KR20230120126A - 자가-복제 rna 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230120126A
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잉샤 웬
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Abstract

본 개시내용은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로부터의 항원을 암호화하는 자가-복제 RNA 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용은 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 자가-복제 RNA 또는 모노시스트론 자가-복제 RNA를 제공하고, 여기서 항원은 SARS-CoV-2로부터 유래하고, 항원은 스파이크(S) 단백질 또는 뉴클레오캡시드(N) 단백질이다.

Description

자가-복제 RNA 및 이의 용도
관련 출원 데이터
본 출원은 2020년 12월 2일에 "자가-복제 RNA 및 이의 용도"라는 명칭으로 출원된 미국 특허 출원 제63/120,370호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 명세서는 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로부터의 항원을 암호화하는 자가-복제 RNA 및 이의 용도에 관한 것이다.
2019년 말, 중국에서 신종 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2)가 인간에게서 확인되었으며 중증 감염성 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)를 유발하는 원인이 되었다. 2019년 12월부터 이 바이러스의 전 세계적 확산은 세계보건기구(WHO)가 2020년 3월 11일 팬데믹으로 선언하면서 모든 국가에 확산되었다. 이 바이러스에 의한 인간 감염은 높은 전염률로 광범위한 임상 스펙트럼을 나타낸다. 전 세계 감염자 수와 사망자 수는 계속 증가하여 현재까지 감염자 수는 5,400만 명을 초과하고 회복자 수는 3,500만 명을 초과하고 사망자 수는 130만 명을 초과한다.
백신은 이 전염병을 예방하기 위한 중요한 건강 개입이다. 이 팬데믹으로 인해 현재까지 200개 초과의 백신이 개발 중이고 30개 초과의 백신이 임상 시험 중이며 여러 백신이 3상에 있는 등 전례 없이 여러 백신의 개발을 목격했다. 햄스터 챌린지 모델에서 재조합 SARS-CoV 단백질에 대한 초기 연구에서 이 접근법이 면역원성 및 보호 효과가 있음을 입증한 이후, 지금까지 개발된 대부분의 백신은 면역 체계가 SARS-COV-2 스파이크 단백질(또는 S 단백질)을 인식하도록 유도하려는 시도가 있었다.
그러나, 현재 SARS-CoV-2에 대해 승인된 치료 및/또는 예방 백신은 없다. 따라서, SARS-CoV-2에 대한 구체적이고 효율적인 백신을 개발할 필요가 남아 있다. 또한, 이러한 백신은 충분한 양으로, 특히 팬데믹 기간 동안에, 그리고 인플루엔자 백신 제조에 사용되는 현재의 계란-기반 기술보다 더 빠르게 생산될 수 있는 것이 바람직하다.
요약
본 개시내용은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 항원에 대한 자가-복제 RNA의 본 발명자의 확인에 기초한다.
본 발명자들에 의한 발견은 SARS-CoV-2 항원에 대한 자가-복제 RNA의 기초를 제공한다. 본 발명자들에 의한 발견은 또한 SARS-CoV-2 항원에 대한 모노시스트론 자가-복제 RNA에 대한 기초를 제공한다. 또한, 본 발명자들에 의한 발견은 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, SARS-COV-2 감염, COVID-19 및/또는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS))을 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법에 대한 기초를 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 서브게놈(SG) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 자가-복제 RNA를 제공하며, 여기서 항원은 SARS-CoV-2로부터 유래한 것이다.
본 개시내용은 또한 SG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모노시스트론 자가-복제 RNA를 제공하며, 여기서 항원은 SARS-CoV-2로부터 유래한 것이다.
한 예에서, 항원은 스파이크(S) 단백질 또는 뉴클레오캡시드(N) 단백질이다. 한 예에서, 항원은 SARS-CoV-2 균주 2019-nCoV/USA-WA1/2020으로부터의 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 S 단백질이다.
한 예에서, 항원은 S 단백질이다. 예를 들어, S 단백질은 서열번호 1에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 예에서, S 단백질은 돌연변이체 S 단백질이다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 수용체 결합 도메인에서 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이는 S438F, N439K, N440K, L441I, K444R, V445A, V445I, G446V, G446S, N450K, L452R, L452P, L455F, K458N, N460T, D467V, I468F, I468T, I468V, E471O, I472V, A475V, G476S, S477G, S477I, S477N, S477R, T478I, P479L, P479L, P479S, N481D, N481H, V483F, V483A, E484D, E484K, E484K, E484O, G485S, Y489H, Y489D, Y489F, Y489C, Y489N, F490L, F490S, P491R, Q493L, S494P, Y495N, T500N, N501S 및 Y505H, Y508H로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 N439K, N439L, L452R, S477N, T478I, V483A 및 E484D로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 결합 도메인에서 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 P337S, F338L, F338C, G339D, E340K, V341I, A344S, T345S, R346K, A348S, A348T, W353R, N354D, N354K, N354S, S359N, D364Y, V367F, S373L, V382L, P384L, P384S, T385A, T393P, V395I, F400C, R403K, R403S, D405V, R408I, Q414E, Q414K, Q414P, Q414R, T415S, K417R, K417N, I418V, Y421S, Y423C, Y423F, Y423S, D427Y, R509K, V510L, V511E, V512L, L518I, H519O, A520S, A520V, P521R, P521S, A522P, A522S 및 D614G로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 L18F, D80A, T95I, Y144S, Y145N, D215G, P337S, F338L, F338C, G339D, E340K, V341I, A344S, T345S, R346K, A348S, A348T, W353R, N354D, N354K, N354S, S359N, D364Y, V367F, S373L, V382L, P384L, P384S, T385A, T393P, V395I, F400C, R403K, R403S, D405V, R408I, Q414E, Q414K, Q414P, Q414R, T415S, K417N, K417T, K417R, I418V, Y421S, Y423C, Y423F, Y423S, D427Y, S438F, N439K, N440K, L441I, K444R, V445A, V445I, G446V, G446S, N450K, L452R, L452P, L455F, K458N, N460T, D467V, I468F, I468T, I468V, E471O, I472V, A475V, G476S, S477G, S477I, S477N, S477R, T478I, T478K, P479L, P479S, N481D, N481H, V483F, V483A, E484D, E484K, E484K, E484O, G485S, Y489H, Y489D, Y489F, Y489C, Y489N, F490L, F490S, P491R, Q493L, S494P, Y495N, T500N, N501S, N501Y, Y505H, Y508H, R509K, V510L, V511E, V512L, L518I, H519O, A520S, A520V, P521R, P521S, A522P, A522S, A570D, D614G, P680H, P681H, A701V, T716I 및 D950N으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은: (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고/있거나; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 7에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 5에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 4에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 3에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 6에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 69 및 70에 상응하는 2개의 잔기의 결실을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 144에 상응하는 하나의 잔기의 결실을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 69 및 70에 상응하는 2개의 잔기의 결실을 포함하고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 144에 상응하는 하나의 잔기의 결실을 포함하고; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함하고; (v) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 19에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 242 내지 244에 상응하는 3개의 잔기의 결실을 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 417에 상응하는 잔기에서 K에서 N으로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 484에 상응하는 잔기에서 E에서 K로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 242 내지 244에 상응하는 3개의 잔기의 결실을 포함하고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 417에 상응하는 잔기에서 K에서 N으로의 돌연변이를 포함하고; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 484에 상응하는 잔기에서 E에서 K로의 돌연변이를 포함하고; (v) 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함하고; (vi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 20에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 (i) 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 69 및 70에 상응하는 2개의 잔기의 결실을 포함하고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 242 내지 244에 상응하는 3개의 잔기의 결실을 포함하고; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 417에 상응하는 잔기에서 K에서 N으로의 돌연변이를 포함하고; (v) 서열번호 18의 뉴클레오티드 484에 상응하는 잔기에서 E에서 K로의 돌연변이를 포함하고; (vi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함하고; (vii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 21에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 570에 상응하는 잔기에서 A에서 D로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 680에 상응하는 잔기에서 P에서 H로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 716에 상응하는 잔기에서 T에서 I로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 69 및 70에 상응하는 2개의 잔기의 결실을 포함하고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 144에 상응하는 하나의 잔기의 결실을 포함하고; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함하고; (v) 서열번호 18의 뉴클레오티드 570에 상응하는 잔기에서 A에서 D로의 돌연변이를 포함하고; (vi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고; (vii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 680에 상응하는 잔기에서 P에서 H로의 돌연변이를 포함하고; (viii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 716에 상응하는 잔기에서 T에서 I로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 22에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 18에 상응하는 잔기에서 L에서 F로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 80에 상응하는 잔기에서 D에서 A로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 215에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 서열번호 18의 뉴클레오티드 701에 상응하는 잔기에서 A에서 V로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, S 단백질은 (i) 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고; (ii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 18에 상응하는 잔기에서 L에서 F로의 돌연변이를 포함하고; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 80에 상응하는 잔기에서 D에서 A로의 돌연변이를 포함하고; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 215에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고; (v) 서열번호 18의 뉴클레오티드 242 내지 244에 상응하는 3개의 잔기의 결실을 포함하고; (vi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 417에 상응하는 잔기에서 K에서 N으로의 돌연변이를 포함하고; (vii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 484에 상응하는 잔기에서 E에서 K로의 돌연변이를 포함하고; (viii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함하고; (ix) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고; (x) 서열번호 18의 뉴클레오티드 701에 상응하는 잔기에서 A에서 V로의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 23에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은: (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고/있거나; (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함하고/하거나; (v) 서열번호 18의 뉴클레오티드 501에 상응하는 잔기에서 N에서 Y로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (vi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 69 및 70에 상응하는 2개의 잔기의 결실을 포함하고/하거나; (vii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 144에 상응하는 하나의 잔기의 결실을 포함하고/하거나; (viii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 242 내지 244에 상응하는 3개의 잔기의 결실을 포함하고/하거나; (ix) 서열번호 18의 뉴클레오티드 417에 상응하는 잔기에서 K에서 N으로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (x) 서열번호 18의 뉴클레오티드 484에 상응하는 잔기에서 E에서 K로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 570에 상응하는 잔기에서 A에서 D로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 680에 상응하는 잔기에서 P에서 H로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xiii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 716에 상응하는 잔기에서 T에서 I로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xix) 서열번호 18의 뉴클레오티드 18에 상응하는 잔기에서 L에서 F로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xx); 서열번호 18의 뉴클레오티드 80에 상응하는 잔기에서 D에서 A로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xxi) 서열번호 18의 뉴클레오티드 215에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고/하거나; (xxii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 701에 상응하는 잔기에서 A에서 V로의 돌연변이를 포함한다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 3에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 4에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 5에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 6에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 7에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 2 내지 7 및/또는 19 내지 23 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 19 내지 23 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 19에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 20에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 21에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 22에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 23에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 항원은 N 단백질이다. 예를 들어, N 단백질은 서열번호 8에 제시된 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, SG 프로모터는 천연 SG 프로모터이다. 예를 들어, 천연 SG 프로모터는 그것이 유래 및/또는 기반이 되는 RNA 바이러스(예를 들어, 알파바이러스)에 고유한 프로모터이다. 한 예에서, 천연 SG 프로모터는 천연 알파바이러스 SG 프로모터이다.
한 예에서, 천연 SG 프로모터는 최소 SG 프로모터이다. 예를 들어, 최소 SG 프로모터는 전사 개시에 필요한 최소 서열이다. 한 예에서, 최소 천연 SG 프로모터는 49개 뉴클레오티드 길이이다. 한 예에서, 최소 천연 SG 프로모터는 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 서열에 의해 암호화된다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 알파바이러스로부터 유래된다. 예를 들어, 알파바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스(SFV: Semliki Forest virus), 신드비스 바이러스(SIN: Sindbis virus), 및 베네수엘라 말뇌염 바이러스(VEE: Venezuelan equine encephalitis virus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 셈리키 포레스트 바이러스(SFV)로부터 유래된다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 신드비스 바이러스(SIN)로부터 유래된다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 베네수엘라 말뇌염 바이러스(VEE)로부터 유래된다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 10(Co5)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 11(Co6)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 12(Co16)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 13(Co17)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 14(Co48)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 15(Co49)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 16(Co58)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 17(Co59)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 24(Co77)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 25(Co78)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 26(Co79)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 27(Co80)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 서열번호 28(Co81)에 제시된 서열에 의해 암호화된 자가-복제 RNA를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 투여될 때 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 투여는 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 유도한다. 한 예에서, 조성물은 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 예를 들어, 체액성 면역 반응은 항체-매개 면역 반응이다. 또 다른 예에서, 조성물은 세포-매개 면역 반응을 유도한다. 예를 들어, 세포-매개 면역 반응은 항원-특이적 세포독성 T 세포의 활성화를 포함한다.
