 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)의 별개의 폴리펩티드(예를 들어, 서로 연결된 2개 이상의 별개의 에피토프 서열)를 암호화하거나 2개 이상의 별개의 비코딩 핵산 서열(예를 들어, 2개 이상의 별개의 RNAi 폴리뉴클레오티드)을 함유할 수 있다. 페이로드 핵산 서열은 폴리펩티드 암호화 핵산 서열과 비코딩 핵산 서열의 조합을 가질 수 있다.
벡터는 1 내지 30개의 페이로드-암호화 핵산 서열, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 상이한 페이로드-암호화 핵산 서열, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 또는 14개의 상이한 페이로드-암호화 핵산 서열, 또는 12, 13 또는 14개의 상이한 페이로드-암호화 핵산 서열을 함유할 수 있다. 페이로드-암호화 핵산 서열은 "카세트"의 페이로드 암호화 부분을 지칭할 수 있다. 카세트의 특징이 본원에 보다 상세히 기재된다. 카세트는 카세트에서 함께 연결된 2개 이상의 페이로드-암호화 핵산 서열을 함유할 수 있다(예를 들어, 예시적인 비제한적 예로서, 연결된 T 세포 에피토프를 암호화하는 연결된 항원-암호화 핵산 서열).
벡터는 1 내지 30개의 별개의 페이로드-암호화 핵산 서열, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 별개의 페이로드-암호화 핵산 서열, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 또는 14개의 별개의 페이로드-암호화 핵산 서열, 또는 12, 13 또는 14개의 별개의 페이로드-암호화 핵산 서열을 함유할 수 있다. 페이로드-암호화 핵산 서열은 개별 페이로드 서열에 대한 서열, 예를 들어 예시적인 비제한적 예로서 카세트에서 함께 연결된 2개 이상의 페이로드-암호화 핵산 서열의 각각의 연결된 T 세포 에피토프를 지칭할 수 있다.
항원은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 폴리펩티드 서열을 암호화하는 RNA 서열일 수 있다. 따라서 백신에서 유용한 항원은 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 암 백신을 위해 사용될 수 있는 항원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 국제 특허 출원 공개 WO/2019/226941에 기재되어 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 확인된 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 단리된 펩티드, 알려진 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 펩티드, 및 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 돌연변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편이 본원에 개시된다. 신생항원 펩티드는 신생항원이 관련된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하는 경우 이의 코딩 서열의 맥락에서 기재될 수 있다.
또한 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 변경된 발현을 갖는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드, 예를 들어 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 비정상적으로 발현되는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드로부터 유래된 펩티드가 본원에 개시된다. 항원성 펩티드가 유래될 수 있는 적합한 폴리펩티드는 예를 들어 COSMIC 데이터베이스에서 찾을 수 있다. COSMIC은 인간 암의 체세포 돌연변이에 대한 포괄적인 정보를 큐레이션한다. 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 함유한다. 종양 항원(예를 들어, 공유된 종양 항원 및 종양 신생항원)은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 출원 번호 17/058,128에 기재된 것들을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 항원 펩티드는 항원이 관련된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하는 경우 이의 코딩 서열의 맥락에서 기재될 수 있다.
항원 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드는 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 1000 nM 미만의 IC50 값을 갖는 MHC와의 결합 친화도, MHC 클래스 I 펩티드의 경우 8-15, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 길이, 프로테아좀 절단을 촉진하는 펩티드 내 또는 근처의 서열 모티프의 존재, 및 TAP 수송을 촉진하는 서열 모티프의 존재. MHC 클래스 II 펩티드의 경우 6-30, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 길이, 세포외 또는 리소좀 프로테아제(예를 들어, 카텝신)에 의한 절단을 촉진하는 펩티드 내 또는 근처의 서열 모티프의 존재 또는 HLA-DM 촉매화된 HLA 결합.
하나 이상의 항원이 종양 표면 상에 제시될 수 있다.
하나 이상의 항원은 종양을 갖는 대상체에서 면역원성일 수 있다, 예를 들어 대상체에서 T 세포 반응 또는 B 세포 반응을 촉발할 수 있다.
대상체에서 자가면역 반응을 유도하는 하나 이상의 항원은 종양을 갖는 대상체에 대한 백신 생성과 관련하여 고려에서 제외될 수 있다.
적어도 하나의 항원성 펩티드 분자의 크기는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120개 이상의 아미노 분자 잔기, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서 항원성 펩티드 분자는 50개 아미노산 이하이다.　
항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 MHC 클래스 I의 경우 15개 잔기 이하의 길이이고 일반적으로 약 8개 내지 약 11개의 잔기, 특히 9개 또는 10개의 잔기로 구성될 수 있고; MHC 클래스 II의 경우, 6-30개의 잔기(경계 포함)로 구성될 수 있다.　
항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 HLA 단백질 상에 제시될 수 있다. 일부 측면에서 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 야생형 펩티드보다 더 큰 친화도로 HLA 단백질 상에 제시된다. 일부 측면에서, 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 5000 nM 미만, 적어도 1000 nM 미만, 적어도 500 nM 미만, 적어도 250 nM 미만, 적어도 200 nM 미만, 적어도 150 nM 미만, 적어도 100 nM 미만, 적어도 50 nM 미만 이하의 IC50을 가질 수 있다.　
일부 측면에서, 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 대상체에 투여될 때 자가면역 반응을 유도하지 않고/않거나 면역학적 관용성을 불러일으키지 않는다.　
또한 적어도 2개 이상의 항원성 펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서 조성물은 적어도 2개의 별개의 펩티드를 함유한다. 적어도 2개의 별개의 펩티드는 동일한 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 별개의 폴리펩티드란 펩티드가 길이, 아미노산 서열 또는 둘 모두에 의해 다양함을 의미한다. 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 함유하는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드로부터 유래되거나, 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 발현이 변경된 것으로 알려지거나 발견된 임의의 폴리펩티드, 예를 들어, 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 비정상적으로 발현되는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드로부터 유래되었다. 항원성 펩티드가 유래될 수 있는 적합한 폴리펩티드는 예를 들어 COSMIC 데이터베이스 또는 AACR 게노믹스 증거 신생물 정보 교환(Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange, GENIE) 데이터베이스에서 찾을 수 있다. COSMIC은 인간 암의 체세포 돌연변이에 대한 포괄적인 정보를 큐레이션한다. AACR GENIE는 임상 등급 암 게노믹 데이터를 수만 명의 암 환자의 임상 결과와 집계하고 연결한다. 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 함유한다. 일부 측면에서 종양 특이적 돌연변이는 특정 암 유형에 대한 동인 돌연변이이다.
또한 감염성 질환 유기체, 대상체의 감염 또는 대상체의 감염된 세포와 관련된 임의의 폴리펩티드로부터 유래된 펩티드가 본원에 개시된다. 항원은 감염성 질환 유기체의 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열로부터 유래될 수 있다. 감염성 질환 유기체의 폴리펩티드 서열은 병원체 유래 펩티드, 바이러스 유래 펩티드, 박테리아 유래 펩티드, 진균 유래 펩티드 및/또는 기생충 유래 펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 감염성 질환 유기체는 중증 급성 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스(SARS), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2), 에볼라, HIV, B형 간염 바이러스(HBV), 인플루엔자, C형 간염 바이러스(HCV), 인유두종바이러스(HPV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 치쿤군야 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 뎅기 바이러스, 오르티믹소비리대 과 바이러스 및 결핵을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 방법에 의해 확인된 감염성 질환 유기체 특이적 항원 또는 에피토프를 포함하는 단리된 펩티드, 알려진 감염성 질환 유기체 특이적 항원 또는 에피토프를 포함하는 펩티드, 및 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 돌연변이체 폴리펩티드 또는 이의 단편이 본원에 개시된다. 항원 펩티드는 항원이 관련된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하는 경우 이의 코딩 서열의 맥락에서 기재될 수 있다.
벡터 및 관련 조성물은 유기체 또는 그 부산물과 관련된 감염 또는 다른 유해 반응을 방지 및/또는 치료하기 위해, 이의 독소 또는 다른 부산물을 포함하는 임의의 유기체로부터의 항원을 전달하기 위해 사용될 수 있다.
백신에 혼입될 수 있는(예를 들어, 카세트에서 암호화되는) 항원은 인간 및 비인간 척추동물을 감염시키는 병원성 바이러스와 같은 바이러스에 대해 인간 또는 비인간 동물을 면역화하는 데 유용한 면역원을 포함한다. 항원은 다양한 바이러스 과로부터 선택될 수 있다. 이에 대한 면역 반응이 요망될 원하는 바이러스 과의 예는 일반 감기 사례의 약 50%에 관여하는 리노바이러스 속을 포함하는 피코나바이러스 과; 폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스 및 A형 간염 바이러스와 같은 인간 엔테로바이러스를 포함하는 엔테로바이러스 속; 주로 비인간 동물에서 구제역에 관여하는 아프토바이러스 속을 포함한다. 바이러스의 피코나바이러스 과 내에서 표적 항원은 VP1, VP2, VP3, VP4 및 VPG를 포함한다. 또 다른 바이러스 과는 칼시바이러스 과를 포함하며, 이는 유행성 위장염의 중요한 원인 제제인 바이러스의 노르워크(Norwalk) 그룹을 포괄한다. 인간 및 비인간 동물에서 면역 반응을 자극하기 위해 항원을 표적화하는 데 사용하기 위해 요망되는 또 다른 바이러스 과는 신드비스 바이러스, 로스리버 바이러스 및 베네수엘라, 동부 및 서부 말 뇌염, 및 풍진 바이러스를 포함하는 루비 바이러스를 포함하는 알파바이러스 속을 포함하는 토가바이러스 과이다. 플라비비리대 과는 뎅기열, 황열병, 일본 뇌염, 세인트루이스 뇌염 및 진드기 매개 뇌염 바이러스를 포함한다. 다른 표적 항원은 C형 간염 또는 코로나바이러스 과에서 생성될 수 있으며, 이는 감염성 기관지염 바이러스(가금류), 돼지 전염성 위장병 바이러스(돼지), 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(돼지), 고양이 전염성 복막염 바이러스(고양이), 고양이 장 코로나바이러스(고양이), 개 코로나바이러스(개)와 같은 여러 비인간 바이러스 및 일반 감기 및/또는 비 A형, B형 또는 C형 간염을 유발할 수 있는 인간 호흡기 코로나바이러스를 포함한다. 코로나바이러스 과 내에서 표적 항원은 E1(M 또는 매트릭스 단백질이라고도 함), E2(S 또는 스파이크 단백질이라고도 함), E3(HE 또는 헤마글루틴-엘테로스라고도 함) 당단백질(모든 코로나바이러스에 존재하지는 않음) 또는 N(뉴클레오캡시드)을 포함한다. 또 다른 항원은 베시쿨로바이러스 속(예를 들어, 소수포 구내염 바이러스) 및 일반적인 리싸바이러스(예를 들어, 광견병)를 포함하는 랍도바이러스 과에 대해 표적화될 수 있다. 랍도바이러스 과 내에서 적합한 항원은 G 단백질 또는 N 단백질로부터 유래될 수 있다. 마르부르그 및 에볼라 바이러스와 같은 출혈열 바이러스를 포함하는 필로비리대 과는 적합한 항원 공급원일 수 있다. 파라믹소바이러스 과는 파라인플루엔자 바이러스 1형, 파라인플루엔자 바이러스 3형, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형, 루불라바이러스(볼거리 바이러스), 파라인플루엔자 바이러스 2형, 파라인플루엔자 바이러스 4형, 뉴캐슬병 바이러스(닭), 우역, 홍역 및 개 홍역을 포함하는 모빌리바이러스, 및 호흡기 융합 바이러스를 포함하는 뉴모바이러스를 포함한다(예를 들어, 당(G) 단백질 및 융합(F) 단백질, 이에 대한 서열은 GenBank로부터 이용 가능함). 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스 과 내로 분류되며 항원(예를 들어, HA 단백질, N1 단백질)의 적절한 공급원일 수 있다. 분야바이러스 과는 분야바이러스 속(캘리포니아 뇌염, 라크로스(La Crosse)), 플레보바이러스 속(리프트 밸리열), 한타바이러스 속(퓨레말라는 헤마긴열 바이러스임), 나이로바이러스 속(나이로비 양병) 및 다양한 할당되지 않은 분가바이러스 속을 포함한다. 아레나바이러스 과는 LCM 및 라싸열병 바이러스에 대한 항원 공급원을 제공한다. 레오바이러스 과는 레오바이러스 속, 로타바이러스 속(소아에서 급성 위장염을 유발함), 오르비바이러스 속 및 컬티바이러스 속(콜로라도 진드기열, 레봄보(인간), 말 뇌증, 푸른 혀)을 포함한다. 레트로바이러스 과는 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII, 렌티비리날(인간 면역결핍 바이러스(HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스 및 스푸마비리날을 포함함)과 같은 인간 및 수의학 질환을 포괄하는 온코비리날 아과를 포함한다. 렌티바이러스 중에서 많은 적합한 항원이 기재되어 있으며 쉽게 선택될 수 있다. 적합한 HIV 및 SIV 항원의 예는 비제한적으로 gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef 및 Rev 단백질뿐만 아니라 이의 다양한 단편을 포함한다. 예를 들어, Env 단백질의 적합한 단편은 gp120, gp160, gp41 또는 이의 더 작은 단편, 예를 들어 적어도 약 8개의 아미노산 길이와 같은 임의의 서브유닛을 포함할 수 있다. 유사하게, tat 단백질의 단편이 선택될 수 있다[U.S. 특허 번호 5,891,994 및 U.S. 특허 번호 6,193,981 참고]. 또한 HIV 및 SIV 단백질은 문헌(D. H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (March 2001), 및 R. R. Amara, et al,　Science,　292:69-74 (6 Apr. 2001))에 기재되어 있다. 또 다른 예에서, HIV 및/또는 SIV 면역원성 단백질 또는 펩티드는 융합 단백질 또는 다른 면역원성 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 2001년 8월 2일에 공개된 WO 01/54719 및 1999년 4월 8일에 공개된 WO 99/16884에 기재된 HIV-1 Tat 및/또는 Nef 융합 단백질 및 면역화 요법을 참고한다. 본 발명은 본원에 기재된 HIV 및/또는 SIV 면역원성 단백질 또는 펩티드로 제한되지 않는다. 또한, 이들 단백질에 대한 다양한 변형이 기재되었거나 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,972,596에 기재된 변형된 gag 단백질을 참고한다. 또한, 임의의 요망되는 HIV 및/또는 SIV 면역원은 단독으로 또는 조합으로 전달될 수 있다. 이러한 조합은 단일 벡터 또는 다중 벡터로부터의 발현을 포함할 수 있다. 파포바바이러스 과는 폴리오마바이러스 아과(BKU 및 JCU 바이러스) 및 유두종바이러스 아과(암 또는 유두종의 악성 진행과 관련됨)를 포함한다. 아데노바이러스 과는 호흡기 질환 및/또는 장염을 유발하는 바이러스(EX, AD7, ARD, OB)를 포함한다. 파보바이러스 과 고양이 파보바이러스(고양이 장염), 고양이 범백혈구감소증바이러스, 개 파보바이러스 및 돼지 파보바이러스. 헤르페스바이러스 과는 심플렉스바이러스 속(HSVI, HSVII), 바리셀로바이러스 속(위광견병, 바리셀라 조스터(varicella zoster))을 포괄하는 알파헤르페스비리내 아과 및 사이토메갈로바이러스 속(인간 CMV), 무로메갈로바이러스 속을 포함하는 베타헤르페스비리내 아과, 그리고 림포크립토바이러스 속, EBV 속(버키트 림프종), 감염성 비기관염 바이러스 속, 마렉병 바이러스 속 및 라디노바이러스 속을 포함하는 감마헤르페스바이러스 아과를 포함한다. 폭스바이러스 과는 오르토폭스바이러스 속(바리올라(천연두) 및 백시니아(우두)), 파라폭스바이러스 속, 아비폭스바이러스 속, 카프리폭스바이러스 속, 레포리폭스바이러스 속, 수이폭스바이러스 속을 포괄하는 코르도폭시이리내 아과 및 엔토모폭시이리내 아과를 포함한다. 헤파드나바이러스 과는 B형 간염 바이러스를 포함한다. 적합한 항원 공급원일 수 있는 분류되지 않은 바이러스 중 하나는 간염 델타 바이러스이다. 또 다른 바이러스 공급원은 조류 감염성 윤활낭병 바이러스 및 돼지 호흡기 및 생식 증후군 바이러스를 포함할 수 있다. 알파바이러스 과는 말 동맥염 바이러스와 다양한 뇌염 바이러스를 포함한다.
백신에 혼입될 수 있는(예를 들어, 카세트에서 암호화되는) 항원은 또한 인간 및 비인간 척추동물을 감염시키는 박테리아, 진균, 기생 미생물 또는 다세포 기생충을 포함하는 병원체에 대해 인간 또는 비인간 동물을 면역화하는 데 유용한 면역원을 포함한다. 박테리아 병원체의 예는 폐렴구균; 포도상구균; 및 연쇄상 구균을 포함하는 병원성 그람 양성 구균을 포함한다. 병원성 그람 음성 구균은 수막구균; 임균을 포함한다. 병원성 장 그람 음성 간균은 엔테로박테리아세애(enterobacteriaceae);　슈도모나스(pseudomonas), 아시네토박테리아 및 에이케넬라(eikenella); 멜리오이도시스(melioidosis);　살모넬라(salmonella); 시겔라(shigella); 해모필러스(haemophilus)(해모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae), 해모필러스 솜누스(Haemophilus somnus));　모락셀라(moraxella); 및 H. 두크레이이(ducreyi)(무른궤양을 유발함); 브루셀라(brucella); 프라니셀라 툴라렌시스(Franisella tularensis)(야생토끼병을 유발함);　예르시니아(yersinia)(파스퇴렐라(pasteurella)); 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(streptobacillus moniliformis) 및 스피릴룸(spirillum)을 포함한다. 그람-양성 간균은 리스테리아 모노사이토게네스(listeria monocytogenes); 에리시펠로트릭스 루시오파티애(erysipelothrix rhusiopathiae); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(디프테리아); 콜레라; B. 안트라시스(anthracis)(탄저병); 도너반증(그라눌로마 인귀날레(granuloma inguinale)); 및 바르토넬라증을 포함한다. 병원성 혐기성 박테리아에 의해 유발되는 질환은 파상풍; 보툴리누스 중독; 기타 클로스트리디아; 결핵; 나병; 및 기타 미코박테리아를 포함한다. 특정 박테리아 종의 예는 비제한적으로, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노레애(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 치타시(Chlamydia psittaci), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레래수이스(Salmonella choleraesuis), 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 시겔라, 비브리오 콜레래(Vibrio cholerae), 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare) 복합체, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 파스퇴렐라 해모라이티카(Pasteurella haemolytica), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 액티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 미코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)이다. 병원성 스피로케타병은 매독; 트레포네마증: 요스, 핀타 및 풍토병 매독; 및 렙토스피라증을 포함한다. 고병원성 박테리아 및 병원성 진균에 의해 유발되는 다른 감염은 방선균증; 노카르디아증; 크립토코커스증(크립토코커스(Cryptococcus)), 분아균증(블라스토마이세스(Blastomyces)), 히스토플라즈마증(히스토플라즈마(Histoplasma)) 및 콕시디오이드진균증(콕시디오데스(Coccidiodes)); 칸디다증(칸디다(Candida)), 아스페르길루스증(아스페르길리스(Aspergillis)), 및 모균증; 스포로트릭스증; 파라콕시디오이데스 진균증, 피부심재성진균증, 토룰롭시스증, 진균종 및 색소진균증; 및 피부사상균증을 포함한다. 리케차 감염은 티푸스열, 로키산 홍반열, Q열 및 리케차두창을 포함한다. 미코플라즈마 및 클라미디아 감염의 예는 미코플라즈마 뉴모니애(mycoplasma pneumoniae); 성병 림프육아종; 앵무새병; 및 주산기 클라미디아 감염을 포함한다. 병원성 진핵생물은 병원성 원생동물 및 연충을 포함하고 이에 의해 생성된 감염은 아메바증; 말라리아; 리슈만편모충증(예를 들어, 리슈마니아 메이저(Leishmania major)에 의해 유발됨); 트리파노소마증; 톡소플라즈마증(예를 들어, 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii)에 의해 유발됨); 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii); 트리칸스(Trichans); 톡소플라즈마 곤디이; 바베시아증; 지아르디아증(예를 들어, 지아르디아(Giardia)에 의해 유발됨); 선모충증(예를 들어, 트리코모나스(Trichomonas)에 의해 유발됨); 사상충증; 주혈흡충증(예를 들어, 주혈흡충(Schistosoma)에 의해 유발됨); 선충; 흡충류 또는 흡충; 및 세스토데(촌충) 감염을 포함한다. 다른 기생충 감염은 특히 아스카리스(Ascaris), 트리추리스(Trichuris), 크립토스포리듐(Cryptosporidium) 및 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii) 등에 의해 유발될 수 있다.
또한 감염성 질환 유기체, 대상체의 감염 또는 대상체의 감염된 세포와 관련된 임의의 폴리펩티드로부터 유래된 펩티드가 본원에 개시된다. 항원은 감염성 질환 유기체의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열로부터 유래될 수 있다. 감염성 질환 유기체의 폴리펩티드 서열은 병원체 유래 펩티드, 바이러스 유래 펩티드, 박테리아 유래 펩티드, 진균 유래 펩티드 및/또는 기생충 유래 펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 감염성 질환 유기체는 중증 급성 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스(SARS), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2), 에볼라, HIV, B형 간염 바이러스(HBV), 인플루엔자, C형 간염 바이러스(HCV), 인유두종바이러스(HPV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 치쿤군야 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 뎅기 바이러스, 오르티믹소비리대 과 바이러스 및 결핵을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
수지상 세포와 같은 전문 항원 제시 세포를 포함하여, 종양 세포, 감염된 세포 또는 면역 세포와 같은 세포의 세포 표면 상에 제시될 것으로 예측되는 항원이 선택될 수 있다. 면역원성으로 예측되는 항원이 선택될 수 있다.
항원 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드는 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 1000 nM 미만의 IC50 값을 갖는 MHC와의 결합 친화도, MHC 클래스 I 펩티드의 경우 8-15, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 길이, 프로테아좀 절단을 촉진하는 펩티드 내 또는 근처의 서열 모티프의 존재, 및 TAP 수송을 촉진하는 서열 모티프의 존재. MHC 클래스 II 펩티드의 경우 6-30, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 길이, 세포외 또는 리소좀 프로테아제(예를 들어, 카텝신)에 의한 절단을 촉진하는 펩티드 내 또는 근처의 서열 모티프의 존재 또는 HLA-DM 촉매화된 HLA 결합.
하나 이상의 항원이 종양 표면 상에 제시될 수 있다. 하나 이상의 항원이 감염된 세포의 표면 상에 제시될 수 있다.
하나 이상의 항원은 예를 들어 대상체에서 T 세포 반응 및/또는 B 세포 반응을 자극할 수 있는 종양을 갖는 대상체에서 면역원성일 수 있다. 하나 이상의 항원은 예를 들어 대상체에서 T 세포 반응 및/또는 B 세포 반응을 자극할 수 있는 감염을 갖거나 감염을 가질 것으로 의심되는 대상체에서 면역원성일 수 있다. 하나 이상의 항원은 감염 위험이 있는 대상체에서 면역원성일 수 있으며, 예를 들어 기억 T 세포, 기억 B 세포 또는 감염에 특이적인 항체의 생산을 자극하는 것과 같은, 예를 들어 감염에 대한 면역학적 보호(즉, 면역)를 제공하는 대상체에서의 T 세포 반응 및/또는 B 세포 반응을 자극할 수 있다.
하나 이상의 항원은 하나 이상의 항원을 인식하는 항체(예를 들어, 종양 또는 감염성 질환 항원을 인식하는 항체)의 생산과 같은 B 세포 반응을 자극할 수 있다. 항체는 선형 폴리펩티드 서열을 인식하거나 2차 및 3차 구조를 인식할 수 있다. 따라서, B 세포 항원은 선형 폴리펩티드 서열 또는 전장 단백질, 단백질 서브유닛, 단백질 도메인, 또는 2차 및 3차 구조를 갖는 것으로 알려지거나 예측되는 임의의 폴리펩티드 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 2차 및 3차 구조를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 종양에 대한 B 세포 반응을 자극할 수 있는 항원 또는 감염성 질환 항원은 각각 종양 세포 또는 감염성 질환 유기체의 표면 상에서 발견되는 항원일 수 있다. 종양 또는 감염 질환 항원에 대한 B 세포 반응을 촉발할 수 있는 항원은 각각 종양 또는 감염 질환 유기체에서 발현되는 세포내 신생항원일 수 있다.
하나 이상의 항원은 T 세포 반응을 자극할 수 있는 항원(예를 들어, 예측된 T 세포 에피토프 서열을 포함하는 펩티드) 및 B 세포 반응을 자극할 수 있는 별개의 항원(예를 들어, 전장 단백질, 단백질 서브유닛, 단백질 도메인)의 조합을 포함할 수 있다.
대상체에서 자가면역 반응을 자극하는 하나 이상의 항원은 대상체에 대한 백신 생성과 관련하여 고려에서 제외될 수 있다.
적어도 하나의 항원성 펩티드 분자(예를 들어, 에피토프 서열)의 크기는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120개 이상의 아미노 분자 잔기, 및 여기서 유래될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서 항원성 펩티드 분자는 50개의 아미노산 이하이다.　
항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 MHC 클래스 I의 경우 15개 잔기 이하의 길이이고 보통 약 8개 내지 약 11개의 잔기, 특히 9개 또는 10개의 잔기를 포함하고; MHC 클래스 II의 경우, 6-30개의 잔기를 포함한다(경계 포함).　
원하는 경우 더 긴 펩티드가 여러 방식으로 설계될 수 있다. 한 경우에서 HLA 대립유전자에 대한 펩티드의 제시 가능성이 예측되거나 알려졌을 때, 더 긴 펩티드는 (1) 각각의 상응하는 유전자 산물의 N- 및 C-말단에 대한 2-5개의 아미노산 연장을 갖는 개별 제시된 펩티드; (2) 각각에 대해 연장된 서열을 갖는 제시된 펩티드의 일부 또는 전부의 연결 중 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 경우에, 시퀀싱이 종양에 존재하는 긴(>10개 잔기) 신생에피토프 서열을 드러낼 때(예를 들어, 새로운 펩티드 서열을 야기하는 프레임이동, 판독-통과 또는 인트론 포함으로 인해), 더 긴 펩티드는 (3) 새로운 종양 특이적 또는 감염성 질환 특이적 아미노산의 전체 신장을 포함할 것이다 - 따라서 가장 강력한 더 짧은 HLA-제시 펩티드의 전산 또는 시험관내 시험 기반 선택의 필요성을 우회한다. 두 경우 모두 더 긴 펩티드를 사용하면 환자 세포에 의한 내인성 처리를 허용하고 더 효과적인 항원 제시 및 T 세포 반응의 자극을 야기할 수 있다. 더 긴 펩티드는 또한 각각 종양 또는 감염성 질환 유기체에서 발현되는 것과 같은 펩티드의 전장 단백질, 단백질 서브유닛, 단백질 도메인, 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 더 긴 펩티드(예를 들어, 전장 단백질, 단백질 서브유닛 또는 단백질 도메인) 및 이의 조합은 B 세포 반응을 자극하기 위해 포함될 수 있다.　
항원 펩티드 및 폴리펩티드는 HLA 단백질 상에 제시될 수 있다. 일부 측면에서 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 야생형 펩티드보다 더 큰 친화도로 HLA 단백질 상에 제시된다. 일부 측면에서, 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 5000 nM 미만, 적어도 1000 nM 미만, 적어도 500 nM 미만, 적어도 250 nM 미만, 적어도 200 nM 미만, 적어도 150 nM 미만, 적어도 100 nM 미만, 적어도 50 nM 미만 이하의 IC50을 가질 수 있다.
일부 측면에서, 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 대상체에 투여될 때 자가면역 반응을 유도하지 않고/않거나 면역학적 관용성을 불러일으키지 않는다.
또한 적어도 2개 이상의 항원성 펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서 조성물은 적어도 2개의 별개의 펩티드를 함유한다. 적어도 2개의 별개의 펩티드는 동일한 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 별개의 폴리펩티드란 펩티드가 길이, 아미노산 서열 또는 둘 모두에 의해 다양함을 의미한다. 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 포함할 수 있다. 종양 특이적 펩티드는 종양 특이적 돌연변이를 포함하는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있거나, 펩티드는 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 변경된 발현을 갖는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드, 예를 들어 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 비정상적으로 발현되는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 펩티드는 감염성 질환 유기체와 관련된 것으로 알려졌거나 의심되는 임의의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있거나, 펩티드는 정상 세포 또는 조직과 비교하여 감염된 세포에서 변경된 발현을 갖는 것으로 알려졌거나 발견된 임의의 폴리펩티드(예를 들어, 숙주 세포에 대해 발현이 제한된 감염성 질환 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 감염성 질환 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)로부터 유래될 수 있다. 항원성 펩티드가 유래될 수 있는 적합한 폴리펩티드는 예를 들어 COSMIC 데이터베이스 또는 AACR 게노믹스 증거 신생물 정보 교환(GENIE) 데이터베이스에서 찾을 수 있다. COSMIC은 인간 암의 체세포 돌연변이에 대한 포괄적인 정보를 큐레이션한다. AACR GENIE는 임상 등급 암 게노믹 데이터를 수만 명의 암 환자의 임상 결과와 집계하고 연결한다. 일부 측면에서 종양 특이적 돌연변이는 특정 암 유형에 대한 동인 돌연변이이다.
원하는 활성 또는 특성을 갖는 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 원하는 MHC 분자에 결합하고 적절한 T 세포를 활성화하는 변형되지 않은 펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 모두 증가시키거나 적어도 유지하면서 원하는 특정 속성, 예를 들어 개선된 약리학적 특성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩티드 및 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 치환과 같은 다양한 변화를 거칠 수 있으며, 이러한 변화는 개선된 MHC 결합, 안정성 또는 제시와 같은 이의 사용에서의 특정 장점을 제공할 수 있다. 보존적 치환이란 아미노산 잔기를 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 또 다른 잔기로, 예를 들어 하나의 소수성 잔기를 또 다른 잔기로, 또는 하나의 극성 잔기를 또 다른 잔기로 대체하는 것을 의미한다. 치환은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다. 단일 아미노산 치환의 효과는 또한 D-아미노산을 사용하여 탐침분석될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 문헌(Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); 및 Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984))에 기재된 바와 같은 잘 알려진 펩티드 합성 절차를 사용하여 제조될 수 있다.　
다양한 아미노산 모방체 또는 비-천연 아미노산을 사용한 펩티드 및 폴리펩티드의 변형은 생체내 펩티드 및 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 데 특히 유용할 수 있다. 안정성은 여러 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들어, 펩티다제 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 매질이 안정성을 시험하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 문헌(Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986))을 참고한다. 펩티드의 반감기는 25% 인간 혈청(v/v) 검정을 사용하여 편리하게 결정될 수 있다. 프로토콜은 일반적으로 하기와 같다. 풀링된 인간 혈청(AB형, 비-열 불활성화)은 사용 전에 원심분리에 의해 지질이 제거된다. 그런 다음 혈청이 RPMI 조직 배양 배지로 25%로 희석되고 펩티드 안정성을 시험하기 위해 사용된다. 미리 결정된 시간 간격으로 소량의 반응 용액을 제거하고 6% 수성 삼염화아세트산 또는 에탄올에 첨가한다. 탁한 반응 샘플이 15분 동안 냉각된 후(4℃) 회전침강되어 혈청 단백질을 펠렛화한다. 이어서 안정성-특이적 크로마토그래피 조건을 사용하여 역상 HPLC에 의해 펩티드의 존재가 결정된다.　
펩티드 및 폴리펩티드는 개선된 혈청 반감기 이외의 원하는 속성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CTL 활성을 자극하는 펩티드의 능력은 T 헬퍼 세포 반응을 자극할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에 대한 연결에 의해 향상될 수 있다. 면역원성 펩티드/T 헬퍼 접합체는 스페이서 분자에 의해 연결될 수 있다. 스페이서는 전형적으로 생리학적 조건 하에 실질적으로 하전되지 않는 아미노산 또는 아미노산 모방체와 같은 비교적 작은 중성 분자로 이루어진다. 스페이서는 전형적으로 예를 들어 Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택된다. 임의로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 이루어질 필요가 없으므로 이종- 또는 동종-올리고머일 수 있음이 이해될 것이다. 존재하는 경우, 스페이서는 일반적으로 적어도 1개 또는 2개의 잔기, 보다 일반적으로 3개 내지 6개의 잔기일 것이다. 대안적으로, 펩티드는 스페이서 없이 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다.
항원성 펩티드는 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단에서 직접 또는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩티드에 연결될 수 있다. 항원성 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. 예시적인 T 헬퍼 펩티드는 파상풍 유독소 830-843, 인플루엔자 307-319, 말라리아 포자소체 382-398 및 378-389를 포함한다.
