KR20230119870A - Method for preparing a composition for improving brain function and food and pharmaceutical composition for improving brain function - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 알로에로부터 분리된 신규의 유산균인 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP)이 시알산(sialic acid)을 다량으로 생성하고 있어서 이를 발효하여 치매에 대해 예방 또는 치료 효과를 가지는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법 및 상기 뇌기능 개선용 조성물을 포함하는 뇌기능 개선용 식품 및 약학적 조성물에 관한 것이다.In the present invention, Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP, a novel lactic acid bacterium isolated from aloe, produces a large amount of sialic acid, which is fermented to have a preventive or therapeutic effect on dementia. It relates to a method for preparing a composition for improving brain function and a food and pharmaceutical composition for improving brain function including the composition for improving brain function.
의학 기술의 발달과 생활수준의 향상으로 인간의 평균수명은 지난 반세기 동안 두 배 가까이 연장되었으며, 이로 인하여 전체인구에 대한 노인 인구의 비율이 급속하게 증가되었다. 통계청이 발표한 2005년 자료에 의하면, 현재 우리나라 사람의 평균수명은 78.5세이고 2000년도에 이미 65세 이상의 인구 비율이 약 7%에 달하는 등 급속하게 노령화 사회로 진입하고 있음을 알 수 있다. 또한, 우리나라는 2018년에는 고령사회, 2026년에는 노인 인구의 비율이 20% 이상인 초고령화 사회로 진입할 것으로 예측되고 있다. BACKGROUND OF THE INVENTION Due to the development of medical technology and the improvement of living standards, the average lifespan of a human being has almost doubled over the past half century, and as a result, the proportion of the elderly population to the total population has rapidly increased. According to the 2005 data released by the National Statistical Office, the current average life expectancy of Koreans is 78.5 years, and the proportion of the population aged 65 or older already reached about 7% in 2000, indicating that Korea is rapidly entering an aging society. In addition, it is predicted that Korea will enter an aged society in 2018 and a super-aged society in which the proportion of the elderly population exceeds 20% in 2026.
이러한 노인 인구 비율의 급격한 증가와 더불어 각종 노인성 만성질환을 비롯하여 인지기능의 장애와 치매 환자의 비율이 증가할 것으로 예측되며, 2018년에는 치매, 파킨슨병, 알츠하이머 질환 및 뇌질환 등의 노인성질병을 가진 노인의 비율이 65세 이상 인구의 8.8%에 이르렀다. 노인성 질환 중 가장 큰 문제가 되는 치매는 뇌의 퇴행성 변화, 뇌혈관 장애, 뇌의 염증성 장애, 대사성 질환 등에 의해 일어나는 인지기능의 장애를 특징으로 하는 뇌 증후군이다. 인지기능 장애는 치매환자의 독립성과 삶의 질을 저해할 뿐 아니라 간호자의 간호부담도 가중시키게 되기 때문에 뇌질환의 예방 또는 치료에 대한 필요성이 증대되고 있다. 이에 따라 뇌 순환, 대사 개선약 또는 치매 치료제 등의 뇌기능 개선성을 가진 건강기능성식품 및 의약품의 연구가 활발하게 진행되고 있고 사회가 점차 고령화되면서 치매를 비롯한 인지기능장애의 예방 및 치료가 가능한 기능성 물질 및 식품 등의 개발에 대한 요구가 더욱 커지고 있는 실정이다.Along with the rapid increase in the elderly population, the proportion of patients with cognitive impairment and dementia, including various geriatric chronic diseases, is expected to increase. The proportion of the elderly reached 8.8% of the population aged 65 or older. Dementia, which is the biggest problem among geriatric diseases, is a brain syndrome characterized by cognitive impairment caused by degenerative changes in the brain, cerebrovascular disorders, inflammatory disorders of the brain, and metabolic diseases. Cognitive dysfunction not only impairs the independence and quality of life of patients with dementia, but also increases the nursing burden of caregivers, so the need for prevention or treatment of brain diseases is increasing. Accordingly, studies on health functional foods and medicines with brain function improvement such as cerebral circulation, metabolism improving drugs or dementia treatments are being actively conducted, and functionalities that can prevent and treat cognitive dysfunction including dementia as society is gradually aging. The demand for development of materials and food is increasing.
알츠하이머 질환은 중추신경계의 신경퇴행성 질환으로, 치매의 가장 흔한 형태이다. 알츠하이머성 치매 환자의 인지 기능의 감소 및 신경세포의 손상이 유발되는 과정에서 아세틸콜린(acetylcholine), 도파민(dopamine), 시알산(sialic acid) 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)와 같은 신경전달물질의 전달 및 생성, 분비, 제거 과정의 이상이 중요한 역할을 한다. 이러한 신경전달물질은 노화에 따라 감소하는데, 치매의 주 증상인 기억력 장애는 기억과 학습에 있어서 중요한 역할을 수행하는 콜린성 시스템(cholinergic system)의 심각한 손상에 의한 것으로 알려져 있다. 특히 알츠하이머성 치매의 인지력 감소 증상은 아세틸콜린을 생성하는 신경세포의 손상과 아세틸콜린을 분해하는 효소인 아세틸콜린가수분해효소(acetylcholinesterase, AChE)의 활성 증가와 함께 기억장애가 더욱 악화된다. 치매는 다양한 원인만큼 그 치료제 또한 다양한 경로를 표적으로 하고 있는데, 대표적으로 뇌 조직의 콜린계 활성의 감소로 기억력이 감퇴하기 때문에 뇌 신경접합부의 콜린성 작용을 활성화하기 위해 신경전달물질인 아세틸콜린의 작용을 활성화시키는 콜린성 작용제(cholinergic agonist), 아세틸콜린 전구체, AChE의 활성을 억제하는 AChE 효소 저해제(inhibitor)를 사용하는 많은 연구가 수행되고 있다. Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease of the central nervous system and is the most common form of dementia. Neurotransmitters such as acetylcholine, dopamine, sialic acid, and γ-aminobutyric acid (GABA) in the process of reducing cognitive function and damaging nerve cells in patients with Alzheimer's disease Abnormalities in the transport, production, secretion, and elimination processes play an important role. These neurotransmitters decrease with aging, and memory impairment, a major symptom of dementia, is known to be caused by severe damage to the cholinergic system, which plays an important role in memory and learning. In particular, the symptoms of cognitive decline in Alzheimer's disease are aggravated by damage to nerve cells that produce acetylcholine and increased activity of acetylcholinesterase (AChE), an enzyme that degrades acetylcholine. Dementia targets various pathways as well as its various causes. Representatively, because memory declines due to a decrease in cholinergic activity in brain tissue, the action of acetylcholine, a neurotransmitter, to activate the cholinergic action of the brain neuronal junction. Many studies have been conducted using cholinergic agonists, acetylcholine precursors, and AChE enzyme inhibitors that inhibit the activity of AChE.
아세틸콜린 수용체(muscarine acetylcholine receptor)에 대한 효능제(agonist), 아세틸콜린 생성촉진제, 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholinesterase, AChE) 저해제 등 여러 가지 작용기전에 따라 아세틸콜린성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 약물들이 개발되어 왔다. 실제로 현재 각국에서 사용되고 있는 알츠하이머병 치료제는 이러한 아세틸콜린 분해효소 억제제가 대부분이며, 타크린(tacrine)과 도네페질(donepezil) 등이 이에 속한다. 이 밖에도 리바스티그민(rivastigmin), 갈라타민(galatamine) 등이 사용되고 있다.There are drugs that can enhance the function of acetylcholine nerve cells according to various mechanisms of action, such as agonists for muscarine acetylcholine receptors, acetylcholine production promoters, and acetylcholinesterase (AChE) inhibitors. has been developed In fact, most Alzheimer's disease drugs currently used in various countries are acetylcholinesterase inhibitors, including tacrine and donepezil. In addition, rivastigmin and galatamine are also used.
현재 퇴행성 뇌신경 질환으로서의 인지기능 또는 기억능력 저하 현상 개선을 위한 더욱 효과적인 제제(건강기능성 식품 소재 포함)의 개발이 어느 때보다 높은 시기이다. 결국 치매 발병에 대한 뇌신경 세포의 기작을 대상으로 새로운 다중 기능성 효과(multi-functional effect)를 갖는 소개 개발을 위한 연구가 필요한 실정이다.Currently, the development of more effective agents (including health functional food materials) to improve cognitive function or memory decline as a degenerative cranial nerve disease is at a higher level than ever. In the end, research is needed to develop an introduction with a new multi-functional effect targeting the mechanism of brain nerve cells for the onset of dementia.
본 발명은 알로에로부터 분리된 신규의 유산균인 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP)이 시알산을 다량으로 생성하고 있어서 이를 발효하여 치매에 대해 예방 또는 치료 효과를 가지는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP, a new lactic acid bacterium isolated from aloe, produces a large amount of sialic acid, and fermenting it is for improving brain function, which has preventive or therapeutic effects on dementia. It is intended to provide a method for preparing the composition.
또한, 본 발명은 알로에 유래 신규 유산균인 락토바실러스 갈리나룸을 배양 후 그 발효물로부터 인지기능 및 기억력을 포함한 뇌기능 개선 효과가 더욱 증진되어, 알츠하이머 등의 노인성 치매 질환을 예방할 수 있는 식품 또는 약학적 조성물을 제공하고자 한다. In addition, the present invention is a food or pharmaceutical product that can prevent senile dementia diseases such as Alzheimer's by culturing Lactobacillus gallina room, a novel lactic acid bacterium derived from aloe, and further improving brain function including cognitive function and memory from the fermented product. It is intended to provide a composition.
상기 과제를 해결하기 위하여, In order to solve the above problems,
본 발명은 일실시예에서, (a) 알로에 생잎에서 분리된 유산균을 MRS 배지에 접종하여 유산균 전배양액을 제조하는 단계; (b) 알로에로부터 취득된 알로에 다당체 추출물에 MRS 배지 및 제비집 분말을 첨가하여 알로에 다당체 추출물 발효배지를 제조하는 단계; (c) 상기 알로에 다당체 추출물 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 유래 유산균 발효액을 제조하는 단계; (d) 상기 알로에 유래 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계; (e) 상기 알로에 유래 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및, (f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유래 유산균 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the present invention, (a) preparing a pre-culture solution of lactic acid bacteria by inoculating lactic acid bacteria isolated from fresh aloe leaves into an MRS medium; (b) preparing an aloe polysaccharide extract fermentation medium by adding MRS medium and bird's nest powder to the aloe polysaccharide extract obtained from aloe; (c) preparing an aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth by inoculating the lactic acid bacteria pre-culture solution into the fermentation medium of the aloe polysaccharide extract and fermenting the solution; (d) tyndallizing the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth; (e) crushing the lactic acid bacteria in the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth to form a lactic acid bacteria disruption solution; and (f) mixing the tindalized lactic acid bacteria fermented liquid and the lactic acid bacteria disrupted liquid and then drying to prepare a tindalized aloe-derived lactic acid bacteria fermented product.
상기 (a)단계에서 알로에 생잎에서 유산균을 분리하는 것은, 알로에 생잎에서 유산균을 분리하는 단계; 상기 분리된 유산균을 동정하는 단계; 및, 상기 분리 및 동정된 유산균을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.Separating the lactic acid bacteria from the fresh aloe leaves in step (a) may include separating the lactic acid bacteria from the fresh aloe leaves; Identifying the isolated lactic acid bacteria; And, it may include the step of culturing the isolated and identified lactic acid bacteria in a medium.
상기 (b)단계에서 알로에 다당체 추출물을 취득하는 것은, 알로에를 수확 및 전처리하는 단계; 및 상기 전처리 알로에에서 점액질의 알로에 다당체 추출물을 취득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.Obtaining the aloe polysaccharide extract in step (b) may include harvesting and pre-treating the aloe; and obtaining a mucilaginous aloe polysaccharide extract from the pretreated aloe.
상기 (b)단계에서 알로에 다당체 추출물은 pH를 pH6으로 보정하고, 농도를 10 내지 20°Birx로 조정하는 것일 수 있다.In step (b), the pH of the aloe polysaccharide extract may be corrected to pH6, and the concentration may be adjusted to 10 to 20°Birx.
상기 (c)단계에서 유산균 전배양액은 1 내지 5중량%를 접종하고, 60 내지 80시간 동안 진탕배양하여 발효시키는 것일 수 있다.In step (c), 1 to 5% by weight of the lactic acid bacteria pre-culture solution may be inoculated and cultured with shaking for 60 to 80 hours to ferment.
상기 (d)단계에서 알로에 유래 유산균 발효액을 틴달화하는 단계는, 상기 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60분 동안 가열; 및 40℃ 이하로 급속 냉각하여 상기 유산균 발효액 중 살아있는 유산균을 사멸시키는 것을 포함하는 것일 수 있다.The step of tindalizing the lactic acid bacteria fermentation broth derived from aloe in step (d) may include heating the lactic acid bacteria fermentation broth at 60 to 150° C. for 10 to 60 minutes; And rapid cooling to 40 ° C. or less may include killing live lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria fermentation broth.
상기 유산균은 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum)인 것일 수 있다. The lactic acid bacteria may be Lactobacillus gallinarum.
상기 알로에는 알로에 베라, 알로에 아보레센스 및 알로에 사포나리아로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종인 것일 수 있다. The aloe may be one or more species selected from the group consisting of aloe vera, aloe arborescens, and aloe saponaria.