한 예에서, 면역원성 조성물은 복수의 자가-복제 RNA를 포함하고, 여기서 각각의 자가-복제 RNA는 상이한 폴리펩타이드 항원 서열을 암호화한다. 예를 들어, 상이한 폴리펩타이드 항원 서열은 바이러스의 동일한 균주로부터 유래한다(예를 들어, 동일한 SARS-CoV-2 균주로부터의 항원을 암호화함). 한 예에서, 상이한 폴리펩타이드 항원 서열은 동일한 바이러스의 상이한 균주로부터 유래한다(예를 들어, SARS-CoV-2의 상이한 균주로부터의 항원을 암호화함). 한 예에서, 상이한 폴리펩타이드 항원 서열은 상이한 바이러스로부터 유래한다(예를 들어, SARS-CoV-2로부터의 항원 및 관련되지 않은 바이러스, 예를 들어 인플루엔자로부터의 항원을 암호화함).
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
한 예에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP), 중합체성 미립자, 및 수중유 에멀젼을 추가로 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 LNP, 중합체성 미립자, 및 수중유 에멀젼에 캡슐화되거나, 결합되거나, 흡착된다.
한 예에서, 약제학적 조성물은 LNP를 추가로 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 LNP에 캡슐화된다. 또 다른 예에서, 자가-복제 RNA는 LNP에 결합된다. 추가 예에서, 자가-복제 RNA는 LNP에 흡착된다.
한 예에서, 약제학적 조성물은 중합체성 미립자를 추가로 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 중합체성 미립자에 캡슐화된다. 또 다른 예에서, 자가-복제 RNA는 중합체성 미립자에 결합된다. 추가 예에서, 자가-복제 RNA는 중합체성 미립자에 흡착된다.
한 예에서, 약제학적 조성물은 수중유 에멀젼을 추가로 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 수중유 에멀젼에 캡슐화된다. 또 다른 예에서, 자가-복제 RNA는 수중유 에멀젼에 결합된다. 추가 예에서, 자가-복제 RNA는 수중유 에멀젼에 흡착된다. 추가 예에서, 자가-복제 RNA는 수중유 에멀젼에 재현탁된다.
본 개시내용은 또한 백신으로서 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 자가-복제 RNA 백신을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 한 예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 자가-복제 RNA 백신을 암호화하는 DNA를 제공한다.
본 개시내용은 SARS-2-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 SARS-2-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 예에서, 본 개시내용은 SARS-2-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합의 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 SARS-2-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 COVID-19의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 COVID-19의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 COVID-19의 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가 예에서, 본 개시내용은 COVID-19의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 SARS-CoV-2 감염의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 SARS-CoV-2 감염의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 SARS-CoV-2 감염의 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가 예에서, 본 개시내용은 SARS-CoV-2 감염의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용은 ARDS의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 ARDS의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 ARDS의 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가 예에서, 본 개시내용은 ARDS의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 예에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환 또는 병태를 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가 예에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환 또는 병태의 진행을 지연시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 자가-복제 RNA의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 자가-복제 RNA의 용도를 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 자가-복제 RNA의 용도를 제공한다. 추가 예에서, 본 개시내용은 본 개시내용은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 자가-복제 RNA의 용도를 제공한다.
한 예에서, 대상체는 질환 또는 병태를 앓고 있다. 한 예에서, 대상체는 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단되었다. 한 예에서, 대상체는 질환 또는 병태에 대한 치료를 받고 있다.
한 예에서, 질환 또는 병태는 SARS-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 예에서, 질환 또는 병태는 SARS-CoV-2 감염이다. 또 다른 예에서, 질환 또는 병태는 COVID-19이다. 추가 예에서, 질환 또는 병태는 ARDS이다. 한 예에서, ARDS는 SARS-CoV-2 감염 및/또는 COVID-19와 관련이 있다. 예를 들어, 질환 또는 병태는 ARDS이다. 한 예에서, ARDS는 SARS-CoV-2 감염과 관련이 있다. 또 다른 예에서, 질환 또는 병태는 ARDS이다. 한 예에서, ARDS는 COVID-19와 관련이 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 대상체에서 SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS의 발생 전 또는 후에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 대상체에서 SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS의 발생 전에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 대상체에서 SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS의 발생 후에 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 대상체에서 SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS의 검출 후에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 SARS-CoV-2 감염의 검출 후에 투여된다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 SARS-CoV-2 감염의 검출 후 그러나 COVID-19의 발생 전에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 추가 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 COVID-19의 검출 후에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 COVID-19의 검출 후 그러나 ARDS의 발생 전에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 또 다른 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 ARDS의 검출 후에 투여된다.
한 예에서, 대상체는 COVID-19 또는 ARDS가 발생할 위험이 있다. 예를 들어, 대상체는 COVID-19가 발생할 위험이 있다. 추가 예에서, 대상체는 ARDS가 발생할 위험이 있다.
한 예에서, 본 개시내용의 조성물은 SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나 발병을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS의 증상은 당업자에게 명백할 것이며/이거나 본원에 기재되어 있다.
본 개시내용은 본 개시내용의의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물은 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 유도한다. 한 예에서, 조성물은 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 예를 들어, 체액성 면역 반응은 항체-매개 면역 반응이다. 예를 들어, 중화 항체의 생산. 또 다른 예에서, 조성물은 세포-매개 면역 반응을 유도한다. 예를 들어, 세포-매개 면역 반응은 항원-특이적 세포독성 T 세포의 활성화를 유도한다. 예를 들어, T 세포는 CD4 T 세포 및/또는 CD8 T 세포이다. 한 예에서, T 세포는 CD4 T 세포이다. 또 다른 예에서, T 세포는 CD8 T 세포이다. 추가 예에서, T 세포는 CD4 및 CD8 T 세포이다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여는 CD4 T 세포 매개 면역 반응을 유도한다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여는 CD8 T 세포 매개 면역 반응을 유도한다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여는 CD4 및 CD8 T 세포 매개 면역 반응을 유도한다.
한 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th0, Th1 및/또는 Th2 반응이다. 예를 들어, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th0 반응이다. 또 다른 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th1 반응이다. 추가 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th2 반응이다. 한 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th0 및 Th1 반응이다. 또 다른 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th0 및 Th2 반응이다. 추가 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th1 및 Th2 반응이다. 또 다른 예에서, CD4 T 세포 매개 면역 반응은 Th0, Th1 및 Th2 반응이다.
한 예에서, Th0 반응 사이토카인은 인터루킨 2(IL2+) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNFa+)를 발현하고/하거나; 인터페론 감마(IFNg-), IL5- 및/또는 IL13-에 대해 음성이다. 예를 들어, 사이토카인은 IL2+이다. 또 다른 예에서, 사이토카인은 TNFa+이다. 한 예에서, 사이토카인은 IFNg-이다. 또 다른 예에서, 사이토카인은 IL5-이다. 추가 예에서, 사이토카인은 IL13-이다.
한 예에서, Th1 반응 사이토카인은 인터페론 감마(IFNg+)를 발현하고/하거나; IL5- 및/또는 IL13-에 대해 음성이다. 예를 들어, 사이토카인은 IFNg+이다. 또 다른 예에서, 사이토카인은 IL5-이다. 추가 예에서, 사이토카인은 IL13-이다.
한 예에서, Th2 반응 사이토카인은 IL5+ 및/또는 IL13+를 발현하고/하거나; IFNg에 대해 음성이다. 예를 들어, 사이토카인은 IL5+이다. 추가 예에서, 사이토카인은 IL13+이다. 예를 들어, 사이토카인은 IFNg-이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 재조합 DNA이다. 한 예에서, 재조합 DNA는 플라스미드이다. 한 예에서, 플라스미드는 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS)를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 지침서와 함께 포장된, 선택적으로 전달 시스템에서 본 개시내용의 적어도 하나의 자가-복제 RNA 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 또한 질환 또는 장애(예를 들어, SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS)를 앓고 있거나 앓을 위험에 처한 대상체에게 RNA를 투여하기 위한 지침서와 함께 포장된, 선택적으로 전달 시스템에서 본 개시내용의 적어도 하나의 자가-복제 RNA 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 키트를 제공한다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물은 바이알로 공급된다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물은 주사기로 공급된다.
도 1은 Co16에 의해 유도된 항원-특이적 T 세포를 보여주는 일련의 그래픽 표현이다. (A) S1-특이적 CD4 T 세포, (B) S1-특이적 CD8 T 세포, (C) S2-특이적 CD4 T 세포, (D) S2-특이적 CD8 T 세포, 및 (E) N-특이적 CD4 T 세포에 대해 유도된 순(항원-특이적) % 사이토카인-생성 CD4 및 CD8 T 세포를 나타낸다.
도 2는 (A) 참조 후안(Whuan) 서열; (B) 알파 변이체(B.1.1.7; UK 균주); (C) 베타 변이체(B.1.351; 남아프리카 균주); (D) 감마 변이체(P.1; 브라질 균주); 및 (E) 델타 변이체(B.1.617.2; 인도 균주)에 대한 작제물의 중화 능력을 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
도 3은 (A) 참조 후안 서열; (B) 알파 변이체(B.1.1.7; UK 균주); (C) 베타 변이체(B.1.351; 남아프리카 균주); (D) 감마 변이체(P.1; 브라질 균주); 및 (E) 델타 변이체(B.1.617.2; 인도 균주)에 대한 고용량 및 저용량에서 총 Ig 반응을 생성한 모든 작제물을 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
도 4는 모든 변이체 B-세포 수용체 특이적 프로브와 반응하는 S-특이적 B 세포를 생성한 모든 작제물을 보여주는 그래픽 표현이다. 비특이적 대조군(즉, 베이트 없음 및 음성 대조군 HA H1)은 낮은 수준의 배경 결합을 나타낸다.
도 5는 S1 및 S2 에피토프와 반응성인 항원-특이적 (A) CD4 및 (B) CD8 T 세포를 유도한 모든 작제물을 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
서열 목록의 핵심
서열번호 1 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 전장 wt(절단 가능)의 뉴클레오티드 서열
서열번호 2 절단 불가능한 SARS-CoV-2 돌연변이 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(S1/S2 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이)
서열번호 3 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(S1/S2 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이 및 986P/987P 돌연변이)
서열번호 4 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(S1/S2 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이 및 D614G 돌연변이)
서열번호 5 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(S1/S2 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이 및 S2' 돌연변이)
서열번호 6 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(S1/S2 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이 및 D614G 돌연변이 및 S2' 돌연변이)
서열번호 7 절단 가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(D614G 돌연변이)
서열번호 8 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 전장 wt의 뉴클레오티드 서열
서열번호 9 알파바이러스 천연 서브게놈 프로모터의 뉴클레오티드 서열
서열번호 10 작제물 Co5의 뉴클레오티드 서열
서열번호 11 작제물 Co6의 뉴클레오티드 서열
서열번호 12 작제물 Co16의 뉴클레오티드 서열
서열번호 13 작제물 Co17의 뉴클레오티드 서열
서열번호 14 작제물 Co48의 뉴클레오티드 서열
서열번호 15 작제물 Co49의 뉴클레오티드 서열
서열번호 16 작제물 Co58의 뉴클레오티드 서열
서열번호 17 작제물 Co59의 뉴클레오티드 서열
서열번호 18 SARS-CoV-2 S 단백질 전장 wt의 아미노산 서열
서열번호 19 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(RRAR→QQAA; △69-70; △Y144; N501Y; D614G)
서열번호 20 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(RRAR→QQAA; △242-244; K417N; E484K; N501Y; D614G)
서열번호 21 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(RRAR→QQAA; △69-70; △242-244; K417N; E484K; N501Y; D614G)
서열번호 22 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(RRAR→QQAA; △69-70; △Y144; N501Y; A570D; D614G; P680H; T716I)
서열번호 23 절단 불가능한 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 뉴클레오티드 서열(RRAR→QQAA; L18F; D80A; D215G; △242-244; K417N; E484K; N501Y; D614G; A701V)
서열번호 24 작제물 Co77의 뉴클레오티드 서열
서열번호 25 작제물 Co78의 뉴클레오티드 서열
서열번호 26 작제물 Co79의 뉴클레오티드 서열
서열번호 27 작제물 Co80의 뉴클레오티드 서열
서열번호 28 작제물 Co81의 뉴클레오티드 서열
서열번호 29 VEEV의 5'UTR의 뉴클레오티드 서열
서열번호 30 SINV의 3'UTR의 뉴클레오티드 서열
서열번호 31 GC-풍부 요소
서열번호 32 GC-풍부 요소
서열번호 33 GC-풍부 요소
서열번호 34 히스톤 스템 루프 서열
서열번호 35 코작(Kozak) 컨센서스 서열
서열번호 36 코작 컨센서스 서열
서열번호 37 폴리-A 서열
상세한 설명
일반
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 명시되지 않거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질 구성, 단계의 그룹 또는 물질 구성의 그룹에 대한 언급은 이들 단계, 물질 구성, 단계의 그룹 또는 물질 구성의 그룹 중 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 받아들여질 것이다.
