KR20230126456A

KR20230126456A - 중증 열성 혈소판감소 증후군에 대한 예방 및 치료용 백신

Info

Publication number: KR20230126456A
Application number: KR1020220023642A
Authority: KR
Inventors: 이주연; 임희영; 박우정; 정선희
Original assignee: 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장)
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-08-30

Abstract

본 발명은 중증 열성혈소판감소 증후군 백신 범용 후보주의 불활성화 면역 후보물질 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스는 다양한 유전형의 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 교차 중화능이 우수하여 중증 열성혈소판감소 증후군혈소판감소 증후군혈소판감소 증후군용할 수 있다.

Description

중증 열성 혈소판감소 증후군에 대한 예방 및 치료용 백신 {Vaccines for the prevention and treatment of severe febrile thrombocytopenia syndrome}

본 발명은 중증 열성 혈소판감소 증후군의 불활성화 바이러스를 유효성분으로 함유하는 중증 열성 혈소판감소 증후군의 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다.

중증 열성 혈소판감소 증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome; SFTS)은 SFTS 바이러스 (SFTSV)에 의한 진드기 매개 열성 질환으로, 고열, 혈소판감소, 전신염증반응증후군, 다발성 장기부전의 임상적 증상으로 보이며, 특히 고령군에서의 중증도가 높다고 보고되어 있다.

SFTSV는 플레보바이러스 속 (Phlebovirus genus)에 속하는 단일 가닥 음성 (single-stranded negative sense) RNA 바이러스이며 11,490 뉴클레오타이드 크기로 3개의 세그먼트 (segment), 즉 L (large), M (medium) 그리고 S (small) 세그먼트로 구성되어 있다. 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid, N)와 비구조 (non-structural, NS) 단백질은 S 세그먼트에서 암호화되며, 반면에 L과 M 세그먼트는 각각 RNA-의존적 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)와 Gn-Gc 엔벨로프 당단백질 (Gn-Gc envelope glycoprotein)을 암호화한다고 알려져 있다.

국내에서는 제3군 법정감염병으로 2013년 첫 환자 발생 이후 환자 발생이 매년 증가하고 있으며, 치사율은 약 18%로 알려져 있다. SFTSV의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTSV가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 여겨지고 있다. 국내외에서 SFTSV 감염증 관련 연구로 바이러스 특성 분석, 치료제 탐색 및 백신개발 연구 등이 진행되고 있다. 단백질 서브유닛, DNA 기반 등 여러 플랫폼 적용 백신후보 개발 및 비임상 효능평가 등이 진행 중이나, 아직 백신이 개발되지 않은 실정이다. 또한, 국내외 SFTS 바이러스의 다양한 유전형에 따른 변이성을 고려하여 이들 다양한 변이주에 대한 면역성을 보유한 인체유래 후보주를 선별해야 할 필요성이 제기되고 있다.

