KR20230123005A

KR20230123005A - 약물 전달용 마이크로니들 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20230123005A
Application number: KR1020230020278A
Authority: KR
Inventors: 정재환; 오신진; 추상민
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2022-02-15
Filing date: 2023-02-15
Publication date: 2023-08-22

Abstract

본 발명은 시트부; 및 상기 시트부의 상부에 형성되고, 약물 및 상기 약물이 함유되는 리포좀 또는 지질나노입자와 동결건조보호액을 포함하는 복수개의 니들부;를 포함하고, 상기 니들부는 동결건조에 의해 형성된 것인, 약물 전달용 마이크로니들과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 마이크로니들은 동결건조에 의해 약물, 특히 핵산 백신, 펩타이드 약물과 같은 바이오 의약품의 전달 효율과 저장 안정성을 향상시킬 수 있다.

Description

약물 전달용 마이크로니들 및 이의 제조방법 {Microneedle for drug delivery and manufacturing method thereof}

본 발명은 약물 전달용 마이크로니들 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 개발되어지는 약물 중의 40%가 난용성 약물이며, 난용성 약물은 생물 약제학적 분류체계(BCS Class)중 낮은 용해도를 갖는 BCSⅡ와 BCSⅤ의 약물로서 높은 생리활성을 보이지만 가용화 공정 없이는 체내 흡수율이 낮다는 한계점이 존재한다.

또한 핵산의약품(RNA 또는 DNA)은 체내에서 질병에 대해 특이적으로 작용하며, 일반적으로 상온의 수용성 상태에서는 점점 불안정해져 의약품의 변성이 일어나게 되어, 운반 및 보관에 저온 유통 시스템(cold chain system)을 반드시 필요로 한다. 따라서 이런 핵산의약품(특히 핵산 백신류)은 비경구적 경로에 한정되어 대부분 주사제로 투여하는 방식으로 사용되고 있다. 주사제 투여 방식은 전문적인 의료진의 기술이 요구되므로, 신속한 투여가 불가능한 단점이 있다. 이에, 안정성이 우수한 제형 개발을 통해 상온에서 저장 및 유통이 가능한 제형이 필요하다.

이를 해결하기 위한 약물전달시스템(DDS)의 개발로서 최근 유전자나 약물전달의 수단으로 각광받고 있는 물질 가운데 하나가 리포좀(liposome) 또는 지질나노입자(lipid nanoparticle)이다. 이는 우수한 생체적합성, 다양한 화합물과의 결합능력, 크기와 조성과 관련된 다재 다능성으로 널리 연구되어지고 있다. 리포좀 및 지질나노입자를 주로 구성하는 인지질은 세포막을 이루는 주성분으로 고유 구조적 유연성과 생체 적합성을 가지므로, 약물을 효율적으로 전달할 수 있어 의약품 제형 개발에 적합하다.

한편, 용해성 마이크로니들은 생분해성 수용성 고분자로 구성된 마이크로니들로 통증 없이 피부에 직접 삽입되어 경피 투여의 효율성을 향상시키는 최소 침습적인 약물 전달 시스템이다. 마이크로니들은 간의 초회 통과 효과(first pass effect)를 우회할 수 있고, 약물의 서방출이 가능하며 날카로운 폐기물을 발생시키지 않는다는 장점을 가진다.

이에, 난용성 약물 또는 핵산의약품을 리포좀에 캡슐화시켜 제조한 리포좀 용해성 마이크로니들은 기존 약물전달과 의약품 유통에서 야기되는 문제들을 해결할 수 있는 유망한 대안책이 될 수 있다.

한국 공개특허 제10-2018-0105153호

본 발명은 시트부; 및 상기 시트부의 상부에 형성되고, 약물 및 상기 약물이 함유되는 리포좀 또는 지질나노입자를 포함하는 복수개의 니들부;를 포함하고, 상기 니들부는 동결건조에 의해 형성된 것인, 약물 전달용 마이크로니들과 이의제조방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 시트부; 및

상기 시트부의 상부에 형성되고, 약물 및 상기 약물이 함유되는 리포좀 또는 지질나노입자와 동결건조보호액을 포함하는 복수개의 니들부;를 포함하고,

상기 니들부는 동결건조에 의해 형성된 것인, 약물 전달용 마이크로니들을 제공한다.