또한, 본 발명은 일실시예에서, 알로에 유래 유산균인 락토바실러스 갈리나룸 균주를 이용한 알로에 유래 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 뇌기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.In addition, in one embodiment, the present invention provides a food composition for improving brain function comprising, as an active ingredient, a fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria using an aloe-derived lactic acid bacterium, Lactobacillus gallina room strain.
상기 뇌기능 개선용 식품 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 5 내지 20 중량부 포함하는 것일 수 있다.The fermented product of lactic acid bacteria derived from aloe may be included in an amount of 5 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the food composition for improving brain function.
더불어, 본 발명은 일실시예에서, 알로에 유래 유산균인 락토바실러스 갈리나룸 균주를 이용한 알로에 유래 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 뇌기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, in one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition for improving brain function comprising, as an active ingredient, a fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria using an aloe-derived lactic acid bacterium, Lactobacillus gallina room strain.
상기 뇌기능 개선용 약학적 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 40 내지 99 중량부 포함하는 것일 수 있다.The aloe-derived lactic acid bacteria fermented product may contain 40 to 99 parts by weight based on 100 parts by weight of the pharmaceutical composition for improving brain function.
본 발명은 시알산 함량이 증가된 신규 알로에 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 뇌기능(인지기능 또는 기억능력) 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 시알산 함량이 증가된 신규 알로에 유산균 발효물은 아세틸콜린을 파괴하여 신경전달을 억제하는 아세틸콜린 분해효소의 활성을 저해하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 스코폴라민으로 유도된 기억력 손상 동물모델의 기억력 및 인지능력에 대한 회복 능력이 우수하므로, 알츠하이머성 치매 등의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 저하된 기억력, 학습능력 및 인지기능을 개선 또는 증진시키는 건강기능 식품 조성물 또는 약학적 조성물로도 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a composition for improving brain function (cognitive function or memory ability) containing, as an active ingredient, a novel fermentation product of aloe lactobacillus with increased sialic acid content, and the novel fermentation product with increased sialic acid content of the present invention. silver is not only excellent in inhibiting the activity of acetylcholine degrading enzyme, which inhibits neurotransmission by destroying acetylcholine, but also has excellent ability to restore memory and cognitive ability in animal models with memory impairment induced by scopolamine. It can be usefully used for the prevention or treatment of degenerative cranial nerve diseases such as Alzheimer's dementia, and can also be usefully used as a health functional food composition or pharmaceutical composition for improving or enhancing deteriorated memory, learning ability and cognitive function.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 틴달화 알로에 유산균발효 분말의 제조공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 베라 BCP-MRS(a) 및 BS 배지(b) 상에 형성된 유산균 콜로니 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균의 형태적 특성분석을 FE-SEM으로 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균의 16S rRNA의 염기서열(forward blast)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균의 16S rRNA의 염기서열(reverse blast)을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균의 phylogenetic tree(Lactobacillus gallinarum)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균(Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112)의 미생물안전기탁증이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균(Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP) 미생물특허기탁증이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일실시예에 따른 알로에 유래 유산균 발효 전(도 9a)과 후(도 9b)의 시알산 성분 분석(KOTITI시험연구원 공인시험성적서, 형광라벨 키트 및 HPLC-FLD) 결과를 나타낸 공인시험성적서이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 MTT 분석법을 이용한 in vitro 뇌신경세포 증식 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 DPPH 분석법을 이용한 in vitro 항산화 활성 평가결과를 나타낸 그래프 및 도표이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 산화형 글루타치온(GSSG)(a)과 환원형 글루타치온(GSH)(b)을 HPLC로 평가한 결과물이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 GSH의 일정량에 대한 흡광도의 기울기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 총 시알산 in vitro 세포 내 유입량을 HPLC로 평가한 결과물이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 AChE 활성에 대한 in vivo 효능을 평가한 결과물이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 모리스 수중 미로시험을 통한 공간기억능력 회복 평가를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 Aβ(amyloid-β) 활성에 대한 in vivo 효능 평가를 조직학적으로 분석한 사진이다.1 shows a manufacturing process of tindalized aloe lactic acid bacteria fermented powder according to an embodiment of the present invention.
2 is a photograph of lactic acid bacteria colonies formed on Aloe vera BCP-MRS (a) and BS medium (b) according to an embodiment of the present invention.
3 is a photograph taken by FE-SEM of morphological characterization of aloe-derived lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
4 shows the nucleotide sequence (forward blast) of 16S rRNA of aloe-derived lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
5 shows the nucleotide sequence (reverse blast) of 16S rRNA of aloe-derived lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
6 shows a phylogenetic tree (Lactobacillus gallinarum) of aloe-derived lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention.
7 is a microorganism safety deposit certificate of aloe-derived lactic acid bacteria (Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112) according to an embodiment of the present invention.
8 is a microorganism patent deposit of aloe-derived lactic acid bacteria (Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP) according to an embodiment of the present invention.
9a and 9b are analysis of sialic acid components before (FIG. 9a) and after (FIG. 9b) fermentation of aloe-derived lactic acid bacteria according to an embodiment of the present invention (KOTITI Testing & Research Institute official test report, fluorescent label kit and HPLC-FLD) It is an official test report showing the results.
10 is a graph showing the results of in vitro brain nerve cell proliferation evaluation using the MTT assay according to an embodiment of the present invention.
11 is a graph and chart showing the results of in vitro antioxidant activity evaluation using the DPPH assay according to an embodiment of the present invention.
12 is a result of HPLC evaluation of oxidized glutathione (GSSG) (a) and reduced glutathione (GSH) (b) according to an embodiment of the present invention.
13 is a graph showing the change in the slope of the absorbance with respect to a certain amount of GSH according to an embodiment of the present invention.
14 is a result of HPLC evaluation of total sialic acid in vitro cell influx according to an embodiment of the present invention.
15 is a result of evaluating the in vivo efficacy for AChE activity according to an embodiment of the present invention.
16 is a graph showing the evaluation of spatial memory recovery through the Morris water maze test according to an embodiment of the present invention.
17 is a photograph of histologically analyzing the in vivo efficacy evaluation for amyloid-β (Aβ) activity according to an embodiment of the present invention.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.Since the present invention can make various changes and have various embodiments, specific embodiments will be illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.In the present invention, the term "comprises" or "has" is intended to designate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification, but one or more other features It should be understood that the presence or addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof is not precluded.
본 발명에서, “시알산(sialic acid)”은 9개의 탄소 골격을 가지는 뉴라민산(neuraminic acid)의 아실 유도체의 총칭으로 현재 동물계에 20여종 이상이 알려져 있고 자연계에는 30여종 이상의 유도체가 존재한다고 알려져 있다. 이 중에 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid)이라고도 알려져 있는 시알산은 동물의 뇌, 장기, 조직, 혈액, 점액, 유즙 등의 올리고당, 다당, 당단백질, 당지질의 구성성분으로 널리 존재하며 식물계에는 없으나 유산균 등 미생물계에서는 비교적 널리 분포되어 있다. 또한, 시알산은 세포막의 세포 표면에 있는 당단백질 또는 당지질의 구성성분으로 말단에 위치하여 다양한 생물학적인 기능을 발휘하는데, 최근의 활발한 연구로 인하여 여러 가지 생리적 기능이 해명되고 있다. 예를 들면, 시알산은 포유동물의 생체 내에서 프락토즈-6-포스페이트(Fructose-6-phosphate)로부터 엔-아세틸만노즈아민(N-acetylamannoseamine)을 경유하여 합성된다. 이러한 시알산은 뇌의 강글리오사이드(ganglioside)나 당단백질의 구성성분으로, 뇌나 중추신경계에 특히 많이 함유되어 있으며 그 양이 유아기에 급격히 증가하기 때문에, 시알산은 이러한 조직의 기능발현이나 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 신생아와 노년층의 경우는 엔-아세틸만노즈아민을 합성하는 UDP-N-아세틸클루코스아민-2'-에피머레이즈의 활성이 약하다는 것이 동물실험을 통해 밝혀져서 외부로부터 공급되는 시알산은 영아 및 노인의 두뇌발달에 도움을 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, 시알산은 butyrylcholinesterase(BuChE)의 저해제(inhibitor)로 작용하여 알츠하이머 치매의 치료에 유효한 것으로 규명되었다. 일반적으로 시알산은 글리코시드 결합을 통해 N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine, GalNAc)을 형성하는데, 이 화합물은 시냅스의 적절한 기능에 중요한 역할을 하며 기억력 개선에 도움을 주는 것으로 알려져 있다.In the present invention, “sialic acid” is a general term for acyl derivatives of neuraminic acid having a nine-carbon skeleton, and it is said that more than 20 kinds of derivatives are currently known in the animal world and more than 30 kinds of derivatives exist in the natural world. It is known. Among them, sialic acid, also known as N-acetylneuraminic acid, is widely present as a component of oligosaccharides, polysaccharides, glycoproteins, and glycolipids in animal brains, organs, tissues, blood, mucus, milk, etc. It is absent in lactic acid bacteria, but is relatively widely distributed in microorganisms such as lactic acid bacteria. In addition, sialic acid is a component of glycoproteins or glycolipids on the cell surface of cell membranes and is located at the end to exert various biological functions, and various physiological functions have been elucidated due to recent active research. For example, sialic acid is synthesized from fructose-6-phosphate via N-acetylamannoseamine in mammals. Sialic acid is a component of ganglioside or glycoprotein in the brain, and is particularly abundant in the brain or central nervous system, and its amount increases rapidly during infancy. It is known. However, in the case of neonates and the elderly, it was found through animal experiments that the activity of UDP-N-acetylglucosamine-2'-epimerase, which synthesizes N-acetylmannoseamine, is weak. And it has been found to be helpful in brain development of the elderly. In particular, sialic acid has been found to be effective in the treatment of Alzheimer's disease by acting as an inhibitor of butyrylcholinesterase (BuChE). In general, sialic acid forms N-acetylgalactosamine (GalNAc) through a glycosidic bond, and this compound plays an important role in the proper functioning of synapses and is known to help improve memory.
본 발명에서, “제비집(edible bird’s nest)”은 동남아시아 지역에 주로 서식하는 ‘금사연(Aerodramus funiphagus)’이라 불리는 작은 바다제비가 분비한 타액(saliva)과 깃털 등으로 만들어진 둥지로, 중국 명나라 시기부터 섭취되던 중국의 전통식품이다. 제비집은 비타민, 호르몬 및 지방산이 풍부할 뿐만 아니라 단백질, 탄수화물, 무기질 염과 아미노산, 시알산과 같은 다양한 영양 성분을 포함하고 있다. 특히 제비집의 인지 기능 개선의 메커니즘은 제비집 추출물 중 시알산이 뇌신경 시냅스의 적절한 기능에 중요한 화합물인 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)을 형성하기 위해 공유 결합되어있는 것으로 밝혀졌고, GalNAc는 또한 뇌기능(기억력 및 인지기능)를 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 연구된 모든 뇌의 해마부 서브필드에서 sWGA 및 GSLⅡ는 음성인 반면에 시알산 물질인 GalNAc, GluNAc는 양성으로 나타나 제비집의 시알산 성분이 뇌기능(기억력 및 인지기능) 향상과 뇌질환(치매 및 알츠하이머 등)에 효과가 있음이 밝혀졌다. 제비집 내부에 시알산이 사람의 2천배, 로열젤리의 2백배에 가까운 양이 존재하여 시알산을 추출하기 위한 적합한 소재로 널리 알려져 있다. 제비집의 탄수화물 성분은 인체에 다양한 약리학적 효과를 가지는데, 그 중에서도 약 60 내지 160mg/kg 가량의 농도로 함유되어 있는 시알산(sialic acid)은 9개의 탄소 골격을 가지는 뉴라민산(neuraminic acid)의 아실 유도체의 총칭으로 현재 동물계에 20여종 이상이 알려져 있다.In the present invention, the "edible bird's nest" is a nest made of saliva and feathers secreted by a small sea petrel called 'Aerodramus funiphagus', which mainly lives in Southeast Asia, and has been since the Ming Dynasty of China. It is a traditional Chinese food consumed. Bird's nest is not only rich in vitamins, hormones and fatty acids, but also contains various nutritional components such as proteins, carbohydrates, mineral salts, amino acids, and sialic acid. In particular, the mechanism of cognitive function improvement in bird's nest has been found to be covalently bound to form N-acetyl galactosamine (GalNAc), a compound important for the proper functioning of cranial nerve synapses, in sialic acid in bird's nest extract, and GalNAc also has brain function ( It has been shown to improve memory and cognitive function. In addition, sWGA and GSLII were negative in the hippocampal subfields of all brains studied, while GalNAc and GluNAc, which are sialic acid substances, were positive. It has been shown to be effective in dementia and Alzheimer's, etc.). It is widely known as a suitable material for extracting sialic acid, as there is 2,000 times the amount of sialic acid in the bird's nest and 200 times that of royal jelly. The carbohydrate component of bird's nest has various pharmacological effects on the human body. Among them, sialic acid, which is contained at a concentration of about 60 to 160 mg/kg, is neuraminic acid with a 9-carbon skeleton. It is a generic term for acyl derivatives of , and more than 20 species are currently known in the animal kingdom.
