KR20230116487A - Method and kit for detecting omicron variant of coronavirus using loop-mediated isothermal amplification - Google Patents
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Abstract
본 발명의 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트 및 방법은 고리매개 등온증폭법을 이용하여 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있다. 또한, 본 발명은 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트의 조합을 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행하면 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우에 비해 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 훨씬 높은 민감도로 검출할 수 있다.The coronavirus omicron mutant test kit and method of the present invention can accurately distinguish and detect the omicron mutant strain of coronavirus from other mutant strains of SARS-CoV-2 coronavirus using the loop-mediated isothermal amplification method, and can detect the coronavirus It can detect all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains with high sensitivity, including the Omicron mutant strain of . In addition, the present invention performs loop-mediated isothermal amplification using a combination of a primer set for loop-mediated isothermal amplification for detecting an omicron mutant of coronavirus and a primer set for loop-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus The Omicron mutant strain of coronavirus can be accurately distinguished and detected from other SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains, and ring-mediated isothermal amplification is performed using a primer set for detecting SARS-CoV-2 coronavirus in the prior art. It can detect the SARS-CoV-2 coronavirus with a much higher sensitivity than in one case.
Description
본 발명은 고리매개 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있는 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a kit and method for testing an omicron mutant strain of coronavirus using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, and more particularly, to a test kit and method for an omicron mutant strain of coronavirus using other SARS-CoV-2 strains. It relates to a coronavirus omicron mutant test kit and method capable of accurately distinguishing and detecting all SARS-CoV-2 coronavirus mutants, including omicron mutants of coronavirus, with high sensitivity. .
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR(polymerase chain reaction) 방식과 달리 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하여 검사시간을 대폭 단축할 수 있고, 고가의 리얼타임 PCR 장비 없이도 저가의 휴대용 항온 장비로 검사가 가능하여 소규모의 진단실이나 현장에서도 검사가 가능하면서도 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우 보다 검출 민감도가 훨씬 높은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다. In addition, unlike the real-time PCR (polymerase chain reaction) method, the present invention can amplify high-concentration genes in a short time, so the test time can be greatly shortened, and the test can be performed with low-cost portable thermostat equipment without expensive real-time PCR equipment SARS-CoV-2 coronavirus detection with much higher detection sensitivity than when ring-mediated isothermal amplification is performed using the prior art primer set for SARS-CoV-2 coronavirus detection, while enabling testing in a small diagnostic room or on-site It relates to a primer set for ring-mediated isothermal amplification for
2021년 11월 24일 남아프리카 공화국에서는 새로운 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변종인 B.1.1.529 변이주(코로나바이러스의 오미크론 변이주)의 확인을 세계보건기구(WHO)에 보고하였다. B.1.1.529 변이주(코로나바이러스의 오미크론 변이주)는 2021년 11월 11일 남아프리카 공화국 보츠와나에서 수집된 표본에서 처음 확인되었다. 최초 보고 이후, B.1.1.529 변이주(코로나바이러스의 오미크론 변이주)는 여러 유럽 국가와 호주, 브라질, 캐나다, 홍콩, 이스라엘, 일본, 나이지리아, 노르웨이, 스웨덴 및 영국의 여행 관련 사례에서도 감지되었고, 현재 국내에서도 B.1.1.529 변이주(코로나바이러스의 오미크론 변이주) 감염자가 급격하게 늘고 있다. On November 24, 2021, South Africa reported to the World Health Organization (WHO) the confirmation of a new SARS-CoV-2 coronavirus variant, the B.1.1.529 variant (Omicron variant of coronavirus). The B.1.1.529 variant (Omicron variant of coronavirus) was first identified in a specimen collected on 11 November 2021 in Botswana, South Africa. Since the initial report, the B.1.1.529 variant (Omicron variant of coronavirus) has been detected in several European countries and travel-related cases in Australia, Brazil, Canada, Hong Kong, Israel, Japan, Nigeria, Norway, Sweden and the United Kingdom; Currently, the number of people infected with the B.1.1.529 mutant strain (Omicron mutant strain of coronavirus) is rapidly increasing in Korea.
B.1.1.529 변이주(코로나바이러스의 오미크론 변이주)는 스파이크 단백질 치환과 관련하여 많은 변이를 가지고 있으며, 그 중 일부는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 및 다른 코로나바이러스 변이주에 작용가능한 단일클론 항체 치료제에 대한 감소된 감수성 또는 회복기와 관련되어 있고, 백신 접종을 한 경우에는 혈청의 항체 중화 능력이 감소되는 것으로 알려져 있다.The B.1.1.529 mutant strain (Omicron mutant strain of coronavirus) has many mutations related to spike protein substitution, some of which are monoclonal antibody therapeutics that can act on SARS-CoV-2 coronavirus and other coronavirus mutant strains. It is known to be associated with a reduced susceptibility or convalescent period to , and the ability of serum to neutralize antibodies is reduced when vaccinated.
SARS-CoV-2 코로나바이러스의 오미크론 변이주의 유전자 변이를 보게 되면 다수의 변이들 중 S 단백질 유전자 염기서열의 수용체 결합부위(receptor-binding domain, RBD)에 15개의 변이(G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H)가 확인되었고 이중 수용체 결합모티프(receptor-binding motif, RBM)에 10개 변이(N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H)가 모여있는 것으로 확인되었다. 이 중 N501Y는 ACE2 수용체에 대한 결합을 증가시켜 세포 내 바이러스 전달을 증가시킬 수 있으며 N501Y와 Q498R의 조합은 결합 친화도를 훨씬 더 증가시킬 수 있다. 하지만, 전체 변이를 종합적으로 판단해야만 정확한 친화도를 측정할 수 있으며 아직은 관련 데이터가 적어 정확한 판단은 어렵다.Looking at the genetic mutations of the Omicron mutant strain of the SARS-CoV-2 coronavirus, among the many mutations, 15 mutations (G339D, S371L, S373P, 10 mutations (N440K, G446S, S477N, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H) were confirmed to be gathered. Among them, N501Y can increase intracellular viral delivery by increasing binding to the ACE2 receptor, and the combination of N501Y and Q498R can further increase binding affinity. However, accurate affinity can be measured only when all mutations are comprehensively judged, and it is difficult to make an accurate determination due to the lack of related data.