종래의 선행 기술로서 대한민국 등록특허 제10-2097994호에는 SFTSV의 유전형 B에 속하는 B-1, B-2 및 B-3 유전형에 대한 면역원성을 개시하고 있다. 또한 대한민국 등록특허 제10-2097992에는 A 또는 F 유전형에 대한 면역원성을 개시하고 있다. 또한, 등록특허 제10-1630499호에는 SFTSV 및 이를 이용한 SFTSV 진단 방법을 개시하고 있다. 그러나 SFTSV의 다양한 유전형에 대한 교차면역능을 보이는 백신에 대해서는 개시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 국내 SFTS 인체 분리주에서 동정된 바이러스에서 다른 유전형의 바이러스에 대한 교차면역능이 있는 방어면역 (백신용) 변이주를 선별하였고, 상기 선별된 바이러스 변이주의 불활화 조건을 구축하여 SFTSV에 대한 면역원성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스를 가지고 면역화에 반응하여 생산된 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사람이 아닌 동물에서 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항혈청을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 L 세그먼트 (segment)를 암호화하는 아미노산 서열, 서열번호 2의 M 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열 및 서열번호 3의 S 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4의 L 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열, 서열번호 5의 M 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열 및 서열번호 6의 S 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스를 가지고 면역화에 반응하여 생산된 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단 키트을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 항원-항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 검체로부터 분리된 시료를 상기 바이러스와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 바이러스를 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 사람이 아닌 동물에게 투여하는 단계; 및 (b) 상기 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항체를 함유하는 항혈청 또는 혈장을 수집하는 단계를 포함하는 사람이 아닌 동물에서 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항혈청을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 시료를 상기 바이러스와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 중증 열성혈소판감소 증후군 백신 범용 후보주의 불활성화 면역 후보물질 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스는 다양한 유전형의 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 교차 중화능이 우수하여 중증 열성 혈소판감소 증후군의 예방 또는 치료용 백신으로서 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 SFTS 바이러스의 유전형별 세포병변효과를 나타낸 도이다.
도 2는 유전형별 바이러스 감염 후 3일, 7일째 역가 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 마우스에서의 SFTS 바이러스 중화항체 형성능 확인 실험 모식도이다.
도 4는 마우스에서의 SFTS 바이러스 중화능을 확인한 도이다.
도 5a는 노령 면역결핍마우스 (C57/BL6 (IFNR^-/-)에서 B2 유전형 바이러스 농도별 감염 후 생존율을 나타낸 도이다.
도 5b는 노령 면역결핍마우스 (C57/BL6 (IFNR^-/-)에서 B2 유전형 바이러스 농도별 감염 후 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 5c는 노령 면역결핍마우스 (C57/BL6 (IFNR^-/-)에서 F 유전형 바이러스 농도별 감염 후 생존율을 나타낸 도이다.
도 5d는 노령 면역결핍마우스 (C57/BL6 (IFNR^-/-)에서 F 유전형 바이러스 농도별 감염 후 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 포름알데히드 (FA) 농도별 SFTS 바이러스 불활화를 확인한 도 (붉은 점선: 바이러스 검출 한계점)이다.
도 7은 포름알데히드 (FA) 온도별 SFTS 바이러스 불활화를 확인한 (붉은 점선: 바이러스 검출한계점) 도이다.
도 8a는 포름알데히드 (FA)에 의해 불활화된 SFTS 바이러스의 세포내 유전자 증폭을 결과를 나타낸 도이다.
도 8b는 포름알데히드 (FA)에 의해 불활화된 SFTS 바이러스의 재감염 시, 세포내 유전자 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 포름알데히드 (FA)에 의해 불활화된 비농축 SFTS 바이러스 감염 세포에서의 바이러스 단백질 발현을 확인한 도이다 (1열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 2-4열; FA처리 후 1, 7, 14 DPI, 5-8열; FA (재감염) - 1, 3, 5, 7 DPI, 9-11열; 바이러스 대조군 - 1, 3, 5 DPI).
도 9b는 포름알데히드 (FA)에 의해 불활화된 농축 SFTS 바이러스 감염 세포에서의 바이러스 단백질 발현을 확인한 도이다 (1열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 2-4열; FA처리 후 1, 7, 14 DPI, 5-8열; FA (재감염) - 1, 3, 5, 7 DPI, 9-11열; 바이러스 대조군 - 1, 3, 5 DPI).
도 10은 과산화수소 (H₂O₂) 농도별 SFTS 바이러스 불활화 조건을 확인한 (붉은 점선: 바이러스 검출한계점) 도이다.
도 11은 과산화수소 처리시 온도별 SFTS 바이러스 불활화 조건 확인한 도이다.
도 12a는 과산화수소에 의해 불활화된 SFTS 바이러스의 세포내 유전자 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 12b는 과산화수소에 의해 불활화된 SFTS 바이러스의 재감염 시, 세포내 유전자 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 13a는 과산화수소에 의해 불활화된 비농축 SFTS 바이러스 감염 세포내 바이러스 단백질 발현을 확인한 도이다 (1열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 2-4열; FA처리 후 1, 7, 14 DPI, 5-8열; FA (재감염) - 1, 3, 5, 7 DPI, 9-11열; 바이러스 대조군 - 1, 3, 5 DPI).
도 13b는 과산화수소에 의해 불활화된 농축 SFTS 바이러스 감염 세포내 바이러스 단백질 발현을 확인한 도이다 (1열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 2-4열; FA처리 후 1, 7, 14 DPI, 5-8열; FA (재감염) - 1, 3, 5, 7 DPI, 9-11열; 바이러스 대조군 - 1, 3, 5 DPI).
도 14는 β-프로피오락톤 (BPL) 농도별 SFTS 바이러스 불활화 조건을 확인한 (붉은 점선: 바이러스 검출한계점) 도이다.
도 15a는 β-프로피오락톤 (BPL)에 의해 불활화된 SFTS 바이러스의 세포내 유전자 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 15b는 β-프로피오락톤에 의해 불활화된 SFTS 바이러스의 재감염 시, 세포내 유전자 증폭 결과를 나타낸 도이다.
도 16a는 β-프로피오락톤에 의해 불활화된 비농축 SFTS 바이러스 감염 세포내 바이러스 단백질 발현을 확인한 도이다 (1열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 2-4열; FA처리 후 1, 7, 14 DPI, 5-8열; FA (재감염) - 1, 3, 5, 7 DPI, 9-11열; 바이러스 대조군 - 1, 3, 5 DPI).
도 16b는 β-프로피오락톤에 의해 불활화된 농축 SFTS 바이러스 감염 세포내 바이러스 단백질 발현을 확인한 도이다 (1열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 2-4열; FA처리 후 1, 7, 14 DPI, 5-8열; FA (재감염) - 1, 3, 5, 7 DPI, 9-11열; 바이러스 대조군 - 1, 3, 5 DPI).
도 17은 수크로스 농도 구배 (Sucrose density gradient) 방법을 이용한 불활화 SFTS 바이러스 정제를 나타낸 도이다.
도 18은 포름알데히드로 불활화된 바이러스의 농축 및 정제 후 Gn 단백질 검출한 결과를 나타낸 도이다 (1열; 불활화 바이러스, 2열; SFTSV 감염된 세포 용해물, 3 내지 13열; 1-11 분획물)
도 19a는 37℃에서 과산화수소로 불활화된 바이러스의 농축 및 정제 후 Gn 단백질 검출 결과를 나타낸 도이다 (1열; SFTS바이러스에 감염된 세포 용해물, 2-12열; 1-11 분획물).
도 19b는 4℃에서 과산화수소로 불활화된 바이러스의 농축 및 정제 후 Gn 단백질 검출 결과를 나타낸 도이다 (1열; SFTS바이러스에 감염된 세포 용해물, 2-12열; 1-11 분획물).
도 20은 β-프로피오락톤으로 불활화된 바이러스의 농축 및 정제 후 Gn 단백질 검출 결과를 나타낸 도이다 (1열; SFTS바이러스에 감염된 세포 용해물, 2-12열; 1-11 분획물).
도 21은 투과전자현미경 (TEM)을 이용하여 불활화 SFTS 바이러스 형태를 확인한 도이다.
도 22a는 저농도 (5 ㎍)의 불활화 바이러스 3종 (FA, BPL 및 H₂O₂₎에 대한 항체 (IgG) 형성능을 비교 분석힌 도이다.
도 22b는 고농도 (20 ㎍)의 불활화 바이러스 3종(FA, BPL 및 H₂O₂₎에 대한 항체(IgG) 형성능을 비교 분석한 도이다.
도 23a는 저농도 (5 ㎍)의 불활화 SFTS 바이러스에 대한 중화항체 형성능 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 23b는 고농도 (20 ㎍)의 불활화 SFTS 바이러스에 대한 중화항체 형성능 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 24a는 불활화 SFTS 바이러스에 대한 RNA 면역증강제의 IgG2c Gn 형성능을 평가한 도이다.
도 24b는 불활화 SFTS 바이러스에 대한 RNA 면역증강제의 IgG2c NP 형성능을 평가한 도이다.
도 24c는 불활화 SFTS 바이러스에 대한 RNA 면역증강제의 IgG1c Gn 형성능을 평가한 도이다.
도 24d는 불활화 SFTS 바이러스에 대한 RNA 면역증강제의 IgG1c NP 형성능을 평가한 도이다.
도 25는 SFTS 불활화 백신의 혼합조건에 따른 중화항체 형성능 분석한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스는 마이너스 단일가닥 RNA 바이러스로 부니아바이러스과 (Bunyaviridae)과, 플레보바이러스 (phlebovirus) 속에 속한다. 직경 80~100nm의 구형 바이러스로 작은 참진드기를 매개체로 하며, 유전체는 large(L), Medium (M), small (S) 세그먼트로 구성되어 있으며, RNA dependent RNA polymerase (RdRp), glycoprotein precursor(M), glycoprotein N (Gn), glycoprotein C (Gc), nucleocapsid protein (NP) 및 non-structural protein (NSs)의 6개의 단백질을 코딩한다. 마이너스 또는 안티센스 가닥 (바이러스 단백질을 코딩하는 센스 또는 플러스 가닥에 대한 안티센스)은 단백질 또는 유전자가 안티센스로서 코딩되며, 유전자의 단백질로의 발현을 위해 센스 또는 플러스 가닥 RNA 생성 후, 이로부터 번역을 수행하여 단백질이 생성된다.

본 발명은 서열번호 1의 L 세그먼트 (segment)를 암호화하는 아미노산 서열, 서열번호 2의 M 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열 및 서열번호 3의 S 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스를 제공한다.

상기 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스는 계통학적으로 B2 유전형에 속하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스이다.

또한, 서열번호 4의 L 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열, 서열번호 5의 M 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열 및 서열번호 6의 S 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스를 제공한다.

상기 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스는 계통학적으로 F 유전형에 속하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스이다.

본 발명자들은 110주의 국내 SFTS 인체 분리주의 분자계통학적 분석, M 유전자 아미노산 서열의 상동성 비교 분석, 세포변병효과를 분석을 토대로 유전형 (A, B2, B3, D, F)별 2개의 바이러스를 선정하였다. 또한, 총 10주의 바이러스 (A, B2, B3, D, F type, 각 2주씩)에 대해 교차 중화능을 확인하였고, 이를 통해 국내발생 주요 유전형으로 확인된 B2 유전형 바이러스 1주와 모든 유전형 바이러스에 대해 높은 중화항체가를 가지는 F 유전형 바이러스 1주, 총 2주를 최종 방어면역 후보주로 선별하였다.