또한, 본 발명은, 몰드에 리포좀 또는 지질나노입자 및 동결건조보호액을 포함하는 용액을 충전하는 단계(S1);

용액이 충전된 몰드를 동결건조하여 니들부를 제조하는 단계(S2); 및

상기 니들부 상부에 고분자 용액을 충전한 후 건조하여 시트부를 제조하는 단계(S3);를 포함하고,

상기 리포좀 또는 지질나노입자는 약물을 함유하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 약물은 수용성 약물, 난용성 약물, 백신, 호르몬제, 항체 약물, 및 펩타이드 약물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 니들부 및 시트부는 고분자를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜, 키토산, 소듐히알루로네이트 및 플루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 리포좀 또는 지질나노입자는,

1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EPOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(SPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDPPC), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Cholesterol), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DO-Ethyl-PC) 및 DLin-MC3-DMA(MC3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 동결건조보호액은 수크로스, 트레할로스, 말토즈 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 동결건조보호제를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 리포좀은, -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고, 10~500 nm 의 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 지질 나노입자는, -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고, 10~400 nm 의 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따라 제조된 리포좀 또는 지질나노입자를 포함하는 마이크로니들은 리포좀 또는 지질나노입자에 약물을 포함하여, 난용성 약물이나 핵산 백신과 같은 바이오 의약품의 피부를 통한 체내 전달효율이 증가된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 마이크로니들은 상기 리포좀 또는 지질나노입자를 동결건조하여 제조되는 것으로, 저장 수명이 현저히 연장되었으며, 저온 냉장보관이 필요했던 약물의 상온 유통이 가능한 장점이 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 리포좀 마이크로니들의 제조 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 지질나노입자의 제조 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 3은 리포좀 나노입자의 입자 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 리포좀 마이크로니들을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 mRNA를 포함하는 리포좀(Lipoplex)을 이용하여 제조된 마이크로니들(좌) 및 리포좀을 이용하여 제조된 마이크로니들의 입자 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 지질나노입자 마이크로니들의 제조 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예에서 제조된 LNP 마이크로니들을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예에서 LNP를 포함하는 용액(a) 및 LNP를 포함하지 않는 용액(b)과, 상기 두 용액을 이용하여 제조된 마이크로니들(c, d)에 대한 입자 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 마이크로니들 제조 전의 LNP 유무에 따른 입자 분석 결과(좌) 및 마이크로니들 제조 후 재분산된 용액의 LNP 유무에 따른 입자 분석 결과(우)를 나타낸 도면이다.
도 10은 LNP를 이용한 마이크로니들에서 mRNA 포함 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 리포좀 마이크로니들을 피부에 침투한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 LNP 마이크로니들을 피부에 침투한 결과를 나타낸 도면이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 약물전달용 마이크로니들과 상기 마이크로니들의 제조방법에 대하여 실시예 및 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 시트부; 및

본 명세서에서 약물이란, 인체에 대하여 작용을 미치는 효능을 갖는 물질이다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 약물은 수용성 약물, 난용성 약물, 백신, 호르몬제, 항체 약물, 및 펩타이드 약물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 상기 종류 외에 리포좀 또는 지질나노입자에 함유(봉입)되어 체내에 전달될 수 있는 약물이라면 상기 약물에 제한되지 않는다.

상기 수용성 약물은, 인산베타메사존, 인산덱사메타존, 인산프레드니졸론,숙신산프레드니졸론, 숙신산히드로코르티존, 반코마이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 숙신산클로람페니콜, 라타목세프, 세프피롬, 카루모남, 인산클린다마이신 및 아바카비르에로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이는 예시로서, 수용성을 갖는 약물이라면 상기 종류에 제한되지 않는다.