한편, H655Y는 푸린 절단 부위에 인접하고 스파이크 절단을 증가시켜 전파를 도울 수 있으며, N679K는 푸린 절단 부위의 다염기성 특성 부위에 근접하고 이에 추가되는데, 스파이크 절단을 증가시킬 수 있고 전파를 도울 수 있다. 또한, P681H는 감염을 증가시킬 수 있는 스파이크 절단을 향상시키는 것으로 나타나는데, 이 돌연변이는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 알파 변이주에서 발견되었고, 이 위치의 대체 돌연변이(P681R)는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 델타 변이주에서 발견되었다.On the other hand, H655Y is adjacent to the furin cleavage site and can help propagation by increasing spike cleavage, and N679K is close to and added to the polybasic characteristic site of the furin cleavage site, can increase spike cleavage and help propagation . In addition, P681H appears to enhance spike cleavage, which can increase infection; this mutation was found in the alpha mutant of the SARS-CoV-2 coronavirus, and an alternative mutation (P681R) at this location was found in the SARS-CoV-2 coronavirus. It was found in the delta mutant strain of the virus.
본 발명자는 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있는 코로나바이러스 검사 방법 및 키트를 개발하였다. The present inventors can accurately distinguish and detect the Omicron mutant strain of coronavirus from other SARS-CoV-2 coronaviruses, and can detect all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains, including the Omicron mutant strain of coronavirus, with high sensitivity. developed a coronavirus test method and kit.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.On the other hand, it should be understood that the matters described as the background art are not cited as an acknowledgment that they can be used as "prior art" of the present invention, only for improving understanding of the background of the present invention.
본 발명은 고리매개 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 이용하여 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있는 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.The present invention can accurately distinguish and detect an omicron mutant strain of coronavirus from other mutant strains of SARS-CoV-2 coronavirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and detects an erroneous strain of coronavirus. The purpose is to provide a test kit and method for the Omicron mutant strain of coronavirus that can detect all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains with high sensitivity, including micron mutant strains.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR(polymerase chain reaction) 방식과 달리 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하여 검사시간을 대폭 단축할 수 있고, 고가의 리얼타임 PCR 장비 없이도 저가의 휴대용 항온 장비로 검사가 가능하여 소규모의 진단실이나 현장에서도 검사가 가능하면서도 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우 보다 검출 민감도가 훨씬 높은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, unlike the real-time PCR (polymerase chain reaction) method, the present invention can amplify high-concentration genes in a short time, so the test time can be greatly shortened, and the test can be performed with low-cost portable thermostat equipment without expensive real-time PCR equipment SARS-CoV-2 coronavirus detection with much higher detection sensitivity than when ring-mediated isothermal amplification is performed using the prior art primer set for SARS-CoV-2 coronavirus detection, while enabling testing in a small diagnostic room or on-site The purpose is to provide a primer set for ring-mediated isothermal amplification for.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.However, the problems of the present invention as described above are illustrative, and the scope of the present invention is not limited thereby. Further, other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명자는 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있는 고리매개 등온증폭법 기반의 검사 방법 및 키트에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 코로나바이러스의 오미크론 변이주의 S 단백질 유전자 중 RBD(receptor-binding domain)내의 RBM(receptor-binding motif)을 코딩하는 염기서열의 변이들, 즉 S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, Y505H를 특이적으로 검출할 수 있는 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 개발하였다. 또한, 본 발명자는 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있는 표적 서열을 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자 서열 범위 내에서 선택한 후 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우 보다 검출 민감도가 훨씬 높은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 개발하였다. The present inventors can accurately distinguish and detect the Omicron mutant strain of coronavirus from other SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains, and can detect all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains, including the Omicron mutant strain of coronavirus, with high sensitivity. As a result of repeated research on test methods and kits based on the loop-mediated isothermal amplification method that can be used, coding for the receptor-binding motif (RBM) in the receptor-binding domain (RBD) of the S protein gene of the Omicron mutant strain of coronavirus A primer set for ring-mediated isothermal amplification capable of specifically detecting mutations in the nucleotide sequence of S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, Y505H was developed. In addition, the present inventors select target sequences capable of detecting all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains with high sensitivity, including Omicron mutant strains of coronavirus, within the ORF1ab gene sequence range of SARS-CoV-2 coronavirus, and then prior art A primer set for detecting SARS-CoV-2 coronavirus with much higher detection sensitivity than when ring-mediated isothermal amplification was performed using a primer set for detecting SARS-CoV-2 coronavirus was developed.
본 발명은 상기 2가지 프라이머 세트의 조합을 제공하며, 이러한 2가지 프라이머 세트의 조합을 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행하면 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, SARS-CoV-2 코로나바이러스를 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우 보다 훨씬 높은 민감도로 검출할 수 있다.The present invention provides a combination of the two primer sets, and when loop-mediated isothermal amplification is performed using the combination of these two primer sets, the omicron mutant strain of the coronavirus is accurately compared to the mutant strain of the other SARS-CoV-2 coronavirus. It can be detected separately, and the SARS-CoV-2 coronavirus can be detected with much higher sensitivity than when ring-mediated isothermal amplification is performed using the prior art SARS-CoV-2 coronavirus detection primer set.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체"란 감염 의심 환자의 상기도 점막, 콧속 점막, 객담, 타액, 콧물, 혈액, 눈물 외에도 코로나바이러스의 오미크론 변이주 및/또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 유전자 검출이 가능한 각종 시료, 예를 들어 다른 숙주동물의 조직, 세포, 혈액, 타액 등도 포함하는 개념으로 사용된다.As used herein, the term “specimen” refers to the upper respiratory tract mucosa, nasal mucosa, sputum, saliva, runny nose, blood, and tears of a patient suspected of infection, as well as the omicron mutant strain of coronavirus and/or the gene of SARS-CoV-2 coronavirus. It is used as a concept that includes various samples that can be detected, such as tissues, cells, blood, and saliva of other host animals.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 RNA, DNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "합성 유전자 서열"은 지금까지 알려진 코로나바이러스의 오미크론 변이주 및/또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 RNA 유전자 서열 뿐만아니라 RNA 유전자로부터 생성된 cDNA 서열로 구성될 수 있다.As used herein, the term "genetic sample" is used in a broad sense, including RNA, DNA, cDNA generated from RNA by reverse transcriptase, DNA or cDNA amplified through pre-PCR (pre-PCR), and the like. . In addition, "synthetic gene sequence" as used herein may consist of a cDNA sequence generated from an RNA gene, as well as an RNA gene sequence of an Omicron mutant strain of coronavirus and/or SARS-CoV-2 coronavirus known so far. .