또한 본 발명은 선별된 바이러스주에 화학적 처리를 통해 불활화 바이러스 제작하였고, 불활화 방법 조건 및 처리시간 등을 변경하여 최적화된 불활화 제작방법을 구축하였다.

불활화 바이러스는 죽은 바이러스 또는 이의 활성 성분을 포함하는 것을 의미하는 것으로, 상기 불활화는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이러스가 높은 역가로 증식되면, 바이러스를 수득한 후 이들을 포름알데히드, 과산화수소, β-프로피오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 바람직한 실시예에서 포름알데히드, 과산화수소 또는 β-프로피오락톤을 처리하여 불활화하였다.

상기 포름알데히드는 0.01 내지 0.1% 농도로 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 포름알데히드는 1일 내지 30일 동안 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 포름알데히드는 4℃ 내지 37℃의 온도에서 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서 포름알데히드는 0.025% 농도로 37℃에서 24시간동안 처리하였다.

상기 과산화수소는 0.1 내지 5% 농도로 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 과산화수소는 30분 내지 24시간 동안 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 과산화수소는 4℃ 내지 37℃의 온도에서 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서 과산화수소는 1% 농도로 4℃에서 24시간동안 처리하였다.

상기 β-프로피오락톤은 0.01 내지 0.5% 농도로 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 β-프로피오락톤은 1시간 내지 24시간 동안 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, β-프로피오락톤은 4℃ 내지 22℃의 온도에서 처리될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서 β-프로피오락톤은 0.05% 농도로 4℃에서 24시간동안 처리하였다.

또한 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 생독 백신, 사독 백신, 약독화된 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스의 유전자를 사용하여 생산한 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신, DNA 및 RNA 백신의 형태일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 바이러스의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 1종 이상의 면역증강제와 함께 투여할 수 있다. 면역증강제 또는 어쥬번트 (Adjuvant)는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다. 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트 (Freund adjuvant), 알룸 화합물 (aluminum compound), 무라밀 디펩타이드 (muramyl dipeptide), 포폴리싸카라이드 (LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A등이 알려져 있다. 상기 애쥬번트는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서 불활화된 바이러스와 Alum, Alum + RNA 면역증강제 (CrPV MCS RNA) 또는 AS04 (Adjuvant System 04) + RNA 면역증강제 (CrPV MCS RNA)를 조합을 투여하였다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외 (eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 상기 면역학적 유효량이란 결핵 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.

본 발명은 상기 바이러스를 가지고 면역화에 반응하여 생산된 것을 특징으로 하는, 항체를 제공한다.

상기 항체는 전체 (whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 (light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄 (heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합 (disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역 (VL) 및 중쇄의 가변영역 (VH)과 경쇄의 불변영역 (CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자 (scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디 (diabody) (WO94/13804) 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단 키트를 제공한다.

상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 검출시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로 써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝 (high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR (surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI (surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 항원-항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 검체로부터 분리된 시료를 상기 바이러스와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 상기 바이러스를 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 사람이 아닌 동물에게 투여하는 단계; 및 (b) 상기 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항체를 함유하는 항혈청 또는 혈장을 수집하는 단계를 포함하는 사람이 아닌 동물에서 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항혈청을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 검체로부터 분리된 시료를 상기 바이러스와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 110주의 국내 SFTS 인체 분리주의 분자계통학적 분석, M 유전자 아미노산 서열의 상동성 비교 분석, 세포변병효과를 분석을 토대로 유전형 (A, B2, B3, D, F)별 2개의 바이러스를 선정하였다. 또한, 총 10주의 바이러스 (A, B2, B3, D, F type, 각 2주씩)에 대해 교차 중화능을 확인하였고, 이를 통해 국내발생 주요 유전형으로 확인된 B2 유전형 바이러스 1주와 모든 유전형 바이러스에 대해 높은 중화항체가를 가지는 F 유전형 바이러스 1주, 총 2주를 최종 방어면역 후보주로 선별하였다 (표 1). 또한, 최종 선정된 방여면역 후보 바이러스 2주 (B2-2, F-2)에 대해 C57BL/6_IFNR(^-/-) 마우스를 이용하여 치사율 및 체중변화를 비교 분석하여 선별한 바이러스주의 병원성을 확인하였다 (도 5a 내지 도 5d). 또한, SFTS 불활화 바이러스를 제작하기 위하여 포름알데히드, 과산화수소 또는 β-프로피오락톤을 처리하여 불활화 조건을 구축하였다 (표 4). 3종의 화학물질에 의해 생산된 각 불활화 SFTS 바이러스의 면역원성을 비교 분석한 결과, 각 불활화 바이러스를 저농도 (5 ㎍)로 면역하였을 경우 불활화 바이러스 3종 모두 면역원성이 우수하였고, 고농도(20 ㎍)로 면역하였을 경우 과산화수소로 불활화시킨 SFTS 바이러스가 BPL로 불활화시킨 SFTS 바이러스보다 유의적으로 높은 항체가가 형성됨을 확인하였다 (도 22 참조). 또한, 불활화 바이러스 저농도 및 고농도 모두 BPL 보다는 포름알데히드 및 H₂O₂로 제작된 불활화 바이러스가 중화항체 형성에 더 효과적인 것으로 확인하였다 (도 23 참조).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 바이러스 분리

국내 주요 발생 지역에서 확보한 중증열성혈소판감소 증후군 의심되는 환자의 혈액을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (real time PCR) 분석으로 SFTSV (severe fever thrombocytopenia syndrome virus, 중증열성 혈소판감소 증후군 바이러스)의 양성 또는 음성을 확인하였다. 구체적으로, 바이러스 감염 전날, VeroE6 세포를 12웰 플레이트에 분주하고 세포 밀도가 60%가 넘도록 배양한 뒤, 세포를 PBS로 세척하고, 감염 의심 환자의 혈청 300㎕ (전체 혈액을 3000rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 혈청)를 1시간 동안 처리하여 감염시켰다. 감염 후에 혈청을 제거하고 PBS로 세포를 세척한 뒤, 1% FBS DMEM 배지로 교환하여 2주 동안 배양하였다. 2주 후, RT-PCR (reverse transcription 후 real time PCR로 확인) 및 면역형광 분석법 (immuno fluoresence assay) (자체 실험실에서 생산한 mouse SFTSV NP 항체를 1차 항체 및 FITC가 접합(counjugation)된 항체를 2차 항체로 사용)으로 바이러스 분리 유무를 확인하였으며, 바이러스가 분리되지 않을 경우에는 처음 감염시켰던 상등액을 또 다른 VeroE6 세포에 감염시키는 방식으로 바이러스를 분리하였다.

<실시예 2> 바이러스주의 선정

<2-1> 바이러스 계통 분류

확보된 SFTS　국내 인체 분리주 110주의 염기서열 기반 유전학적 계통분석을 수행하였다.

그 결과, SFTS 바이러스 A 유전형 8주, B1 유전형 16주, B2 유전형 47주, B3 유전형 27주, D 유전형 4주 및 F 유전형 8주로 분류하였다.