상기 난용성 약물은, 생물 약제학적 분류체계(BCS Class)중 낮은 용해도를 갖는 BCSⅡ와 BCSⅤ의 약물로서, 에시로서 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 펜부프로펜, 페노프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 나프록센, 에토로락, 케토프로펜, 덱시부프로펜, 피록시캄　 또는 아세클로페낙을 포함하는 비스테로이드성 항염증제; 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신, 미코페닐레이트　 또는 피메크롤리무스를 포함하는 면역억제제 또는 아토피성 피부염 치료제; 니페디핀, 니모디핀, 니트렌디핀, 닐바디핀, 펠로디핀, 암로디핀또는 이스라디핀을 포함하는 칼슘 통로 차단제; 발사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 칸데르사르탄, 텔미사르탄, 올메사르탄　 또는 로사르탄을 포함하는 안지오텐신 II 길항제; 아토르바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 로수바스타틴　 또는 프라바스타틴을 포함하는 콜레스테롤 합성 억제형 고지혈증 치료제; 겜피브로질, 페노피브레이트, 에토피브레이트　 또는 베자피브레이트를 포함하는 콜레스테롤 대사 및 분비 촉진형고지혈증 치료제; 피오글리타존, 로지글리타존　 또는 메트포민을 포함하는 당뇨병 치료제; 오를리스타트를 포함하는 리파아제 억제제; 이트라코나졸, 암포테리신 비, 테르비나핀, 나이스타틴, 글리세오풀빈, 플루코나졸　 또는 케토코나졸을 포함하는 항진균제; 비페닐 디메틸 디카복실레이트, 실리마린　 또는 우루소데옥시콜린산을 포함하는 간보호제; 소팔콘, 오메프라졸, 판토프라졸, 파모티딘, 이토프라이드 또는 메살라진을 포함하는 소화기계 질환 치료제; 실로스타졸 클로피도그렐을 포함하는 혈소판응집 억제제; 랄록시펜을 포함하는 골다공증 치료제; 아시클로버, 팜시클로버, 라미부딘　 또는 오셀타미비르를 포함하는 항바이러스제; 클라리스로마이신, 씨플로플록사신　 또는 세푸록심을 포함하는 항생제; 프란루카스트, 부데소나이드　 또는 펙소페나딘을 포함하는 천식치료제 또는 항히스타민제; 테스토스테론, 프레드니솔론, 에스트로겐, 코티손, 하이드로코티손　 또는 덱사메타손을 포함하는 호르몬제; 파클리탁셀, 도세탁셀, 파클리탁셀 유도체, 독소루비신, 아드리아미이신, 다우노마이신, 켐포테신, 에토포시드, 테니포사이드　 또는 부설판을 포함하는 항종양제; 이들의 염; 및 이들의 약제학적 유도체 중에서 적어도 하나 선택되는 것일 수 있으나, 이는 예시로서 상술한 종류에 제한되지 않는다.

상기 백신은 코로나바이러스 백신, 인플루엔자 백신, B형 간염 백신, Hepatitis Be 백신, 그 외에도 BCG, 홍역, 풍진, 수두, 황열, 대상 포진, 로타 바이러스, Hib(인플루엔자 간균 b형), 광견병, 콜레라, 디프테리아, 백일해, 파상풍, 불활화 폴리오, 일본 뇌염, 또는 인간 파필로마 등의 질환의 예방에 사용되는 백신일 수 있다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 리포좀 또는 지질나노입자에 포함되는 백신은 핵산 백신(RNA, mRNA, 또는 DNA)일 수 있다.

상기 항체 약물은 면역세포 신호전달 체계에 관여하는 단백질 항원이나 암세포 표면에서 발현되는 표지인자를 표적으로 하는 단클론항체(monoclonal antibody, mAb)을 포함하는 것으로 예시로서 트라스투주맙, 퍼투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 라무시루맙, 리툭시맙, 이브리투모맙-튜세탄, 브렌툭시맙- 베도틴, 데노수맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 에타너셉트, 인플릭시맵, 아달리무맙, 서톨리주맙, 골리무맙, 토실리주맙, 아바타셉트, 우스테키누맙, 세쿠키누맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베돌리주맙, 오말리주맙, 메폴리주맙, 라니비주맙, 애플리버셉트, 압식시맙, 팔리비주맙, 에쿨리주맙, 나탈리주맙, 알렘투주맙, 또는 이다루시주맙 등일 수 있다.

상기 펩타이드 약물이란, 약 40여개 이하의 아미노산으로 이루어진 물질로 주로 화학적인 합성을 통해서 생산하는 의약품을 의미하는 것으로, 루프론, 란투스, 인슐린 유사체, 또는 빅토자 등일 수 있으나, 이는 예시로서 상기 종류에 제한되지 않는다.