당업자들은 본 개시내용이 구체적으로 설명된 것 이외의 변형 및 수정에 민감하다는 것을 인식할 것이다. 본 개시내용은 그러한 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 개시내용은 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 지시된 모든 단계, 특징, 구성 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상을 포함한다.
본 개시내용은 예시의 목적으로만 의도된 본원에 기재된 특정 예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백히 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용의 모든 실시예는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 임의의 다른 실시예에 필요한 변경을 가하여 적용되는 것으로 받아들여질 것이다. 다른 방식으로 말하면, 본 개시내용의 임의의 특정 예는 본 개시내용의 임의의 다른 특정 예와 조합될 수 있다(상호 배타적이지 않은 경우 제외).
특정 기능 또는 기능 그룹 또는 방법 또는 방법 단계를 개시하는 본 개시내용의 모든 예는 특정 기능 또는 기능 그룹 또는 방법 또는 방법 단계를 부인하는 것에 대한 명시적인 지원을 제공하기 위해 받아들여질 것이다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학에서) 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 받아들여질 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook 등 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel 등 (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) 항체: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan 등 (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함)]과 같은 출처의 문헌 전반에 걸쳐 기술되고 설명되어 있다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 두 가지 의미 또는 두 가지 의미 중 하나를 명시적으로 지원을 제공하는 것으로 받아들여질 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "포함하다"라는 단어 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "로부터 유도된"이라는 용어는 특정 정수가 반드시 해당 공급원으로부터 직접적으로는 아니더라도 특정 공급원으로부터 얻어질 수 있음을 나타내는 것으로 받아들여질 것이다. 마찬가지로, "기반"이라는 용어는 특정 정수가 반드시 해당 공급원으로부터 직접적으로는 아니더라도 특정 공급원으로부터 개발되거나 사용될 수 있음을 나타내는 것으로 받아들여질 것이다.
선택된 정의
본원에 사용된 바와 같이, "자가-복제 RNA"라는 용어는 이종 RNA 및 단백질의 발현을 가능하게 하도록 조작된 RNA 바이러스에 기초한 작제물을 지칭한다. 자가-복제 RNA(예를 들어, 네이키드 RNA 형태로)는 숙주 세포에서 증폭되어 숙주 세포에서 원하는 유전자 산물의 발현을 유도할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 자가-복제 RNA와 관련하여 "모노시스트론"이라는 용어는 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA를 지칭한다.
본원에 사용된 "네이키드"라는 용어는 지질, 중합체 및 단백질과 같은 다른 거대분자가 실질적으로 없는 핵산을 지칭한다. 자가-복제 RNA와 같은 "네이키드" 핵산은 세포 흡수를 개선하기 위해 다른 거대분자와 함께 제형화되지 않는다. 따라서, 네이키드 핵산은 LNP, 리포좀, 중합체성 미립자 또는 수중유 에멀젼에 캡슐화되거나, 흡수되거나, 결합되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 포스포디에스테르 백본에 공유 결합된 일련의 연속적인 뉴클레오티드(또는 염기)를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 관례에 따라, 서열은, 달리 명시되지 않는 한, 5' 말단에서 3' 말단으로 제시된다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원"이라는 용어는 세포 및/또는 체액성 면역 반응을 유도(induce), 유도(elicit), 증강 또는 촉진하는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 분자 또는 구조를 지칭한다. 항원은, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 식물 또는 종양과 같은 병원체로부터의 단백질 및 펩타이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산의 발현이 요소에 의해 제어 또는 조절되도록 핵산에 대해 서브게놈 프로모터를 위치시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "서브게놈 프로모터"(SG; '접합 영역' 프로모터로도 알려져 있음)라는 용어는 단백질 발현을 조절하는 이종 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 프로모터를 지칭한다.
"폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 사슬"이라는 용어는 펩타이드 결합에 의해 연결된 일련의 인접한 아미노산을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 단백질은 단일 폴리펩타이드 사슬, 즉 펩타이드 결합에 의해 연결된 일련의 인접한 아미노산 또는 서로 공유 또는 비공유적으로 연결된 일련의 폴리펩타이드 사슬(즉, 폴리펩타이드 복합체)을 포함하는 것으로 받아들여질 것이다. 일련의 폴리펩타이드 사슬은 적합한 화학적 결합 또는 이황화 결합을 사용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비공유 결합의 예는 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용을 포함한다.
"재조합체"라는 용어는 인공 유전자 재조합의 산물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환", "장애" 또는 "병태"라는 용어는 정상 기능의 중단 또는 방해를 지칭하며, 임의의 특정 상태에 제한되지 않으며 질환 또는 장애를 포함할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 병태가 발생할 "위험이 있는" 대상체는 검출 가능한 질환 또는 질환의 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본 개시내용에 따른 치료 이전에 검출 가능한 질환 또는 질환의 증상이 나타났을 수도 있고 나타나지 않았을 수도 있다. "위험에 처한"이라는 것은 당업계에 알려져 있고/있거나 본원에 기재된 바와 같이 대상체가 질환 또는 병태의 발생과 상관관계가 있는 측정 가능한 매개변수인 하나 이상의 위험 인자를 가지고 있음을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 본원에 기재된 RNA 또는 조성물을 투여함으로써 특정 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"이라는 용어는 개체의 특정 질환 또는 병태의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 개체는 질환에 걸리기 쉽거나 발생 위험이 있을 수 있지만 아직 질환 진단을 받지 않았을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "의 진행을 지연시키는"이라는 어구는 개체에서 질환 또는 병태의 진행 및/또는 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 늦추는 것을 포함한다.
"유효량"이란 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량에서 적어도 유효한 양을 지칭한다. 예를 들어, 원하는 결과는 치료적 또는 예방적 결과일 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여로 제공될 수 있다. 본 개시내용의 일부 예에서, "유효량"이라는 용어는 전술한 바와 같은 질환 또는 병태를 치료하는데 필요한 양을 의미한다. 본 개시내용의 일부 예에서, "유효량"이라는 용어는 전술한 바와 같은 질환 또는 병태와 관련된 변화를 일으키는 데 필요한 양을 의미한다. 유효량은 치료될 질환 또는 병태 또는 변경될 요인에 따라 달라질 수 있으며, 또한 체중, 연령, 인종적 배경, 성별, 건강 및/또는 신체 상태 및 치료될 포유동물과 관련된 기타 인자에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 유효량은 의사의 일상적인 시험 및 실험을 통해 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위(예를 들어, "투여량" 범위)에 속한다. 따라서, 이러한 용어는 본 개시를 특정 양, 예를 들어, RNA의 증량 또는 수로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 유효량은 단일 용량으로 또는 치료 기간에 걸쳐 1회 또는 수회 반복 용량으로 투여될 수 있다.
"치료학적 유효량"은 특정 질환 또는 병태의 측정 가능한 개선에 영향을 미치는 데 필요한 적어도 최소 농도이다. 본원에서 치료학적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 본 개시내용의 RNA가 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 RNA의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 큰 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방학적 유효량"이라는 용어는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애의 하나 이상의 검출 가능한 증상의 발병을 예방 또는 억제 또는 지연시키기에 충분한 양의 본 개시내용의 RNA를 의미하는 것으로 받아들여질 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 인간을 포함한 모든 동물, 예를 들어, 포유동물을 의미하는 것으로 받아들여질 것이다. 예시적인 대상체는 인간 및 비인간 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 대상체는 인간이다.
자가-복제 RNA
본 개시내용은 자가-복제 RNA(레플리콘으로도 알려져 있음)를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 모노시스트론 자가-복제 RNA를 제공한다.
당업자는 본 개시내용의 자가-복제 RNA가 RNA 바이러스의 게놈 RNA에 기초한다는 것을 이해할 것이다. RNA는 중간 복제 단계(예를 들어, 역전사) 없이 세포로 전달된 후 직접 번역될 수 있도록 양성(+) 가닥이어야 한다. RNA가 번역되면 비구조적 단백질(NSP)이 생성되고, 이 단백질이 결합하여 레플리카아제 복합체(즉, RNA 의존성 RNA 폴리머라제)를 형성한다. 이어서, 이 복합체는 본래의 RNA를 증폭하여 안티센스 및 센스 전사체를 모두 생성하고, 그 결과 이후에 번역되고 전사될 수 있는 다중 딸 RNA를 생성하여 전체 단백질 발현을 향상시킬 수 있다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 RNA 바이러스의 비구조적 단백질, 5' 및 3' 비번역 영역(UTR) 및 천연 서브게놈 프로모터를 포함한다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 RNA 바이러스의 하나 이상의 비구조적 단백질을 포함한다. 예를 들어, RNA는 바이러스 레플리카아제(또는 바이러스 폴리머라제), 바이러스 프로테아제, 바이러스 헬리카아제 및 기타 비구조적 바이러스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 바이러스 레플리카아제(또는 바이러스 폴리머라제)를 포함한다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 RNA는 5' 비번역 영역(5'-UTR), 3' 비번역 영역(3'UTR) 및/또는 암호화 또는 번역 서열을 포함할 수도 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, RNA는 5' 캡 구조, 사슬 종결 뉴클레오티드, 스템 루프(예를 들어, 히스톤 스템 루프), 3' 테일링 서열(예를 들어, 폴리아데닐화 신호 또는 하나 이상의 폴리A 테일)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 자가-복제 RNA는 RNA 바이러스의 5'- 및 3'-말단 UTR을 포함한다. 5' 및 3' UTR이라는 용어는 또한 5' 및 3' 보존 서열 요소(CSE)라는 용어를 포함한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 한 예에서, 자가-복제 RNA는 5'-말단 및 3'-말단 CSE를 포함한다.
본 개시내용의 자가-복제 RNA는 감염성 바이러스 입자의 생성을 유도할 수 없다. 예를 들어, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 바이러스 입자의 생산에 필요한 구조적 단백질을 암호화하는 바이러스 유전자를 포함하지 않는다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 알파바이러스로부터 유래되거나 이를 기반으로 한다. 적합한 알파바이러스는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재될 것이다.
또 다른 예에서, 자가-복제 RNA는 알파 바이러스 이외의 바이러스, 예를 들어, 양성-가닥 RNA 바이러스로부터 유래되거나 이에 기반한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 양성-가닥 RNA 바이러스는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 피코르나바이러스, 플라비바이러스, 루비바이러스, 페스티바이러스, 헤파시바이러스, 칼리시바이러스 또는 코로나바이러스를 포함한다.
알파바이러스
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 알파바이러스로부터 유래된다(또는 이에 기반한다).
알파바이러스는 토가바이러스과(Togaviridae) 계열에 속하는 유일한 속이며, 양성-센스 단일-가닥 RNA 게놈을 가진 외피 바이러스이다. 당업자는 알파바이러스 게놈이 비구조적 및 구조적 2개의 개방 판독 프레임(ORF)을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 제1 ORF는 바이러스 RNA의 전사 및 복제에 필요한 4개의 비구조적 단백질(NSP1, NSP2, NSP3 및 NSP4)을 암호화한다. 제2 ORF는 핵심 뉴클레오캡시드 단백질 C와 헤테로이량체로 연결되는 외피 단백질 P62 및 E1의 3개의 구조적 단백질을 암호화한다. 바이러스 막에 고정된 표면 당단백질은 막 융합을 통해 수용체 인식 및 표적 세포로의 진입을 담당한다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 바이러스 레플리카아제(또는 바이러스 폴리머라제)를 포함한다. 예를 들어, 바이러스 레플리카아제는 알파바이러스 레플리카아제, 예컨대 알파바이러스 단백질 NSP4이다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 하나 이상의 알파바이러스 구조적 단백질(예를 들어, 캡시드 및/또는 외피 당단백질)을 암호화하지 않는다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 RNA-함유 알파바이러스 비리온(즉, 감염성 바이러스 입자)을 생성할 수 없다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 천연 알파바이러스 SG 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 천연 알파바이러스 SG 프로모터는 최소 SG 프로모터(즉, 전사 개시에 필요한 최소 서열)이며 서열번호 9에 제시된 서열을 포함한다.
당업자는 본 개시내용에 사용하기에 적합한 알파바이러스를 알고 있을 것이다. 예시적인 알파바이러스는 베네수엘라 말뇌염 바이러스(VEE; 예를 들어, 트리니다드 당나귀, TC83CR), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 신드비스 바이러스(SIN), 로스 리버 바이러스, 서부 말뇌염 바이러스, 동부 말뇌염 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, S.A. AR86 바이러스, 에버글레이즈 바이러스, 무캄보 바이러스, 바마 포레스트 바이러스, 미델버그 바이러스, 픽수나 바이러스, 오니옹-니옹 바이러스(O'nyong-nyong virus), 게타 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 우나 바이러스, 아우라 바이러스, 와타로아 바이러스, 반반키 바이러스, 키질라가치 바이러스, 하이랜드 J 바이러스, 포트 모건 바이러스, 엔두무 바이러스(Ndumu virus), 및 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 알파바이러스는 또한 하나 초과의 알파바이러스로부터의 게놈 서열을 함유하는 키메라 알파바이러스(예를 들어, 문헌[Perri 등, (2003) J. Virol. 77(19): 10394-403]에 기재되어 있음)를 포함할 수 있다.