<2-2> 1차 선별: 유전자 대표성

SFTS 바이러스의 Gn/Gc 단백질이 중화항체 유도능이 있다는 선행연구 결과를 토대로 각 유전형별 분리주간 Gn/Gc 단백질을 코딩하는 M 유전자 아미노산 서열의 상동성 비교분석을 수행하여 99.5% (B3 유전형은 99%) 이상 일치하면서 유전형별 그룹에서 상동성 기준을 50% 이상 보유한 바이러스들을 1차 선별하였다.

그 결과, A 유전형 6주, B2 유전형은 17주, B3 유전형은 13주, D 유전형은 3주를 각 선별하고, F 유전형의 경우 다른 유전형들과 달리 유전자 상동성이 매우 높아 8주 모두 선별하여 총 47주의 후보주를 선별하였다.

<2-3> 2차 선별: 세포 증식 특성

1차 선별된 47주 후보주들을 Vero E6 세포에 감염 후 14일간 세포병변효과 (cytopathic effect; CPE) 양상을 비교 관찰하였다. 포커스 형성 실험 (Focus forming assay; FFA) 기법을 이용하여 바이러스들의 역가를 측정하였다

구체적으로, 6웰 플레이트에 분주한 VeroE6 세포를 세척한 후 1차 선별된 바이러스로 감염시키고, 1시간 후 세척한 뒤, 4% FBS가 함유된 1% DMEM 아가로즈 겔을 세포에 부어주었다. 감염 7일 후 포르말린을 활용하여 고정하고 30분 후, 배지와 고정액을 제거하고, 3번의 세척을 수행하였다. 0.5% Triton X-100에 희석된 자체 제작된 단클론 NP antibody를 1차 항체로 사용하여 인큐베이션한 뒤 3번 세척하고 2차 항체로 HRP 접합된 항체를 90분간 동안 반응시켜 세척한 뒤, DAB (Diaminobenzidine)으로 발색하여 결과를 확인하였다. 각 웰의 형성된 포커스 형성 개수를 산출하여 바이러스 역가를 계산하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Vero E6 세포에서 배양되지 않은 D 유전형 바이러스 1주를 제외한 대부분의 바이러스들이 1×10⁶내지 1×10⁷FFU/mL 이상으로 증식하였다. 또한, 모든 유전형 바이러스들은 세포융합 (syncytium)효과를 보이며 유전형별 특이적인 차이점은 관찰되지 않았으나 (도 1), 선별된 바이러스주 이외 바이러스들은 비교적 느린 10일 이후에야 세포병변효과가 관찰되었다.

Vero-E6 세포에 0.1 MOI로 감염 후 3일 및 7일째에 바이러스 역가를 측정하여 높은 역가와 감염 후 6-8일 내에 90% 이상의 세포변병효과를 보이는 각 유전형별 2개 바이러스들을 유전형별 후보주로 선정하였다 (도 2 및 표 1).

유전형	바이러스주
A	15KS64(A1) / 16KS115(A2)
B2	16MS351(B2-1) / 16KS86(B2-2)
B3	16KS129(B3-1) / 14KS38(B3-2)
D	KACNH(D-1) / KASJH(D-2)
F	16KS89(F-1) / 15KS73(F-2)

<2-4> 후보주 특성분석-1: 마우스 혈청 확보

선정된 유전형별 바이러스주의 특성분석을 위해 일반 마우스 (C57/BL6)에서 항혈청을 제작하여 SFTS 바이러스의 중화항체 형성능 프로파일링을 확인하였다.

구체적으로, SFTS 바이러스 (B2 유전형)를 1×10⁵ FFU/mL 역가로 접종하고 2주 간격으로 동일한 역가의 바이러스로 2회 boosting 하였고 0, 2, 3, 4, 7주째에 채혈하였다 (도 3). 분리한 혈청을 30분 동안 56℃에 서 불활성화시킨 뒤, 1/10으로 희석 후, 2배씩 계단 희석하였다. 800FFU/ml로 희석한 바이러스를 계단 희석한 바이러스와 1:1로 37℃에서 반응시켰다. 6웰 플레이트에 분주한 VeroE6 세포를 세척한 후 상기 반응시킨 바이러스로 감염시키고, 1시간 후 세척한 뒤, 1.5% CMC를 세포에 부어주었다. 감염 2일 후 포르말린을 활용하여 고정하고 1시간 후, 3번의 세척을 수행한 뒤, 0.5% Triton X-100에 희석된 자체 제작된 단클론 NP antibody를 1차 항체로 사용하여 인큐베이션한 뒤 3번 세척하고 2차 항체로 HRP 접합된 항체를 90분간 동안 반응시켜 세척한 뒤, DAB 으로 발색하여 결과를 확인하였다. 바이러스만 감염시킨 웰의 포거스 형성보다 50% 감소된 값까지를 유효하다고 해석하여, 50% 바이러스 중화능 (FRNT₅₀) 측정산식을 적용하여 항체가를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 감염 후 4~7주에 160~320의 가장 높은 중화항체가를 보였다.

<2-5> 후보주 특성분석-2: SFTS 바이러스 유전형별 교차 중화능 확인을 통한 후보주 선정

SFTS 바이러스에 대한 최종 방어면역 후보주를 선정하기 위하여 유전형별 바이러스 총 10주에 (A, B2, B3, D, F type, 각 2주씩) 대해 교차 중화능을 확인하였다. C57BL/6 마우스 (SFTS 바이러스 감염력 없음)에 각 바이러스를 10⁵ FFU으로 감염시킨 후 2주 간격으로 3차 감염하였다. 3차 감염 후 2주 후에 항혈청 확보한 다음, FRNT 기법으로 항혈청 희석값 (FRNT₅₀)을 구하여 교차 중화능을 비교 분석하였다.

Immune sera		Neutralizing capacity against SFTSV strain (FRNT50)
		A type		B2 type		B3 type		D type		F type
		A-1	A-2	B2-1	B2-2	B3-1	B3-2	D-1	D-2	F-1	F-2
A type	Anti-A1	160	320	160	160	160	80	80	80	80	80
A type	Anti-A2	160	160	160	160	160	80	80	80	80	160
B2 type	Anti-B2-1	160	80	160	320	320	160	160	80	80	80
B2 type	Anti-B2-2	160	160	160	320	320	160	80	160	80	160
B3 type	Anti-B3-1	160	160	80	160	160	160	80	160	80	80
B3 type	Anti-B3-2	80	160	160	160	160	160	20	80	80	80
D type	Anti-D-1	160	160	320	320	160	160	80	160	160	80
D type	Anti-D-2	320	160	160	160	160	160	160	80	80	160
F type	Anti-F-1	160	160	160	320	160	80	80	160	160	160
F type	Anti-F-2	320	160	80	160	160	160	160	80	320	320

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 모든 유전형의 항혈청들은 다른 유전형 바이러스에 대해 중화시킬 수 있는 것으로 확인되었다. A, B2, B3 바이러스의 항혈청은 A, B2, B3 바이러스에 대해 160 이상의 중화항체가를 보이는 반면 D 및 F 유전형 바이러스에 대해 비교적 낮은 중화항체가 (80)를 보였다. 그러나 F 유전형 바이러스의 항혈청은 다른 유전형 바이러스에 대해 대부분 높은 중화항체가 (160-320)를 보여주었다. 결과적으로 국내발생 주요 유전형으로 확인된 B2 유전형 바이러스 1주 (B2-2)와 모든 유전형 바이러스에 대해 높은 중화항체가를 가지는 F 유전형 바이러스 1주 (F-2), 총 2주를 최종 방어면역 후보주로 선정하였다.

