KR20230115347A - 바이오마커 검출을 위한 순수 그래핀 기반 바이오센서및 관련 코어 입자, 재료 구성 방법 및 시스템 - Google Patents

바이오마커 검출을 위한 순수 그래핀 기반 바이오센서및 관련 코어 입자, 재료 구성 방법 및 시스템 Download PDF

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폴 더블유. 뎀프시
스펜서 한투라
크리스티나-미하엘라 산두 아파리시오
스테판 에이치. 보스만
크리스토퍼 엠. 소렌센
오브두리아 코바루비아스-잠브라노
조세 코바루비아스
Original Assignee
호크아이 바이오 리미티드
더 유니버시티 오브 캔사스
더 유니버시티 오브 캔사스
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Abstract

본원에는 그래핀 바이오센서 및 관련 코어 입자, 조성물, 방법 및 시스템이 제공되며, 하나 초과의 순수 그래핀 시트가 유기 또는 무기 물질의 코팅층으로 코팅되어 코어 그래핀 입자를 제공하고, 여기서 검출 가능한 모이어티 및 펩타이드 연결을 포함하는 검출 가능한 성분은 펩타이드 연결의 결합을 통해 부착된다.

Description

바이오마커 검출을 위한 순수 그래핀 기반 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료 구성 방법 및 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 30일에 사건 번호 54840-PRO로 출원된 "바이오마커 검출을 위한 순수 그래핀 기반 나노바이오센서"라는 제목의 미국 가출원 제63/131,972호에 대한 우선권을 주장하며, 이며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
정부 보조금 명세서
본 발명은 국립과학재단이 수여한 승인 번호 2032751 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
분야
본 개시내용은 바이오마커의 검출 및 관련된 바이오센서에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 바이오마커 검출을 위한 순수(pristine) 그래핀 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료 구성 방법 및 시스템에 관한 것이다.
바이오 마커의 검출은 의학 분야 및 기초 생물학적 연구와 같은 많은 연구 분야에서 핵심적이다.
특히, 바이오마커의 검출은 암에서 바이러스 감염, 혈액 응고 및 염증과 같은 추가 사건에 이르기까지 다양한 병태의 발생을 포함하여 다양한 유기체에서 여러 생물학적 사건에 대한 이해를 얻는 데 중요하다.
이 분야에서 진전이 있었음에도 불구하고, 특히 조건과 관련하여 나노몰 또는 더 낮은 농도의 샘플에서 바이오마커를 강력하고 재현 가능하게 검출하는 것은 여전히 어려운 과제이다.
본 개시내용은 그래핀 기반 바이오센서(본원에서 또한 그래핀 바이오센서 또는 바이오센서) 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것으로, 이는 여러 실시양태에서 높은 재현성 및 신호 대 잡음 비율로 피코몰 또는 펨토몰 농도에서 바이오마커의 검출을 가능하게 하는 본 개시내용의 의미에서 샘플에서 매우 안정이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
제1 양상에 따르면, 그래핀 코어 입자가 설명된다. 그래핀 코어 입자는 25℃에서 1 중량%의 수용해도(solubility in water)를 갖는 유기 및/또는 무기 화합물의 코팅층에 의해 코팅된 하나 초과의 순수 그래핀 나노시트를 포함한다. 그래핀 코어 입자에서, 하나 초과의 순수 그래핀 나노시트 및/또는 코팅층의 유기 및/또는 무기 화합물은 수용액에서 상응하는 작용기와 결합할 수 있는 작용기를 제시하도록 구성된다.
제2 양상에 따르면, 표적 바이오마커를 검출하도록 구성된 바이오센서가 기재되어 있다. 바이오센서는 본 개시내용의 그래핀 코어 입자, 및 형광 신호(fluorescent signal)를 방출할 수 있는 검출 가능한 모이어티를 포함하며, 상기 검출 가능한 모이어티는 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 포함하는 펩타이드 연결을 통해 코어 입자에 부착된다.
바이오센서에서, 코팅층과 펩타이드 연결은 그래핀 나노시트와 검출 가능한 모이어티 사이의 소광 거리(quenching distance)를 설정하도록 구성되며, 여기서 그래핀 나노시트는 검출 가능한 모이어티의 형광 신호를 소광한다.
바이오센서에서, 펩타이드 연결은 인식 서열의 표적 바이오마커에 의한 인식 시, 그래핀 나노시트와 검출 가능한 모이어티 사이의 방출 거리를 설정하도록 추가로 구성되며, 여기서 그래핀 나노시트는 검출 가능한 모이어티의 형광 신호를 소광시키지 않는다.
바이오센서에서, 표적 바이오마커 특이적 펩타이드 연결과 검출 가능한 모이어티는 따라서 표적 바이오마커에 의한 펩타이드 연결의 변형 시 검출 가능한 형광 신호를 방출하도록 구성된 표적 특이적 검출 가능한 구성요소를 형성한다.
제3 양상에 따르면, 본 개시내용의 코어 입자 및 그래핀 코어 입자에 부착된 복수의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소를 포함하는 다중 바이오센서가 기재되어 있다. 다중 바이오센서에서, 각각의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소는 여기 상태(excited state)에서 형광 신호를 방출할 수 있고 여기 스펙트럼(excitation spectrum) 및 방출 스펙트럼을 갖는 검출 가능한 모이어티에 의해 형성되며, 상기 검출 가능한 모이어티는 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 포함하는 펩타이드 연결에 부착된다.
각각의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소에서, 펩타이드 연결은 코어 입자의 코팅층과 조합하여 검출 가능한 모이어티와 그래핀 시트 코어 입자 사이의 소광 거리를 제공하도록 구성되며, 여기서 그래핀 나노시트는 검출 가능한 모이어티의 형광 신호를 소광한다.
바이오센서에서, 각각의 검출 가능한 구성요소의 표적 바이오마커에 대한 인식 서열은 표적 바이오마커를 특이적으로 검출하도록 구성되고, 복수의 검출 가능한 구성요소는 복수의 상이한 표적 바이오마커를 특이적으로 검출하도록 선택된다.
바이오센서의 복수의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소에서, 각각의 검출 가능한 모이어티는 복수의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소의 또 다른 검출 가능한 모이어티의 방출 스펙트럼과 중첩이 최소화된 여기 스펙트럼을 갖는다.
제4 양상에 따르면, 하나 이상의 그래핀 코어 입자 및/또는 본원에 기재된 하나 이상의 바이오센서를 비히클 희석제, 부형제 등과 같은 적절한 보조제와 조합하여 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약제학적 조성물이고 보조제는 약제학적으로 허용되는 보조제이다. 조성물이 상이한 표적 바이오마커에 특이적인 2개 이상의 검출 가능한 구성요소를 제시하는 2개 이상의 그래핀 바이오센서를 포함하는 실시양태에서, 2개 이상의 검출 가능한 구성요소의 각각의 검출 가능한 모이어티의 여기 스펙트럼은 2개 이상의 검출 가능한 구성요소의 또 다른 검출 가능한 모이어티의 방출 스펙트럼과 최소화된 중첩을 갖는다.
제5 양상에 따르면, 본원에 기재된 코어 입자를 제조하는 방법 및 시스템이 기재되어 있다. 상기 방법은 그래핀 표면을 갖는 순수 그래핀 나노시트를 제공하는 단계; 및 그래핀 표면을 유기 및/또는 무기 분자의 층으로 코팅하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 코어 입자를 제조하기 위한 시스템은 그래핀 표면을 갖는 순수 그래핀 나노시트와 화학적으로 변환하기 위한 시약을 포함하며, 상기 그래핀 표면은 코팅층으로 코팅된 순수 그래핀 나노시트를 제공하기 위한 것이다.
제6 양상에 따르면, 본원에 기재된 바이오센서를 제조하기 위한 방법 및 시스템이 기재되어 있다. 상기 방법은 본원에 기재된 코어 입자를 제공하고, 펩타이드 연결을 통해 검출 가능한 모이어티를 그래핀 표면에 부착하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 바이오센서를 제조하기 위한 시스템은 그래핀 표면, 펩타이드 연결, 검출 가능한 모이어티 및 펩타이드 연결을 통해 검출 가능한 모이어티를 그래핀 표면에 부착하기 위한 시약을 갖는 순수 그래핀 나노시트를 포함한다. 본원에 기재된 바이오센서를 제조하기 위한 시스템에서, 상기 구성요소는 본원에 기재된 바이오센서를 제조하는 방법에서 동시 조합 또는 순차적 사용을 위한 구성으로 포함된다.
제7 양상에 따르면, 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하기 위한 방법 및 시스템이 기재되어 있다. 상기 방법은 생물학적 샘플을 본 개시내용에 따른 임의의 바이오센서와 접촉시켜 반응 용액을 생성하는 단계; 및 반응 용액의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
시스템은 본원에 기재된 바이오센서 및 본원에 기재된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하는 방법에서 동시 조합 또는 순차적 사용을 위한 시약을 포함한다.
제8 양상에 따르면, 생물학적 샘플에서 복수의 바이오마커의 활성의 다중 검출을 위한 방법 및 시스템이 기재되어 있다. 상기 방법은 생물학적 샘플을 복수의 바이오마커에 특이적인 검출 가능한 구성요소를 제시하도록 구성된 본 개시내용에 따른 다중 바이오센서와 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 반응 용액을 생성하기 위해 수행되는 것인 단계; 및 상기 반응 용액의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 또는 대안적으로, 상기 방법은 생물학적 샘플을 다중 바이오센서와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 다중 바이오센서 각각은 복수의 바이오마커 중 하나의 바이오마커에 특이적인 펩타이드 연결을 제시한다.
생물학적 샘플에서 복수의 바이오마커의 활성의 다중 검출을 위한 시스템은 본원에 기재된 다중 바이오센서 및/또는 바이오센서를 포함하며, 이들 각각은 본원에 기재된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하는 방법에서 복수의 바이오마커 중 하나의 바이오마커에 특이적인 펩타이드 연결뿐만 아니라 선택적으로 동시 조합 또는 순차적 사용을 위한 복수의 시약을 제시한다.
표적 바이오마커의 검출을 위한 방법 및 시스템의 제9 양상에 따르면, 검출은 샘플 및/또는 시험 용액의 가열이 선행된다. 특히, 혈청 전처리 및/또는 선택된 온도에서 프로테아제 검정을 실행하면 별도 및 추가의 메커니즘을 사용하여 신호 대 잡음을 개선한다는 것이 예기치 않게 발견되었다.
본원에 기재된 바이오센서 및 관련 그래핀 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템은 여러 실시양태에서 수성 샘플에서 매우 안정한 그래핀 기반 바이오센서를 제공하며, 이는 수개월 동안 OD650에서 -24% 이하의 콜로이드 안정성 변화와 함께 현탁액에서 적어도 95% 입자의 백분율을 유지할 수 있다.
본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템은 몇몇 실시양태에서 높은 재현성으로 피코몰 또는 펨토몰 농도에서 바이오마커의 검출을 가능하게 하며, 일부 실시양태에서는 상이한 제조된 로트(lot)들 또는 배치(batch)들 사이에서 검출된 신호의 변동 계수가 10% 미만인 바이오마커의 검출을 가능하게 한다.
본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템은 여러 실시양태에서 다수의 센서에 걸쳐 25 이상의 신호 대 잡음 비율로 수용액에서 피코몰 또는 펨토몰 농도의 바이오마커의 검출을 가능하게 하며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템은 여러 실시양태에서 동일한 그래핀 입자 상에 또는 동일한 용액 내에 제시된 UV/vis 스펙트럼에서 최대 10개 이하 또는 전체 전자기 스펙트럼에서 최대 50개의 여러 상이한 검출 가능한 구성요소를 사용하여 높은 다중 능력을 갖는 수성 샘플에서 다중 바이오마커의 검출을 가능하게 하며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템은 여러 실시양태에서 수성 형태로 분산되고, 건조되고, 최대 10회의 분산 사이클 동안 재분산될 수 있는 강력한 바이오센서의 생산을 가능하게 한다. 따라서, 본 개시내용의 바이오센서는 건조 형태로 조성물 및 시스템에 포함될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 물질, 조성물, 방법 및 시스템은, 특히 피코몰 또는 펨토몰 농도와 같이 매우 낮은 농도로 존재하는 경우, 하나 이상의 바이오마커의 재현 가능한 검출이 요구되는 다양한 응용분야와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템은 당업자가 식별할 수 있는 다른 이점 중에서 진단 및 치료용 세포 제제의 개발을 촉진하는 질환 병리의 발병과, 약물 치료 및 요법에 대한 반응의 시각화뿐만 아니라 세포 신호전달, 항상성, 세포 이동, 온도 및 pH와 같은 외부 자극에 대한 반응과 같은 생물학적 사건의 시각화를 위한 의료 및 진단 응용분양에서 사용될 수 있다.
추가의 예시적인 응용분야로는 약물 연구에서 그리고 진단 및 치료 접근법 및 도구를 개발하기 위해 기초 생물학 연구, 응용 생물학, 생명 공학, 병인학, 의학 연구, 의학 진단, 치료학을 포함하는 여러 분야에서 그리고 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 식별할 수 있는 추가 분야에서 본원에 기재된 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템의 사용을 포함한다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태에 대한 세부사항은 첨부된 도면 및 아래의 설명에 기재되어 있다. 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 명세서에 통합되고 그 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 개시내용의 하나 이상의 실시양태를 예시하고, 상세한 설명 및 실시예 섹션과 함께 본 개시내용의 원리 및 구현을 설명하는 역할을 한다. 본 개시내용의 예시적인 실시양태는 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다.