본 발명에서, “유산균(Lactic acid bacteria)”은 오랫동안 이용되어 왔으며 유산균의 정장작용, 항암효과, 면역증강 효과, 신경전달물질 생성 등의 유익한 효과가 보고되어 왔다. 또한, 발효과정 동안에 젖산 및 다수의 유기산 등의 다양한 대사산물들(항균 효과를 갖는 bacteriocin 등의 항균물질 , 항산화 물질, 면역활성물질, GABA 및 시알산 등의 신경전달물질 등)을 생성하고 식품의 풍미와 제품 수명에 영향을 주거나 인체 생리 활성과 건강 기능 조절에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 probiotics로서 사람의 장내에 서식하면서 장내 균총 개선, 면역조절 작용, 콜레스테롤 저하, 병원성 세균들의 생육 억제, 유당 불내증 개선 등의 다양한 역할을 하는 것으로 보고되어 유산균이 생산하는 다양한 생리활성물질들에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있고 이를 활용하여 건강기능식품, 화장품, 제약 분야에서 다양한 소재로 이용되고 있다. In the present invention, "lactic acid bacteria" have been used for a long time, and beneficial effects such as intestinal function, anticancer effect, immune enhancing effect, and neurotransmitter production of lactic acid bacteria have been reported. In addition, during the fermentation process, various metabolites such as lactic acid and a number of organic acids are produced (antibacterial substances such as bacteriocin having antibacterial effects, antioxidant substances, immunoactive substances, neurotransmitters such as GABA and sialic acid, etc.) It is known to play an important role in affecting flavor and product life or regulating human physiological activity and health functions. In addition, as probiotics, it has been reported to play various roles such as improving intestinal flora, immunomodulating action, lowering cholesterol, inhibiting the growth of pathogenic bacteria, and improving lactose intolerance while living in the human intestine. Research on various physiologically active substances produced by lactic acid bacteria is being actively carried out, and it is being used as a variety of materials in the fields of health functional food, cosmetics, and pharmaceuticals.
알로에(Aloe)는 동서양을 막론하고 수천년 전부터 민간요법으로 질병의 치료에 널리 사용되어 왔다. 동양에서는 알로에를 노회라고 부르고 있는데, 중국 송나라의 ‘개보본초’에 처음으로 정조품으로 수재되어 ‘눈을 맑게 하고 경풍을 치료하며 오감을 다스린다'라고 하여 알로에의 약효가 기재되어 있다. 그동안 알로에에 대한 많은 연구가 진행되어 알로에 추출물을 사용한 연구에서 저혈압에 대한 치료효과, 뼈의 칼슘/인의 축적효과, 동맥경화증의 치료효과, 다리궤양 및 피부병의 치료효과, 초점성 폐결핵의 치료효과, 항염증 성분의 조성, 눈병에 대한 치료효과, 화장품의 보습제로서의 역할, 면역작용, 체중 조절작용, 뇌신경세포 보호 및 학습능력 개선작용, 항산화 작용, 전립선염과 건선의 치료효과 등의 성인병 및 노인병 관련 연구가 보고되어 알로에에 서식하는 신규 유산균인 락토바실러스 갈리나룸을 발굴하여 탁월한 약리효능을 기대할 수 있었다. Aloe has been widely used in the treatment of diseases as a folk remedy for thousands of years, both in the East and the West. In the Orient, aloe is called Nohoe, and it was first listed as a chastity item in 'Gaebo Herb' in the Song Dynasty of China, and the medicinal effects of aloe are described as 'clearing the eyes, treating convulsions, and controlling the five senses'. In the meantime, many studies on aloe have been conducted, and in studies using aloe extract, the treatment effect on hypotension, the accumulation of calcium / phosphorus in bones, the treatment effect of arteriosclerosis, the treatment effect of leg ulcers and skin diseases, the treatment effect of focal pulmonary tuberculosis, Composition of anti-inflammatory ingredients, therapeutic effect on eye disease, role as a moisturizer in cosmetics, immune action, weight control action, brain nerve cell protection and learning ability improvement action, antioxidant action, prostatitis and psoriasis treatment effect, etc. The research was reported and a new lactic acid bacterium, Lactobacillus gallina room, which lives in aloe was discovered, and excellent pharmacological efficacy could be expected.
따라서, 본 발명에서는 시알산 함량이 증가된 신규 알로에 유산균인 락토바실러스 갈리나룸의 발효물이 치매실험 동물모델로서 알려진 기억 및 학습 장해 동물모델인 노화촉진마우스(SAMP8)에 있어서 수동회피시험(passive avoidance test) 및 노화도(grading score of senescence)를 평가한 결과, 신경전달물질과 그 대사산물 및 신경전달물질에 대한 대사산물의 비율 그리고 아세틸콜린 에스테라아제(acetylcholinesterase)의 활성 등을 평가하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 뇌기능(인지기능 또는 기억능력) 개선을 위한 조성물의 제조방법 및 식품 및 약학적 조성물을 제공한다.Therefore, in the present invention, the fermented product of Lactobacillus gallina room, a novel aloe lactic acid bacterium with increased sialic acid content, was tested in a passive avoidance test (SAMP8), an animal model for memory and learning impairment known as an animal model for dementia. test) and grading score of senescence, neurotransmitters and their metabolites, the ratio of metabolites to neurotransmitters, and the activity of acetylcholinesterase were evaluated to obtain significant results. It provides a method for preparing a composition for improving brain function (cognitive function or memory ability) and a food and pharmaceutical composition.
구체적으로, 본 발명은 (a) 알로에 생잎에서 분리된 유산균을 MRS 배지에 접종하여 유산균 전배양액을 제조하는 단계; (b) 알로에로부터 취득된 알로에 다당체 추출물에 MRS 배지 및 제비집 분말을 첨가하여 알로에 다당체 추출물 발효배지를 제조하는 단계; (c) 상기 알로에 다당체 추출물 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 유래 유산균 발효액을 제조하는 단계; (d) 상기 알로에 유래 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계; (e) 상기 알로에 유래 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및, (f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유래 유산균 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.Specifically, the present invention includes the steps of (a) preparing a pre-culture solution of lactic acid bacteria by inoculating lactic acid bacteria isolated from fresh aloe leaves into an MRS medium; (b) preparing an aloe polysaccharide extract fermentation medium by adding MRS medium and bird's nest powder to the aloe polysaccharide extract obtained from aloe; (c) preparing an aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth by inoculating the lactic acid bacteria pre-culture solution into the fermentation medium of the aloe polysaccharide extract and fermenting the solution; (d) tyndallizing the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth; (e) crushing the lactic acid bacteria in the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth to form a lactic acid bacteria disruption solution; and (f) mixing the tindalized lactic acid bacteria fermented liquid and the lactic acid bacteria disrupted liquid and then drying to prepare a tindalized aloe-derived lactic acid bacteria fermented product.
상기 (a)단계에서 알로에 생잎에서 유산균을 분리하는 것은, 알로에 생잎에서 유산균을 분리하는 단계; 상기 분리된 유산균을 동정하는 단계; 및, 상기 분리 및 동정된 유산균을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.Separating the lactic acid bacteria from the fresh aloe leaves in step (a) may include separating the lactic acid bacteria from the fresh aloe leaves; Identifying the isolated lactic acid bacteria; And, it may include the step of culturing the isolated and identified lactic acid bacteria in a medium.
상기 (a)단계에서 유산균 전배양액을 제조하는 것은, 전배양을 위한 MRS 배지를 멸균하고 유산균을 접종 및 진탕배양하여 1×1010 내지 1×1012 CFU/㎖ 이상의 유산균 수를 확보한 후 유산균 전배양액을 제조하는 것을 포함하는 것일 수 있다. Preparation of the lactic acid bacteria pre-culture solution in step (a) is to sterilize the MRS medium for pre-culture, inoculate and shake the lactic acid bacteria to secure the number of lactic acid bacteria of 1 × 10 10 to 1 × 10 12 CFU / ㎖ or more, and then lactic acid bacteria It may include preparing a pre-culture solution.
상기 MRS 배지를 멸균하는 것은 100 내지 130℃에서 10 내지 20분 동안 수행하는 것일 수 있고, 유산균 균주를 접종하여 37℃에서 바람직하게는 24 내지 32 시간, 가장 바람직하게는 28 시간 동안 진탕 배양하여 유산균 전배양액을 제조할 수 있다.Sterilization of the MRS medium may be carried out at 100 to 130 ° C for 10 to 20 minutes, and lactic acid bacteria strains are inoculated and shaken cultured at 37 ° C for preferably 24 to 32 hours, most preferably 28 hours. A pre-culture solution can be prepared.
상기 유산균은 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum)인 것일 수 있다. The lactic acid bacteria may be Lactobacillus gallinarum.
상기 알로에는 알로에 베라, 알로에 아보레센스 및 알로에 사포나리아로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종인 것일 수 있다.The aloe may be one or more species selected from the group consisting of aloe vera, aloe arborescens, and aloe saponaria.
상기 (b)단계에서는 알로에로부터 취득된 알로에 다당체 추출물에 MRS 배지 및 제비집 분말을 첨가하여 알로에 다당체 추출물 발효배지를 제조한다. In step (b), an MRS medium and bird's nest powder are added to the aloe polysaccharide extract obtained from aloe to prepare an aloe polysaccharide extract fermentation medium.
상기 (b)단계에서 알로에 다당체 추출물을 취득하는 것은, 알로에를 수확 및 전처리하는 단계; 및 상기 전처리 알로에에서 점액질의 알로에 다당체 추출물을 취득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.Obtaining the aloe polysaccharide extract in step (b) may include harvesting and pre-treating the aloe; and obtaining a mucilaginous aloe polysaccharide extract from the pretreated aloe.
상기 (b)단계에서 알로에 다당체 추출물은 상기 MRS 배지 및 제비집 분말을 첨가하기 전에 pH를 pH6으로 보정하고, 농도를 10 내지 20°Birx로 조정하는 것일 수 있다.In the step (b), the pH of the aloe polysaccharide extract may be corrected to pH6 and the concentration adjusted to 10 to 20°Birx before adding the MRS medium and bird's nest powder.
알로에 제품군의 건강기능식품으로서 일일섭취량은 식품의약품안전처 고시 기준으로 총 다당체 함량이 100 내지 200 mg/20g을 함유하고 있어야 하므로, 상기 알로에 다당체 추출물은 10 중량% 이상의 함유량을 가지는 것일 수 있다.As a health functional food of the aloe family, the daily intake should contain 100 to 200 mg/20g of total polysaccharide content according to the Ministry of Food and Drug Safety, so the aloe polysaccharide extract may have a content of 10% by weight or more.
상기 (c)단계에서는, 상기 (a)단계에서 제조된 알로에 다당체 추출액 발효배지에 상기 (b) 단계에서 제조된 유산균 전배양액을 접종하고 37℃에서 68 내지 76 시간 동안 발효시켜 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 제조한다. 상기 (c)단계에서는 상기 알로에 다당체 추출물 발효배지에 첨가된 MRS 배지 및 제비집 분말을 알로에 유산균으로 발효할 수 있다. 제비집 분말을 유산균이 발효하여 대사생성물로 생성, 즉, 제비집 분말이 유산균에 의해 발효되어 제비집 분말의 미첨가에 의해 발효 전(유산균 단독) 보다 대사산물에서 시알산이 증가될 수 있다.In the step (c), the fermentation medium of the aloe polysaccharide extract prepared in the step (a) is inoculated with the pre-culture of the lactic acid bacteria prepared in the step (b) and fermented at 37° C. for 68 to 76 hours, so that the lactic acid bacteria in the aloe polysaccharide extract are fermented. prepare a fermentation broth. In step (c), the MRS medium and bird's nest powder added to the aloe polysaccharide extract fermentation medium may be fermented with aloe lactic acid bacteria. Bird's nest powder is fermented by lactic acid bacteria to produce metabolites, that is, swallow's nest powder is fermented by lactic acid bacteria, and sialic acid can be increased in metabolites before fermentation (lactic acid bacteria alone) by not adding bird's nest powder.
상기 (c)단계에서 유산균 전배양액은 1 내지 5중량%를 접종하고, 60 내지 80시간 동안 진탕배양하여 발효시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균 전배양액은 1 내지 4중량%, 1 내지 3중량% 또는 1 내지 2중량%를 접종하는 것일 수 있다. In step (c), 1 to 5% by weight of the lactic acid bacteria pre-culture solution may be inoculated and cultured with shaking for 60 to 80 hours to ferment. For example, the lactic acid bacteria pre-culture solution may be inoculated with 1 to 4% by weight, 1 to 3% by weight or 1 to 2% by weight.
상기 유산균 발효액을 제조한 후, 상기 (d)단계에서 유산균 발효액을 틴달화한다.After preparing the lactic acid bacteria fermentation broth, the lactic acid bacteria fermentation broth is tindaled in the step (d).
상기 (d)단계에서 알로에 유래 유산균 발효액을 틴달화하는 단계는, 상기 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60분 동안 가열; 및 40℃ 이하로 급속 냉각하여 상기 유산균 발효액 중 살아있는 유산균을 사멸시키는 것을 포함하는 것일 수 있다.The step of tindalizing the lactic acid bacteria fermentation broth derived from aloe in step (d) may include heating the lactic acid bacteria fermentation broth at 60 to 150° C. for 10 to 60 minutes; And rapid cooling to 40 ° C. or less may include killing live lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria fermentation broth.