<2-5> 후보주 특성분석-3: 노령 마우스를 이용한 방어면역 후보주 병원성 분석

최종 선정된 방여면역 후보 바이러스 2주 (B2-2, F-2)에 대해 노령 (32~36주령) 인터페론 수용체가 결핍된 C57BL/6_IFNR(^-/-) 마우스를 이용하여 치사율 및 체중변화 등 감염여부 및 병원성을 비교 분석하였다.

구체적으로, 면역결핍마우스 (C57BL/6_IFNR(^-/-))에 각 바이러스를 10^-1 내지 10² FFU 농도로 감염시킨 후 14일 동안 관찰하였다.

그 결과, 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, B2 유전형의 경우, 1 ~ 100 FFU로 감염 그룹에서는 감염 후 8일 이내 체중이 급격하게 감소하면서 모두 폐사하였으며 10^-1 FFU로 감염시킨 그룹에서는 감염 후 14일 동안 60%의 생존율을 보여주었다. 반면, 도 5c 및 5d에 나타난 바와 같이, F 유전형 바이러스는 모든 감염 그룹에서 감염 후 7일 이내 급격한 체중감소를 보이며 100% 폐사하였다. 이는 노령 마우스에서 F 유전형 바이러스가 B2 유전형 바이러스보다 병원성이 높은 것을 보여준다.

<실시예 3> SFTS 바이러스 불활화 조건 구축

SFTS 불활화 바이러스를 제작하기 위하여 현재 FDA 승인 물질이며 불활화 백신 제작에 일반적으로 많이 사용되는 3 종류의 화학물질 (포름알데히드, 과산화수소 및 β-프로피오락톤)을 이용하였고, 농도, 온도 및 시간에 따른 SFTS 바이러스 불활화 조건을 비교하였다.

<3-1> 포름알데히드 (formaldehyde) 처리

<3-1-1> 포름알데히드의 처리 농도에 따른 SFTS 바이러스 불활화의 비교

선행 연구에서 주로 포름알데히드 0.05% 농도를 사용한 것을 토대로, 본 연구에서는 0.05% 및 0.025% 두 농도에서 SFTS 바이러스 불활화 조건을 확인하였다. B2 유전형 바이러스를 이용하여 불활화하였으며, 바이러스 검출 여부는 FFA 기법으로 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 포름알데히드 최종 농도 0.05%, 37℃로 반응 시 1시간 이후 바이러스 검출이 되지 않았으며, 동일한 온도에서 최종 농도 0.025% 처리 시에는 2시간 이후에 바이러스 검출이 되지 않았다. 이에, 포름알데히드 독성 등을 고려하여 SFTS 바이러스 불활성화 제작은 포름알데히드 최종 농도 0.025%로 선정하였다.

<3-1-2> 포름알데히드의 처리 온도에 따른 SFTS 바이러스 불활화의 비교

포름알데히드를 0.025% 농도로 처리 후 4℃ 및 37℃ 각 온도 조건으로 반응시킨 후 SFTS 바이러스 불활화를 비교하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 37℃의 경우 2시간 이후 바이러스 검출이 되지 않은 반면, 4℃의 경우 6시간 후에도 바이러스가 검출되어 완벽히 불활화가 되지 않았다. 따라서 0.025% 포름알데히드를 이용한 SFTS 바이러스 불활화 제작시 온도 조건은 37℃로 선정하였다.

<3-1-3> 포름알데히드를 이용한 불활화 확인

SFTS 바이러스 불활성화 조건 구축에 사용된 FFA 기법은 포름알데히드의 독성으로 인한 바이러스 검출한계점을 갖고 있어, 최종 SFTS 바이러스가 완전히 불활성화 되는지 확인하는 것이 필요하다. 따라서 선정된 포름알데히드 농도 및 온도 조건으로 SFTS 바이러스를 불활화 후 감수성 세포에 감염시켜 바이러스 유전자 및 단백질 검출을 통해 SFTS 바이러스 불활화를 최종 확인하였다.

이를 위하여, 100mL SFTS 바이러스를 최종 농도 0.025% 포름알데히드로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 불활성화하고, 초고속원심분리를 통해 1 mL의 PBS로 부유 및 농축한 후 Vero E6 세포에 감염시켰다. 또한 농축을 하지 않은 불활화 바이러스도 동일하게 감수성세포 감염 후 14일 동안 배양하였고, 14일째 확보한 배양액을 다시 Vero E6 세포에 재감염하여 기간별 배양액 및 세포 용해물로부터 real-time PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 바이러스 유전자 및 단백질 검출을 각각 확인하였다.

불활화 바이러스를 세포에 감염 후 SFTS 바이러스 M 및 S segment 유전자를 검출한 결과, 도 8a에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군에서는 유전자 증폭이 확인 (Ct값이 낮아짐)되었으나, 농축 및 비농축시킨 불활화 바이러스 감염 세포에서는 Ct값의 변화가 보이지 않았다. 또한, 도 8b에 나타난 바와 같이, 재감염 세포에서도 7일 동안 Ct값의 변화가 보이지 않았다.

불활화 바이러스를 세포에 감염 후 SFTS 바이러스 Gn 및 NP 단백질을 검출한 결과, 도 9a 및 9b에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군에서는 감염 후 3일 및 5일 에 Gn, NP 단백질이 검출된 반면, 비농축시킨 불활화 바이러스에서는 Gn 및 NP 단백질이 검출되지 않았다. 또한, 재감염 세포에서도 Gn, NP 단백질이 전혀 검출되지 않았다. 농축시킨 불활화 바이러스에서는 초기 감염 후 1일, 7일, 14일 에 Gn 및 NP 단백질이 검출되었으나 재감염 후에는 두 단백질 모두 검출되지 않았다. 농축된 불활화 바이러스의 경우 초기 감염에 Gn 및 NP 단백질이 검출된 이유는 많은 바이러스의 양이 세포 표면에 부착되어 검출되었을 것으로 예상되며, 재감염 후 두 바이러스 단백질 모두 검출되지 않은 것으로 보아 SFTS 바이러스가 완벽히 불활화된 것으로 보인다.

상기 결과를 통해 0.025% 포름알데히드를 이용하여 37℃에서 24시간동안 반응시키면 SFTS 바이러스를 완벽히 불활화시킬 수 있음을 알 수 있다.

<3-2> 과산화수소 (H ₂ O ₂ ) 처리

<3-2-1> 과산화수소 (H ₂ O ₂ )의 처리 농도에 따른 SFTS 바이러스 불활화의 비교

선행 연구에서는 바이러스 불활성화 연구에서 주로 3% H₂O₂를 사용하였지만, 본 연구에서는 H₂O₂의 세포독성을 고려하여 1% 및 0.3% 두 농도에서의 SFTS 바이러스 불활화 조건을 확인하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, H₂O₂ 최종 농도 1% 처리 후 37℃에서 반응 시 5분 이후, 동일한 온도에서 최종 농도 0.3% 처리 시 2시간 이후 바이러스 검출은 되지 않았다. 따라서 SFTS 바이러스 불활성화 제작에 있어서 H₂O₂ 최종 농도는 1%로 선정하였다.