단백질 또는 펩티드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터 단백질 또는 펩티드의 단리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성을 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열은 이전에 개시되었으며, 당업자에게 알려진 전산화된 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 이러한 데이터베이스 중 하나는 미국 국립 위생 연구 웹 사이트에 있는 국립 생명공학 정보 센터의 Genbank 및 GenPept 데이터베이스이다. 알려진 유전자에 대한 코딩 영역은 본원에 개시된 기술을 사용하거나 당업자에게 알려진 바와 같이 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 다양한 상업적 조제물이 당업자에게 알려져 있다.　
추가 측면에서 항원은 항원성 펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA(예를 들어, mRNA), 단일- 및/또는 이중-가닥, 또는 천연 또는 예를 들어 포스포로티오에이트 골격을 갖는 폴리뉴클레오티드와 같은 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 조합일 수 있으며 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 전사, 번역, 전사 후 처리 및/또는 RNA 안정성 개선을 통한 것과 같이 발현을 개선하기 위해 서열 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 본원에서 "코돈-최적화"는 주어진 유기체의 코돈 편향과 관련하여 자주 사용되지 않는 코돈을 자주 사용되는 동의 코돈으로 대체하는 것을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 선호되는 스플라이싱 이벤트로 편향하기 위한 스플라이싱 모티프(예를 들어, 정규 및/또는 잠재/비정규 스플라이스 공여체, 분지 및/또는 수신체 서열)의 제거 및/또는 외인성 스플라이싱 모티프(예를 들어, 스플라이스 공여체, 분지 및/또는 수신체 서열)의 도입을 통한 것과 같이 전사 후 처리를 개선하기 위해 최적화될 수 있으며, 예를 들어 의도되지 않은 스플라이싱을 감소시키기 위해 최적화될 수 있다. 외인성 인트론 서열은 SV40으로부터 유래된 서열(예를 들어, SV40 미니-인트론) 및 면역글로불린으로부터 유래된 서열(예를 들어, 인간 β-글로빈 유전자)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 외인성 인트론 서열은 프로모터/인핸서 서열과 항원(들) 서열 사이에 혼입될 수 있다. 발현 벡터에서 사용하기 위한 외인성 인트론 서열은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Callendret et al. (Virology. 2007 Jul 5; 363(2): 288-302))에 보다 상세히 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 RNA 불안정성 모티프(예를 들어, AU-풍부 요소 및 3' UTR 모티프) 및/또는 반복 뉴클레오티드 서열의 제거를 통해 전사 안정성을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 잠재 전사 개시인자 및/또는 종결인자의 제거를 통해 정확한 전사를 개선하기 위해 최적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 잠재 AUG 시작 코돈, 조기 폴리A 서열 및/또는 2차 구조 모티프의 제거를 통해 번역 및 번역 정확성을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 구성적 수송 요소(CTE), RNA 수송 요소(RTE) 또는 우드척 전사 후 조절 요소(WPRE)의 부가를 통한 것과 같이 전사체의 핵 외수송을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. 발현 벡터에서 사용하기 위한 핵 외수송 신호는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌(Callendret et al. (Virology. 2007 Jul 5; 363(2): 288-302))에 보다 상세히 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어 주어진 유기체의 평균 GC 함량을 반영하기 위해 GC 함량과 관련하여 최적화될 수 있다. 서열 최적화는 전사, 번역, 전사 후 처리 및/또는 RNA 안정성과 같은 하나 이상의 서열 특성의 균형을 맞출 수 있다. 서열 최적화는 전사, 번역, 전사 후 처리 및 RNA 안정성 각각의 균형을 이루는 최적 서열을 생성할 수 있다. GeneArt(Thermo Fisher), 코돈 최적화 도구(IDT), Cool Tool(University of Singapore), SGI-DNA(La Jolla California)와 같은 서열 최적화 알고리즘은 당업자에게 알려져 있다. 항원 암호화 단백질의 하나 이상의 영역은 별도로 서열 최적화될 수 있다.
또 다른 측면은 폴리펩티드 또는 이의 일부를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 상이한 세포 유형에 대한 발현 벡터는 당분야에 잘 알려져 있으며 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로 DNA는 플라스미드와 같은 발현 벡터에 적절한 배향 및 발현을 위한 정확한 판독 프레임으로 삽입된다. 필요한 경우, DNA는 원하는 숙주에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있지만, 이러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용 가능하다. 그런 다음 벡터는 표준 기술을 통해 숙주에 도입된다. 안내는 예를 들어 문헌(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)에서 찾을 수 있다.
IV.A. 카세트
하나 이상의 페이로드의 선택, "카세트"의 클로닝 및 작제 그리고 바이러스 벡터로의 그 삽입을 위해 사용되는 방법은 본원에 제공된 교시가 주어진 분야의 기술 내에 있다. "페이로드 카세트" 또는 "카세트" 또는 "항원 카세트"란 선택된 페이로드 또는 복수의 페이로드(예를 들어, 항원-암호화 핵산 서열과 같은 페이로드-암호화 핵산 서열) 및 페이로드(들)를 전사하고 전사된 산물을 발현하기 위해 필요한 다른 조절 요소의 조합을 의미한다. 선택된 페이로드 또는 복수의 페이로드는 별개의 페이로드 서열을 지칭할 수 있으며, 예를 들어 카세트 내의 페이로드-암호화 핵산 서열은 페이로드가 전사되고 발현되도록 페이로드-암호화 핵산 서열(또는 복수의 페이로드-암호화 핵산 서열)을 암호화할 수 있다. 페이로드 또는 복수의 페이로드는 전사를 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 성분은 바이러스 벡터로 형질감염된 세포에서 페이로드(들)의 발현을 구동할 수 있는 통상적인 조절 요소를 포함한다. 따라서 페이로드 카세트는 또한 페이로드(들)에 연결되고 재조합 벡터의 선택된 바이러스 서열 내에 다른 선택적 조절 요소와 함께 배치되는 선택된 프로모터를 함유할 수 있다. 카세트는 본원에 기재된 임의의 페이로드를 암호화하는 하나 이상의 서열과 같은 하나 이상의 페이로드를 포함할 수 있다. 카세트는 각각 독립적으로 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 및/또는 2A 리보솜 건너뛰기 서열 요소(예를 들어, E2A, P2A, F2A 또는 T2A 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열 요소)와 같은 다른 다중시스톤 시스템을 사용하여 함께 연결된 다중 페이로드-암호화 핵산 서열을 함유하는 카세트와 같이 하나 이상의 페이로드-암호화 핵산 서열을 가질 수 있다. 링커는 또한 TEV 또는 푸린 절단 부위와 같은 절단 부위를 가질 수 있다. 절단 부위를 갖는 링커는 다중시스트론 시스템의 요소와 같은 다른 요소와 조합으로 사용될 수 있다. 비제한적인 예시적 예에서, 푸린 프로테아제 절단 부위는 푸린 프로테아제 절단 부위가 번역 후 2A 서열의 제거를 용이하게 하도록 구성되도록 2A 리보솜 건너뛰기 서열 요소와 함께 사용될 수 있다.
하나 초과의 페이로드-암호화 핵산 서열을 함유하는 카세트에서, 각각의 페이로드-암호화 핵산 서열은 연결될 수 있다(예를 들어, 예시적인 비제한적 예에서, 연결된 T 세포 에피토프를 암호화하는 연결된 페이로드-암호화 핵산 서열). 다중시스트론 형식의 예시적인 예에서, 페이로드를 암호화하는 카세트는 하기와 같이 구성된다: (1) 내인성 26S 프로모터 - 페이로드 1 - T2A - 페이로드 2 단백질, 또는 (2) 내인성 26S 프로모터 - 페이로드 1 - 26S 프로모터 - 페이로드 2. 다중시스트론 형식의 추가의 예시적인 예에서, SARS-CoV-2 페이로드를 암호화하는 카세트는 하기와 같이 구성된다: (1) 내인성 26S 프로모터 - 스파이크 단백질 - T2A - 막 단백질, 또는 (2) 내인성 26S 프로모터 - 스파이크 단백질 - 26S 프로모터 - 연결된 T 세포 에피토프.
본원에 기재된 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터에 더하여, 추가적인 프로모터 또는 프로모터 요소가 사용될 수 있다. 유용한 프로모터는 발현될 페이로드(들)의 양을 제어할 수 있게 할, 구성적 프로모터 또는 조절된(유도성) 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 요망되는 프로모터는 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터/인핸서의 프로모터이다[예를 들어, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985) 참고]. 다른 요망되는 프로모터는 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터/인핸서를 포함한다. 또 다른 프로모터/인핸서 서열은 닭 세포질 베타-액틴 프로모터이다[T. A. Kost et al, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)]. 다른 적합하거나 요망되는 프로모터는 당업자에 의해 선택될 수 있다.　
카세트는 또한 전사체(폴리(A), 폴리-A 또는 pA)의 효율적인 폴리아데닐화를 위한 신호를 제공하는 서열 및 기능적 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 갖는 인트론을 포함하는 바이러스 벡터 서열에 대해 이종인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 벡터에서 사용되는 일반적인 폴리-A 서열은 파포바바이러스 SV-40으로부터 유래된 것이다. 폴리-A 서열(예를 들어, 비-천연 폴리-A)은 일반적으로 카세트에서 페이로드-기반 서열 다음에 그리고 바이러스 벡터 서열 전에 삽입될 수 있다. 일반적인 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래될 수도 있으며 SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 카세트는 또한 프로모터/인핸서 서열과 페이로드(들) 사이에 배치된 인트론을 함유할 수 있다. 이들 및 다른 일반적 벡터 요소의 선택은 통상적이며[예를 들어, Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual.", 2d edit., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) 및 여기에 인용된 참고문헌 참고] 많은 이러한 서열이 상업적 및 산업 공급원뿐만 아니라 Genbank로부터 이용 가능하다.
카세트는 하나 이상의 페이로드(예를 들어, 하나 이상의 페이로드-암호화 핵산 서열)를 가질 수 있다. 예를 들어, 주어진 카세트는 1-10, 1-20, 1-30, 10-20, 15-25, 15-20, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 페이로드를 포함할 수 있다. 페이로드는 서로 직접 연결될 수 있다. 페이로드는 또한 링커를 사용하여 서로 연결될 수 있다. 페이로드는 N에서 C 또는 C에서 N을 포함하여 서로에 대해 임의의 배향일 수 있다.
본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 카세트는 선택될 수 있는 다른 것들 중 VEE 골격의 결실된 구조 단백질 또는 ChAd-기반 벡터의 E1 유전자 영역 결실 또는 E3 유전자 영역 결실 부위와 같이 바이러스 벡터에서 임의의 선택된 결실 부위에 배치될 수 있다.
다중시스트론 SAM 벡터는 5'에서 3'으로, 각각의 요소의 구성된 서열을 기재하기 위해 하기 식을 사용하여 기재될 수 있다:
P1-(L5b-Nc-L3d)X-P2-(L5b-Nc-L3d)X-Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
식 중, P1은 SGP1 서브게놈 프로모터를 포함하고, P2는 SGP2 서브게놈 프로모터를 포함하며, 추가 카세트의 경우 Pa에 대해 a = 0 또는 1이고, N은 페이로드-암호화 핵산 서열을 포함하고, c = 1이고, L5는 5' 링커 서열을 포함하고, b = 0 또는 1이고, L3은 3' 링커 서열을 포함하고, d = 0 또는 1이고, G5는 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, e = 0 또는 1이고, G3은 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, g = 0 또는 1이고, U는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열 중 하나를 포함하고, f = 1이고, X = 1 내지 400이고, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 상응하는 페이로드-암호화 핵산 서열이고, Y = 0, 1 또는 2이고, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이며, 임의로 적어도 하나의 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나를 포함한다.
페이로드 암호화 서열(예를 들어, 카세트 또는 카세트에서 페이로드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열)은 5'에서 3'으로 각각의 요소의 구성된 서열을 기재하기 위해 하기 식을 사용하여 기재될 수 있다:
Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
식 중, P는 제2 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하고, a = 0 또는 1이고, c = 1이고, N은 본원에 기재된 페이로드-유래 핵산 서열 중 하나(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항원-암호화 핵산 서열)를 포함하고, L5는 5' 링커 서열을 포함하고, b = 0 또는 1이고, L3은 3' 링커 서열을 포함하고, d = 0 또는 1이고, G5는 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, e = 0 또는 1, G3은 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, g = 0 또는 1이고, U는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열 중 하나를 포함하고, f = 1이고, X = 1 내지 400이고, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 페이로드-암호화 핵산 서열이고, Y = 0, 1 또는 2이고, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 (1) 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열로서, 임의로 적어도 하나의 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나를 포함하는, 서열 또는 (2) MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 별개의 페이로드-암호화 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 별개의 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열 또는 별개의 MHC 클래스 II 항원-암호화 핵산 서열이다. 일부 경우에 상기 페이로드 암호화 서열 식은 연결된 T 세포 에피토프와 같은 연결된 페이로드 서열을 암호화하는 카세트의 일부만을 기재한다. 예를 들어, 예시적인 비제한적 예로서, 연결된 T 세포 에피토프와 하나 이상의 전장 SARS-CoV-2 단백질을 암호화하는 카세트에서 상기 페이로드 암호화 서열 식은 연결된 T 세포 에피토프를 기재하고 별도로 카세트는 2A 리보솜 건너뛰기 서열 요소(예를 들어, E2A, P2A, F2A 또는 T2A 서열) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열 요소와 같은 다중시스톤 시스템을 사용하여 임의로 연결되는 하나 이상의 전장 SARS-CoV-2 단백질을 암호화한다.
한 예에서, 존재하는 요소는 b = 1, d = 1, e = 1, g = 1, h = 1, X = 18, Y = 2인 경우를 포함하고 벡터 골격은 ChAdV68 벡터를 포함하고, a = 1이고, P는 CMV 프로모터이고, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열이 존재하고, 제2 폴리(A) 서열은 벡터 골격에 대해 외인성 폴리(A) 서열이고, 임의로 외인성 폴리(A) 서열은 SV40 폴리(A) 신호 서열 또는 BGH 폴리(A) 신호 서열을 포함하고, 각각의 N은 7-15개의 아미노산 길이인 MHC 클래스 I 에피토프, MHC 클래스 II 에피토프, B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프 또는 이의 조합을 암호화하고, L5는 에피토프의 천연 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 5' 링커 서열이고, 5' 링커 서열은 적어도 3개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하고, L3은 에피토프의 천연 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 3' 링커 서열이고, 3' 링커 서열은 적어도 3개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하고, U는 각각 PADRE 클래스 II 서열, 및 파상풍 유독소 MHC 클래스 II 서열이다. 일부 경우에 상기 페이로드 암호화 서열 식은 연결된 T 세포 에피토프와 같은 연결된 에피토프 서열을 암호화하는 페이로드 카세트의 일부만을 기재한다.
한 예에서, 존재하는 요소는 b = 1, d = 1, e = 1, g = 1, h = 1, X = 18, Y = 2인 경우를 포함하고 벡터 골격은 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 벡터를 포함하고, a = 0이고, 페이로드 카세트는 내인성 26S 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 적어도 하나의 폴리아데닐화 폴리(A) 서열은 골격에 의해 제공되는 적어도 80개의 연속 A 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열이고, 각각의 N은 MHC 클래스 I 에피토프 7-15개의 아미노산 길이, MHC 클래스 II 에피토프, B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프, 또는 이의 조합을 암호화하고, L5는 에피토프의 천연 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 5' 링커 서열이고, 5' 링커 서열은 적어도 3개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하고, L3은 에피토프의 천연 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 3' 링커 서열이고, 3' 링커 서열은 적어도 3개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하고, U는 각각 PADRE 클래스 II 서열 및 파상풍 유독소 MHC 클래스 II 서열이다.
페이로드 카세트는 5'에서 3'으로 각각의 요소의 구성된 서열을 기재하기 위해 하기 식을 사용하여 기재될 수 있다:
(Pa-(L5b-Nc-L3d)X)Z-(P2h-(G5e-Uf)Y)W-G3g
식 중, P 및 P2는 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하고, N은 MHC 클래스 I 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, L5는 5' 링커 서열을 포함하고, L3은 3' 링커 서열을 포함하고, G5는 아미노산 링커를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, G3은 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하고, U는 MHC 클래스 II 항원 암호화 핵산 서열을 포함하며, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 에피토프 암호화 핵산 서열이고, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열(예를 들어, 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열)이다. 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 범용 서열은 파상풍 유독소 펩티드를 포함할 수 있다. 범용 서열은 PADRE 펩티드를 포함할 수 있다. 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 펩티드를 포함할 수 있다. 조성 및 구성된 서열은 존재하는 요소의 수를 선택하여 추가로 정의될 수 있고, 예를 들어 a = 0 또는 1이고, b = 0 또는 1이고, c = 1이고, d = 0 또는 1이고, e = 0 또는 1이고, f = 1이고, g = 0 또는 1이고, h = 0 또는 1이고, X = 1 내지 400이고, Y = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, Z = 1 내지 400이고, W = 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
한 예에서, 존재하는 요소는 a = 0, b = 1, d = 1, e = 1, g = 1, h = 0, X = 10, Y = 2, Z = 1 및 W = 1인 경우를 포함하여, 추가적인 프로모터가 존재하지 않고(예를 들어, RNA 알파바이러스 또는 ChAdV 골격과 같은 벡터 골격에 의해 제공되는 프로모터 뉴클레오티드 서열만 존재함), 10개의 MHC 클래스 I 에피토프가 존재하고, 5' 링커가 각각의 N에 대해 존재하고, 3' 링커가 각각의 N에 대해 존재하고, 2개의 MHC 클래스 II 에피토프가 존재하고, 2개의 MHC 클래스 II 에피토프를 연결하는 링커가 존재하고, 2개의 MHC 클래스 II 에피토프의 5' 말단을 최종 MHC 클래스 I 에피토프의 3' 링커에 연결하는 링커가 존재하고, 2개의 MHC 클래스 II 에피토프의 3' 말단을 벡터 골격(예를 들어, ChAdV 또는 RNA 알파바이러스 골격)에 연결하는 링커가 존재하는 경우를 기재한다.
카세트의 3' 말단을 벡터 골격(예를 들어, RNA 알파바이러스 골격)에 연결하는 예는 3' 19-nt CSE와 같은 벡터 골격에 의해 제공되는 3' UTR 요소에 직접 연결하는 것을 포함한다. 카세트의 5' 말단을 벡터 골격(예를 들어, RNA 알파바이러스 골격)에 연결하는 예는 서브게놈 프로모터 서열(예를 들어, 26S 서브게놈 프로모터 서열), 알파바이러스 5' UTR, 51-nt CSE 또는 24-nt CSE와 같은 프로모터 또는 벡터 골격의 5' UTR 요소에 직접 연결하는 것을 포함한다.
다른 예는 다음을 포함한다: a = 1은 벡터 골격(예를 들어, ChAdV 또는 RNA 알파바이러스 골격)에 의해 제공되는 프로모터 뉴클레오티드 서열 이외의 프로모터가 존재하는 경우를 기재하고; a = 1이고 Z는 1 초과인 것은 벡터 골격에 의해 제공되는 프로모터 뉴클레오티드 서열 이외의 다중 프로모터가 존재하여 각각 1개 이상의 별개의 MHC 클래스 I 에피토프 암호화 핵산 서열의 발현을 구동하는 경우를 기재하고; h = 1은 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열의 발현을 구동하기 위해 별도의 프로모터가 존재하는 경우를 기재하며; g = 0은 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재하는 경우, 벡터 골격(예를 들어, ChAdV 또는 RNA 알파바이러스 골격)에 직접 연결되는 경우를 기재한다. 예를 들어, ChAdV 벡터 골격은 CMV 프로모터/인핸서의 제어 하에 배치된 카세트를 가질 수 있다.
다른 예는 존재하는 각각의 MHC 클래스 I 에피토프가 5' 링커, 3' 링커, 둘 모두를 가질 수 있거나 둘 모두 가질 수 없는 경우를 포함한다. 하나 초과의 MHC 클래스 I 에피토프가 동일한 항원 카세트에 존재하는 예에서, 일부 MHC 클래스 I 에피토프는 5' 링커와 3' 링커를 둘 모두 가질 수 있는 반면, 다른 MHC 클래스 I 에피토프는 5' 링커, 3' 링커를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없다. 하나 초과의 MHC 클래스 I 에피토프가 동일한 항원 카세트에 존재하는 다른 예에서, 일부 MHC 클래스 I 에피토프는 5' 링커 또는 3' 링커를 가질 수 있는 반면, 다른 MHC 클래스 I 에피토프는 5' 링커, 3' 링커를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없다.
하나 초과의 MHC 클래스 II 에피토프가 동일한 항원 카세트에 존재하는 예에서, 일부 MHC 클래스 II 에피토프는 5' 링커와 3' 링커를 둘 모두 가질 수 있는 반면, 다른 MHC 클래스 II 에피토프는 5' 링커, 3' 링커를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없다. 하나 초과의 MHC 클래스 II 에피토프가 동일한 항원 카세트에 존재하는 다른 예에서, 일부 MHC 클래스 II 에피토프는 5' 링커 또는 3' 링커를 가질 수 있는 반면, 다른 MHC 클래스 II 에피토프는 5' 링커, 3' 링커를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없다.
다른 예로는 존재하는 각각의 페이로드가 5' 링커, 3' 링커, 둘 모두를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없는 경우를 포함한다. 하나 초과의 페이로드가 동일한 페이로드 카세트에 존재하는 예에서 일부 페이로드는 5' 링커와 3' 링커를 둘 모두 가질 수 있는 반면, 다른 페이로드는 5' 링커, 3' 링커를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없다. 하나 초과의 페이로드가 동일한 페이로드 카세트에 존재하는 다른 예에서, 일부 페이로드는 5' 링커 또는 3' 링커를 가질 수 있는 반면, 다른 페이로드는 5' 링커, 3' 링커를 가질 수 있거나 둘 모두를 가질 수 없다.
프로모터 뉴클레오티드 서열 P 및/또는 P2는 RNA 알파바이러스 골격과 같은 벡터 골격에 의해 제공되는 프로모터 뉴클레오티드 서열과 동일할 수 있다. 예를 들어, RNA 알파바이러스 골격에 의해 제공되는 프로모터 서열, Pn 및 P2는 각각 서브게놈 프로모터 서열(예를 들어, 26S 서브게놈 프로모터 서열) 또는 CMV 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터 뉴클레오티드 서열 P 및/또는 P2는 벡터 골격(예를 들어, ChAdV 또는 RNA 알파바이러스 골격)에 의해 제공되는 프로모터 뉴클레오티드 서열과 상이할 수 있을 뿐만 아니라 서로 상이할 수 있다.
5' 링커 L5는 천연 서열 또는 비-천연 서열일 수 있다. 비-천연 서열은 AAY, RR 및 DPP를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 3' 링커 L3은 또한 천연 서열 또는 비-천연 서열일 수 있다. 추가로, L5 및 L3은 둘 모두 천연 서열이거나, 둘 모두 비-천연 서열이거나, 하나는 천연이고 다른 하나는 비-천연일 수 있다. 각각의 X에 대해, 아미노산 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 각각의 X에 대해, 아미노산 링커는 또한 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30개의 아미노산 길이일 수 있다. 각각의 X에 대해, 아미노산 링커는 또한 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-40, 2-50, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-40, 3-50, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-40, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-40, 5-50, 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-40, 6-50, 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-40, 또는 8-50개의 아미노산 길이일 수 있다.
아미노산 링커 G5는 각각의 Y에 대해, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 각각의 Y에 대해, 아미노산 링커는 또한 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30개의 아미노산 길이일 수 있다. G5는 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-40, 2-50, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-40, 3-50, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-40, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-40, 5-50, 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-40, 6-50, 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-40, 또는 8-50개의 아미노산 길이일 수 있다.
아미노산 링커 G3은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. G3은 또한 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30개의 아미노산 길이일 수 있다. G3은 또한 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-40, 2-50, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-40, 3-50, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-40, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-40, 5-50, 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-40, 6-50, 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-40, 7-50, 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-40, 또는 8-50개의 아미노산 길이일 수 있다.
각각의 X에 대해, 각각의 N은 MHC 클래스 I 에피토프, MHC 클래스 II 에피토프, B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프/항원, 또는 이의 조합을 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 MHC 클래스 I 에피토프, MHC 클래스 II 에피토프 및 B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프/항원의 조합을 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 MHC 클래스 I 에피토프와 MHC 클래스 II 에피토프의 조합을 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 MHC 클래스 I 에피토프와 B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프/항원의 조합을 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 MHC 클래스 II 에피토프와 B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프/항원의 조합을 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 MHC 클래스 II 에피토프를 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프/항원을 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 7-15개의 아미노산 길이인 MHC 클래스 I 에피토프를 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해, 각각의 N은 또한 MHC 클래스 I 에피토프 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산 길이를 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해, 각각의 N은 또한 MHC 클래스 I 에피토프 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 또는 적어도 30개의 아미노산 길이를 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 MHC 클래스 II 에피토프를 암호화할 수 있다. 각각의 X에 대해 각각의 N은 B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프를 암호화할 수 있다.
다중시스트론 시스템에서 각각의 카세트를 포함하는 카세트는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 적어도 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 적어도 1000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 적어도 2000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 적어도 3000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 적어도 4000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 적어도 5000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트의 길이는 적어도 6000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 카세트는 적어도 7000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트의 길이는 적어도 8000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 카세트는 적어도 9000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 100-1000, 100-2000, 100-3000, 100-4000, 100-5000, 100-6000, 100-7000, 100-8000, 100-9000, 또는 100-10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 500-1000, 500-2000, 500-3000, 500-4000, 500-5000, 500-6000, 500-7000, 500-8000, 500-9000, 또는 500-10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 1000-2000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 또는 1000-10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 약 알파바이러스로부터 결실된 길이(예를 들어, VEE 골격에서 결실된 구조 단백질의 길이)일 수 있다. 카세트는 알파바이러스로부터 결실된 길이보다 짧을 수 있다. 카세트는 알파바이러스로부터 결실된 길이보다 길 수 있다.
다중 카세트를 포함하는 벡터의 경우, 조합된 모든 카세트의 전체 길이는 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다중 카세트를 포함하는 벡터의 경우, 조합된 모든 카세트의 전체 길이는 적어도 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다 다중 카세트를 포함하는 벡터의 경우, 조합된 모든 카세트의 전체 길이는 100-1000, 100-2000, 100-3000, 100-4000, 100-5000, 100-6000, 100-7000, 100-8000, 100-9000, 또는 100-10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다중 카세트를 포함하는 벡터의 경우 조합된 모든 카세트의 전체 길이는 500-1000, 500-2000, 500-3000, 500-4000, 500-5000, 500-6000, 500-7000, 500-8000, 500-9000, 또는 500-10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다중 카세트를 포함하는 벡터의 경우 조합된 모든 카세트의 전체 길이는 1000-2000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 또는 1000-10000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
카세트는 700개 뉴클레오티드 이하일 수 있다. 카세트는 700개 뉴클레오티드 이하일 수 있고 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다(예를 들어, 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 2개의 별개의 감염성 질환 또는 종양 유래 핵산 서열을 암호화함). 카세트는 700개 뉴클레오티드 이하일 수 있고 적어도 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 700개 뉴클레오티드 이하일 수 있으며 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 700개 뉴클레오티드 이하일 수 있고 적어도 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 700개 뉴클레오티드 이하일 수 있고 1-10, 1-5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 페이로드를 포함할 수 있다.
카세트는 375-700개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 375-700개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다(예를 들어, 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 2개의 별개의 감염성 질환 또는 종양 유래 핵산 서열을 암호화함). 카세트는 375-700개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 적어도 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 375-700개의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 375-700개의 뉴클레오티드 길이이고 적어도 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 375-700개의 뉴클레오티드 길이이고 1-10, 1-5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 페이로드를 포함할 수 있다.
카세트는 600, 500, 400, 300, 200 또는 100개 뉴클레오티드 이하의 길이일 수 있다. 카세트는 600, 500, 400, 300, 200 또는 100개 뉴클레오티드 이하의 길이일 수 있으며 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 600, 500, 400, 300, 200 또는 100개 뉴클레오티드 이하의 길이일 수 있으며 적어도 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 600, 500, 400, 300, 200 또는 100개 뉴클레오티드 이하의 길이일 수 있으며 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 600, 500, 400, 300, 200 또는 100개 뉴클레오티드 이하의 길이일 수 있으며 적어도 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 600, 500, 400, 300, 200 또는 100개 뉴클레오티드 이하의 길이일 수 있으며 1-10, 1-5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 페이로드를 포함할 수 있다.
카세트는 375-600, 375-500 또는 375-400개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 카세트는 375-600, 375-500 또는 375-400개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 375-600, 375-500 또는 375-400개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 적어도 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 375-600, 375-500, 또는 375-400개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 길이가 375-600, 375-500 또는 375-400개의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며 적어도 3개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 암호화할 수 있다. 카세트는 375-600, 375-500 또는 375-400개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 1-10, 1-5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 페이로드를 포함할 수 있다.
V. 백신 조성물
또한 특정 면역 반응, 예를 들어 종양-특이적 면역 반응 또는 감염성 질환 유기체-특이적 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역원성 조성물, 예를 들어 백신 조성물이 본원에 개시된다. 백신 조성물은 전형적으로 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여 선택되거나 병원체 유래 펩티드, 바이러스 유래 펩티드, 박테리아 유래 펩티드, 진균 유래 펩티드, 및/또는 기생충 유래 펩티드로부터 선택된 하나 또는 복수의 항원을 포함할 수 있다. 백신 조성물은 또한 백신으로 지칭될 수 있다.
백신은 1-30개 펩티드, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 상이한 펩티드, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 또는 14개의 상이한 펩티드, 또는 12, 13 또는 14개의 상이한 펩티드를 함유할 수 있다. 펩티드는 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 백신은 1-100개 이상의 뉴클레오티드 서열, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 또는 14개의 상이한 뉴클레오티드 서열, 또는 12, 13 또는 14개의 상이한 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 백신은 1-30개의 항원 서열, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 상이한 항원 서열, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 상이한 항원 서열, 또는 12, 13 또는 14개의 상이한 항원 서열을 함유할 수 있다.
백신은 1-30개의 항원 암호화 핵산 서열, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 상이한 항원-암호화 핵산 서열, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 또는 14개의 상이한 항원-암호화 핵산 서열, 또는 12, 13 또는 14개의 상이한 항원-암호화 핵산 서열을 함유할 수 있다. 항원 암호화 핵산 서열은 항원 "카세트"의 항원 암호화 부분을 지칭할 수 있다. 항원 카세트의 특징은 본원에 보다 상세하게 기재된다. 카세트는 카세트에서 함께 연결된 2개 이상의 항원-암호화 핵산 서열(예를 들어, 연결된 T 세포 에피토프를 암호화하는 연결된 항원-암호화 핵산 서열)을 함유할 수 있다.
백신은 1-30개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 또는 14개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열, 또는 12, 13 또는 14개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 함유할 수 있다. 에피토프-암호화 핵산 서열은 카세트에서 함께 연결된 2개 이상의 항원-암호화 핵산 서열의 각각의 연결된 T 세포 에피토프와 같은 개별 에피토프 서열에 대한 서열을 지칭할 수 있다.
백신은 에피토프-암호화 핵산 서열의 적어도 2개의 반복을 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "반복"(또는 상호교환적으로 "되풀이")은 항원-암호화 핵산 서열 내에서 동일한 핵산 에피토프-암호화 핵산 서열(본원에 기재된 선택적 5' 링커 서열 및/또는 선택적 3' 링커 서열 포함)의 2개 이상의 반복을 지칭한다. 한 예에서, 카세트의 항원-암호화 핵산 서열 부분은 에피토프-암호화 핵산 서열의 적어도 2개의 반복을 암호화한다. 추가의 비제한적 예에서, 카세트의 항원-암호화 핵산 서열 부분은 하나 초과의 별개의 에피토프를 암호화하고, 별개의 에피토프 중 적어도 하나는 별개의 에피토프를 암호화하는 핵산 서열의 적어도 2개의 반복(즉, 적어도 2개의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열)에 의해 암호화된다. 예시적인 비제한적 예에서, 항원-암호화 핵산 서열은 에피토프-암호화 핵산 서열 에피토프-암호화 서열 A(EA), 에피토프-암호화 서열 B(EB), 및 에피토프-암호화 서열 C(EC)에 의해 암호화되는 에피토프 A, B 및 C를 암호화하며 별개의 에피토프 중 적어도 하나의 반복을 갖는 예시적인 항원-암호화 핵산 서열은 아래 화학식에 의해 예시되지만 이에 제한되지 않는다:
- 하나의 별개의 에피토프의 반복(에피토프 A의 반복):
EA-EB-EC-EA; 또는
EA-EA-EB-EC
- 다수의 별개의 에피토프의 반복(에피토프 A, B 및 C의 반복):
EA-EB-EC-EA-EB-EC; 또는
EA-EA-EB-EB-EC-EC
- 다수의 별개의 에피토프의 다중 반복(에피토프 A, B 및 C의 반복):
EA-EB-EC-EA-EB-EC-EA-EB-EC; 또는
EA-EA-EA-EB-EB-EB-EC-EC-EC
상기 예는 제한적이지 않으며 별개의 에피토프 중 적어도 하나의 반복을 갖는 항원-암호화 핵산 서열은 임의의 순서 또는 빈도로 각각의 별개의 에피토프를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 순서 및 빈도는 예를 들어 화학식 EA-EB-EC-EC-EA-EB-EA-EC-EA-EC-EC-EB에 의한 에피토프 A, B 및 C로의 예에서, 별개의 에피토프의 무작위 배열일 수 있다.