서브게놈 프로모터
본 개시내용은 SG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 자가-복제 RNA를 제공한다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 SG 프로모터('접합 영역' 프로모터로도 알려져 있음)는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
한 예에서, SG 프로모터는 알파바이러스 SG 프로모터로부터 유래되거나 이를 기반으로 한다. 예를 들어, SG 프로모터는 천연 알파바이러스 SG 프로모터이다. 한 예에서, 천연 SG 프로모터는 최소 SG 프로모터이다. 예를 들어, 최소 SG 프로모터는 전사 개시에 필요한 최소 서열이다.
5' 비번역 영역(5'UTR)
한 예에서, 자가-복제 RNA는 RNA 바이러스의 5'-UTR을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "5'-비번역 영역" 또는 "5'-UTR"은 번역 개시 서열(AUG)의 5' 말단에 위치한 mRNA의 비암호화 영역을 의미한다.
한 예에서, 5'UTR은 베네수엘라 말뇌염 바이러스(VEEV) 또는 이의 변형된 형태의 5'UTR이다. 예를 들어, 5'UTR은 서열번호 29에 제시된 서열을 포함한다.
한 예에서, 5'UTR은 적어도 하나의 마이크로RNA 결합 부위, AU 풍부 요소(ARE), GC-풍부 요소, 스템 루프, 및 이들의 조합을 포함한다.
마이크로RNA 결합 부위
본원에 사용된 바와 같이, "마이크로RNA 결합 부위"라는 용어는 마이크로RNA(miRNA)와 상호작용, 회합 또는 결합하기 위해 miRNA의 전체 또는 하나의 영역에 대해 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 내의(예를 들어, DNA 또는 RNA 전사체 내의) 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"라는 용어는 폴리뉴클레오티드의 5'-UTR에 결합하고 유전자 발현을 하향 조절하는(예를 들어, 번역을 억제함으로써) 19-25개 뉴클레오티드 길이의 비암호화 RNA를 지칭한다. 본 개시내용의 5'UTR에서 마이크로RNA 결합 부위(들)의 존재는 5'-UTR의 번역을 억제하는 기능을 할 수 있다.
본 개시내용에서 사용하기에 적합한 miRNA 결합 부위는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
한 예에서, miRNA 결합 부위는 조직 특이적 마이크로RNA 또는 생물학적 과정을 조절하는 것에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 간(miR-122), 근육(miR-133, miR-206, miR-208), 내피 세포(miR-17-92, miR-126), 골수 세포(miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), 지방 조직(let-7, miR-30c), 심장(miR-id, miR-149), 신장(miR-192), miR-194, miR-204) 및 폐 상피 세포(let-7, miR-133, miR-126)의 miRNA. 예를 들어, 혈관신생과 같은 생물학적 과정을 조절하는 마이크로RNA(miR-132). 추가로 예시적인 miRNA 및 miRNA 결합 부위는 미국 특허 출원 US14/043,927에 개시되어 있다.
AU 풍부 요소(ARE)
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "AU 풍부 요소(ARE)" 또는 "AU 풍부 요소들(AREs)"은 아데노신(A) 및 우리딘(U)의 스트레치를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭한다. 예시적인 ARE에는, 예를 들어, 세포질 myc(c-myc), 근아세포 결정 단백질 1(myoD), c-Jun, 미오게닌, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 또는 이들의 조합으로부터의 ARE가 포함된다.
한 예에서, ARE는 인간 항원 R 또는 "HuR"(Elavl1로도 알려져 있음) 특이적 결합 부위를 포함한다. HuR은 mRNA의 안정성을 증가시키는 ARE에 결합하는 것으로 알려져 있다.
GC-풍부 요소
본원에 사용된 바와 같이, "GC-풍부 요소"라는 용어는 아데닌(A) 및 티민(T)/우라실(U)에 비해 구아닌(G) 및/또는 시토신(C)의 양이 많은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)에 GC-풍부 요소가 존재하면 mRNA를 안정화할 수 있다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 16, 또는 17, 또는 18, 또는 19, 또는 20, 또는 21, 또는 22, 또는 23, 또는 24, 또는 25, 또는 26, 또는 27, 또는 28, 또는 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함한다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 30%와 40% 사이, 또는 40%와 50% 사이, 또는 50%와 60% 사이, 또는 60%와 70% 사이의 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 30%와 40% 사이의 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 40%와 50% 사이의 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 50%와 60% 사이의 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 60%와 70% 사이의 시토신을 포함한다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70% 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 30% 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 40% 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 50% 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 60% 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 60% 시토신을 포함한다. 예를 들어, GC-풍부 요소는 70% 시토신을 포함한다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 적어도 50% 시토신이다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 적어도 60% 시토신이다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 적어도 70% 시토신이다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 뉴클레오티드 서열 CCCCGGCGCC를 포함한다. 또 다른 예에서, GC-풍부 요소는 뉴클레오티드 서열 CCCCGGC를 포함한다. 추가 예에서, GC-풍부 요소는 뉴클레오티드 서열 GCGCCCCGCGGCGCCCCGCG를 포함한다.
한 예에서, GC-풍부 요소는 서열번호 31 내지 33에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 예에서, GC-풍부 요소는 서열번호 31에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GC-풍부 요소는 서열번호 32에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가 예에서, GC-풍부 요소는 서열번호 33에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다
스템 루프
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스템 루프"는 스템-루프를 형성하기 위해 이웃한 2개의 전체적 또는 부분적 역 상보적 서열의 분자내 염기 쌍을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 스템-루프는 단일-가닥 DNA 또는, 보다 일반적으로, RNA에서 발생할 수 있다. 스템 루프는 또한 일반적으로 연속 서열 내에서 스템과 말단 루프로 이루어진 헤어핀 또는 헤어핀 루프로 지칭할 수 있으며, 여기서 스템은 루프를 스템-루프 구조로 구축하는 짧은 서열에 의해 분리된 2개의 이웃하는 전체적 또는 부분적 역 상보적 서열에 의해 형성된다.
쌍을 이룬 스템 루프의 안정성은 길이, 포함된 불일치 또는 돌출의 수, 쌍을 이룬 영역의 뉴클레오티드 구성에 의해 결정된다.
한 예에서, 스템 루프의 루프는 길이가 3개와 10개 사이의 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 스템 루프의 루프는 3개와 8개 사이, 3개와 7 사이, 3개와 6 사이, 또는 4개와 5개 사이의 뉴클레오티드 길이다.
한 예에서, 스템 루프의 루프는 4개 뉴클레오티드 길이이다.
한 예에서, 스템 루프는 히스톤 스템 루프이다. 예를 들어, 히스톤 스템 루프는 서열번호 34에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
코작 컨센서스 서열
본원에 사용된 바와 같이, "코작 컨센서스 서열"이라는 용어는 리보솜에 의해 인식되는 시작 코돈(번역 개시 코돈으로도 지칭됨)을 함유함으로써 유전자의 번역을 용이하게 하는 진핵 유전자에서 확인된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
예시적인 코작 컨센서스 서열은 당업계에 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 한 예에서, 코작 컨센서스 서열은 서열번호 35에 제시되어 있다. 또 다른 예에서, 코작 컨센서스 서열은 서열번호 36에 제시되어 있다. 한 예에서, 코작 컨센서스 서열은 ACCATGG이다. 또 다른 예에서, 코작 컨센서스 서열은 ACCATG이다.
3'비번역 영역(3'-UTR)
한 예에서, 자가-복제 RNA는 RNA 바이러스의 3'-UTR을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "3'-UTR"이라는 용어는 번역 종결 코돈(즉, 정지 코돈)의 3'말단에 위치한 mRNA의 영역을 지칭한다.
한 예에서, 3'UTR은 신드비스 바이러스(SINV) 또는 이의 변형된 형태의 3'UTR이다. 예를 들어, 3'UTR은 서열번호 30에 제시된 서열을 포함한다.
한 예에서, 본 개시내용의 3'-UTR은 적어도 하나의 마이크로RNA 결합 부위, AU 풍부 요소(ARE), GC-풍부 요소, 삼중 나선, 스템 루프, 하나 이상의 정지 코돈 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
정지 코돈
본원에 사용된 바와 같이, "정지 코돈"이라는 용어는 리보솜에 의한 단백질 합성의 중지 신호를 보내는 mRNA 내의 트리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
한 예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 3'-UTR의 5'말단에서 적어도 하나의 정지 코돈을 포함한다. 예를 들어, 정지 코돈은 UAG, UAA 및 UGA로부터 선택된다.
한 예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 UGAUGA를 포함하는 2개의 연속적인 정지 코돈을 포함한다.
한 예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 UAAUAG를 포함하는 2개의 연속적인 정지 코돈을 포함한다.
3' 테일링 서열
본 개시내용의 RNA는 3'UTR의 3'말단에 위치한 하나 이상의 3' 테일링 서열을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, "3' 테일링 서열" 또는 "3' 테일링 서열들"이라는 용어는 mRNA의 3' 말단에 암호화되지 않은 뉴클레오티드의 추가를 유도하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리아데닐화 신호) 또는 mRNA의 3' 말단에 위치한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리-A 서열)을 지칭한다. 당업자는 mRNA에서 3'테일링 서열 및/또는 3' 테일링 서열의 생성물이 mRNA를 안정화시키고/시키거나 mRNA의 분해를 방지하는 기능을 한다는 것을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 폴리-A 또는 폴리-C 서열과 관련하여 "중단 링커"라는 용어는 폴리-A 또는 폴리-C 서열에서 연속적인 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드의 스트레치에 연결되고 중단되는 단일 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 폴리-A 서열에서 중단 링커는 단일 뉴클레오티드, 또는 아데노신 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 폴리-C 서열에서 중단 링커는 단일 뉴클레오티드, 또는 시토신 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
한 예에서, 하나 이상의 3' 테일링 서열은 폴리-A 서열, 폴리아데닐화 신호, G-사중체, 폴리-C 서열, 스템 루프 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
폴리-A 서열
본원에 사용된 바와 같이, "폴리A 서열"이라는 용어는 mRNA의 3'말단에 위치한 아데닌(A)의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락에서, 폴리A 서열은 mRNA 또는 DNA(예를 들어, 벡터의 전사에 의해 mRNA를 생성하기 위한 주형 역할을 하는 DNA 플라스미드) 내에 위치할 수 있다.
본 개시내용에서 사용하기에 적합한 폴리-A 서열은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 한 예에서, 폴리-A 서열은 임의의 길이(예를 들어, 10 내지 300개)의 연속적인(즉, 차례로) 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 폴리-A 서열은 36개의 연속적인 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 한 예에서, 폴리-A 서열은 서열번호 37에 제시된 서열을 포함한다.
한 예에서, 폴리-A 서열은 하나 이상의 중단 링커에 의해 분리된 연속적인 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 한 예에서, 폴리-A 서열은 중단 링커 없이 연속적인 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리아데닐화 신호
본원에 사용된 바와 같이, "폴리아데닐화 신호"라는 용어는 폴리아데닐화를 유도하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화는 전형적으로 RNA에(예를 들어, 성숙한 mRNA를 생성하기 위한 미성숙 mRNA에) 폴리A 서열을 부가하는 것으로 이해된다. 폴리아데닐화 신호는 폴리아데닐화될 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 3'-말단에서 뉴클레오티드 서열 내에 위치할 수 있다.
본 개시내용에서 사용하기에 적합한 폴리아데닐화 신호는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
한 예에서, 폴리아데닐화 신호는 아데닌 및 우라실/티미딘 뉴클레오티드로 이루어진 헥사머를 포함한다. 한 예에서, 헥사머 서열은 AAUAAA를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 예에서, 3'테일링 서열은 폴리아데닐화 신호를 포함하지만 폴리A 서열은 포함하지 않는다.
G-사중체
본원에 사용된 바와 같이, "G-사중체" 또는 "G4"라는 용어는 4개의 가닥 2차 구조를 형성하는 구아닌 잔기가 풍부한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, G-사중체는 DNA와 RNA 둘 모두에서 G가 풍부한 서열에 의해 형성된 4개의 구아닌 뉴클레오티드의 사이클릭 수소 결합 배열이다.
한 예에서, 3' 테일링 서열은 폴리A 서열 및 G-사중체를 포함한다. 예를 들어, 3' 테일링 서열은 G-사중체에 연결된 폴리A 서열을 포함하여 폴리A-G 사중체(quartet)를 생성한다.