이러한 백신, 호르몬제, 항체 약물, 펩타이드 약물과 같은 바이오 의약품은 체내에서 질병에 대해 특이적으로 작용하며, 일반적으로 상온의 수용성 상태에서는 점점 불안정해져 의약품의 변성이 일어나게 되어, 운반 및 보관에 cold chain system이 반드시 필요하다. 따라서 이런 바이오의약품은 (특히 핵산 백신류) 비경구적 경로에 한정되어 대부분 주사제로 투여되고, 안정성이 우수한 제형 개발을 통해 상온에서 저장 및 유통이 가능한 제형이 요구된다. 따라서, 본 발명은 이를 해결하기 위한 약물전달시스템(DDS)으로서, 리포좀(liposome) 또는 지질나노입자(lipid nanoparticle)를 이용한 것이다. 상기 리포좀 및 지질나노입자를 주로 구성하는 인지질은 세포막을 이루는 주성분으로 고유 구조적 유연성과 생체 적합성 때문에 약물을 효율적으로 전달할 수 있어 의약품 제형 개발에 적합한 장점을 갖는다.

본 발명의 일 구현예로서, 리포좀 또는 리피드 나노입자는, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EPOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(SPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDPPC), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Cholesterol), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DO-Ethyl-PC) 및 DLin-MC3-DMA((6Z,9Z,28Z,31Z)-Heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate, MC3) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질을 포함할 수 있으며, 상기 지질의 종류는 예시로서, 상기 종류에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 동결건조보호액은 수크로스, 트레할로스, 말토즈 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 동결건조보호제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 동결건조보호액은, 동결건조보호제가 용해된 수상의 용액으로서, 수상 용액에 동결건조보호제를 1 %(w/v) 내지 30 %(w/v)으로 용해시켜 제조할 수 있다. 예를 들어 상기 수상 용액은 Phosphate Buffer Solution (PBS)일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따라, 상기 시트부와 니들부는, 고분자를 포함한다. 상기 상기 고분자는, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜, 키토산, 소듐히알루로네이트 및 플루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 본 발명과 같이 지용성 및 수용성을 모두 가지는 양친매성 고분자로서 폴리비닐피롤리돈(PVP)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 마이크로니들은 피부를 투과할 수 있는 기계적 강도를 갖는 것이 바람직하다. 상기 마이크로니들은, 50 내지 2000 μm의 높이를 갖고, 상기 시트부는, 10 내지 1000 μm 의 높이를 가질 수 있다. 상기 마이크로 니들은 50 내지 2000 μm 의 높이 범위를 가질 때, 피부를 충분히 투과할 수 있다. 상기 시트부는 마이크로니들을 지지하는 역할을 하며, 안정적인 지지를 위해, 10 내지 1000 μm의 높이 범위를 가질 수 있다.

상기 마이크로니들은 피라미드형, 원뿔형, 및 다각뿔로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형상을 가질 수 있다. 상기 형상의 종류는 예시로서, 피부를 투과할 수 있도록 단부가 첨예한 형태를 가지는 형상이라면 상기 종류에 제한되지는 않는다.

상기 마이크로 니들은, 예시로서 마이크로 니들 패치에 9개 내지 10,000개로 포함될 수 있다. 예를 들어, 가로 10개 * 세로 10개의 배열을 가져 총 100개의 마이크로 니들이 포함될 수 있으나, 이는 예시로서 통상의 기술자라면 추출하여 진단하고자 하는 질환의 종류에 따라 충분히 변형시켜 제조할 수 있을 것이다.

상기 마이크로 니들은 피부 등의 표적 부위에서, 약물의 전달을 보다 용이하게 하기 위해, 표적 부위에 대한 마이크로 니들의 표면적을 크게 하는 형태를 가질 수 있으며, 예를 들어, 마이크로 니들의 니들부 주위에 보다 작은 크기의 니들을 가지는 삼지창 형태 등의 니들에 해당할 수 있다.

또한, 본 발명은, 몰드에 리포좀 또는 리피드 나노입자 및 동결건조보호액을 포함하는 용액을 충전하는 단계(S1);