또한 다음 화학식에 의해 5'에서 3'으로 기재된 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열을 갖는, 항원-암호화 카세트가 본원에 제공된다:
(Ex-(EN n)y)z
식 중, E는 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고,
n은 별도의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열의 수를 나타내며 0을 포함하는 임의의 정수이고,
EN은 각각의 상응하는 n에 대해 별도의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고,
z의 각각의 반복에 대해: 각각의 n에 대해 x = 0 또는 1이고, y = 0 또는 1이고, x 또는 y 중 적어도 하나 = 1이고,
z = 2 이상이고, 항원-암호화 핵산 서열은 E, 주어진 EN 또는 이의 조합의 적어도 2개의 반복을 포함한다.
각각의 E 또는 EN은 독립적으로 본원에 기재된 임의의 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 감염성 질환 T 세포 에피토프 및/또는 신생항원 에피토프를 암호화하는 펩티드). 예를 들어, 각각의 E 또는 EN은 독립적으로 화학식 (L5b-Nc-L3d)에 의해 5'에서 3'으로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, N은 각각의 E 또는 EN과 관련된 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, c = 1이고, L5는 5' 링커 서열을 포함하고, b = 0 또는 1이고, L3은 3' 링커 서열을 포함하고, d = 0 또는 1이다. 사용될 수 있는 에피토프 및 링커는 본원에 추가로 기재되며, 예를 들어 V.A. 항원 카세트를 참고한다.
에피토프-암호화 핵산 서열(선택적 5' 링커 서열 및/또는 선택적 3' 링커 서열 포함)의 반복은 서로 직접 선형으로 연결될 수 있다(예를 들어, 상기 예시된 바와 같은 EA-EA-…). 에피토프-암호화 핵산 서열의 반복은 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 서열에 의해 분리될 수 있다. 일반적으로, 에피토프-암호화 핵산 서열의 반복은 본원에 기재된 조성물에 적용 가능한 임의의 크기의 뉴클레오티드 서열에 의해 분리될 수 있다. 한 예에서, 에피토프-암호화 핵산 서열의 반복은 별도의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 분리될 수 있다(예를 들어, 상기 예시된 바와 같이 EA-EB-EC-EA…). 반복이 하나의 별도의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 분리되고, 각각의 에피토프-암호화 핵산 서열(선택적 5' 링커 서열 및/또는 선택적 3' 링커 서열 포함)이 펩티드 25개 아미노산 길이를 암호화하는 예에서 반복은 EA-EB-EA…에 의해 나타내는 항원-암호화 핵산에서, EA가 75개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것과 같이, 75개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다, 예컨대 표시되는 다. 예시적인 예에서, 25머 항원 Trp1(VTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPGQ) 및 Trp2(TQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDT)의 반복을 암호화하는 서열 VTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPGQTQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDTVTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPGQTQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDT를 갖는 항원-암호화 핵산에서, Trp1의 반복은 25머 Trp2에 의해 분리되고 따라서 Trp1-암호화 핵산 서열의 반복은 75개 뉴클레오티드 Trp2 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 분리된다. 반복이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 별도의 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 분리되고, 각각의 에피토프-암호화 핵산 서열(선택적 5' 링커 서열 및/또는 선택적 3' 링커 서열 포함)이 25개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하는 예에서, 반복은 각각 150, 225, 300, 375, 450, 525, 600 또는 675개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
한 구현예에서, 상이한 펩티드 및/또는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 상이한 MHC 클래스 I 분자 및/또는 상이한 MHC 클래스 II 분자와 같은 상이한 MHC 분자와 회합할 수 있도록 선택된다. 일부 측면에서, 하나의 백신 조성물은 가장 빈번하게 발생하는 MHC 클래스 I 분자 및/또는 상이한 MHC 클래스 II 분자와 회합할 수 있는 펩티드 및/또는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 백신 조성물은 적어도 2개의 바람직한, 적어도 3개의 바람직한, 또는 적어도 4개의 바람직한 MHC 부류 I 분자 및/또는 상이한 MHC 부류 II 분자와 회합할 수 있는 상이한 단편을 포함할 수 있다.　
백신 조성물은 특정 세포독성 T 세포 반응 및/또는 특정 헬퍼 T 세포 반응을 자극할 수 있다.　백신 조성물은 특정 세포독성 T 세포 반응 및 특정 헬퍼 T 세포 반응을 자극할 수 있다.
백신 조성물은 특정 B-세포 반응(예를 들어, 항체 반응)을 자극할 수 있다.
백신 조성물은 특정 세포독성 T 세포 반응, 특정 헬퍼 T 세포 반응 및/또는 특정 B 세포 반응을 자극할 수 있다. 백신 조성물은 특정 세포독성 T 세포 반응 및 특정 B 세포 반응을 자극할 수 있다. 백신 조성물은 특정 헬퍼 T 세포 반응 및 특정 B 세포 반응을 자극할 수 있다. 백신 조성물은 특정 세포독성 T 세포 반응, 특정 헬퍼 T 세포 반응 및 특정 B 세포 반응을 자극할 수 있다.
백신 조성물은 보조제 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 유용한 보조제 및 담체의 예는 본원에서 아래에 제공된다. 조성물은 예를 들어 단백질과 같은 담체 또는 예를 들어 T-세포에 펩티드를 제시할 수 있는 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포와 회합될 수 있다.　
보조제는 백신 조성물로의 혼합이 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 달리 변형하는 임의의 물질이다. 담체는 스캐폴드 구조, 예를 들어 항원이 회합될 수 있는 폴리펩티드 또는 다당류일 수 있다. 임의로 보조제는 공유적으로 또는 비공유적으로 접합된다.　
항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 보조제의 능력은 전형적으로 면역 매개 반응의 상당한 또는 실질적 증가 또는 질환 증상의 감소로 나타난다. 예를 들어, 체액성 면역성의 증가는 전형적으로 항원에 대해 생성된 항체 역가의 상당한 증가로 나타나고, T-세포 활성의 증가는 전형적으로 증가된 세포 증식, 또는 세포성 세포독성 또는 사이토카인 분비로 나타난다. 보조제는 또한 예를 들어 체액성 또는 Th 반응을 주로 세포성 또는 Th 반응으로 변화시킴으로써 면역 반응을 변경할 수 있다.　
적합한 보조제는 1018 ISS, 명반, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax_, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod), ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel 벡터 시스템, PLG 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 바이로좀 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 사포닌으로부터 유래된 Aquila의 QS21 스티뮬론(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), 미코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체, Ribi의 Detox. Quil 또는 Superfos와 같은 다른 독점적 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 불완전 프로인트 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 유용하다. 수지상 세포에 특이적인 여러 면역학적 보조제(예를 들어, MF59) 및 이의 조제물은 이전에 기재되었다(Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). 또한 사이토카인이 사용될 수 있다. 몇몇 사이토카인은 수지상 세포가 림프 조직으로 이동하는 데 영향을 미치고(예를 들어, TNF-알파), 수지상 세포가 T-림프구에 대한 효율적인 항원 제시 세포로 성숙되는 것을 가속화하며(예를 들어, GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(그 전체가 구체적으로 본원에 참조로 포함된, U.S. 특허 번호 5,849,589) 면역보조제로 작용하는 데 직접적으로 연관되었다(예를 들어, IL-12)(Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드가 또한 백신 설정에서 보조제의 효과를 향상시키는 것으로 보고되었다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9와 같은 다른 TLR 결합 분자도 사용될 수 있다.　
유용한 보조제의 다른 예는 치료적으로 및/또는 보조제로서 작용할 수 있는, 화학적으로 변형된 CpG(예를 들어, CpR, Idera), 폴리(I:C)(예를 들어, 폴리i:CI2U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA뿐만 아니라 사이클로포스파미드, 수니티닙, 베바시주맙, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라피닙, XL-999, CP-547632, 파조파닙, ZD2171, AZD2171, 이필리무맙, 트레멜리무맙 및 SC58175와 같은 면역활성 소분자 및 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보조제 및 첨가제의 양 및 농도는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 추가적인 보조제는 과립구 대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 사그라모스팀)와 같은 콜로니 자극 인자를 포함한다.　
백신 조성물은 하나 초과의 상이한 보조제를 포함할 수 있다. 또한, 치료 조성물은 임의의 상기 물질 또는 이의 조합을 포함하는 임의의 보조 물질을 포함할 수 있다. 또한, 백신 및 보조제가 임의의 적절한 순서로 함께 또는 별도로 투여될 수 있음이 고려된다.　
담체(또는 부형제)는 보조제와 독립적으로 존재할 수 있다. 담체의 기능은 예를 들어 특정 돌연변이체의 분자량을 증가시키거나, 활성 또는 면역원성을 증가시키거나, 안정성을 부여하거나, 생물학적 활성을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 담체는 펩티드를 T 세포에 제시하는 것을 도울 수 있다. 담체는 당업자에게 알려진 임의의 적합한 담체, 예를 들어 단백질 또는 항원 제시 세포일 수 있다. 담체 단백질은 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 트랜스페린, 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 티로글로불린 또는 오발부민과 같은 혈청 단백질, 면역글로불린, 또는 인슐린과 같은 호르몬 또는 팔미트산일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 인간의 면역화를 위해 담체는 일반적으로 인간에게 허용 가능하고 안전한 생리학적으로 허용 가능한 담체이다. 그러나 파상풍 유독소 및/또는 디프테리아 유독소가 적합한 담체이다. 대안적으로, 담체는 덱스트란, 예를 들어 세파로스일 수 있다.　
세포독성 T 세포(CTL)는 온전한 외래 항원 자체가 아니라 MHC 분자에 결합된 펩티드 형태로 항원을 인식한다. MHC 분자 자체는 항원 제시 세포의 세포 표면에 위치한다. 따라서, 펩티드 항원, MHC 분자 및 APC의 삼량체 복합체가 존재하는 경우 CTL의 활성화가 가능하다. 이에 따라, 펩티드가 CTL의 활성화를 위해 사용될 뿐만 아니라 추가로 각각의 MHC 분자를 가진 APC가 첨가되는 경우 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 백신 조성물은 적어도 하나의 항원 제시 세포를 추가로 함유한다.　
항원은 또한 백시니아, 계두, 자가 복제 알파바이러스, 마라바바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, Tatsis et al., Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616―629 참고) 또는 제2/제3 또는 하이브리드 제2/제3 세대 렌티바이러스 및 특정 세포 유형 또는 수용체를 표적화하도록 설계된 임의의 세대의 재조합 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 렌티바이러스(예를 들어, Hu et al., Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma et al., Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper et al., Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey et al., Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880 참고)와 같은 바이러스 벡터 기반 백신 플랫폼에 포함될 수 있다. 위에서 언급한 바이러스 벡터 기반 백신 플랫폼의 패키징 용량에 따라 이 접근법은 하나 이상의 항원 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 전달할 수 있다. 서열은 돌연변이되지 않은 서열이 측면에 있을 수 있고, 링커에 의해 분리될 수 있거나 세포하 구획을 표적화하는 하나 이상의 서열이 선행될 수 있다(예를 들어, Gros et al., Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen et al., Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires, Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu et al., Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions, Clin Cancer Res. (2014) 20(13):3401-10 참고). 숙주에 도입되면 감염된 세포는 항원을 발현하고 이에 따라 펩티드(들)에 대한 숙주 면역(예를 들어, CTL) 반응을 자극한다. 면역화 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들어 U.S. 특허 번호 4,722,848에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(칼메트-구에린 간균)이다. BCG 벡터는 문헌(Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)))에 기재되어 있다. 항원의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 매우 다양한 다른 백신 벡터, 예를 들어 살모넬라 타이피 벡터 등은 본원의 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다.
V.A. 백신 설계 및 제조를 위한 추가적인 고려사항
V.A.1. 모든 종양 서브클론을 포괄하는 펩티드 세트의 결정
모든 또는 대부분의 종양 서브클론에 의해 제시된 것을 의미하는 줄기(truncal) 펩티드는 백신으로의 포함에 대해 우선순위가 부여될 수 있다. 임의로, 제시되고 높은 확률로 면역원성일 것으로 예측되는 줄기 펩티드가 없는 경우, 또는 제시되고 높은 확률로 면역원성일 것으로 예측되는 줄기 펩티드의 수가 추가적인 비-줄기 펩티드가 백신에 포함될 수 있을 만큼 충분히 적은 경우, 백신에 의해 포괄되는 종양 서브클론의 수를 최대화하기 위해 종양 서브클론의 수와 정체를 추정하고 펩티드를 선택하여 추가 펩티드에 우선순위가 부여될 수 있다.
V.A.2. 항원 우선 순위
상기 항원 필터가 모두 적용된 후, 백신 기술이 지원할 수 있는 것보다 더 많은 후보 항원이 여전히 백신으로의 포함을 위해 이용 가능할 수 있다. 또한 항원 분석의 다양한 측면에 대한 불확실성이 남아 있을 수 있으며 후보 백신 항원의 상이한 특성 간에 장단점이 존재할 수 있다. 따라서 선택 과정의 각각의 단계에서 미리 결정된 필터 대신에 후보 항원을 적어도 하기 축을 가진 공간에 배치하고 통합 접근법을 사용하여 선택을 최적화하는 통합된 다차원 모델이 고려될 수 있다.
1. 자가 면역성 또는 관용성의 위험(생식계열의 위험)(전형적으로 자가 면역성의 위험이 낮을수록 선호됨)
2. 시퀀싱 아티팩트의 확률(전형적으로 아티팩트 확률이 낮을수록 선호됨)
3. 면역원성의 확률(전형적으로 면역원성 확률이 높을수록 선호됨)
4. 제시 확률(전형적으로 제시 확률이 높을수록 선호됨)
5. 유전자 발현(전형적으로 발현이 높을수록 선호됨)
6. HLA 유전자 적용범위(항원 세트의 제시에 관여되는 HLA 분자 수가 많을수록 종양, 감염성 질환 및/또는 감염된 세포가 HLA 분자의 하향조절 또는 돌연변이를 통해 면역 공격을 회피할 확률이 낮아질 수 있음)
7. HLA 클래스의 적용범위(HLA-I 및 HLA-II 둘 모두의 커버는 치료 반응의 확률을 증가시키고 종양 또는 감염성 질환 회피 확률을 감소시킬 수 있음)
추가로, 임의로, 항원이 환자의 종양 또는 감염된 세포의 전부 또는 일부에서 소실되거나 불활성화된 HLA 대립유전자에 의해 제시될 것으로 예측되는 경우 이들은 백신접종으로부터 우선순위가 낮아질(예를 들어, 제외될)수 있다. HLA 대립유전자 손실은 체세포 돌연변이, 이형접합성의 손실 또는 유전자좌의 동형접합성 결실에 의해 발생할 수 있다. HLA 대립유전자 체세포 돌연변이의 검출 방법은 당분야에 예를 들어 문헌(Shukla et al., 2015)에 잘 알려져 있다. 체세포 LOH 및 동형접합성 결실(HLA 유전자좌 포함)의 검출 방법도 마찬가지로 잘 기재되어 있다(Carter et al., 2012; McGranahan et al., 2017; Van Loo et al., 2010). 또한 질량 분광측정 데이터가 예측된 항원이 예측된 HLA 대립유전자에 의해 제시되지 않음을 표시하는 경우 항원의 우선순위가 낮아질 수 있다.
V.C. 자가 증폭 RNA 벡터
일반적으로 모든 자가 증폭 RNA(SAM) 벡터는 자가 복제 바이러스로부터 유래된 자가 증폭 골격을 함유한다. 용어 "자가 증폭 골격"은 바이러스 게놈의 자가 복제를 허용하는 자가 복제 바이러스의 최소 서열(들)을 지칭한다. 예를 들어, 알파바이러스의 자가 복제를 허용하는 최소 서열은 비구조 단백질 매개 증폭을 위한 보존된 서열(예를 들어, 비구조 단백질 1(nsP1) 유전자, nsP2 유전자, nsP3 유전자, nsP4 유전자 및/또는 또는 폴리A 서열)을 포함할 수 있다. 자가 증폭 골격은 또한 서브게놈 바이러스 RNA의 발현을 위한 서열(예를 들어, 알파바이러스를 위한 26S 프로모터 요소)을 포함할 수 있다. SAM 벡터는 포지티브 센스 또는 네가티브 센스 자가 복제 바이러스로부터 유래된 골격을 갖는 벡터와 같은 포지티브 센스 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 네가티브 센스 RNA 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 자가 복제 바이러스는 알파바이러스, 플라비바이러스(예를 들어, 쿤진(Kunjin) 바이러스), 홍역 바이러스 및 랩도바이러스(예를 들어, 광견병 바이러스 및 소수포 구내염 바이러스)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 자가 복제 바이러스로부터 유래된 SAM 벡터 시스템의 예는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, 문헌(Lundstrom (Molecules. 2018 Dec 13;23(12). pii: E3310. doi: 10.3390/molecules23123310))에 보다 상세히 기재되어 있다.
V.C.1. 알파바이러스 생물학
알파바이러스는 토가비리대(Togaviridae) 과의 구성원이며 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 구성원은 전형적으로 신드비스, 로스 리버, 마야로, 치쿤군야 및 셈리키 포레스트 바이러스와 같은 구세계 또는 동부 말 뇌염, 아우라, 포트 모건 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 및 그 유도체 균주 TC-83(Strauss Microbial Review 1994)와 같은 신세계로 분류된다. 천연 알파바이러스 게놈은 전형적으로 약 12 kb 길이이며, 그 처음 2/3는 바이러스 게놈의 자가 복제를 위한 RNA 복제 복합체를 형성하는 비구조 단백질(nsP)을 암호화하는 유전자를 함유하고 마지막 3분의 1은 비리온 생산을 위한 구조 단백질을 암호화하는 서브게놈 발현 카세트를 함유한다(Frolov RNA 2001).
알파바이러스의 모델 생활주기는 몇몇 별개의 단계가 관여된다(Strauss Microbrial Review 1994, Jose Future Microbiol 2009). 바이러스가 숙주 세포에 부착된 후, 비리온은 세포내이입 구획 내의 막과 융합하여 궁극적으로 게놈 RNA의 세포질로의 방출을 초래한다. 플러스 가닥 배향으로 5' 메틸구아닐레이트 캡과 3' 폴리A 꼬리를 포함하는 게놈 RNA는 번역되어 복제 복합체를 형성하는 비구조 단백질 nsP1-4를 생산한다. 이어서 감염 초기에 플러스 가닥은 복합체에 의해 마이너스 스탠드 주형으로 복제된다. 현재 모델에서 복제 복합체는 감염이 진행됨에 따라 추가로 처리되며, 생성된 처리된 복합체는 마이너스 가닥의 전사를 전장 포지티브 가닥 게놈 RNA뿐만 아니라 구조 유전자를 함유하는 26S 서브게놈 포지티브 가닥 RNA로 전환한다. 알파바이러스의 몇몇 보존된 서열 요소(CSE)는 마이너스 가닥 주형으로부터 플러스 가닥 RNA의 복제에서 5' UTR의 상보체, 게놈 주형으로부터 마이너스 가닥 합성의 복제에서 51-nt CSE, 마이너스 가닥으로부터의 서브게놈 RNA의 전사에서 nsP 및 26S RNA 사이의 접합 영역에서 24-nt CSE, 및 플러스 가닥 주형으로부터의 마이너스 가닥 합성에서 3' 19-nt CSE를 포함하는 다양한 RNA 복제 단계에서 잠재적으로 역할을 하는 것으로 확인되었다.
이어서 다양한 RNA 종의 복제 후 바이러스 입자는 전형적으로 바이러스의 자연적 생활주기에서 조립된다. 26S RNA가 번역되고 생성된 단백질은 추가 처리되어 캡시드 단백질, 당단백질 E1 및 E2, 두 개의 작은 폴리펩티드 E3 및 6K를 포함하는 구조 단백질을 생산한다(Strauss 1994). 바이러스 RNA의 캡슐화는 일반적으로 게놈 RNA에만 특이적인 캡시드 단백질이 패키징된 후 비리온 조립 및 막 표면에서의 발아로 발생한다.
V.C.2. 배달 벡터로서의 알파바이러스
알파바이러스(알파바이러스 서열, 특징 및 다른 요소 포함)는 알파바이러스-기반 전달 벡터(알파바이러스 벡터, 알파바이러스 바이러스 벡터, 알파바이러스 백신 벡터, 자가 복제 RNA(srRNA) 벡터 또는 자가 증폭 mRNA(SAM) 벡터로도 지칭됨)를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 알파바이러스는 이전에 발현 벡터 시스템으로 사용하기 위해 조작되었다(Pushko 1997, Rheme 2004). 알파바이러스는 특히 이종 항원 발현이 요망될 수 있는 백신 설정에서 몇몇 장점을 제공한다. 숙주 세포질에서 자가 복제하는 그 능력으로 인해, 알파바이러스 벡터는 일반적으로 높은 수준의 이종 항원 생산을 초래하는 세포 내 높은 카피 수의 발현 카세트를 생산할 수 있다. 또한, 벡터는 일반적으로 일시적이어서 개선된 생체안전성뿐만 아니라 벡터에 대한 면역학적 관용성의 유도 감소를 초래한다. 일반적으로 대중은 인간 아데노바이러스와 같은 다른 표준 바이러스 벡터와 비교할 때 알파바이러스 벡터에 대한 기존 면역성이 부족하다. 알파바이러스 기반 벡터는 또한 일반적으로 감염된 세포에 대해 세포독성 반응을 초래한다. 세포독성은 어느 정도 발현된 이종 항원에 대한 면역 반응을 적절하게 자극하기 위해 백신 설정에서 중요할 수 있다. 그러나 원하는 세포독성의 정도가 균형을 이룰 수 있으므로 VEE의 TC-83 균주를 포함하여 몇몇 약독화된 알파바이러스가 개발되었다. 따라서, 본원에 기재된 항원 발현 벡터의 한 예는 높은 수준의 항원 발현을 허용하고, 항원에 대해 강력한 면역 반응을 자극하고, 벡터 자체에 대한 면역 반응을 자극하지 않는 알파바이러스 골격을 이용할 수 있고, 안전한 방식으로 사용될 수 있다. 또한, 항원 발현 카세트는 VEE 또는 그 약독화된 유도체 TC-83으로부터 유래된 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터가 사용하는 알파바이러스 서열의 최적화를 통해 상이한 수준의 면역 반응을 자극하도록 설계될 수 있다.
몇몇 발현 벡터 설계 전략이 알파바이러스 서열을 사용하여 조작되었다(Pushko 1997). 한 전략에서, 알파바이러스 벡터 설계는 구조 단백질 유전자의 하류에 26S 프로모터 서열 요소의 제2 사본에 이어 이종 유전자를 삽입하는 것을 포함한다(Frolov 1993). 따라서, 천연 비구조 및 구조 단백질에 더하여, 이종 단백질을 발현하는 추가적인 서브게놈 RNA가 생산된다. 이 시스템에는 감염성 비리온의 생산을 위한 모든 요소가 존재하므로 감염되지 않은 세포에서 발현 벡터의 반복 회의 감염이 발생할 수 있다.
또 다른 발현 벡터 설계는 헬퍼 바이러스 시스템을 이용한다(Pushko 1997). 이 전략에서 구조 단백질은 이종 유전자에 의해 대체된다. 따라서, 여전히 온전한 비구조 유전자에 의해 매개되는 바이러스 RNA의 자가 복제에 이어, 26S 서브게놈 RNA가 이종 단백질의 발현을 제공한다. 이어서 전통적으로 구조 단백질을 발현하는 추가적인 벡터가 세포주의 공동 형질감염에 의한 것과 같이 트랜스로 공급되어 감염성 바이러스를 생산한다. 시스템은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, USPN 8,093,021에 상세히 기재되어 있다. 헬퍼 벡터 시스템은 감염성 입자의 형성 가능성을 제한하는 이점을 제공하므로 생물안전성을 개선한다. 또한 헬퍼 벡터 시스템은 전체 벡터 길이를 줄여서 잠재적으로 복제 및 발현 효율을 개선한다. 따라서, 본원에 기재된 항원 발현 벡터의 한 예는 구조 단백질이 항원 카세트로 대체된 알파바이러스 골격을 이용할 수 있으며, 생성 벡터는 생물안전성 우려를 감소시키는 동시에 전반적 발현 벡터 크기의 감소로 인해 효율적인 발현을 촉진한다.
V.C.3. 시험관내 자가 증폭 바이러스 생산
RNA 생산을 위한 당분야에 잘 알려진 편리한 기술은 시험관내 전사(IVT)이다. 이 기술에서, 원하는 벡터의 DNA 주형은 클로닝, 제한 분해, 결찰, 유전자 합성(예를 들어, 화학적 및/또는 효소적 합성), 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 표준 분자 생물학 기술을 포함하는 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 먼저 생산된다.
DNA 주형은 RNA(예를 들어, SAM)로 전사되기 원하는 서열의 5' 말단에 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유한다. 프로모터는 T3, T7, K11 또는 SP6과 같은 박테리오파지 폴리머라제 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 선택된 특정 RNA 폴리머라제 프로모터 서열에 따라, 추가적인 5' 뉴클레오티드가 원하는 서열에 더하여 전사될 수 있다. 예를 들어, 정규 T7 프로모터는 서열 TAATACGACTCACTATAGG로 지칭될 수 있으며, 원하는 서열 N의 생산을 위한 DNA 주형 TAATACGACTCACTATAGGN을 사용하는 IVT 반응이 mRNA 서열 GG-N을 생성할 것이다. 일반적으로 이론에 얽매이지 않고 T7 폴리머라제는 구아노신으로 시작하는 RNA 전사체를 보다 효율적으로 전사한다. 추가적인 5' 뉴클레오티드가 요망되지 않는 경우(예를 들어, 추가적인 GG 없음), DNA 주형에 함유된 RNA 폴리머라제 프로모터는 원하는 서열의 5' 뉴클레오티드만 함유하는 전사체를 생성하는 서열, 예를 들어, SAM 벡터가 유래된 자가 복제 바이러스의 천연 5' 서열을 갖는 SAM일 수 있다. 예를 들어, 최소 T7 프로모터는 서열 TAATACGACTCACTATA로 지칭될 수 있으며, 원하는 서열 N의 생산을 위한 DNA 주형 TAATACGACTCACTATAN을 사용하는 IVT 반응은 mRNA 서열 N을 생성할 것이다. 마찬가지로, 서열 ATTTAGGTGACACTATA에 의해 지칭되는 최소 SP6 프로모터가 사용되어 추가적인 5' 뉴클레오티드 없이 전사체를 생성할 수 있다. 전형적인 IVT 반응에서 DNA 주형은 적절한 RNA 폴리머라제 효소, 완충제 및 뉴클레오티드(NTP)와 함께 인큐베이션된다.
생성된 RNA 폴리뉴클레오티드는 임의로 7-메틸구아노신 또는 관련 구조와 같은 5' 캡 구조의 부가 및 임의로 폴리아데닐레이트(폴리A) 꼬리를 포함하도록 3' 말단을 변형하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않고 추가 변형될 수 있다. 변형된 IVT 반응에서 RNA는 IVT 동안 캡 유사체의 부가를 통해 공동-전사적으로 5' 캡 구조로 캡핑된다. 캡 유사체는 디뉴클레오티드(m7G-ppp-N) 캡 유사체 또는 트리뉴클레오티드(m7G-ppp-N-N) 캡 유사체를 포함할 수 있으며, N은 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 우라딘을 포함하지만 이에 제한되지 않는 리보뉴클레오시드를 나타냄)를 나타낸다. 예시적인 캡 유사체 및 IVT 반응에서의 이의 사용이 또한 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, U.S. 특허 번호 10,519,189에 보다 상세히 기재되어 있다. 논의한 바와 같이, T7 폴리머라제는 구아노신으로 시작하는 RNA 전사체를 보다 효율적으로 전사한다. 구아노신으로 시작하지 않는 주형에서 전사 효율을 개선하기 위해 트리뉴클레오티드 캡 유사체(m7G-ppp-N-N)가 사용될 수 있다. 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 디뉴클레오티드 캡 유사체(m7G-ppp-N)를 사용하는 IVT 반응에 비해 전사 효율을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 이상 증가시킬 수 있다.
5' 캡 구조는 또한 mRNA 2'-O-메틸트랜스퍼라제 및 S-아데노실 메티오닌을 함유하는 백시니아 캡핑 시스템(예를 들어, NEB Cat. No. M2080)을 사용하는 것과 같이 전사 후 부가될 수 있다.
생성된 RNA 폴리뉴클레오티드는 임의로 폴리아데닐레이트(폴리A) 꼬리를 포함하도록 3' 말단을 변형하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기재된 캡핑 기술과 별도로 또는 이에 더하여 추가로 변형될 수 있다.
이어서 RNA는 페놀-클로로포름 추출 또는 칼럼 정제(예를 들어, 크로마토그래피 기반 정제)와 같은 당분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
V.C.4. 지질 나노입자를 통한 전달
백신 벡터 설계에서 고려해야 할 중요한 측면은 벡터 자체에 대한 면역성이다(Riley 2017). 이는 특정 인간 아데노바이러스 시스템과 같은 벡터 자체에 대한 기존 면역성의 형태이거나 백신 투여 후 벡터에 대한 면역성 발생의 형태일 수 있다. 후자는 별도의 프라이밍 및 부스팅 용량과 같이 동일한 백신의 다회 투여가 수행되는 경우 또는 동일한 백신 벡터 시스템이 상이한 항원 카세트를 전달하기 위해 사용되는 경우 중요한 고려사항이다.
알파바이러스 벡터의 경우, 표준 전달 방법은 캡시드, E1 및 E2 단백질을 트랜스로 제공하여 감염성 바이러스 입자를 생산하는 이전에 논의된 헬퍼 바이러스 시스템이다. 그러나 E1 및 E2 단백질이 종종 중화 항체의 주요 표적이라는 점을 주지하는 것이 중요하다(Strauss 1994). 따라서, 감염성 입자가 중화 항체에 의해 표적화되는 경우 표적 세포로 관심 항원을 전달하기 위해 알파바이러스 벡터를 사용하는 유효성이 감소될 수 있다.
바이러스 입자 매개 유전자 전달에 대한 대안은 나노물질을 사용하여 발현 벡터를 전달하는 것이다(Riley 2017). 중요한 것은 나노물질 비히클이 비면역원성 물질로 만들어질 수 있고 일반적으로 전달 벡터 자체에 대한 면역성 자극을 배제할 수 있다는 점이다. 이들 물질은 지질, 무기 나노물질 및 다른 중합체 물질을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 지질은 양이온성, 음이온성 또는 중성일 수 있다. 물질은 합성 또는 자연적으로 유래될 수 있으며 일부 경우에 생분해성일 수 있다. 지질은 지방, 콜레스테롤, 인지질, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 접합체(PEG화 지질)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 지질 접합체, 왁스, 오일, 글리세리드 및 지용성 비타민을 포함할 수 있다.
지질 나노입자(LNP)는 지질의 양친매성 성질로 인해 막 및 소포 유사 구조의 형성을 가능하게 하는 매력적인 전달 시스템이다(Riley 2017). 일반적으로, 이들 소포는 표적 세포의 막으로 흡수되고 핵산을 세포질로 방출함으로써 발현 벡터를 전달한다. 또한 LNP는 특정 세포 유형의 표적화를 용이하게 하기 위해 추가로 변형되거나 기능화될 수 있다. LNP 설계에서 또 다른 고려사항은 표적화 효율과 세포독성 사이의 균형이다. 지질 조성물은 일반적으로 양이온성, 중성, 음이온성 및 양친매성 지질의 정의된 혼합물을 포함한다. 일부 경우에 LNP 응집을 방지하거나, 지질 산화를 방지하거나, 추가적인 모이어티의 부착을 용이하게 하는 기능성 화학기를 제공하기 위해 특정 지질이 포함된다. 지질 조성물은 전반적 LNP 크기와 안정성에 영향을 줄 수 있다. 한 예에서, 지질 조성물은 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트(MC3) 또는 MC3-유사 분자를 포함한다. MC3 및 MC3-유사 지질 조성물은 PEG 또는 PEG-접합 지질, 스테롤 또는 중성 지질과 같은 하나 이상의 다른 지질을 포함하도록 제형화될 수 있다.