도 1은 [1]로부터의 폭발(explosion) 그래핀의 SEM(주사 전자 현미경)을 나타낸다.
도 2a는 본 개시내용의 프로테아제 검출을 위한 예시적인 그래핀 기반 바이오센서의 개략도를 나타낸다.
도 2b는 본 개시내용에 따른 바이오센서를 제공하기 위한 예시적인 공정의 개략도를 나타낸다: A: 카복시그래핀의 합성; B: 아미드 결합을 통한 폴리에틸렌 이민의 화학적 부착; C: 테트라 카복시-페닐-포르피린(TCPP)과 같은 컨센서스 서열(올리고펩타이드)과 형광 염료의 부착.
도 2c는 중첩된 가장자리가 서로 얽힌 그래핀의 얇은 단일층, 또는 2 내지 3개의 층을 포함하거나 이로 이루어진 나노시트의 보다 정렬된 적층을 도시하는 개략도를 나타낸다.
도 2d는 그래핀 나노시트 미립자의 표면에 걸쳐 첨가된 고밀도의 카복실산기의 개략도를 나타낸다.
도 3a는 그래핀의 표면에 맞춰진 양의 카복실산을 첨가하기 위한 아지란-고리화첨가(cycloaddition)에 대한 반응식을 나타낸다.
도 3b는 카복시그래핀(CG)의 단일 나노시트의 예시적인 구조를 나타낸다.
도 3c는 표면에 걸쳐 카복실산기의 고밀도 분포를 나타내는 예시적인 카복시그래핀 상부층 구조에 대한 측면도를 나타낸다.
도 3d는 N2 하에 합성된 카복시그래핀 20의 시차 열중량측정법(DTA)을 나타낸다.
도 4는 100 mg의 카복시그래핀에 20 mL의 0.100 M NaOH를 첨가하는 것으로 시작하는 적정 곡선(pH 대 부피 0.100 M HCl)을 나타낸다. 둥근 점: 카복시그래핀의 적정; 정사각형 점: 참조 곡선(GO가 추가되지 않음).
도 5a는 카복시그래핀-폴리에틸렌이민의 구조를 나타내며, 참조를 위해 단일 시트만 나타내었다.
도 5b는 N2 하에 합성된 예시적인 카복시그래핀-폴리에틸렌이민(G-PEI)의 차등 열중량분석(DTA)의 결과를 보고하는 차트를 나타낸다.
도 6a는 예시적인 카복시그래핀-폴리에틸렌이민 기반 바이오센서의 구조를 나타내며, 참조를 위해 단일 시트만 나타내었다.
도 6b는 수중에서 MMP-1에 대한 카복시그래핀(상단 곡선), 카복시그래핀-PEI(하단 곡선) 및 카복시그래핀-바이오센서(중간 곡선)의 UV/Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 6c는 여기 스펙트럼과 흡수 스펙트럼 사이에 중첩이 없거나 최소한의 중첩만 있는 4개의 예시적인 BODIPY 염료, 특히 BODIPY FL, BODIPY TR, BODIPY 530550 및 BODIPY 630650을 나타낸다.
도 7은 바이오센서를 위한 가능한 스페이서로서 라이신 및 오르니틴의 개략도를 나타낸다.
도 8은 그래핀 표면의 화학적 아미노화를 위한 방향족 치환된 니트렌 반응을 도시하는 개략도를 나타낸다.
도 9는 그래핀 표면에 PEI가 화학적으로 부착되도록 하는, 그래핀에 내장된 카보양이온과 PEI의 2차 아민기의 반응식을 나타낸다. 1차 아민기도 반응할 수 있다는 것에 유의한다.
도 10은 말레이미드 유도체와 그래핀 사이의 딜스-알더 반응(Diels-Alder reaction)을 나타낸 도면이다.
도 11은 프로테아제 검출에 사용되는 본 개시내용의 그래핀 기반 바이오센서의 기능적 원리의 개략도를 나타낸다.
도 12는 프로테아제 활성을 검출하도록 구성된 예시적인 그래핀 기반 바이오센서에 대한 작동 원리의 개략도를 나타낸다.
도 13a는 본 개시내용의 예시적인 바이오센서에서 로그 신호 대 효소 농도로 표시된 검출 한계(LOD: 검출 한계)의 추정치를 나타내고; 특히, 도 13a는 각 막대 쌍의 왼쪽 막대가 인큐베이션 전 혈청에 MMP1을 첨가한 후 검출된 초기 형광 신호를 나타내고 각 막대 쌍의 오른쪽 막대가 37℃에서 60분 인큐베이션 후 검출된 형광 신호를 나타내는 차트를 나타낸다. AC(검정 대조군)는 완충액만 혼합된 바이오센서 용액이고, 블랭크는 완충액 단독이고; 이들은 백그라운드 신호, 또는 완충액 및 바이오센서 단독으로부터 측정되는 형광 신호를 나타낸다.
도 13b는 시험된 다양한 예시적인 바이오센서 농도에 대한 형광 신호 대 인큐베이션 시간을 도시하는 차트를 나타낸다. 4가지 상이한 농도의 그래핀 바이오센서 용액을 혈청과 함께 인큐베이션하고 37℃에서 60분에 걸쳐 인큐베이션하여 측정하였고, 각 농도는 기호로 표시되어 정량화된 최적의 신호가 0.01 mg/mL와 0.1 mg/mL 사이의 바이오센서 농도에 대한 것임을 나타낸다.
도 14는 범 gNBS 완충을 위한 11가지 예시적인 완충액 배합물을 보고하는 표를 나타낸다.
도 15는 도 17의 완충액에서 카텝신 D(CTSD gNBS(패널 A) 및 유로키나아제(uPA) gNBS(패널 B)의 성능을 도시하는 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 표시된 바와 같이 도 17의 완충액 1-11에 CTSD 및 uPA gNBS를 30 μg/ml의 최종 농도로 현탁시켰다. 5 μl의 혈청 A, S 또는 풀링된 정상 혈청(PNS) 또는 완충액 단독(AC)을 작업 용액에 3회 첨가하였다. 37℃에서 60분 동안 인큐베이션 후 421 nm/650 nm에서 형광을 측정하였다.
도 16은 염이 제타 전위 안정성에 미치는 영향을 도시하는 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. uPA gNBS는 155 mM NaCl이 있는(패널 B) 또는 없는(패널 A) 표시된 pH를 갖는 5 mM MES 완충액의 작업 용액에서 조립되었다. uPA gNBS의 대조군 용액을 탈이온수에서 제조하였다.
도 17은 등장성 염 완충액에서 uPA gNBS(패널 A), 매트릭스 메탈로프로테이나제 10(MMP10) gNBS(패널 B), CTSD gNBS(패널 C) 및 카텝신 H(CTSH) gNBS(패널 D)의 성능을 도시하는 실험의 보고 결과를 차트로 나타낸다. CTSD, uPA, MMP10 및 CTSH gNBS를 표시된 바와 같이 완충액 1,2 또는 9에 30 μg/ml 최종 농도로 현탁시켰다. 5 μl의 혈청 A, S 또는 풀링된 정상 혈청(PNS) 또는 완충액 단독(AC)을 작업 용액에 3회 첨가하였다. 37℃에서 60분 동안 인큐베이션 후 421 nm/650 nm에서 형광을 측정하였다.
도 18은 NaCl 농도가 배경 잡음에 미치는 영향을 나타낸다. uPA gNBS를 10 μM 2가 양이온 또는 154 mM NaCl을 함유하거나 염을 함유하지 않는 5 mM 또는 10 mM MES 완충액으로 인큐베이션하였다. 신호는 37℃에서 90분 후 얻어졌다(평균 RFU로 표시됨).
도 19a는 다양한 배율 스케일, 특히, 5 nm: 배율 250,000, 10 nm: 배율 120,000, 20 nm: 배율 70,000, 200 nm: 배율 10,000에서 순수 디토네이션(detonation) 그래핀의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 19b는 그래핀 바이오센서의 TEM 이미지를 나타낸다. gNBS는 MMP15에 대한 펩타이드 표적으로 조립되었다. 주사 전자 현미경사진은 15,000x(왼쪽 패널) 및 (중간 패널) 300,000x 배율(오른쪽 패널)에서 수집되었다. 전체 크기를 볼 수 있으며 그래핀 시트의 층상 구조가 드러난다. 막대는 200 nm 또는 5 nm를 나타낸다.
도 20은 그래핀 출발 물질에 대한 초음파처리의 영향을 보여주는 실험 결과를 보고하는 사진을 나타낸다. 3개의 튜브는 왼쪽에서 오른쪽 순서로 KSU 로트 1, HEB100 및 HEB101의 샘플을 나타낸다. gNBS는 원래 KSU 프로토콜을 사용하여 NE에 대한 펩타이드 표적으로 조립되었다. 유일한 차이점은 HEB100은 10분 동안 프로브를 초음파처리하고, HEB101은 60분 동안 프로브를 초음파처리한 후 gNBS 센서를 조립했다는 점이었다. gNBS 작업 용액을 준비한 후, KSU 로트 1 제제에서 gNBS 입자가 침전되는 것을 볼 수 있다. HEB 100에서도 소량이 검출될 수 있다. HEB 101 제제에서는 침전물이 관찰되지 않는다.
도 21은 출발 물질을 초음파처리하는 것이 다분산성에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 그래프는 작업 용액이 처음 만들어지고 초음파처리 워터 배스(water bath)에서 분산될 때(0분 휴지(resting)) 그리고 이어서 30분 후(30분 휴지) 각 배합물에 대한 다분산성 지수(PDI)를 나타낸다. 초음파처리된 그래핀을 사용하여 제조된 입자에 대해 제조의 각 단계에서 PDI의 현저한 감소가 관찰되었는데, 이는 공정의 각 단계에서 생성된 입자의 더 큰 균일성을 반영한다.
도 22는 초음파처리 시간이 증가함에 따라 그래핀에 대한 270 nm에서의 흡광도를 보고하는 차트를 나타낸다. DMF 내 그래핀 용액을 증분 기간(incremental periods of time) 동안 프로브 초음파처리하였다. 샘플을 간격을 두고 채취하여 흡광도를 측정하고 관련 측정값을 차트에 플롯팅하였다.
도 23은 상이한 건조 프로토콜에 따른 원래의 KSU 로트 120120 및 CG 제제 CG-1, CG-2, CG-3 및 CG-4의 총 중량 손실 측면에서 열중량 분석(TGA)의 결과를 보고하는 표를 나타낸다.
도 24는 적정에 따라 1.6 ± 0.1×10-4 mol/g의 카복실산 작용기를 특징으로 하는 CG 제제의 열중량 분석 결과를 보고한 차트를 나타낸다. 그래프는 온도가 RT에서 600℃로 증가함에 따라 질량 변화를 보여준다. 그래프는 100℃로 증가하는 동안 손실되는 질량을 나타낸다. 400℃ 이후의 질량 변화는 미미하다.
도 25는 도 23의 CG 제제 CG1.1, CG1.2, CG1.3 및 CG1.4의 열중량 분석 결과를 나타낸다. CG의 다른 제제는 TG 분석을 받았다. 그래프는 온도가 RT에서 1000℃로 증가함에 따른 질량 변화를 보여준다. 그래프는 100℃로 증가하는 동안 손실되는 질량을 나타낸다. 400℃ 이후의 질량 변화는 미미하다.
도 26은 용매 제거가 gNBS 성능에 미치는 영향을 나타내는 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 특히 uPA gNBS는 표준 프로토콜을 사용하여 제조 후 2일, 16일 또는 27일차에 3회 평가되었다. uPA gNBS의 별도 로트는 37℃ 오븐에서 30분 및 밤새 주변 건조를 포함하여 제조하였다. 이들은 제조 5일 후에 평가되었다. 차트는 샘플/검정 대조군에 의해 계산된 상대 형광 지수를 보여준다. 도 26에 보고된 실험에서, 사용된 uPA 센서는 카복시그래핀/폴리에틸렌이민을 기반으로 한다.
도 27은 출발 물질의 초음파처리가 신호의 배치 간 변화(batch-to-batch variation)에 미치는 영향을 보고하는 차트를 나타낸다. 호중구 엘라스타제(NE)를 위한 gNBS의 세 로트, HEB 로트 NE100, HEB 로트 NE 101 및 HEB 로트 NE 102의 gNBS를 제조하여 원래 KSU 로트 120120과 비교하였다. gNBS는 2명의 상이한 정상 인간 공여자의 혈청으로 정상 조건 하에 시험되었다.
도 28은 분산 노력이 증가함에 따른 바이오센서 제조 HEB 로트 NE100, HEB 로트 NE 101 및 HEB 로트 NE 102의 배합물을 보고하는 표를 나타낸다.