본 명세서에서 사용되는 용어인 "고리매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification; LAMP)"은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 방법과는 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법으로서, 표적 유전자에서 6개 부위를 선택하여 설계한 최소 4개의 프라이머를 이용하여, 프라이머가 특이적으로 결합하는 고리 구조를 만들고 사슬치환 반응을 통해 표적 유전자를 증폭하는 방법이다. 고리매개 등온증폭법은 기존의 PCR 방법에서 사용되는 Taq DNA 중합효소 대신에 표적 유전자를 염기가닥 치환(strand displacement) 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA 중합효소를 이용함으로써 표적 유전자 증폭 효율이 높고 온도 변화가 없는 등온 조건에서 표적 유전자 증폭이 이루어지기 때문에, 검사 시간이 단축되고 항온수조와 같은 저가의 장비로도 검사가 가능하며 현장 진단에도 적합하다.As used herein, the term "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)" is a method that can perform an amplification reaction under isothermal conditions, unlike conventional PCR (polymerase chain reaction) methods, and is a target It is a method of amplifying a target gene through a chain displacement reaction by using at least four primers designed by selecting six sites in a gene to create a ring structure to which the primers specifically bind. The loop-mediated isothermal amplification method has high target gene amplification efficiency by using Bst DNA polymerase, which can amplify target genes in large quantities by strand displacement method, instead of Taq DNA polymerase used in conventional PCR methods. Since target gene amplification is performed under isothermal conditions with no temperature change, the test time is shortened, the test can be performed with low-cost equipment such as a constant temperature water bath, and it is suitable for on-site diagnosis.
고리매개 등온증폭을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 선택적으로 반응 속도를 향상시키기 위해서는 2종의 프라이머(LF, LB)를 더 포함하는 6종의 프라이머가 필요하다. 4종의 기본 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)는 외부 프라이머 2종(F3, B3)과 내부 프라이머 2종(FIP, BIP)으로 구성된다. 외부 프라이머는 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 핵산의 이중 가닥을 풀어주는 역할을 하고, 정방향 외부 프라이머(forward outer primer; F3) 및 역방향 외부 프라이머(backward outer primer; B3)로 구성된다. 내부 프라이머는 고리매개 등온증폭 반응에 필수적인 고리를 만드는 상보적인 염기서열들을 포함하고, 정방향 내부 프라이머(forward inner primer; FIP) 및 역방향 내부 프라이머(backward inner primer; BIP)로 구성된다. 추가의 2종의 프라이머(LF, LB)는 내부 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개 등온증폭 반응을 가속화시키고, 정방향 고리 프라이머(forward loop primer; LF) 및 역방향 고리 프라이머(backward loop primer; LB)로 구성된다.For loop-mediated isothermal amplification, basically 4 types of primers (F3, B3, FIP, BIP) are required, and 6 types of primers including 2 types of primers (LF, LB) are required to selectively improve the reaction rate is needed The four basic primers (F3, B3, FIP, BIP) consist of two external primers (F3, B3) and two internal primers (FIP, BIP). The outer primer serves to release double strands of nucleic acids during the non-cyclic step of the reaction and is composed of a forward outer primer (F3) and a backward outer primer (B3). The inner primer contains complementary nucleotide sequences that form a loop essential for a loop-mediated isothermal amplification reaction, and is composed of a forward inner primer (FIP) and a backward inner primer (BIP). The additional two primers (LF, LB) attach to the base sequence to which the internal primer does not bind to accelerate the loop-mediated isothermal amplification reaction, forward loop primer (LF) and reverse loop primer (backward loop primer ; LB).
본 발명은 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머, 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는, 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention detects an omicron mutant strain of coronavirus, including a primer of SEQ ID NO: 1, a primer of SEQ ID NO: 2, a primer of SEQ ID NO: 3, a primer of SEQ ID NO: 4, a primer of SEQ ID NO: 5, and a primer of SEQ ID NO: 6 Provided is a primer set for loop-mediated isothermal amplification for
본 발명의 일 구쳬예의 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 외부 프라이머(F3)이고 서열번호 2의 프라이머는 역방향 외부 프라이머(B3)이며, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 내부 프라이머(FIP)이고 서열번호 4의 프라이머는 역방향 내부 프라이머(BIP)이며, 서열번호 5의 프라이머는 정방향 고리 프라이머(LF)이고 서열번호 6의 프라이머는 역방향 고리 프라이머(LB)이다.In the primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting an omicron mutant strain of coronavirus of one embodiment of the present invention, the primer of SEQ ID NO: 1 is a forward external primer (F3) and the primer of SEQ ID NO: 2 is a reverse external primer (B3) The primer of SEQ ID NO: 3 is a forward inner primer (FIP), the primer of SEQ ID NO: 4 is a reverse inner primer (BIP), the primer of SEQ ID NO: 5 is a forward loop primer (LF) and the primer of SEQ ID NO: 6 is a reverse loop primer. Primer (LB).
또한, 본 발명은 서열번호 7의 프라이머, 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열번호 10의 프라이머, 서열번호 11의 프라이머 및 서열번호 12의 프라이머를 포함하는, SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention is a SARS-CoV-2 corona comprising the primer of SEQ ID NO: 7, the primer of SEQ ID NO: 8, the primer of SEQ ID NO: 9, the primer of SEQ ID NO: 10, the primer of SEQ ID NO: 11, and the primer of SEQ ID NO: 12 Provided is a primer set for loop-mediated isothermal amplification for virus detection.
본 발명의 일 구체예의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 7의 프라이머는 정방향 외부 프라이머(F3)이고 서열번호 8의 프라이머는 역방향 외부 프라이머(B3)이며, 서열번호 9의 프라이머는 정방향 내부 프라이머(FIP)이고 서열번호 10의 프라이머는 역방향 내부 프라이머(BIP)이며, 서열번호 11의 프라이머는 정방향 고리 프라이머(LF)이고 서열번호 12의 프라이머는 역방향 고리 프라이머(LB)이다. In the primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus of one embodiment of the present invention, the primer of SEQ ID NO: 7 is a forward external primer (F3) and the primer of SEQ ID NO: 8 is a reverse external primer (B3 ), the primer of SEQ ID NO: 9 is a forward inner primer (FIP), the primer of SEQ ID NO: 10 is a reverse inner primer (BIP), the primer of SEQ ID NO: 11 is a forward loop primer (LF) and the primer of SEQ ID NO: 12 is a reverse inner primer (BIP). ring primer (LB).
본 발명의 일 구체예에 따른 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트 및/또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트는 검체로부터 분리된 RNA, 역전사 효소 및 중합효소를 하나의 튜브에 혼합하여 역전사 반응과 고리매개 등온증폭 반응이 일어나게 하는 역전사 고리매개 등온증폭 검사방법에 이용될 수 있고, 검체로부터 분리된 RNA를 역전사하여 cDNA를 얻은 후 cDNA를 주형으로 이용하여 고리매개 등온증폭을 수행하는 검사방법에도 이용될 수 있다. A primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting an omicron variant of coronavirus and/or a primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus according to an embodiment of the present invention is RNA isolated from a sample. , reverse transcriptase and polymerase can be mixed in one tube to cause a reverse transcription reaction and a loop-mediated isothermal amplification reaction. It can also be used for an inspection method in which ring-mediated isothermal amplification is performed by using as a template.
또한, 본 발명은 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a test kit for an omicron mutant strain of coronavirus using a loop-mediated isothermal amplification method.