폴리-C 서열
본원에 사용된 바와 같이, "폴리-C 서열"이라는 용어는 mRNA의 3' 말단에 위치한 시토신(C)의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락에서, 폴리C 서열은 mRNA 또는 DNA(예를 들어, 벡터의 전사에 의해 mRNA를 생성하기 위한 주형 역할을 하는 DNA 플라스미드) 내에 위치할 수 있다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 폴리-C 서열은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
한 예에서, 하나 이상의 3' 테일링 서열은 각각 10개와 300개 사이의 연속적인 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리-C 서열을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리-C 서열은 각각 10개와 20개 사이, 또는 20개와 30개 사이, 또는 30개와 40개 사이, 또는 40개와 50 사이, 또는 50개와 60개 사이, 또는 60개와 70개 사이, 또는 70개와 80개 사이, 또는 80개와 90개 사이, 또는 90개와 100개 사이, 또는 100개와 125개 사이, 또는 125개와 150개 사이, 또는 150개와 175개 사이, 또는 175개와 200개 사이, 또는 200개와 225개 사이, 또는 225개와 250개 사이, 또는 250개와 275개 사이, 또는 275개와 300개 사이의 연속적인 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리-C 서열은 각각 10, 또는 20, 또는 30, 또는 40, 또는 50, 또는 60, 또는 70, 또는 80, 또는 90, 또는 100, 또는 125, 또는 150, 또는 175, 또는 200, 또는 225, 또는 250, 또는 275, 또는 300개의 연속적인 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
한 예에서, 하나 이상의 폴리-C 서열은 중단 링커에 의해 분리된다. 예를 들어, 하나 이상의 3'테일링 서열을 포함하는 제4 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3'의 순서로 연속적인 시토신 뉴클레오티드, 중단 링커, 및 추가의 연속적인 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
한 예에서, 중단 링커는 10 내지 50, 또는 50 내지 100, 또는 100 내지 150개 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 중단 링커는 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10, 또는 11, 또는 12, 또는 13, 또는 14, 또는 15, 또는 16, 또는 17, 또는 18, 또는 19, 또는 20, 또는 25, 또는 30, 또는 35, 또는 40, 또는 45, 또는 50, 또는 55, 또는 60, 또는 65, 또는 70, 또는 75, 또는 80, 또는 85, 또는 90, 또는 95, 또는 100, 또는 110, 또는 120, 또는 130, 또는 140, 또는 150개 뉴클레오티드 길이이다.
5'캡
한 예에서, 자가-복제 RNA는 5'말단 캡 구조를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "5'캡 구조"라는 용어는 핵 이송에 관여하는 mRNA의 5'말단에 있는 구조로, mRNA 캡 결합 단백질(CBP)과 결합하는 구조를 지칭한다. 5'캡 구조는 CBP와 폴리(A) 결합 단백질의 결합을 통해 mRNA를 안정화시켜 성숙한 mRNA를 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 개시내용의 mRNA에 5'캡 구조가 존재하면 5'캡이 없는 mRNA에 비해 mRNA의 안정성을 더 증가시킬 수 있다.
예시적인 5'캡 구조는, 예를 들어, 역방향 캡 유사체(ARCA), N7,2'-0-디메틸-구아노신(mCAP), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 2-아지도-구아노신, 6,2'-O-디메틸아데노신, 7-메틸구아노신(m7G), ap1, 및 ap2를 포함한다.
전형적으로, 내인성 mRNA는 mRNA의 5'말단 뉴클레오티드에 부착된 (5)'-ppp-(5)'-트리포스페이트 연결을 통해 구아노신으로 5'캡핑된다. 이어서, 구아노신 캡은 7mG(5')ppp(5')N,pN2p(Cap0 구조)를 생성하는 7-메틸구아노신(m7G)으로 메틸화될 수 있으며, 여기서 N은 mRNA의 제1 및 제2 5'말단 뉴클레오티드를 나타낸다. cap0 구조는 추가로 2'-O-메틸화되어 7mG(5')ppp(5')NlmpNp(Cap1) 및/또는 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp(Cap2)를 생성할 수 있다.
한 예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 내인성 캡을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "내인성 캡"이라는 용어는 세포에서 합성되는 5'캡을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 캡은 천연 5'캡 또는 야생형 5'캡이다. 예를 들어, 내인성 캡은 Cap0, Cap1 또는 Cap2 구조이다.
한 예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 내인성 캡의 유사체(캡 유사체로도 지칭됨)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 내인성 캡 또는 "캡 유사체"와 관련하여 용어 "이의 유사체"는 합성 5'캡을 지칭한다. 캡 유사체는 시험관내 전사 반응에서 5'캡핑된 mRNA를 생성하는 데 사용될 수 있다. 캡 유사체는 화학적으로(즉, 비-효소적으로) 또는 효소적으로 합성 및/또는 뉴클레오티드(예를 들어, mRNA의 5'말단 뉴클레오티드)에 연결될 수 있다. 예시적인 캡 유사체는 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어 3"-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, G(5')ppp(5')A, G(5')ppp( 5')G, m7G(5')ppp(5')A, m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs)를 포함한다. 한 예에서, 캡 유사체는 N7,3'-O-디메틸-구아노신-5'-트리포스페이트-5'-구아노신(즉, 역방향 캡 유사체(ARCA))이다.
한 예에서, 5'캡 구조는 비가수분해성 캡 구조이다. 비가수분해성 캡 구조는 mRNA의 탈캡핑을 방지하고 mRNA의 반감기를 증가시킬 수 있다.
한 예에서, 비가수분해성 캡 구조는 α-티오-구아노신 뉴클레오티드, α-메틸-포스포네이트, 셀레노-포스페이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 한 예에서, 변형된 뉴클레오티드는 α-포스포로티아이트 연결을 통해 mRNA의 5'말단에 연결된다. 변형된 뉴클레오티드를 mRNA의 5'말단에 연결하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소(New England Biolabs)를 사용한다.
항원
본 개시내용의 자가-복제 RNA는 항원(예를 들어, 병원성 항원)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 항원은 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다.
한 예에서, 본 개시내용의 자가-복제 RNA는 SARS-CoV-2로부터의 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
생성 방법
본 개시내용의 자가-복제 RNA의 생성을 위한 적합한 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
한 예에서, 자가-복제 RNA는 플라스미드 DNA를 사용하여 생성된다. 당업자는 플라스미드 DNA가 비교적 안정하다는 것을 이해할 것이다. 간략하게, 컴피턴트 박테리아 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)) 세포는 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 암호화하는 DNA 플라스미드로 형질전환된다. 개별 박테리아 콜로니를 단리하고 생성된 플라스미드 DNA를 이. 콜리 배양물에서 증폭한다.
한 예에서, 플라스미드 DNA는 발효 후 단리된다. 예를 들어, 플라스미드 DNA는 상업적으로 이용 가능한 키트(예를 들어, Maxiprep DNA 키트) 또는 당업자에게 알려진 다른 일상적인 방법을 사용하여 단리된다. 단리 후, 플라스미드 DNA는 제한 분해(즉, 제한 효소 사용)에 의해 선형화된다. 예를 들어, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 포함하는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 제한 효소를 제거한다.
한 예에서, mRNA는 RNA 폴리머라제(예를 들어, T7 RNA 폴리머라제)를 사용하여 선형화된 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 만들어진다. 시험관 내 전사 후, DNA 주형은 DNase 분해에 의해 제거된다. 당업자는 합성 mRNA 캡핑이 mRNA 프로세싱을 교정하고 mRNA의 안정화에 기여하기 위해 수행된다는 것을 이해할 것이다. 한 예에서, mRNA는 효소적으로 5'-캡핑된다. 예를 들어, 5' 캡은 cap0 구조 또는 cap1 구조이다. 한 예에서, 5' 캡은 cap0 구조이며, 예를 들어, 5'-캡(즉, cap0)은 5'-5' 트리포스페이트 브릿지를 통해 mRNA의 나머지 부분에 연결된 역전된 7-메틸구아노신으로 이루어진다. 한 예에서, 5' 캡은 cap1 구조이고, 예를 들어, 5'-캡(즉, cap1)은 개시 뉴클레오티드의 2'O 위치의 추가적인 메틸화를 갖는 cap0으로 이루어진다.
한 예에서, mRNA는 정제된다. mRNA를 정제하기 위한 다양한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, mRNA는 염화리튬(LiCl) 침전을 사용하여 정제된다. 또 다른 예에서, mRNA는 접선 흐름 여과(TFF)를 사용하여 정제된다. 정제 후, mRNA는, 예를 들어, 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁된다.
조성물
본 개시내용은 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 자가-복제 RNA가 네이키드 RNA로서 또는 지질, 중합체 또는 세포 내로의 진입을 용이하게 하는 다른 전달 시스템과 조합하여 존재할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
전달 시스템
한 예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 LNP, 중합체성 미립자 및 수중유 에멀젼을 추가로 포함한다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 LNP, 중합체성 미립자, 또는 수중유 에멀젼에 캡슐화되거나, 결합되거나, 흡착된다.
지질 나노입자
한 예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 LNP를 추가로 포함한다.
"지질 나노입자"라는 용어는 비수성 코어 및 고체 지질 나노입자(여기서, 고체 지질 나노입자는 지질 이중층이 결여되어 있다)를 갖는 양친매성 지질 이중층(예를 들어, 단일; 단층 또는 다중; 다층) 미셀-유사 지질 나노입자에 의해 수성 부피가 캡슐화되는 리포좀 또는 소포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 지질 조성물을 지칭하는 것이 명백할 것이다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 지질 나노입자는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 지질은 음이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성 친수성 헤드 그룹을 가질 수 있다.
한 예에서, 지질 나노입자는 PEG-지질, 스테롤 구조 지질 및/또는 중성 지질을 포함한다. 한 예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질을 추가로 포함한다. 한 예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질을 포함하지 않는다.
한 예에서, LNP는 PEG-지질을 포함한다. 예를 들어, PEG-지질은 PEG-c-DMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE 지질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, LNP는 구조적 지질을 포함한다. 예를 들어, 구조적 지질은 콜레스테롤 페코스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산 및 알파-토코페롤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, LNP는 중성 지질을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기 위한 예시적인 인지질(음이온성 또는 쯔비터이온성)은, 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜글리세롤을 포함한다. 예를 들어, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 리소 PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨 염(DOPG), 및 스핑고미엘린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 예시적인 양이온성 지질은 디올레오일 트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLenDMA), 2,5-비스((9z,12z)-옥타데카-9,12,디엔-1-일옥실)벤질-4-(디메틸아미노)부트노에이트(LKY750)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 예에서, 인지질은 2,5-비스((9z,12z)-옥타데카-9,12,디엔-1-일옥실)벤질-4-(디메틸아미노)부트노에이트(LKY750)이다. 예시적인 쯔비터이온성 지질은 아실 쯔비터이온성 지질 및 에테르 쯔비터이온성 지질, 예컨대 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC) 및 도데실포스포콜린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 지질은 포화되거나 불포화될 수 있다.
중합체성 미립자
한 예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 중합체성 미립자를 추가로 포함한다.
당업자는 다양한 중합체가 미립자를 형성하여 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 캡슐화하거나 흡착할 수 있음을 알 것이다. 실질적으로 무독성 중합체의 사용은 입자가 안전하다는 것을 의미하고 생분해성 중합체의 사용은 입자가 장기 지속성을 피하기 위해 전달 후 대사될 수 있음을 의미한다는 것이 명백할 것이다. 유용한 중합체는 또한 멸균이 가능하여 제약 등급의 제형을 제조하는데 도움이 된다.
예시적인 무독성 및 생분해성 중합체는 폴리(α-하이드록시산), 폴리하이드록시 부티르산, 폴리락톤(폴리카프로락톤 포함), 폴리디옥사논, 폴리발레로락톤, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리시아노아크릴레이트, 티로신-유래 폴리카보네이트, 폴리비닐-피롤리디논 또는 폴리에스테르-아미드, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
수중유 양이온성 에멀젼
한 예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 수중유 양이온성 에멀젼을 추가로 포함한다.
수중유 에멀젼에 사용하기에 적합한 오일은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 에멀젼은, 예를 들어, 동물(예: 어류) 또는 식물성 공급원(예를 들어, 견과류, 씨앗, 곡물)으로부터 유래된 하나 이상의 오일을 포함한다. 당업자는 생체적합성 및 생분해성 오일이 우선적으로 사용된다는 것을 인식할 것이다. 예시적인 동물성 오일(즉, 어유)은 대구 간유, 상어 간유 및 고래 기름을 포함한다. 예시적인 식물성 오일은 땅콩유, 코코넛유, 올리브유, 대두유, 호호바유, 잇꽃유, 면실유, 해바라기씨유, 참깨유, 옥수수유를 포함한다.