도 29는 워터 배스 초음파처리가 시간 경과에 따른 gNBS 흡광도에 미치는 영향을 평가하는 것에 관한 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. gNBS HEB 로트 NE100, HEB 로트 NE 101 및 HEB 로트 NE 102 및 KSU 로트 120120을 작업 완충액에 재현탁시키고, 초음파처리 워터 배스에서 증분 시간 동안 현탁시켰다. 간격을 두고 샘플을 회수하여 425 nm 및 265 nm에서 흡광도를 측정하였다. NE를 위한 gNBS의 4개 로트를 나타낸다.
도 30 패널 A 및 도 30 패널 B는 카복시그래핀의 pH 적정 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 본원에 기재된 프로토콜을 사용하여 제조된 카복시그래핀 용액을 50 ml의 0.05 M NaOH에서 제조하였다. 인큐베이션 및 CG 제거 후, 생성된 용액을 20 mL의 0.05 M HCl로 처리한 다음, 증분량의 0.05 M NaOH로 중화시키고 물 용액의 중화와 비교하였다.
도 31은 상이한 로트의 그래핀 카복시그래핀(CG) 제제 및 폴리에틸렌이민으로 유도체화된 CG(CGP) 제제의 원소 분석 결과를 보고하는 표를 나타낸다. 특히 표시된 바와 같이 2개의 상이한 로트의 그래핀, 6개의 상이한 CG 제제 및 1개의 CGP 제제에 대해 C, H, O 및 결과가 인용된 경우 N에 대한 원소 분석을 수행하였다. 모든 결과는 KSU에서 생성한 데이터를 제외한 Galbraith Laboratories에 의해 생성하였다. 결과는 퍼센트 구성으로 표시된다. 비교를 위해, CGP102는 CG1.0으로 조립된 PEI 유도체화 제품이다.
도 32는 카복실화 단계 없이 gNBS의 제조에 관한 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. PEI를 카복시그래핀 백본(uPA)에 부착하거나 EDC 화학을 사용하여 그래핀 백본(backbone)에 직접 부착하거나 EDC를 사용하지 않고 80℃로 가열하여 PEI와 반응시킴으로써 uPA gNBS를 조립하였다. 그 후, 3개의 백본 모두에 uPA-TCPP를 첨가하고 생성된 gNBS를 45℃에서 90분 동안 풀링된 정상 혈청(풀 정상 혈청) 또는 완충액(검정 대조군)으로 자극한 후 421/653 nm에서 VarioSkan Lux에서 측정하였다.
도 33은 이전 카복실화 없이 PEI를 빠르게 접합한 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 아지도아세트산 NHS 에스테르로 1.2 k 또는 10 k PEI를 활성화하고 80℃에서 그래핀에 결합하여 uPA gNBS를 제조하였다. 생성된 센서의 활성은 완충액, 50 mg/mL BSA 또는 풀링된 정상 혈청으로 자극하여 평가되었다.
도 34는 MMP1 G-TEG3아민 바이오센서에 대한 DLS 및 제타 전위 결과를 보고하는 표를 나타낸다.
도 35는 MMP1 G-PEI 바이오센서(패널 A) 대 B) MMP1 G-TEG3아민 바이오센서(패널 B)에 대해 측정된 형광 강도의 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 형광 강도는 37℃에서 인큐베이션 후 15분마다 측정되었으며, 이러한 강도는 시간이 경과함에 따라 계속 증가하여 두 바이오센서 모두 거의 선형적인 추세를 따른다. 두 바이오센서를 비교하면, G-TEG3아민은 60분 인큐베이션 후 G-PEI에 비해 더 높은 강도를 나타냈다.
도 36은 G-PEI 대 G-TEG3아민 및 검정 대조군에 대한 60분 인큐베이션 후 형광 강도의 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 60분 인큐베이션 후(패널 A), G-TEG3아민에 대한 강도는 G-PEI에 비해 가장 높은 강도를 나타냈고, 대조군 혈청 S 및 P의 경우, G-TEG3아민에 대한 강도는 G-PEI에 비해 거의 2배 더 높았음을 보여준다. (패널 B) MMP1 G-PEI 대 G-TEG3아민 바이오센서에 대한 검정 대조군에 대해 측정된 형광 강도.
도 37은 호중구 엘라스타제 gNBS 용액의 가시 스펙트럼에 대한 흡광도 결과를 보고하는 차트를 나타낸다.
도 38은 그래핀에 의한 다수의 상이한 염료의 소광을 나타내는 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. gNBS는 표준 절차를 사용하여 초음파처리된 그래핀에 NE-FAM(패널 A), NE-TAMRA(패널 B), 또는 uPA-TCPP(패널 C)를 결합하여 제조하였다. 70 μL 부피의 각 센서의 용량 반응을 384 웰 플레이트에서 완충액 단독(AC) 또는 10 μl 혈청으로 3회 자극하였다. 플레이트를 45℃에서 인큐베이션하고 형광을 90분 동안 10분 간격으로 판독하였다.
도 39는 로다민-B gNBS(Rhodamine-B gNBS)를 사용한 그래핀에 의한 로다민-B의 소광을 나타내는 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. MMP7 및 MMP9 로다민-B 펩타이드를 CGP에 결합하고 혈청 또는 완충액만(AC) 있는 상태에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
도 40은 다중 gNBS를 사용한 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. gNBS 센서는 표준 절차를 사용하여 초음파처리된 그래핀에 표시된 바와 같이 Arg-FAM 또는 NE-TAMRA를 결합하여 제조하였다. 70 μl 작업 용액을 각 센서만(단독) 또는 두 센서 함께(다중) 200 μg/ml의 최종 농도로 제조하였다. 3중 웰을 10 μl 완충액 또는 10 μl 혈청으로 처리하고 45℃에서 90분 동안 인큐베이션하고 10분 간격으로 측정하였다. 각 웰은 496/526(FAM) 및 555/586(TAMRA)에서 측정하였다(D03-250).
도 41은 다수의 상이한 플랫폼에서 나노센서 분석의 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. gNBS 센서는 표준 절차를 사용하여 초음파처리된 그래핀에 NE-FAM을 결합하여 제조하였다. 200 μg/ml의 센서로 125 μl의 작업 용액을 제조하였다. 3중 웰을 5 μl 완충액(AC) 또는 5 μl 혈청으로 처리하였다. 5 μl 혈청을 125 μl 완충액으로 희석한 추가 웰도 준비하였다(샘플 배경). 각 웰은 Varioskan에서 30분 간격으로 그리고 StepOnePlus에서 1분 간격으로 496/526(FAM)에서 측정하였다.
도 42는 열 처리 후 프로테아제를 검출하는 것에 관한 실험 결과를 나타낸다. (패널 A) 대조군 혈청 및 풀링된 정상 대조군 혈청을 사용하여 5 mM MES, 10 μM 양이온 및 IS:155의 125 μl 작업 용액에서 MMP10 gNBS 및 CTSH gNBS를 자극하였다. 각 혈청의 분취량을 55℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 자극된 복제 반응에 사용하였다. 두 반응 세트를 모두 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 Varioskan Lux에서 형광을 측정하였다. (패널 B) MMP2 gNBS 및 CTSH gNBS를 5 mM MES, 10 μM 양이온 및 IS:155의 125 μl 작업 용액에서 자극하였다. 그들을 5 μl 완충액(AC)으로 자극하거나 5 μl 대조군 혈청 C 또는 풀링된 정상 혈청(PNS)으로 3회 자극하였다. 혈청은 대안적으로, 최종 농도가 5 mM 또는 둘 모두가 되도록 65℃에서 10분 동안 EDTA로 사전에 처리하였다. RFU에 보고된 결과 활성은 각 센서에 대해 표시된다.
도 43은 혈청의 열 전처리를 포함하는 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 5 mM MES, 10 μM 양이온 및 IS:155의 125 μl 작업 용액에서 CTSH gNBS를 자극하였다. 그들을 5 μl 완충액(AC)으로 자극하거나 이전에 65℃에서 열 처리했거나 열 처리하지 않은 5 μl PNS로 3회 자극하였다. CTSH gNBS의 활성은 30분 간격으로 6시간 동안 37℃ 인큐베이션에서 모니터링하였다. 차트는 열 전처리가 선형 활성을 초래한다는 것을 보여준다.
도 44는 혈청의 열 전처리를 포함하는 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 5 mM MES, 10 μM 양이온 및 IS:155의 125 μl 작업 용액에서 18개의 gNBS를 제조하였다. 그들을 5 μl 완충액(AC)으로 자극하거나 이전에 65℃에서 열 처리했거나 열 처리하지 않은 5 μl PNS로 3회 자극하였다. gNBS의 활성은 90분 동안 37℃ 인큐베이션 후 측정하였다. 결과는 샘플 RFU를 분석 대조군으로 나눈 RFI로서 표시된다(RFI = SM-(AC+SC). 차트는 열 전처리로 인해 센서 패널에 걸쳐 활성이 증가했음을 보여준다.
도 45는 상이한 온도에서 수행된 검정의 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 125 μL MMP12 및 CTSD gNBS를 5 μl 완충액)으로 자극하거나(검정 배경 그래프) 5 μl PNS로 3회 자극하고 검정을 VarioSkan Lux에서 37, 41 또는 45℃(열린 기호)에서 인큐베이션하였다. 대안적으로, 혈청을 65℃에서 12분 동안 열 처리한 다음, 5 μL를 표준 MES 완충액에서 125 μL MMP12 또는 CTSD gNBS에 3회 첨가하였다. 인큐베이션 기간 동안 10분 간격으로 형광을 측정하였다. 샘플 배경 측정은 센서 없이 5 μL의 혈청이 추가된 125 μL의 완충액과 함께 인큐베이션된 웰로부터의 결과를 보여주었다. 차트는 상승된 인큐베이션 온도가 혈청의 열 처리를 모방한다는 것을 보여준다.
도 46은 차트에 표시된 바와 같이, 18개의 상이한 표적 프로테아제에 특이적인 gBNS의 단백질 코로나의 검출을 보고하는 차트를 나타낸다. 175개의 인간 샘플에 걸쳐 관찰된 평균 및 최소 신호를 20 mg/ml 아세틸화 BSA 용액과 비교하였다. 그래프는 18개 센서 모두에 걸쳐 175개 샘플에 대한 평균 및 최소 형광 판독값을 보여준다.
도 47은 동결건조된 gNBS 시약의 정밀도를 검출하는 것에 관한 실험 결과를 보고하는 차트를 나타낸다. 선택된 gNBS를 세 가지 상이한 부형제 배합물인 A, B 또는 C 중 하나에서 384웰 플레이트에 동결건조시켰다. 각 배합물을 동일한 배치에서 제조하였지만 동결건조되지 않은 습식 시약과 비교하였다. (패널 A) 검정간 정밀도: 별도의 3일에 걸쳐 3개의 384웰 플레이트를 시험하였으며, 총 혈청 샘플은 256개이고 플레이트당 NBS는 4개였다. 각 플레이트에서 부형제당 64개의 혈청 샘플을 시험하였다. %CV는 각각의 부형제에 대한 평균의 샘플 표준 편차와 평균의 몫을 평균하여 측정되었다. (패널 B) 검정내 정밀도: 부형제당 시험된 64개 혈청 샘플과 4개의 NBS. 정밀도는 384웰 플레이트 실행 내에서 각 부형제의 평균 %CV로부터 측정되었다.
도 48은 폐암 및 비-폐암 그룹으로 분리된 256명 또는 175명의 환자들에 대해 평가된 각 NBS에 대한 평균 RFU를 보고하는 표를 나타낸다. 각각 207명과 175명의 총 환자를 조사한 EU 351 및 US SST-18로 지칭되는 두 가지 연구가 제시된다. 숫자는 표시된 그룹에 대해 각 gNBS에 의해 생성된 평균 RFU를 나타낸다. 각 그룹의 대상체는 병리학적으로 확인된 폐암 사례 또는 임상적으로 확인된 음성 폐암 사례로 구분된다. 모든 사례는 치료받지 않은 환자이다.
도 49는 폐암 및 비-폐암 샘플의 RFU를 비교하는 스튜던트 양측 이분산 t-테스트(student's two-tailed, heteroscedastic t-Test)에 대한 p-값의 표를 나타낸다.
도 50은 분자량(Da) 대 입자 직경(옹스트롬)의 플롯을 나타낸다. Mn: 수평균 거대분자량, Mw: 중량평균 거대분자량, Mv: 평균 거대분자량[문헌(Loebach 1975[2])의 도 1에 해당].
도 51은 프로테아제 활성 검출을 위한 그래핀 바이오센서에서 펩타이드 길이(A) 및 중합체 층 두께(B)의 허용 가능한 비율을 나타낸다.
도 52는 올리고에틸렌 글리콜의 수용성 유기 분자의 예시적인 단일층 및 그래핀 표면에 대한 관련 부착을 위한 관련 반응 도식을 나타낸다.
도 53은 ~7.00의 동일한 pH 값에 대한 2개의 적정 곡선에서 NaOH 부피의 차이가 카복시그래핀의 중량 증가당 이온화 기(카복실기)의 농도를 제공하는 카복시그래핀의 pH 적정을 나타낸다.