상기 알로에 유래 유산균 발효액의 틴달화는 상기 알로에 유래 유산균 발효액 중 발효 후 살아있는 유산균을 사균화하는 방법으로서, 알려진 발효액의 틴달화 방법은 어느 방법이든 무방하게 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 알로에 유래 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60분간 가열하고, 20 내지 40℃ 또는 40℃ 이하로 급속 냉각하여 사멸시키는 방법인 간헐멸균법으로 틴달화하는 방법을 사용하는 것일 수 있다.The tindalization of the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth is a method of killing live lactic acid bacteria after fermentation in the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth. It may be to use a method of tindalization by an intermittent sterilization method, which is a method of heating at 60 to 150 ° C. for 10 to 60 minutes and rapidly cooling to 20 to 40 ° C. or below 40 ° C.
상기 (e)단계에서는 상기 (c)단계에서 제조한 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성한다. 상기 파쇄는 상기 유산균 발효액을 원심분리하여 발효액과 균체로 분리한 다음, 분리된 균체를 파쇄하는 것일 수 있으며, 초음파분쇄기를 이용하는 것일 수 있다. 여기서 수득된 파쇄물은 다시 한번 원심분리하여 세포 침전물을 제거하고 상등액을 유산균 파쇄액으로 획득하는 것일 수 있다. In the step (e), the lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria fermentation broth prepared in the step (c) are disrupted to form a disrupted lactic acid bacteria solution. The crushing may be centrifuging the lactic acid bacteria fermentation broth to separate the fermentation broth and cells, and then crushing the separated cells, or using an ultrasonicator. The lysate obtained here may be centrifuged once again to remove the cell precipitate, and the supernatant may be obtained as a lactic acid bacteria lysate.
이때, 상기 세포 침전물을 이루는 성분은 소수성의 세포벽 성분들이 대부분이고, 상등액을 이루는 성분은 유산균 세포를 구성하는 성분으로 뮤레인(murein)이라 불리는 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 시알산(sialic acid) 그리고 세포막 성분인 다당류(polysaccharide), 세포내 단백질(intercellular protein), 여러 종류의 세포내 효소(intercellular enzymes) 등으로 면역 및 뇌세포 증강 효과와 관련한 중요한 물질들이다. At this time, most of the components constituting the cell precipitate are hydrophobic cell wall components, and the components constituting the supernatant are components constituting lactic acid bacteria cells, which include peptidoglycan called murein and sialic acid In addition, polysaccharides, which are components of cell membranes, intercellular proteins, and various types of intercellular enzymes, are important substances related to immune and brain cell enhancement effects.
상기 유산균 발효액 중에 존재하는 유산균 세포를 파쇄하게 되면 실제로 유산균의 세포벽 구성 성분과 세포내에 중요한 면역물질들이 모두 빠져나와 발효 시 생성된 대사성분들과 함께 잠재적인 병원성 미생물들에 저항할 수 있는 획득면역(acquired immunity)의 효율성을 더욱 증대시킬 뿐만 아니라 보다 강력한 면역 시스템을 가질 수 있다.When the lactic acid bacteria cells present in the lactic acid bacteria fermentation broth are actually disrupted, all of the cell wall constituents of the lactic acid bacteria and important immune substances in the cells escape, resulting in acquired immunity that can resist potential pathogenic microorganisms along with metabolic components generated during fermentation. immunity), as well as having a stronger immune system.
마지막으로, 상기 (f)단계에서는 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유산균 발효분말(틴달화 알로에 유래 유산균 발효물)을 제조한다.Finally, in the step (f), the tindalized aloe lactic acid bacteria fermented powder (tindalized aloe-derived lactic acid bacteria fermented product) is prepared by mixing the tindalized lactic acid bacteria fermentation liquid and the lactic acid bacteria disrupted liquid.
상기 건조는 동결건조 또는 분무건조하는 것일 수 있다.The drying may be lyophilization or spray drying.
본 발명은 시알산 함량이 증가된 신규 알로에 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 뇌기능(인지기능 또는 기억능력) 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 시알산 함량이 증가된 신규 알로에 유산균 발효물은 아세틸콜린을 파괴하여 신경전달을 억제하는 아세틸콜린 분해효소의 활성을 저해하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 스코폴라민으로 유도된 기억력 손상 동물모델의 기억력 및 인지능력에 대한 회복 능력이 우수하므로, 알츠하이머성 치매 등의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 저하된 기억력, 학습능력 및 인지기능을 개선 또는 증진시키는 건강기능 식품 조성물 또는 약학적 조성물로도 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a composition for improving brain function (cognitive function or memory ability) containing, as an active ingredient, a novel fermentation product of aloe lactobacillus with increased sialic acid content, and the novel fermentation product with increased sialic acid content of the present invention. silver is not only excellent in inhibiting the activity of acetylcholine degrading enzyme, which inhibits neurotransmission by destroying acetylcholine, but also has excellent ability to restore memory and cognitive ability in animal models with memory impairment induced by scopolamine. It can be usefully used for the prevention or treatment of degenerative cranial nerve diseases such as Alzheimer's dementia, and can also be usefully used as a health functional food composition or pharmaceutical composition for improving or enhancing deteriorated memory, learning ability and cognitive function.
또한, 본 발명은 알로에 유래 유산균인 락토바실러스 갈리나룸 균주를 이용한 알로에 유래 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 뇌기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition for improving brain function comprising, as an active ingredient, a fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria using an aloe-derived lactic acid bacterium, Lactobacillus gallina room strain.
상기 뇌기능 개선용 식품 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 5 내지 20 중량부 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌기능 개선용 식품 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 5 내지 18 중량부, 5 내지 16 중량부, 5 내지 14 중량부, 5 내지 12 중량부 또는 5 내지 10 중량부를 포함하는 것일 수 있다.The fermented product of lactic acid bacteria derived from aloe may be included in an amount of 5 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the food composition for improving brain function. For example, 5 to 18 parts by weight, 5 to 16 parts by weight, 5 to 14 parts by weight, 5 to 12 parts by weight, or 5 to 10 parts by weight of the aloe-derived lactic acid bacteria fermented product with respect to 100 parts by weight of the food composition for improving brain function. It may include parts by weight.
더불어, 본 발명은 일실시예에서, 알로에 유래 유산균인 락토바실러스 갈리나룸 균주를 이용한 알로에 유래 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 뇌기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, in one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition for improving brain function comprising, as an active ingredient, a fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria using an aloe-derived lactic acid bacterium, Lactobacillus gallina room strain.
상기 뇌기능 개선용 약학적 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 40 내지 99 중량부 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌기능 개선용 약학적 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 40 내지 99 중량부, 40 내지 80 중량부, 40 내지 60 중량부, 60 내지 99 중량부 또는 80 내지 99 중량부를 포함하는 것일 수 있다. The aloe-derived lactic acid bacteria fermented product may contain 40 to 99 parts by weight based on 100 parts by weight of the pharmaceutical composition for improving brain function. For example, 40 to 99 parts by weight, 40 to 80 parts by weight, 40 to 60 parts by weight, 60 to 99 parts by weight, or 80 to 99 parts by weight of the aloe-derived lactic acid bacteria fermented product with respect to 100 parts by weight of the pharmaceutical composition for improving brain function. It may be one containing 99 parts by weight.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples and the like according to the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the examples presented below.
[실시예] [Example]
실시예 1: 알로에 유래 신규 유산균 분리 및 스크리닝Example 1: Isolation and screening of novel lactic acid bacteria derived from aloe
도 1은 실시예 1 내지 6의 틴달화 알로에 유산균 발효 분말의 제조공정을 나타낸 것이다.1 shows a manufacturing process of the fermented tindaled aloe lactobacillus powder of Examples 1 to 6.
도 1을 참조하면, 대한민국 제주도 성산읍에 위치한 (주)김정문알로에 제주 농공장으로부터 3 내지 5년 생육한 알로에 생잎을 샘플로 수집하여 서울대학교 미생물학과에서 유산균 분리 및 스크리닝 시험을 3개월간 위탁하여 실시하였다. 공시재료로는 알로에 3품종(베라, 사포나리아, 아보레센스), 희석액(0.1 % peptone water), 유산균 배양배지 (BCP-MRS, BS agar)를 사용하였고 실험방법은 각 알로에를 겉 껍질부분과 내부, 뾰족한 윗부분, 넓은 부분인 아랫부분으로 나누어 30g씩 시료를 채취 후 희석액 270mL 으로 stomacher로 균질화하였다. 균질화한 샘플들은 연속희석 후 혐기 유산균 분리를 위한 선택배지인 BS 배지와 BCP-MRS 배지에 시료를 분주 후 도말하였고, 37 ℃ 배양기에서 2 내지 7일 동안 배양 후 유산균을 분리하고 스크리닝을 완료하였다. 유산균 분리 및 스크리닝 완료 후 혐기균의 대량 중식을 위해서 혐기 jar를 이용해 혐기 상태에서 배양하였다.Referring to FIG. 1, samples were collected from fresh aloe leaves grown for 3 to 5 years from Kim Jeongmun Aloe Jeju Farm located in Seongsan-eup, Jeju-do, Korea, and lactic acid bacteria isolation and screening tests were consigned for 3 months to the Department of Microbiology at Seoul National University. . Three types of aloe (Vera, Saponaria, Arborescens), diluted solution (0.1% peptone water), and lactobacillus culture medium (BCP-MRS, BS agar) were used as test materials. Divided into the inside, the sharp upper part, and the wide lower part, samples were taken by 30g, and then homogenized with a stomacher with 270mL of the diluted solution. After serial dilution, the homogenized samples were plated on BS medium and BCP-MRS medium, which are selective media for anaerobic lactic acid bacteria isolation, and cultured for 2 to 7 days in a 37 ° C. incubator to separate lactic acid bacteria and complete screening. After the lactic acid bacteria were isolated and screened, they were cultured under anaerobic conditions using an anaerobic jar for mass reproduction of anaerobic bacteria.
배양결과, 도 2와 같이 알로에 베라 시료군의 유산균 배양 배지와 시료에서만 모두 2일차에서 BCP-MRS 배지 및 BS 배지 중 미세한 콜로니가 나타났고, 7일차까지 배양한 결과를 샘플로 제시되었다. 그러나, 알로에 사포나리아와 알로에 아보라센스 시료군의 두 유산균 배양 배지와 시료에서는 모두 배양 2일차와 배양 7일차에서 콜로니가 나타나지 않았다.As a result of the culture, as shown in FIG. 2, fine colonies appeared in the BCP-MRS medium and BS medium on the 2nd day only in the lactic acid bacteria culture medium and the samples of the Aloe vera sample group, and the culture results until the 7th day were presented as samples. However, no colonies appeared on the 2nd day and 7th day of culture in both the culture media and samples of the lactic acid bacteria in the Aloe saponaria and Aloe aboracense sample groups.
또한, 서울대학교 농생대 공동기기원에서 FE-SEM(field emission scanning electron microscope; SIGMA, Cal Zeiss, UK)을 촬영한 결과, 도 3과 같이 유산균의 전형적인 간균(rod shape) 형태적 특징을 보여주었다. In addition, as a result of taking FE-SEM (field emission scanning electron microscope; SIGMA, Cal Zeiss, UK) at the Joint Institute of Agriculture and Life Sciences of Seoul National University, as shown in FIG. 3, it showed typical rod shape morphological characteristics of lactic acid bacteria.
실시예 2: 알로에 유래 신규 유산균의 16S rRNA 시퀀스 분석 및 동정Example 2: 16S rRNA sequence analysis and identification of novel lactic acid bacteria derived from aloe
실시예 1로부터 수득한 알로에 유래 신규 유산균의 유전학적 동정을 위하여 미생물 동정 전문기관인 (주)마크로젠에 동정을 의뢰한 결과, 도 4, 도 5 및 하기 표 1과 같은 염기서열의 16S rRNA를 갖는 것으로 밝혀졌고, BLAST 프로그램을 이용하여 16S rRNA 염기서열을 GenBank의 데이터베이스에 등록된 염기서열과 대비하였을 때, 공지된 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum)과 도 6과 같이 염기서열 상 99%의 상동성을 갖는 것으로 확인되어 16S rRNA의 염기서열을 토대로 분자계통 분류학적으로 락토바실러스 갈리나룸인 것으로 판정되었다.For the genetic identification of the new aloe-derived lactic acid bacteria obtained from Example 1, the identification was requested to Macrogen Co., Ltd., an organization specializing in microbial identification, and was found to have 16S rRNA with the base sequence shown in FIGS. 4 and 5 and Table 1 below. When the 16S rRNA base sequence was compared with the base sequence registered in the GenBank database using the BLAST program, 99% homology on the base sequence with the known Lactobacillus gallinarum as shown in FIG. 6 It was confirmed to have, and it was determined to be Lactobacillus gallina room taxonomically based on the nucleotide sequence of 16S rRNA.
따라서, 신규한 김정문알로에 유래의 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum)이라는 의미로 균주명을 ‘KJM-ALOE2112’로 정하고, 이 균주를 도 7과 같이 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2021년 11월 15일자로 미생물안전기탁(번호: SD1458) 후 KRIBB(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)로부터 도 8과 같이 KJM-ALOE2112 균주를 2021년 12월 15일자로 특허기탁으로서 수탁번호 KCTC 14824BP를 부여받았다.Therefore, the name of the strain was set as 'KJM-ALOE2112' in the sense of Lactobacillus gallinarum derived from Kim Jung-moon's aloe, and this strain was submitted to the Microbial Resource Center of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology as shown in Figure 7 on November 15, 2021 After the microbiological safety deposit (number: SD1458) on the date, the KJM-ALOE2112 strain as shown in Figure 8 from KRIBB (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) was granted accession number KCTC 14824BP as a patent deposit on December 15, 2021.