오일 이외에, 수중유 에멀젼은 또한 에멀젼의 형성 및 안정화를 용이하게 하는 양이온성 지질을 포함한다. 적합한 양이온성 지질은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 예시적인 양이온성 지질은 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP), 3'-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일] 콜레스테롤(DC 콜레스테롤), 디메틸디옥타데실암모늄(DDA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸-암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일[C16:0]트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP) 및 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 수중유 에멀젼은 또한 비이온성 계면활성제 및/또는 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다. 당업자는 본 개시내용에 사용하기에 적합한 계면활성제를 알고 있을 것이다. 예시적인 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80) 및 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO) 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용되는 담체
적합하게는, 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 대상체에게 투여하기 위한 조성물 또는 방법에서, 자가-복제 RNA는 당업계에서 이해되는 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된다. 따라서, 본 개시내용의 한 예는 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 개시내용의 자가-복제 RNA (및 임의의 전달 시스템)를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다.
일반적으로, "담체"는 임의의 대상체, 예를 들어, 인간에게 안전하게 투여될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 결합제, 희석제, 캡슐화 물질, 유화제, 습윤제, 용매, 현탁화제, 코팅 또는 윤활제를 의미한다. 특정 투여 경로에 따라, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)]에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 다양한 허용되는 담체가 사용될 수 있다.
본 개시내용의 자가-복제 RNA는 비경구, 국소, 경구 또는 국소 투여, 근육내 투여, 에어로졸 투여 또는 경피 투여에, 예방적 또는 치료적 치료를 위해 유용하다. 한 예에서, 자가-복제 RNA는 근육내, 피하 또는 정맥내와 같은 비경구적으로 투여된다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 근육 내로 투여된다.
투여될 자가-복제 RNA의 제형은 투여 경로 및 선택된 제형(예를 들어, 용액, 에멀젼, 캡슐)에 따라 달라질 것이다. 투여될 자가-복제 RNA를 포함하는 적절한 약제학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체에서 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀젼의 경우, 적합한 담체는, 예를 들어, 식염수 및 완충 매질을 포함한 수용액 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락트화된 링거 또는 고정 오일이 포함될 수 있다. 물, 완충수, 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로스 용액 및 글리신을 포함하는 다양한 적절한 수성 담체가 당업자에게 알려져 있다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 방부제 또는 유체, 영양분 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다(일반적으로, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980] 참조). 조성물은 pH 조절제 및 완충제 및 독성 조절제, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 락트산나트륨과 같은 대략적인 생리학적 조건에 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 선택적으로 함유할 수 있다. 자가-복제 RNA는 액체 단계에 저장될 수 있거나 저장을 위해 동결건조될 수 있고 당업계에 알려진 동결건조 및 재구성 기술에 따라 사용하기 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다.
선택된 매질에서 활성 성분(들)의 최적 농도는 당업자에게 알려진 절차에 따라 실험적으로 결정될 수 있으며 원하는 최종 약제학적 제형에 따라 달라질 것이다.
제형화 시, 본 개시내용의 조성물은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로 그리고 치료학적/예방학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 본 개시내용의 분자의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 예를 들어, 조성물은 유효량의 자가-복제 RNA를 포함한다. 한 예에서, 조성물은 치료학적 유효량의 자가-복제 RNA를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 예방학적 유효량의 자가-복제 RNA를 포함한다.
투여량은 불리한 부작용을 야기할 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 합병증이 발생할 경우 개별 의사가 투여량을 조정할 수 있다.
투여량은 하루 또는 며칠 동안 매일 1회 이상의 용량 투여에서 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 예를 들어, 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 예컨대 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 다양할 수 있다.
일부 예에서, 자가-복제 RNA는 후속(유지 용량)보다 높은 초기(또는 로딩) 용량으로 투여된다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 초기 용량으로 투여된다. 자가-복제 RNA는 약 0.0001 mg/kg과 약 10 mg/kg 사이의 유지 용량으로 투여된다. 유지 용량은 7-35일마다, 예컨대 7일 또는 14일 또는 28일마다 투여될 수 있다.
일부 예에서, 자가-복제 RNA가 초기에 후속 용량에서 사용되는 것보다 더 낮은 용량으로 투여되는 용량 증량 용법이 사용된다. 이 투약 용법은 대상체가 초기에 부작용을 겪는 경우에 유용하다.
치료에 적절히 반응하지 않는 대상체의 경우, 1주일에 다중 용량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
대상체는 결합 단백질의 적어도 약 2회 노출, 예를 들어 약 2 내지 60회 노출, 보다 구체적으로는 약 2 내지 40회 노출, 가장 구체적으로는 약 2 내지 20회 노출과 같은 1회 초과의 노출 또는 일련의 용량을 제공함으로써 자가-복제 RNA로 재치료될 수 있다.
한 예에서, 대상체는 0일차에 자가-복제 RNA의 제1 용량으로 치료를 받고 21일차에 자가-복제 RNA의 제2 용량으로 치료를 받는다. 예를 들어, 제1 및 제2 용량은 21일(또는 3주) 간격으로 투여된다.
또 다른 예에서, 대상체는 0일차에 자가-복제 RNA의 제1 용량으로 치료를 받고 28일차에 자가-복제 RNA의 제2 용량으로 치료를 받는다. 예를 들어, 제1 및 제2 용량은 28일(또는 4주) 간격으로 투여된다.
한 예에서, 질환의 징후 또는 증상이 재발할 때 임의의 재치료를 받을 수 있다.
또 다른 예에서, 임의의 재치료는 정의된 간격으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 후속 노출은, 예를 들어, 약 24-28주 또는 48-56주 또는 그 이상과 같은 다양한 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 노출은 각각 약 24-26주 또는 약 38-42주 또는 약 50-54주 간격으로 투여된다.
치료에 적절히 반응하지 않는 대상체의 경우, 1주일에 다중 용량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, 부작용을 경험한 대상체의 경우, 초기(또는 로딩) 용량을 1주일에 여러 날에 걸쳐 또는 연속하는 여러 날에 걸쳐 분할할 수 있다.
본 개시내용의 방법에 따른 자가-복제 RNA의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료인지 예방인지 여부, 및 숙련된 실무자에게 알려진 기타 인자에 따라, 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 자가-복제 RNA의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 일련의 간격을 둔 용량으로, 예를 들어, 병태의 발생 동안 또는 후에 투여될 수 있다.
스크리닝 검정
본 개시내용의 자가-복제 RNA를 선택하기 위한 적합한 방법은 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 혈청학 및 면역 반응을 포함하는 RNA의 효율 및 효능을 평가하기 위해 검정을 수행할 수 있다.
항원 발현
한 예에서, 자가-복제 RNA는 관심 유전자의 발현에 대해 평가된다.
예를 들어, 항원 발현은 관심 유전자에 대한 항체를 사용하여 검출된다. 한 예에서, 항원 발현에 양성인 세포의 수는, 예를 들어, 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 통해 측정된다. 또 다른 예에서, 평균 형광 강도(MFI)는, 예를 들어, FACS를 사용하여 결정된다. 추가 예에서, 특정 역가 값 또는 RNA 단위 질량당 성공적인 형질감염 확률이 계산된다.
미세중화 검정
한 예에서, 자가-복제 RNA(네이키드 및/또는 제형화)는 항체 반응에 대해 평가된다. 예를 들어, 자가-복제 RNA는 미세중화 검정을 사용하여 평가된다. 미세중화 검정을 수행하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 한 예에서, 미세중화 검정은 약식 검정이다. 한 예의 경우, 바이러스 형광 초점 기반 미세중화 검정이 수행된다. 또 다른 예에서, 미세중화 검정은 긴 형태의 검정이다.
항원 특이적 T 세포 반응
한 예에서, 자가-복제 RNA는 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하는 능력에 대해 평가된다. 항원 특이적 T 세포 반응의 유도를 평가하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
예를 들어, 항원-특이적 T 세포 검출은 비장 배양에서 수행된다. 간단히 말해, 비장 세포 배양은 T 세포 배지에서 확립되고 세포 배양은 항원성 펩타이드로 자극되거나 자극되지 않는다. 한 예에서, 항원-특이적 T 세포 반응은 유세포 분석법을 사용하여 결정된다.
중화 검정
본 개시내용의 자가-복제 RNA는 SARS-CoV-2 S 단백질 RBD에 결합하고 S 단백질 RBD와 ACE2의 결합을 중화시키는 능력에 대해 시험관내에서 스크리닝될 수 있다. 적합한 검정은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, Vero 미세중화 검정, sVNT 검정 또는 슈도바이러스 중화 검정(예를 들어, HEK-293T 세포 또는 HeLa-ACE2 세포 사용)을 포함한다.
한 예에서, 중화 검정은 Vero 미세중화 검정이다. 간단히 말해, SARS-Cov-2 야생형 바이러스는 Vero 세포(즉, 아프리카 녹색 원숭이로부터 추출된 신장 상피 세포에서 단리된 Vero 계통)에서 계대된다. 시험 단백질의 연속 2배 희석물을 SARS-CoV-2의 100 TCID50(즉, 중간 조직 배양 감염 용량)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고 Vero 세포에서 잔류 바이러스 감염성을 평가하며; 예를 들어 5일차에 바이러스 세포 병리 효과를 판독한다. 중화 항체 역가는 이전에 설명된 대로 Reed/Muench 방법을 사용하여 계산된다(Houser 등, 2016; Subbarao 등 2004).
한 예에서, 중화 검정은 대리 중화 시험(sVNT)이다. 간단히 말해, 플레이트의 웰을 탄산염-중탄산염 코팅 완충액(예를 들어, pH 9.6)에 hACE2 단백질로 코팅된다. 시험 단백질로 사전 인큐베이션된 HRP-접합 SARS-CoV-2 및 HRP-접합 SARS-CoV-RBD를 다양한 농도로 hACE2에 첨가하고, 예를 들어, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 결합되지 않은 HRP 접합 항원은 세척하여 제거한다. 비색 신호는 발색 기질, 예를 들어, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB))과 HRP의 효소 반응에 따라 발생한다. 한 예로, 450 nm 및 570 nm에서 흡광도 판독값이 획득된다.
한 예에서, 중화는 슈도바이러스 중화 검정이다. 간단히 말해, SARS-2 스파이크 단백질로 위형화된 HIV 리포터 바이러스는 SARS-2-COV-2 스파이크 플라스미드를 바이러스 백본 플라스미드(예를 들어, pDR-NL △env FLUC)와 함께 HEK-293T 세포에 형질감염시켜 생성한다. 슈도바이러스는 형질감염 후 수확되고 여과에 의해 정제된다. 상대 루시페라아제 단위 감염 용량(RLU: Relative Luciferase Units Infectious Dose)으로 보고된 바이러스 스톡 역가는 Hela-hACE2 세포에서 희석 감염을 제한하여 바이러스 감염에 대한 판독값으로 루시퍼라제 활성을 측정하여 계산된다.
치료 또는 예방 방법
본 개시내용은 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 백신으로서 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 질환 또는 병태는 SARS-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19)
본 개시내용은, 예를 들어, COVID-19를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 예를 들어, SARS-CoV-2 감염을 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 일부 예에서, 대상체는 SARS-CoV-2 감염을 갖지만 임상적으로 COVID-19 진단을 받지 않은 상태이다.
COVID-19는 SARS-CoV-2에 의해 야기된 감염병이다. 일반적인 증상으로는 열, 기침, 피로, 숨가쁨, 및 후각 및 미각 상실을 포함한다. 대부분의 경우 경미한 증상으로 끝나지만 일부는 ARDS로 진행된다. 노출 후 증상이 발병까지의 시간은 일반적으로 약 5일이지만, 2일에서 14일 사이일 수 있다. 현재 COVID-19에 대한 백신이나 특정 항바이러스 치료법은 없으며 관리에는 증상 치료, 지원 치료, 격리, 실험적 조치가 포함된다.
따라서, 일부 예에서, 대상체는 SARS-CoV-2에 감염되었다. 한 예에서, 대상체는 COVID-19, 예를 들어, 중증 COVID-19에 걸렸다. 특히, 중증 COVID-19는 종종 ARDS를 초래한다. 본 개시내용의 방법은 중증 COVID-19를 앓고 있는 대상체에서 ARDS를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 데 사용될 수 있다.
급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)
본 개시내용은, 예를 들어, 대상체에서 ARDS를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
ARDS는 양측 폐 침윤, 심각한 저산소혈증 및 폐포-모세혈관 막 장벽의 붕괴(즉, 폐혈관 누출)를 특징으로 하는 생명을 위협하는 상태로, 비심인성 폐부종을 유발한다. 현재 효과적인 약물 요법은 없다.
인플루엔자 및 코로나바이러스 감염을 포함한 감염성 병인이 ARDS의 주요 원인이다. 따라서, 본 개시내용의 한 예에서, ARDS는 코로나바이러스 감염과 관련이 있다. 예를 들어, SARS-COV 감염. 한 예에서, ARDS는 SARS-CoV-2 감염과 관련이 있다.