혈청에 직접 노출되는 발현 벡터와 같은 핵산 벡터는 혈청 뉴클레아제에 의한 핵산 분해 또는 유리 핵산에 의한 면역계의 표적-외 자극을 포함하는 몇몇 원하지 않는 결과를 가질 수 있다. 따라서, 알파바이러스 벡터의 캡슐화는 분해를 배제하는 동시에 잠재적인 표적-외 효과를 배제하기 위해 사용될 수 있다. 특정 예에서, 알파바이러스 벡터는 LNP의 수성 내부와 같은 전달 비히클 내에 완전히 캡슐화된다. LNP 내 알파바이러스 벡터의 캡슐화는 미세유체 액적 생성 장치에서 수행되는 미세유체 혼합 및 액적 생성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 이러한 장치는 표준 T-접합 장치 또는 흐름 집속 장치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 예에서, MC3 또는 MC3-유사 함유 조성물과 같은 원하는 지질 제형물은 전달 벡터 및 원하는 제제가 MC3 또는 MC3 유사 기반 LNP의 내부 내에 완전히 캡슐화되도록 알파바이러스 전달 벡터 및 다른 원하는 제제와 병행하여 액적 생성 장치에 제공된다. 한 예에서, 액적 생성 장치는 생산된 LNP의 크기 범위 및 크기 분포를 제어할 수 있다. 예를 들어, LNP는 1 내지 1000나노미터, 예를 들어 1, 10, 50, 100, 500 또는 1000나노미터 지름 범위의 크기를 가질 수 있다. 액적 생성 후, 발현 벡터를 캡슐화하는 전달 비히클은 이를 투여를 위해 제조하기 위해 추가로 처리되거나 변형될 수 있다.
V.D. 침팬지 아데노바이러스(ChAd)
V.D.1. 침팬지 아데노바이러스를 사용한 바이러스 전달
하나 이상의 항원을(예를 들어, 항원 카세트를 통해) 전달하기 위한 백신 조성물은 침팬지 기원의 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열, 다양한 신규 벡터 및 침팬지 아데노바이러스 유전자를 발현하는 세포주를 제공함으로써 생성될 수 있다.　침팬지 C68 아데노바이러스(본원에서 ChAdV68로도 지칭됨)의 뉴클레오티드 서열이 항원 전달용 백신 조성물에서 사용될 수 있다(서열 번호 1 참고). C68 아데노바이러스 유래 벡터의 사용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, USPN 6,083,716에 보다 상세히 기재되어 있다. ChAdV68 기반 벡터 및 전달 시스템은 각각 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 출원 공개 번호 US20200197500A1 및 국제 특허 출원 공개 WO2020243719A1에 상세히 기재되어 있다.
추가 측면에서, C68과 같은 침팬지 아데노바이러스의 DNA 서열 및 그 발현을 지시하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 항원 카세트를 포함하는 재조합 아데노바이러스가 본원에 제공된다. 재조합 바이러스는 포유동물, 바람직하게는 인간 세포를 감염시킬 수 있고 세포에서 항원 카세트 산물을 발현할 수 있다. 이 벡터에서, 천연 침팬지 E1 유전자 및/또는 E3 유전자 및/또는 E4 유전자가 결실될 수 있다. 항원 카세트는 임의의 이러한 유전자 결실 부위에 삽입될 수 있다. 항원 카세트는 프라이밍된 면역 반응이 요망되는 항원을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, C68과 같은 침팬지 아데노바이러스로 감염된 포유동물 세포가 본원에 제공된다.　
여전히 추가 측면에서, 침팬지 아데노바이러스 유전자(예를 들어, C68 유래) 또는 이의 기능적 단편을 발현하는 신규 포유동물 세포주가 제공된다.　
또 다른 측면에서, 항원 카세트를 발현하도록 조작된 C68과 같은 침팬지 아데노바이러스의 유효량을 세포로 도입하는 단계를 포함하는, 항원 카세트를 포유동물 세포로 전달하는 방법이 본원에 제공된다.　
또 다른 측면은 암을 치료하기 위해 포유동물 숙주에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 이 방법은 면역 반응이 표적화되는 종양으로부터의 하나 이상의 항원을 암호화하는 항원 카세트를 포함하는 C68과 같은 재조합 침팬지 아데노바이러스의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면은 감염성 질환과 같은 대상체의 질환을 치료하거나 방지하기 위해 포유동물 숙주에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들어 면역 반응이 표적화되는 감염성 질환으로부터와 같은 하나 이상의 항원을 암호화하는 항원 카세트를 포함하는 C68과 같은 재조합 침팬지 아데노바이러스의 유효량을 숙주에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 서열 번호 1의 서열로부터 얻은 침팬지 아데노바이러스 유전자를 발현하는 비-원숭이 포유동물 세포가 개시된다. 유전자는 서열 번호 1의 아데노바이러스 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 서열 번호 1의 서열로부터 얻은 유전자를 포함하는 침팬지 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자가 개시된다.　이 유전자는 서열 번호 1의 상기 침팬지 아데노바이러스 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.　일부 측면에서 핵산 분자는 서열 번호 1을 포함한다.　일부 측면에서 핵산 분자는 서열 번호 1의 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 결여된 서열 번호 1의 서열을 포함한다.　
또한 서열 번호 1로부터 얻은 침팬지 아데노바이러스 DNA 서열 및 이종 숙주 세포에서 카세트의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 항원 카세트를 포함하는 벡터가 개시되며, 임의로 침팬지 아데노바이러스 DNA 서열은 적어도 복제 및 비리온 캡슐화에 필요한 시스-요소를 포함하고, 시스-요소는 항원 카세트 및 조절 서열의 측면에 있다.　일부 측면에서, 침팬지 아데노바이러스 DNA 서열은 서열 번호 1의 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자 서열로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 벡터에는 E1A 및/또는 E1B 유전자가 결여될 수 있다.
또한 결실되거나 부분 결실된 E4orf2 영역 및 결실되거나 부분 결실된 E4orf3 영역, 그리고 임의로 결실되거나 부분 결실된 E4orf4 영역을 포함하는 부분 결실된 E4 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터가 본원에 개시된다. 부분 결실된 E4는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,916 내지 35,642의 E4 결실을 포함할 수 있고, 벡터는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 2 내지 36,518을 포함한다. 부분 결실된 E4는 서열 번호 1에 제시된 서열의 뉴클레오티드 34,916 내지 34,942의 적어도 부분 결실, 서열 번호 1에 제시된 서열의 뉴클레오티드 34,952 내지 35,305의 적어도 부분 결실, 및 서열 번호 1에 제시된 서열의 뉴클레오티드 35,302 내지 35,642의 적어도 부분 결실의 E4 결실을 포함할 수 있고, 벡터는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 2 내지 36,518을 포함한다 부분 결실된 E4 벡터는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,980 내지 36,516의 E4 결실을 포함할 수 있고, 벡터는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 2 내지 36,518을 포함한다. 부분 결실된 E4는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,979 내지 35,642의 E4 결실을 포함할 수 있고, 벡터는 서열 번호 1에 제시된 서열의 적어도 뉴클레오티드 2 내지 36,518을 포함한다. 부분 결실된 E4는 E4Orf2의 적어도 부분 결실, 완전 결실된 E4Orf3, 및 E4Orf4의 적어도 부분 결실의 E4 결실을 포함할 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf2의 적어도 부분 결실, E4Orf3의 적어도 부분 결실, 및 E4Orf4의 적어도 부분 결실의 E4 결실을 포함할 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf1의 적어도 부분 결실, 완전 결실된 E4Orf2, 및 E4Orf3의 적어도 부분 결실의 E4 결실을 포함할 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf2의 적어도 부분 결실 및 E4Orf3의 적어도 부분 결실의 E4 결실을 포함할 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf1의 시작 부위 내지 E4Orf5의 시작 부위의 E4 결실을 포함할 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf1의 시작 부위에 인접한 E4 결실일 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf2의 시작 부위에 인접한 E4 결실일 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf3의 시작 부위에 인접한 E4 결실일 수 있다. 부분 결실된 E4는 E4Orf4의 시작 부위에 인접한 E4 결실일 수 있다. E4 결실은 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1100, 적어도 1200, 적어도 1300, 적어도 1400, 적어도 1500, 적어도 1600, 적어도 1700, 적어도 1800, 적어도 1900, 또는 적어도 2000개의 뉴클레오티드일 수 있다. E4 결실은 적어도 700개의 뉴클레오티드일 수 있다. E4 결실은 적어도 1500개의 뉴클레오티드일 수 있다. E4 결실은 50개 이하, 100개 이하, 200개 이하, 300개 이하, 400개 이하, 500개 이하, 600개 이하, 700개 이하, 800개 이하, 900개 이하, 1000개 이하, 1100개 이하, 1200개 이하, 1300개 이하, 1400개 이하, 1500개 이하, 1600개 이하, 1700개 이하, 1800개 이하, 1900개 이하, 또는 2000개 뉴클레오티드 이하일 수 있다. E4 결실은 750개 뉴클레오티드 이하일 수 있다. E4 결실은 적어도 1550개 뉴클레오티드 이하일 수 있다.
부분 결실된 E4 유전자는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,916 내지 35,642가 결여된 서열 번호 1에 나타낸 E4 유전자 서열일 수 있다. 부분 결실된 E4 유전자는 서열 번호 1에 나타낸 E4 유전자 서열이 결여되고 서열 번호 1에 나타낸 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,916 내지 34,942, 뉴클레오티드 34,952 내지 35,305, 및 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 35,302 내지 35,642가 결여된 서열 번호 1에 나타낸 E4 유전자 서열일 수 있다. 부분 결실된 E4 유전자는 서열 번호 1에 나타내고 서열 번호 1에 나타낸 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,980 내지 36,516이 결여된 E4 유전자 서열일 수 있다. 부분 결실된 E4 유전자는 서열 번호 1에 나타내고 서열 번호 1에 나타낸 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,979 내지 35,642가 결여된 E4 유전자 서열일 수 있다. 부분 결실된 E4 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터는 카세트를 가질 수 있고, 카세트는 적어도 하나의 페이로드 핵산 서열을 포함하고, 카세트는 적어도 하나의 페이로드 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함한다. 부분 결실된 E4 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1에 나타낸 ChAdV68 서열의 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열을 가질 수 있으며, 임의로 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열은 서열 번호 1에 나타낸 서열의 침팬지 아데노바이러스 역방위 말단 반복(ITR), E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4, 및 L5 유전자 중 적어도 하나를 포함한다. 부분 결실된 E4 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 2 내지 34,916을 가질 수 있고, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 2 내지 34,916의 3'이고, 임의로 뉴클레오티드 2 내지 34,916은 추가로 E1 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 577 내지 3403이 결여되고/되거나 해당 E3 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 27,125 내지 31,825가 결실되어 있다. 부분 결실된 E4 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 35,643 내지 36,518을 가질 수 있고, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 35,643 내지 36,518의 5'이다. 부분 결실된 E4 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 2 내지 34,916을 가질 수 있으며, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 2 내지 34,916의 3'이고, 뉴클레오티드 2 내지 34,916은 추가로 E1 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 577 내지 3403이 결여되고 E3 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 27,125 내지 31,825가 결여되어 있다. 부분 결실된 E4 유전자를 갖는 아데노바이러스 벡터는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 2 내지 34,916을 가질 수 있으며, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 2 내지 34,916의 3'이고, 뉴클레오티드 2 내지 34,916은 추가로 E1 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 577 내지 3403이 결여되고 E3 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 27,125 내지 31,825가 결여되고, 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 35,643 내지 36,518을 갖고, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 35,643 내지 36,518의 5'이다.
부분 결실된 E4 유전자는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 적어도 뉴클레오티드 34,916 내지 35,642가 결여된, 서열 번호 1에 나타낸 E4 유전자 서열, 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 2 내지 34,916일 수 있고, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 2 내지 34,916의 3'이고, 뉴클레오티드 2 내지 34,916은 E1 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 577 내지 3403이 추가로 결여되고 E3 결실에 상응하는 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 27,125 내지 31,825가 결여되고, 서열 번호 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 35,643 내지 36,518을 갖고, 부분 결실된 E4 유전자는 뉴클레오티드 35,643 내지 36,518의 5'이다.
또한 항원 카세트를 발현하도록 조작된 C68 벡터와 같은 본원에 개시된 벡터로 형질감염된 숙주 세포가 본원에 개시된다.　또한 본원에 개시된 벡터를 세포에 도입함으로써 여기에 도입된 선택된 유전자를 발현하는 인간 세포가 본원에 개시된다.
또한 항원 카세트를 발현하도록 조작된 C68 벡터와 같은 본원에 개시된 벡터의 유효량을 포유동물 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 항원 카세트를 포유동물 세포에 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
또한 본원에 개시된 벡터를 포유동물 세포에 도입하는 단계, 적합한 조건 하에 세포를 배양하는 단계 및 항원을 제조하는 단계를 포함하는, 항원을 제조하는 방법이 본원에 개시된다.
V.D.2. E1-발현 보완 세포주
본원에 기재된 임의의 유전자에서 결실된 재조합 침팬지 아데노바이러스(Ad)를 생성하기 위해, 결실된 유전자 영역의 기능은 바이러스의 복제 및 감염성에 필수적인 경우 헬퍼 바이러스 또는 세포주, 즉 보완 또는 패키징 세포주에 의해 재조합 바이러스에 공급될 수 있다. 예를 들어, 복제 결함 침팬지 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위해 인간 또는 침팬지 아데노바이러스의 E1 유전자 산물을 발현하는 세포주가 사용될 수 있다; 이러한 세포주는 HEK293 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 침팬지 E1 유전자 산물을 발현하는 세포주의 생성을 위한 프로토콜(USPN 6,083,716의 실시예 3 및 4)에 따라 임의의 선택된 침팬지 아데노바이러스 유전자를 발현하는 세포주를 생성할 수 있다.　
AAV 증강 검정이 침팬지 아데노바이러스 E1-발현 세포주를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 검정은 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 특성규명되지 않은 아데노바이러스의 E1 유전자를 사용하여 만들어진 세포주에서 E1 기능을 확인하는 데 유용하다. 그 검정은 USPN 6,083,716의 실시예 4B에 기재되어 있다.　
선택된 침팬지 아데노바이러스 유전자, 예를 들어 E1은 선택된 모 세포주에서의 발현을 위한 프로모터의 전사 제어 하에 있을 수 있다. 유도성 또는 구성적 프로모터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 유도 가능한 프로모터 중에는 아연에 의해 유도 가능한 양 메탈로티오닌 프로모터, 또는 글루코코르티코이드, 특히 덱사메타손에 의해 유도 가능한 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터가 포함된다. 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 WO95/13392에서 확인된 것들과 같은 다른 유도성 프로모터도 패키징 세포주의 생산에서 사용될 수 있다. 침팬지 아데노바이러스 유전자의 발현을 제어하는 구성적 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
임의의 원하는 C68 유전자를 발현하는 신규 세포주의 생성을 위해 모 세포가 선택될 수 있다. 비제한적으로, 이러한 모 세포주는 HeLa[ATCC 접근 번호 CCL 2], A549[ATCC 접근 번호 CCL 185], KB[CCL 17], Detroit[예를 들어, Detroit 510, CCL 72] 및 WI-38[CCL 75] 세포일 수 있다. 다른 적합한 모 세포주는 다른 공급원에서 얻을 수 있다.　모 세포주는 CHO, HEK293 또는 이의 변이체, 911, HeLa, A549, LP-293, PER.C6, 또는 AE1-2a를 포함할 수 있다.
E1-발현 세포주는 재조합 침팬지 아데노바이러스 E1 결실 벡터의 생성에서 유용할 수 있다. 본질적으로 하나 이상의 다른 침팬지 아데노바이러스 유전자 산물을 발현하는 것과 동일한 절차를 사용하여 작제된 세포주는 이러한 산물을 암호화하는 유전자에서 결실된 재조합 침팬지 아데노바이러스 벡터의 생성에서 유용하다.　또한, 다른 인간 Ad E1 유전자 산물을 발현하는 세포주가 또한 침팬지 재조합 Ad를 생성하는 데 유용하다.　
V.D.3. 벡터로서의 재조합 바이러스 입자
본원에 개시된 조성물은 적어도 하나의 항원을 세포에 전달하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 C68과 같은 침팬지 아데노바이러스 DNA 서열 및 카세트의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 항원 카세트를 포함한다. C68 벡터는 감염된 포유동물 세포에서 카세트를 발현할 수 있다. C68 벡터는 하나 이상의 바이러스 유전자에서 기능적으로 결실될 수 있다. 항원 카세트는 프로모터와 같은 하나 이상의 조절 서열의 제어 하에 적어도 하나의 항원을 포함한다. 선택적인 헬퍼 바이러스 및/또는 패키징 세포주는 침팬지 바이러스 벡터에 결실된 아데노바이러스 유전자의 임의의 필요한 산물을 공급할 수 있다.　
용어 "기능적으로 결실된"은 유전자 영역이 유전자 발현의 하나 이상의 기능적 산물을 더 이상 생산할 수 없도록 충분한 양의 유전자 영역이 제거되거나, 예를 들어 돌연변이 또는 변형에 의해 달리 변경됨을 의미한다. 기능적 결실을 초래할 수 있는 돌연변이 또는 변형은 조기 정지 코돈의 도입 그리고 정규 및 비정규 시작 코돈의 제거와 같은 논센스 돌연변이, mRNA 스플라이싱 또는 다른 전사 처리를 변경하는 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 원하는 경우, 전체 유전자 영역이 제거될 수 있다.
서열 결실, 삽입 및 다른 돌연변이를 포함하는 본원에 개시된 벡터를 형성하는 핵산 서열의 변형은 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 생성될 수 있으며 본 발명의 범위 내에 있다.　
V.D.4. 바이러스성 플라스미드 벡터의 작제
본 발명에서 유용한 침팬지 아데노바이러스 C68 벡터는 재조합 결함 아데노바이러스, 즉 E1a 또는 E1b 유전자에서 기능적으로 결실되고 임의로 다른 돌연변이, 예를 들어 다른 유전자에서 온도-민감성 돌연변이 또는 결실을 보유하는 침팬지 아데노바이러스 서열을 포함한다. 이들 침팬지 서열은 또한 다른 아데노바이러스 및/또는 아데노 관련 바이러스 서열로부터 하이브리드 벡터를 형성하는 데 유용할 것으로 예상된다. 인간 아데노바이러스로부터 제조된 동종 아데노바이러스 벡터는 공개된 문헌[예를 들어, 상기 인용된 Kozarsky I 및 II, 및 여기에 인용된 참고문헌, U.S. 특허 번호 5,240,846]에 기재되어 있다.　
항원 카세트를 인간(또는 다른 포유동물) 세포로 전달하기 위해 유용한 침팬지 아데노바이러스 C68 벡터의 작제에서, 다양한 아데노바이러스 핵산 서열이 벡터에서 사용될 수 있다. 최소 침팬지 C68 아데노바이러스 서열을 포함하는 벡터가 감염성 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위해 헬퍼 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 바이러스 감염 및 최소 침팬지 아데노바이러스 벡터의 전파에 필요한 필수 유전자 산물을 제공한다. 다른 기능적 바이러스 벡터에서 침팬지 아데노바이러스 유전자의 하나 이상의 선택된 결실이 만들어질 때, 결실된 유전자 산물은 결실된 유전자 기능을 트랜스로 제공하는 선택된 패키징 세포주에서 바이러스를 번식시켜 바이러스 벡터 생산 공정에 공급될 수 있다.
V.D.5. 재조합 최소 아데노바이러스
최소 침팬지 Ad C68 바이러스는 복제 및 비리온 캡슐화에 필요한 아데노바이러스 시스-요소만을 포함하는 바이러스 입자이다. 즉, 벡터는 아데노바이러스의 시스-작용 5' 및 3' 역방위 말단 반복(ITR) 서열(복제 기점으로 기능함) 및 천연 5' 패키징/인핸서 도메인(선형 Ad 게놈의 패키징에 필요한 서열 및 E1 프로모터에 대한 인핸서 요소 함유)을 함유한다. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO96/13597에서 "최소" 인간 Ad 벡터의 제조에 대해 기재되고 본원에 참조로 포함된 기술을 참고한다.
V.D.6. 다른 결함 아데노바이러스
재조합, 복제 결핍 아데노바이러스는 또한 최소 침팬지 아데노바이러스 서열보다 많이 함유할 수 있다. 이들 다른 Ad 벡터는 바이러스의 유전자 영역의 다양한 부분의 결실 및 헬퍼 바이러스 및/또는 패키징 세포주의 선택적 사용에 의해 형성된 감염성 바이러스 입자를 특징으로 할 수 있다.　
하나의 예로서, 적합한 벡터는 이의 정상적인 생물학적 기능을 제거하기 위해 C68 아데노바이러스 최조기 유전자 E1a 및 지연된 조기 유전자 E1b의 전부 또는 충분한 부분을 결실시켜 형성될 수 있다. 복제 결함 E1-결실 바이러스는 트랜스로 상응하는 유전자 산물을 제공하는 기능적 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 함유하는 침팬지 아데노바이러스-형질전환, 보완 세포주 상에서 성장시킬 때 감염성 바이러스를 복제하고 생산할 수 있다. 알려진 아데노바이러스 서열에 대한 상동성에 기반하여, 당분야의 인간 재조합 E1-결실 아데노바이러스에 대해 해당되는 바와 같이, 생성된 재조합 침팬지 아데노바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있고 항원(들)을 발현할 수 있지만, 세포가 매우 높은 감염 다중도로 감염되지 않는 한 침팬지 E1 영역 DNA를 보유하지 않는 대부분의 세포에서는 복제할 수 없을 것으로 예상된다.　
또 다른 예로서, C68 아데노바이러스 지연된 조기 유전자 E3의 전부 또는 일부가 재조합 바이러스의 일부를 형성하는 침팬지 아데노바이러스 서열로부터 제거될 수 있다.
E4 유전자의 결실을 갖는 침팬지 아데노바이러스 C68 벡터도 작제될 수 있다. 또 다른 벡터는 지연된 조기 유전자 E2a에서 결실을 함유할 수 있다.　
또한 침팬지 C68 아데노바이러스 게놈의 임의의 후기 유전자 L1 내지 L5에서도 결실이 이루어질 수 있다. 마찬가지로, 중간 유전자 IX 및 IVa2에서의 결실은 일부 목적을 위해 유용할 수 있다. 다른 구조 또는 비구조 아데노바이러스 유전자에서 다른 결실이 이루어질 수 있다.　
상기 논의된 결실은 개별적으로 사용될 수 있다. 즉, 아데노바이러스 서열은 E1의 결실만을 함유할 수 있다. 대안적으로, 이의 생물학적 활성을 파괴하거나 감소시키는 데 효과적인 전체 유전자 또는 이의 일부의 결실이 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 예시적인 벡터에서, 아데노바이러스 C68 서열은 E1 유전자 및 E4 유전자, 또는 E1, E2a 및 E3 유전자, 또는 E1 및 E3 유전자, 또는 E1, E2a 및 E4 유전자의 결실을 E3 등을 결실하거나 결실하지 않고 가질 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 결실은 원하는 결과를 달성하기 위해 온도 민감성 돌연변이와 같은 다른 돌연변이와 조합으로 사용될 수 있다.　
항원(들)을 포함하는 카세트는 임의로 침팬지 C68 Ad 바이러스의 임의의 결실된 영역에 삽입될 수 있다. 대안적으로 카세트는 원하는 경우 해당 영역의 기능을 손상시키기 위해 기존 유전자 영역에 삽입될 수 있다.　
V.D.7. 헬퍼 바이러스
항원 카세트를 운반하기 위해 사용되는 바이러스 벡터의 침팬지 아데노바이러스 유전자 내용물에 따라, 헬퍼 아데노바이러스 또는 비복제 바이러스 단편이 카세트를 함유하는 감염성 재조합 바이러스 입자를 생산하기 충분한 침팬지 아데노바이러스 유전자 서열을 제공하기 위해 사용될 수 있다.　
유용한 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 벡터 작제물에 존재하지 않고/않거나 벡터가 형질감염되는 패키징 세포주에 의해 발현되지 않는 선택된 아데노바이러스 유전자 서열을 함유한다. 헬퍼 바이러스는 복제 결함이 있을 수 있으며 상술된 서열에 더하여 다양한 아데노바이러스 유전자를 함유할 수 있다. 헬퍼 바이러스는 본원에 기재된 E1-발현 세포주와 조합으로 사용될 수 있다.　
C68의 경우 "헬퍼" 바이러스는 C68 게놈의 C 말단을 SspI로 잘라서 형성된 단편일 수 있으며, 이는 바이러스의 왼쪽 말단으로부터 약 1300 bp를 제거한다. 이 잘린 바이러스는 플라스미드 DNA와 함께 E1-발현 세포주에 공동 형질감염되어 플라스미드의 C68 서열과 상동 재조합에 의해 재조합 바이러스를 형성한다.　
헬퍼 바이러스는 문헌(Wu et al, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989); K. J. Fisher 및 J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (Apr. 1, 1994))에 기재된 바와 같이 다중-양이온 접합체로 형성될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 임의로 리포터 유전자를 함유할 수 있다. 다수의 이러한 리포터 유전자는 당분야에 알려져 있다. 아데노바이러스 벡터의 항원 카세트와 상이한 헬퍼 바이러스 상의 리포터 유전자의 존재는 Ad 벡터와 헬퍼 바이러스 둘 모두의 독립적 모니터링을 허용한다. 이 제2 리포터는 정제 시 생성된 재조합 바이러스와 헬퍼 바이러스 간 분리를 가능하게 하기 위해 사용된다.
V.D.8. 바이러스 입자의 조립 및 세포주의 감염
아데노바이러스의 선택된 DNA 서열, 항원 카세트 및 다른 벡터 요소의 다양한 중간 플라스미드 및 셔틀 벡터로의 조립 그리고 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 플라스미드 및 벡터의 사용은 모두 통상적 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 기술은 cDNA의 통상적인 클로닝 기술, 시험관내 재조합 기술(예를 들어, 깁슨 조립), 아데노바이러스 게놈의 중첩 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 폴리머라제 연쇄 반응, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 임의의 적합한 방법을 포함한다. 표준 형질감염 및 공동-형질감염 기술, 예를 들어 CaPO4 침전 기술 또는 리포펙타민과 같은 리포좀-매개 형질감염 방법이 사용된다. 사용되는 다른 통상적인 방법은 바이러스 게놈의 상동 재조합, 한천 오버레이에서의 바이러스 플라크화, 신호 생성을 측정하는 방법 등을 포함한다.　
예를 들어, 원하는 항원 카세트 함유 바이러스 벡터의 작제 및 조립 후, 벡터는 패키징 세포주로 헬퍼 바이러스의 존재 하에 시험관내 형질감염될 수 있다. 헬퍼와 벡터 서열 사이에 상동 재조합이 발생하며, 이는 벡터의 아데노바이러스-항원 서열이 복제되고 비리온 캡시드로 패키징되어 재조합 바이러스 벡터 입자를 생성하도록 한다.
생성된 재조합 침팬지 C68 아데노바이러스는 항원 카세트를 선택된 세포로 옮기는 데 유용하다. 패키징 세포주에서 성장시킨 재조합 바이러스를 사용한 생체내 실험에서, E1-결실 재조합 침팬지 아데노바이러스는 비-침팬지 세포, 바람직하게는 인간 세포에 카세트를 전달하는 데 있어서 유용성을 실증한다.　
V.D.9. 재조합 바이러스 벡터의 사용
따라서 항원 카세트(상술된 바와 같이 아데노바이러스 벡터와 헬퍼 바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 패키징 세포주의 협력에 의해 생산됨)를 함유하는 생성된 재조합 침팬지 C68 아데노바이러스는 대상체에 항원(들)을 생체내 또는 시험관내 전달할 수 있는 효율적인 유전자 전달 비히클을 제공한다.
상술된 재조합 벡터는 공개된 유전자 치료법 방법에 따라 인간에게 투여된다. 항원 카세트를 보유하는 침팬지 바이러스 벡터는 환자에게 투여될 수 있으며, 바람직하게는 생물학적으로 상용성인 용액 또는 약학적으로 허용 가능한 전달 비히클에 현탁된다. 적합한 비히클은 멸균 식염수를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로 알려져 있고 당업자에게 잘 알려진 다른 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액 그리고 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.　
침팬지 아데노바이러스 벡터는 인간 세포를 형질도입하고 충분한 수준의 항원 전달 및 발현을 제공하기 충분한 양으로 투여되어 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있는 과도한 유해 효과 없이 또는 의학적으로 허용 가능한 생리적 효과와 함께 치료 이점을 제공한다. 통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로는 간으로의 직접 전달, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경구 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 원하는 경우 투여 경로는 조합될 수 있다.　
바이러스 벡터의 투여량은 주로 치료되는 병태, 환자의 연령, 체중 및 건강과 같은 요인에 의존할 것이며 이에 따라 환자마다 다를 수 있다. 투여량은 임의의 부작용에 대한 치료적 이점의 균형을 맞추도록 조정될 것이며 이러한 투여량은 재조합 벡터가 사용되는 치료 적용에 따라 달라질 수 있다. 항원(들)의 발현 수준이 모니터링되어 투여량 투여의 빈도를 결정할 수 있다.　
재조합, 복제 결함 아데노바이러스는 "약학 유효량", 즉 원하는 세포를 형질감염시키고 백신 이점, 즉 일부 측정 가능한 수준의 보호 면역성을 제공하기 충분한 수준의 선택된 유전자 발현을 제공하는 투여 경로에서 효과적인 재조합 아데노바이러스의 양으로 투여될 수 있다.　항원 카세트를 포함하는 C68 벡터는 보조제와 공동 투여될 수 있다. 보조제는 특히 보조제가 단백질인 경우 벡터(예를 들어, 명반)로부터 분리되거나 벡터 내에서 암호화될 수 있다. 보조제는 당분야에 잘 알려져 있다.
통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로는 비강내, 근육내, 기관내, 피하, 피내, 직장, 경구 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 투여 경로는 원할 경우 조합되거나 면역원 또는 질환에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어 광견병 예방에서는 피하, 기관내 및 비강내 경로가 선호된다. 투여 경로는 주로 치료되는 질환의 성질에 의존할 것이다.　
항원(들)에 대한 면역성 수준이 모니터링되어 필요한 경우 부스터에 대한 필요성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 혈청 중 항체 역가를 평가한 후, 선택적 부스터 면역화가 요망될 수 있다.
VI. 치료 및 제조 방법
또한 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인된 복수의 항원과 같은 하나 이상의 항원을 대상체에 투여함으로써 대상체에서 종양 특이적 면역 반응을 자극하고, 종양에 대해 백신접종하고, 대상체에서 암의 증상을 치료 및/또는 완화하는 방법이 제공된다.
또한, 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인된 복수의 항원과 같은 하나 이상의 항원을 대상체에 투여함으로써 대상체에서 감염성 질환 유기체 특이적 면역 반응을 자극하고, 감염성 질환 유기체에 대해 백신접종하고, 대상체에서 감염성 질환 유기체와 관련된 감염 증상을 치료 및/또는 완화하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 대상체는 암으로 진단받았거나 암이 발생할 위험이 있다. 대상체는 인간, 개, 고양이, 말 또는 종양 특이적 면역 반응이 요망되는 임의의 동물일 수 있다. 종양은 유방, 난소, 전립샘, 폐, 신장, 위, 결장, 정소, 두경부, 췌장, 뇌, 흑색종 및 조직 장기의 다른 종양 그리고 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, T 세포 림프구성 백혈병 및 B 세포 림프종을 포함하는 림프종 및 백혈병과 같은 혈액학적 종양과 같은 임의의 고형 종양일 수 있다.　
일부 측면에서, 대상체는 감염으로 진단받았거나 감염 위험이 있다(예를 들어, 감염에 대한 나이, 지리/여행, 및/또는 작업 관련 증가된 위험 또는 소인, 또는 계절성 및/또는 새로운 질환 감염에 대한 위험).
항원은 CTL 반응을 자극하기 충분한 양으로 투여될 수 있다.　항원은 T 세포 반응을 자극하기 충분한 양으로 투여될 수 있다. 항원은 B 세포 반응을 자극하기 충분한 양으로 투여될 수 있다. 항원은 T 세포 반응과 B 세포 반응 둘 모두를 자극하기 충분한 양으로 투여될 수 있다.
항원은 단독 또는 다른 치료제와 조합으로 투여될 수 있다. 치료제는 항바이러스제 또는 항생제와 같은 감염성 질환 유기체를 표적화하는 것들을 포함할 수 있다.
또한, 대상체는 체크포인트 억제제와 같은 항면역억제/면역자극제가 추가로 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 항-CTLA 항체 또는 항-PD-1 또는 항-PD-L1이 추가로 투여될 수 있다. 항체에 의한 CTLA-4 또는 PD-L1의 차단은 환자에서 암 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 특히, CTLA-4 차단은 백신접종 프로토콜을 따를 때 효과적인 것으로 나타났다.
백신 조성물에 포함될 각각의 항원의 최적량 및 최적 투여 요법이 결정될 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 그 변이체는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사를 위해 제조될 수 있다. 주사 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m. 및 i.v.를 포함한다. DNA 또는 RNA 주사 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.를 포함한다. 백신 조성물의 다른 투여 방법은 당업자에게 알려져 있다.