<3-2-2> 과산화수소의 처리 온도에 따른 SFTS 바이러스 불활화의 비교

H₂O₂ 1% 농도로 처리 후 4℃ 및 37℃ 각 온도 조건으로 반응시킨 후 SFTS 바이러스 불활화를 비교하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 4℃ 및 37℃ 두 온도에서 5분 처리 이후 바이러스 검출이 되지 않았다. 따라서 1% H₂O₂를 이용하여 SFTS 바이러스 불활화할 경우, 4℃ 또는 37℃ 두 온도 모두 이용 가능하다.

<3-2-3> 과산화수소를 이용한 불활화 확인

포름알데하이드와 동일하게 H₂O₂역시 독성으로 인한 바이러스 검출 한계점을 가지고 있어 SFTS 바이러스가 완벽히 불활화 되었는지 확인하게 위해 상기 제시된 방법과 동일하게 수행하였다. 따라서 선정된 H₂O₂ 농도(1%) 및 온도(4℃) 조건으로 불활성화된 SFTS 바이러스를 감수성 세포에 감염 후 바이러스 불활성화를 최종 확인하였다. 이를 위해 100 mL SFTS 바이러스를 최종 농도 1% H₂O₂ 로 처리한 후 4℃에서 24시간 동안 반응시켜 불활성화하고, 이 후 과정은 포름알데히드의 실험 방법과 동일하게 진행하였다.

유전자 증폭을 확인한 결과, 도 12a 내지 12b에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군에서는 유전자 증폭이 확인된 반면 (Ct값이 낮아짐) 농축 및 비농축시킨 불활화 바이러스 감염 세포에서는 Ct값의 변화가 보이지 않았다. 또한, 재감염 세포에서도 7일 동안 Ct값의 변화가 보이지 않았다.

단백질 검출을 확인한 결과, 도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군에서는 감염 후 3일 및 5일에 Gn, NP 단백질이 검출된 반면 비농축시킨 불활화 바이러스에서는 Gn 및 NP 단백질 모두 검출되지 않았으며 또한, 재감염 세포에서도 전혀 검출되지 않았다. 포름알데히드와 유사하게 농축시킨 불활화 바이러스에서는 초기 감염 후 1일, 7일, 14일에 Gn 및 NP 단백이 검출되었으나 재감염 후에는 두 단백질 모두 검출되지 않았다. 농축된 불활화 바이러스의 경우 초기 감염에 Gn 및 NP 단백질이 검출된 이유는 많은 바이러스의 양이 세포 표면에 부착되어 검출된 것으로 예상되며 재감염 후에는 두 단백질 모두 검출되지 않은 것으로 보아 SFTS 바이러스가 완벽히 불활화된 것으로 예상된다.

상기의 결과를 통해 H₂O₂ 1%의 농도로 4℃에서 24시간 동안 반응시키면 SFTS 바이러스를 완벽히 불활화시킬 수 있음을 알 수 있다.

<3-3> β-프로피오락톤 (β-propiolactone; BPL)의 처리

<3-3-1> β-프로피오락톤의 처리 농도에 따른 SFTS 바이러스 불활화의 비교

선행 연구에서 바이러스 불활화 백신 연구에서 주로 0.1% BPL을 사용하였고, 본 연구에서는 BPL의 세포독성을 고려하여 0.1% 및 0.05% 두 농도로 SFTS 바이러스 불활화 조건을 확인하였다. BPL는 37℃에서 2시간 이내의 빠른 시간에 가수분해되는 특성이 있어 온도조건에 따른 SFTS 바이러스의 불활화 최적조건 실험은 수행하지 않고 4℃로 선정하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, BPL 농도 0.1% 처리 후 4℃에서 반응 한 경우 20분 이후 바이러스가 검출되지 않았으며, 최종 농도 0.05% 처리한 경우 4시간 이후 바이러스가 검출되지 않았다. 따라서 SFTS 바이러스 불활성화 제작을 위해 BPL 최종 농도는 0.05%로 선정하였다.

<3-3-2> β-프로피오락톤을 이용한 불활화 확인

다른 두 화학물질과 동일하게 BPL에 의한 불활화 SFTS 바이러스 확인용 바이러스 검출법(FFA)은 화학물질 독성으로 인한 바이러스 검출한계점을 가지고 있어 최종 SFTS 바이러스가 완벽하게 불활화되었는지 확인할 필요가 있다. 따라서, 선정된 BPL 농도 (0.05%) 및 온도 (4℃)조건으로 SFTS 바이러스를 불활화시킨 후 감수성 세포에 감염시켜 바이러스 유전자 및 단백질 검출을 통해 최종 SFTS 바이러스 불활화를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이에 100mL SFTS 바이러스를 최종 농도 0.05% BPL로 처리한 후 4℃에서 24시간 동안 충분히 반응시켜 불활성화시켰으며, 이 후 과정은 다른 두 화학물질 적용시의 방법과 동일하게 진행하였다.

유전자의 증폭을 확인 결과, 도 15a 및 15b에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군에서는 감염세포에서의 SFTS 바이러스 M 및 S segment 유전자 증폭이 확인되었으나 (Ct값이 낮아짐), 농축 및 비농축시킨 불활화 바이러스 감염 세포에서는 Ct값의 변화가 보이지 않았으며, 재감염 세포에서도 7일 동안 Ct값의 변화가 보이지 않았다.

단백질 발현을 확인한 결과, 도 16a 및 16b에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군에서는 감염 후 3일 및 5일 에 Gn, NP 단백질이 검출된 반면 비농축시킨 불활화 바이러스에서는 Gn 및 NP 단백질 모두 검출되지 않았다. 또한, 재감염 세포에서도 전혀 검출되지 않았다. 농축시킨 불활화 바이러스에서는 초기 감염 후 1일, 7일, 14일에 Gn 및 NP 단백질이 검출되었으나 재감염 후에는 두 단백질 모두 검출되지 않았다. 농축된 불활화 바이러스의 경우 초기 감염에 Gn 및 NP 단백질이 검출된 이유는 많은 바이러스의 양이 세포 표면에 부착되어 검출된 것으로 예상되며 재감염 후에는 두 단백질 모두 검출되지 않은 것으로 보아 SFTS 바이러스가 완벽히 불활화된 것으로 예상된다.

상기의 결과를 통해 0.05% BPL의 농도로 4℃에서 24시간 동안 반응시키면 SFTS 바이러스를 완벽히 불활화시킬 수 있음을 알 수 있다.

<3-4> 불활화 바이러스 농축 및 정제

불활화 SFTS 바이러스 백신 제작에 이용할 3종 화학물질을 위 불활화 최적조건으로 불활화 후 농축 및 정제하여 바이러스 Gn 단백질 검출 및 최종 단백질량을 화학물질별로 정량하여 비교분석하였다.