본 발명의 일 구체예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트는, 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머, 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 제1 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 포함한다. In one embodiment of the present invention, the coronavirus Omicron mutant test kit using the loop-mediated isothermal amplification method comprises the primers of SEQ ID NO: 1, the primers of SEQ ID NO: 2, the primers of SEQ ID NO: 3, the primers of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5 and a primer set for first loop-mediated isothermal amplification including the primer of SEQ ID NO: 6.
본 발명의 일 구체예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트는, 서열번호 7의 프라이머, 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열번호 10의 프라이머, 서열번호 11의 프라이머 및 서열번호 12의 프라이머를 포함하는 제2 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.The Omicron mutant test kit for coronavirus using the loop-mediated isothermal amplification method of one embodiment of the present invention includes the primers of SEQ ID NO: 7, the primers of SEQ ID NO: 8, the primers of SEQ ID NO: 9, the primers of SEQ ID NO: 10, and the primers of SEQ ID NO: 11 A primer set for second loop-mediated isothermal amplification including the primer of SEQ ID NO: 12 and a primer of SEQ ID NO: 12 may be further included.
본 발명의 일구체예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트는, 중합효소, dNTP, Mg2+ 이온을 포함하는 완충용액, 및 발색물질이나 형광물질을 더 포함할 수 있다.The kit for testing the Omicron mutant strain of coronavirus using the loop-mediated isothermal amplification method of one embodiment of the present invention may further include a polymerase, dNTP, a buffer solution containing Mg 2+ ions, and a color developing material or a fluorescent material. .
한편, 본 발명의 일 구체예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트에 있어서, 중합효소는 예를 들어, Bst 중합효소, GspSSD 중합효소 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 본 발명이 속한 기술분야에서 현재 사용되고 있거나 장래에 사용될 수 있는 고리매개 등온증폭용 중합효소를 모두 사용할 수 있다. On the other hand, in the test kit for the Omicron mutant strain of coronavirus using the ring-mediated isothermal amplification method of one embodiment of the present invention, the polymerase may be, for example, Bst polymerase, GspSSD polymerase, etc., but is not limited thereto, and the present invention is not limited thereto. All polymerases for ring-mediated isothermal amplification that are currently used or can be used in the future in the related art can be used.
본 발명의 일실시예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법은, 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와, 전술한 바와 같은 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 고리매개 등온증폭하는 단계와, 상기 증폭 산물의 형성을 확인하는 단계를 포함한다.The method for testing an omicron mutant strain of coronavirus using the loop-mediated isothermal amplification method according to an embodiment of the present invention includes the steps of preparing a genetic sample from a specimen, and the loop-mediated isothermal amplification for detecting an omicron mutant strain of coronavirus as described above. A step of isothermally amplifying the genetic sample using a primer set for linkage, and a step of confirming the formation of the amplification product.
본 발명의 일실시예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법은, 전술한 바와 같은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 고리매개 등온증폭하는 단계와, 상기 증폭 산물의 형성을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method for examining an Omicron mutant strain of coronavirus using the ring-mediated isothermal amplification method uses the primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting the SARS-CoV-2 coronavirus as described above, The method may further include performing loop-mediated isothermal amplification of the sample and confirming formation of the amplification product.
본 발명의 일실시예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법에 있어서, 상기 유전자 샘플을 고리매개 등온증폭하는 단계는 상기 유전자 샘플인 RNA를 바로 역전사 고리매개 등온증폭하거나, RNA를 1차적으로 역전사하고 RNA를 역전사하여 얻은 cDNA를 2차적으로 고리매개 등온증폭하여 수행될 수 있다. In the method for testing an omicron mutant strain of coronavirus using a loop-mediated isothermal amplification method according to an embodiment of the present invention, the step of isothermally amplifying the genetic sample is either reverse transcription or loop-mediated isothermal amplification of the RNA, which is the genetic sample, or RNA It can be carried out by firstly reverse-transcription and secondarily loop-mediated isothermal amplification of cDNA obtained by reverse-transcription of RNA.
본 발명의 일실시예의 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 형성을 확인하는 단계는 비색법, 탁도 측정, 형광 측정, 인광 측정, 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩 또는 방사성 측정에 의해 수행될 수 있다.In the method for testing an omicron mutant strain of coronavirus using the loop-mediated isothermal amplification method of an embodiment of the present invention, the step of confirming the formation of the amplification product is a colorimetric method, turbidity measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement, gel electrophoresis, capillary It can be performed by electrophoresis, DNA chip or radiometry.
본 발명에 따르면, 고리매개 등온증폭법을 이용하여 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 민감도 높게 검출할 수 있다.According to the present invention, the Omicron mutant strain of coronavirus can be accurately distinguished and detected from other SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains using the loop-mediated isothermal amplification method, and all SARS-CoV-2 coronavirus strains, including Omicron mutant strains, can be detected. CoV-2 coronavirus mutants can be detected with high sensitivity.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR(polymerase chain reaction) 방식과 달리 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하여 검사시간을 대폭 단축할 수 있고, 고가의 리얼타임 PCR 장비 없이도 저가의 휴대용 항온 장비로 검사가 가능하여 소규모의 진단실이나 현장에서도 검사가 가능하면서도 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우 보다 검출 민감도가 훨씬 높은 장점이 있다.In addition, unlike the real-time PCR (polymerase chain reaction) method, the present invention can amplify high-concentration genes in a short time, so the test time can be greatly shortened, and the test can be performed with low-cost portable thermostat equipment without expensive real-time PCR equipment Therefore, it is possible to test in a small diagnostic room or on-site, but the detection sensitivity is much higher than when ring-mediated isothermal amplification is performed using the prior art primer set for detecting SARS-CoV-2 coronavirus.
따라서, 본 발명은 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트 및/또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행하면 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우에 비해 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 훨씬 높은 민감도로 검출할 수 있다.Therefore, the present invention performs ring-mediated isothermal amplification using a primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting an omicron variant of coronavirus and/or a primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus. The Omicron mutant strain of coronavirus can be accurately distinguished and detected from other SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains, and ring-mediated isothermal amplification is performed using a primer set for detecting SARS-CoV-2 coronavirus in the prior art. It can detect the SARS-CoV-2 coronavirus with a much higher sensitivity than in one case.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.On the other hand, the scope of the present invention is not limited by the effects as described above.
도 1은 본 발명의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트(왼쪽) 및 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트(오른쪽)를 각각 사용하여 각 튜브 내의 검체에 대해 고리매개 등온증폭을 수행한 결과들을 나타낸다. 도 1에서 각 튜브 내의 반응액 색상이 핑크이면 음성이고 노란색이면 양성이다. 도 1에서 27번 튜브 내의 검체는 오미크론 변이주 양성인 것을 나타낸다.