백신은 조성물에 존재하는 항원의 선택, 수 및/또는 양이 조직, 암, 감염성 질환 및/또는 환자 특이적이도록 편집될 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 정확한 선택은 주어진 조직에서 모 단백질의 발현 패턴에 의해 안내되거나 환자의 돌연변이 또는 질환 상태에 의해 안내될 수 있다. 선택은 암의 특정 유형, 특정 감염성 질환(예를 들어, 대상체가 감염되었거나 감염 위험이 있는 특정 감염성 질환 단리물/균주), 질환의 상태, 백신접종의 목표(예를 들어, 진행 중인 질환의 방지 또는 표적화), 조기 치료 요법, 환자의 면역 상태, 그리고 물론 환자의 HLA-일배체형에 의존할 수 있다. 또한, 백신은 특정 환자의 개인적 필요성에 따라 개별화된 성분을 함유할 수 있다. 예는 특정 환자의 항원 발현에 따른 항원 선택의 변경 또는 1차 치료 또는 치료 방식에 따른 2차 치료에 대한 조정을 포함한다.　
환자는 다양한 진단 방법, 예를 들어 아래에 추가로 기재된 환자 선택 방법을 사용하여 항원 백신의 투여에 대해 확인될 수 있다. 환자 선택에는 하나 이상의 유전자의 돌연변이 또는 그 발현 패턴을 확인하는 것이 관여될 수 있다. 환자 선택에는 진행 중인 감염의 감염성 질환을 확인하는 것이 관여될 수 있다. 환자 선택에는 감염성 질환에 의한 감염 위험을 확인하는 것이 관여될 수 있다. 일부 경우에, 환자 선택에는 환자의 일배체형을 확인하는 것이 관여된다. 다양한 환자 선택 방법이 병렬로 수행될 수 있으며, 예를 들어 시퀀싱 진단은 환자의 돌연변이 및 일배체형 둘 모두를 확인할 수 있다. 다양한 환자 선택 방법은 순차적으로 수행될 수 있으며, 예를 들어, 하나의 진단 시험이 돌연변이를 확인하고 별도의 진단 시험이 환자의 일배체형을 확인하며, 각각의 시험은 동일하거나(예를 들어, 둘 모두 고처리량 시퀀싱) 상이한(예를 들어, 하나는 고처리량 시퀀싱이고 다른 다른 하나는 생거(Sanger) 시퀀싱인) 진단 방법일 수 있다.
암 또는 감염성 질환에 대한 백신으로 사용될 조성물의 경우, 정상 조직에서 다량으로 발현되는 유사한 정상 자가-펩티드를 갖는 항원은 회피하거나 본원에 기재된 조성물에 소량으로 존재할 수 있다. 한편, 환자의 종양 또는 감염된 세포가 특정 항원을 다량 발현하는 것으로 알려진 경우, 이 암 또는 감염의 치료를 위한 각각의 약학 조성물이 다량으로 존재할 수 있고/있거나 이 특정 항원에 특이적인 하나 초과의 항원 또는 이 항원의 경로가 포함될 수 있다.　
항원을 포함하는 조성물은 이미 암 또는 감염을 앓고 있는 개체에 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 종양 항원 또는 감염성 질환 유기체 항원에 대한 효과적인 CTL 반응을 자극하고 증상 및/또는 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 대상체에 투여된다. 이를 달성하기 적절한 양이 "치료 유효 용량"으로 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 예를 들어 조성, 투여 방식, 치료되는 질환의 단계 및 중증도, 환자의 체중 및 일반 건강 상태, 그리고 처방의의 판단에 의존할 것이다. 조성물은 일반적으로 심각한 질환 상태, 즉 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황, 특히 암이 전이되었거나 감염성 질환 유기체가 장기 손상 및/또는 다른 면역 병리를 유도했을 때 사용될 수 있음을 명심해야 한다. 이러한 경우에, 외인성 물질의 최소화 및 항원의 상대적 비독성 성질의 관점에서, 치료의가 이들 조성물의 실질적 과량을 투여하는 것이 가능하고 바람직하다고 느낄 수 있다.
치료적 사용을 위해, 투여는 종양의 검출 또는 외과적 제거에 시작하거나, 감염의 검출 또는 치료에 시작할 수 있다. 여기에 적어도 증상이 실질적으로 경감될 때까지 그리고 그 후 일정 기간 동안, 또는 면역성이 제공되는(예를 들어, 기억 B 세포 또는 T 세포 집단, 또는 항원 특이적 B 세포 또는 항체가 생산되는) 것으로 간주될 때까지 부스팅 용량이 뒤따를 수 있다.　
치료적 치료를 위한 약학 조성물(예를 들어, 백신 조성물)은 비경구, 국소, 비강, 경구 또는 국소 투여를 위한 것이다. 약학 조성물은 비경구로, 예를 들어 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 조성물은 종양에 대한 국소 면역 반응을 자극하기 위해 외과적 절제 부위에 투여될 수 있다. 조성물은 대상체의 감염된 특정 조직 및/또는 세포를 표적화하기 위해 투여될 수 있다. 항원의 용액을 포함하는 비경구 투여용 조성물이 본원에 개시되고 백신 조성물은 허용 가능한 담체, 예를 들어 수성 담체에 용해되거나 현탁된다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 0.9% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 사용될 수 있다. 이들 조성물은 통상적인 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 조제물은 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 장성 조정제, 수화제 등과 같은 생리학적 조건을 근사하기 위해 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다.
항원은 이들을 림프 조직과 같은 특정 세포 조직으로 표적화하는 리포좀을 통해 투여될 수도 있다. 리포좀은 또한 반감기를 증가시키는 데 유용하다. 리포좀은 에멀젼, 폼, 마이셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 층판 층 등을 포함한다. 이들 조제물에서 전달될 항원은 단독으로 또는 예를 들어 CD45 항원에 결합하는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 사이에 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 다른 치료 또는 면역원성 조성물과 함께 리포좀의 일부로서 혼입될 수 있다. 따라서, 원하는 항원으로 충전된 리포좀은 림프 세포 부위로 유도될 수 있으며, 이어서 여기에서 리포좀이 선택된 치료/면역원성 조성물을 전달한다. 리포좀은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함하는, 표준 소포 형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질의 선택은 일반적으로 예를 들어 리포좀 크기, 산 불안정성 및 혈류에서 리포좀의 안정성을 고려하여 안내된다. 예를 들어, 문헌(Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980), U.S. 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369)에 기재된 바와 같이, 다양한 방법이 리포좀을 제조하기 위해 이용 가능하다.
면역 세포로의 표적화를 위해, 리포좀에 혼입될 리간드는, 예를 들어 원하는 면역계 세포의 세포 표면 결정인자에 특이적인 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 리포좀 현탁액은 특히 투여 방식, 전달되는 펩티드 및 치료되는 질환의 단계에 따라 다른 용량으로 정맥내, 국소, 국부적 등으로 투여될 수 있다.　
치료 또는 면역화 목적을 위해, 펩티드 및 임의로 본원에 기재된 하나 이상의 펩티드를 암호화하는 핵산이 또한 환자에 투여될 수 있다. 여러 방법이 핵산을 환자에게 전달하기 위해 편리하게 사용된다. 예를 들어, 핵산은 "네이키드 DNA"로 직접 전달될 수 있다. 이 접근법은 예를 들어 문헌(Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990)뿐만 아니라 U.S. 특허 번호 5,580,859 및 5,589,466)에 기재되어 있다. 핵산은 또한 예를 들어 U.S. 특허 번호 5,204,253에 기재된 바와 같은 발리스틱 전달을 사용하여 투여될 수 있다. DNA만으로 이루어진 입자가 투여될 수 있다. 대안적으로 DNA는 금 입자와 같은 입자에 부착될 수 있다. 핵산 서열을 전달하기 위한 접근법은 전기천공을 사용하거나 사용하지 않고 바이러스 벡터, mRNA 벡터 및 DNA 벡터를 포함할 수 있다.
핵산은 또한 양이온성 지질과 같은 양이온성 화합물과 복합체화되어 전달될 수 있다. 지질 매개 유전자 전달 방법은 예를 들어 문헌(9618372WOAWO 96/18372; 9324640WOAWO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988); U.S. 특허 번호 5,279,833 Rose U.S. 특허 번호 5,279,833; 9106309WOAWO 91/06309; 및 Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987))에 기재되어 있다.
항원은 또한 백시니아, 계두, 자가 복제 알파바이러스, 마라바바이러스, 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 기반 백신 플랫폼(예를 들어, Tatsis et al., Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616―629 참고) 또는 제2, 제3 또는 하이브리드 제2/제3 세대 렌티바이러스 및 특정 세포 유형 또는 수용체를 표적화하도록 설계된 임의의 세대의 재조합 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 렌티바이러스에 포함될 수 있다(예를 들어, Hu et al., Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma et al., Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper et al., Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey et al., Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880 참고). 위에서 언급된 바이러스 벡터 기반 백신 플랫폼의 패키징 용량에 따라 이 접근법은 하나 이상의 항원 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 전달할 수 있다. 서열은 돌연변이되지 않은 서열이 측면에 있을 수 있거나, 링커에 의해 분리될 수 있거나 세포하 구획을 표적화하는 하나 이상의 서열이 선행될 수 있다(예를 들어, Gros et al., Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen et al., Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires, Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu et al., Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions, Clin Cancer Res. (2014) 20(13):3401-10 참고). 숙주에 도입되면 감염된 세포는 항원을 발현하고 이에 따라 펩티드(들)에 대한 숙주 면역(예를 들어, CTL) 반응을 자극한다. 면역화 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들어 U.S. 특허 번호 4,722,848에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(칼메트 구에린 간균)이다. BCG 벡터는 문헌(Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)))에 기재되어 있다. 항원의 치료적 투여 또는 면역화를 위해 유용한 매우 다양한 다른 백신 벡터, 예를 들어 살모넬라 타이피 벡터 등은 본원의 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다.　
핵산을 투여하는 수단은 하나 또는 다수의 에피토프를 암호화하는 미니유전자 작제물을 사용한다. 인간 세포에서의 발현을 위해 선택된 CTL 에피토프를 암호화하는 DNA 서열(미니유전자)을 생성하기 위해 에피토프의 아미노산 서열이 역번역된다. 인간 코돈 용법 표가 각각의 아미노산에 대한 코돈 선택을 안내하기 위해 사용된다. 이러한 에피토프 암호화 DNA 서열은 직접 연결되어 연속의 폴리펩티드 서열을 생성한다. 발현 및/또는 면역원성을 최적화하기 위해 미니유전자 설계에 추가적인 요소가 혼입될 수 있다. 역번역될 수 있고 미니유전자 서열에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예는 헬퍼 T 림프구, 에피토프, 리더(신호) 서열 및 소포체 잔류 신호를 포함한다. 또한, CTL 에피토프의 MHC 제시는 CTL 에피토프에 인접한 합성(예를 들어, 폴리알라닌) 또는 자연 발생 측면 서열을 포함함으로써 개선될 수 있다.　미니유전자 서열은 미니유전자의 플러스 및 마이너스 가닥을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 조합하여 DNA로 전환된다. 중첩 올리고뉴클레오티드(30-100개 염기 길이)는 잘 알려진 기술을 사용하여 적절한 조건 하에 합성, 인산화, 정제 및 어닐링된다. 올리고뉴클레오티드의 말단은 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결된다. 이어서 CTL 에피토프 폴리펩티드를 암호화하는 이 합성 미니유전자가 원하는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.　
정제된 플라스미드 DNA는 다양한 제형물을 사용하여 주사용으로 제조될 수 있다. 가장 간단한 방법은 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 동결 건조된 DNA를 재구성하는 것이다. 다양한 방법이 기재되었으며 새로운 기술이 이용 가능해질 수 있다. 위에서 주지된 바와 같이 핵산은 양이온성 지질과 함께 편리하게 제형화된다. 또한 보호, 양방향, 비-응축(PINC)으로 통칭되는 당지질, 융합생성 리포좀, 펩티드 및 화합물이 또한 정제된 플라스미드 DNA로 복합체화되어 안정성, 근육내 분산 또는 특정 장기 또는 세포 유형으로의 수송과 같은 변수에 영향을 미칠 수 있다.
또한, 본원에 개시된 방법의 단계를 수행하는 단계; 및 복수의 항원 또는 복수의 항원의 하위세트를 포함하는 백신을 생산하는 단계를 포함하는, 백신을 제조하는 방법이 개시된다.
본원에 개시된 항원은 당분야에 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항원 또는 벡터(예를 들어, 하나 이상의 항원을 암호화하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 벡터)를 생산하는 방법은 항원 또는 벡터를 발현하기 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 항원 또는 벡터를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단계 및 항원 또는 벡터를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 표준 정제 방법은 크로마토그래피 기술, 전기영동, 면역학적, 침전, 투석, 여과, 농축 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다.　
숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, 효모 또는 HEK293 세포를 포함할 수 있다. 숙주 세포는 본원에 개시된 항원 또는 벡터를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있으며, 임의로 단리된 폴리뉴클레오티드는 항원 또는 벡터를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다.
VII. 항원 사용 및 투여
또한 사용될 수 있는 백신접종 방법, 프로토콜 및 일정은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, 국제 출원 공개 WO2021092095에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
프라임/부스트 전략의 각각의 벡터는 전형적으로 항원을 포함하는 카세트를 포함한다. 카세트는 일반적으로 각각의 항원을 둘러싸는 천연 서열 또는 AAY와 같은 다른 비-천연 링커 서열과 같은 링커에 의해 분리된, 약 1-50개의 항원을 포함할 수 있다. 카세트는 범용 클래스 II 항원으로 간주될 수 있는 파상풍 유독소 항원 및 PADRE 항원과 같은 MHCII 항원을 포함할 수도 있다. 카세트는 또한 유비퀴틴 표적화 서열과 같은 표적화 서열을 포함할 수 있다. 또한, 각각의 백신 용량은 면역 조절제와 함께(예를 들어, 동시에, 전에 또는 후에) 대상체에 투여될 수 있다. 각각의 백신 용량은 체크포인트 억제제(CPI)와 함께(예를 들어, 동시에, 전에 또는 후에) 대상체에 투여될 수 있다. CPI는 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 같이 CTLA4, PD1, 및/또는 PDL1을 억제하는 것들을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 트레멜리무맙 또는 더발루맙을 포함할 수 있다. 각각의 백신 용량은 IL-2, IL-7, IL-12(IL-12 p35, p40, p70 및/또는 p70-융합 작제물 포함), IL-15, 또는 IL-21과 같은 사이토카인과 함께(예를 들어, 동시에, 전에 또는 후에) 대상체에 투여될 수 있다. 각각의 백신 용량은 변형된 사이토카인(예를 들어, pegIL-2)과 함께(예를 들어, 동시에, 전에 또는 후에) 대상체에 투여될 수 있다.
백신접종 프로토콜은 하나 이상의 항원을 대상체에 투약하기 위해 사용될 수 있다. 프라이밍 백신 및 부스팅 백신이 대상체에 투약하기 위해 사용될 수 있다. 프라이밍 백신은 ChAdV68에 기반한 벡터(예를 들어, 서열 번호 1 또는 2에 나타낸 서열)와 같이 본원에 기재된 임의의 항원 암호화 벡터와 함께 있을 수 있다. 부스팅 용량은 ChAdV68에 기반한 벡터(예를 들어, 서열 번호 1 또는 2에 나타낸 서열) 또는 SAM 기반 벡터(예를 들어, 서열 번호 3 또는 4에 나타낸 서열)와 같은 본원에 기재된 임의의 항원 암호화 벡터와 함께 있을 수 있다. 하나 이상의 부스팅 용량이 투여될 수 있고 동일한 부스팅 백신의 일련의 투여(예를 들어, 동일한 ChAdV68-기반 벡터의 일련의 투여 또는 동일한 SAM-기반 벡터의 일련의 투여)일 수 있거나 상이한 부스팅 백신의 일련의 투여(예를 들어, SAM 기반 벡터의 투여 후 ChAdV68 기반 벡터의 투여)일 수 있다. 상이한 백신의 일련의 투여는 상이한 백신의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 전략은 ChAdV68 기반 프라임에 이어, 하나 이상의 SAM 기반 부스트, 및 SAM 기반 부스트에 이어 ChAdV68 기반 부스트를 사용할 수 있다. 예시적인 비제한적 백신 전략은 ChAdV 프라임 - SAM 부스트 - SAM 부스트 - ChAdV 부스트; 또는 ChAdV 프라임 - SAM 부스트 - SAM 부스트 - SAM 부스트 - SAM 부스트 - ChAdV 부스트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
ChAdV68 기반 백신은 1x1011개 바이러스 입자 내지 1x1012개 바이러스 입자 범위의 용량으로 투여될 수 있다. ChAdV68 기반 백신은 1x1011개 바이러스 입자의 용량으로 투여될 수 있다. ChAdV68 기반 백신은 5x1011개 바이러스 입자의 용량으로 투여될 수 있다. ChAdV68 기반 백신은 1x1012개 바이러스 입자의 용량으로 투여될 수 있다. ChAdV68 기반 백신에 대해 선택된 투여량은 예를 들어 조성, 투여 방식, 치료받는 질환의 단계 및 중증도, 환자의 체중 및 일반 건강 상태, 그리고 처방의의 판단에 의존할 것이다.
SAM 기반 백신은 10-300 μg RNA 범위의 용량으로 투여될 수 있다. SAM 기반 백신은 100-300 μg RNA 범위의 용량으로 투여될 수 있다. SAM 기반 백신은 100 μg RNA의 용량으로 투여될 수 있다. SAM 기반 백신은 300 μg RNA의 용량으로 투여될 수 있다. SAM 기반 백신의 선택된 투여량은 예를 들어 조성, 투여 방식, 치료받는 질환의 단계 및 중증도, 환자의 체중 및 일반 건강 상태, 그리고 처방의의 판단에 의존할 것이다.
프라이밍 백신은 대상체에 주사될 수 있다(예를 들어, 근육내로). 용량당 양측 주사가 사용될 수 있다. 예를 들어, ChAdV68(C68)의 1회 이상의 주사가 사용될 수 있고(예를 들어, 전체 용량 1x1012개 바이러스 입자); 0.001 내지 1 ug RNA, 특히 0.1 또는 1 ug 범위로부터 선택된 낮은 백신 용량에서 SAM 벡터의 1회 이상의 주사가 사용될 수 있거나; 1 내지 100 ug RNA 범위, 특히 10, 100 또는 300 ug으로부터 선택된 높은 백신 용량에서 SAM 벡터의 1회 이상의 주사가 사용될 수 있다.
백신 부스트(부스팅 백신)는 프라임 백신접종 후 주사될 수 있다(예를 들어, 근육내로). 용량당 양측 주사가 사용될 수 있다. 예를 들어, ChAdV68(C68)의 1회 이상의 주사가 사용될 수 있고(예를 들어, 전체 용량 1x1012개 바이러스 입자); 0.001 내지 1 ug RNA, 특히 0.1 또는 1 ug 범위로부터 선택된 낮은 백신 용량에서 SAM 벡터의 1회 이상의 주사가 사용될 수 있거나; 1 내지 100 ug RNA 범위, 특히 10, 100 또는 300 ug으로부터 선택된 높은 백신 용량에서 SAM 벡터의 1회 이상의 주사가 사용될 수 있다.
부스팅 백신은 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주마다, 예를 들어 프라임 후 4주마다 및/또는 8주마다 투여될 수 있다. 부스팅 백신은 프라임 후 4주마다 투여될 수 있다. 부스팅 백신은 프라임 후 6주마다 투여될 수 있다. 부스팅 백신은 프라임 후 12주마다 투여될 수 있다. 부스팅 용량은 백신접종 프로토콜 과정 동안 상이한 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 예시적인 비제한적 예는 프라임 - 4w - 부스트 - 12w - 부스트 - 12w - 부스트; 또는 프라임 - 4w - 부스트 - 6w - 부스트 - 6w - 부스트 - 6w - 부스트 - 6w - 부스트를 포함하며, "w"는 주를 나타낸다.
하나 이상의 백신 투여는 하나 이상의 체크포인트 억제제의 공동 투여를 포함할 수 있다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 트레멜리무맙(CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체(항-B7-H1; MEDI4736), 이필리무맙, MK-3475(PD-1 차단제), 니볼루맙(항-PD1 항체), CT-011(항-PD1 항체), BY55 모노클로날 항체, AMP224(항-PDL1 항체), BMS-936559(항-PDL1 항체), MPLDL3280A(항-PDL1 항체), MSB0010718C(항-PDL1 항체) 및 Yervoy/이필리무맙(항-CTLA-4 체크포인트 억제제)을 포함한다. 예시적인 비제한적 예에서, 니볼루맙, Yervoy/이필리무맙 또는 이의 조합.
항-CTLA-4(예를 들어, 트레멜리무맙)가 또한 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA4는 동일한 림프절로 배출되도록 확실히 하기 위해 근육내 백신 주사 부위 근처에 피하로 투여될 수 있다(ChAdV68 프라임 또는 SAM 저용량). 트레멜리무맙은 CTLA-4의 선택적 인간 IgG2 mAb 억제제이다. 표적 항-CTLA-4(트레멜리무맙) 피하 용량은 전형적으로 70-75 mg(특히 75 mg)이며, 용량 범위는 예를 들어 1-100 mg 또는 5-420 mg이다.
특정 경우에 더발루맙(MEDI 4736)과 같은 항-PD-L1 항체가 사용될 수 있다. 더발루맙은 PD-1 및 CD80에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 선택적 고친화도 인간 IgG1 mAb이다. 더발루맙은 일반적으로 4주마다 20 mg/kg i.v.로 투여된다.
면역 모니터링은 백신 투여 전에, 동안에 및/또는 후에 수행될 수 있다. 이러한 모니터링은 다른 매개변수 중에서 안전성과 유효성을 알릴 수 있다.
면역 모니터링을 수행하기 위해 PBMC가 일반적으로 사용된다. PBMC는 프라임 백신접종 전에 및 프라임 백신 접종 후에(예를 들어, 4주 및 8주) 단리될 수 있다. PBMC는 부스트 백신접종 직전에 및 각각의 부스트 백신접종 후에(예를 들어, 4주 및 8주) 수확될 수 있다.
T 세포 반응 및 B 세포 반응과 같은 면역 반응이 면역 모니터링 프로토콜의 일부로 평가될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 자극 하는 본원에 기재된 백신 조성물의 능력이 모니터링 및/또는 평가될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "면역 반응을 자극한다"는 면역 반응의 개시(예를 들어, 나이브 대상체에서 면역 반응의 개시를 자극하는 프라이밍 백신) 또는 면역 반응의 향상(예를 들어, 프라이밍 백신에 의해 개시되는 기존 면역 반응과 같은 항원에 대한, 기존 면역 반응을 갖는 대상체에서 면역 반응의 향상을 자극하는 부스팅 백신)과 같은, 면역 반응의 임의의 증가를 지칭한다. T 세포 반응은 ELISpot, 세포내 사이토카인 염색, 사이토카인 분비 및 세포 표면 포획, T 세포 증식, MHC 다량체 염색과 같은 당분야에 알려진 하나 이상의 방법을 사용하거나 세포독성 검정에 의해 측정될 수 있다. 백신에서 암호화된 에피토프에 대한 T 세포 반응은 ELISpot 검정을 사용하여 IFN-감마와 같은 사이토카인의 유래를 측정함으로써 PBMC로부터 모니터링될 수 있다. 백신에서 암호화된 에피토프에 대한 특정 CD4 또는 CD8 T 세포 반응은 유세포 측정을 사용하여 IFN-감마와 같은 세포내 또는 세포외 포획된 사이토카인의 유도를 측정함으로써 PBMC로부터 모니터링될 수 있다. 백신에서 암호화된 에피토프에 대한 특정 CD4 또는 CD8 T 세포 반응은 MHC 다량체 염색을 사용하여 에피토프/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포 집단을 측정함으로써 PBMC로부터 모니터링될 수 있다. 백신에서 암호화된 에피토프에 대한 특정 CD4 또는 CD8 T 세포 반응은 3H-티미딘, 브로모데옥시우리딘 및 카복시플루오레신-디아세테이트-숙신이미딜에스테르(CFSE) 혼입 후 T 세포 집단의 생체외 증식을 측정하여 PBMC로부터 모니터링될 수 있다. 백신에서 암호화된 에피토프에 특이적인 PBMC-유래 T 세포의 항원 인식 능력 및 용해 활성은 크롬 방출 검정 또는 대안적 비색측정 세포독성 검정에 의해 기능적으로 평가될 수 있다.
B 세포 반응은 B 세포 분화(예를 들어, 형질 세포로의 분화), B 세포 또는 형질 세포 증식, B 세포 또는 형질 세포 활성화(예를 들어, CD80 또는 CD86과 같은 공동자극 마커의 상향조절), 항체 클래스 전환 및/또는 항체 생산(예를 들어, ELISA)을 결정하기 위해 사용되는 검정과 같이 당분야에 알려진 하나 이상의 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
대상체의 질환 상태는 본원에 기재된 임의의 백신 조성물의 투여 후에 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 질환 상태는 대상체로부터 단리된 무세포 DNA(cfDNA)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 또한, 백신 치료법의 유효성이 대상체로부터 단리된 cfDNA를 사용하여 모니터링될 수 있다. cfDNA 모니터링은 a. 대상체로부터 cfDNA를 단리했거나 단리하는 단계; b. 단리된 cfDNA를 시퀀싱했거나 시퀀싱하는 단계; c. 대상체의 야생형 생식계열 핵산 서열 대비 cfDNA에서 하나 이상의 돌연변이의 빈도를 결정했거나 결정하는 단계, 및 d. 단계 (c)로부터 대상체의 질환 상태를 평가했거나 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 상기 단계 (c)에 이어서, d. 주어진 대상에 대해 단계 (a)-(c)의 1회 초과 반복을 수행하고 1회 초과 반복에서 결정된 하나 이상의 돌연변이의 빈도를 비교하는 단계; 및 f. 단계 (d)로부터 대상체의 질환 상태를 평가했거나 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (a)-(c)의 첫 번째 반복이 백신 조성물의 투여 전에 수행되고 단계 (a)-(c)의 두 번째 반복이 백신 조성물의 투여 후에 수행되는 것과 같이, 1회 초과 반복은 상이한 시점에 수행될 수 있다. 단계 (c)는 1회 초과 반복에서 결정된 하나 이상의 돌연변이의 빈도, 또는 첫 번째 반복과 두 번째 반복에서 결정된 하나 이상의 돌연변이의 빈도를 비교하는 것을 포함할 수 있다. 후속 반복 또는 두 번째 반복에서 결정된 하나 이상의 돌연변이의 빈도 증가는 질환 진행으로 평가될 수 있다. 후속 반복 또는 두 번째 반복에서 결정된 하나 이상의 돌연변이의 빈도 감소는 반응으로 평가될 수 있다. 일부 측면에서, 반응은 전체 반응(CR) 또는 부분 반응(PR)이다. 치료법은 cfDNA에서 하나 이상의 돌연변이의 빈도 평가가 대상체가 질환을 가지고 있음을 표시하는 경우와 같이, 평가 단계 후에 대상체에 투여될 수 있다. cfDNA 단리 단계는 원심분리를 사용하여 세포 또는 세포 파편으로부터 cfDNA를 분리할 수 있다. cfDNA는 혈장 층, 버피 코트 및 적혈구를 분리하는 것과 같이 전혈로부터 단리할 수 있다. cfDNA 시퀀싱은 차세대 시퀀싱(NGS), 생거 시퀀싱, 듀플렉스 시퀀싱, 전체 엑솜 시퀀싱, 전체 게놈 시퀀싱, 드 노보 시퀀싱, 위상차 시퀀싱, 표적화된 앰플리콘 시퀀싱, 샷건 시퀀싱 또는 이의 조합을 사용할 수 있으며, 시퀀싱 전에 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 하나 이상의 돌연변이, 코딩 영역 및/또는 종양 엑솜 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 것으로 알려졌거나 의심되는 폴리뉴클레오티드) 영역에 대한 cfDNA를 풍부하게 하는 것을 포함할 수 있다. cfDNA를 풍부하게 하는 것은 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 영역에 변형(예를 들어, 비오틴화)될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 탐침을 혼성화하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로 임의의 수의 돌연변이가 동시에 또는 병렬로 모니터링될 수 있다.
동종 백신접종 요법은 제2 용량의 유효성을 개선하기 위해 동종 용량 사이에 간격을 포함할 수 있다. 예를 들어, ChAdV68 기반 백신은 초기 용량으로 투여될 수 있으며 부스팅 용량의 유효성에 대한 ChAdV 특이적 중화 항체 역가의 영향 감소와 같이 유효성을 개선하기 위한 부스팅 용량으로 ChAdV68 기반 백신의 재투여 전 간격을 포함할 수 있다. 예를 들어, 초기 용량은 중화 항체의 생산을 유도할 수 있으며 이는 이후 시간이 지남에 따라 약해진다. 본원에 기재된 ChAdV68-기반 백신에 대한 예시적인 비제한적 예에서, 간격은 적어도 27주이다. 간격은 27주일 수 있다. 간격은 28주일 수 있다. 간격은 29주일 수 있다. 간격은 30주일 수 있다. 간격은 31주일 수 있다. 간격은 32주일 수 있다. 간격은 33주일 수 있다. 간격은 적어도 27주일 수 있다. 간격은 적어도 28주일 수 있다. 간격은 적어도 29주일 수 있다. 간격은 적어도 30주일 수 있다. 간격은 적어도 31주일 수 있다. 간격은 적어도 32주일 수 있다. 간격은 적어도 33주일 수 있다.
동종 프라임-부스트 전략에서 ChAdV68 기반 백신 투여 사이의 간격은 8주만큼 짧을 수 있다. 간격은 8주일 수 있다. 간격은 9주일 수 있다. 간격은 10주일 수 있다. 간격은 11주일 수 있다. 간격은 12주일 수 있다. 간격은 13주일 수 있다. 간격은 14주일 수 있다. 간격은 15주일 수 있다. 간격은 16주일 수 있다. 간격은 17주일 수 있다. 간격은 18주일 수 있다. 간격은 19주일 수 있다. 간격은 20주일 수 있다. 간격은 21주일 수 있다. 간격은 23주일 수 있다. 간격은 24주일 수 있다. 간격은 25주일 수 있다. 간격은 26주일 수 있다.
동종 프라임-부스트 전략에서 ChAdV68 기반 백신 투여 사이의 간격은 적어도 8주일 수 있다. 간격은 적어도 9주일 수 있다. 간격은 적어도 10주일 수 있다. 간격은 적어도 11주일 수 있다. 간격은 적어도 12주일 수 있다. 간격은 적어도 13주일 수 있다. 간격은 적어도 14주일 수 있다. 간격은 적어도 15주일 수 있다. 간격은 적어도 16주일 수 있다. 간격은 적어도 17주일 수 있다. 간격은 적어도 18주일 수 있다. 간격은 적어도 19주일 수 있다. 간격은 적어도 20주일 수 있다. 간격은 적어도 21주일 수 있다. 간격은 적어도 23주일 수 있다. 간격은 적어도 24주일 수 있다. 간격은 적어도 25주일 수 있다. 간격은 적어도 26주일 수 있다.
동종 프라임-부스트 전략에서 ChAdV68 기반 백신 투여 사이의 간격은 2개월일 수 있다. 간격은 2.5개월일 수 있다. 간격은 3개월일 수 있다. 간격은 3.5개월일 수 있다. 간격은 4개월일 수 있다. 간격은 4.5개월일 수 있다. 간격은 5개월일 수 있다. 간격은 5.5개월일 수 있다. 간격은 6개월일 수 있다. 간격은 6.5개월일 수 있다. 간격은 7개월일 수 있다. 간격은 7.5개월일 수 있다. 간격은 8개월일 수 있다. 간격은 8.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 2개월일 수 있다. 간격은 적어도 2.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 3개월일 수 있다. 간격은 적어도 3.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 4개월일 수 있다. 간격은 적어도 4.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 5개월일 수 있다. 간격은 적어도 5.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 6개월일 수 있다. 간격은 적어도 6.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 7개월일 수 있다. 간격은 적어도 7.5개월일 수 있다. 간격은 적어도 8개월일 수 있다. 간격은 적어도 8.5개월일 수 있다.
VIII. HLA 펩티드의 단리 및 검출
HLA-펩티드 분자의 단리는 조직 샘플의 용해 및 가용화 후 전통적 면역침전(IP) 방법을 사용하여 수행되었다(55-58). HLA 특정 IP를 위해 정화된 용해물이 사용되었다. 실시예 및 방법은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 국제 특허 출원 공개 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다.
IX. 제시 모델
제시 모델이 환자에서 펩티드 제시의 가능성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 제시 모델이 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 제시 모델은 각각 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 특허 제10,055,540호, US 출원 공개 번호 US20200010849A1 및 US20110293637, 및 국제 특허 출원 공개 WO/2018/195357, WO/2018/208856 및 WO2016187508에 보다 상세히 기재되어 있다.