[표 1][Table 1]
실시예 3: 알로에 다당체 추출물 취득Example 3: Acquisition of aloe polysaccharide extract
3 내지 5년 생육한 알로에 생잎을 (주)김정문알로에 제주 농공장으로부터 채취하여 KGMP 시설에서 정제수로 3회 세척 후 제피하여 수득한 알로에의 마쇄단계를 거쳐서 U-tech 특허 공법을 적용하여 점질상의 다당체 추출물을 취득하였다(품목신고 및 제조번호 : 1992063113512, 기타가공품). Fresh aloe leaves grown for 3 to 5 years are collected from Kim Jeong-moon Aloe Jeju Farm, washed 3 times with purified water in KGMP facility, peeled, and then subjected to the grinding step of the obtained aloe, and U-tech patented method is applied to obtain a viscous polysaccharide The extract was obtained (item declaration and manufacturing number: 1992063113512, other processed products).
본 발명에서 알로에의 약 98% 이상은 수분이며 고형부분의 대부분이 섬유질이나 다당류 등으로 구성되어 있어 보관상 알로에를 분말화하여 사용하는 것이 바람직하나 유산균 발효공정을 위해서는 100%의 알로에를 액상화하여 점질상의 다당체 추출물을 사용하였다. 액상화하는 방법으로는 알로에 잎의 껍질 부분을 제거한 후 얻은 생겔을 U-tech 특허 공법으로 추출한 후 활성탄 컬럼을 이용하여 안트라퀴논계 화합물 및 기타 색소들을 제거하여 알로에 다당체 추출물을 수득하였다.In the present invention, about 98% or more of aloe is water, and most of the solid part is composed of fibers or polysaccharides, so it is preferable to use powdered aloe for storage. A polysaccharide extract of the phase was used. As a liquefaction method, the green gel obtained after removing the bark of the aloe leaf was extracted using a U-tech patented method, and anthraquinone-based compounds and other pigments were removed using an activated carbon column to obtain an aloe polysaccharide extract.
알로에 제품군의 건강기능식품으로서 일일섭취량은 식품의약품안전처 고시 기준으로 총 다당체 함량이 100 내지 200mg/20g을 함유하고 있어야 하므로 10 중량% 이상의 함유량을 가진 알로에 다당체 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.As a health functional food of the aloe family, the daily intake should contain 100 to 200mg/20g of total polysaccharide content according to the Ministry of Food and Drug Safety, so it is preferable to use an aloe polysaccharide extract having a content of 10% by weight or more.
실시예 4: 알로에 유래 신규 유산균 전배양액 제조Example 4: Preparation of new lactic acid bacteria pre-culture solution derived from aloe
본 발명에 사용한 알로에 유래 유산균은 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP)으로 신규 균주로 등재되었다. The aloe-derived lactic acid bacteria used in the present invention was registered as a new strain as Lactobacillus gallinarum KJM-ALOE2112, KCTC 14824BP.
본 발명의 알로에 유래 유산균 전배양 배지는 MRS 배지(1.00% Pancreatic digest of gelatin, 0.80% Beef extract, 2.00% Dextrose, 0.20% Dipotassium phosphate, 0.10% Polysorbate 80, 0.50% Sodium acetate, 0.20% Ammonium citrate, 0.02% Magnesium sulfate, 0.01% Manganese sulfate, 95.18% Water)를 조제하여 121℃에서 15분 동안 멸균 후 냉각시키고 락토바실러스 갈리나룸 균주를 상기 배지에 접종하여 37℃, 90rpm에서 28시간 동안 진탕배양하여 1×1010 내지 1×1012 CFU/㎖ 이상의 유산균 수를 확보한 후 유산균 전배양액을 수득하였다.The aloe-derived lactic acid bacteria pre-culture medium of the present invention is MRS medium (1.00% Pancreatic digest of gelatin, 0.80% Beef extract, 2.00% Dextrose, 0.20% Dipotassium phosphate, 0.10% Polysorbate 80, 0.50% Sodium acetate, 0.20% Ammonium citrate, 0.02% % Magnesium sulfate, 0.01% Manganese sulfate, 95.18% Water) was prepared, sterilized at 121 ° C for 15 minutes, cooled, and Lactobacillus gallina room strain was inoculated into the medium and cultured with shaking at 37 ° C and 90 rpm for 28 hours to obtain 1 × After securing the number of lactic acid bacteria of 10 10 to 1 × 10 12 CFU / ㎖ or more, a lactic acid bacteria pre-culture solution was obtained.
실시예 5: 알로에 유래 유산균 발효액 제조Example 5: Preparation of aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth
본 발명에 사용되는 알로에 유래 유산균 발효액은 하기와 같이 제조하였다. 먼저, 실시예 3에서 수득한 95.18%의 알로에 다당체 추출물의 pH를 6.0으로 보정 후 농도를 10 내지 20° Brix로 조정하였다. 알로에 다당체 추출물에 MRS 배지성분(1.00% Pancreatic digest of gelatin, 0.80% Beef extract, 2.00% Dextrose, 0.20% Dipotassium phosphate, 0.10% Polysorbate 80, 0.50% Sodium acetate, 0.20% Ammonium citrate, 0.02% Magnesium sulfate, 0.01% Manganese sulfate)과 제비집 분말을 1.0 내지 10.0%를 첨가하고 121℃에서 15분 동안 고압멸균 하였다. 이렇게 제조된 발효배지를 냉각하고 상기 실시예 4에서 얻은 알로에 유래 유산균 전배양액을 1.0 내지 5.0% 접종하고 37℃, 90rpm에서 68 내지 76시간 진탕배양하여 알로에 유래 유산균 발효액을 수득하였다.The fermentation broth of aloe-derived lactic acid bacteria used in the present invention was prepared as follows. First, the pH of the 95.18% aloe polysaccharide extract obtained in Example 3 was corrected to 6.0, and then the concentration was adjusted to 10 to 20° Brix. MRS medium components (1.00% Pancreatic digest of gelatin, 0.80% Beef extract, 2.00% Dextrose, 0.20% Dipotassium phosphate, 0.10% Polysorbate 80, 0.50% Sodium acetate, 0.20% Ammonium citrate, 0.02% Magnesium sulfate, 0.01 % Manganese sulfate) and 1.0 to 10.0% of bird's nest powder were added and autoclaved at 121°C for 15 minutes. The fermentation medium thus prepared was cooled, and 1.0 to 5.0% of the pre-culture of the aloe-derived lactic acid bacteria obtained in Example 4 was inoculated and cultured with shaking at 37° C. and 90 rpm for 68 to 76 hours to obtain a fermentation broth of the aloe-derived lactic acid bacteria.
실시예 6: 알로에 유래 유산균 발효액의 틴달화 및 균체 파쇄 후 발효분말 제조Example 6: Production of fermented powder after tindalization of aloe-derived lactic acid bacteria fermented liquid and cell disruption
본 발명의 알로에 유래 유산균 발효액의 틴달화는 상기 실시예 5로부터 얻은 발효액 중 발효 후 살아있는 유산균을 사균화하는 방법으로서, 알려진 발효액의 틴달화 방법은 어느 방법이든 무방하게 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 알로에 유래 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60분간 가열하고, 20 내지 40℃ 또는 20℃ 이하로 급속 냉각하여 사멸시키는 방법인 간헐멸균법으로 틴달화하는 방법을 사용하였다. The tindalization of the fermentation broth of aloe-derived lactic acid bacteria of the present invention is a method for killing live lactic acid bacteria after fermentation in the fermentation broth obtained in Example 5. Any known method for tindalization of the fermentation broth can be used, but in the present invention, aloe A method of tindalization by intermittent sterilization, which is a method of heating the derived lactic acid bacteria fermentation broth at 60 to 150 ° C. for 10 to 60 minutes and rapidly cooling to 20 to 40 ° C. or below 20 ° C., was used.
또한 본 발명의 상기 실시예 5로부터 얻은 알로에 유래 유산균 발효액 중의 유산균 파쇄방법은 유산균의 총균수가 5.0 내지 8.0×109 CFU/㎖ 이상이 되었을 때 발효액을 8,000rpm으로 30분간 연속식 원심분리기(Continuous Centrifuge, J-075AT, MDM Co., Ltd, Korea)에 연결하여 원심분리 후 발효액과 균체를 각각 분리한 다음, 분리된 균체를 5 내지 10배수의 멸균수로 희석하여 균체를 40% amplitude, pulse on 20sec, off 10sec, 15℃, 25분(Vibracell, VCX2500, SONICS, USA)의 조건으로 파쇄하였다. 여기서 얻어진 파쇄물은 상기와 같은 방법으로 다시 한번 원심분리하여 세포 침전물(cell debris)은 제거하고 상등액을 최종적인 유산균 파쇄물로 획득하여 알로에 발효액과 합쳐서 알로에 유산균 발효분말을 제조하는데 사용하였다. 이때, 세포 침전물을 이루는 성분은 소수성의 세포벽 성분들이 대부분이고, 상등액을 이루는 성분은 유산균 세포를 구성하는 성분으로 뮤레인(murein)이라 불리는 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 시알산(sialic acid) 그리고 세포막 성분인 다당류(polysaccharide), 세포내 단백질(intercellular protein), 여러 종류의 세포내 효소(intercellular enzymes) 등으로 면역 및 뇌세포 증강 효과와 관련한 중요한 물질들이었다.In addition, in the method of disrupting lactic acid bacteria in the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth obtained from Example 5 of the present invention, when the total number of lactic acid bacteria reaches 5.0 to 8.0 × 10 9 CFU/mL or more, the fermentation broth is continuously centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes (Continuous Centrifuge, J-075AT, MDM Co., Ltd, Korea) to separate fermentation broth and cells after centrifugation, and then dilute the separated cells with 5 to 10 times sterile water to obtain 40% amplitude, pulse On 20 sec, off 10 sec, 15 ℃, 25 minutes (Vibracell, VCX2500, SONICS, USA) conditions were crushed. The lysate obtained here was centrifuged again in the same way as above to remove cell debris, and the supernatant was obtained as the final lactic acid bacteria lysate, which was then combined with the aloe fermented liquid to prepare a fermented aloe lactic acid bacteria powder. At this time, most of the components constituting the cell sediment are hydrophobic cell wall components, and the components constituting the supernatant are components constituting lactic acid bacteria cells, which include peptidoglycan called murein, sialic acid, and Cell membrane components such as polysaccharide, intercellular protein, and various types of intercellular enzymes were important substances related to the immune and brain cell enhancement effects.
또한, 상기 틴달화 알로에 유래 유산균 발효액과 유산균 파쇄 혼합액 중량의 0.01~0.1%로 감압 농축하여 동결건조(freeze drying)하거나 말토덱스트린(maltodextrin) 등과 같은 포접제를 사용하여 분무건조(spray drying)하였고, 상기 건조된 분말을 최종 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말 시료로 사용하였다.In addition, 0.01 to 0.1% of the weight of the mixture of the tindal aloe-derived lactic acid bacteria fermented liquid and the lactic acid bacteria crushed mixture was concentrated under reduced pressure and freeze-dried or spray-dried using an inclusion agent such as maltodextrin, The dried powder was used as a final sample of the fermented lactic acid bacteria derived from tindaled aloe.
실시예 7: 알로에 유래 유산균 발효 전후의 시알산 성분 분석Example 7: Sialic acid component analysis before and after fermentation of aloe-derived lactic acid bacteria
상기 실시예 1 내지 6의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말에 대한 발효 전후의 성분변화를 알아보고자 시알산(Sialic acid) 성분 함량을 측정하였다. 발효 전 시료는 상기 실시예 5에서 제비집 분말을 첨가하지 않은 시료를 사용하였다. 상기 시알산 성분 함량의 측정은, KOTITI시험연구원에 시알산 100μM 형광라벨 키트(Sialic acid fluorescence labeling Kit, Takara, Japan) 메뉴얼 방법으로 HPLC-FLD(1200, Agilent Technologies, USA) 기기분석을 의뢰한 결과, 도 9와 같이 알로에 유래 유산균 발효물이 비발효물보다 전체 시알산 함량이 전반적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는, 상기 실시예에 따라 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말은 제비집 분말 첨가에 의해 발효 대사물질 중 시알산의 함량이 증가된 것이다. In order to investigate the component change before and after fermentation of the fermented tindalhwa aloe-derived lactic acid bacteria powder prepared by the methods of Examples 1 to 6, the content of sialic acid was measured. As the sample before fermentation, the sample in Example 5 to which bird's nest powder was not added was used. The measurement of the content of the sialic acid component is the result of requesting HPLC-FLD (1200, Agilent Technologies, USA) instrumental analysis by the manual method of a 100 μM sialic acid fluorescence labeling kit (Sialic acid fluorescence labeling Kit, Takara, Japan) to KOTITI Testing & Research Institute. , as shown in FIG. 9, it was confirmed that the total sialic acid content of the fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria was generally higher than that of the non-fermented product. This is because the content of sialic acid among fermentation metabolites in the fermented tindaled aloe-derived lactic acid bacteria powder prepared according to the above example was increased by the addition of bird's nest powder.