상기 리포좀 또는 리피드 나노입자는 약물을 함유하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 S1 단계의 리포좀을 포함하는 용액은, SPC, 콜레스테롤, 스테아릴아민을 포함하는 것일 수 있다. 상기 SPC는 리포좀 입자의 안정성과 리포좀의 유동성을 증가시킬 수 있고, 콜레스테롤은 리포좀의 안정성과 이중층 멤브레인의 유동성을 조정할 수 있으며, 스테아릴아민은 리포좀의 표면이 양이온성을 갖도록 할 수 있다. 상기 SPC, 콜레스테롤 및 스테아릴아민은, 60-80 : 15-30 : 1-10의 몰비율로 혼합될 수 있고, 보다 바람직하게는 70-75 : 22-26 : 2-6의 몰비율로 혼합될 수 있다. 상기 혼합 범위로 제조된 리포좀은 유전자 등 약물 전달을 위해 이상적인 제타포텐셜을 가지며, 안정성이 우수한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 S1 단계의 지질나노입자를 포함하는 용액은, MC3, DSPC, 콜레스테롤 및 C18-PEG2000을 포함하는 것일 수 있다. 상기 MC3는 이온화 지질로서 LNP의 이온화를 통해 지질나노입자가 안정적으로 형성되도록하고, DSPC는 LNP가 안정적으로 형성되도록 하며, 콜레스테롤은 LNP의 안정성과 유동성을 조정할 수 있으며, C18-PEG2000은 LNP가 이중층을 양호하게 형성하도록 할 수 있다. 상기 MC3, DSPC, 콜레스테롤 및 C18-PEG2000은, 40-60 : 5-25 : 30-45 : 0.1-5의 몰비율로 혼합될 수 있고, 보다 바람직하게는 45-55 : 8-12 : 35-40 : 1-3의 몰비율로 혼합될 수 있다. 상기 혼합 범위로 제조된 LNP는 유전자 등 약물 전달을 위해 이상적인 제타포텐셜을 가지며, 안정성이 우수한 것을 특징으로 한다.

상기 제조방법에 의해 제조된 마이크로니들은, 상술한 마이크로니들과 실질적으로 동일한 것으로, 제조방법에 대한 설명으로서 기재된 내용 중 일부의 내용은 마이크로니들을 설명한 내용에 포함되므로 중복 기재되지 않고 생략된 것으로 이해되어야 할 것이다.

본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 마이크로니들의 제조에 사용되는 몰드는, 원추 모양의 복수 개의 홀이 이격되어 형성되어 있는 몰드일 수 있다. 상기 몰드는 S3 단계 이후, 니들부 및 시트부가 결합되어 제조된 마이크로니들과 분리된다. 상기 몰드의 재료는, PDMS를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

리포좀과 지질 나노입자(LNP)는, 설계상 유사하지만 구성과 기능이 약간 상이한 입자이다. 일반적으로 리포좀은 코어-쉘 구조를 가지는 것으로 바운더리가 지질 이중층 구조를 가지며, 지질 나노입자는 동일하게 지질 이중층 구조를 갖거나 지질 단일층 구조를 가질 수도 있다.

보다 구체적인 하나의 예시로서, 리포좀은 친수성 코어를 가질 수 있고, LNP의 경우 소수성 코어를 가질 수 있으며, 이에 PEG화 인지질과 같은 안정화제를 제조에 사용하여, LNP가 작은 크기를 유지할 수 있도록 구조를 안정화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 실시예로서, 상기 리포좀은 유기용매에 지질을 용해시켜 지질 용액을 형성한 후, 약물을 포함하는 수용액을 지질 용액에 첨가한 후, 유화시켜 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 리포좀은, 바람직하게는 양이온성을 갖는 것으로 -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고, 10~500 nm 의 크기를 갖는 것일 수 있다. 더 바람직하게는, 10~200 nm(일반적으로 약 100 nm)의 크기를 갖고, ± 10 mV의 제타전위를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시예로서, 상기 지질 나노입자는, 유기용매에 지질과 안정화지질(예를 들어, PEG 함유 인지질)을 용해시켜 음이온성 지질 용액을 형성한 후, 약물을 포함하는 수용액을 지질 용액에 첨가한 후, 투석 및 여과 과정을 거쳐 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 지질 나노입자는, 바람직하게는 음이온성을 갖는 것으로 -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고 10~400 nm의 크기를 갖는 것일 수 있다. 더 바람직하게는, 10~200 nm(일반적으로 약 100 nm)의 크기를 갖고, ± 10 mV의 제타전위를 가질 수 있다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예 들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.

어느 하나의 실시예에 포함된 구성요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성요소는, 다른 실시예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시예에 기재한 설명은 다른 실시 예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

[실시예]

실시예 1. 지질나노입자(LNP) 및 리포좀의 제조

1.1. 리포좀 제조

표 1에 나타낸 몰비율로, SPC 75 mg, Cholesterol 25 mg (Lipid(SPC) : Cholesterol = 3:1), Stearylamine 3.75 mg 및 Ethanol 1.5mL을 준비하였다. 상기 SPC, Cholesterol 및 Stearylamine를 70℃ 수조에서 2시간 동안 에탄올에 용해시켜 Lipid solution을 제조하였다.