ARDS는 다음을 포함하는 베를린 정의(Berlin Definition)에 따라 분류된다:
(1) 임상적 상해 또는 호흡기 증상 발병 1주 이내에 발현;
(2) 적어도 5 cm의 지속 양압(CPAP) 또는 호기말 양압(PEEP)에서 PaO2/FiO2 비율이 300 mmHg 이하로 결정되는 급성 저산소혈증 호흡 부전으로서, 여기서 PaO2는 동맥혈 내 산소 분압이고 FiO2는 흡기 산소의 비율임;
(3) 삼출, 경화 또는 무기폐로 완전히 설명되지 않는 폐 방사선 사진의 양측 불투명도; 및
(4) 심부전 또는 유체 과부하로 완전히 설명되지 않는 부종/호흡 부전.
한 예에서, 대상체는 ARDS를 갖거나 앓고 있다(즉, 대상체는 ARDS의 베를린 정의를 충족함). 예를 들어, 대상체는 치료가 필요하다(즉, 치료를 필요로 함).
한 예에서, 대상체는 ARDS와 관련된 증상을 갖거나 앓고 있다. ARDS와 관련된 증상 및 ARDS가 발생할 위험이 있는 대상체를 식별하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 대상체는 다음 증상 중 하나 이상 또는 모두를 가지고 있다:
a) 분당 30회 초과의 호흡 빈도;
b) 실내 공기에서 93% 이하의 산소 포화도(SpO2);
c) 300 mmHg 미만의 흡기 산소 비율(PaO2/FiO2)에 대한 산소의 동맥 분압 비율;
d) 218 미만의 SpO2/FiO2 비율; 및
e) 50%를 초과하는 양의 방사선학적 폐 침윤.
현재 ARDS는 경증, 중등도 또는 중증으로 분류되며 사망률 증가와 관련이 있디. ARDS의 중증도는 베를린 정의에 따라 다음과 같이 분류할 수 있다:
(i) 경증 ARDS: 적어도 5 cm CPAP 또는 PEEP에서 200-300 mmHg의 PaO2/FiO2;
(ii) 중등 ARDS: 적어도 5 cm PEEP에서 100~200 mmHg의 PaO2/FiO2; 및
(iii) 중증 ARDS: 적어도 5 cm PEEP에서 100 mmHg 이하의 PaO2/FiO2.
한 예에서, ARDS는 경증 ARDS이다. 또 다른 예에서, ARDS는 중등 ARDS이다. 추가 예에서, ARDS는 중증 ARDS이다.
본 개시내용의 방법은 기존 ARDS의 치료 이외에 ARDS의 발병을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 예에서, 대상체는 ARDS를 갖지 않는다.
키트
본 개시내용의 또 다른 예는 상기 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키는데 유용한 본 개시내용의 자가-복제 RNA를 함유하는 키트를 제공한다.
한 예에서, 키트는 (a) 선택적으로 전달 시스템에서 자가-복제 RNA 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 용기; 및 (b) 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, COVID-19 또는 ARDS)를 치료 또는 예방하거나 그 진행을 지연시키기 위한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한다.
본 개시내용의 예에 따르면, 패키지 삽입물은 용기에 있거나 용기와 관련이 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 본 개시내용의 질환 또는 장애에 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 자가-복제 RNA이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 투여량과 치료 간격 및 제공되는 기타 약물에 관한 구체적인 지침과 함께, 조성물이 치료에 적합한 대상자, 예를 들어, 인플루엔자, 인플루엔자 바이러스 감염, SARS-CoV-2 감염, COVID-19 및/또는 ARDS에 걸렸거나 발병할 소인이 있는 대상체를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 키트는 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 희석 완충액을 포함하는 추가 용기를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용은 다음의 비제한적인 실시예를 포함한다.
실시예
실시예 1: 자가-복제 RNA의 생성
자가-복제 RNA를 암호화하는 DNA 주형은 DNA 플라스미드로 형질전환된 적격한 에스케리키아 콜리 세포에서 생성되었다. 개별 박테리아 콜로니를 단리하고 생성된 플라스미드 DNA를 이. 콜리 배양에서 증폭하였다. 발효 후, Maxiprep DNA 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하고 제한 분해로 선형화하였다. 이어서, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 사용하여 제한 효소를 제거하였다.
mRNA는 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 선형화된 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 만들어졌다. 그 후, DNA 주형은 DNase 분해에 의해 제거되었다. 기능적 mRNA를 제공하기 위해 Cap0로 효소적 캡핑을 수행하였다. 생성된 mRNA를 정제하고 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하였다.
SARS-CoV-2 균주 2019-nCoV/USA-WA1/2020으로부터 스파이크(S) 및 뉴클레오캡시드(N) 항원을 사용하여 자가-복제 RNA를 제조하였다. 다음 작제물을 제조하였다:
ㆍ NSP1-4.SGP.S (wt) (Co5)
ㆍ NSP1-4.SGP.N (wt) (Co6)
ㆍ NSP1-4.SGP.S (RRAR→QQAA) (Co16)
ㆍ NSP1-4.SGP.S (RRAR→QQAA 및 986P/987P) (Co17)
ㆍ NSP1-4.SGP.S (D614G) (Co48)
ㆍ NSP1-4.SGP.S (RRAR→QQAA 및 D614G) (Co49)
ㆍ NSP1-4.SGP.S (RRAR→QQAA 및 S2') (Co58)
ㆍ NSP1-4.SGP.S (RRAR→QQAA, S2' 및 D614G) (Co59)
실시예 2: 자가-복제 RNA의 시험관내 특성화
실시예 1에서 생성된 자가-복제 RNA는 관심 유전자의 발현에 대해 평가되었다.
제형화되지 않은(네이키드) 또는 LNP-제형화된 자가-증폭 mRNA 작제물의 2배 연속 희석액을 전기 천공하거나 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포주에 감염시켰다. 17-19시간 후, 세포를 수확하고 항-S 또는 항-N 항체를 사용하여 S 또는 N 항원 발현에 대해 염색하였다. 항원 발현에 양성인 세포의 수와 평균 형광 강도(MFI)를 FACS로 측정하였다. 데이터를 분석하여 특정 역가 값(RNA 질량 단위당 성공적인 형질감염 확률)을 계산하였다.
제형화되지 않은 RNA 및 LNP의 시험관내 활성 및 효능은 S 및 N 발현을 기반으로 FAC에 의해 결정되었으며 아래 표 1에 나타낸다:
표 1: 제형화되지 않은 RNA 및 LNP에 대한 시험관내 활성 및 효능
항체 반응
항체 반응을 평가하기 위해, 연구 종료 시(즉, 첫 번째 백신 투여 42일 후 또는 마지막 두 번째 백신 투여 21일 후) 혈청을 수집하고 미세중화 검정(표 2) 및 ACE2 결합(표 3)으로 시험하였다.
모든 혈청학적 검정에 대해 혈청을 수용체 파괴 효소(RDE)(Denka Seiken Co. Ltd., Tokyo, Japan)로도 알려진 비브리오 콜레라 뉴라미니다제(Vibrio cholerae neuraminidase)로 동일한 방식으로 처리하고 PBS로 1:10의 시작 희석액으로 희석하였다. H5N1 바이러스에 대한 양 혈청(FDA/CBER Kensington lot nu. H5-Ag-1115)을 양성 대조군 혈청 세 가지 검정으로서 사용하였다.
미세중화 검정
자체 개발한 프로토콜을 사용하여 바이러스 형광 초점 기반 미세중화(FFA MN) 검정을 수행하였다. RDE 처리된 시험 마우스 샘플과 양성 대조군 혈청을 열 비활성화하고 PBS로 1:40의 시작 희석액으로 희석하고, 중화 배지(최소 필수 배지 D-MEM(GIBCO)으로 구성, 1% BSA(Rockland, BSA-30), 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신(GIBCO)으로 보충됨)에서 U-Bottom 96웰 플레이트(BD Falcon)를 사용하여 4배 연속 희석하였다. 바이러스를 중화 배지에서 ~1,000-1,500 형광 초점-형성 유닛(FFU)/(20,000-30,000 FFU/mL)으로 희석하고 희석된 혈청에 1:1 비율로 첨가하였다.
37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, MDCK 33016-PF 세포를 함유하는 플레이트(Half Area 96 웰 플레이트, Corning)에 이 혼합물을 접종하고 37℃에서 5% CO2로 16-18시간 동안 밤새 인큐베이션하였다. MDCK 33016-PF 세포는 세포 성장 배지(D-MEM으로 구성, 10% HyClone 태아 소 혈청 - FBS(Gibco), 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신으로 보충됨)에서 6-8시간 일찍 3.0E4/웰(3.0E6/플레이트)로서 시딩되었다. 밤새 인큐베이션한 후, 면역염색 전에 세포를 아세톤과 메탄올의 차가운 혼합물로 고정시켰다.
스파이크(S) 단백질에 특이적인 단클론 항체와 0.05% tween-20(Sigma) 및 2% BSA(Fraction V, Calbiochem, 2960, 1194C175)를 함유한 PBS 완충액에 희석한 Alexa Fluor 488 염소 항 마우스 IgG(H+L) Ab(Invitrogen cat. no. A11001)를 실온에서 별도의 1시간 인큐베이션하여 바이러스를 시각화하였다. 여기 및 방출 파장이 482 및 536 nm인 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 플루오레세인 형광 필터 세트를 사용하여 CTL 면역스팟 분석기(Cellular Technology Limited, Shaker Heights, Cleveland, OH)로 S 단백질을 정량화하였다. 맞춤형 분석 모듈을 사용하여 소프트웨어 Immunospot 7.0.12.1 전문 분석기 DC를 사용하여 형광 초점을 열거하였다. 이 소프트웨어로 데이터를 Excel 데이터 분석 스프레드시트에 연속적으로 기록한 다음, 바이러스 대조군 웰의 평균 초점 수(각 플레이트에 대해)로부터 60% 초점 감소 종료점을 계산하고, 60% 초점 감소 중화 역가는 60% 종점(각 샘플에 대해) 바로 위 및 아래 웰 사이의 선형 보간에 의해 계산되었다.
표 2: 미세중화 검정
ACE2 결합 억제
ACE2 결합의 억제도 평가되었다. 결과는 표 3에 나타낸다.
표 3: ACE2 결합 억제
ACE2 결합의 억제는 또한 살아있는 바이러스 또는 세포를 사용할 필요 없이 중화 항체를 검출하는 대리 바이러스 중화 시험(sVNT)을 사용하여 평가하였다. 바이러스 스파이크(S) 단백질로부터의 수용체 결합 도메인(RBD) 단백질과 숙주 세포 수용체 ACE2를 사용하는 이 시험은 ELISA 플레이트 웰에서 직접적인 단백질-단백질 상호작용에 의해 바이러스-숙주 상호 작용을 모방하도록 설계되었다. 이어서, 고도로 특이적인 상호 작용은 중화되는데, 즉 기존 VNT에서와 동일한 방식으로 동물 혈청의 특정 NAb에 의해 차단된다.
결과는 표 3A에 나타낸다.
표 3A: ACE2 결합 억제
S 및 N 단백질 항체
N 단백질에 특이적인 항체도 ELISA로 평가하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. S 단백질에 특이적인 항체도 ELISA로 평가하였다. 결과는 표 5에 나타낸다.
표 4: N 단백질 항체
표 5: S 단백질 항체
슈도바이러스 중화
sVNT 검정 이외에, 슈도바이러스 중화 검정을 사용하여 중화 능력을 평가하였다. 슈도바이러스 검정은 세포로의 바이러스 진입을 방지하는 작제물의 능력을 입증하는 데 사용된다. 결과는 표 6에 나타낸다.
표 6: 슈도바이러스 중화
세포-매개 면역 반응
자가-복제 RNA Co5, Co6, Co16(S(QQAA)) 및 Co17(S(QQAA; PP)은 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하는 능력에 대해 평가되었다.
항원-특이적 T 세포 검출은 비장 배양에서 수행되었다. 간단히 말해, 비장 세포를 해리 용액(autoMACS 헹굼 용액을 포함하는 MACS BSA 스톡 1:20)에서 해리시키고 4E7 세포/ml로 농축시켰다. 간단히 말해, RPMI, NEAA, pen/스트렙토마이신 및 βME)를 포함하는 T 세포 배지에서 96웰 플레이트에 비장 세포 배양을 확립하고 37℃/5% CO2에서 배양하였다. 항-CD28(클론 37.51; BD Biosciences #553294) 및 항-CD107a(클론 #1D4B; Biolegend #121618)를 각 웰에 첨가하였다. 세포 배양은 자극되거나 자극되지 않았다. 배양을 자극하기 위해, N pep 믹스(CoV-2 전장 N 단백질의 아미노산 잔기 1-419에 걸쳐 있음), S pep 믹스 1(CoV-2 전장 S 단백질의 아미노산 잔기 1-643에 걸쳐 있음), S pep 믹스 2(CoV-2 전체 길이 S 단백질의 아미노산 잔기 633-1273에 걸쳐 있음), CoV-1 S 펩타이드(CYGVSATKL) 또는 CoV-2 S 펩타이드(CYGVSPTKL)가 추가되었다. 2시간의 자극 후, 골지 플러그(브레펠딘 A 포함; BD Biosciences #555029)를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 총 6시간 동안 인큐베이션한 후 세포를 4℃로 옮기고 밤새 보관하였다.