시료 전처리 방법은 발효전후 분말에 0.05N 염산용액 0.5mL를 첨가하여 80℃에서 1시간 가열한 후, 증류수로 정용하고 시약 1(DMB solution), 시약 2(coupling solution), 증류수를 1:5:4의 비율로 혼합용액 제조하여 시료에 0.2mL씩 처리 및 차광조건에서 50℃에서 2시간 30분 반응 후 냉각하여 기기분석을 진행하였다. HPLC-FLD 기기분석 조건은 column(CAPCELL PAK, 4.6 x 250mm, Particle size 5μm), wavelength(excitation 373nm, emission 448nm), flow rate 0.9ml/min, injection volume 10μl, oven temperature 35℃, 이동상 용매(메탄올 : 아세트니트릴 : 정제수 = 7 : 8 : 85(v/v/v), run time 40분의 조건으로 분석하였다.The sample pretreatment method is to add 0.5 mL of 0.05N hydrochloric acid solution to the powder before and after fermentation, heat it at 80 ° C for 1 hour, and then use it with distilled water and mix reagent 1 (DMB solution), reagent 2 (coupling solution), and distilled water in a 1:5: A mixed solution was prepared at a ratio of 4, treated with 0.2 mL of each sample and reacted at 50 ° C. for 2 hours and 30 minutes under light-shielding conditions, followed by cooling to perform instrumental analysis. HPLC-FLD instrumental analysis conditions are column (CAPCELL PAK, 4.6 x 250mm, Particle size 5μm), wavelength (excitation 373nm, emission 448nm), flow rate 0.9ml/min, injection volume 10μl, oven temperature 35℃, mobile phase solvent (methanol) : Acetonitrile : Purified water = 7 : 8 : 85 (v / v / v), run time was analyzed under the condition of 40 minutes.
실시예 8: MTT 분석법을 이용한 in vitro 뇌신경세포 증식 평가Example 8: Evaluation of in vitro brain nerve cell proliferation using MTT assay
상기 실시예 1 내지 6의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말을 도 10의 상단에 제시한 실험방법과 같이 경희대학교 한방과학과에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) 분석을 진행하였고, 이를 통해 스코폴라민(scopolamine) 처리에 따른 뇌신경세포에 대한 보호 효과를 확인하였다. 뇌신경질환을 유발하는 스코폴라민(scopolamine)을 처리한 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y 세포에 상기 실시예 6에서 제조한 시료들을 처리하였다. 그 결과, 도 10의 하단에 개시한 바와 같이 왼쪽의 정상대조군은 스코폴라민 처리로 인해 세포 생존율이 감소한 반면, 본 발명의 각 생산 Lot. 별 시료들을 처리한 경우에는 양성대조군(Donepezil 1.0 내지 10μM)과 유사한 세포 생존율을 나타내었으며, 특히 시료 중 SA0, SA1, SA4가 SA2, SA3에 비해 1.0 내지 100μl의 농도 범위 내에서도 세포 생존율을 현저하게 증가시킨다는 것을 통해 신경세포 보호효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.The lactic acid bacteria fermented powder derived from tindalhwa aloe prepared by the method of Examples 1 to 6 was tested by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2 ,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) analysis was performed, and through this, the protective effect on brain neurons according to scopolamine treatment was confirmed. The samples prepared in Example 6 were treated with SH-SY5Y cells, a human neuroblastoma cell line treated with scopolamine, which induces cranial nerve disease. As a result, as shown at the bottom of FIG. 10, the normal control group on the left had reduced cell viability due to scopolamine treatment, whereas each production lot of the present invention. When different samples were treated, cell viability was similar to that of the positive control group (Donepezil 1.0 to 10 μM). In particular, SA0, SA1, and SA4 among the samples significantly increased cell viability compared to SA2 and SA3 within the concentration range of 1.0 to 100 μl. It was confirmed that the effect of protecting nerve cells was excellent.
실시예 9: DPPH 분석법을 이용한 in vitro 항산화 활성 평가Example 9: Evaluation of in vitro antioxidant activity using DPPH assay
상기 실시예 1 내지 6의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말을 도 11의 상단에 제시한 실험방법과 같이 경희대학교 한방과학과에서 항산화 활성을 측정하였다. 항산화 활성 실험은 각 생산 Lot. 별 시료별로 DPPH 소거 활성 측정 실험을 하였고, 양성대조군으로는 항산화제로 알려진 아스코르브산(ascrobic acid, Sigma-Aldrich, USA) 0.2 mg/ml를 사용하였다. 각 시료들과 아스코르브산은 각각 80μl와 0.1 mM DPPH 200 μL를 혼합하였고 25℃에서 30분간 방치한 후 530 nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 정도를 분석하였다. 이때 각 시료별로 도 11에 나타낸 바와 같이 각기 농도를 달리하여 분석하였다. 분석 결과, 도 11 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 시료들의 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가되는 것으로 나타났으나, SA1 시료가 DPPH IC50 값이 낮아 항산화 활성이 높고 실시예 8에 의한 세포 보호효과가 우수하여 본 실시예에 적합한 시료로 확인할 수 있었다.Antioxidant activity of the lactic acid bacteria fermented powder derived from tindalhwa aloe prepared by the methods of Examples 1 to 6 was measured at the Department of Oriental Science, Kyung Hee University, as in the experimental method shown at the top of FIG. 11 . Antioxidant activity tests were performed on each production lot. DPPH scavenging activity was measured for each sample, and 0.2 mg/ml of ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA) known as an antioxidant was used as a positive control. Each sample and ascorbic acid were mixed with 80 μl and 200 μl of 0.1 mM DPPH, respectively, left at 25 ° C for 30 minutes, and then the absorbance was measured at 530 nm to analyze the antioxidant level. At this time, each sample was analyzed by varying the concentration as shown in FIG. 11 . As a result of the analysis, as shown in FIG. 11 and Table 2 below, the antioxidant activity of each sample was found to increase in a concentration-dependent manner, but the SA1 sample had a low DPPH IC 50 value and high antioxidant activity and cell protection according to Example 8 The effect was excellent, and it could be confirmed as a sample suitable for this example.
[표 2][Table 2]
실시예 10: 총 글루타티온 in vitro 항산화 활성 평가Example 10: Evaluation of total glutathione in vitro antioxidant activity
세포 내 총 글루타티온 항산화 활성 실험은 실시예 9에서 SA1 시료가 DPPH IC50 값이 낮아 항산화 활성이 높고 실시예 8에 의한 세포 보호효과가 우수하여 본 실시예에 적합한 시료로 확인할 수 있었다. 본 실시예에서 글루타치온 환원효소는 상기 완충용액을 1×로 희석시켜 농도가 6units/mL가 되게 만들어 얼음에 채워 준비하였고, 시료에 가하기 직전에 다시 상기 완충용액으로 5배 희석하여 사용 하였다. 산화형 글루타티온(이하 "GSH"라 약칭함)과 환원형 글루타티온(이하 "GSSG"라 약칭함)의 표준용액은 1mM GSH와 1mM GSSG 용액을 만들어 2μM, 5μM, 10μM, 20μM, 30μM, 40μM로 희석하여 사용하였다. 총 글루타치온 정량을 위한 세포주 시료의 추출 및 SA1 시료의 처리구와 무처리구는 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y 세포로 실시하였으며 경희대학교 한방과학과에서 제공받았다. As for the total intracellular glutathione antioxidant activity test, the SA1 sample in Example 9 had a low DPPH IC 50 value, high antioxidant activity, and excellent cell protection effect according to Example 8, confirming that the sample was suitable for this example. In this example, glutathione reductase was prepared by diluting the buffer solution 1× to a concentration of 6 units/mL and filling it on ice, and was diluted 5-fold with the buffer solution immediately before adding to the sample. Standard solutions of oxidized glutathione (hereinafter abbreviated as "GSH") and reduced glutathione (hereinafter abbreviated as "GSSG") were diluted to 2μM, 5μM, 10μM, 20μM, 30μM, 40μM by making 1mM GSH and 1mM GSSG solutions. and used it. Extraction of cell line samples for quantification of total glutathione and treatment and non-treatment of SA1 samples were performed using SH-SY5Y cells, a human neuroblastoma cell line, provided by the Department of Oriental Science, Kyung Hee University.
GSSG의 정확한 측정을 위해서는 적당한 시약으로 GSH를 불활성화 시켜야 하는데, 본 발명에서는 GSH의 불활 성화제로서 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, 이하 “NEM”이라 약칭함)을 사용하였다. 분획을 위해서는 NEM의 최종농도가 50mM이 되도록 250mM NEM 100㎕를 첨가 후 2M KHCO3 용액 210㎕ 를 가하여 중화시킨 후 30분간 실온에서 반응시켰다. 정확하게 GSH와 GSSG를 정량하기 위해서는 이 NEM 반응의 완결 여부가 관건인데, NH2 칼럼을 사용하여 HPLC로 확인해 본 결과 NEM 처리 분획에는 GSH가 전혀 보이지 않으므로 반응이 완결되었음을 확인하였다(도 12).In order to accurately measure GSSG, it is necessary to inactivate GSH with an appropriate reagent. In the present invention, N-ethylmaleimide (hereinafter abbreviated as “NEM”) was used as a GSH inactivator. For fractionation, 100 μl of 250 mM NEM was added so that the final concentration of NEM was 50 mM, and 210 μl of 2M KHCO 3 solution was added to neutralize the mixture, followed by reaction at room temperature for 30 minutes. In order to accurately quantify GSH and GSSG, the completion of the NEM reaction is key. As a result of HPLC using an NH2 column, no GSH was observed in the NEM-treated fraction, confirming that the reaction was complete (FIG. 12).
SA1 시료 처리 SH-SY5Y 세포주 시료 내 총 글루타치온의 정량은 세포를 배양 후 원심분리하여 수거한 세포 덩어리 20mg을 500 ㎕의 5% PCA 용액에 넣어 균질화시키고 NEM을 처리한 후, 아래에 각 단계별로 기재한 글루타치온 정량방법에 따라 반응시키면서 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 기울기를 구하여 총 글루타치온과 GSSG의 표준곡선과 비교하여 세포주 시료 내 총 글루타치온(도 13(a)의 총 글루타치온 표준곡선으로부터)과 GSSG(도 13(b)의 GSSG 표준 곡선으로부터)의 양을 구하였다.SA1 sample treatment For quantification of total glutathione in SH-SY5Y cell line samples, 20 mg of the cell mass harvested by centrifugation after culturing the cells was homogenized in 500 μl of 5% PCA solution, treated with NEM, and described in each step below. While reacting according to one glutathione quantification method, the slope of the section in which absorbance increases in a straight line was obtained, and compared with the standard curve of total glutathione and GSSG, total glutathione in the cell line sample (from the total glutathione standard curve in FIG. 13 (a)) and GSSG ( from the GSSG standard curve in Fig. 13(b)) was obtained.