구체적으로, Vero E6 세포에서 배양된 SFTS 바이러스를 0.2 ㎛ filter로 여과한 후 포름알데히드, H₂O₂ 및 β-프로피오락톤을 상기 선정된 조건으로 120mL의 SFTS 바이러스를 각각 불활화시켰다. 불활화 후 0.2 ㎛ filter로 재 여과한 후 20% 수크로스(sucrose)에 각각의 불활화 바이러스 100 mL를 섞이지 않도록 분주한 후 초고속 원심분리 (SW41 rotor, 28,000 rpm, 4℃, 4시간)하여 농축하였다. 농축된 불활화 바이러스를 PBS 1mL로 부유시킨 후 수크로스 농도 차등 (Sucrose Density Gradient, 20% - 60%) 방법으로 정제하였다. 이후 28,000 rpm, 4℃ 조건으로 4시간 동안 초고속 원심분리 후 수크로스 30%와 50% 사이에 하얀 층이 형성된 것을 확인하였다. 3종 화학물질로 각각 불활화된 SFTS 바이러스를 농축 및 정제과정에서 형성된 하얀 층에 불활화 바이러스 포함 여부를 확인하기 위해 윗 층부터 1mL씩 수거하여 총 11개의 fraction을 확보한 후 Gn 단백질 검출 여부를 확인하였다 (도 17).

그 결과, 포름알데히드 처리한 불화활 바이러스는 8-13번 분획 (fraction)에서 약 66 KDa 크기의 Gn 단백질이 검출되었고 연속된 6개 분획물 중 하얀 층이 주로 포함된 8-9번 분획에서 가장 많은 단백질이 검출되었다 (도 18). 단, 각 슬롯 윗부분부터 단백질 끌림 현상이 확인되었으나 이는 포름알데히드의 특성인 단백질 교차결합 (cross-linking)에 의해 바이러스들간의 결합으로 인해 발생한 것으로 예상된다.

H₂O₂를 처리한 경우 4℃ 및 37℃의 온도조건으로 불활화된 바이러스의 농축 및 정제 후 분획별 Gn 단백질 검출을 비교하였다.

그 결과, 도 19a 및 19b에 나타난 바와 같이, 37℃에서 불활화된 바이러스는 정제 후 분획별 Gn 단백질이 희미하게 검출되었으나, 4℃에서는 7-12번 분획에서 Gn 단백질이 강하게 검출되었다. 포름알데히드와 달리 교차결합 (cross-linking)의 현상도 발생하지 않은 것으로 확인되어 H₂O₂를 이용한 SFTS 바이러스 불활성화 온도 조건은 37℃가 최적임을 확인하였다.

BPL 처리하여 불활화된 바이러스의 농축 및 정제 후 분획별 Gn 단백질 검출을 비교한 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, 7-9번 분획물에서 Gn 단백질이 잘 검출되었다. 또한, 포름알데히드에 의한 불활성화시 나타난 교차결합 (cross-linking) 현상도 확인되지 않았다.

각 물질별로 불활화된 SFTS 바이러스 100 mL을 초고속원심분리하여 농축한 후 PBS 1 mL로 부유시킨 후 BCA protein assay kit를 이용하여 총 단백질량을 정량하여 비교분석하였다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, H₂O₂ 및 BPL 두 물질은 각각 842 및 813 ug/mL의 농도로 유사하게 측정되었으나 포름알데히드의 경우 불활화 과정 중 바이러스 응집 (aggregation) 및 단백질 교차결합 등으로 인해 여과하는 과정에서 많은 손실이 발생한 것으로 예상되어 H₂O₂ 및 BPL보다 비교적 낮은 농도로 측정되었다.

종합적으로, 표 4에 나타난 바와 같이, 물질 농도, 온도, 처리 시간, 농축 및 정제후 Gn 단백질 검출 등을 통해 SFTS 바이러스 불활성화를 위한 각 물질별 최적 조건을 확인할 수 있었다.

화학물질	바이러스 양 (FFU/ml)	농도	온도	처리 시간 (시간)
Formaldehyde	8×10⁶	0.025%	37℃	24
H ₂ O ₂	8×10⁶	1%	4℃	24
b-propiolactone	1.8×10⁷	0.05%	4℃	24

<실시예 4> 불활화 SFTS 바이러스 제작 및 특성 분석

<4-1> 불활화 바이러스의 형태 확인

불활화 SFTS 바이러스의 항체 형성능 분석에 앞서 최종 방어면역 후보주로 선정된 B2 및 F 유전형 바이러스에 대해 불활화 바이러스 생산에 이용된 3종의 화학물질 처리 후 전자 현미경 (음성염색법)을 이용하여 불활화 바이러스 형태를 확인하였다.

그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, B2 및 F 유전형 바이러스에서 3종의 화학물질 처리 후에도 바이러스 형태가 잘 유지되는 것을 확인하였다.

<4-2> 불활화 SFTS 바이러스의 항체 형성능 분석

3종의 화학물질에 의해 생산된 각 불활화 SFTS 바이러스의 면역원성 (항체 형성능)을 비교 분석하였다. 방어면역 후보주로 선정된 B2 유전형 바이러스를 포름알데히드, β-프로피오락톤 및 H₂O₂로 처리 후 농축 및 정제하여 불활화 바이러스를 생산하였고 브래드포드 어세이 (bradford assay)로 총 단백질 농도를 측정하였다.

구체적으로, 표 5와 같이 각각의 불활화 바이러스 5㎍ 및 20㎍에 면역증강제 (adjuvant)로서 Alum을 혼합하여 C57/BL6 마우스에 2주 간격으로 3회 근육접종한 후 2, 4, 8주의 혈청으로부터 항체가를 측정하였다. IgG 측정은 효소면역측정법 (ELISA)을 이용하여 Gn 단백질에 대한 항체가를 측정하였으며 중화항체는 FRNT 기법을 이용하여 측정하였다.

그룹	면역법	면역증강제	투여방법
G1 (n=5)	PBS	-	근육주사
G2 (n=5)	FA-IV (5 ㎍)	Alum
G3 (n=5)	FA-IV (20 ㎍)	Alum
G4 (n=5)	BPL-IV (5 ㎍)	Alum
G5 (n=5)	BPL-IV (20 ㎍)	Alum
G6 (n=5)	H₂O₂-IV (5 ㎍)	Alum
G7 (n=5)	H₂O₂-IV (20 ㎍)	Alum

(FA: 포름알데히드, IV: Inactivated virus, BPL : b-propiolactone)

항체가 측정결과, 도 22a 및 도 22b에 나타난 바와 같이, 각 불활화 바이러스를 저농도 (5 ㎍)로 3회 면역하였을 경우 4주 및 8주에서 IgG 항체가가 대조군 및 면역 2주차에 비해 상대적으로 높게 측정되어 불활화 바이러스 3종 모두 면역원성이 우수하게 보이나 각 물질별 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나 고농도(20 ㎍) 면역군에서는 4주 및 8주에서 높은 항체가가 검출되었으며, 특히 H₂O₂로 불활화시킨 SFTS 바이러스가 BPL로 불활화시킨 SFTS 바이러스보다 유의적으로 높은 항체가가 형성되었다.