항원-특이적 T 세포 반응은 유세포 분석법을 사용하여 결정되었다. 간단히 말해, Fc 블록 혼합물(클론 2.4G2; BD Biosciences #553142)을 각 웰에 첨가한 후 세포외 염색하였다(Brilliant 염색 완충액 플러스 (BD Biosciences #566385), ICOS BV711(클론 C398.4A; Biolegend #313548), CD44 BUV395(클론 IM7; BD Biosciences #740215), CD3 BV786(클론 145-2C11; BD Biosciences #564379), CD4 APC-H7(클론 GK1.5, BD Biosciences #560181), CD8 AF700(클론 53-6.7, BD Biosciences #557959) 및 염색 완충액을 포함함). 제조업체의 프로토콜에 따라 UltraComp eBeads(eBiosciences #01-222-42)로 세포를 염색하고 빛으로부터 보호된 상태에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충액으로 세척하고, 원심분리하고, 염색 완충액에 재현탁하고 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집하였다.
항원 특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응은 N 및 S 작제물 둘 모두에서 관찰되었다. sa-mRNA 백신에 의해 유발된 CD4 T 세포는 대부분 Th0(IL2+ 및/또는 TNFa+, IFNg-, IL5-, IL13-) 및 Th1(IFNg+, IL5-, IL13-)이었고 Th2(IL5+ 및/또는 IL13+, IFNg-)는 거의 없거나 전혀 없었다(도 1). 유사한 빈도의 S1- 및 S2-반응성 CD4 T 세포가 발견되었다; 그러나, CD8 T 세포의 경우 S1-반응성 T 세포가 광범위한 사이토카인 표현형, 삼중, 이중 및 단일 사이토카인 생성 CD8+ T 세포를 가진 S2-반응성 T 세포보다 우세했다.
IgG 서브클래스
생성된 면역 반응의 유형, 즉 Th1 대 Th2 유형 반응을 특성화하기 위해, S 특이적 IgG1 및 IgG2a IgG 서브클래스를 ELISA로 평가하였다. IgG1과 IgG2a 반응 사이에 약간의 차이가 관찰되었다(표 7).
표 7: IgG 서브클래스
실시예 5: 자가-복제 RNA를 이용한 면역화의 보호 효과
면역화의 보호 효과를 평가하기 위해, 햄스터를 1일차와 22일차에 3 μg RNA/햄스터 또는 0.3 μg RNA/햄스터의 용량으로 Co16으로 면역화하였다. 모든 동물은 SARS-CoV-2 US 바이러스로 두 번째 면역화 후 28일에 비강 내로 감염되었고 4일 후에 폐 및 비갑개(nasal turbinate)에서 측정된 감염성 바이러스에 대해 폐 및 비갑개가 수집되었을 때 희생되었다.
햄스터에서 3.0 및 0.3 μg 용량은 중화 역가 GMT를 각각 394 및 270으로 높였다.
바이러스 감염으로부터 폐의 보호를 평가하기 위해, Co16으로 면역화된 햄스터와 PBS로 면역된 대조군 햄스터에 대해 폐로부터의 평균 바이러스 회복을 비교하였다. 대조군 햄스터로부터의 바이러스 역가는 5,011,872 TCID50/gr인 반면, 백신-면역 햄스터의 평균 바이러스 회수율은 검정 정량 한계 20 TCID50/gr 미만으로 이는 연구에 포함된 모든 백신으로 하기도의 완전한 보호를 입증하였다.
상기도의 보호를 평가하기 위해, 비갑개로부터의 바이러스 회복을 측정하였으며 대조군 햄스터로부터의 평균 바이러스 회수율은 120,226,443 TCID50/gr이다. 바이러스 역가는 각각 3.0 및 0.3 μg 용량의 Co16으로 면역화된 햄스터의 경우 1,995 및 9,120 TCID50/gr로 104 내지 105배 감소하였다. 이러한 결과는 sa-mRNA S가 상기도에서 바이러스 감염을 유의하게 감소시킨다는 것을 입증하였다.
실시예 6: SARS-CoV-2에 대한 자가-복제 RNA의 이중 투여
SARS-CoV-2 S 및 N 항원은 면역학적으로 교차 반응하지 않는다. 전임상 동물 모델에서 항체 면역 반응을 평가하기 위해, 암컷 BALB/c 마우스를 0일차에 1 μg 용량으로 면역화하고 21일차에 제2 용량으로 면역화하였다. 42일차에 동물을 희생시키고 혈청을 얻어 중화 항체뿐만 아니라 ACE2 수용체에 대한 S 단백질의 결합을 억제하는 항체를 시험하였다.
다음의 제1-제2 용량 조합을 평가하였다:
ㆍ PBS-Co6 (N)
ㆍ PBS-Co16 (S; RRAR→QQAA)
ㆍ Co6-Co6
ㆍ Co6-Co16
ㆍ Co6-PBS
ㆍ Co16-Co16
ㆍ Co16-Co6
ㆍ Co16-PBS
S 및 N 단백질 항체
S 및 N 단백질에 특이적인 항체를 42일차에 ELISA로 평가하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
표 8: 프라임-부스트 후 S 단백질 항체
동종 프라임/부스트는 항-S 반응과 관련하여 이종 프라임-부스트보다 더 효과적이었지만, 이종 프라임-부스트는 항-N 반응과 관련하여 동종 프라임-부스트보다 더 효과적이었다. 또한 S(즉, Co16)를 사용한 부스트는 PBS를 사용한 부스트에 비해 항-N 반응을 증가시킨다.
부스트의 부재 하에, 항-S 항체는 21일차부터 42일차까지 증가하였다(데이터는 나타내지 않음).
ACE2 결합 억제
ACE2 결합 억제 또한 평가하였다. 결과를 표 9에 나타낸다.
표 9: ACE2 결합 억제
미세중화 검정
WT 바이러스 중화 또한 평가하였다. 결과를 표 10에 나타낸다
표 10: WT 바이러스 중화
세포-매개 면역 반응
항원 특이적 T 세포 반응 또한 평가하였다. CD4 및 CD8 T 세포 반응은 동종 및 이종 항원 둘 모두로 백신접종한 후 관찰되었다.
실시예 6: 자가-복제 RNA 변이체의 생성
자가-복제 RNA는 SARS-CoV-2 변이체 균주, 즉 UK 알파 균주(B.1.1.7), 남아프리카 베타(B.1.351) 균주의 스파이크(S) 항원을 사용하여 제조하였다. 다음 작제물을 제조하였다:
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA) (Co16)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA 및 D614G) (Co49)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA, S2' (R815N) 및 D614G) (Co59)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA; △69-70; △Y144; N501Y; D614G) (Co77)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA; △242-244; K417N; E484K; N501Y; D614G) (Co78)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA; △69-70; △242-244; K417N; E484K; N501Y; D614G) (Co79)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA; △69-70; △Y144; N501Y; A570D; D614G; P680H; T716I) (Co80)
ㆍ NSP1-4.SGP.S(RRAR→QQAA; L18F; D80A; D215G; △242-244; K417N; E484K; N501Y; D614G; A701V) (Co81)
LNP 제형화된 RNA의 시험관내 활성 및 효능을 상기 기재된 바와 같이 결정하였고 하기 표 11에 나타낸다:
표 11: LNP에서 제형화된 RNA에 대한 시험관내 효능
표 12에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 시험관내 활성 및 효능을 갖는다.
표 12: 시험관내 효능 및 활성
중화 검정
작제물의 중화 능력을 결정하기 위해, 참조 후안 서열뿐만 아니라 알파 변이체(B.1.1.7; UK 균주); 베타 변이체(B.1.351; 남아프리카 균주); 감마 변이체(P.1; 브라질 균주); 및 델타 변이체(B.1.617.2; 인도 균주)에 대해 미세중화 검정을 수행하였다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 모든 균주에 대해 면역 반응을 생성하였다.
ACE2 결합 억제
ACE2 결합 억제 또한 평가하였다. 결과를 표 13에 나타낸다. 모든 작제물은 42일차에 ACE2 결합을 억제하였다.
표 13: ACE2 결합 억제
IgG ELISA
도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 고용량 및 저용량에서 총 Ig 반응을 생성하였다. 모든 작제물은 교차 반응성이 높은 반응을 생성하였다.
세포-매개 면역 반응
변이체 작제물에 의해 유도된 B 세포의 빈도를 특성화하였다.
도 4 및 표 14에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 모든 변이체 B-세포 수용체 특이적 프로브와 반응하는 S-특이적 B 세포를 생성하였다. 비특이적 대조군(즉, 베이트 없음 및 음성 대조군 HA H1)은 낮은 수준의 배경 결합을 나타냈다.
항원-특이적 T 세포 반응은 상기 기재된 바와 같이 유세포 분석법을 사용하여 결정하였다. 펩타이드 풀(상기 기재된 대로)은 변이체 균주가 아닌 원래 CoV-2 균주와 일치했다. 모든 작제물은 S1 및 S2 에피토프와 반응성인 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포를 유도하였다(도 5 및 표 14). CD4 T 세포는 대부분이 Th0(IL2+ 및/또는 TNFa+, IFNg-, IL5-, IL13-) 및 Th1(IFNg+, IL5-, IL13-)이었고 Th2(IL5+ 및/또는 IL13+, IFNg-)가 거의 없거나 전혀 없다.
표 15: 세포-매개 면역 반응

Claims (29)

  1. 자가-복제 RNA로서, 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 항원은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로부터 유래되는 것인, 자가-복제 RNA.
  2. 모노시스트론 자가-복제 RNA로서, 서브게놈 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 항원은 SARS-CoV-2로부터 유래되는 것인, 자가-복제 RNA.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항원은 스파이크(S) 단백질 또는 뉴클레오캡시드(N) 단백질인, 자가-복제 RNA.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 S 단백질은 서열번호 1에 제시된 서열에 의해 암호화되는, 자가-복제 RNA.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 S 단백질은 돌연변이체 S 단백질인, 자가-복제 RNA.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 돌연변이체 S 단백질은:
    (i) S1/S2 경계에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고, 서열번호 18의 뉴클레오티드 682-685에 상응하는 잔기에서 RRAR에서 QQAA로의 돌연변이를 포함하고/하거나;
    (ii) S2' 부위에서 푸린 절단 부위가 결여되어 있고/있거나;
    (iii) 서열번호 18의 뉴클레오티드 614에 상응하는 잔기에서 D에서 G로의 돌연변이를 포함하고/하거나;
    (iv) 서열번호 18의 뉴클레오티드 986 및 987에 상응하는 잔기 사이에 2개의 프롤린 잔기의 삽입을 포함하는, 자가-복제 RNA.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 2 내지 7 및/또는 서열번호 19-23 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 암호화되는, 자가-복제 RNA.
  8. 청구항 3에 있어서, 상기 N 단백질은 서열번호 8에 제시된 서열에 의해 암호화되는, 자가-복제 RNA.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SG 프로모터는 서열번호 9에 제시된 서열에 의해 암호화되는, 자가-복제 RNA.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가-복제 RNA는 알파바이러스로부터 유래되는, 자가-복제 RNA.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 알파바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스(SFV: Semliki Forest virus), 신드비스 바이러스(SIN: Sindbis virus), 및 베네수엘라 말뇌염 바이러스(VEE: Venezuelan equine encephalitis virus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 자가-복제 RNA.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 암호화되는, 자가-복제 RNA.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 자가-복제 RNA를 포함하는 면역원성 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 복수의 자기 복제 RNA를 포함하고, 각각의 자가-복제 RNA는 상이한 폴리펩타이드 항원 서열을 암호화하는, 면역원성 조성물.
  15. 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 지질 나노입자(LNP), 중합체성 미립자 또는 수중유 에멀젼을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 자가-복제 RNA는 LNP, 중합체성 미립자 또는 수중유 에멀젼에 캡슐화되거나, 결합되거나, 흡착되는 것인, 약제학적 조성물.
  18. 백신으로서 사용하기 위한, 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물 또는 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  19. SARS-CoV-2 감염, 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19), 급성 호흡기 질환 증후군(ARDS) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연에 사용하기 위한, 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물 또는 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  20. 대상체에서 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연 방법으로서, 상기 방법은 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물, 또는 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 또는 그 진행 지연을 위한 약제의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 자가-복제 RNA, 또는 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물, 또는 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 SARS-CoV-2 감염, COVID-19, ARDS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 용도.
  23. 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물, 또는 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 면역 반응은 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응인, 방법.
  25. 면역 반응을 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 자가-복제 RNA, 또는 청구항 13 또는 14의 면역원성 조성물, 또는 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도.
  26. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 자가-복제 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 DNA인, 폴리뉴클레오티드.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 재조합 DNA는 플라스미드인, 폴리뉴클레오티드.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 플라스미드는 서열번호 10 내지 17 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
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