그 결과, 20 배로 희석한 SH-SY5Y 세포주 시료 내 총 글루타치온의 흡광도를 측정 후 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 분광 흡광도의 변화량이 74.49로 측정되었고, 이로부터 세포주 시료 내 총 글루타치온의 양을 구하기 위하여 도 13(a)의 총 글루타치온 표준곡선을 이용하여 상기 분광 흡광도의 변화량에 상응하는 총 글루타치온의 양을 환산한 결과 467.45nmole/㎖ 시료의 값을 얻었다. 또한, GSSG 역시 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 28.49의 분광 흡광도의 변화량을 얻었고, 도 13(b)의 GSSG 표준곡선으로부터 상기 기울기 값에 상응하는 GSSG의 양을 환산한 결과 9.63 nmole/㎖ 시료의 값을 얻었다.As a result, after measuring the absorbance of total glutathione in the 20-fold diluted SH-SY5Y cell line sample, the amount of change in spectral absorbance in the section where the absorbance increases linearly was measured to be 74.49. From this, to obtain the amount of total glutathione in the cell line sample As a result of converting the amount of total glutathione corresponding to the change in spectral absorbance using the total glutathione standard curve of FIG. 13 (a), a value of 467.45 nmole/ml was obtained. In addition, GSSG also measured absorbance in the same manner as above to obtain a change in spectral absorbance of 28.49, and as a result of converting the amount of GSSG corresponding to the slope value from the GSSG standard curve in FIG. 13 (b), 9.63 nmole/ml sample got the value of
반면에 총 글루타치온 정량을 위한 SH-SY5Y 세포주에 대한 SA1의 무처리구에서는 상기와 동일한 방법으로 20 배로 희석한 세포주 시료 내 총 글루타치온의 흡광도를 측정 후 흡광도가 일직선으로 증가하는 구간의 분광 흡광도의 변화량이 21.31로 측정되었고, 이로부터 세포주 시료 내 총 글루타치온의 양을 구하기 위하여 상기 도 13(a)의 총 글루타치온 표준곡선을 이용하여 분광 흡광도의 변화량에 상응하는 총 글루타치온의 양을 환산한 결과 66.71nmole/㎖ 시료의 값을 얻었다. 또한, GSSG 역시 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 4.89의 분광 흡광도의 변화량을 얻었고, 도 13(b)의 GSSG 표준곡선으로부터 상기 기울기 값에 상응 하는 GSSG의 양을 환산한 결과 1.37nmole/㎖ 시료의 값을 얻었다.On the other hand, in the SH-SY5Y cell line for quantification of total glutathione, SA1 untreated, after measuring the absorbance of total glutathione in the cell line sample diluted 20 times in the same way as above, the change in spectral absorbance in the section where the absorbance increases in a straight line was 21.31 , and the amount of total glutathione corresponding to the change in spectral absorbance was converted using the total glutathione standard curve of FIG. 13 (a) to obtain the amount of total glutathione in the cell line sample. got the value of In addition, GSSG also measured absorbance in the same manner as above to obtain a change in spectral absorbance of 4.89, and as a result of converting the amount of GSSG corresponding to the slope value from the GSSG standard curve in FIG. 13(b), 1.37 nmole/ml sample got the value of
결론적으로 SH-SY5Y 세포주 시료 내 총 글루타치온의 농도는 SA1의 처리구가 SA1의 무처리구 보다 6~7배 이상의 농도로 나타나, SA1 시료를 투여한 SH-SY5Y 세포주의 항산화 활성이 6~7배 이상 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.In conclusion, the concentration of total glutathione in the SH-SY5Y cell line sample was 6 to 7 times higher than that of the SA1 treated group, and the antioxidant activity of the SH-SY5Y cell line administered with the SA1 sample was 6 to 7 times higher. could confirm that
실시예 11: 총 시알산 in vitro 세포 내 유입량 평가Example 11: Evaluation of total sialic acid in vitro cell uptake
세포 내 총 시알산의 유입량 실험은 실시예 9에서 SA1 시료가 IC50 항산화 활성이 높고 실시예 8 내지 10에 의한 세포 증식 등 효과가 우수하여 본 실시예에 적합한 시료로 확인할 수 있었다. 본 실시예에서 총 시알산의 정량을 위한 세포주 시료의 추출 및 SA1 시료의 처리구와 무처리구는 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y 세포로 실시하였으며 경희대학교 한방과학과에서 제공받았다. In the experiment of total sialic acid influx into cells, the SA1 sample in Example 9 had high IC50 antioxidant activity and excellent cell proliferation and other effects according to Examples 8 to 10, confirming that the sample was suitable for this example. In this example, SH-SY5Y cells, a human neuroblastoma cell line, were used to extract cell line samples for quantification of total sialic acid, and treatment and non-treatment of SA1 samples were provided by the Department of Oriental Science, Kyung Hee University.
SA1 시료의 처리구 및 무처리구는 HPLC 정량분석을 위해 아래와 같이 전처리하였다.Treatment and non-treatment of the SA1 sample were pretreated as follows for HPLC quantitative analysis.
1) 제공받은 SH-SY5Y 세포를 100㎕에 뉴라미니데이즈 5㎕ (1250 unit)와 완충액 150㎕를 넣고 수조에 넣어 반응을 진행하였다(37℃, 16h).1) To 100 μl of the provided SH-SY5Y cells, 5 μl (1250 units) of neuraminidase and 150 μl of buffer were added and placed in a water bath to proceed with the reaction (37° C., 16 h).
2) -40 내지 -42℃의 에탄올을 가하고 원심분리(14,000rpm, 4℃, 20분)하여 시알산이 분리된 당단백질을 제거하였다.2) Ethanol at -40 to -42°C was added and centrifuged (14,000 rpm, 4°C, 20 minutes) to remove glycoproteins from which sialic acid was separated.
3) PGC(porous graphitic carbon) 카트리지를 이용한 고체상 추출법을 통해 시료 내 염을 제거하고 시알산을 농축하였다.3) Salts in the sample were removed and sialic acid was concentrated through solid phase extraction using a PGC (porous graphitic carbon) cartridge.
위 전처리에서 얻은 시알산은 HPLC를 이용하여 정량분석을 수행하였다. 더 자세히는 희석된 시알산을 오토샘플러(4℃로 유지됨), 초고압 펌프 및 컬럼오븐으로 구성된 HPLC 시스템을 이용하였고, PGC 컬럼(100×2.1mm, 3㎛)을 사용하였고, 크로마토그래피 방법에 의한 분리는 최적화된 분리 조건에 따라 수행하였다. 시료를 로딩한 후 시알산 용출 농도구배 용액을 분당 0.3ml씩 흘려주었다. 농도 구배 용액은 (A)96.9% 물, 0.1% 포름산(v/v) 수액, 3.0% 아세토나이트릴 및 (B)9.9% 물, 90.0% 아세토나이트릴, 0.1% 포름산(v/v) 수액이고, 각각 아래 시간별/농도별로 처리하였다. 즉, 0% B, 0~0.5 min; 0~10% B, 0.5~6 min; 10~100% B, 6~8 min. 최종적으로 분석 컬럼은 0% B로 3분간 평형화하였다.Sialic acid obtained from the above pretreatment was quantitatively analyzed using HPLC. In more detail, an HPLC system consisting of an autosampler (maintained at 4 ° C), an ultra-high pressure pump and a column oven was used for diluted sialic acid, a PGC column (100 × 2.1 mm, 3 μm) was used, and a chromatographic method was used. Separation was performed according to optimized separation conditions. After loading the sample, the sialic acid eluting concentration gradient solution was flowed at a rate of 0.3 ml per minute. The gradient solutions are (A) 96.9% water, 0.1% formic acid (v/v) sap, 3.0% acetonitrile and (B) 9.9% water, 90.0% acetonitrile, 0.1% formic acid (v/v) sap. , respectively, treated by time/concentration below. That is, 0% B, 0-0.5 min; 0-10% B, 0.5-6min; 10-100% B, 6-8 min. Finally, the analytical column was equilibrated with 0% B for 3 minutes.
본 실시예에서는 도네페질(Donepezil 1.0mg/kg) 처리 세포 대조구(control구), SA1 세포 처리구, SA1 세포 무처리구에 대한 전처리 시료에 적용하여 NeuGc함량을 분석하기 위해서 도 14a는 산처리를 통하여 도네페질 처리 세포 대조구 내 시알산을 선택적으로 유리하고, PGC SPE를 통하여 간섭물질을 제거 후 정제된 시알산을 형광유도체화 과정을 거쳐 HPLC-FLD 시스템에 주입하여 분석한 결과이다. 그 결과, 도네페질 처리 세포 대조구에 함유된 NeuAc와 NeuGc를 동시에 정량할 수 있었으며, 세포 시료에 NeuAc는 1g당 22.4㎍, NeuGc는 1g당 22.4㎍ 수준으로 존재함을 확인할 수 있었다. 또한, 도 14b는 본 발명의 SA1 세포 처리구, SA1 세포 무처리구에 같은 방법을 적용하여 얻은 크로마토그램이다. 파란색 크로마토그램은 SA1 세포 무처리구에 적용하여 분석한 결과이며, 빨간색 크로마토그램은 SA1 세포 처리구를 적용한 결과이다. 그 결과, SA1 세포 처리구가 SA1 세포 무처리구 대비 약 10배 이상의 농도로 NeuGc 및 NeuAc가 존재함을 확인하였다.In this Example, in order to analyze the NeuGc content by applying to the pre-treated samples for the Donepezil (Donepezil 1.0mg/kg) treated cell control group, SA1 cell treated group, and SA1 cell untreated group, FIG. 14a is donepezil through acid treatment This is the result of analysis by selectively releasing sialic acid in the treated cell control group, removing interfering substances through PGC SPE, and then injecting the purified sialic acid into an HPLC-FLD system through a fluorescence induction process. As a result, NeuAc and NeuGc contained in the control cells treated with donepezil could be simultaneously quantified, and it was confirmed that NeuAc and NeuGc were present at levels of 22.4 μg/g and 22.4 μg/g in the cell sample. 14b is a chromatogram obtained by applying the same method to the SA1 cell-treated group and the SA1 cell-untreated group of the present invention. The blue chromatogram is the result of analysis applied to the SA1 cell untreated group, and the red chromatogram is the result of applying the SA1 cell treatment group. As a result, it was confirmed that NeuGc and NeuAc were present in the SA1 cell treated group at about 10 times higher concentrations than the SA1 cell untreated group.
실시예 12: AChE 활성에 대한 in vivo 효능 평가Example 12: In vivo efficacy evaluation for AChE activity
AChE 활성에 대한 in vivo 효능 실험은 실시예 9에서 SA1 시료가 항산화 활성이 높고 실시예 8 내지 11에 의한 세포 증식 등 효과가 우수하여 본 실시예에 적합한 시료로 확인할 수 있었다. 본 실시예에서는 도네페질(Donepezil 1.0mg/kg) 처리 세포 대조구 및 SA1(200 mg/kg)과 시알산(50 mg/kg)을 실험군으로 하여 경희대학교 한방과학과에서 AChE 활성에 대한 효능 비교를 다음과 같이 실시하였다. 실험동물로 5주령의 수컷 ICR 마우스(Orient Bio, 대한민국)를 구입하여 일주일의 적응기간을 유지하였다. 생체 내 AChE 활성 억제 효과를 비교하기 위하여 도네페질 처리 세포 대조구 및 SA1과 시알산을 각각의 마우스(각 군당 3마리)에 1회 경구 투여하였다. 각각의 물질을 투여한 후 6시간째에 해마를 분리한 후 1 M 인산 완충용액(pH 8.0)을 이용하여 균질화한 후 균질액을 획득하였다. 획득한 균질액은 Amplex red assay kit(Molecular probe, USA)를 이용하여 생체 내 AChE 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 15와 같이 도네페질 처리 세포 대조구와 시알산 처리구의 경우 AChE 활성 억제 효과가 미미한 반면에 SA1 처리군의 경우 약 71.5%의 상대적으로 높은 AChE 활성 억제효과를 나타내었다.In the in vivo efficacy test for AChE activity, the SA1 sample in Example 9 had high antioxidant activity and excellent cell proliferation and other effects according to Examples 8 to 11, and it was confirmed that the sample was suitable for this example. In this example, comparison of efficacy on AChE activity at the Department of Oriental Science, Kyung Hee University using Donepezil (Donepezil 1.0mg/kg) treated cell control group and SA1 (200 mg/kg) and sialic acid (50 mg/kg) as experimental groups was performed as follows: It was carried out as A 5-week-old male ICR mouse (Orient Bio, Korea) was purchased as an experimental animal and maintained for a week of adaptation. In order to compare the in vivo AChE activity inhibitory effect, control cells treated with donepezil and SA1 and sialic acid were orally administered once to each mouse (three mice in each group). 6 hours after administration of each substance, the hippocampus was separated and then homogenized using 1 M phosphate buffer (pH 8.0) to obtain a homogenate. The obtained homogenate was measured for AChE activity in vivo using Amplex red assay kit (Molecular probe, USA). As a result, as shown in FIG. 15, the control group treated with donepezil and the group treated with sialic acid showed little AChE activity inhibition effect, whereas the SA1 treatment group showed a relatively high AChE activity inhibition effect of about 71.5%.
실시예 13: 모리스 수중 미로시험을 통한 공간기억능력 회복 평가Example 13: Evaluation of spatial memory recovery through Morris water maze test
본 실시예에서는 실시예 9에서 SA1 시료가 항산화 활성이 높고 실시예 8 내지 11에 의한 세포 증식 등 효과가 우수할 뿐만 아니라 실시예 12에 의한 AChE 활성에 대한 in vivo 효능이 우수하여 본 실시예에 적합한 시료로 확인할 수 있었다. 따라서 본 실시예에서는 SA0 내지 SA4를 실험군으로 하고 스코폴라민 단독 처리군을 대조군으로 하여 경희대학교 한방과학과에서 모리스 수중 미로 시험을 통한 공간기억능력 회복 효과를 다음과 같이 실시하였다. 본 실험에 사용된 동물은 10주령의 체중 평균 26 g인 BLAB/C 수컷 마우스를 사용하였으며, 3마리씩 하나의 사육 케이스에 넣고 항온(23±2℃) 및 항습(50~55%)이 유지되며 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 실험실 환경에서 사육하면서 사료와 물은 자율적으로 섭취할 수 있게 공급하였다. 이들 마우스에게 1주일간 환경 적응기간을 거치게 한 후 각 시료를 100 mg/kg로 1일 2회 경구 투여하고 대조군(control)은 같은 양의 증류수를 경구 투여하였다. 그리고 5일간 수중미로 학습 후 플랫폼을 제거하고 마우스들이 플랫폼의 위치를 얼마나 정확히 기억하는지에 따라 공간기억력의 정도를 측정하였으며, 단기기억능력은 수중 미로 학습 후 14일째, 장기기억능력은 21일째에 측정하였다. 기억능력측정 30분 전에 스코폴라민(scopolamine) 2 mg/kg를 IP(intraperitoneal)로 투여하였다. 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 스코폴라민 단독 처리군에서는 기억력 손상으로 인해 마우스가 플랫폼의 위치를 찾기 위해 수많은 방향 전환을 시도할 뿐만 아니라 동선의 길이가 복잡하고 머무름 시간(54초)도 증가하였다. 반면에, 본 발명의 시료(SA0~SA4) 처리군에서는 방향 전환 횟수 및 동선의 길이가 다소 감소하였으며 머무름 시간도 줄어든 것을 알 수 있었다. 더욱이, 본 발명의 시료들 중에 실시예 9의 SA1 시료를 경구 투여한 경우에, SA0, SA2, SA3, SA4 보다 스코폴라민으로 인해 손상된 단기기억능력이 현저하게 회복된 것을 확인할 수 있었다. 장기기억능력 분석 결과에서도 마찬가지로, 시료들 중에 본 발명의 SA1을 경구 투여한 경우에 스코폴라민으로 인해 손상된 장기기억능력이 현저하게 회복된 것을 알 수 있었다(도 16).In this example, the SA1 sample in Example 9 has high antioxidant activity and excellent effects such as cell proliferation according to Examples 8 to 11, as well as excellent in vivo efficacy for AChE activity according to Example 12, A suitable sample was identified. Therefore, in this example, SA0 to SA4 were used as the experimental group and the scopolamine-only treated group as the control group, and the spatial memory recovery effect through the Morris water maze test was performed at the Department of Oriental Science, Kyung Hee University as follows. The animals used in this experiment were 10-week-old BLAB/C male mice with an average body weight of 26 g, and 3 animals were placed in one breeding case, and constant temperature (23 ± 2 ° C) and constant humidity (50-55%) were maintained. Feed and water were supplied autonomously while rearing in the same laboratory environment, alternating day and night at 12-hour intervals. After allowing these mice to undergo an environmental adaptation period for one week, each sample was orally administered twice a day at 100 mg/kg, and the control group was orally administered with the same amount of distilled water. After learning the water maze for 5 days, the platform was removed, and the degree of spatial memory was measured according to how accurately the mice remembered the location of the platform. did 2 mg/kg of scopolamine was administered IP (intraperitoneal) 30 minutes before memory capacity measurement. As a result, compared to the control group not treated with anything, in the group treated with scopolamine alone, not only did the mice try numerous directions to find the location of the platform due to memory impairment, but also the length of the movement line was complicated and the retention time (54 seconds) was shorter. increased. On the other hand, in the sample (SA0 to SA4) treatment group of the present invention, it was found that the number of direction changes and the length of the copper wire were slightly decreased, and the retention time was also reduced. Moreover, when the SA1 sample of Example 9 was orally administered among the samples of the present invention, it was confirmed that the short-term memory ability damaged by scopolamine was remarkably recovered compared to SA0, SA2, SA3, and SA4. Similarly, in the results of long-term memory analysis, it was found that the long-term memory ability damaged by scopolamine was remarkably restored when SA1 of the present invention was orally administered among the samples (FIG. 16).