X. 훈련 모듈
훈련 모듈은 펩티드 서열이 펩티드 서열과 관련된 MHC 대립유전자에 의해 제시될 것인지의 가능성을 생성하는 훈련 데이터 세트에 기반하여 하나 이상의 제시 모델을 구축하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 훈련 모듈이 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 제시 모델은 각각 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 특허 번호 10,055,540, US 출원 공개 번호 US20200010849A1, 및 국제 특허 출원 공개 WO/2018/195357 및 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다. 훈련 모듈은 대립유전자별 기준으로 펩티드의 제시 가능성을 예측하기 위한 제시 모델을 구축할 수 있다. 훈련 모듈은 또한 2개 이상의 MHC 대립유전자가 존재하는 다중 대립유전자 설정에서 펩티드의 제시 가능성을 예측하기 위한 제시 모델을 구축할 수 있다.
XI. 예측 모듈
예측 모듈은 서열 데이터를 수신하고 제시 모델을 사용하여 서열 데이터에서 후보 항원을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 서열 데이터는 환자의 종양 조직 세포, 감염된 세포 환자 또는 감염성 질환 유기체 자체로부터 추출된 DNA 서열, RNA 서열 및/또는 단백질 서열일 수 있다. 예측 모듈은 환자의 정상 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터를 환자의 종양 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 부분을 확인함으로써 돌연변이된 펩티드 서열인 후보 신생항원을 확인할 수 있다. 예측 모듈은 예를 들어 환자의 정상 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터를 환자의 감염된 세포로부터 추출된 서열 데이터와 비교하여 하나 이상의 감염성 질환 유기체 관련 항원을 함유하는 부분을 확인하는 것과 같이 병원체 유래 펩티드, 바이러스 유래 펩티드, 박테리아 유래 펩티드, 진균 유래 펩티드 및 기생충 유래 펩티드인 후보 항원을 확인할 수 있다. 예측 모델은 환자의 정상 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터를 환자의 종양 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터와 비교하여 부적절하게 발현된 후보 항원을 확인함으로써 정상 세포 또는 조직과 비교하여 종양 세포 또는 암성 조직에서 변경된 발현을 갖는 후보 항원을 확인할 수 있다. 예측 모듈은 환자의 정상 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터를 환자의 감염된 조직 세포로부터 추출된 서열 데이터를 비교하여 발현된 후보 항원을 확인(예를 들어, 감염성 질환에 특이적인 발현된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 확인)함으로써 정상 세포 또는 조직과 비교하여 감염된 세포 또는 감염된 조직에서 발현되는 후보 항원을 확인할 수 있다.
제시 모듈은 처리된 펩티드 서열에 하나 이상의 제시 모델을 적용하여 펩티드 서열의 제시 가능성을 추정할 수 있다. 구체적으로, 예측 모듈은 후보 항원에 제시 모델을 적용하여 종양 HLA 분자 또는 감염된 세포 HLA 분자 상에 제시될 가능성이 있는 하나 이상의 후보 항원 펩티드 서열을 선택할 수 있다. 한 구현예에서, 제시 모듈은 미리 결정된 역치 초과의 추정된 제시 가능성을 갖는 후보 항원 서열을 선택한다. 또 다른 구현예에서, 제시 모델은 최고 추정 제시 가능성을 갖는 N개의 후보 항원 서열을 선택한다(여기서 N은 일반적으로 백신에서 전달될 수 있는 에피토프의 최대 수임). 주어진 환자에 대해 선택된 후보 항원을 포함하는 백신이 대상체에 주사되어 면역 반응을 자극할 수 있다.
XI.B. 카세트 설계 모듈
XI.B.1 개요
카세트 설계 모듈은 환자에 주사하기 위해 선택된 후보 펩티드에 기반하여 하는 백신 카세트 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 카세트 설계 모듈은 연결된 T 세포 에피토프와 같은 연결된 에피토프 서열을 암호화하는 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 카세트 설계 모듈은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 카세트 설계 모듈은 각각 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 특허 번호 10,055,540, US 출원 공개 번호 US20200010849A1, 및 국제 특허 출원 공개 WO/2018/195357 및 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다.
한 세트의 치료 에피토프가 미리 결정된 역치 초과의 제시 가능성과 관련된 예측 모듈에 의해 결정된 선택된 펩티드에 기반하여 생성될 수 있고, 제시 가능성은 제시 모델에 의해 결정된다. 그러나 다른 구현예에서, 치료 에피토프 세트는 예를 들어 환자의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자에 대한 결합 친화도 또는 예측된 결합 친화도, 환자의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자에 대한 결합 안정성 또는 예측된 결합 안정성, 무작위 샘플링 등에 기반하여 (단독으로 또는 조합으로) 여러 방법 중 임의의 하나 이상에 기반하여 생성될 수 있음이 이해된다.
치료 에피토프는 선택된 펩티드 자체에 상응할 수 있다. 치료 에피토프는 또한 선택된 펩티드에 더하여 C- 및/또는 N-말단 측면 서열을 포함할 수 있다. N- 및 C-말단 측면 서열은 그 공급원 단백질과 관련하여 치료 백신 에피토프의 천연 N- 및 C-말단 측면 서열일 수 있다. 치료 에피토프는 고정 길이 에피토프를 나타낼 수 있다 치료 에피토프는 가변 길이 에피토프를 나타낼 수 있으며, 에피토프의 길이는 예를 들어 C- 또는 N-측면 서열의 길이에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, C-말단 측면 서열 및 N-말단 측면 서열은 각각 2-5개의 잔기의 다양한 길이를 가질 수 있어서, 에피토프에 대해 16개의 가능한 선택을 생성한다.
카세트 설계 모듈은 또한 카세트에서 한 쌍의 치료 에피토프 사이의 접합부에 걸친 접합부 에피토프의 제시를 고려하여 카세트 서열을 생성할 수 있다. 접합부 에피토프는 카세트에서 치료 에피토프와 링커 서열을 연결하는 과정으로 인해 카세트에서 발생하는 새로운 비자가의, 그러나 관련 없는 에피토프 서열이다. 접합부 에피토프의 새로운 서열은 카세트 자체의 치료 에피토프와 상이하다.
카세트 설계 모듈은 접합부 에피토프가 환자에게 제시될 가능성을 줄이는 카세트 서열을 생성할 수 있다. 구체적으로, 카세트가 환자에 주사될 때 접합부 에피토프는 환자의 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 의해 제시될 가능성이 있으며 각각 CD8 또는 CD4 T 세포 반응을 자극한다. 접합부 에피토프에 반응하는 T-세포는 치료적 이점을 갖지 않고 항원 경쟁에 의해 카세트에서 선택된 치료 에피토프에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있기 때문에 이러한 반응은 종종 요망되지 않는다.76
카세트 설계 모듈은 하나 이상의 후보 카세트를 통해 반복하고, 그 카세트 서열과 관련된 접합부 에피토프의 제시 점수가 임계 수치 미만인 카세트 서열을 결정할 수 있다. 접합부 에피토프 제시 점수는 카세트에서 접합부 에피토프의 제시 가능성과 관련된 양이며, 접합부 에피토프 제시 점수의 값이 높을수록 카세트의 접합부 에피토프가 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 또는 둘 모두에 의해 제시될 가능성이 높다는 것을 표시한다.
한 구현예에서, 카세트 설계 모듈은 후보 카세트 서열 중에서 최저 접합부 에피토프 제시 점수와 연관된 카세트 서열을 결정할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 하나 이상의 후보 카세트 서열을 통해 반복하고, 후보 카세트에 대한 접합부 에피토프 제시 점수를 결정하고, 역치 미만의 접합부 에피토프 제시 점수와 관련된 최적 카세트 서열을 확인할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 하나 이상의 후보 카세트 서열을 추가로 검사하여 후보 카세트 서열에서 임의의 접합부 에피토프가 그를 위해 백신이 설계되고 있는 주어진 환자에 대한 자가-에피토프인지 확인할 수 있다. 이를 달성하기 위해 카세트 설계 모듈은 BLAST와 같은 알려진 데이터베이스에 대해 접합부 에피토프를 검사한다. 한 구현예에서, 카세트 설계 모듈은 접합부 자가-에피토프를 회피하는 카세트를 설계하도록 구성될 수 있다.
카세트 설계 모듈은 무차별 대입 접근법을 수행하고 모든 또는 대부분의 가능한 후보 카세트 서열을 반복하여 최저 접합부 에피토프 제시 점수를 갖는 서열을 선택할 수 있다. 그러나 이러한 후보 카세트의 수는 백신의 용량이 증가함에 따라 엄청나게 클 수 있다. 예를 들어, 20개 에피토프의 백신 용량에 대해 카세트 설계 모듈은 최저 접합부 에피토프 제시 점수를 가진 카세트를 결정하기 위해 약 1018개의 가능한 후보 카세트를 통해 반복해야 한다. 이 결정은 (필요한 전산 처리 자원의 관점에서) 전산적으로 부담이 될 수 있으며 때때로 카세트 설계 모듈이 환자를 위한 백신을 생성하기 위해 합당한 시간 내에 완료하는 데 있어서 처리하기 어려울 수 있다. 더욱이, 각각의 후보 카세트에 대해 가능한 접합부 에피토프를 계산하는 것은 훨씬 더 부담스러울 수 있다. 따라서, 카세트 설계 모듈은 무차별 대입 접근법에 대한 후보 카세트 서열의 수보다 상당히 더 적은 수의 후보 카세트 서열을 통해 반복하는 방식에 기반하여 카세트 서열을 선택할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 무작위로 또는 적어도 유사-무작위로 생성된 후보 카세트의 하위세트를 생성할 수 있고, 카세트 서열로서 미리 결정된 역치 미만의 접합부 에피토프 제시 점수와 관련된 후보 카세트를 선택한다. 추가로, 카세트 설계 모듈은 카세트 서열로서 최저 접합부 에피토프 제시 점수를 갖는 하위세트로부터 후보 카세트를 선택할 수 있다. 예를 들어, 카세트 설계 모듈은 20개의 선택된 에피토프 세트에 대해 약 1백만 개의 후보 카세트의 하위세트를 생성하고 최저 접합부 에피토프 제시 점수를 갖는 후보 카세트를 선택할 수 있다. 무작위 카세트 서열의 하위세트를 생성하고 하위세트 중 낮은 접합부 에피토프 제시 점수를 갖는 카세트 서열을 선택하는 것은 무차별 대입 접근법에 비해 차선일 수 있지만 전산 자원을 훨씬 더 적게 필요로 하므로 그 구현을 기술적으로 타당하게 만든다. 또한, 이 보다 효율적인 기술과 대비되어 무차별 대입 방법을 수행하면 접합부 에피토프 제시 점수의 미미하거나 심지어 무시할 수 있을 정도의 개선을 초래할 수 있으므로 자원 할당 관점에서 볼 때 가치가 없다. 카세트 설계 모듈은 카세트에 대한 에피토프 서열을 비대칭 이동 세일즈맨 문제(TSP)로 공식화하여 개선된 카세트 구성을 결정할 수 있다. 노드 목록과 각각의 노드 쌍 사이의 거리가 주어지면 TSP는 각각의 노드를 정확히 한 번 방문하고 원래 노드로 돌아가기 위한 가장 짧은 전체 거리와 관련된 노드 서열을 결정한다. 예를 들어 도시 A, B, 및 C가 서로 알려진 거리를 갖는 경우 TSP의 해결책은 각각의 도시를 정확히 한 번 방문하기 위해 이동한 전체 거리가 가능한 경로 중에서 가장 작은 도시의 폐쇄 서열을 생성한다. TSP의 비대칭 버전은 한 쌍의 노드 사이의 거리가 비대칭일 때 최적 노드 서열을 결정한다. 예를 들어 노드 A에서 노드 B로 이동하는 "거리"는 노드 B에서 노드 A로 이동하는 "거리"와 상이할 수 있다. 비대칭 TSP를 사용하여 개선된 최적 카세트를 해결함으로써 카세트 설계 모듈은 카세트의 에피토프 사이의 접합부에 걸쳐 감소된 제시 점수를 초래하는 카세트 서열을 찾을 수 있다. 비대칭 TSP의 해결책은 카세트의 접합부에 걸쳐 접합부 에피토프 제시 점수를 최소화하기 위해 카세트에서 에피토프가 연결되어야 하는 순서에 상응하는 치료 에피토프의 서열을 표시한다. 이 접근법을 통해 결정된 카세트 서열은 특히 생성된 후보 카세트 서열의 수가 많을 때 무작위 샘플링 접근법보다 잠재적으로 훨씬 더 적은 전산 자원을 필요로 하면서 접합부 에피토프의 제시가 훨씬 더 적은 서열을 생성할 수 있다. 카세트 설계를 최적화하기 위한 상이한 전산 접근법 및 비교의 예시적인 예는 각각 모든 목적을 위해 이의 전체가 본원에 참조로 포함된, US 특허 번호 10,055,540, US 출원 공개 번호 US20200010849A1, 및 국제 특허 출원 공개 WO/2018/195357 및 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다.
공유 항원 백신에 포함시키기 위한 공유 (신생)항원 서열 및 이러한 백신으로의 치료에 적절한 환자는 예를 들어 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 출원 번호 17/058,128에 기재된 바와 같이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 후보 공유 (신생)항원의 질량 분광측정(MS) 검증이 선택 과정의 일부로 수행될 수 있다.
카세트 설계 모듈은 또한 백신에 암호화된 추가적인 단백질 서열을 고려하여 카세트 서열을 생성할 수 있다. 예를 들어, 연결된 T 세포 에피토프를 암호화하는 서열을 생성하기 위해 사용되는 카세트 설계 모듈은 후보 서열 목록으로부터 추가적인 단백질 서열에 의해 이미 암호화된 T 세포 에피토프를 제거하는 것과 같이 백신에 존재하는 추가적인 단백질 서열(예를 들어, 전장 단백질 서열)에 의해 이미 암호화된 T 세포 에피토프를 고려할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 또한 서열의 크기를 고려하여 카세트 서열을 생성할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고 일반적으로 증가된 카세트 크기는 백신 생산 및/또는 백신 유효성과 같은 백신 측면에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 한 예에서, 카세트 설계 모듈은 중첩 T 세포 에피토프 서열과 같은 중첩 서열을 고려할 수 있다. 일반적으로 중첩 T 세포 에피토프 서열을 함유하는 단일 서열("프레임"으로도 지칭됨)은 다중 펩티드를 암호화하는 데 필요한 서열 크기를 줄이므로 개별 T 세포 에피토프 서열을 별도로 연결하는 것보다 더 효율적이다. 따라서, 한 예시적인 예에서, 연결된 T 세포 에피토프를 암호화하는 서열을 생성하기 위해 사용되는 카세트 설계 모듈은 추가적인 T 세포 에피토프를 제시하는 MHC에 대한 추가적인 집단 적용범위에서 획득된 이점 대 서열의 크기를 증가시키는 비용을 결정하는 것과 같이 후보 T 세포 에피토프를 연장하여 하나 이상의 추가적인 T 세포 에피토프를 암호화하는 비용/이점을 고려할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 또한 검증된 에피토프에 의해 생성된 면역 반응의 자극 크기를 고려하여 카세트 서열을 생성할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 또한 집단에 걸쳐 암호화된 에피토프의 제시를, 예를 들어 적어도 하나의 면역원성 에피토프가 집단의 일부에 걸쳐, 예를 들어 집단의 적어도 85%, 90% 또는 95%에 의해 적어도 하나의 HLA(예를 들어, 4개 주요 인종 그룹, 즉 유럽인(EUR), 아프리카계 미국인(AFA), 아시아 및 태평양 섬 주민(APA) 및 히스패닉(HIS)에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자)에 의해 제시됨을 고려하여 카세트 서열을 생성할 수 있다. 예시적인 비제한적 예로서, 카세트 설계 모듈은 또한 적어도 하나의 HLA가 적어도 하나의 검증된 에피토프를 제시하거나 적어도 4, 5, 6 또는 7개의 예측된 에피토프를 제시하는 집단의 85%, 90%, 또는 95%에 걸쳐 존재하도록 카세트 서열을 생성할 수 있다.
카세트 설계 모듈은 또한 잠재적으로 안전성 위험을 제시하는 기능적 단백질, 기능적 단백질 도메인, 기능적 단백질 서브유닛 또는 기능적 단백질 단편의 암호화 또는 암호화 가능성을 제한하는 것과 같이 잠재적 안전성을 개선하는 다른 측면을 고려하여 카세트 서열을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 카세트 설계 모듈은 이들이 번역되는 상응하는 전장 단백질의 50% 미만, 49% 미만, 48% 미만, 47% 미만, 46% 미만, 45% 미만, 45% 미만, 43% 미만, 42% 미만, 41% 미만, 40% 미만, 39% 미만, 38% 미만, 37% 미만, 36% 미만, 35% 미만, 34% 미만 또는 33% 미만이도록 암호화된 펩티드의 서열 크기를 제한할 수 있다. 일부 경우에 카세트 설계 모듈은 하나의 인접 서열이 번역된 상응하는 전장 단백질의 50% 미만이지만 하나 초과의 서열이 동일한 번역된 상응하는 전장 단백질로부터 유도되고 함께 50% 초과를 암호화하도록 암호화된 펩티드의 서열 크기를 제한할 수 있다. 한 예시적인 예에서, 중첩 T 세포 에피토프 서열을 함유하는 단일 서열("프레임")이 번역된 상응하는 전장 단백질의 50%보다 큰 경우, 프레임은 각각의 프레임이 번역된 상응하는 전장 단백질의 50% 미만이도록 여러 프레임(예를 들어, f1, f2 등)으로 분할될 수 있다. 카세트 설계 모듈은 또한 하나의 인접 서열이 번역된 상응하는 전장 단백질의 49% 미만, 48% 미만, 47% 미만, 46% 미만, 45% 미만, 45% 미만, 43% 미만, 42% 미만, 41% 미만, 40% 미만, 39% 미만, 38% 미만, 37% 미만, 36% 미만, 35% 미만, 34% 미만 또는 33% 미만이도록 암호화된 펩티드의 서열 크기를 제한할 수 있다. 동일한 유전자로부터 다중 프레임이 암호화되는 경우, 다중 프레임은 서로 중첩되는 서열을 가질 수 있다, 즉 각각 동일한 서열을 별도로 암호화한다. 동일한 유전자로부터 다중 프레임이 암호화되는 경우, 동일한 유전자로부터 유래된 2개 이상의 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열이 상응하는 유전자에서 첫 번째 핵산 서열을 바로 또는 바로가 아니라 뒤따르는 경우에 첫 번째 핵산 서열에 두 번째 핵산 서열 바로 뒤따르거나 연결될 수 없도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 동일한 유전자 내에 3개의 프레임이 있는 경우(아미노산 위치의 오름차순으로 f1, f2, f3):
- 하기 카세트 순서는 허용되지 않는다:
o f1 바로 다음에 f2
o f2 바로 다음에 f3
o f1 바로 다음에 f3
- 하기 카세트 순서는 허용된다:
o f3 바로 다음에 f2
o f2 바로 다음에 f1
XIII. 예시적 컴퓨터
컴퓨터는 본원에 기재된 임의의 전산 방법을 위해 사용될 수 있다. 당업자는 컴퓨터가 상이한 아키텍처를 가질 수 있음을 인지할 것이다. 컴퓨터의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 컴퓨터는 각각 이의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, US 특허 번호 10,055,540, US 출원 공개 번호 US20200010849A1, 및 국제 특허 출원 공개 WO/2018/195357 및 WO/2018/208856에 보다 상세히 기재되어 있다.
XIV. 실시예
아래는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구현예의 실시예이다. 실시예는 예시적 목적으로만 제공되며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오차 및 편차가 당연히 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 표시되지 않는 한 당분야의 기술 범위 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌(T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992))을 참고한다.
XIV.A. 스파이크 단백질 서열 최적화
스파이크 단백질을 암호화하는 다양한 서열 최적화 뉴클레오티드 서열을 ChAdV68 백신 벡터에서 평가했다.
스파이크 서열의 서열 최적화
우한(Wuhan) Hu/1의 스파이크 뉴클레오티드 서열(서열 번호 78)을 아미노산 서열이 영향을 받지 않도록 동의 코돈을 치환함으로써 서열 최적화하였다. 인간에서의 향상된 발현 및 감소된 복잡성을 위해 IDT 알고리즘을 사용하여 합성을 보조하였다(예를 들어, 서열 번호 66-74 참고). 스파이크 서열은 2개의 추가적인 알고리즘을 사용하여 추가로 서열 최적화하였다: (1) SGI DNA(La Jolla, CA)를 사용하여 생성된 단일 서열(서열 번호 87); (2) 싱가포르 대학(University of Singapore)의 COOL을 사용하여 생성된 CT1, CT20, CT56, CT83, CT131 및 CT 199(서열 번호 79-84)로 지정된 6개의 서열(COOL 알고리즘은 다중 서열을 생성하며 6개를 선택함). 각각의 서열을 표 1에 제시한다.
ChAdV68 바이러스로 감염되거나 ChAdV68 게놈 DNA로 형질감염된 293A 세포로부터의 cDNA에서 스플라이싱 이벤트를 확인하였다. 구체적으로, Qiagen의 RNeasy 컬럼을 사용하여 10e5-10e6개 세포의 전체 RNA를 정제했다. DNAse 처리로 잔여 DNA를 제거하고 SuperScriptIV 역전사효소(Thermo)를 사용하여 cDNA를 제조했다. 이어서, Gritstone ChAdV68 카세트의 5' UTR 및 3' UTR에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 산물을 생성하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, 겔 정제하고, 생거 시퀀싱하여 스플라이싱에 의해 결실된 영역을 확인하였다.
아미노산 서열을 손상시키지 않으면서 뉴클레오티드 서열 모티프를 손상시키는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 스플라이스 공여체 부위를 제거하였다. 돌연변이유발은 상기 돌연변이를 PCR 프라이머에 혼입하고, 몇몇 단편을 병렬로 증폭하고, 단편에서 깁슨(Gibson) 조립을 실행하여 달성하였다(30-60 nt 중첩). 최적화된 클론 CT1-2C(서열 번호 85)는 돌연변이된 NT385 및 NT539에서 생거 서열-확인 스플라이스 공여체 모티프를 가졌고, 클론 IDT-4C(서열 번호 86)는 NT385, NT539에서 생거 서열-확인 스플라이스 공여체 모티프를 및 돌연변이된 NT2003 및 NT2473에서 예측된 공여체 모티프를 가졌다. 또한, nt 445에서 가능한 폴리아데닐화 부위 AATAAA는 IDT-4C 클론에서 AAcAAA로 돌연변이되었다.
기재된 서열을 표 1에 제시한다.
[표 1]
서열-최적화 스파이크 서열의 클로닝
각각의 서열 최적화 스파이크 서열은 IDT로부터 3개 gBlock의 세트로 주문하였으며 각각의 gblock은 1300-1500 bp이고 대략 100개 뉴클레오티드가 서로 중첩된다. 스파이크 서열의 5' 및 3' 말단을 포함하는 gBlock은 100개 뉴클레오티드만큼 플라스미드 골격과 중첩되었다. gblock을 선형화된 pA68-E4d AsisI/PmeI 골격으로 PCR 및 깁슨 조립의 조합에 의해 조립하여 pA68-E4-서열 최적화 스파이크 클론을 생성하였다. 클론을 PCR로 스크리닝한 다음 정확한 크기의 클론을 플라스미드 생산을 위해 성장시키고 NGS 또는 생거 시퀀싱으로 시퀀싱했다. 정확한 클론의 서열이 확인되면 형질감염을 위해 대규모 플라스미드 생산 및 정제를 수행했다.
벡터 생산
pA68-E4-스파이크 플라스미드 DNA를 PacI로 절단하고 2 ug DNA를 TransIt Lenti 형질감염 시약을 사용하여 293F 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 세포 및 배지를 수확하고 -80C 및 37C에서 동결-해동하여 용해물을 생성했다. 용해물의 분획을 사용하여 30 mL의 293F 세포를 재감염시키고 수확 전에 48-72시간 동안 인큐베이션했다. -80C 및 37C에서 동결-해동하여 용해물을 생성하고 용해물의 분획을 사용하여 1e6개 세포/mL로 시딩된 400 mL의 293F 세포를 감염시켰다. 다음으로, 48-72시간 후에 세포를 수확하고, 10 mM 트리스 pH 8.0/0.1% 트리톤 X-100에서 용해시키고, 37 및 -80C에서 1X 동결 해동하였다. 그런 다음 용해물을 1.2/1.4 CsCl 구배에 로딩하기 전에 10분 동안 4300 x g에서 원심분리하여 정화했다. 구배는 밴드가 트리스에서 2-4x로 희석되기 전에 최소 2시간 동안 실행하였고 그 다음 적어도 2시간 동안 1.35 CsCl 구배에서 재실행하였다. 바이러스 밴드를 수확한 다음 1x ARM 완충액에서 3x 투석했다. 바이러스 감염성 역가를 면역염색 역가 검정에 의해 결정하였고 바이러스 입자를 A260 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
웨스턴 분석
스파이크 발현 분석을 위한 샘플은 형질감염 후 지정된 시간에 수확하거나 정제된 바이러스의 경우 알려진 바이러스 MOI로 제어되는 감염 실험을 설정하여 감염 후 특정 시간, 전형적으로 24 내지 48시간에 수확했다. 1e6개 세포를 전형적으로 10% 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 0.5 mL의 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 수확하였다. 샘플을 끓이고 변성 및 환원 조건 하에 4-20% 폴리아크릴아미드 겔에서 실행했다. 그런 다음 겔을 BioRad Rapid 전달 장치를 사용하여 PVDF 막 상으로 블로팅했다. 막은 TBST의 5% 탈지유에서 실온에서 2시간 동안 차단하였다. 그런 다음 막을 항스파이크 S1 폴리클로날(Sino Biologicals) 또는 항스파이크 모노클로날 항체 1A9(GeneTex; Cat. No. GTX632604)로 탐침분석하고 2시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 막을 PBST에서 세척하고(5x) HRP-결합 항-마우스 항체(Bethyl labs)로 1시간 동안 탐침분석했다. 막을 상술된 대로 세척한 다음 화학발광 기질 ECL plus(ThermoFisher)와 함께 인큐베이션했다. 그런 다음 Chemidoc(BioRad 장치)을 사용하여 이미지를 포착했다.
결과
스파이크 S2 단백질의 발현을 다양한 스파이크-암호화 벡터로 293F 세포에서 바이러스 생산 동안 평가하였다. IDT 서열-최적화 스파이크 카세트를 암호화하는 벡터를 사용하여 스파이크 S2 단백질은 SAM 벡터에서 발현될 때 항-스파이크 S2 항체(GeneTex)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출되었지만 ChAdV68 벡터("CMV-스파이크(IDT)"; 서열 번호 69)에서 발현될 때 2개의 상이한 MOI 및 시점에(데이터는 나타내지 않음) 검출되지 않았다. 스파이크 변이체 D614G("CMV-스파이크(IDT)-D614G" 서열 번호 70)를 발현하도록 조작한 2개의 클론은 또한 S2 항체를 사용하는 웨스턴에 의해 검출 가능한 수준의 스파이크 단백질을 발현하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 스파이크와 함께 SARS-CoV-2 막 단백질을 공동 발현하도록 조작된 클론("CMV-스파이크(IDT)-D614G-Mem" 서열 번호 66) 또는 퓨린 절단 부위를 손상시키는 R682V 돌연변이를 포함하도록 조작된 클론은 발현 표현형을 구제하지 못했다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, 스파이크 S1 단백질이 검출되지 않은 퓨린 R682V 돌연변이를 제외하고, 낮은 수준이지만 모든 IDT 작제물에 대해 스파이크 S1 단백질이 검출되었다.
IDT 서열-최적화 클론의 발현 문제가 S1 또는 S2 도메인에 특이적인 경우 디컨볼루션하기 위해, S1 또는 S2 도메인만 발현하는 벡터도 평가하였다. IDT 서열-최적화 스파이크 S1 단백질만을 암호화하는 ChAdV68 벡터는 전장 스파이크 벡터에서 관찰된 더 낮은 발현과 대조적으로 강한 단백질 발현을 실증했다(데이터는 나타내지 않음). 예상된 바와 같이, S2 도메인만을 암호화하는 벡터로는 S1에 대한 신호가 관찰되지 않았다. 대조적으로, IDT 서열-최적화 스파이크 S2 단백질만을 암호화하는 ChAdV68 벡터는 전장 스파이크 벡터로 관찰된 신호의 부재와 필적하게, 관찰 가능한 단백질 발현을 실증하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, 데이터는 IDT 서열-최적화 스파이크 S2가 전장 스파이크 서열의 발현에 영향을 주는 것을 포함하여 불량한 발현을 나타냄을 표시한다.
단백질 발현을 해결하기 위해 SARS-CoV-2 스파이크-암호화 뉴클레오티드 서열을 추가적인 서열 최적화 알고리즘을 사용하여 서열 최적화했다: (1) SGI DNA(La Jolla, CA)를 사용하여 생성된 단일 서열(서열 번호 87); (2) 싱가포르 대학의 COOL을 사용하여 생성된 CT1, CT20, CT56, CT83, CT131 및 CT 199(서열 번호 79-84)로 지정된 6개 서열(COOL 알고리즘은 다중 서열을 생성하고 6개를 선택함). COOL 알고리즘을 사용한 서열 최적화는 항-S2 및 항-S1 항체를 둘 모두 사용하여 웨스턴에 의해 평가된 바와 같이 ChAdV68 벡터를 사용하여 검출 가능한 발현을 실증한 서열 - CT1(서열 번호 79) - 을 생성했다(데이터는 나타내지 않음). COOL 알고리즘과 SGI 알고리즘을 사용하여 생성된 추가 서열도 웨스턴에 의해 평가했다. SGI 클론 및 COOL 서열 CT131은 또한 항-S2 항체를 사용하여 웨스턴에 의해 검출 가능한 수준의 스파이크 단백질을 실증한 반면, 다른 COOL 생성된 서열은 대조군 CT1 유래 서열(레인 2) 이외에 검출 가능한 신호를 생성하지 않았다. 따라서 데이터는 특정 서열 최적화가 ChAdV68 벡터에서 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 발현을 개선했음을 표시한다.
SARS-CoV-2는 그 자체 복제 기구를 암호화 하는 세포질 복제 포지티브 센스 RNA 바이러스이며, 따라서 SARS-CoV-2 mRNA는 스플라이싱 및 핵 외수송 기구에 의해 자연적으로 처리되지 않는다. ChAdV68 벡터로부터 발현된 SARS-CoV-2 스파이크 암호화 mRNA에서 스플라이싱의 역할을 평가하기 위해 스파이크 암호화 영역을 증폭하도록 프라이머를 설계했다. mRNA 스플라이싱이 있는 경우, 앰플리콘 크기는 예상되는 전장 암호화 영역보다 작을 것이다. SARS-CoV-2 스파이크 카세트를 암호화하는 플라스미드의 PCR은 예상되는 앰플리콘 크기("스파이크 플라스미드" 왼쪽 패널, 오른쪽 열)를 실증한 반면, 감염된 293 세포로부터의 cDNA의 PCR 증폭은 2개의 더 작은 앰플리콘을 실증하여 mRNA 전사체의 스플라이싱을 표시했다("ChAd-스파이크(IDT) cDNA" 왼쪽 패널, 왼쪽 열). 또한 스파이크 코딩 서열은 S1 및 S2 암호화 서열로 분할되었다. 감염된 293 세포로부터의 S1 cDNA의 PCR 증폭은 예상되는 앰플리콘 크기를 실증하여("스파이크S1" 오른쪽 패널, 왼쪽 열) S1은 요망되지 않는 스플라이싱을 겪지 않았을 수 있는 반면 S2 영역의 서열은 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있음을 표시하였다.
더 작은 앰플리콘 서열을 분석하고 2개의 스플라이스 공여체 부위를 생거 시퀀싱에 의해 확인했다. 추가 서열 분석에 의해 3개의 추가적인 잠재적 공여체 부위가 예측되었다. 스플라이스 모티프 서열의 위치 및 정체를 아래에 제시한다(nt 3중체는 코돈에 상응하며 번호 지정은 스파이크 ATG를 참조하여 시작함).