동결건조보호제 (sucrose, trehalose, maltose, glucose)를 15%(w/v) 또는 20%(w/v)으로 용해시킨 Phosphate Buffer Solution (PBS)을 Aqueous solution으로 사용하였다.

상기 ethanol phase로 제조된 lipid solution과 aqua phase를 1:13 비율로 하여 microfluidic machine을 이용하여 liposome을 제조하였다.

재료	몰비율(%)
Soy phosphatidylcholine(SPC)	72
Cholesterol(Chol)	24
Stearylamine(SA)	4

제조된 리포좀의 특성을 하기 표 2에 나타내었다.

Formulation	Z-Average (nm)	Zeta potential (mV)	Concentration(mg/mL)
Liposome	98.02±2.40	+ 9.89±1.37	50

상기 표 2의 결과와 같이 본 발명의 리포좀은 약물 전달에 이용되기에 적합한 100 nm와 유사 수준의 크기를 가지며, 유전자 물질 전달을 위한 이상적인 제타포텐셜인 + 10 mV를 갖는다는 것을 확인하였다.

이후 실시예에서 DNA와 같은 성분을 제형화 할 수 있는지 확인하기 위해, 제조된 lipid solution을 plasmid DNA를 용해시킨 aqueous solution과 함께 microfluidic machine으로 혼합하여 DNA가 제형화된 Lipoplex를 제조하였다.

1.2. LNP의 제조

도 2에 나타낸 것과 같이 LNP 제조를 진행하였다. 먼저 표 3에 나타낸 몰비율로 MC3, DSPC, cholesterol, C18-PEG 2K를 준비하여, pure EtOH에 30분 동안 microfluidic machine을 이용하여 리피드 용액을 제조하였다.

재료	몰비율(%)
Ionizable lipid(MC3)	50
Helper lipid(DSPC)	10
Cholesterol	38.5
PEG-lipid(C18-PEG 2000)	1.5

내부에 봉입시키기 위한 mRNA는 Luciferase control DNA로부터 in vitro transcription을 통해 luciferase mRNA를 뽑아내 제조하였다. 상기 mRNA를 20:1의 비율 (MC3:mRNA)로 50 mM pH 4.0 citrate buffer에 용해시켰다.

ethanol phase의 리피드 용액과 mRNA를 용해시킨 aqua phase를 1:3 비율로 30분 동안 vortexing으로 혼합한 뒤, 실온에서 1시간 동안 안정화 과정을 진행하였다. 이후, Dialysis kit를 이용하여 DI water로 2시간동안 투석과정을 거쳤다(물은 10, 20, 30, 50, 70, 90분 시점에 갈아주었음).

실시예 2. 리포좀 입자 분석

2.1. 리포좀 입자 분석

상기 실시예 1에서 제조된 리포좀 입자 및 Lipoplex 입자에 대하여 동결건조를 수행하여 입자의 성상을 확인하였다.

Dynamic Light scattering (DLS) 및 zetasizer를 이용한 입도분석을 통해 입자의 성상을 분석한 후 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 것과 같이 Liposome 이 동결건조 후에도 그 입자의 성상을 유지하는 것을 확인할 수 있으며, lipoplex(liposome+DNA)도 동결건조후 그 모양이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 마이크로니들의 제조

3.1. 리포좀 마이크로 니들의 제조

도 1에 나타낸 것과 같이, PDMS 몰드(7x7 어레이) 표면에 실시예 1에서 제조한 리포솜 용액 100 μL 및 DNA 및 리포솜을 포함하는 Lipoplex 용액 100 μL을 부은 다음 몰드의 캡을 덮고 1시간 30분 동안 진공을 설정하였다.

PDMS 몰드 표면의 과잉 리포솜 용액 및 Lipoplex 용액을 긁어내고 1시간 동안 진공 상태를 유지하였고, PDMS 몰드의 용액을 -4℃에서 4시간 동안 보관한 후, PDMS 몰드의 용액을 24시간 동안 동결건조해주었다.

동결 건조가 마무리되면, 몰드 표면에 PVP 용액(40% w/w)을 첨가한 후, 몰드를 25℃의 오븐에서 밤새 건조시켰다. 이후 DMN을 몰드에서 부드럽게 벗겨내고 데시케이터에 24시간 동안 보관했다.