도 54는 2개의 상이한 염료로 표지된 상이한 절단 가능한 펩타이드 서열, 특히 TCPP로 표지된 MMP-9(GAGVPLS-LYSGAG)(서열번호: 132) 및 로다민 B로 표지된 MMP-9(GCDDHAAG-LLGLDG)(서열번호: 133)을 제시하는 코어 입자 G-PEI 및 G-TEG3아민을 갖는 3개의 상이한 대조군 혈청 샘플에서 표적 바이오마커 MMP-9의 검출을 나타내는 실험 결과를 도시하는 차트를 나타낸다. 형광 강도는 3개의 대조군 샘플(각 차트에서 A, B 및 C로 표시됨)에 표시된 바와 같이 시간 경과에 따라 측정되었다.
도 55는 분산 및 용매 제거가 gNBS의 흡광 효율에 미치는 예시적인 영향을 도시하는 차트를 나타낸다. gNBS의 작업 용액은 25 μg/mL의 농도로 155 mM NaCl을 사용하여 5 mM MES pH 7.4에서 제조하였다. 초음파처리 하지 않은 2개의 로트(로트 1 및 2)와 1시간 초음파처리하여 제조된 2개의 로트(로트 3 및 4) 및 용매 제거(로트 4)를 반영하는 각 로트에 대해 250 nm 내지 650 nm에 걸쳐 흡광도를 측정하였다. 데이터는 OD270에서 스펙트럼 또는 흡광 효율로 표시된다. 특히 도 54 패널 A는 250 nm에서 650 nm에 걸친 NE 바이오센서에 대한 흡광 효율의 변화를 나타낸다. 도 54 패널 B는 250 nm에서 650 nm에 걸친 MMP15 바이오센서에 대한 흡광 효율 변화를 나타낸다. 표는 각 바이오센서의 4개 로트에 걸쳐 OD270에서 흡광 효율의 증가를 강조한다.
도 56은 완충액 배합물이 신호 대 잡음 성능에 미치는 영향을 나타낸다. gNBS의 작업 용액은 도 14에 상세히 설명된 바와 같이 완충액에서 제조하였다. 신호 대 잡음은 샘플/검정 대조군(RFI)에서 관찰된 형광 비율을 기반으로 계산하였다. MES를 함유하는 완충액 7만 완충액 1(Hepes)과 유사하게 수행되었다. 30 mM NaCl(완충액 8) 또는 155 mM NaCl(완충액 9)을 추가하면 RFI가 증가한다.
도 57은 완충액 배합물 및 열 처리가 신호 대 잡음 성능에 미치는 예시적인 영향을 도시하는 차트를 나타낸다. gNBS의 작업 용액은 10 μM 2가 양이온 및 155 mM NaCl이 보충된 HEPES 또는 MES 완충액에서 제조하였다. 샘플을 65℃에서 12분 동안 열 처리(MES 기준선)하거나 열 처리하지 않고(HEPES 기준선) 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다.
도 58은 gNBS 센서의 예시적인 콜로이드 안정성을 도시하는 차트를 나타낸다. gNBS의 작업 용액은 25 μg/mL에서 155 mM NaCl을 사용하여 5 mM MES ph 7.4에서 제조하였다. 용액을 볼텍싱할 때 각 로트에 대해 250 nm 내지 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 60분 후 두 번째 샘플을 측정하였다. 데이터는 시간 0으로부터 흡광도의 배수 변화를 나타낸다. 상이한 샘플은 초음파처리 하지 않은 2개의 gNBS 로트(로트 1 및 2)와 1시간 초음파처리하여 제조된 2개의 로트(로트 3 및 4) 및 용매 제거(로트 4)를 반영한다. 비교를 위해 FeNBS(300 μg/mL)가 포함되어 있다. 로트 2는 콜로이드 안정성을 과소 평가할 정도로 현탁액에 전혀 남아있지 않은 큰 gNBS 입자가 있었다.
도 59는 gNBS에 대한 상이한 제조 프로토콜에 걸친 신호 대 잡음의 예시적인 평가를 도시하는 차트를 나타낸다. CTSB는 원래의 철 백본(FeNBS)을 사용하고, 그래핀 백본과 원래의 KSU 프로토콜(gNBS 로트 1)을 사용하고, 확장된 건조 절차를 사용하는 KSU 프로토콜의 복제물(gNBS 로트 2), 프로브 초음파처리된 gNBS 백본(gNBS 로트 3) 및 제조 시 용매 제거를 위해 완전히 건조된 프로브 초음파처리된 gNBS 백본(gNBS 로트 4)을 사용하여 제조되었다. 그래프는 시간 0에서 RFI(SM/AC)로 측정한 신호:잡음(A), 풀링된 정상 혈청과 함께 인큐베이션 60분 후 신호:잡음(B), RFI 60/RFI 0의 비율로서 표현된 신호:잡음(C)을 나타낸다. 별도의 실험(D)에서 CTSB, MMP12 및 NE에 대해서도 유사한 관찰이 이루어졌다.
도 60은 다중 설정에서 gNBS의 검출 결과를 도시하는 차트를 나타낸다. 신호는 100%에서 얻은 신호의 백분율로서 표시된다.
도 61은 Fe 및 그래핀 바이오센서에 대한 다양한 제조 프로토콜에 걸친 신호 대 잡음의 예시적인 평가를 도시하는 차트를 나타낸다. 바이오센서는 원래의 철 백본(FeNBS)을 사용하고, 그래핀 백본과 원래의 KSU 프로토콜(gNBS 로트 1)을 사용하고, 확장된 건조 절차를 사용하는 KSU 프로토콜의 복제물(gNBS 로트 2), 프로브 초음파처리된 gNBS 백본(gNBS 로트 3) 및 제조 시 용매 제거를 위해 완전히 건조된 프로브 초음파처리된 gNBS 백본(gNBS 로트 4)을 사용하여 제조되었다. 그래프는 시간 0에서 그리고 2개의 상이한 정상적인 인간 혈청과 함께 인큐베이션 60분 후 RFI(SM/AC)로 측정된 신호:잡음을 평균해서 나타낸다. 4개의 예시적인 바이오센서가 표시된다.
본 개시내용은 다양한 생물학적 마커의 비침습적 검출 및 정량화를 위한 검정을 위한 그래핀 기반 바이오센서 및 관련 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.
본원에 사용된 "그래핀"이라는 용어는 2차원 벌집 격자 나노구조로 배열된 단일 원자층으로 이루어진 탄소의 동소체를 나타낸다. 명칭은 '흑연'과 접미사 -ene에서 유래한 것으로, 탄소의 흑연 동소체가 수많은 이중 결합을 포함한다는 사실을 반영한다. 특히, 그래핀은 본 발명의 의미에서 육각형 방식으로 배열된 sp2 혼성화에서 적어도 1000개의 탄소 원자의 단일 층을 지칭한다. 본원에서 교환적으로 사용되는 그래핀 응집체 또는 그래핀 입자는 서로 적층된 적어도 두 층의 그래핀을 지칭한다.
따라서, 본 개시내용의 의미에서 그래핀은 적어도 98%의 탄소 원자가 시트로 조직된 것을 포함한다. 그래핀 시트에서 각 원자는 가장 가까운 3개의 이웃 원자와 σ-결합에 의해 연결되어 있으며, 하나의 전자를 전체 시트에 걸쳐 확장되는 전도 밴드에 기여한다. ([3]) (실시예 1 및 실시예 2에서 논의된 반응식 및 특성 참조).
본 개시내용의 의미에서 그래핀에서, 전형적인 그래핀 표면의 전형적인 겉보기 정적 접촉각 θ*는 θ* = 150 ± 15°이며, 이는 경계선 초소수성(θ* ≥150°)이다. 이러한 발견과 그래핀이 대부분 탄소(최소 99 ± 1%)로만 이루어져 있다는 사실에 근거하여, 그래핀이 알려진 가장 소수성 물질 중 하나라는 것은 잘 확립되어 있다. 따라서, 물에서의 분산성은 1 밀리리터당 1×10-8 mg 미만이다. [4].
그래핀은 흑연을 초과하는 흡수 계수로 UV, 가시광선 및 근적외선 영역의 빛을 흡수한다[5]. 따라서, 본 개시내용의 의미에서 그래핀은 모든 가시 파장의 빛을 흡수하도록 구성된 물질이다. ([3]) 적층된 그래핀은 원적외선부터 중적외선(100 내지 1500 nm)에 이르는 전체 파장 범위에 걸쳐 빛을 흡수하는 특징이 있다 [6]. 폭발 그래핀(5-7층)의 경우, 본 발명자들은 660 nm에서 흡수 계수 알파가 5,000 ml mg-1 m-1을 초과하는 것을 발견했으며 이는 문헌과 매우 일치한다[7]. 일반적으로, 다양한 공급원의 그래핀은 660 nm에서 흡수 계수 알파가 1,000 내지 5,000이다.
본 개시내용의 의미에서 그래핀에서, 직접 여기는 심자외선/원자외선에서 발생하고, 가시광선 범위에서 그래핀의 표면 플라즈몬은 다양한 강도를 가지고, 그래핀의 직접 여기 및 표면 플라즈몬은 여기 상태(예컨대 형광 염료 또는 입자)에서 형광 신호를 방출할 수 있는 대부분의 검출 가능한 모이어티를 효과적으로 여기시킬 수 없다. 이 표시는 전자기 스펙트럼의 전체 가시광선 범위(400 내지 730 nm)에 적용되며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. [6]
본 개시내용의 의미에서 그래핀은 순수 그래핀(원래의 순수하고 산화되지 않은 형태의 그래핀)뿐만 아니라 산화되거나 표면 변형된 형태의 그래핀, (표면 변형된) 그래핀 및 당업자가 식별 가능한 추가 그래핀 형태를 포함한다.
순수 그래핀은 XRD(층 거리), TEM 및 SEM(모폴로지), RAMAN(존재하는 경우, 층 거리 및 난층(turbostratic) 특성) 및 FTIR(탄소-탄소 이중 결합 및 방향족 배음(overtone)을 제외한 시그니처 유기 작용기의 결여)과 같은 당업자가 식별할 수 있는 기술로 식별할 수 있다. 특히, FTIR 및 RAMAN 스펙트럼은 그래핀 표면의 산화/화학적 변형을 고려하여 관련 스펙트럼이 변할 것이기 때문에 표면만 산화되거나 화학적으로 변형된 그래핀에 대해 순수 그래핀을 식별하는 데 사용될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. XRD, TEM, SEM, RAMAN, FTIR은 당업자가 식별할 수도 있는 관련 스펙트럼의 변화를 고려하여 그래핀의 층 구조를 파괴하는 산화/화학적 변형에 대해 순수 그래핀을 식별하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 모든 경우에 원소 분석은 그래핀 재료가 98% 초과의 탄소임이 확인될 것이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본 개시내용의 실시양태에서, 본 개시내용의 의미에서 순수 그래핀은, 하나 초과의 순수 그래핀 시트가 표적 바이오마커에 특이적인 검출 가능한 구성요소를 부착하도록 구성된 코팅 물질로 코팅된 그래핀 입자를 형성하는, 본원에 기재된 그래핀 코어 입자의 구성요소로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "입자" 또는 "미립자"라는 용어는 크기 부피, 밀도 또는 질량과 같은 뚜렷한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 물질의 일부를 나타낸다. 다양한 물질의 예시적인 입자는 2020년 12월 30일에 출원된 "폐 병태의 신속한 식별을 위한 광학 나노바이오센서"라는 제목의 미국 가특허 일련 번호 제63/132,058호와 사건 번호 P2685-PCT로 2021년 12월 29일에 출원된 "폐 병태의 신속한 식별을 위한 나노센서"라는 제목의 PCT 출원번호 ___________에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
본 개시내용의 의미에서 입자는 1 내지 5000 나노미터의 크기를 갖는다. 특히, 본 개시내용의 의미에서 입자는 1 내지 250 나노미터의 크기를 가질 수 있고, 나노스코픽 메조스코픽(nanoscopic mesoscopic)/시스템에서 50 내지 150 나노미터의 크기를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 크기는 입자의 임의의 두 지점의 최대 물리적 길이이다. 본 개시내용의 의미에서 입자에서, 입자의 크기는 입자의 임의의 두 지점 사이의 가장 긴 거리를 지칭한다. 예를 들어, 불규칙한 형상의 그래핀 입자는 불규칙한 형상의 그래핀 입자에서 임의의 두 탄소 사이에서 가장 긴 크기를 갖는다. 구형 형상 입자에서, 입자의 크기는 구형 형상 입자의 직경이다.
본 개시내용의 그래핀 입자에서, 그래핀 입자의 질량 분포는 원심분리 및 침강에 필요한 시간 측정 및 당업자가 식별할 수 있는 추가 기술에 의해 검출될 수 있다. 공기(또는 N2, Ar) 및 적합한 소수성 용매(예를 들어, 클로로포름)에서 그래핀 입자의 실제 크기는 동적 광산란(DLS)에 의해 결정될 수 있다. 입자의 표면 전하는 제타 전위 측정에 의해 결정될 수 있다.