NT 385-: AAG GTG TGT -> AAa GTc TGc(시퀀싱에 의해 확인됨)
NT 539-: AA GGT AAG C -> Ag GGc AAa C(시퀀싱에 의해 확인됨)
NT 2003-: CA GGT ATC T -> Ct GGa ATC T(예측됨)
NT 2473-: AAG GTG ACC -> AAa GTc ACC(예측됨)
NT 3417-: C CCC CTT CAG CCT GAA CTT GAT TCC -> T CCa CTg CAa CCT GAA CTT GAT agt
선택된 스플라이스 공여체 부위를 아미노산 서열을 손상시키지 않으면서 뉴클레오티드 서열 모티프를 손상시키는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제거하였다. COOL 서열-최적화 클론 CT1은 돌연변이된 NT385 및 NT539에서 서열-확인 스플라이스 공여체 모티프를 갖는 클론 CT1-2C(서열 번호 85)에 대한 참조 서열로 사용하였다. IDT 서열-최적화 클론은 클론 IDT-4C(서열 번호 86)에 대한 참조 서열로 사용하였으며 돌연변이된 NT385, NT539, NT2003 및 NT2473에서 서열-확인 및 예측된 스플라이스 공여체 모티프를 둘 모두 가질 뿐만 아니라 AAcAAA로 돌연변이된 NT445의 가능한 폴리아데닐화 부위 AATAAA를 가졌다. 스파이크 단백질 발현은 서열-확인 스플라이스 공여체 모티프를 포함하는 클론에서 웨스턴에 의해 검출되었다. 스플라이싱을 PCR 분석에 의해 작제물에서 추가로 평가하였다. 스플라이스 공여체 모티프 및/또는 잠재적인 폴리A 부위의 단독 돌연변이는 스플라이싱을 방지하지 못하여 스플라이싱이 하위우성(sub-dominant) 스플라이스 부위로부터 잠재적으로 발생함을 표시하였다.
ChAdV68 벡터로부터 발현된 전장 스파이크 mRNA에서 스플라이싱 이벤트의 확인을 고려하여, 추가적인 작제물을 생성하고 개선된 단백질 발현에 대해 평가한다. 추가적인 최적화는 외인성 핵 외수송 신호(예를 들어, 구성적 수송 요소(CTE), RNA 수송 요소(RTE) 또는 우드척 전사 후 조절 요소(WPRE))를 특징으로 하는 작제물 또는 SV40 미니-인트론(서열 번호 88)을 CMV 프로모터와 스파이크 유전자 바로 상류의 코작 서열 사이에 도입하는 것과 같은 스플라이싱을 편향시키기 위한 외인성 스플라이스 공여체/분지/수신체 모티프 서열의 도입을 통한 인공 인트론의 부가를 포함한다. 확인되고 예측된 스플라이스 공여체 모티프를 추가적인 서열 최적화와 조합으로 추가 평가한다.
XIV.B. 다중시스트론 자가 증폭 mRNA 벡터 평가
별도의 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 특징으로 하는 자가 증폭 mRNA(SAM) SARS-CoV-2 백신 설계에 대한 평가 결과를 제시한다. 도 1은 단일 알파바이러스 유래 서브게놈 프로모터(SGP)를 특징으로 하는 자가 증폭 mRNA(SAM) 시스템을 예시한다. 이러한 시스템에서는 단일 SGP가 2A 리보솜 건너뛰기 서열 요소(예를 들어, E2A, P2A, F2A 또는 T2A 서열) 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열 요소를 사용하여 다중 단백질을 발현하는 다중시스트론 전사체를 포함하는 페이로드 카세트의 전사에 단독으로 관여된다. 도 2는 별도의 SGP에 의해 구동되는 다중 발현 카세트를 특징으로 하는 SAM 시스템을 예시한다. 이론에 얽매이지 않고, 다중 SGP는 SGP1 및 SGP2 둘 모두가 제2 유전자를 암호화하는 전사체를 생산할 것이라는 점에서 제2 SGP(SGP2)의 제어하에 유전자의 더 큰 발현을 구동할 수 있다.
다양한 SARS-CoV-2 백신 설계, 작제물 및 투약 요법을 평가했다. 백신은 다양한 최적화된 버전의 스파이크 단백질, 선택된 예측 T 세포 에피토프(TCE) 또는 스파이크와 TCE 카세트의 조합을 암호화했다.
특히, 26S 전사체의 전사를 위한 프로모터로 기능하는 코어 24-nt 보존된 프로모터 서열 ctctctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하는 다양한 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터(SGP)를 평가했다.
SARS-CoV-2 펩티드(아래 표 2의 다양한 스파이크 변이체 서열)를 암호화하는 두 개의 카세트 또는 다양한 연결된 T 세포 에피토프 카세트(대표적인 "TCE5" 참고)를 갖는 벡터에서, 제1 카세트는 제1 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터 SGP1(GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC)에 의해 구동되었고 제2 카세트는 제2 서브게놈 알파바이러스 유래 프로모터 SGP2(GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG)에 의해 구동되었다. SGP2는 5' 영역에서 비구조 단백질 4(nsP4)의 C-말단 8개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 측면에 있었고 VEEV 알파바이러스로부터의 18-nt 비번역 영역(예를 들어, atagtctagtccgccaag)을 암호화하는 뉴클레오티드가 3' 측면에 있었다(모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된, Am. J. Trop. Med. Hyg., 59(6), 1998, pp. 952-964 참고). 측면 서열을 SGP1과의 재조합 방지 및 임의의 잠재적인 추가적 전사 인핸서 요소 혼입을 포함하는 다양한 목적을 위해 SGP2에 포함시켰다. 또한 SGP2는 제2 카세트에 대한 코작 서열의 5'에 바로 암호화된다. SGP1 및 SGP2를 둘 모두 포함하는 대표적인 서열을 서열 번호 93에 나타낸다.
구체적인 방법을 아래에서 추가로 상세히 설명한다.
마우스 면역화
모든 마우스 연구는 Murigenics에서 IACUC 승인 프로토콜 하에 수행하였다. 6-8주령의 Balb/c 마우스(Envigo)를 모든 연구에 사용했다. 백신은 -80℃에 보관하고 면역화 당일 실온에서 해동한 다음 PBS로 0.1 μg/mL로 희석하고 0.2마이크론 필터를 통해 여과했다. 여과된 제형물은 4℃에서 보관하였고 제조 4시간 내에 주사하였다. 모든 면역화는 전방 경골근에 대해 양측 근육내로, 각각 50 μL의 2개 주사, 총 100 μL였다.
비장세포 단리
T-세포 반응의 평가를 위해, 면역화 후 다양한 시점에 마우스 비장을 적출하였다. 일부 연구에서는 비장을 동시에 수집하고 비교할 수 있도록 면역화에 시차를 두었다. 비장을 수집하여 IFNγ ELISpot 및 ICS에 의해 분석하였다. 비장을 완전 RPMI(RPMI + 10% FBS)에 현탁시키고 gentleMACS 해리장치(Milltenyi Biotec)를 사용하여 해리시켰다. 해리된 세포를 40 μm 스트레이너를 사용하여 여과하고 적혈구를 ACK 용해 완충액(150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA)으로 용해시켰다. 용해 후, 세포를 30 μm 스트레이너로 여과하고 완전 RMPI에 재현탁했다.
혈청 수집
면역화 후 다양한 시점에 200 μL의 혈액을 채취했다. 혈액을 실온에서 10분 동안 1000 g에서 원심분리했다. 혈청을 수집하여 -80℃에서 동결했다.
S1 IgG MSD/ELISA
96-웰 QuickPlex 플레이트(Meso Scale Discovery, Rockville, MD)를 50 μL의 1 μg/mL SARS-CoV-2 S1(ACROBiosystems, Newark, DE)로 코팅하고 DPBS(Corning, Corning, NY)에 희석하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션했다. 웰을 250 μL의 PBS + 0.05% Tween-20(Teknova, Hollister, CA)을 사용하여 진탕하면서 3회 세척하고 플레이트를 궤도 진탕기 상에서 150 μL Superblock PBS(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 실온에서 1시간 동안 차단했다. 시험 혈청을 10% 종-매치 혈청(Innovative Research, Novi, MI)에서 적절한 패밀리로 희석하고 각각의 플레이트의 단일 웰에서 시험했다. 시작 희석 1:100, 3배 희석, 샘플당 11개 희석. 웰을 세척하고 50 uL의 희석된 샘플을 웰에 첨가하고 궤도 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척하고 궤도 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 DPBS + 1% BSA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 희석된 25 μL의 1 μg/mL SULFO-TAG 표지화 항-마우스 항체(MSD)와 인큐베이션했다. 웰을 세척하고 판독 완충액(MSD)을 함유하는 150 μL 트리프로필아민을 첨가하였다. QPlex SQ 120(MSD) ECL 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 즉시 실행했다. 종결점 역가는 신호가 배경 값의 두 배인 각각의 샘플에 대한 역 희석으로 정의되며 배경 값의 두 배보다 큰 마지막 두 값 사이에 선을 피팅하여 보간한다. 배경 값은 10% 종-매치 혈청만 함유하는 대조군 웰의 평균값(각 플레이트에 대해 계산함)이다.
IFNγ ELISpot 분석
제조사의 프로토콜에 따라 사전 코팅된 96-웰 플레이트(MAbtech, 마우스 IFNγ ELISpot PLUS, ALP)를 사용하여 IFNγ ELISpot 검정을 수행하였다. 샘플은 펩티드당 1 μg/mL의 최종 농도에서 다양한 중첩 펩티드 풀(15개의 아미노산 길이, 11개 아미노산 중첩)로 밤새 자극하였다. 스파이크의 경우 - SARS-CoV-2 스파이크 항원에 걸친 8개의 상이한 중첩 펩티드 풀(Genscript, 풀당 36-40개의 펩티드). 비장세포를 각각의 스파이크 풀에 대해 웰당 1 x 105개 세포로, 그리고 스파이크 풀 2, 4 및 7에 대해 웰당 2.5 x 104개 세포로(7.5 x 104개 나이브 세포와 혼합함) 2개씩 플레이팅하였다. TCE 카세트에 대한 반응을 측정하기 위해 - 뉴클레오캡시드 단백질에 걸친 하나의 풀(JPT, NCap-1, 102개의 펩티드), 막 단백질에 걸친 하나의 풀(JPT, VME-1, 53개의 펩티드) 및 Orf3a 영역에 걸친 하나의 풀(Genscript, 38개 펩티드)이 카세트에서 암호화되었다. TCE 펩티드 풀의 경우, 비장세포를 각각의 풀에 대해 웰당 2x105개 세포로 2개씩 플레이팅하였다. 각각의 샘플 및 세포 수에 대해 DMSO 단독 대조군을 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS로 세척하고 항-원숭이 IFNγ mAb 비오틴(MAbtech)과 2시간 동안 인큐베이션한 다음 추가로 세척하고 스트렙타비딘-ALP(MAbtech)와 1시간 동안 인큐베이션했다. 최종 세척 후, 플레이트를 BCIP/NBT(MAbtech)와 10분 동안 인큐베이션하여 면역스팟을 발생시켰다. 스팟은 AID 판독기(Autoimmun Diagnostika)를 사용하여 이미지화하고 열거했다. 데이터 처리 및 분석을 위해 복제 웰 가변성(가변성(Variability) = 변동성(Variance)/(중앙값 + 1))이 10 초과이고 중앙값이 10 초과인 샘플은 제외하였다. 스팟 값은 다음 식에 따라 웰 포화도에 기반하여 조정하였다:
조정된 스팟 = 미가공 스팟 + 2 * (미가공 스팟 * 포화도 / (100 - 포화도)
각 샘플은 음성 대조군 펩티드 웰의 평균값을 빼서 배경 보정하였다. 데이터는 1×106개 비장세포당 스팟 형성 콜로니(SFC)로 제시된다. 웰 포화도 값이 35% 초과인 웰은 "너무 많아 셀 수 없음"(TNTC)으로 표지하고 제외했다. TNTC인 샘플 및 펩티드의 경우, 2.5×104개 세포/웰로 측정된 값을 사용하였다.
평가한 다양한 서열은 하기와 같다:
- "IDT스파이크g": IDT 최적화 서열(서열 번호 69 참고)에 의해 암호화되고 서열 번호 59를 참조하여 D614G 돌연변이를 포함하는(서열 번호 70에서 상응하는 뉴클레오티드 돌연변이 참고) SARS-CoV-2 스파이크 단백질; "스파이크 V1"이라고도 지칭함
- "CT스파이크g": 서열 번호 59를 참조하여 D614G 돌연변이를 포함하는(서열 번호 70에서 상응하는 뉴클레오티드 돌연변이 참고) Cool Tool 최적화된 서열 버전 1(서열 번호 79)에 의해 암호화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질; "스파이크 V2"로도 지칭함. "CT스파이크D"로 지칭하는 버전에서는 D614가 변경되지 않는다.
- "CT스파이크F2Pg": 푸린 절단 부위(682-685 RRAR에서 GSAS로)를 손상시키기 위한 R682V; 및 참조 스파이크 단백질(서열 번호 59)을 참조하여 스파이크의 2차 구조를 손상시키기 위한 K986P 및 V987P를 포함하는 Cool Tool 최적화된 서열 버전 1(서열 번호 79)에 의해 암호화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질. 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 89에 나타내고 단백질 서열을 서열 번호 90에 나타냄.
- "TCE5": EDGE 플랫폼에서 스파이크 이외에 SARS-CoV-2 단백질에 대해 MHC 분자 상에 제시될 것으로 예측된 선택한 CD8+ 에피토프. 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 91에 나타내고 단백질 서열을 서열 번호 92에 나타냄.
- "TCE6": EDGE 플랫폼에서 스파이크 이외에 SARS-CoV-2 단백질에 대해 MHC 분자 상에 제시될 것으로 예측된 선택한 CD8+ 에피토프.
- "TCE7": EDGE 플랫폼에서 스파이크 이외의 SARS-CoV-2 단백질에 대해 MHC 분자 상에 제시될 것으로 예측된 선택한 CD8+ 에피토프.
- "TCE7": EDGE 플랫폼에서 스파이크 이외의 SARS-CoV-2 단백질에 대해 MHC 분자 상에 제시될 것으로 예측된 선택한 CD8+ 에피토프.
- "TCE9": SARS 및 SARS-2 사이에 보존된 검증된 에피토프를 포함하(예를 들어 범코로나바이러스 백신으로) EDGE 플랫폼에 의해 스파이크 이외에 SARS-CoV-2 단백질에 대해 MHC 분자 상에 제시될 것으로 예측된 선택한 CD8+ 에피토프로서, 특정 프레임이 대립유전자에 대한 추가적인 예측된 에피토프(즉, 검증되지 않은 에피토프)를 포함하도록 총 556개의 아미노산 크기로 연장된(모든 프레임에 걸쳐 21개의 추가적인 아미노산), 에피토프
- "TCE11": EDGE 플랫폼에 의해 스파이크 및 뉴클레오캡시드 이외에 SARS-CoV-2 단백질에 대해 MHC 분자 상에 제시될 것으로 예측된 선택한 CD8+ 에피토프; 스파이크에 더하여 총 616개의 아미노산(197 aa + 전체 N) 크기로 검증된 에피토프
- 대표적인 SAM 벡터 SAM-SGP1-TCE5-SGP2-CT스파이크GF2P는 서열 번호 93에 나타냄
[표 2]
[표 8]
[표 9]
TCE5 아미노산 서열(서열 번호 92):
MAGEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLVTLKQGEIKDATPSDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIMACLVGLMWLSYFIASFRLKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTLLWPVTLACFVLAAVYRINWFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQKMKDLSPRWYFYYLGTGPEDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGPGPGAKFVAAWTLKAAAGPGPGQYIKANSKFIGITELGPGPG-
TCE11 아미노산 서열: 연결된 EDGE 예측 SARS-CoV-2 MHC 클래스 I 에피토프 카세트 "TCE11"과 N-말단 리더(진한 글씨체) 및 C-말단 범용 MHC 클래스 II와 GPGPG 링커(서열 번호 56)(진한 이탤릭체):
MAGNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNDGVPFVVSTGYHFRELGVYLTFYLTNDVSFLAHIQWMVMFTPGLMWLSYFIASFRLFARTRSMFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKYPQISNEKQEILGTVSWNLREATTRQVVNVVTTKIALKTLACFVLAAVYRINWIT GPGPGAKFVAAWTLKAAAGPGPGQYIKANSKFIGITELGPGPG -
SAM-SGP1-TCE5-SGP2-CT스파이크 G F2P 뉴클레오티드 서열(서열 번호 93): (NT 1-17: T7 프로모터; NT 62-7543: VEEV 비-구조 단백질 코딩 영역; NT 7518-7560: SGP1; NT 7582-7587 및 9541-9546: 코작 서열; NT 7588-9474: TCE5 카세트; NT 9480-9540: SGP2; NT 9547-13368: CT스파이크 퓨린-2P)
CMV-CT스파이크GF2P-CMV-TCE5 카세트 뉴클레오티드 서열(서열 번호 114)
결과
모두 SGP1 및 SGP2에 의해 발현되는 이중 카세트를 특징으로 하는 다양한 SAM 벡터 구성을 평가했다.
다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당분야에 존재하는 잠재적인 기술적 한계를 해결하는 다중시스트론 SAM 벡터를 조사했다: (1) 큰 카세트(예를 들어, 길이가 대략 4 kb 이상인 카세트와 같이 천연 알파바이러스 서브게놈 프로모터로부터 발현된 천연 카세트의 크기보다 큼)를 포함하는 다중 페이로드의 발현 개선; (2) 다중 페이로드 발현의 개선된 제어, 예를 들어 상이한 페이로드의 상대적 발현 제어; 및 (3) 벡터 재조합 이벤트(예를 들어, 알파바이러스 서브게놈 프로모터 사이의 벡터내 프로모터 재조합)를 감소시키는 것과 같은 개선된 벡터 안정성.
카세트의 발현은 암호화된 에피토프에 대한 T 세포 반응을 모니터링함으로써 평가된 바와 같이 두 프로모터 모두에 의해 효과적으로 구동되었다. 특히, SGP2 프로모터의 제어 하에 있는 제2 카세트는 T 세포 반응을 모니터링함으로써 평가된 바와 같이, 백신 설정에서 더 우수한, 일반적으로 2배보다 큰 발현을 초래한다.
다양한 순서의 변형된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 EDGE 예측 에피토프(EPE)를 암호화하는 T 세포 에피토프(TCE) 카세트를 암호화하는 SAM 백신 플랫폼을 평가했다.
스파이크에 대한 T 세포 반응(상단 패널), 암호화된 T 세포 에피토프에 대한 T 세포 반응(중간 패널) 및 스파이크 특이적 IgG 항체(하단 패널)가 다양한 작제물로 백신접종될 때 생성되었다. 도 5 및 도 6에서(그리고 표 4A-C에서 정량함), SAM 작제물은 "IDT스파이크g"(서열 번호 69)만(왼쪽 열), 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 IDT스파이크g에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE5(가운데 열) 또는 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE5에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 IDT스파이크g(오른쪽 열)를 포함하였고, 면역 반응은 상술된 바와 같이 평가하였다. 도 7 및 도 8에서(그리고 표 5A-C에서 정량함), SAM 작제물은 "IDT스파이크g"(서열 번호 69)만(제1 열), 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 IDT스파이크g에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE6 또는 TCE7(각각 2열 및 4열) 또는 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE6 또는 TCE7에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 IDT스파이크g(각각 3열 및 5열)를 포함하였고, 면역 반응은 상술된 바와 같이 평가하였다. 도 9 및 도 10에서(그리고 표 6A-C에서 정량함), SAM 작제물은 "CT스파이크g"(서열 번호 79)만(1열), 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 CT스파이크g에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE5 또는 TCE8(각각 2열 및 4열), 또는 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE5 또는 TCE8에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 CT스파이크g(각각 3열 및 5열)를 포함하였고, 면역 반응을 상술된 바와 같이 평가하였다. 도 11 및 도 12에서(그리고 표 7A-D에 정량함), SAM 작제물은 B.1.351("남아프리카" 베타 계통) SARS-CoV-2 단리물로부터의 스파이크 단백질(501Y.V2)(서열 번호 112; " SA 스파이크")만(1열), 첫 번째 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE9(표 8 참고)에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 SA-스파이크(2열), SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(서열 번호 62; "Nuc"; 원래 우한 단리물) 및 제1 서브게놈 프로모터로부터 발현된 TCE11(표 9 참고)을 둘 모두 암호화하는 카세트(뉴클레오캡시드-T2A 링커-TCE11, GPGPG 링커 그리고 PADRE 및 파상풍 유독소 범용 MHC 클래스 II 에피토프를 둘 모두 포함함)에 이어 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현된 SA-스파이크(칼럼 3)를 포함하거나 나이브 마우스(칼럼 4)로, 면역 반응은 상술된 바와 같이 평가하였다.
일반적으로, 특히 스파이크 단백질의 경우, 스파이크만에 비해 증가된 스파이크-유래 T 세포 반응을 포함하여, 각각의 에피토프가 제2 서브게놈 프로모터(SGP2)로부터 발현될 때 T 세포 반응이 증가했다. 잠재적으로 CT스파이크g 작제물을 제외하고, 스파이크 항원이 제2 서브게놈 프로모터로부터 발현될 때 유사한 경향이 또한 증가된 스파이크 특이적 IgG 역가를 가지며 일반적으로 관찰되었다.
따라서, 결과는 특히 백신 설정에서 별개의 다중 SGP 프로모터의 사용이 알파바이러스-유래 SAM 벡터 내에서 다중 카세트의 효과적인 발현을 초래함을 실증한다. 또한, 데이터는 SAM 백신 플랫폼에서 항원 카세트의 서열 순서가 면역 반응에 영향을 미침을 실증한다.
[표 4A]
[표 4B]
[표 4C]
[표 5A]
[표 5B]
[표 5C]
[표 6A]
[표 6B]
[표 6C]
[표 7A]
[표 7B]
[표 7C]
[표 7D]
본원에서 언급된 벡터, 카세트 및 항체에 대한 특정 추가 서열을 아래에 기재하고 서열 번호로 지칭한다.
표 A
서열 목록, 서열 번호 130-8195를 참조한다. EDGE 점수 >0.001을 갖는 주어진 HLA 대립유전자와 관련될 것으로 예측된 SARS-CoV-2에 의해 암호화된 각각의 후보 MHC 클래스 I 에피토프가 제시된다. 각각의 항목은 0.001보다 큰 예측 EDGE 점수를 갖는 후보 에피토프 서열 및 동족 HLA 대립유전자를 포함하며, 각각의 동족 쌍은 H(EDGE 점수 >0.1), M(EDGE 점수 0.01 내지 0.1) 및 L(EDGE 점수 <0.01)로 순위를 매긴다. 예를 들어, 후보 에피토프 MESLVPGF(서열 번호 127)는 각각 EDGE 점수 .019, .032 및 .008로 HLA-B*18:01, HLA-B*37:01 및 HLA-B*07:05와 쌍을 이룰 것으로 예측된다. 따라서, 서열 번호 130에 대한 엔트리는 "MESLVPGF: B18:01M; B37:01M; B07:05L"이다.
표 B
서열 목록, 서열 번호 8196-26740을 참조한다. EDGE 점수 >0.001를 갖는 주어진 HLA 대립유전자와 관련될 것으로 예측된 SARS-CoV-2에 의해 암호화된 각각의 후보 MHC 클래스 II 에피토프가 제시된다. 각각의 엔트리는 0.001보다 큰 예측 EDGE 점수를 가진 후보 에피토프 서열 및 동족 HLA 대립유전자를 포함하며, 각각의 동족 쌍은 H(EDGE 점수 >0.1), M(EDGE 점수 0.01 내지 0.1) 및 L(EDGE 점수 <0.01)로 순위를 매긴다. 예를 들어, 후보 에피토프 VELVAELEGI(서열 번호 128)는 각각 EDGE 점수는 0.003145, 0.00328, 0.041097 및 0.011613으로 HLA-DQA1*03:02-B1*03:03, HLA-DRB1*11:02, HLA-DQA1*05:05-B1*03:19 및 HLA-DPA1*01:03-B1*104:01과 쌍을 이룰 것으로 예측된다. 따라서, 서열 번호 8219에 대한 엔트리는 "VELVAELEGI: DQA1*03:02-B1*03:03L; DRB1*11:02L; DQA1*05:05-B1*03:19M; DPA1*01:03-B1*104:01M"이다. HLA-DQ 및 HLA-DP만 알파 및 베타 사슬로 지칭된다. HLA-DR은 인간 집단에서 알파 사슬이 일반적으로 불변이고 HLA-DR 펩티드 접촉 영역이 특히 불변이므로 베타 사슬로만 지칭된다.
표 C
서열 목록, 서열 번호 26741-27179를 참조한다. EDGE 점수 >0.001을 갖는 주어진 HLA 대립유전자와 관련될 것으로 예측된 최적화된 카세트 내에 암호화된, 스파이크 단백질로부터의 것들 이외의 추가적인 MHC 클래스 I 에피토프가 제시된다. 추가적인 에피토프는 S1 및 S2로 분할된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(서열 번호 59)에 의해 제공된 모든 초기 에피토프로 집단 적용범위 기준 P를 계산하고 본원에 기재된 최적화 알고리즘을 적용하여 결정하였다.
표 D
SARS-CoV-2 스파이크 중첩 펩티드 풀에 대해 서열 목록, 서열 번호 27180-27495를 참조한다. 각각의 엔트리는 자극 펩티드, SARS-CoV-2 단백질 공급원, 펩티드 하위풀 정보 및 표를 포함한다. 예를 들어, 자극 펩티드 MFVFLVLLPLVSSQC(서열 번호 27180)는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(우한 D614G 변이체)로부터 유래되고 하위풀 S_Wu_1_2에 포함되며 표 D에서 발견된다. 따라서 서열 번호 27180에 대한 엔트리는 "MFVFLVLLPLVSSQC: 스파이크 우한 D614G; S_Wu_1_2; 표 D"이다.
표 E
TCE5-암호화 중첩 펩티드 풀에 대해 서열 목록, 서열 번호 27496-27603을 참조한다. 각각의 엔트리는 자극 펩티드, SARS-CoV-2 단백질 공급원, 펩티드 하위풀 정보 및 표를 포함한다. 예를 들어, 자극 펩티드 LLWPVTLACFVLAAV(서열 번호 27496)는 SARS-CoV-2 막 단백질로부터 유래되며 하위풀 OLP_Mem에 포함되고, 표 E에서 발견된다. 따라서 서열 번호 27496에 대한 엔트리는 "LLWPVTLACFVLAAV: 막; OLP_Mem; 표 E"이다.
표 F
TCE5-암호화된 최소 에피토프 펩티드 풀에 대해 서열 목록, 서열 번호 27604-27939를 참조한다. 각각의 엔트리는 자극 펩티드, SARS-CoV-2 단백질 공급원, 펩티드 하위풀 정보 및 표를 포함한다. 예를 들어, 자극 펩티드 ALSKGVHFV(서열 번호 27604)는 SARS-CoV-2 ORF3a 단백질(프레임 52-85)로부터 유래되고, 하위풀 Min_validated에 포함되며 표 F에서 발견된다. 따라서 서열 번호 27604에 대한 엔트리는 "ALSKGVHFV: ORF3a 52-85; Min_validated; 표 F"이다.
참고문헌
1. Desrichard, A., Snyder, A. & Chan, T. A. Cancer Neoantigens and Applications for Immunotherapy. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. (2015). doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-3175
2. Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348, 69-74 (2015).
3. Gubin, M. M., Artyomov, M. N., Mardis, E. R. & Schreiber, R. D. Tumor neoantigens: building a framework for personalized cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 125, 3413-3421 (2015).
4. Rizvi, N. A. et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science 348, 124-128 (2015).
5. Snyder, A. et al. Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N. Engl. J. Med. 371, 2189-2199 (2014).
6. Carreno, B. M. et al. Cancer immunotherapy. A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanoma neoantigen-specific T cells. Science 348, 803-808 (2015).
7. Tran, E. et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 344, 641-645 (2014).
8. Hacohen, N. & Wu, C. J.-Y. United States Patent Application: 20110293637 - COMPOSITIONS AND METHODS OF IDENTIFYING TUMOR SPECIFIC NEOANTIGENS. (A1). at <http://appft1.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PG01&p=1&u=/netahtml/PTO/srchnum.html&r=1&f=G&l=50&s1=20110293637.PGNR.>
9. Lundegaard, C., Hoof, I., Lund, O. & Nielsen, M. State of the art and challenges in sequence based T-cell epitope prediction. Immunome Res. 6 Suppl 2, S3 (2010).
10. Yadav, M. et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature 515, 572-576 (2014).
11. Bassani-Sternberg, M., Pletscher-Frankild, S., Jensen, L. J. & Mann, M. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol. Cell. Proteomics MCP 14, 658-673 (2015).
12. Van Allen, E. M. et al. Genomic correlates of response to CTLA-4 blockade in metastatic melanoma. Science 350, 207-211 (2015).
13. Yoshida, K. & Ogawa, S. Splicing factor mutations and cancer. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 5, 445-459 (2014).
14. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature 511, 543-550 (2014).
15. Rajasagi, M. et al. Systematic identification of personal tumor-specific neoantigens in chronic lymphocytic leukemia. Blood 124, 453-462 (2014).
16. Downing, S. R. et al. United States Patent Application: 0120208706 - OPTIMIZATION OF MULTIGENE ANALYSIS OF TUMOR SAMPLES. (A1). at <http://appft1.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PG01&p=1&u=/netahtml/PTO/srchnum.html&r=1&f=G&l=50&s1=20120208706.PGNR.>
17. Target Capture for NextGen Sequencing - IDT. at <http://www.idtdna.com/pages/products/nextgen/target-capture>
18. Shukla, S. A. et al. Comprehensive analysis of cancer-associated somatic mutations in class I HLA genes. Nat. Biotechnol. 33, 1152-1158 (2015).
19. Cieslik, M. et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. 25, 1372-1381 (2015).
20. Bodini, M. et al. The hidden genomic landscape of acute myeloid leukemia: subclonal structure revealed by undetected mutations. Blood 125, 600-605 (2015).
21. Saunders, C. T. et al. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinforma. Oxf. Engl. 28, 1811-1817 (2012).
22. Cibulskis, K. et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31, 213-219 (2013).
23. Wilkerson, M. D. et al. Integrated RNA and DNA sequencing improves mutation detection in low purity tumors. Nucleic Acids Res. 42, e107 (2014).
24. Mose, L. E., Wilkerson, M. D., Hayes, D. N., Perou, C. M. & Parker, J. S. ABRA: improved coding indel detection via assembly-based realignment. Bioinforma. Oxf. Engl. 30, 2813-2815 (2014).
25. Ye, K., Schulz, M. H., Long, Q., Apweiler, R. & Ning, Z. Pindel: a pattern growth approach to detect break points of large deletions and medium sized insertions from paired-end short reads. Bioinforma. Oxf. Engl. 25, 2865-2871 (2009).
26. Lam, H. Y. K. et al. Nucleotide-resolution analysis of structural variants using BreakSeq and a breakpoint library. Nat. Biotechnol. 28, 47-55 (2010).
27. Frampton, G. M. et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 31, 1023-1031 (2013).
28. Boegel, S. et al. HLA typing from RNA-Seq sequence reads. Genome Med. 4, 102 (2012).
29. Liu, C. et al. ATHLATES: accurate typing of human leukocyte antigen through exome sequencing. Nucleic Acids Res. 41, e142 (2013).
30. Mayor, N. P. et al. HLA Typing for the Next Generation. PloS One 10, e0127153 (2015).
31. Roy, C. K., Olson, S., Graveley, B. R., Zamore, P. D. & Moore, M. J. Assessing long-distance RNA sequence connectivity via RNA-templated DNA-DNA ligation. eLife 4, (2015).
32. Song, L. & Florea, L. CLASS: constrained transcript assembly of RNA-seq reads. BMC Bioinformatics 14 Suppl 5, S14 (2013).
33. Maretty, L., Sibbesen, J. A. & Krogh, A. Bayesian transcriptome assembly. Genome Biol. 15, 501 (2014).
34. Pertea, M. et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat. Biotechnol. 33, 290-295 (2015).
35. Roberts, A., Pimentel, H., Trapnell, C. & Pachter, L. Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq. Bioinforma. Oxf. Engl. (2011). doi:10.1093/bioinformatics/btr355
36. Vitting-Seerup, K., Porse, B. T., Sandelin, A. & Waage, J. spliceR: an R package for classification of alternative splicing and prediction of coding potential from RNA-seq data. BMC Bioinformatics 15, 81 (2014).
37. Rivas, M. A. et al. Human genomics. Effect of predicted protein-truncating genetic variants on the human transcriptome. Science 348, 666-669 (2015).
38. Skelly, D. A., Johansson, M., Madeoy, J., Wakefield, J. & Akey, J. M. A powerful and flexible statistical framework for testing hypotheses of allele-specific gene expression from RNA-seq data. Genome Res. 21, 1728-1737 (2011).
39. Anders, S., Pyl, P. T. & Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinforma. Oxf. Engl. 31, 166-169 (2015).
40. Furney, S. J. et al. SF3B1 mutations are associated with alternative splicing in uveal melanoma. Cancer Discov. (2013). doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0330
41. Zhou, Q. et al. A chemical genetics approach for the functional assessment of novel cancer genes. Cancer Res. (2015). doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-2930
42. Maguire, S. L. et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J. Pathol. 235, 571-580 (2015).
43. Carithers, L. J. et al. A Novel Approach to High-Quality Postmortem Tissue Procurement: The GTEx Project. Biopreservation Biobanking 13, 311-319 (2015).
44. Xu, G. et al. RNA CoMPASS: a dual approach for pathogen and host transcriptome analysis of RNA-seq datasets. PloS One 9, e89445 (2014).