리포좀을 이용하여 제조된 마이크로 니들을 현미경을 통해 관찰하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이, 리포좀이 포함된 마이크로니들이 잘 제조되었음을 알 수 있다.

또한 상기 Lipoplex를 이용하여 제조된 마이크로니들(좌)과 리포좀을 이용하여 제조된 마이크로니들(우)의 입도분석 결과를 도 5에 나타내었다. 마이크로니들 제형에 lipoplex(liposome+DNA) 및 동결건조보호제(sucrose, trehalose, maltose, glucose 등)를 넣고 동결건조한 마이크로니들을 제조한 뒤에도 lipoplex 의 그 모양이 유지 되는 것을 확인할 수 있다(*표시는 마이크로니들 자체의 구성물질).

3.2. LNP 마이크로 니들의 제조

도 6에 나타낸 것과 같이, PDMS 몰드(7x7 어레이) 표면에 실시예 1에서 제조한 LNP 용액 100 μL와 PVA 및 PVP K-30을 혼합한 용액(동결건조보호제 및 LNP 구조 안정제로서 트레할로스 또는 수크로스 포함)을 부은 다음 몰드의 캡을 덮고 1시간 30분 동안 진공을 설정하였다.

PDMS 몰드 표면의 과잉 LNP 용액을 긁어내고 1시간 동안 진공 상태를 유지하였고, PDMS 몰드의 용액을 -4℃에서 4시간 동안 보관한 후, PDMS 몰드의 용액을 24시간 동안 동결건조해주었다.

동결 건조가 마무리되면, 몰드 표면에 PVP K-30 용액(40% w/w)을 첨가한 후, 몰드를 25℃의 오븐에서 밤새 건조시켰다. 이후 DMN을 몰드에서 부드럽게 벗겨내고 데시케이터에 24시간 동안 보관했다.

상기 LNP 마이크로 니들을 현미경을 통해 관찰하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인할 수 있는 것과 같이, LNP가 포함된 마이크로니들이 잘 제조되었음을 알 수 있다.

또한 상기 LNP, PVA 및 PVP K-30을 포함하는 용액(a) 및 LNP 없이 PVA 및 PVP K-30만 포함하는 용액(b)과, 상기 두 용액을 이용하여 제조된 마이크로니들(c, d)에 대한 입도 분석 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 것과 같이, *는 마이크로니들 제형 자체로 인한 peak 이며, 마이크로니들 제작 후에도 LNP 가 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.

이에 제조전 제형의 상태와 제작 후 재분산한 후 제형의 상태를 확인하여 도 9에 나타내었다. 도 9의 좌측 도면은 DMA 제조에 사용되는 formulation 과 LNP 를 섞었을 때 결과로, 실선은 LNP 가 없는 그룹, 점선은 LNP 가 있는 그룹으로, 두 그룹을 비교하였을 때 10 nm 부근에서 발현되는 피크는 PVA 와 PVP K 30 의 피크이며 약 100 nm 부근에서 발현되는 피크는 LNP 의 피크인 것을 확인할 수 있다. 도 9의 우측 도면은 DMA 제조 후 phosphate buffer saline 에 녹인 용액을 분석한 것으로, 실선은 LNP 가 없는 그룹, 점선은 LNP가 있는 그룹이며, 두 그룹을 비교하였을 때 약 100 nm 부근에서 LNP 의 피크가 유지되는 것을 확인할 수 있다.

상기 결과를 통해 본 발명의 LNP는 마이크로 니들 제작 후에도 LNP가 잘 유지되며, 제조 후 재분산 시에도 LNP 피크가 유지되는 것이 확인되어, 약물 전달에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4. LNP의 mRNA 포함 효율 확인

LNP를 이용한 마이크로니들에서 mRNA 포함 수준을 측정하여 도 10 및 하기 표 4에 나타내었다.

Sample		EE (%)
저농도 mRNA stock	Fresh LNPs	99.43±0.12
저농도 mRNA stock	마이크로니들 제형	70.09±2.39
고농도 mRNA stock	Fresh LNPs	88.53±1.58
고농도 mRNA stock	마이크로니들 제형	45.15±2.64

상기 결과를 통해, 마이크로니들 제형을 통해서도 LNP의 70%가 유지되었음을 확인하였고, 특히 저농도 mRNA에서 높은 효율을 보이는 것이 확인되었다.