도 2는 종래기술의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우 음성으로 판정한 델타 플러스 변이주 및 뮤 변이주의 낮은 검체 농도에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행한 경우에 델타 플러스 변이주 및 뮤 변이주를 양성으로 판정하는 높은 검출 민감도 결과들을 나타낸다. 도 2에서 각 튜브 내의 반응액 색상이 핑크이면 음성이고 노란색이면 양성이며 주황색이면 약한 양성이다. 1 is a primer set for ring-mediated isothermal amplification (left) for detecting SARS-CoV-2 coronavirus and a primer set for ring-mediated isothermal amplification (right) for detecting an omicron mutant of coronavirus of the present invention, respectively. The results of loop-mediated isothermal amplification for the sample in each tube are shown. In FIG. 1, if the color of the reaction solution in each tube is pink, it is negative, and if it is yellow, it is positive. In FIG. 1, the sample in tube 27 is positive for the Omicron mutant strain.
Figure 2 shows the SARS-CoV of the present invention at low sample concentrations of the delta plus mutant strain and mu mutant strain judged negative when ring-mediated isothermal amplification was performed using a prior art primer set for detecting SARS-CoV-2 coronavirus When ring-mediated isothermal amplification was performed using a primer set for ring-mediated isothermal amplification for -2 coronavirus detection, high detection sensitivity results were shown for determining the delta plus mutant strain and the mu mutant strain as positive. In FIG. 2, the color of the reaction solution in each tube is negative when it is pink, positive when it is yellow, and weakly positive when it is orange.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.The present invention is described in more detail in the following examples. However, the following examples are merely illustrative of the contents of the present invention and are not intended to limit or limit the scope of the present invention. What can be easily inferred by those skilled in the art from the detailed description and examples of the present invention is interpreted as belonging to the scope of the present invention. References cited herein are incorporated herein by reference.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a certain component is said to "include", it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.
실시예Example
실시예 1: 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 프라이머 설계Example 1: Primer Design for Detection of Omicron Mutants of Coronavirus
코로나바이러스의 오미크론 변이주에 특이적인 유전자 서열을 결정하기 위해, GISAID(www.gisaid.org) 코로나바이러스 데이터 정보 중 아프리카 남아프리카 공화국의 보츠와나에서 분리된 오미크론 염기서열(EPI_ISL_6774083)을 기준으로 오미크론 변이주에 특이적인 부분을 선택하였다. 구체적으로, 코로나바이러스가 인체 세포에 침투할 때 세포 표면의 표지자인 안지오텐신전환효소(angiotensin converting enzyme; ACE2)를 인식하는 RBD(receptor-binding domain)를 표적으로 선택하였다. In order to determine the gene sequence specific to the Omicron mutant strain of coronavirus, based on the Omicron sequence (EPI_ISL_6774083) isolated from Botswana, South Africa among the GISAID ( www.gisaid.org ) coronavirus data information, the Omicron mutant strain specific parts were selected. Specifically, when the coronavirus penetrates human cells, the receptor-binding domain (RBD) that recognizes angiotensin converting enzyme (ACE2), a marker on the cell surface, was selected as a target.
선택된 영역의 염기서열을 NEB LAMP 프라이머 설계 툴(NEB LAMP primer design tool)(https://lamp.neb.com/#!/)을 이용하여 오미크론 변이주 검출을 위한 6개의 고리매개 등온증폭용 프라이머를 설계하였다. 이와 같이 설계된 오미크론 변이주 검출을 위한 6개의 고리매개 등온증폭용 프라이머들로 구성된 프라이머 세트(제1 프라이머 세트)는 오미크론 변이주의 S 단백질 유전자 중 RBD(receptor-binding domain)내의 RBM(receptor-binding motif)을 코딩하는 염기서열의 변이들, 즉 S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, Y505H를 특이적으로 검출할 수 있다. 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 특이적으로 검출하기 위한 6개의 고리매개 등온증폭용 프라이머들의 염기서열은 아래의 표 1과 같다.Six ring-mediated isothermal amplification primers for detection of omicron variants using the NEB LAMP primer design tool ( https://lamp.neb.com/#!/ ) for the base sequence of the selected region. was designed. A primer set (first primer set) consisting of 6 ring-mediated isothermal amplification primers for detecting the Omicron mutant strain designed as described above is the RBM (receptor-binding domain) within the RBD (receptor-binding domain) of the S protein gene of the Omicron mutant strain. motif), mutations in the nucleotide sequence encoding S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, Y505H can be specifically detected. The base sequences of six ring-mediated isothermal amplification primers for specifically detecting the omicron mutant of coronavirus are shown in Table 1 below.
Y=C/TY=C/T
* EPI_ISL_6774083 서열내 위치정보* EPI_ISL_6774083 Location information in sequence
또한, SARS-CoV-2 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자 서열 범위 내에서 오미크론 변이주를 포함한 모든 변이주들의 보존적인 영역을 표적 서열로서 선택하고, 오미크론 변이주를 검출하기 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 설계 방법과 동일한 방법에 따라, SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 6개의 고리매개 등온증폭용 프라이머를 설계하였다. 이와 같이 설계된 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 6개의 고리매개 등온증폭용 프라이머들로 구성된 프라이머 세트(제2 프라이머 세트)는 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 검출할 수 있다. SARS-CoV-2 코로나바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 6개의 고리매개 등온증폭용 프라이머들의 염기서열은 아래의 표 2와 같다.In addition, within the ORF1ab gene sequence range of SARS-CoV-2 coronavirus, a conserved region of all mutants, including Omicron mutants, is selected as a target sequence, and a primer design method for ring-mediated isothermal amplification to detect Omicron mutants and According to the same method, six ring-mediated isothermal amplification primers for the detection of SARS-CoV-2 coronavirus were designed. A primer set (second primer set) composed of six ring-mediated isothermal amplification primers for detecting SARS-CoV-2 coronavirus designed as described above is all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains including Omicron mutant strains of coronavirus. can be detected. The base sequences of six ring-mediated isothermal amplification primers for specifically detecting SARS-CoV-2 coronavirus are shown in Table 2 below.
* EPI_ISL_6774083 서열내 위치정보* EPI_ISL_6774083 Location information in sequence
실시예 2: 표적 유전자 및 RNA 합성Example 2: Target gene and RNA synthesis
실시예 1에서 각각 설계된 제1 프라이머 세트(표 1) 및/또는 제2 프라이머 세트(표 2)를 이용한 고리매개 등온증폭을 수행하여 코로나바이러스의 오미크론 변이주와 SARS-CoV-2 코로나바이러스가 특이적으로 검출되는지 여부를 확인하는 실험을 수행하기 위해, 표 1 및 표 2의 염기서열에 기초하여 코로나바이러스의 오미크론 변이주의 표적 유전자 영역과 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 표적 유전자 영역을 합성하였다. By performing ring-mediated isothermal amplification using the first primer set (Table 1) and/or the second primer set (Table 2), respectively designed in Example 1, the Omicron mutant strain of coronavirus and the SARS-CoV-2 coronavirus were specific. In order to conduct an experiment to determine whether it is detected as an enemy, the target gene region of the omicron mutant strain of coronavirus and the target gene region of SARS-CoV-2 coronavirus were synthesized based on the nucleotide sequences in Tables 1 and 2 .