그래핀 입자는 원자의 절반이 하부 그래핀 시트의 육각형 중심 바로 위에 놓이고, 원자의 절반이 원자 위에 놓이는 AB 또는 베르날 적층 형태(Bernal-stacked form)로 배열된 층을 가질 수 있다. 그래핀 입자는 한 층의 각 탄소 원자가 인접한 그래핀 층의 또 다른 탄소 원자 위에 정확히 배치되도록 층이 정확히 정렬된 AA 형태로 배열된 층을 가질 수도 있다. 난층 입자(AA 및 AB 적층)에서, 개별 층은 서로에 대하여 이동할 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본 개시내용의 그래핀 코어 입자는 하나 초과의 그래핀 층을 포함하는 구성에서 반데르발스 적층을 통해 응집된 순수 그래핀 시트를 포함한다.
본 개시내용의 의미에서, "시트" 또는 "층"은 1 내지 150 나노미터 범위의 두께를 갖는 2차원 나노구조를 나타낸다. 그래핀 물질의 육각형 격자를 갖는 단일 탄소 원자층은 0.34 nm로, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 그래핀의 단일층은 입사광의 2.3%를 흡수하여 약 97.7%를 통과시키므로, 본 개시내용의 그래핀 코어 입자에 2개 이상의 시트를 포함함으로써 특히 적층된 그래핀 층이 소수층(few layer)의 그래핀으로 구성될 때 적층된 그래핀 층의 전자적 상호작용으로 인해 발생하는 향상된 광 흡수(흑도)를 가능하게 한다.
본원에 사용된 "소수층의 그래핀"이라는 용어는 약 2 내지 약 100개의 그래핀 시트, 바람직하게는 3 내지 50개의 그래핀 시트, 보다 바람직하게는 5 내지 25개 시트 범위의 그래핀 층의 수를 나타낸다. 본원에 개시된 소수층의 그래핀에서, 최소 층 수는 2이고, 적층된 그래핀 층의 최대 수는 100이며, 그래핀의 층간 거리는 흑연의 0.337 nm와 비교하여 0.348 ± 0.003 nm이다. [8]. 적층된 그래핀 플레이크의 가장 큰 직경의 하한은 10 nm이고, 상한은 5,000 nm이다.
본 개시내용의 의미에서 그래핀 입자 내의 나노시트의 수는 투과 전자 현미경(TEM), X-선 회절(XRD), 라만 분광법 및 당업자가 식별할 수 있는 추가 기술에 의해 검출될 수 있다.
본 개시내용의 그래핀 입자에서, 그래핀 나노시트는 전형적으로 약 20 내지 약 500 nm(예를 들어, 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 통해 검출된 200 nm 또는 150 nm 크기) 범위의 크기를 가지며, 여기서 "크기"는 그래핀 코어 입자의 최대 지점간 거리(예를 들어, 구형 입자의 경우 직경, 또는 직사각형 형상의 경우 대각선 거리)를 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 입자는 2 내지 100개의 그래핀 시트를 갖는 소수층 그래핀 입자로, 본 개시내용의 검출 가능한 모이어티에 의해 방출되는 형광 신호를 효율적으로 소광시킬 수 있는 흡광 특성을 허용하며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 그래핀 입자는 900 nm 이하, 바람직하게는 500 nm 이하, 더 바람직하게는 350 nm 이하, 더욱 더 50 nm와 250 nm 사이의 크기를 추가로 가져서, 코팅 물질과 조합하여 본 개시내용의 안정한 코어 입자를 형성하고 피코몰 또는 심지어 펨토몰 농도에서 표적 바이오마커를 검출하는 것이 가능하다.
특히, 본원에 기재된 그래핀 입자를 형성하는 순수 그래핀 시트는 당업자가 식별할 수 있는 방법 및 기술에 따라 제공될 수 있다.
예를 들어, 순수 그래핀은 폭발 챔버에서 아세틸렌/산소 혼합물의 폭발을 통해 생성될 수 있다. 이렇게 생성된 그래핀 나노시트는 기상에서 응집체를 생성하고 에어로겔을 형성하며, 이는 디토네이션 그래핀 또는 폭발 그래핀으로도 식별되는 그래핀을 제공하기 위해 당업자가 식별할 수 있는 접근법에 따라 수집될 수 있다.
순수 그래핀은 또한 산화적 박리를 통해 흑연으로부터 얻을 수 있다. 관련 방법에 따르면, 흑연은 화학적으로 매우 가혹한 조건(예를 들어, 허머스 방법(Hummers Method)) 및 열 하에서 산화되어, 산화된 단일층 그래핀(그래핀 산화물로 명명됨)을 생성한다. 이어서, 그래핀 산화물은 당업자가 식별할 수 있는 접근법에 따라 하이드라진 또는 기타 환원제를 사용하여 소수층의 순수 그래핀으로 환원된다. [9]
플래시 합성을 수행하여 순수 그래핀을 얻을 수도 있다. 따라서, 플래시 그래핀을 얻기 위해 당업자가 식별할 수 있는 접근법에 따라 직류를 인가함으로써 유기 물질을 소수층의 그래핀으로 변형시킬 수 있다. [10, 11].
순수 그래핀은 또한 CVD 그래핀을 제공하기 위해 당업자가 식별할 수 있는 접근법에 따라 (민감한 광학 바이오센서에는 적합하지 않은) 기재 상에 그래핀 단일층을 생성하는 CVD(화학 기상 증착)를 통해 얻어질 수 있다. [9].
본원에 기재된 그래핀 코어 입자의 일부 실시양태에서, 순수 그래핀 출발 물질은 바람직하게는 당업자가 식별할 수 있는 공정 및 접근법으로 제조될 수 있는 디토네이션 합성 그래핀 또는 플래시 합성 그래핀을 사용하여 제조된다(예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함된 [12], [8], [13], [14] 참조).
디토네이션 크기의 그래핀의 제조는, 특히 촉매 물질의 사용 없이 순수 그래핀 나노시트 및 이러한 나노시트의 분지형 프랙탈 응집체를 생성하기 위해 상대적으로 높은 온도에서 반응 용기에서 산화제 또는 산소 공급원(예를 들어, O2, N2O, NO)과 함께 탄소-함유 물질(들)을 고체, 액체 또는 가스로서 제어된 디토네이션을 포함하는 1단계 공정을 수반한다. 일반적으로 반응 용기에 원하는 양의 반응물을 넣고 스파크를 사용하여 재료의 디토네이션을 달성한다. 종종 겔화를 거쳐 그래핀 입자를 포함하는 에어로졸 겔을 형성하는 에어로졸이 생성된다. ([15] 및 ([16]).
확장된 접근법에서, 장치는 반응 챔버, 반응 챔버와 작동 가능하게 연결된 진공 공급원, 및 점화 조립체를 포함한다. 반응 챔버는 탄소-함유 물질 공급원 및 산화제 공급원과 작동 가능하게 결합된다. 진공 공급원은 특히 미립자 물질의 생성 후에 반응 챔버의 내용물 중 적어도 일부를 선택적으로 배기하도록 작동 가능하다. 점화 조립체는 또한 반응 챔버에 작동 가능하게 연결되고, 각각의 공급원으로부터 반응 챔버로 전달되는 일정량의 탄소-함유 물질 및 일정량의 산화제의 연소를 개시하도록 구성된다. 점화 조립체는 그들 사이에 이온화 아크를 생성하도록 작동 가능한 한 쌍의 전극을 포함하며, 각 전극은 점화 조립체 내에서 제거 가능하게 수용되는 각 카세트 내에 포함되어 있다. 순수 그래핀의 대량 생산을 위한 확장된 장치 및 합성 공정은 2020년 6월 15일에 출원된 공동 계류 중인 미국 일련 번호 제63/039,087호 및 2021년 6월 15일에 출원된 상응하는 PCT/US2021/037321에 설명되어 있으며, 각각은 본원에 참조로 포함된다.
반응에 사용하기 위한 예시적인 탄소-함유 물질은 탄소가 풍부한 전구체, 가스, 가스 혼합물, 분말, 에어로졸, 및 기타 주사 가능한 물질을 포함한다. 탄소-함유 물질은 단일 물질 또는 화합물, 또는 탄소-함유 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어 석탄, 석유 코크스, 바이오 숯, 카본 블랙, 바이오 폐기물(예를 들어, 음식물 또는 농업 폐기물), 바이오매스 또는 유기 폐기물(예를 들어, 셀룰로오스 물질, 풀 등)이 포함된다. 탄소 함량이 더 높은 물질이 특히 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 출발 물질은 임의의 탄화수소 화합물, 특히 포화 또는 불포화 C1-C12 탄화수소 화합물을 포함할 수 있으며, 고도로 포화된 C1-C12 탄화수소가 특히 바람직하다. 특정 실시양태에서, 바람직한 탄화수소 물질은 아세틸렌, 에틸렌, 톨루엔, 부타디엔 및/또는 이소프렌을 포함한다. 온도 및/또는 압력 파라미터는 선택된 물질에 따라 조정될 수 있다.
하나 이상의 실시양태에서, 연소 반응은 적어도 3000 K, 적어도 3500 K, 또는 적어도 4000 K의 온도에서 발생한다. 특정 실시양태에서, 연소 반응은 약 3000 K와 약 5000 K 사이, 약 3500 K와 약 4500K 사이, 또는 약 4000 K에서 발생한다. 이러한 온도에서 탄소-함유 물질과 산화제의 연소는 흑연 그을음과는 대조적으로 고도로 정렬된 그래핀 미립자의 형성에 유리한 것으로 밝혀졌다. 헬륨, 네온, 아르곤 또는 질소와 같은 불활성 가스 물질은 필요한 경우 연소 동안 온도 조절을 돕기 위해 반응 용기에 충전된 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 또한, 특정 실시양태에서, 특히 연소 반응이 디토네이션인 실시양태에서, 반응 혼합물의 연소는 매우 빠르게 진행된다. 디토네이션은 전형적으로 매질을 통해 가속되는 초음속 발열 전선을 수반하며, 결국에는 충격 전선이 그 바로 앞에서 전파되도록 유도한다. 특정 실시양태에서, 연소는 약 5 ms에서 약 100 ms 사이, 약 10 ms에서 약 75 ms 사이, 또는 약 20 ms에서 약 50 ms 사이의 지속 시간을 갖는다.
디토네이션 전 반응 용기에 존재하는 탄소-함유 물질에 대한 산화제의 비율은 반응 혼합물의 디토네이션 시 형성되는 그래핀 미립자의 특성에 기여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 탄소-함유 물질에 대한 산화제의 몰비는 1.5 이하, 바람직하게는 1.0 이하, 보다 더 바람직하게는 0.5 이하이다. 특정 실시양태에서, 탄소-함유 물질에 대한 산화제의 비율은 약 0.1 내지 약 1.5, 약 0.18 내지 약 1.2, 약 0.18 내지 약 1.0, 또는 약 0.18 내지 약 0.8, 또는 약 0.18 내지 약 0.5이다. 이 공정은 대량 합성 또는 대량의 그래핀을 탁월한 순도로 합성할 수 있다. 본원에서 원하는 크기 범위의 그래핀 나노시트 미립자를 생성하는 바람직한 목적을 위해, 탄소-함유 물질에 대한 산화제의 비율은 바람직하게는 약 0.2 내지 약 0.5이며, 약 0.3, 0.35, 또는 0.4가 특히 바람직한 비율이다. 순수 그래핀의 바람직한 미립자는 크기가 약 20 내지 약 500 nm 범위이며, 대략 150 nm +/- 20 nm가 목표 크기 범위이다. 특히, 생성된 미립자가 단분산성인 것이 본 발명의 바이오센서에 필요하지 않다. 오히려, 다분산 그래핀 미립자 혼합물은 바이오센서를 제조하는 데 쉽게 사용될 수 있다. 사실상, 광 산란 실험에 따르면, 그래핀 응집체는 프랙탈 치수 Df = 1.8 ± 0.1인 작은 응집체로 구성된 미크론 스케일에서 프랙탈 치수 Df = 2.5 ± 0.1인 초-응집체 프랙탈 모폴로지를 특징으로 한다. 이전에는 (나노)바이오센서의 금속, 금속 산화물, 금속/금속 산화물 또는 반도체 입자에서는 이러한 거동이 관찰되지 않았다.
순수 그래핀을 합성하기 위한 대안적인 접근법은 플래시 그래핀(2019년 8월 23일에 출원된 PCT/US2019/047967, WIPO 공보 WO2020/051000, 본원에 참조로 포함됨)을 포함하며, 이는 다양한 탄소 기반 물질 또는 기타 탄소 공급원, 예컨대 석탄, 석유 코크스, 바이오 숯, 카본 블랙, 음식물 쓰레기, 고무 타이어 및 혼합 플라스틱 폐기물의 플래시 주울 가열(flash Joule heating)을 사용하여 물질을 그래핀으로 전환한다. 탄소 공급원은 두 전극 사이의 반응 용기에서 가볍게 압축되고, 커패시터 뱅크로부터 고전압 방전이 일어나 반응 용기 내의 탄소 공급원 물질을 100 ms 미만에 적어도 3000 K로 상승시킨다. 이 공정은 탄소 공급원의 비정질 탄소를 플래시 그래핀으로 전환한다. 이 공정의 수율은 출발 물질의 탄소 함량에 따라 크게 달라진다. 일부 실시양태에서, 탄소 공급원 재료는 물질의 전도도를 향상시키기 위해 카본 블랙 또는 또 다른 유사한 전도성 물질과 혼합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 플래시 그래핀은 20 nm 미만의 평균 입자 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 플래시 그래핀은 평균 크기가 0.5 내지 1.2 μm인 더 크지만 얇은 시트의 형태로 생성된다. 이러한 얇은 시트는 미립자 형태로 사용되는 대신 단일층의 그래핀 나노시트가 고체 표면에 증착되는 대체 센서에 적합할 수 있다.