중화항체 형성능을 비교한 결과, 도 23a 및 23b에 나타난 바와 같이, 저농도 (5 ㎍)의 불활화 SFTS 바이러스 면역군에서 4주째부터 높은 중화항체가 생성되었으며 불활화 바이러스 후보물질간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 또한, 면역 후 8주차 혈청에서 H₂O₂로 불활화시킨 바이러스가 BPL로 불활화시킨 바이러스에 비해 유의적으로 더 높은 중화항체를 생성하였다. 고농도 (20 ㎍) 면역군의 경우, 4주차 혈청에서 FA 및 H₂O₂로 불활화시킨 SFTS 바이러스가 BPL로 불활화시킨 SFTS 바이러스보다 유의적으로 더 높은 중화항체를 생성하였고, 8주차 혈청에서는 저농도와 마찬가지로 H₂O₂로 제작된 불활화 바이러스가 다른 불활화 후보물질에 비해 유의적으로 더 높은 중화항체를 생성하였다.

상기의 결과에 따라 불활화 바이러스 저농도 및 고농도 모두 BPL 보다는 포름알데히드 및 H₂O₂로 제작된 불활화 바이러스가 중화항체 형성에 더 효과적인 것으로 확인되었다.

<4-3> 불활화 SFTS 바이러스 (1 ㎍)에 대한 RNA 면역증강제의 효능 분석

일반적으로 불활화 백신은 충분한 항체형성을 증진시키기 위해서 alum 등과 같은 면역증강제를 필요로 한다. 본 발명에서는 불활화 SFTS 바이러스에 대하여 RNA 기술 기반으로 제작된 면역증가제에 대한 면역증강 효능을 공동 분석하였다. 포름알데히드를 이용하여 제작된 불활화 SFTS 바이러스와 면역증강제 후보물질들을 일반 마우스 (C57/BL6)에 혼합 면역하여 항체가를 측정하는 실험을 수행하였다 (표 6).

그룹	면역법	면역증강제
G1 (n=5)	Inactivated SFTSV (1 ㎍)	-
G2 (n=5)	Inactivated SFTSV (1 ㎍)	Alum
G3 (n=5)	Inactivated SFTSV (1 ㎍)	Alum+CrPV MCS RNA (20 ㎍)

구체적으로, 그룹 1은 불활화 SFTS 바이러스 1 ㎍ 단독 접종하였고, 그룹 2는 불활화 바이러스에 alum을 1:1 비율로 혼합하여 접종하였다. 그룹 3은 그룹 2 조건에 RNA 면역증강제 (CrPV MCS RNA) 20㎍을 혼합 접종하고 모든 그룹은 2주 간격으로 2회 면역하였다. 2회 면역 후 4주 후 (총 8주)에 혈청을 확보한 후 ELISA로 SFTS 바이러스의 Gn 및 N 단백질에 대한 항체가를 측정하고, FRNT 기법으로 중화항체가를 측정하였다. FRNT₅₀의 20 이하 (≤20)는 중화항체가 없는 것으로 간주하였다.

그 결과, 도 24a 내지 24d에 나타난 바와 같이, Gn 및 N 단백질에 대한 IgG2c (Th1) 형성은 그룹 3 (불활화 바이러스/alum+ RNA 면역증강제)에서 가장 높았다. Gn 단백질에 대한 IgG1 (Th2) 형성은 그룹 1 (불활화 바이러스 단독 접종)에서 가장 높았고, N 단백질에 대한 IgG1 (Th2)은 그룹 3 (불활화 바이러스/alum + RNA 면역증강제)에서 가장 높았다.

상기 결과에서는 RNA 면역증강제는 Th1 계열의 항체 형성을 더 증강시킬 것으로 예상된다.

그러나 모든 그룹에서 중화항체 (FRNT₅₀)는 형성되지 않았다 (표 7).

그룹	중화항체 (FRNT ₅₀ )
G1	<20
G2	<20
G3	<20

이는 면역 항원 농도 (1ug)가 낮아 중화항체가 형성되지 않는 것으로 판단되어, 면역 항원의 농도를 변경하여 면역 증강효과를 추가 분석하였다.

<4-4> 불활화 SFTS 바이러스 (5 ㎍)에 대한 RNA 면역증강제의 효능 분석

불활화 SFTS 바이러스 (5 ㎍)에 면역증강제 혼합조건에 따른 중화항체 유도능을 비교 분석하였다. 표 8과 같이 불활화 바이러스 5 ㎍에 다양한 조건으로 면역증강제를 혼합한 후 C57/BL6 마우스에 2주 간격으로 3회 면역 후 1주 후 (총 7주)에 혈청을 확보하고 FRNT 기법으로 중화항체가를 측정하였다. FRNT₅₀의 20 이하(≤20)는 중화항체가 없는 것으로 간주하고, 0.1로 표기하였다.

그룹	면역법	면역증강제
G1 (n=5)	PBS	-
G2 (n=5)	Inactivated SFTSV (5 ㎍)	AS04 + CrPV MCS RNA (20 ㎍)
G3 (n=5)	Inactivated SFTSV (5 ㎍)	Alum + CrPV MCS RNA (20 ㎍)
G4 (n=5)	Inactivated SFTSV (5 ㎍)	Alum + CrPV MCS RNA (20 ㎍) + CA-O

그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 두 혼합 그룹 (G2: AS04 + RNA 면역증강제; G3: alum + RNA 면역증강제)에서는 중화항체가 높게 형성된 것을 확인하였으나, RNA 안정제가 혼합된 그룹 4에서는 반대로 중화항체 형성이 감소되는 것을 확인하였다. 또한 두 면역증강제 혼합 그룹 (G2, G3) 간의 중화항체가는 비교적 다르나, 유의적인 차이는 관찰되지 않았다.

Claims

서열번호 1의 L 세그먼트 (segment)를 암호화하는 아미노산 서열, 서열번호 2의 M 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열 및 서열번호 3의 S 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스 (severe fever thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV).
서열번호 4의 L 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열, 서열번호 5의 M 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열 및 서열번호 6의 S 세그먼트를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스.
제1항에 있어서, 상기 바이러스는 B2 유전형인 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스.
제2에 있어서, 상기 바이러스는 F 유전형인 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스는 다른 유전형을 가진 바이러스에 대해 교차중화능이 있는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스는 포름알데히드 (formaldehyde), 과산화수소 및 β-프로피오락톤 (β-propiolactone)으로 구성된 군으로부터 선택한 화학물질을 처리하여 불활화시킨 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스.
제1항 또는 제2항의 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항의 바이러스의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 예방 또는 치료용 면역원성 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 1종 이상의 면역증강제 (adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
제9항에 있어서, 상기 면역증강제는 Alum, AS04 (Adjuvant System 04) 또는 NA 면역증강제인 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
(문의)
제10항에 있어서, 상기 RNA 면역증강제는 CrPV MCS RNA인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항 또는 제2항의 바이러스를 가지고 면역화에 반응하여 생산된 것을 특징으로 하는, 항체.
제1항 또는 제2항의 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단 키트.
(a) 항원-항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 검체로부터 분리된 시료를 제1항 또는 제2항의 바이러스와 접촉시키는 단계; 및
(b) 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스 항체를 검출하는 방법.
(a) 제1항 또는 제2항의 바이러스를 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 사람이 아닌 동물에게 투여하는 단계; 및
(b) 상기 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항체를 함유하는 항혈청 또는 혈장을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 사람이 아닌 동물에서 중증 열성 혈소판감소 증후군 바이러스에 대한 항혈청을 생산하는 방법.
(a) 검체로부터 분리된 시료를 제1항 또는 제2항의 바이러스와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중증 열성 혈소판감소 증후군 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.