실시예 5. 마이크로니들의 피부 투과여부 확인

5.1. 리포좀 마이크로 니들의 피부 투과여부 확인

실시예 3에서 제조된 리포좀 마이크로니들을 이용하여 피부 투과 여부를 확인하였다. 투과 실험은 생체 외 돼지 피부를 사용하여 수행되었다. 모피를 제거하고 알코올 면봉으로 청소하여 피부를 준비하고 핀으로 보드에 단단히 고정하였다. 그런 다음 실시예 3에서 제조된 마이크로니들을 사용하여 피부에 투과시켜주었다. 이후 현미경(Olympus, SZ61 TR, Tokyo, Japan)을 이용하여 피부영상을 촬영하여 피부 투과도를 확인하였다.

결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에서 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명의 마이크로니들을 이용하여 효과적으로 피부투과가 이루어지는 것을 확인하였다.

5.3. LNP 마이크로 니들의 피부 투과여부 확인

실시예 3에서 제조된 LNP 마이크로니들을 이용하여 피부 투과 여부를 확인하였다. 투과 실험은 생체 외 돼지 피부를 사용하여 수행되었다. 모피를 제거하고 알코올 면봉으로 청소하여 피부를 준비하고 핀으로 보드에 단단히 고정하였다. 그런 다음 실시예 3에서 제조된 LNP 마이크로니들을 사용하여 피부에 투과시켜주었다. 이후 현미경(Olympus, SZ61 TR, Tokyo, Japan)을 이용하여 피부영상을 촬영하여 피부 투과도를 확인하였다.

결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에서 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명의 마이크로니들을 이용하여 효과적으로 피부투과가 이루어지는 것을 확인하였다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

시트부; 및
상기 시트부의 상부에 형성되고, 약물 및 상기 약물이 함유되는 리포좀 또는 지질나노입자와 동결건조보호액을 포함하는 복수개의 니들부;를 포함하고,
상기 니들부는 동결건조에 의해 형성된 것인, 약물 전달용 마이크로니들.
제1항에 있어서,
상기 약물은 수용성 약물, 난용성 약물, 백신, 호르몬제, 항체 약물, 및 펩타이드 약물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약물 전달용 마이크로니들.
제1항에 있어서,
상기 니들부 및 시트부는 고분자를 포함하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들.
제3항에 있어서,
상기 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜, 키토산, 소듐히알루로네이트 및 플루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약물 전달용 마이크로니들.
제1항에 있어서,
상기 리포좀 또는 지질나노입자는,
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EPOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(SPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDPPC), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Cholesterol), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DO-Ethyl-PC) 및 DLin-MC3-DMA(MC3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질을 포함하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들.
제1항에 있어서,
상기 동결건조보호액은 수크로스, 트레할로스, 말토즈 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 동결건조보호제를 포함하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들.
제1항에 있어서,
상기 리포좀은, -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고, 10~500 nm 의 크기를 갖는 것인,
약물 전달용 마이크로니들.
제1항에 있어서,
상기 지질나노입자는, -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고 10~400nm 의 크기를 갖는 것인,
약물 전달용 마이크로니들.
몰드에 리포좀 또는 지질나노입자 및 동결건조보호액을 포함하는 용액을 충전하는 단계(S1);
용액이 충전된 몰드를 동결건조하여 니들부를 제조하는 단계(S2); 및
상기 니들부 상부에 고분자 용액을 충전한 후 건조하여 시트부를 제조하는 단계(S3)를 포함하고,
상기 리포좀 또는 지질나노입자는 약물을 함유하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 약물은 수용성 약물, 난용성 약물, 백신, 호르몬제, 항체 약물, 및 펩타이드 약물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜, 키토산, 소듐히알루로네이트 및 플루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 리포좀 또는 지질나노입자는,
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EPOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDMPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(SPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDPPC), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Cholesterol), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린](DOPS), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DO-Ethyl-PC) 및 DLin-MC3-DMA(MC3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질을 포함하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 동결건조보호액은 수크로스, 트레할로스, 말토즈 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 동결건조보호제를 포함하는 것인, 약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 리포좀은, -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고, 10~500 nm 의 크기를 갖는 것인,
약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 지질나노입자는, -30 내지 30 mV의 제타전위를 갖고 10~400nm 의 크기를 갖는 것인,
약물 전달용 마이크로니들의 제조방법.