이러한 새로운 합성 공정으로부터 생성된 순수 그래핀은 다양한 모폴로지를 채택할 수 있지만, 바람직하게는 단일 또는 다층 그래핀으로서 분지형 프랙탈 응집체, 나노시트, 결정질 플레이크, 나노판상체 및 작은판 모양 사슬(platelet chains)의 형태이며, 일반적으로 거시적으로 고순도(≥98.5% 탄소)의 솜털형 또는 보풀형 흑색 분말 또는 미립자 물질로서 특성화될 수 있다.
미립자는 가장자리가 중첩되어 서로 얽힌 얇은 단일층, 또는 2 내지 3층, 그러나 잠재적으로 최대 25층, 잠재적으로 최대 10층, 예를 들어, 2 내지 25층, 보다 더 바람직하게는 약 5 내지 약 10층(전체 크기는 20 내지 500 나노미터 범위임)을 포함하거나 이로 이루어진 나노시트의 보다 정렬된 적층으로서 전자 현미경 하에 관찰될 수 있다.
따라서, 본원에서 "순수" 그래핀에 대한 언급은 특히 유기 합성, 화학 기상 증착 또는 흑연으로부터의 박리를 통해 제조된 그래핀과 비교하여, 탄소 공급원을 고온(예를 들어, ~ >3000 K)으로 그래핀으로 전환(예를 들어, 무정형 탄소를 디토네이션 그래핀, 플래시 그래핀 등으로 급속 가열 또는 연소)하여 생성된 고순도 그래핀을 나타내기 위해 사용된다. 다시 말해, 순수 그래핀은 흑연 또는 흑연 산화물이 본질적으로 없는 것이 바람직하다. 이와 같이, 순수 그래핀은 이물질 및 불순물이 본질적으로 없고(0.5% w/w 미만, 바람직하게는 0.1% w/w 미만) 탄소 함량이 적어도 약 98.5%, 바람직하게는 적어도 99%(반대로 산소 함량은 1% 미만)임을 의미하는 고순도 그래핀이다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 디토네이션 그래핀의 검출에 대한 논의는 실시예 21 및 순수 디토네이션 그래핀의 예시적인 TEM 이미지를 나타내는 관련 도 19a 및 19b에 제공된다.
일부 실시양태에서 순수 그래핀 나노시트 입자 및 관련된 코어 입자에 기초한 바이오센서에 관한 것이며, 물질은 바람직하게는 0.25, 0.30, 또는 0.35의 디토네이션 그래핀을 포함한다.
일부 가장 바람직한 실시양태에서, 그래핀 나노시트 미립자는 프랙탈 형태의 그래핀 응집체를 포함한다.
대상체와 관련하여 본원에서 사용되는 "프랙탈"이라는 용어는 자기 유사성으로 알려진 특성, 즉 더 작은 부분으로 축소될 수 있는 기하학적 형상을 나타내는 대상체를 나타내며, 각각의 작은 부분은 전체의 축소된 카피물이다. 프랙탈 치수는 프랙탈이 공간을 채우는 것처럼 보이는 방식을 설명하는 통계량이다. [17]
따라서, 전형적으로, 프랙탈 형태의 적층된 소수층의 그래핀 피처는 Df = 2.5 ± 0.3(상한)과 Df = 1.8 ± 0.4(하한) 사이의 프랙탈 치수를 가지며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다 [8](실시예 1 또한 참조).
바이오센서에 사용되는 다른 나노 물질과 그래핀의 프랙탈 성질은 SEM(주사 전자 현미경)[18]과 같은 광 산란 방법 및 광 산란 방법[19]]과 같이 당업자가 식별할 수 있는 추가 기술을 통해 확인할 수 있다(실시예 1 또한 참조).
본원에 기재된 그래핀 코어 입자에서, 하나 초과의 그래핀 나노시트는 유기 및/또는 무기 물질의 코팅층으로 코팅된다. 따라서, 코팅이 가능하도록 그래핀 나노시트는 유기 및/또는 무기 물질에 존재하는 상응하는 작용기와 결합할 수 있는 작용기를 표면에 존재하도록 작용기화 또는 유도체화되어 코팅층을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 "작용기"라는 용어는 분자 구조 내에서 그 구조의 특징적인 화학 반응을 담당하는 원자의 특정 기를 나타낸다. 예시적인 작용기는 탄화수소, 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 기, 할로겐을 포함하는 기, 산소를 포함하는 기, 질소를 포함하는 기 및 인 및 황을 포함하는 기를 포함하며, 모두 당업자가 식별할 수 있다.
작용기와 같은 요소와 관련하여 사용된 "상응하는"이라는 용어는 적절한 조건 하에 서로 반응할 수 있는 2개 이상의 요소를 식별한다. 전형적으로, 상응하는 모이어티와 특정 작용기 사이의 반응은 두 요소의 결합을 초래한다.
본원에 사용된 "결합", "결합하는", "접합"이라는 용어는 요소가 서로 근접해 있는 요소의 안정한 회합을 초래하는 2개의 요소 사이의 매력적인 상호작용을 나타낸다. 각 요소가 분자에 포함된 경우 결합의 결과는 전형적으로 분자 복합체를 형성한다. 본 개시내용의 의미에서 매력적인 상호작용은 비공유 결합 및 공유 결합 둘 모두를 포함한다. 공유 결합은 원자 사이 또는 원자와 다른 공유 결합 사이에 전자 쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 화학 결합의 형태를 나타낸다. 예를 들어, 원자가 전자를 공유할 때 원자 사이에 형성되는 인력 대 반발 안정성은 공유 결합으로 알려져 있다. 공유 결합에는 σ-결합, π-결합, 금속 대 비금속 결합, 아고스틱 상호작용(agostic interaction), 및 3중심 2전자 결합을 포함한 많은 종류의 상호작용이 포함된다. 본원에 사용되는 비공유 결합은 전자쌍의 공유를 포함하지 않고 오히려 전자기 상호작용의 보다 분산된 변형을 포함하는 단백질 단백질 상호작용과 같은 화학 결합의 유형을 나타낸다. 비공유 결합에는 이온 결합, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 수소 결합, 쌍극자-쌍극자 결합이 포함된다. 정전기적 상호작용에는 반대로 하전된 두 개체 사이의 회합이 포함된다.
예시적인 쌍 작용기 및 상응하는 결합 화학을 하기 반응식 I 내지 IX에 나타낸다.
반응식 I
반응식 II
반응식 III
반응식 IV
반응식 V
반응식 VI
반응식 VII
반응식 VIII
반응식 IX
본 개시내용의 의미에서 상응하는 작용기의 추가 쌍은 당업자가 식별할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 얻어진 순수 그래핀 나노시트 미립자는 바이오센서용 코어 입자로서 사용하기에 적합한 유도체 화합물의 제조를 용이하게 하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 적합한 작용기로 기능화될 수 있다. 그래핀은 공유 결합 기능화를 통해 유기 기의 화학적 변형을 사용하여 기능화될 수 있다. 또 다른 접근법으로는 2020년 6월 17일에 출원된 PCT/US2020/038055에 상세히 기술된 펜톤 산화 공정이 포함되며, 상기 특허는 본원에 참조로 포함된다. 이 공정에서는 황산 제1철과 과산화수소를 산화제로서 사용하여 적층된 그래핀의 표면을 산화시켜 표면에 95% 초과의 카복실산 작용기를 생성한다. 수산화물, 알데하이드, 케톤 또는 옥시란과 같은 다른 모든 가능한 작용기는 5% 미만으로 존재한다.
방법은 일반적으로 철 공급원의 존재 하에 낮은 pH(< 5.0)에서 수용성 반응 용액에서 순수 그래핀 미립자를 과산화수소와 반응시키는 것을 포함한다. 반응 용액을 일정 시간 동안 진탕 또는 교반하여 반응 용액에서 생성된 하이드로퍼옥실 라디칼을 그래핀 미립자와 반응시켜 용액 내에서 순수 그래핀 미립자의 외부 표면을 산화시켜 그래핀/그래핀 산화물 미립자를 생성한다. 생성된 그래핀/그래핀 산화물 미립자는 다양한 반응을 통해 쉽게 변형될 수 있는 얇은 그래핀 산화물 표면 코팅 또는 쉘을 갖는 그래핀 코어를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 "카복시그래핀"으로 지칭되는 고밀도의 표면 -COOH 기를 갖는 바람직한 그래핀 유도체는 순수 그래핀 및 안정한 아지란 앵커를 생성하는 니트렌의 고리화첨가에 기초한 표면 기능화를 사용하여 합성될 수 있다. 특정 공정에서는 순수 그래핀 나노미립자는 실온에서 적합한 유기 극성 용매 시스템, 예컨대 무수 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 아세톤, 아세토니트릴 또는 클로로포름에 분산시킨다. 분산이 완료된 후, 1차 또는 2차 할로겐이 포함된 카복실산(예를 들어, 클로로아세트산, 3-요오드프로피온산, 4-브로모-부티르산, 4-브로모발레르산, 5-브로모발레르산 등)을 첨가한 다음 무수 히드라조산 또는 그 아지드 유도체, 예컨대 무수 아지드화나트륨(NaN3), 아지드화리튬 및/또는 아지드화칼륨을 첨가한다. 이어서, 반응 용액의 온도를 천천히(~1℃/분) 약 80℃까지 증가시킨다. 20℃와 40℃ 사이에서는 친핵성 치환 반응(SN)이 발생하여 유기 아지드와 용매-용해성 할로겐화나트륨이 형성된다. 유기 아지드는 이질소(dinitrogen) (N2)를 방출하고 ~50℃를 초과하는 온도에서 니트렌 중간체를 형성한다. 니트렌은 질소 바깥쪽 쉘에 8개의 전자가 아닌 6개의 전자를 특징으로 한다. 이 반응성 중간체는 그래핀 벌집 격자의 표면에서 Π-Π 이중 결합과 고리화첨가를 거쳐 안정한 아지란 앵커(3원 C-N-C 고리)를 형성한다. 아지란-고리화첨가는 그래핀 자체의 광학적 및 전기적 특성을 손상시키지 않으면서 그래핀 표면에 맞춤형 양의 카복실산을 추가하는 기회를 제공한다. 이 경우, 추가 기능화 및/또는 수용성 중합체 코팅과의 상호작용을 위해 고밀도의 카복실산기를 그래핀 나노시트 미립자의 표면에 걸쳐 추가할 수 있다(실시예 2 내지 9 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 추가 반응 및 코팅층의 형성을 가능하게 하는 그래핀의 추가적인 기능적 변형이 기술될 수 있다. 이와 관련하여, 지방족 연결이 본원에서 기능화를 위해 사용되지만, 그래핀 표면의 화학적 아미노화에 대한 방향족 반응도 문헌에 기술되어 있다. ([20] 본원에 참조로 포함됨(실시예 10 참조).
또한, 추가 변형을 수행하여 상기 기재된 기능화 대신에 또는 그에 추가하여 양이온성 중합체를 결합시키는 데 적합하도록 그래핀의 표면 전하를 감소시킬 수 있으며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 기재된 그래핀 코어 입자에서, 그래핀 나노시트는 유기 및/또는 무기 물질의 코팅층으로 코팅된다.
본원에 사용된 "코팅층"이라는 용어는 표면 또는 바디를 덮는 물질의 시트, 양, 또는 두께를 나타낸다. 특히, 본 개시내용의 의미에서 코팅층은 그래핀 입자의 표면을 덮는 유기 및/또는 무기 물질의 두께를 나타낸다. 본 개시내용의 그래핀 코어 입자에서 코팅층은 두 가지 주요 기능을 갖는다: a) 수성 완충액에 그래핀의 분산을 허용하고, b) 그들의 테더링된 상태(tethered state)에서 효과적인 소광을 용이하게 하기 위해 20 nm 미만의 본 개시내용의 부착된 검출 가능한 모이어티의 거리를 유지한다.
특히, 본원에 기재된 실시양태에서, 코팅층은 25℃에서 1 중량%의 수용해도를 갖는 친수성 유기 및/또는 무기 화합물로 도포된다.
본원에 사용된 "유기 화합물"이라는 용어는 탄소-수소 결합 및 물로부터의 수소 결합을 촉진 및/또는 수용하는 능력을 포함하는 임의의 화합물을 나타낸다. 유기 화합물에서 수소 원자의 전부 또는 일부는 다른 원자로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 "무기 화합물"이라는 용어는 C-H 결합을 포함하지 않는 임의의 화학 물질에 대한 화학물질을 나타낸다. 전형적으로, 무기 화합물은 불소보다 무거운 적어도 하나의 원소를 특징으로 한다.