45. Andreatta, M. & Nielsen, M. Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system. Bioinforma. Oxf. Engl. (2015). doi:10.1093/bioinformatics/btv639
46. , K. W., Rasmussen, M., Buus, S. & Nielsen, M. NetMHCstab - predicting stability of peptide-MHC-I complexes; impacts for cytotoxic T lymphocyte epitope discovery. Immunology 141, 18-26 (2014).
47. Larsen, M. V. et al. An integrative approach to CTL epitope prediction: a combined algorithm integrating MHC class I binding, TAP transport efficiency, and proteasomal cleavage predictions. Eur. J. Immunol. 35, 2295-2303 (2005).
48. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. & C. The role of the proteasome in generating cytotoxic T-cell epitopes: insights obtained from improved predictions of proteasomal cleavage. Immunogenetics 57, 33-41 (2005).
49. Boisvert, F.-M. et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Mol. Cell. Proteomics 11, M111.011429-M111.011429 (2012).
50. Duan, F. et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. J. Exp. Med. 211, 2231-2248 (2014).
51. Janeway's Immunobiology: 9780815345312: Medicine & Health Science Books @ Amazon.com. at <http://www.amazon.com/Janeways-Immunobiology-Kenneth-Murphy/dp/0815345313>
52. Calis, J. J. A. et al. Properties of MHC Class I Presented Peptides That Enhance Immunogenicity. PLoS Comput. Biol. 9, e1003266 (2013).
53. Zhang, J. et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multiregion sequencing. Science 346, 256-259 (2014)
54. Walter, M. J. et al. Clonal architecture of secondary acute myeloid leukemia. N. Engl. J. Med. 366, 1090-1098 (2012).
55. Hunt DF, Henderson RA, Shabanowitz J, Sakaguchi K, Michel H, Sevilir N, Cox AL, Appella E, Engelhard VH. Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule　HLA-A2.1 by mass spectrometry. Science 1992. 255: 1261-1263.
56. Zarling AL, Polefrone JM, Evans AM, Mikesh LM, Shabanowitz J, Lewis ST, Engelhard VH,　Hunt DF. Identification of class I MHC-associated phosphopeptides as targets for cancer immunotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 3;103(40):14889-94.
57. Bassani-Sternberg M, Pletscher-Frankild S, Jensen LJ,　Mann M. Mass spectrometry of human leukocyte antigen class I peptidomes reveals strong effects of protein abundance and turnover on antigen presentation. Mol Cell Proteomics. 2015 Mar;14(3):658-73. doi: 10.1074/mcp.M114.042812.
58. Abelin JG,　Trantham PD,　Penny SA,　Patterson AM,　Ward ST,　Hildebrand WH,　Cobbold M,　Bai DL,　Shabanowitz J,　Hunt DF. Complementary IMAC enrichment methods for　HLA-associated phosphopeptide identification by mass spectrometry. Nat Protoc.　2015 Sep;10(9):1308-18. doi: 10.1038/nprot.2015.086. Epub 2015 Aug 6
59. Barnstable CJ, Bodmer WF, Brown G, Galfre G, Milstein C, Williams AF, Ziegler A. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis. Cell. 1978 May;14(1):9-20.
60. Goldman JM, Hibbin J, Kearney L, Orchard K, Th'ng KH. HLA-DR monoclonal antibodies inhibit the proliferation of normal and chronic granulocytic leukaemia myeloid progenitor cells. Br J Haematol. 1982 Nov;52(3):411-20.
61. Eng JK,　Jahan TA,　Hoopmann MR. Comet: an open-source　MS/MS　sequence database　search　tool. Proteomics.　2013 Jan;13(1):22-4. doi: 10.1002/pmic.201200439. Epub 2012 Dec 4.
62. Eng JK,　Hoopmann MR,　Jahan TA,　Egertson JD,　Noble WS,　MacCoss MJ. A deeper look into　Comet--implementation and features. J Am Soc Mass Spectrom.　2015 Nov;26(11):1865-74. doi: 10.1007/s13361-015-1179-x. Epub 2015 Jun 27.
63. Lukas , Jesse Canterbury, Jason Weston, William Stafford Noble and Michael J. MacCoss. Semi-supervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets. Nature Methods 4:923 - 925, November 2007
64. Lukas , John D. Storey, Michael J. MacCoss and William Stafford Noble. Assigning confidence measures to peptides identified by tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research, 7(1):29-34, January 2008
65. Lukas , John D. Storey and William Stafford Noble. Nonparametric estimation of posterior error probabilities associated with peptides identified by tandem mass spectrometry. Bioinformatics, 24(16):i42-i48, August 2008
66. Kinney RM, BJ Johnson, VL Brown, DW Trent. Nucleotide Sequence of the 26 S mRNA of the Virulent Trinidad Donkey Strain of Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Deduced Sequence of the Encoded Structural Proteins. Virology 152 (2), 400-413.　1986 Jul 30.
67. Jill E Slansky, M Rattis, Lisa F Boyd, Tarek Fahmy, Elizabeth M Jaffee, Jonathan P Schneck, David H Margulies, Drew M Pardoll. Enhanced Antigen-Specific Antitumor Immunity with Altered Peptide Ligands that Stabilize the MHC-Peptide-TCR Complex. Immunity, Volume 13, Issue 4, 1 October 2000, Pages 529-538.
68. A Y Huang, P H Gulden, A S Woods, M C Thomas, C D Tong, W Wang, V H Engelhard, G Pasternack, R Cotter, D Hunt, D M Pardoll, and E M Jaffee. The immunodominant major histocompatibility complex class I-restricted antigen of a murine colon tumor derives from an endogenous retroviral gene product. Proc Natl Acad Sci U S A.; 93(18): 9730-9735, 1996 Sep 3.
69. JOHNSON, BARBARA J. B., RICHARD M. KINNEY, CRYSTLE L. KOST AND DENNIS W. TRENT. Molecular Determinants of Alphavirus Neurovirulence: Nucleotide and Deduced Protein Sequence Changes during Attenuation of Venezuelan Equine Encephalitis Virus. J Gen Virol 67:1951-1960, 1986.
70. Aarnoudse, C.A., , M., Konopitzky, R., Brouwenstijn, N., and Schrier, P.I. (2002). TCR reconstitution in Jurkat reporter cells facilitates the identification of novel tumor antigens by cDNA expression cloning. Int J Cancer 99, 7-13.
71. Alexander, J., Sidney, J., Southwood, S., Ruppert, J., Oseroff, C., Maewal, A., Snoke, K., Serra, H.M., Kubo, R.T., and Sette, A. (1994). Development of high potency universal DR-restricted helper epitopes by modification of high affinity DR-blocking peptides. Immunity 1, 751-761.
72. Banu, N., Chia, A., Ho, Z.Z., Garcia, A.T., Paravasivam, K., Grotenbreg, G.M., Bertoletti, A., and Gehring, A.J. (2014). Building and optimizing a virus-specific T cell receptor library for targeted immunotherapy in viral infections. Scientific Reports 4, 4166.
73. Cornet, S., Miconnet, I., Menez, J., Lemonnier, F., and Kosmatopoulos, K. (2006). Optimal organization of a polypeptide-based candidate cancer vaccine composed of cryptic tumor peptides with enhanced immunogenicity. Vaccine 24, 2102-2109.
74. Depla, E., van der Aa, A., Livingston, B.D., Crimi, C., Allosery, K., de Brabandere, V., Krakover, J., Murthy, S., Huang, M., Power, S., et al. (2008). Rational design of a multiepitope vaccine encoding T-lymphocyte epitopes for treatment of chronic hepatitis B virus infections. Journal of Virology 82, 435-450.
75. Ishioka, G.Y., Fikes, J., Hermanson, G., Livingston, B., Crimi, C., Qin, M., del Guercio, M.F., Oseroff, C., Dahlberg, C., Alexander, J., et al. (1999). Utilization of MHC class I transgenic mice for development of minigene DNA vaccines encoding multiple HLA-restricted CTL epitopes. J Immunol 162, 3915-3925.
76. Janetzki, S., Price, L., Schroeder, H., Britten, C.M., Welters, M.J.P., and Hoos, A. (2015). Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat Protoc 10, 1098-1115.
77. Lyons, G.E., Moore, T., Brasic, N., Li, M., Roszkowski, J.J., and Nishimura, M.I. (2006). Influence of human CD8 on antigen recognition by T-cell receptor-transduced cells. Cancer Res 66, 11455-11461.
78. Nagai, K., Ochi, T., Fujiwara, H., An, J., Shirakata, T., Mineno, J., Kuzushima, K., Shiku, H., Melenhorst, J.J., Gostick, E., et al. (2012). Aurora kinase A-specific T-cell receptor gene transfer redirects T lymphocytes to display effective antileukemia reactivity. Blood 119, 368-376.
79. Panina-Bordignon, P., Tan, A., Termijtelen, A., Demotz, S., Corradin, G., and Lanzavecchia, A. (1989). Universally immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells. Eur J Immunol 19, 2237-2242.
80. Vitiello, A., Marchesini, D., Furze, J., Sherman, L.A., and Chesnut, R.W. (1991). Analysis of the HLA-restricted influenza-specific cytotoxic T lymphocyte response in transgenic mice carrying a chimeric human-mouse class I major histocompatibility complex. J Exp Med 173, 1007-1015.
81. Yachi, P.P., Ampudia, J., Zal, T., and Gascoigne, N.R.J. (2006). Altered peptide ligands induce delayed CD8-T cell receptor interaction--a role for CD8 in distinguishing antigen quality. Immunity 25, 203-211.
82. Pushko P, Parker M, Ludwig GV, Davis NL, Johnston RE, Smith JF. Replicon-helper systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens in vivo. Virology. 1997 Dec 22;239(2):389-401.
83. Strauss, JH and E G Strauss. The alphaviruses: gene expression, replication, and evolution. Microbiol Rev. 1994 Sep; 58(3): 491-562.
84. C, Ehrengruber MU, Grandgirard D. Alphaviral cytotoxicity and its implication in vector development. Exp Physiol. 2005 Jan;90(1):45-52. Epub 2004 Nov 12.
85. Riley, Michael K. II, and Wilfred Vermerris. Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery―A Review. Nanomaterials 2017, 7(5), 94.
86. Frolov I, Hardy R, Rice CM. Cis-acting RNA elements at the 5' end of Sindbis virus genome RNA regulate minus- and plus-strand RNA synthesis. RNA. 2001 Nov;7(11):1638-51.
87. Jose J, Snyder JE, Kuhn RJ. A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly. Future Microbiol. 2009 Sep;4(7):837-56.
88. Bo Li and C. olin N. Dewey. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a referenfe genome. BMC Bioinformatics, 12:323, August 2011
89. Hillary Pearson, Tariq Daouda, Diana Paola Granados, Chantal Durette, Eric Bonneil, Mathieu Courcelles, Anja Rodenbrock, Jean-Philippe Laverdure, Caroline , Sylvie Mader, Lemieux, Pierre Thibault, and Claude Perreault. MHC class I-associated peptides derive from selective regions of the human genome. The Journal of Clinical Investigation, 2016,
90. Juliane Liepe, Fabio Marino, John Sidney, Anita Jeko, Daniel E. Bunting, Alessandro Sette, Peter M. Kloetzel, Michael P. H. Stumpf, Albert J. R. Heck, Michele Mishto. A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides. Science, 21, October 2016.
91. Mommen GP., Marino, F., Meiring HD., Poelen, MC., van Gaans-van den Brink, JA., Mohammed S., Heck AJ., and van Els CA. Sampling From the Proteome to the Human Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR) Ligandome Proceeds Via High Specificity. Mol Cell Proteomics 15(4): 1412-1423, April 2016.
92. Sebastian Kreiter, Mathias Vormehr, Niels van de Roemer, Mustafa Diken, Martin , Jan Diekmann, Sebastian Boegel, Barbara , Fulvia Vascotto, John C. Castle, Arbel D. Tadmor, Stephen P. Schoenberger, Christoph Huber, , and Ugur Sahin. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to caner. Nature 520, 692-696, April 2015.
93. Tran E., Turcotte S., Gros A., Robbins P.F., Lu Y.C., Dudley M.E., Wunderlich J.R., Somerville R.P., Hogan K., Hinrichs C.S., Parkhurst M.R., Yang J.C., Rosenberg S.A. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 344(6184) 641-645, May 2014.
94. Andreatta M., Karosiene E., Rasmussen M., Stryhn A., Buus S., Nielsen M. Accurate pan-specific prediction of peptide-MHC class II binding affinity with improved binding core identification. Immunogenetics 67(11-12) 641-650, November 2015.
95. Nielsen, M., Lund, O. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics 10:296, September 2009.
96. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics 8:238, July 2007.
97. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11(4):1-8. 1/2/2012.
98. Jensen, Kamilla Kjaergaard, et al. "Improved Methods for Prediting Peptide Binding Affinity to MHC Class II Molecules." Immunology, 2018, doi:10.1111/imm.12889.
99. Carter, S.L., Cibulskis, K., Helman, E., McKenna, A., Shen, H., Zack, T., Laird, P.W., Onofrio, R.C., Winckler, W., Weir, B.A., et al. (2012). Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat. Biotechnol. 30, 413-421
100. McGranahan, N., Rosenthal, R., Hiley, C.T., Rowan, A.J., Watkins, T.B.K., Wilson, G.A., Birkbak, N.J., Veeriah, S., Van Loo, P., Herrero, J., et al. (2017). Allele-Specific HLA Loss and Immune Escape in Lung Cancer Evolution. Cell 171, 1259-1271.e11.
101. Shukla, S.A., Rooney, M.S., Rajasagi, M., Tiao, G., Dixon, P.M., Lawrence, M.S., Stevens, J., Lane, W.J., Dellagatta, J.L., Steelman, S., et al. (2015). Comprehensive analysis of cancer-associated somatic mutations in class I HLA genes. Nat. Biotechnol. 33, 1152-1158.
102. Van Loo, P., Nordgard, S.H., , O.C., Russnes, H.G., Rye, I.H., Sun, W., Weigman, V.J., Marynen, P., Zetterberg, A., Naume, B., et al. (2010). Allele-specific copy number analysis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 16910-16915.
103. Van Loo, P., Nordgard, S.H., , O.C., Russnes, H.G., Rye, I.H., Sun, W., Weigman, V.J., Marynen, P., Zetterberg, A., Naume, B., et al. (2010). Allele-specific copy number analysis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 16910-16915.

Claims (105)

  1. 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하는 항원 발현 시스템 전달용 조성물로서, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템 전달용 조성물이 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하며,
    자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함하고, 하나 이상의 벡터는
    (a) RNA 알파바이러스 골격으로서, 다음을 포함하는, RNA 알파바이러스 골격:
    (i) 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열; 및
    (b) 적어도 2개의 카세트로서, 각각의 카세트는 독립적으로 다음을 포함하는, 적어도 2개의 카세트:
    (i) 다음을 포함하는 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열:
    a. 에피토프-암호화 핵산 서열,
    b. 임의로 5' 링커 서열, 및
    c. 임의로 3' 링커 서열; 및
    (ii) 임의로, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열로서, 알파바이러스에 대해 천연 폴리(A) 서열 또는 외인성 폴리(A) 서열인, 제2 폴리(A) 서열
    을 포함하고, 5'에서 3'으로 배향된 적어도 2개의 카세트 중 제1 카세트는 폴리뉴클레오티드 서열 ctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제1 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터(SGP1)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 적어도 2개의 카세트 중 적어도 제2 카세트는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제2 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터(SGP2)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고,
    SGP1 및/또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, SGP1의 연장된 3' 프로모터 영역이 SGP2의 연장된 3' 프로모터 영역과 상이한, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터 중 어느 하나가 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역이 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역이 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역이 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT로 구성된, 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역이 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG로 구성된, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역이 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 각각의 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT를 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하고; (b) 둘 모두가 아닌 SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터 중 하나만 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 추가로 포함하는 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하고, 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG는 폴리뉴클레오티드 서열 CTACGACAT의 3'에 암호화된, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SGP1 서브게놈 프로모터, SGP2 서브게놈 프로모터, 또는 둘 모두가 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 5' 프로모터 영역을 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 알파바이러스 비구조 단백질 4(nsp4)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 암호화된, 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된, 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 ctct를 포함하는, 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함하는, 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함하는, 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함하는, 조성물.
  17. 제10항에 있어서, 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성된, 조성물.
  18. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactct를 포함하는, 조성물.
  19. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 acctgagaggggcccctataactct를 포함하는, 조성물.
  20. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct를 포함하는, 조성물.
  21. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터의 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열의 5'에 바로 암호화된 폴리뉴클레오티드 서열 gggcccctataactct로 구성된, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 알파바이러스 골격의 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열이 SGP1 서브게놈 프로모터를 포함하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역이 코어 보존된 프로모터 서열을 유도하기 위해 사용된 알파바이러스와 동일한 알파바이러스로부터 유래된, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역이 SGP1 및 SGP2 서브게놈 프로모터 사이의 재조합을 감소시키거나 제거할 수 있는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역이 하나 이상의 전사 인핸서 요소를 포함하는, 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터가 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 카세트의 발현을 적어도 2배 더 크게 촉진할 수 있는, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2의 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역이 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 카세트의 발현을 적어도 2배 더 크게 촉진할 수 있는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터가 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 대상체에 대한 투여 후 SGP2 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 카세트에 의해 암호화된 에피토프에 대해 더 강한 면역 반응을 자극할 수 있는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2의 연장된 3' 프로모터 영역 및/또는 연장된 5' 프로모터 영역이 SGP1 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 동일한 카세트에 비해 대상체에 대한 투여 후 SGP2 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 카세트에 의해 암호화된 에피토프에 대해 더 강한 면역 반응을 자극할 수 있는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터가 제2 카세트의 5'에 바로, 임의로 제2 카세트의 코작 서열의 5'에 바로 암호화된, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, SGP1 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) SGP1 또는 SGP2 서브게놈 프로모터 중 하나가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하고;
    (b) 다른 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하지만 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하지 않는, 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, SGP2 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하고, SGP1 서브게놈 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열 GGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGAC를 포함하며, SGP1 서브게놈 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열 ATAGTCTAGTCCGCCAAG를 포함하지 않는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 하나 이상의 구성된 서열이 5'에서 3'으로 다음을 포함하는 화학식으로 기재되는, 조성물:
    P1-(L5b-Nc-L3d)X-P2-(L5b-Nc-L3d)X-Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
    (식 중, P1은 SGP1 서브게놈 프로모터를 포함하고, P2는 SGP2 서브게놈 프로모터를 포함하며, 추가 카세트의 경우 Pa에 대해 a = 0 또는 1이고,
    N은 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, c = 1이고,
    L5는 5' 링커 서열을 포함하며, b = 0 또는 1이고,
    L3은 3' 링커 서열을 포함하며, d = 0 또는 1이고,
    G5는 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하며, e = 0 또는 1이고,
    G3은 GPGPG 아미노산 링커를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 중 하나를 포함하며, g = 0 또는 1이고,
    U는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열 중 하나를 포함하며, f = 1이고,
    X = 1 내지 400이고, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc는 상응하는 에피토프-암호화 핵산 서열이고,
    Y = 0, 1 또는 2이고, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf는 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이고, 임의로 적어도 하나의 범용 서열은 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나를 포함함).
  37. 제36항에 있어서, 각각의 X에 대해 상응하는 Nc가 별개의 에피토프-암호화 핵산 서열인, 조성물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 각각의 Y에 대해 상응하는 Uf가 별개의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열인, 조성물.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 N이 7-15개의 아미노산 길이의 MHC 클래스 I 에피토프, MHC 클래스 II 에피토프, B 세포 반응을 자극할 수 있는 에피토프, 또는 이의 조합을 암호화하고,
    L5가 에피토프의 천연 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 5' 링커 서열이고, 5' 링커 서열은 적어도 2개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하고,
    L3이 에피토프의 천연 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 천연 3' 링커 서열이고, 3' 링커 서열은 적어도 2개의 아미노산 길이인 펩티드를 암호화하는, 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프-암호화 핵산 서열이
    야생형 핵산 서열에 의해 암호화되는 상응하는 펩티드 서열과 구별되는 암호화된 에피토프 서열을 만드는 적어도 하나의 변경;
    병원체 유래 펩티드, 바이러스 유래 펩티드, 박테리아 유래 펩티드, 진균 유래 펩티드 및 기생충 유래 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 감염성 질환 유기체 펩티드를 암호화하는 핵산 서열로서, 임의로 에피토프-암호화 핵산 서열은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 에피토프를 암호화하는, 핵산 서열; 또는
    이의 조합
    을 포함하는 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 나노미립자 전달 비히클을 추가로 포함하는 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 나노미립자 전달 비히클이 지질 나노입자(LNP)인, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, LNP가 이온화 가능 아미노 지질을 포함하는, 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 이온화 가능 아미노 지질이 MC3-유사(디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트) 분자를 포함하는, 조성물.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 나노미립자 전달 비히클이 항원 발현 시스템을 캡슐화하는, 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 골격이 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 또는 마야로 바이러스의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 골격이 베네수엘라 말 뇌염 바이러스의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 골격이 적어도 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 비구조 단백질-매개 증폭을 위한 서열, 26S 프로모터 서열, 폴리(A) 서열, 비구조 단백질 1(nsP1) 유전자, nsP2 유전자, nsP3 유전자, 및 nsP4 유전자를 포함하는, 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 골격이 적어도 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 비구조 단백질-매개 증폭을 위한 서열, 26S 프로모터 서열, 및 폴리(A) 서열을 포함하는, 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 비구조 단백질-매개 증폭을 위한 서열이 알파바이러스 5' UTR, 51-nt CSE, 24-nt CSE, 26S 서브게놈 프로모터 서열, 19-nt CSE, 알파바이러스 3' UTR 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된, 조성물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 골격이 구조적 비리온 단백질 캡시드, E2 및 E1을 암호화하지 않는, 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 카세트가 아우라 바이러스, 포트 모건 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 또는 마야로 바이러스의 뉴클레오티드 서열 내의 구조적 비리온 단백질 대신 삽입된, 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스가 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열을 포함하는, 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스가 염기쌍 7544와 11176 사이에 결실을 추가로 포함하는 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열을 포함하는, 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 골격이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 카세트가 위치 7544에 삽입되어 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 서열에 제시된 바와 같이 염기쌍 7544와 11176 사이의 결실을 대체하는, 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 카세트 중 하나 이상이 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개의 뉴클레오티드 길이인, 조성물.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 카세트 중 하나 이상이 적어도 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000개의 뉴클레오티드 길이인, 조성물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 벡터가 적어도 3500개의 뉴클레오티드 길이인 카세트의 발현을 구동할 수 있는, 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 벡터가 적어도 6000개의 뉴클레오티드 길이인 카세트의 발현을 구동할 수 있는, 조성물.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나가 MHC 클래스 I에 의해 제시되는 에피토프를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나가 MHC 클래스 II에 의해 제시되는 에피토프를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나가 B 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, 임의로 B 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부는 항체에 의해 결합될 수 있는 것으로 예측되거나 알려진 전장 단백질, 단백질 도메인, 단백질 서브유닛, 또는 항원성 단편을 포함하는, 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열이 2개 이상의 항원-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 각각의 항원-암호화 핵산 서열이 서로 직접 연결된, 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 각각의 항원-암호화 핵산 서열이 링커를 암호화하는 핵산 서열로 별개의 항원-암호화 핵산 서열에 연결된, 조성물.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나가 적어도 하나의 HLA 대립유전자에 의해 제시될 수 있는 것으로 예측되거나 검증된 2개 이상의 별개의 에피토프를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열이 적어도 2-10, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열이 적어도 11-20, 15-20, 11-100, 11-200, 11-300, 11-400, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 최대 400개의 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열이 적어도 2-400개의 핵산 서열을 포함하고, 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 2개가 (1) MHC 클래스 I에 의해 제시되고/되거나, (2) MHC 클래스 II에 의해 제시되고/되거나, (3) B 세포 반응을 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 2개가 (1) MHC 클래스 I에 의해 제시되고/되거나, (2) MHC 클래스 II에 의해 제시되고/되거나, (3) B 세포 반응 클래스를 자극할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여되고 번역될 때, 적어도 하나의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 암호화되는 에피토프 중 적어도 하나가 항원 제시 세포 상에 제시되어 세포 표면 상의 항원 중 적어도 하나를 표적화하는 면역 반응을 초래하는, 조성물.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여되고 번역될 때, 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열에 의해 암호화되는 항원 중 적어도 하나가 항원 중 적어도 하나를 표적화하는 항체 반응을 초래하는, 조성물.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여되고 번역될 때 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 항원 중 적어도 하나가 항원 제시 세포 상에 제시되어 세포 표면 상의 항원 중 적어도 하나를 표적화하는 면역 반응을 초래하고, 임의로 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 각각의 발현은 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열에 의해 구동된, 조성물.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 MHC 클래스 I 에피토프-암호화 핵산 서열이 8 내지 35개의 아미노산 길이, 임의로 9-17, 9-25, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열을 암호화하는, 조성물.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재하는, 조성물.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재하고, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 12-20, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 20-40개의 아미노산 길이인, 조성물.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열이 존재하고, 적어도 하나의 범용 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하고, 임의로 적어도 하나의 범용 서열이 파상풍 유독소 및 PADRE 중 적어도 하나, 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프-암호화 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 제2 프로모터 뉴클레오티드 서열이 유도성인, 조성물.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 제2 프로모터 뉴클레오티드 서열이 비유도성인, 조성물.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열이 골격에 대해 천연인 폴리(A) 서열을 포함하는, 조성물.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열이 골격에 대해 외인성인 폴리(A) 서열을 포함하는, 조성물.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열이 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나에 작동 가능하게 연결된, 조성물.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열이 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개 또는 적어도 90개의 연속 A 뉴클레오티드인, 조성물.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리(A) 서열이 적어도 80개의 연속 A 뉴클레오티드인, 조성물.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열이 존재하는, 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열이 SV40 폴리(A) 신호 서열 또는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 신호 서열, 또는 2개 이상의 SV40 폴리(A) 신호 서열 또는 BGH 폴리(A) 신호 서열의 조합을 포함하는, 조성물.
  89. 제87항에 있어서, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열이 2개 이상의 제2 폴리(A) 서열을 포함하고, 임의로 2개 이상의 제2 폴리(A) 서열이 2개 이상의 SV40 폴리(A) 신호 서열, 2개 이상의 BGH 폴리(A) 신호 서열, 또는 SV40 폴리(A) 신호 서열과 BGH 폴리(A) 신호 서열의 조합을 포함하는, 조성물.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 카세트가 인트론 서열, 외인성 인트론 서열, 구성적 수송 요소(CTE), RNA 수송 요소(RTE), 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE) 서열, 내부 리보솜 진입 서열(IRES), 2A 자가 절단 펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 퓨린 절단 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열 중 적어도 하나에 작동 가능하게 연결된 mRNA의 핵 외수송, 안정성 또는 번역 효율을 향상시키는 것으로 알려진 5' 또는 3' 비코딩 영역의 서열 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 조성물.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 카세트가 녹색 형광 단백질(GFP), GFP 변이체, 분비된 알칼리성 포스파타제, 루시퍼라제, 루시페라제 변이체 또는 검출 가능한 펩티드 또는 에피토프를 포함하지만 이에 제한되지 않는 리포터 유전자를 추가로 포함하는, 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 검출 가능한 펩티드 또는 에피토프가 HA 태그, 플래그 태그, His-태그 또는 V5 태그로 구성된 군으로부터 선택된, 조성물.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 벡터가 적어도 하나의 면역 조절제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 면역 조절제가 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항-4-1BB 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-OX-40 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, 단일 사슬 Fv(scFv), 함께 연결된 단일 특이성 또는 다중 특이성으로서의 단일 도메인 항체(sdAb)(예를 들어, 낙타 항체 도메인), 또는 전장 단일 사슬 항체(예를 들어, 유연한 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄를 갖는 전장 IgG)인, 조성물.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 2A 또는 IRES와 같은 자가 절단 서열에 의해 분리된 인접 서열이거나; 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 연속 글리신 잔기와 같은 유연한 링커에 의해 연결된, 조성물.
  97. 제93항에 있어서, 면역 조절제가 사이토카인인, 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 사이토카인이 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 또는 IL-21 또는 각각의 이의 변이체 중 적어도 하나인, 조성물.
  99. 임의의 상기 조성물의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 벡터 세트.
  100. 임의의 상기 조성물의 뉴클레오티드 서열 또는 단리된 뉴클레오티드 서열 세트를 포함하는 단리된 세포로서, 임의로 BHK-21, CHO, HEK293 또는 이의 변이체, 911, HeLa, A549, LP-293, PER.C6, 또는 AE1-2a 세포인 세포.
  101. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트.
  102. 대상체에 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 조성물 또는 임의의 상기 조성물 중 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  103. 대상체에 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 대상체가 적어도 하나의 항원-암호화 핵산 서열의 에피토프-암호화 핵산 서열에 의해 암호화되는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 에피토프를 제시하는 것으로 예측되거나 알려진 적어도 하나의 HLA 대립유전자를 발현하는 방법.
  105. 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하는 페이로드 전달용 조성물로서, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템 전달용 조성물이 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템을 포함하며, 자가 복제 알파바이러스 기반 발현 시스템은 하나 이상의 벡터를 포함하고, 하나 이상의 벡터는
    (a) RNA 알파바이러스 골격으로서, 다음을 포함하는, RNA 알파바이러스 골격:
    (i) 적어도 하나의 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열; 및
    (b) 적어도 2개의 카세트로서, 각각의 카세트가 독립적으로 다음을 포함하는, 적어도 2개의 카세트:
    (i) 적어도 하나의 페이로드-암호화 핵산 서열; 및
    (ii) 임의로, 적어도 하나의 제2 폴리(A) 서열로서, 알파바이러스에 대해 천연 폴리(A) 서열 또는 외인성 폴리(A) 서열인, 제2 폴리(A) 서열
    을 포함하고, 5'에서 3'으로 배향된 적어도 2개의 카세트 중 제1 카세트는 폴리뉴클레오티드 서열 ctacggcTAAcctgaa(+1)tgga를 포함하는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제1 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터(SGP1)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, 적어도 2개의 카세트 중 적어도 제2 카세트는 코어 보존된 프로모터 서열을 포함하는 제2 서브게놈 알파바이러스-유래 프로모터(SGP2)를 포함하는 프로모터 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고,
    SGP1 및/또는 SGP2 서브게놈 프로모터는 코어 보존된 프로모터 서열의 3'에 암호화된 알파바이러스로부터 유래된 연장된 3' 프로모터 영역을 포함하는, 조성물.
KR1020237027790A 2021-01-19 2022-01-19 변형된 알파바이러스 벡터 KR20230134138A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163139297P 2021-01-19 2021-01-19
US63/139,297 2021-01-19
PCT/US2022/013004 WO2022159511A2 (en) 2021-01-19 2022-01-19 Modified alphavirus vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230134138A true KR20230134138A (ko) 2023-09-20

Family

ID=82549040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237027790A KR20230134138A (ko) 2021-01-19 2022-01-19 변형된 알파바이러스 벡터

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240167057A1 (ko)
EP (1) EP4281110A2 (ko)
JP (1) JP2024503108A (ko)
KR (1) KR20230134138A (ko)
CN (1) CN117279660A (ko)
AU (1) AU2022210420A1 (ko)
CA (1) CA3205216A1 (ko)
IL (1) IL304311A (ko)
WO (1) WO2022159511A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022268916A2 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 Ose Immunotherapeutics Pan-coronavirus peptide vaccine
US20230366001A1 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 SunVax mRNA Therapeutics Inc. Synthetic self-amplifying mrna molecules with secretion antigen and immunomodulator
WO2024026553A1 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Centre Hospitalier De L'université De Montréal Novel antigenic epitope against sars-cov-2 and uses thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE440957T1 (de) * 1993-09-15 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante alphavirus vektoren
CA3062591A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Gritstone Oncology, Inc. Alphavirus neoantigen vectors

Also Published As

Publication number Publication date
CN117279660A (zh) 2023-12-22
EP4281110A2 (en) 2023-11-29
JP2024503108A (ja) 2024-01-24
US20240167057A1 (en) 2024-05-23
CA3205216A1 (en) 2022-07-28
IL304311A (en) 2023-09-01
WO2022159511A3 (en) 2022-10-06
WO2022159511A2 (en) 2022-07-28
AU2022210420A1 (en) 2023-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3099644A1 (en) Shared antigens
JP7457733B2 (ja) 改変アデノウイルス
US20240167057A1 (en) Modified alphavirus vectors
US20220125919A1 (en) Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors
WO2021119545A1 (en) Durable vaccination
US11771747B2 (en) Multiepitope vaccine cassettes
US20230310563A1 (en) Antigen-encoding cassettes
AU2019275070A1 (en) Immune checkpoint inhibitor co-expression vectors
US20240093235A1 (en) Homologous adenoviral vaccination
CA3231297A1 (en) Kras neoantigen therapies
CN117957015A (zh) Kras新抗原疗法