또한, 인비트로 전사(In vitro transcription)를 통한 RNA 합성을 위해 합성된 표적 유전자 영역의 5' 말단에 T7 프로모터(T7 promoter) 서열(5'-TAATACGACTCACTATAG-3')(서열번호 13)을 추가하여 합성을 진행하였다. 합성된 표적 유전자의 염기서열은 아래의 표 3과 같다. In addition, a T7 promoter sequence (5'-TAATACGACTCACTATAG-3') (SEQ ID NO: 13) was added to the 5' end of the synthesized target gene region for RNA synthesis through in vitro transcription. synthesis proceeded. The nucleotide sequence of the synthesized target gene is shown in Table 3 below.
(서열번호 14)Omicron S gene
(SEQ ID NO: 14)
유전자
(서열번호 15)SARS-CoV-2 ORF1ab
gene
(SEQ ID NO: 15)
합성된 표적 유전자로부터, BIOSEARCH사의 DuraScribe T7 Transcription Kit를 이용하여 해당 키트에 제공되는 실험방법에 따라 RNA를 합성하였고, 합성이 완료된 RNA는 Thermo Scientific사의 Qubit 2.0 Fluorometer를 이용하여 정량하였고, 105 카피(copies)/μL 농도로 냉동 보관하였다.From the synthesized target gene, RNA was synthesized using BIOSEARCH's DuraScribe T7 Transcription Kit according to the experimental method provided in the kit, and the synthesized RNA was quantified using Thermo Scientific's Qubit 2.0 Fluorometer, and 10 5 copies ( copies)/μL concentration was stored frozen.
실시예 3: 제1 프라이머 세트 및 제2 프라이머 세트를 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 및 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 특이적 검출Example 3: Specific detection of Omicron mutant strain of coronavirus and SARS-CoV-2 coronavirus using first primer set and second primer set
실시예 1에서 각각 설계된 제1 프라이머 세트(표 1) 및/또는 제2 프라이머 세트(표 2)를 이용한 고리매개 등온증폭을 수행하여 코로나바이러스의 오미크론 변이주와 SARS-CoV-2 코로나바이러스를 특이적으로 검출하였다. 본 실험을 위해서 국가병원체 자원은행(https://nccp.kdca.go.kr/)으로부터 SARS-CoV-2 코로나바이러스 RNA를 분양받았으며, 각각의 정보(바이러스주 번호 및 변이정보)는 다음과 같다. By performing ring-mediated isothermal amplification using the first primer set (Table 1) and/or the second primer set (Table 2), respectively designed in Example 1, the Omicron mutant strain of coronavirus and the SARS-CoV-2 coronavirus were specifically identified. detected negatively. For this experiment, SARS-CoV-2 coronavirus RNA was distributed from the National Pathogen Resource Bank (https://nccp.kdca.go.kr/), and each information (virus strain number and mutation information) is as follows .
오미크론(omicron) 변이주GR clade (B.1.1.529)
omicron mutant
상기 표 4의 각 일련번호에 해당하는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 RNA는 각각 도 1에서 동일한 일련번호가 매겨진 각 튜브 내에 담겨져 있다. 도 1의 28번 튜브에는 실시예 3에서 합성된 RNA가 양성대조군으로서 담겨져 있고, 도 1의 29번 튜브에는 뉴클레아제가 없는 물(Nuclease-free water)이 음성대조군으로서 담겨져 있다. SARS-CoV-2 coronavirus RNA corresponding to each serial number in Table 4 was contained in each tube with the same serial number in FIG. 1, respectively. Tube 28 in FIG. 1 contained RNA synthesized in Example 3 as a positive control, and tube 29 in FIG. 1 contained nuclease-free water as a negative control.
또한, 도 1의 각 튜브에는 하기 표 5의 고리매개 등온증폭용 반응액(오른쪽 튜브들) 또는 하기 표 6의 고리매개 등온증폭용 반응액(왼쪽 튜브들)이 담겨져 있다.In addition, each tube of FIG. 1 contains a reaction solution for loop-mediated isothermal amplification (tubes on the right) of Table 5 below or a reaction solution for loop-mediated isothermal amplification (tubes on the left) of Table 6 below.
음성대조군SARS-CoV-2 RNA, positive control or
negative control group
음성대조군SARS-CoV-2 RNA, positive control or
negative control group
코로나바이러스의 오미크론 변이주의 검출을 위해 상기 표 5에 따라 고리매개 등온증폭용 반응액을 준비하였고, SARS-CoV-2 코로나바이러스의 검출을 위해 상기 표 6에 따라 고리매개 등온증폭용 반응액을 준비하였다. LAMP 마스터 믹스(LAMP Master mix)는 NEB사의 웜스타트 칼러리메트릭 램프 2X 마스터 믹스(DNA & RNA){WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix(DNA & RNA)}를 사용하였다. 그리고 상기 반응액 각각에 대해 65℃에서 30분 동안 고리매개 등온증폭을 수행하였다. 음성 및 양성의 판정은 LAMP 마스터 믹스의 제조사에서 제공하는 기준에 따라 색으로 판단하였다. 각 튜브 내의 반응액 색상이 핑크인 경우는 음성이고 노란색인 경우 양성으로 판정하였다. For the detection of omicron variants of coronavirus, a reaction solution for ring-mediated isothermal amplification was prepared according to Table 5 above, and for detection of SARS-CoV-2 coronavirus, a reaction solution for ring-mediated isothermal amplification was prepared according to Table 6 above. prepared. As the LAMP Master mix, NEB's Warmstart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) {WarmStart ® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA)} was used. Then, ring-mediated isothermal amplification was performed at 65° C. for 30 minutes for each of the reaction solutions. Negative and positive judgments were made by color according to the criteria provided by the manufacturer of the LAMP master mix. When the color of the reaction solution in each tube was pink, it was determined to be negative, and when it was yellow, it was determined to be positive.
도 1에서 도시된 바와 같이, 다양한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 RNA에 대해 테스트한 결과, 오미크론 특이적 반응결과(오른쪽 튜브들) 및 전체 SARS-CoV-2 코로나바이러스 반응 결과(왼쪽 튜브들)가 상기 표 4에서 제공된 코로나바이러스 정보와 일치함을 확인하였다. As shown in Figure 1, the results of testing for various SARS-CoV-2 coronavirus RNAs, Omicron-specific response results (right tubes) and total SARS-CoV-2 coronavirus response results (left tubes) It was confirmed that was consistent with the coronavirus information provided in Table 4 above.