실시예 14: Aβ(amyloid-β) 활성에 대한 in vivo 효능 평가Example 14: In vivo efficacy evaluation for Aβ (amyloid-β) activity
본 실시예에서는 실시예 9에서 SA1 시료가 항산화 활성이 높고 실시예 8 내지 11에 의한 세포 증식 등 효과가 우수할 뿐만 아니라 실시예 12 내지 13에 의한 AChE 활성과 공간기억력 능력에 대한 in vivo 효능이 우수하여 본 실시예에 적합한 시료로 확인할 수 있었다. 따라서 실시예 9의 SA1 처리군을 실험군으로 하고 무처리군을 대조군으로 하여 경희대학교 한방과학과에서 아밀로이드 베타 단백질 유도 치매 rat 모델에서 해마 부위의 조직학적 검사를 다음과 같이 실시하였다. 행동학적 검사가 끝난 rat는 다이에틸 에스터로 마취한 뒤 복강을 열어 심장을 통하여 염수로 관류하였다. 이후 뇌를 적출하여 10% 중성의 완충용 포르말린에 고정시킨 뒤 헤마톡실린&에오신 염색을 통해 해마 부위의 신경 세포의 퇴화 정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 15와 같이 아밀로이드 베타 단백질을 뇌실 내 처리한 군을 보면 아무것도 처리하지 않은 군에 비하여 해마의 치상회(dentate gyrus) 부위의 기억과 관련된 피라미드 세포(pyramidal cell)의 퇴화가 관찰되었다. SA1을 200 mg/kg 농도로 4주간 투여한 군에서는 그 손상 정도가 약하게 나타났다. In this example, the SA1 sample from Example 9 has high antioxidant activity and excellent effects such as cell proliferation according to Examples 8 to 11, as well as in vivo efficacy on AChE activity and spatial memory ability according to Examples 12 to 13. It was excellent and could be confirmed as a sample suitable for this example. Therefore, using the SA1 treatment group of Example 9 as the experimental group and the untreated group as the control group, a histological examination of the hippocampus was performed in a rat model with amyloid beta protein-induced dementia at the Department of Oriental Science, Kyung Hee University as follows. After the behavioral examination, rats were anesthetized with diethyl ester, and then the abdominal cavity was opened and saline was perfused through the heart. Then, the brain was removed, fixed in 10% neutral buffered formalin, and the degree of degeneration of neurons in the hippocampus was observed through hematoxylin & eosin staining. As a result, in the group treated with amyloid beta protein in the ventricle, as shown in FIG. 15, degeneration of memory-related pyramidal cells in the dentate gyrus of the hippocampus was observed compared to the group not treated with anything. In the group administered SA1 at a concentration of 200 mg/kg for 4 weeks, the degree of damage was weak.
실시예 15: 뇌기능 개용선 식품 또는 약학적 조성물의 제조Example 15: Preparation of food or pharmaceutical composition for improved brain function
1. 뇌기능 개선용 식품 조성물1. Food composition for improving brain function
상기 실시예 9로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말(SA1)에 하기 성분을 물과 혼합하여 통상의 방법으로 음료를 제조하되, 총 100 ml로 맞춘 후 95 ℃에서 15초간 살균 및 냉각하여 드링크제를 제조하였다.The following components were mixed with water in the tindal aloe-derived lactic acid bacteria fermented powder (SA1) prepared in Example 9 to prepare a beverage in the usual way, but after setting the total to 100 ml, sterilizing and cooling at 95 ° C. for 15 seconds to make a drink was manufactured.
SA1 분말 ------------------- 10.0gSA1 powder ------------------- 10.0g
구연산 ---------------------- 1.0gCitric acid ---------------------- 1.0g
아라비아검 ------------------ 1.0gGum arabic ------------------ 1.0g
설탕 ------------------------ 5.0gSugar ------------------------ 5.0g
2. 뇌기능 개선용 약학적 조성물2. Pharmaceutical composition for improving brain function
하기 조성에 따라서 각각 정제, 캡슐제, 산제 및 주사제를 제조하였다. Tablets, capsules, powders and injections were prepared according to the following compositions, respectively.
1) 정제1) Refining
실시예 9로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말(SA1) 500.0 ㎎500.0 mg of lactic acid bacteria fermented powder (SA1) derived from tindalhwa aloe prepared in Example 9
유당 ------------------------------------------------- 500.0 ㎎Lactose ------------------------------------------------- 500.0mg
탈크 --------------------------------------------------- 5.0 ㎎Talc ------------------------------------------------- -- 5.0 mg
마그네슘 스테아레이트 ---------------------------------- 1.0 ㎎Magnesium Stearate ---------------------------------- 1.0 mg
2) 캡슐제2) Capsules
실시예 9로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말(SA1) 500.0 ㎎500.0 mg of lactic acid bacteria fermented powder (SA1) derived from tindalhwa aloe prepared in Example 9
전분 1500 --------------------------------------------- 10.0 ㎎Starch 1500 --------------------------------------------- 10.0 mg
스테아르산마그네슘 ----------------------------------- 100.0 ㎎Magnesium Stearate ----------------------------------- 100.0 mg
3) 산제3) powder
실시예 9로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말(SA1) 500.0 ㎎500.0 mg of lactic acid bacteria fermented powder (SA1) derived from tindalhwa aloe prepared in Example 9
유당 ------------------------------------------------- 100.0 ㎎Lactose ------------------------------------------------- 100.0 mg
탈크 --------------------------------------------------- 5.0 ㎎Talc ------------------------------------------------- -- 5.0 mg
4) 주사제4) Injectables
실시예 9로 제조된 틴달화 알로에 유래 유산균 발효분말(SA1) 50.0 ㎎50.0 mg of lactic acid bacteria fermented powder (SA1) derived from tindalhwa aloe prepared in Example 9
산화방지제 -------------------------------------------- 1.0 ㎎Antioxidants -------------------------------------------- 1.0 mg
트윈 80 ----------------------------------------------- 1.0 ㎎Tween 80 ----------------------------------------------- 1.0 mg
주사용 증류수 ------------------------------------ 2.0 ㎖ 이하Distilled water for injection ------------------------------------ 2.0 ml or less
Claims (12)
(b) 알로에로부터 취득된 알로에 다당체 추출물에 MRS 배지 및 제비집 분말을 첨가하여 알로에 다당체 추출물 발효배지를 제조하는 단계;
(c) 상기 알로에 다당체 추출물 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 유래 유산균 발효액을 제조하는 단계;
(d) 상기 알로에 유래 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계;
(e) 상기 알로에 유래 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및,
(f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유래 유산균 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
(a) preparing a pre-culture solution of lactic acid bacteria by inoculating lactic acid bacteria isolated from fresh aloe leaves into an MRS medium;
(b) preparing an aloe polysaccharide extract fermentation medium by adding MRS medium and bird's nest powder to the aloe polysaccharide extract obtained from aloe;
(c) preparing an aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth by inoculating the lactic acid bacteria pre-culture solution into the fermentation medium of the aloe polysaccharide extract and fermenting the solution;
(d) tyndallizing the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth;
(e) crushing the lactic acid bacteria in the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth to form a lactic acid bacteria disruption solution; and,
(f) A method for producing a composition for improving brain function comprising mixing the tindalized lactic acid bacteria fermented liquid and the lactic acid bacteria disrupted liquid and then drying to prepare a tindalized lactic acid bacteria fermented product derived from aloe.
상기 (a)단계에서 알로에 생잎에서 유산균을 분리하는 것은,
알로에 생잎에서 유산균을 분리하는 단계;
상기 분리된 유산균을 동정하는 단계; 및,
상기 분리 및 동정된 유산균을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
Separating lactic acid bacteria from fresh aloe leaves in step (a),
Separating lactic acid bacteria from fresh aloe leaves;
Identifying the isolated lactic acid bacteria; and,
Method for producing a composition for improving brain function, comprising the step of culturing the isolated and identified lactic acid bacteria in a medium.
상기 (b)단계에서 알로에 다당체 추출물을 취득하는 것은,
알로에를 수확 및 전처리하는 단계; 및
상기 전처리 알로에에서 점액질의 알로에 다당체 추출물을 취득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
Obtaining the aloe polysaccharide extract in step (b),
Harvesting and pre-treating aloe; and
A method for preparing a composition for improving brain function, comprising the step of obtaining a mucilaginous aloe polysaccharide extract from the pretreated aloe.
상기 (b)단계에서 알로에 다당체 추출물은 pH를 pH6으로 보정하고, 농도를 10 내지 20°Birx로 조정하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
In the step (b), the pH of the aloe polysaccharide extract is corrected to pH6 and the concentration is adjusted to 10 to 20 ° Birx.
상기 (c)단계에서 유산균 전배양액은 1 내지 5중량%를 접종하고, 60 내지 80시간 동안 진탕배양하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
In step (c), 1 to 5% by weight of the pre-cultured lactic acid bacteria is inoculated and cultured with shaking for 60 to 80 hours to ferment.
상기 (d)단계에서 알로에 유래 유산균 발효액을 틴달화하는 단계는,
상기 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60분 동안 가열; 및
40℃ 이하로 급속 냉각하여 상기 유산균 발효액 중 살아있는 유산균을 사멸시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
The step of tindalizing the aloe-derived lactic acid bacteria fermentation broth in step (d),
Heating the lactic acid bacteria fermentation broth at 60 to 150 ° C. for 10 to 60 minutes; and
A method for producing a composition for improving brain function, comprising rapidly cooling to 40 ° C. or less to kill live lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria fermentation broth.
상기 유산균은 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum)인 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
The method for producing a composition for improving brain function, characterized in that the lactic acid bacteria is Lactobacillus gallinarum.
상기 알로에는 알로에 베라, 알로에 아보레센스 및 알로에 사포나리아로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종인 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 조성물의 제조방법.
According to claim 1,
The method for preparing a composition for improving brain function, characterized in that the aloe is at least one species selected from the group consisting of aloe vera, aloe arborescens and aloe saponaria.
A food composition for improving brain function comprising, as an active ingredient, a fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria using an aloe-derived lactic acid bacterium, Lactobacillus gallina room strain.
상기 뇌기능 개선용 식품 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 5 내지 20 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 식품 조성물.
According to claim 9,
The food composition for improving brain function, characterized in that it contains 5 to 20 parts by weight of the fermented product of the aloe-derived lactic acid bacteria with respect to 100 parts by weight of the food composition for improving brain function.
A pharmaceutical composition for improving brain function comprising, as an active ingredient, a fermented product of aloe-derived lactic acid bacteria using an aloe-derived lactic acid bacterium Lactobacillus gallina room strain.
상기 뇌기능 개선용 약학적 조성물 100 중량부에 대하여 상기 알로에 유래 유산균 발효물은 40 내지 99 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌기능 개선용 약학적 조성물.According to claim 11,
The pharmaceutical composition for improving brain function, characterized in that it comprises 40 to 99 parts by weight of the fermented product of the aloe-derived lactic acid bacteria with respect to 100 parts by weight of the pharmaceutical composition for improving brain function.
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