특히, 본원에 기재된 바이오센서를 제공하기에 적합한 유기 및/또는 무기 화합물은 수용해도가 H2O 1 리터당 적어도 10 g이고 본원에 기재된 바와 같이 그래핀에 공유 결합될 수 있거나 물에서 정전기적으로 안정적으로 부착될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오센서를 제공하기에 적합한 유기 및/또는 무기 화합물은 컨센서스 log P(또는 cLogP) < 0을 특징으로 한다.
본 개시내용의 의미에서 cLogP 값은 n-옥탄올과 물 log(C옥탄올/C물) 사이의 분배 계수의 로그를 지칭하며, 이는 당업자가 알고 있는 바와 같다. 높은 친유성은 높은 cLogP 값에 해당한다. 본 개시내용의 코팅의 유기 분자는, 특정 cLogP 값을 갖는 모이어티 및/또는 치환체의 조합으로 구성될 수 있으며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본 개시내용에 따른 코팅 물질은 1과 -2.5 사이, 바람직하게는 0 내지 -2의 범위의 cLogP를 가질 것으로 예상된다.
일부 실시양태에서, 무기 화합물은 메조다공성 실리카, 메조다공성 실라잔, 산화알루미늄, 산화주석, 이산화티타늄, 이산화지르코늄, 란타나이드의 산화물을 포함한다. 알콕사이드 및 알콕시-아민, 및 아민 전구체(예를 들어, Si(NH-CH3)4; Si(O-CH2-CH3)3(CH2-CH2-CH2-NH2); M(O-CH2-CH3)4, 이때 M=Si, Sn, Ti, Zn; 또는 M(O-CH2-CH3)3, 이때 (M=Al 또는 란타나이드(III) 양이온)는 그래핀 또는 화학적으로 변형된 그래핀의 표면에서 하이드록실기, 카복실산 또는 옥시렌 고리와 반응하여 안정한 O-금속 결합을 형성한다. 이것은 그래핀이 부착된 금속 주변의 알콕시, 알콕시-아민, 및 아민-결합이 가수분해로 이어져 그래핀을 둘러싼 반도체-산화물 및 금속-산화물 층을 생성한다. [21]
특히, 일부 실시양태에서, 무기 화합물은 직경이 2 nm와 50 nm 사이인 기공을 갖는 실리카 형태인 메조다공성 실리카일 수 있다. 메조다공성 실리카는, 예를 들어, 종종 MPTMS로 약칭되는 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 또는 (3-머캅토프로필)트리메톡시실란의 출발 물질로 제조될 수 있다. 예시적인 공정에서, 실리카 전구체는 실온에서 24시간 동안 교반하여 테트라하이드로푸란/물 혼합물(THF/H2O: 99:1 내지 95:5 중량%)에 침전시킨 후, 5,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 H2O에 재분산한 후 원심분리(5,000 RPM에서 15분 동안)에 의해 수집될 것이다. 그래핀 주위에 (적층된) 메조다공성 실리카 층의 두께는 TEOS 또는 MPTMS와 그래핀 사이의 중량비(0.001/1.0 내지 0.1/1)에 의해 결정될 것이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 있다.
실시양태에서, 무기 화합물이 메조다공성 실리카인 경우, 극성 Si-OH 기를 특징으로 하는 실리카 표면의 작용화는, 예를 들어, 다음 단계 중 하나에 의해 달성될 수 있다:
- 실릴 에테르 형성: Si-OH + X-R -> Si-O-R + HX (X = 할로겐)에 이어서 유기 화학. 이를 위해, 유기 기 R은 극성 작용기를 포함해야 한다
- 펩타이드 서열의 C- 말단 단부 또는 그 측쇄의 카복실산 에스테르 기를 안정한 아미드 결합에 의해 코팅에 포함된 아민기에 테더링하는 단계.
- 그래핀 주변의 메조다공성 실리카 층(또는 금속 산화물 층)을 SiCl4, SiHCl3, SiH2Cl2 또는 Si(CH3)2Cl2와 반응시킨 후 펩타이드의 N-말단 단부를 표면의 Si-Cl 기에 화학흡착시키는 단계. 이것은 극성 하이드록실, 티올 또는 카복실산기를 반응시켜서 달성될 수도 있다.
- 표면의 극성 Si-Cl 기는 NaN3(아지드화나트륨)과 반응하여 실리콘-아지드를 형성하고 이는 클릭 반응을 거친다.
일부 실시양태에서, 유기 화합물은 지방족 아민, 방향족 아민, 올리고에틸렌 글리콜, 지방족 올리고아민, 에틸렌 올리고이민, 지방족 카복실산, 방향족 카복실산, 지방족 알코올, 지방족 설폰산, 방향족 설폰산 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코팅층을 형성하는 무기 및/또는 유기 화합물은 하나 이상의 중합체를 포함한다. 본원에 사용된 "중합체"라는 용어는 매우 큰 분자, 또는 반복되는 많은 서브유닛으로 구성된 거대분자로 이루어진 물질(substance) 또는 물질(material)을 나타낸다. 중합체는 유기 또는 무기, 합성 및 천연일 수 있으며 일반적으로 단량체로 알려진 많은 작은 분자의 중합을 통해 생성된다. 결과적으로 작은 분자 화합물에 비해 큰 분자 질량은 인성, 고탄성, 점탄성, 및 결정보다는 무정형 및 반결정질 구조를 형성하는 경향을 포함하는 고유한 물리적 특성을 생성하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다 [22].
하나 이상의 실시양태에서, 코팅 유기 중합체는 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:
[화학식 I]
상기 식에서, M1 내지 Mm은 동일하거나 상이한 중합성 유기 단량체에 의해 형성된 중합된 단량체 모이어티이고, 여기서 m은 1 내지 10의 범위이고, y1, y2 내지 ym은 각각 독립적으로 1 내지 1,000이다.
특히, 예시적인 중합성 유기 단량체는 아지리딘 프로필렌 옥사이드, 에틸렌 글리콜, 아크릴산, 메타크릴산, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 메타크릴아미드, N-이소-프로필아크릴아미드, 2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, 2-비닐피리딘, 2-비닐피리딘 N-옥사이드, 2-에틸- 2-옥사졸린을 포함한다.
따라서, 하나 이상의 실시양태에서, 하나 이상의 수용성 유기 중합체는 그래핀 유도체(예를 들어, 카복시그래핀)의 표면에 첨가될 수 있다. 화학식 I의 적합한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, (메트)아크릴레이트- 및 (메트)아크릴아미드 중합체, 폴리스티렌-카복실산, 폴리스티렌-아민뿐만 아니라 천연 생체중합체(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키토산, 알기네이트, 셀룰로오스, 및 히알루론산)뿐만 아니라 이들의 혼합물 또는 공중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 단독중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민, 폴리카프로락톤, 폴리비닐 알코올, 폴리글리콜레이트, 폴리비닐피롤리돈, (메트)아크릴레이트- 및 (메트)아크릴아미드 중합체, 폴리스티렌-카복실산, 폴리스티렌-아민, 폴리스티렌-설폰산, 덱스트란, 풀루란, 키토산, 알기네이트, 셀룰로오스, 및 히알루론산, 및 이들의 혼합물 또는 공중합체를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 중합체는 블록 공중합체를 포함하거나 이로 이루어진다. 블록 공중합체가 사용되는 이들 실시양태에서, 소수성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리이소부틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 추가의 중합체는 블록 공중합체가 컨센서스 log P < 0 또는 H2O 1 L당 1.0×103 그램 초과의 수용해도를 특징으로 하는 한 블록 공중합체의 구성요소가 될 수 있다. [23] 소수성 중합체는 순수 그래핀의 표면에 흡착될 것으로 예상되는 반면, 그들의 친수성 성분은 수분산성을 매개할 것이다. 폭발 그래핀에서와 같이 -그래핀의 표면 전하가 양전하(제타 전위 = + 60 mV)인 일부 실시양태에서, [1,8] 이는 폴리스티렌-설폰산과 같은 음으로 하전된 중합체가 폴리스티렌의 블록 공중합체 및 당업자가 식별 가능한 추가 유기 공중합체에 사용될 때 소수성 및 전하 인력의 조합을 가능하게 한다.
소수성-친수성 블록 공중합체가 사용되는 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 또한 그래핀을 잘 분산시키는 용매(예를 들어, 디메틸포름아미드(DMF))에 용해될 것이다. 계속적인 초음파처리 하에, H2O가 혼합물에 첨가되어 블록-공중합체의 소수성 단부가 그래핀에 결합하도록 한다. 이러한 결합은 소수성-친수성 블록 공중합체에 음으로 하전된 기의 존재로 인해 강화되며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 바람직한 유기 중합체는 폴리에틸렌이민, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, (메트)아크릴레이트- 및 (메트)아크릴아미드 중합체뿐만 아니라 폴리스티렌-카복실산 및 폴리스티렌-아민 중 하나 이상을 포함한다. 다른 바람직한 코팅은 화학적으로 변형된 올리고에틸렌 글리콜, 및 올리고이민, 및 스타버스트(starburst) 덴드리머이다.
일부 실시양태에서, 그래핀 입자는 수용성 유기 분자, 예를 들어, 올리고에틸렌 글리콜의 단일층으로 코팅될 수 있고, 이는 그래핀의 표면에 테더링될 수 있다(실시예 32 참조).
지방족 올리고이민, 지방족 티오에테르, 스타버스트 덴드리머, 수용성 펩타이드(컨센서스 서열 이외), 탄수화물(예를 들어, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 프럭토스, 시알산, 히알루론산, 덱스트란, 글리칸 유사 Gb3 트리사카라이드, 갈라비오스). 모든 탄수화물은 다양한 위치에서 아미노화될 수 있다는 점에 주목한다.
일부 실시양태에서, 그래핀 입자는 무기 수용성 쉘(예를 들어, 메조다공성 실리카 나노층)에 의해 코팅될 수 있다. 메조다공성 실리카, 메조다공성 아미노실리카 및 이산화티타늄이 바람직하다.
본 개시내용의 그래핀 코어 입자에서, 하나 이상의 유기 및/또는 무기 화합물은 그래핀 나노시트의 표면에 존재하는 작용기(예를 들어, 카복실기, 실시예 3 내지 9 참조)와 반응하여 그래핀 응집체 주변에 얇고 조밀한 중합체 층을 형성한다(두꺼운 층 또는 할로와 반대임). (실시예 30, 실시예 32, 실시예 35 참조). [24]
본 개시내용의 실시양태에서, 25℃에서 1 중량%의 수용해도를 갖는 유기 및/또는 무기 화합물의 코팅층에 의해 코팅된 하나 초과의 순수 그래핀 나노시트를 포함하는 그래핀 코어 입자는 놀랍게도 수용액에서 안정하고 표적 바이오마커에 특이적인 검출 가능한 성분을 부착할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 특징을 갖는 그래핀 입자가 수용액에서 20일 또는 심지어 30일을 초과할 수 있는 안정성을 나타낸다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 추가로, 농도에 따라, 그렇게 코팅된 그래핀 입자의 가능한 침강은, 예를 들어, 입자를 분산시켜 95% 초과의 입자로 구성된 용액을 얻을 수 있도록 초음파처리를 통해 해결할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
특히, 기재된 바와 같은 바이오센서는 검출 가능한 모이어티의 광 흡수가 완충 현탁액에서 30일에 걸쳐 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하로 감소하는 것으로 정의되는 완충 현탁액에서 화학적으로 안정하고 물리적으로 안정하다.
본원에 사용된 "안정한" 및 "안정성"이라는 용어는 화학적 안정성뿐만 아니라 콜로이드 안정성을 나타낸다.
본원에 사용된 "화학적 안정성"이라는 용어는 바이오센서의 화학적 동일성의 보존을 지칭한다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 바이오센서는 그래핀, 코팅 물질, 펩타이드 및 검출 가능한 모이어티를 포함하는 바이오센서의 각 구성요소를 서로 연결하는 화학 결합을 포함한다. 또한, 그래핀, 코팅 물질, 펩타이드 및 검출 가능한 모이어티 각각은 원자를 함께 연결하여 그래핀, 코팅 물질, 펩타이드 및 검출 가능한 모이어티를 형성하는 화학 결합을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 바이오센서의 화학적 동일성이 보존된다는 것은 바이오센서를 구성하는 화학 결합이 끊어지지 않고 새로운 화학 결합이 형성되지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 화학적 무결성은 원소 분석, UV-vis 흡수 분광법, 자기 공명 분광법, 라만 분광법, IR 분광법, 및 형광 분광법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 측정에 의해 확인될 수 있다.
본원에 사용된 "콜로이드 안정성"이라는 용어는 바이오센서의 콜로이드 현탁액의 물리적 상태의 보존을 지칭한다. 콜로이드 안정성은 반데르발스 및 정전기적 상호작용(고전적인 DLVO(Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) 이론), 입체적 상호작용(예를 들어, 중합체 흡착) 및 소수성 효과를 포함하는 여러 유형의 상호작용에 따라 달라진다. 전기 영동 광산란(ELS: electrophoretic light scattering)은 분산이 안정적으로 유지될 가능성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 기술이다. ELS로 분산액의 제타 전위를 측정할 수 있으며, 이는 정전기 상호작용에 대한 정보와 외삽에 의한 그들의 응집 경향에 대한 정보를 제공한다. 제타 전위는 분산 안정성의 신뢰할 수 있는 지표로 간주되지만 입체 효과, 침강 또는 소수성 효과와 같은 여러 파라미터도 강력한 영향을 미친다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 코어 그래핀 입자 및 관련된 바이오센서는 완충 현탁액에서 검출 가능한 모이어티의 광 흡수가 30일에 걸쳐 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하로 감소하는 것으로 정의되는 완충 현탁액에서 화학적으로 안정하고 물리적으로 안정하다.