도 1의 오른쪽의 27번 튜브에서는 반응액이 노란색으로 나타나 27번 튜브 내의 검체는 오미크론 변이주 양성인 것을 의미하며, 이는 상기 표 4의 27번 바이러스주의 바이러스 정보(즉, 오미크론 변이주)와 일치하였다. 또한, 도 1의 왼쪽의 27번 튜브에서도 양성으로 확인되어 27번 튜브 내의 검체는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 양성인 것도 이중으로 검증하여 확인할 수 있었다.In tube No. 27 on the right side of Figure 1, the reaction solution was shown in yellow, which means that the sample in tube No. 27 was positive for the Omicron mutant strain, which was consistent with the virus information (i.e., Omicron mutant strain) of No. 27 strain in Table 4 above. . In addition, it was also confirmed as positive in tube 27 on the left side of FIG. 1, and it was confirmed by double verification that the sample in tube 27 was positive for SARS-CoV-2 coronavirus.
또한, 도 1의 왼쪽에서는 음성 대조군인 29번 튜브를 제외하고 모든 튜브들에서 SARS-CoV-2 코로나바이러스 양성을 나타내었고, 이는 상기 표 4의 1번 내지 27번 바이러스주의 바이러스 정보(즉, SARS-CoV-2 코로나바이러스)와 일치하였다. 도 1의 28번 튜브는 실시예 3의 합성 RNA(서열번호 14의 합성 RNA 및 서열번호 15의 합성 RNA)가 담겨져 있는 양성대조군이므로 SARS-CoV-2 코로나바이러스 및 오미크론 변이주 모두 양성이다.In addition, on the left side of FIG. 1, all tubes except tube 29, which is a negative control, showed positive SARS-CoV-2 coronavirus, which indicates the virus information of strains 1 to 27 in Table 4 (i.e., SARS -CoV-2 coronavirus). Tube 28 in FIG. 1 is a positive control containing the synthetic RNA of Example 3 (synthetic RNA of SEQ ID NO: 14 and synthetic RNA of SEQ ID NO: 15), so both SARS-CoV-2 coronavirus and Omicron mutant strains are positive.
한편, 도 1의 오른쪽에서 27번 튜브와 28번 튜브(양성 대조군)를 제외하고는 모두 오미크론 변이주 음성이었다. 따라서, 도 1의 왼쪽에서 양성으로 확인된 1번 내지 26번 튜브 내의 검체는 오미크론 변이주 음성이지만 SARS-CoV-2 코로나바이러스 양성인 것을 확인할 수 있었다. 이 역시 상기 표 4의 1번 내지 26번 바이러스주의 바이러스 정보와 일치하였다. On the other hand, except for tubes 27 and 28 (positive control) on the right side of FIG. 1, all of the Omicron mutants were negative. Therefore, it was confirmed that the samples in tubes 1 to 26, which were confirmed as positive on the left side of FIG. 1, were negative for the Omicron mutant but positive for the SARS-CoV-2 coronavirus. This also coincided with the virus information of virus strains Nos. 1 to 26 in Table 4 above.
따라서, 본 발명의 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트 및 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트의 조합을 사용하여 고리매개 등온증폭을 수행하면, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 다른 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 변이주와 정확하게 구분하여 검출할 수 있고, 코로나바이러스의 오미크론 변이주를 포함한 모든 SARS-CoV-2 코로나바이러스 변이주를 검출할 수 있다.Therefore, loop-mediated isothermal amplification is performed using a combination of the primer set for loop-mediated isothermal amplification for detecting the omicron variant of coronavirus of the present invention and the primer set for loop-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus. In this way, the Omicron mutant strain of coronavirus can be accurately distinguished from mutant strains of other SARS-CoV-2 coronaviruses and detected, and all SARS-CoV-2 coronavirus mutant strains, including the Omicron mutant strain of coronavirus, can be detected. .
실시예 4: 제2 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭법을 수행한 경우 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 검출 민감도Example 4: Detection sensitivity of SARS-CoV-2 coronavirus when loop-mediated isothermal amplification was performed using the second primer set
본 발명의 제2 프라이머 세트를 사용한 고리매개 등온증폭법의 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 검출 민감도의 우수성을 확인하기 위하여, 종래기술(Mautner et al. Virol J (2020) 17:160)에서 제시하는 고리매개 등온증폭법을 이용한 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 검출 결과와 비교 평가를 진행하였다. 분양받은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 델타 플러스 변이주 RNA와 뮤 변이주 RNA를 계단 희석하여 샘플을 준비하였고, 실시예 3에서 기술한 방법에 따라 종래기술과의 비교 실험을 진행하였다. 그 결과, 본 발명의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트가 종래기술에 비해 더 낮은 농도의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 RNA를 검출하는 것을 확인하였다(도 2). In order to confirm the superiority of detection sensitivity of SARS-CoV-2 coronavirus of the ring-mediated isothermal amplification method using the second primer set of the present invention, presented in the prior art (Mautner et al. Virol J (2020) 17:160) Comparative evaluation was conducted with the detection results of SARS-CoV-2 coronavirus using the loop-mediated isothermal amplification method. Samples were prepared by serial dilution of SARS-CoV-2 coronavirus delta plus mutant RNA and mu mutant RNA, and a comparative experiment with the prior art was conducted according to the method described in Example 3. As a result, it was confirmed that the primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus of the present invention detects a lower concentration of SARS-CoV-2 coronavirus RNA than the prior art (Fig. 2). .
도 2에 도시된 바와 같이, RNA 샘플 원액을 10-5로 희석한 경우에도 본 발명의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 사용하여 고리매개 등온증폭법을 수행한 경우 양성의 결과를 나타낸 반면에, 종래기술은 음성의 결과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트는 종래기술에 비해 고리매개 등온증폭을 이용한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출 민감도가 훨씬 높은 것을 알 수 있었다.As shown in FIG. 2, even when the RNA sample stock solution is diluted to 10 -5 , the loop-mediated isothermal amplification method is performed using the primer set for loop-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus of the present invention. One case gave a positive result, whereas the prior art gave a negative result. Therefore, it was found that the primer set for ring-mediated isothermal amplification for detecting SARS-CoV-2 coronavirus of the present invention has much higher detection sensitivity of SARS-CoV-2 coronavirus using ring-mediated isothermal amplification than the prior art.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.In the above, the present invention has been described with reference to the above embodiments, but the present invention is not limited thereto. Those skilled in the art will understand that modifications and changes can be made without departing from the spirit and scope of the present invention, and these modifications and changes also belong to the present invention.
<110> Attoplex Inc. <120> Method and kit for detecting omicron variant of coronavirus using loop-mediated isothermal amplification <130> P22-0136KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omicron F3 primer <400> 1 cttttgagag agatatttca actga 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omicron B3 primer <400> 2 cattgaagtt gaaattgaca cat 23 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omicron FIP primer <400> 3 tgggtcggaa acyatatgat cgtaagccgg taacaaacct tgt 43 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omicron BIP primer <400> 4 ttggtcacca accatacaga gtaagacttt ttaggtccac aaaca 45 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omicron LF primer <400> 5 gaaagtaaca attaaaacct gcaacaccat 30 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omicron LB primer <400> 6 tttgaacttc tacatgcacc agcaa 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 F3 primer <400> 7 aattgttgaa tcctgtggta a 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 B3 primer <400> 8 attgttatag cggccttct 19 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 FIP primer <400> 9 gcaaatgcat aaagaggact cagtacaaaa ggaaaagcta aaaaaggtg 49 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 BIP primer <400> 10 cagaggctgc tcgtgttgta taaaacacgc acagaatttt gag 43 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 LF primer <400> 11 gatttctgtt caccaatatt ccagg 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 LB primer <400> 12 cgatcaattt tctcccgcac tct 23 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter <400> 13 taatacgact cactatag 18 <210> 14 <211> 246 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic S protein gene of omicron variant <400> 14 cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg taacaaacct tgtaatggtg 60 ttgcaggttt taattgttac tttcctttac gatcatatag tttccgaccc acttatggtg 120 ttggtcacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa 180 ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc aatttcaact 240 tcaatg 246 <210> 15 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF1ab gene of SARS-CoV-2 <400> 15 aattgttgaa tcctgtggta attttaaagt tacaaaagga aaagctaaaa aaggtgcctg 60 gaatattggt gaacagaaat caatactgag tcctctttat gcatttgcat cagaggctgc 120 tcgtgttgta cgatcaattt tctcccgcac tcttgaaact gctcaaaatt ctgtgcgtgt 180 tttacagaag gccgctataa caat 204 <110> Attoplex Inc. <120> Method and kit for detecting omicron variant of coronavirus using loop-mediated isothermal amplification <130> P22-0136KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> omicron F3 primer <400> 1 cttttgagag agatatttca actga 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> omicron B3 primer <400> 2 cattgaagtt gaaattgaca cat 23 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> omicron FIP primer <400> 3 tgggtcggaa acyatatgat cgtaagccgg taacaaacct tgt 43 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> omicron BIP primer <400> 4 ttggtcacca accatacaga gtaagacttt ttaggtccac aaaca 45 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> omicron LF primer <400> 5 gaaagtaaca attaaaacct gcaacaccat 30 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> omicron LB primer <400> 6 tttgaacttc tacatgcacc agcaa 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SARS-CoV-2 F3 primer <400> 7 aattgttgaa tcctgtggta a 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SARS-CoV-2 B3 primer <400> 8 attgttatag cggccttct 19 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SARS-CoV-2 FIP primer <400> 9 gcaaatgcat aaagaggact cagtacaaaa ggaaaagcta aaaaaggtg 49 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SARS-CoV-2 BIP primer <400> 10 cagaggctgc tcgtgttgta taaaacacgc acagaatttt gag 43 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SARS-CoV-2 LF primer <400> 11 gatttctgtt caccaatatt ccagg 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> SARS-CoV-2 LB primer <400> 12 cgatcaattt tctccccgcac tct 23 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> T7 promoter <400> 13 taatacgact cactatag 18 <210> 14 <211> 246 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic S protein gene of omicron variant <400> 14 cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg taacaaacct tgtaatggtg 60 ttgcaggttt taattgttac tttcctttac gatcatatag tttccgaccc acttatggtg 120 ttggtcacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa 180 ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc aatttcaact 240 tcaatg 246 <210> 15 <211> 204 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ORF1ab gene of SARS-CoV-2 <400> 15 aattgttgaa tcctgtggta attttaaagt tacaaaagga aaagctaaaa aaggtgcctg 60 gaatattggt gaacagaaat caatactgag tcctctttat gcatttgcat cagaggctgc 120 tcgtgttgta cgatcaattt tctcccgcac tcttgaaact gctcaaaatt ctgtgcgtgt 180 tttacagaag gccgctataa caat 204
Claims (8)
서열번호 7의 프라이머, 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열번호 10의 프라이머, 서열번호 11의 프라이머 및 서열번호 12의 프라이머를 포함하는 제2 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 더 포함하는, 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트.According to claim 3,
A primer set for second loop isothermal amplification including the primer of SEQ ID NO: 7, the primer of SEQ ID NO: 8, the primer of SEQ ID NO: 9, the primer of SEQ ID NO: 10, the primer of SEQ ID NO: 11, and the primer of SEQ ID NO: 12; A test kit for an Omicron mutant strain of coronavirus using a loop-mediated isothermal amplification method.
중합효소, dNTP, Mg2+ 이온을 포함하는 완충용액, 및 발색물질이나 형광물질을 더 포함하는, 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 키트.According to claim 3 or 4,
Polymerase, dNTP, a buffer solution containing Mg 2+ ions, and a kit for testing an omicron mutant strain of coronavirus using a loop-mediated isothermal amplification method, further comprising a chromogenic or fluorescent substance.
제1항의 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 고리매개 등온증폭하는 단계와,
상기 증폭 산물의 형성을 확인하는 단계를 포함하는, 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법.preparing a genetic sample from the specimen;
Cyclo-mediated isothermal amplification of the gene sample using the primer set for cyclic isothermal amplification for detecting the Omicron variant of the coronavirus of claim 1;
A method for testing an omicron mutant strain of coronavirus using a loop-mediated isothermal amplification method, comprising the step of confirming the formation of the amplification product.
제2항의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 검출을 위한 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 고리매개 등온증폭하는 단계와, 상기 증폭 산물의 형성을 확인하는 단계를 더 포함하는, 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법.According to claim 6,
Using the primer set for ring-mediated isothermal amplification for detection of the SARS-CoV-2 coronavirus of claim 2, further comprising the step of isothermally amplifying the gene sample through a ring-mediated isotherm, and confirming the formation of the amplification product, A method for screening omicron mutant strains of coronavirus using loop-mediated isothermal amplification.
상기 증폭 산물의 형성을 확인하는 단계는 비색법, 탁도 측정, 형광 측정, 인광 측정, 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩 또는 방사성 측정에 의해 수행되는, 고리매개 등온증폭법을 이용한 코로나바이러스의 오미크론 변이주 검사 방법.According to claim 6 or 7,
The step of confirming the formation of the amplification product is performed by colorimetry, turbidity measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, or radioactivity measurement. Micron variant test method.
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