따라서, 본원에 기재된 실시양태에서, 본 개시내용의 안정한 그래핀 코어 입자는 수용액에서 현탁액에 포함될 때, 적어도 95%의 입자가 OD650에서 콜로이드 안정성 변화가 -24% 이하인 현탁액에 남아있는 용액을 초래하는 그래핀 입자를 지칭한다.
특히, 콜로이드 안정성 변화를 반영하는 데이터는 하위 범위와 함께 26% 이하이다. 22% 및 25% 평균 24% 침강은 본 개시내용에 따른 4개 로트의 나노바이오센서 최악의 성능을 반영한다. 하나의 대표적인 실시양태에서, OD650에서 측정된 60분에서의 그래핀의 안정성은 NE 및 MMP15 나노바이오센서의 절대 콜로이드 안정성의 9% 및 10% 감소를 나타냈다(실시예 40의 로트 4 참조). 따라서, 바람직한 실시양태에 따른 본 개시내용의 그래핀 바이오센서의 수용액에서 콜로이드 안정성은 10% 미만으로 감소할 것으로 예상된다.
특히, 본원에 기재된 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 안정한 그래핀 코어 입자는 적어도 2.40 ± 0.05×10-5 mol/g, 바람직하게는 최대 6.0 ± 0.5×10-4 mol/g의 패킹 밀도로 1-20 nm 두께의 코팅층을 형성하기 위해 반응된 하나 이상의 유기 및/또는 무기 화합물을 포함한다.
따라서, 본 개시내용의 바람직한 안정한 그래핀 코어 입자에서, 부착된 코팅층의 최소 기하학적 연장은 0.45 nm이고, 20 nm까지 갈 수 있고, 코팅층은 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%를 초과한다. 가장 바람직하게는, 중합체의 단일층이 그래핀 주변에 형성되고, 바람직하게는 그 안에 그래핀 나노시트를 완전히 캡슐화한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 그래핀 입자는 주사 전자 현미경 및 디지털 광산란 측정을 사용하여 결정될 때 평균 10 nm 내지 5000 nm, 바람직하게는 150 내지 500 nm의 크기를 갖는다.
이러한 실시양태에서, 그래핀 입자 및 관련된 바이오센서가 12개월 초과 동안 수용액에서 안정적인 예를 통해 그래핀 코어 입자의 안정성은 수개월 및 심지어 수년이 될 수 있으며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
표면 커버리지의 결정은 BET 표면을 비교함으로써 수행된다. BET(Brunauer-Emmett-Teller) 이론은 고체 표면에서 가스 분자의 물리적 흡착을 설명하는 것을 목표로 하며, 물질의 비표면적 측정을 위한 중요한 분석 기술에 대한 기초 역할을 한다. 77 K에서 그래핀에 대한 N2의 흡착을 측정한다. 이 측정 결과는 접근 가능한 표면의 크기이다(여기서 150 ± 40 m2/g). 극성 헤드 기(산 또는 염기)를 사용한 적정 실험으로부터, 본 발명자들은 표면 기의 평균 밀도를 결정한다. 동적 광산란은 부착될 중합체의 크기뿐만 아니라 그래핀 + 층 + 중합체의 크기를 측정하는 데 사용된다. 표면 코팅과 중합체의 화학적 성질에 따라, 표면의 제타 전위는 완전한 표면 커버리지가 달성될 때까지 지속적으로 변화한다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 코어 입자는 검출 가능한 구성요소와 조합되어 본원에 기재된 그래핀 바이오센서를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 그래핀 바이오센서는 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 포함하는 펩타이드 연결을 통해 그래핀 코어 입자에 부착된 검출 가능한 모이어티를 포함한다.
본원에 사용된 "바이오마커"라는 용어는 생물학적 사건과 연관된 생물학적 환경에서 발견되는 생물학적 분자를 나타낸다. 특히, 바이오마커는 생리학적 사건(살아 있는 유기체 및 그 일부의 정상적인 기능과 관련된 생물학적 사건)의 발생 또는 생리학적 조건의 변형, 특히 정상 또는 비정상 과정의 징후 또는 병태의 발생과 연관될 수 있다.
살아있는 유기체와 관련하여 본원에 사용된 "병태"라는 용어는 개체의 완전한 신체적, 정신적 및 사회적 웰빙 상태와 관련된 표준 신체적 상태에 부합하지 않는, (전체로서 또는 그 부분 중 하나 이상으로서) 살아있는 유기체 개체의 신체의 물리적 상태를 나타낸다. 본원에 기재된 병태에는 장애 및 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 "장애"라는 용어는 신체 또는 그 부분 중 어느 하나의 기능적 이상과 관련된 살아있는 개체의 병태를 나타내며, "질환"이라는 용어는 신체 또는 그 부분 중 어느 하나의 정상적인 기능을 손상시키는 살아있는 개체의 병태를 나타내며 전형적으로 징후와 증상을 구별하여 나타난다.
따라서, 본원에 기재된 실시양태에서, 진단 목적 및/또는 병태에 대한 치료에 신체가 얼마나 잘 반응하는지 보기 위해 개체의 병태와 연관된 표적 바이오마커를 선택할 수 있다.
본 개시내용의 표적 바이오마커는 또한 펩타이드 연결과 상호작용하여 관련 입체형태를 변형하도록 구성된 분자이다. 일부 실시양태에서, 표적 바이오마커는 펩타이드 인식 서열과의 특이적 상호작용을 위해 구성된 단백질이다.
본원에 사용된 "단백질"이라는 용어는 2차, 3차, 및 가능하게는 4차 구조를 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다. 단백질의 2차, 3차 및 4차 구조는 다양한 길이 스케일(수십 Å 내지 nm) 및 시간 스케일(ns 내지 초)에서 발생할 수 있으므로, 다양한 경우에 2차, 3차 및 가능하게는 4차 구조는 동적이며 완벽하게 고정되지 않는다.
본원에 사용된 "폴리펩타이드"라는 용어는 중합체 내의 아미노산의 알파 탄소, 아민기 및 카복실기에 의해 형성된 부분이 중합체의 백본을 형성하는 2개 이상의 아미노산 단량체 및/또는 이의 유사체로 구성된 중합체를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "아미노산", "아미노산 단량체" 또는 "아미노산 잔기"라는 용어는 모든 아미노산 하위 세트의 D 및 L 광학 이성질체를 포함하는 임의의 자연 발생 아미노산, 임의의 비-자연 발생 아미노산 및 임의의 인공 아미노산을 지칭한다. 특히, 아미노산은 아민(-NH2)과 카복실산(-COOH)으로 구성된 유기 화합물을 지칭하며, 각 아미노산에 특이적인 측쇄가 알파 탄소로 연결되어 있다. 상이한 아미노산은 상이한 측쇄를 가지며 전하, 극성, 방향성, 환원 전위, 소수성 및 pKa와 같은 독특한 특성을 가지고 있다. 아미노산은 제1 아미노산의 아민기와 제2 아미노산의 카복실산기 사이의 반응에 의해 펩타이드 연결을 통해 공유 결합되어 중합체를 형성할 수 있다.
"폴리펩타이드"라는 용어는 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 중합체뿐만 아니라 이의 유사체 및 단편을 포함한다. 폴리펩타이드는 단백질의 1차 구조를 제공하며, 여기서 단백질의 "1차 구조"라는 용어는 폴리펩타이드 중합체를 형성하기 위해 공유 결합된 폴리펩타이드 사슬 내의 아미노산 서열을 지칭한다. 단백질 "서열"은 1차 구조를 형성하는 아미노산의 순서를 나타낸다. 1차 구조 내의 아미노산 사이의 공유 결합에는 펩타이드 연결 또는 이황화 결합이 포함될 수 있다. 본 개시내용의 의미에서 폴리펩타이드는 일반적으로 펩타이드 연결에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기의 선형 사슬로 구성된다. 말단 잔기와 인접한 분절을 포함하는 선형 폴리펩타이드 사슬의 두 단부는 각 말단의 자유 기의 성질에 기초하여 카복실 말단(C-말단) 및 아미노 말단(N-말단)으로 지칭된다.
펩타이드는 크기에 따라 올리고펩타이드(2-20개의 잔기) 및 폴리펩타이드(20개 초과의 잔기)로 분류될 수 있다. 단백질은 전형적으로 길이가 50개를 초과하는 폴리펩타이드 사슬로 이루어져 있다. [25] 펩타이드의 평균 길이는 펩타이드의 2D 구조(알파-나선 또는 무정형)에 따라 아미노산당 0.35 내지 0.40 nm로 추정할 수 있다. [25] 베타 시트를 형성하는 펩타이드는 효소 절단 시 방출 동역학이 매우 느리기 때문에 바이오센서 설계에 적합하지 않다는 점에 주목한다. 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드는 2D 구조에 따라 길이가 17.5 내지 20 nm이다. 또한 이러한 펩타이드에는 펩타이드를 그래핀 또는 그래핀이 부착된 유기 또는 무기 쉘 표면에 고정하거나 형광단(유기 염료 또는 나노구조체)을 부착하기 위해 비천연 아미노산을 사용할 수 있다는 점에 주목해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산", "아미노산 단량체", 또는 "아미노산 잔기"라는 용어는 각 아미노산에 특이적인 측쇄와 함께 아민 및 카복실산 작용기로 구성된 유기 화합물을 지칭한다. 특히, 알파- 또는 α-아미노산은 아민(-NH2)과 카복실산(-COOH)으로 구성된 유기 화합물을 지칭하며, 각 아미노산에 특이적인 측쇄가 알파 탄소로 연결되어 있다. 상이한 아미노산은 상이한 측쇄를 가지며, 전하, 극성, 방향성, 환원 전위, 소수성 및 pKa와 같은 독특한 특성을 갖는다. 아미노산은 제1 아미노산의 아민기와 제2 아미노산의 카복실산기 사이의 반응에 의해 펩타이드 연결을 통해 공유 결합되어 중합체를 형성할 수 있다. 본 명세서의 의미에서 아미노산은 20개의 자연 발생 아미노산, 비천연 아미노산 중 임의의 것을 지칭하며, D 광학 이성질체와 L 광학 이성질체를 둘 모두 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 표적 바이오마커는 효소 및 케모카인/사이토카인과 같은 50개 초과의 아미노산 길이를 갖는 단백질이다. 이러한 효소 중 일부는 조효소와 보조 인자를 가지고 있으며, 이는 헤테로사이클 결합 금속(예를 들어, 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제)으로 이루어진다. 이들 단백질 중 일부는 번역후 변형되고, 당 또는 지질에 부착되며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
추가의 실시양태에서, 표적 바이오마커는 펩타이드 연결의 입체형태를 변경하거나 펩타이드 연결을 절단할 수 있는 많은 무기 및 유기 분자를 포함할 수 있다. 펩타이드 또는 단백질과 관련하여 본원에 사용된 "입체형태"라는 용어는 단백질 구조(폴리펩타이드 내의 원자의 3차원 배열) 및 분자의 단백질 전체 형상을 결정하는 그의 구성 원자의 공간에서의 배열로서 정의된다. 화합물 및 펩타이드와 관련하여 본원에 사용된 "절단"이라는 용어는 화학 결합의 파괴 및/또는 화학 결합의 파괴를 수반하는 화학 반응을 나타낸다. 펩타이드 연결의 절단은 전형적으로 연결에 있는 펩타이드 결합의 효소적 가수분해를 초래하고, 더 작은 펩타이드 모이어티로 연결을 파괴되며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
펩타이드의 입체형태를 변형시키거나 펩타이드 연결을 절단하기 위해 펩타이드 연결과 상호작용하도록 구성된 유기 및/또는 무기 바이오마커를 확인하는 방법은 다음에 의해 수행될 수 있다:
- 펩타이드 연결의 3차 구조를 컴퓨터로 모델링하여 컴퓨터로 모델링된 펩타이드 연결을 제공하는 단계
- 후보 유기 또는 무기 바이오마커의 3차 구조를 컴퓨터로 모델링하여 컴퓨터로 모델링된 후보 유기 또는 무기 바이오마커를 제공하는 단계
- 컴퓨터로 모델링된 펩타이드 연결과 컴퓨터로 모델링된 후보 유기 또는 무기 바이오마커의 상호작용 표적 부위를 결정하는 단계
- 표적 상호작용 부위에서 상호작용 후보 유기 또는 무기 바이오마커에 따른 컴퓨터로 모델링된 펩타이드 연결의 변화를 결정하는 단계
- 결정된 변화가 펩타이드 연결의 입체형태 변화 또는 펩타이드 연결의 절단인 경우 컴퓨터로 모델링된 펩타이드 연결 및 유기 또는 무기 표적 바이오마커를 결정하는 단계.
추가로 또는 대안적으로, 펩타이드 연결과 상호작용하도록 구성된 유기 및/또는 무기 바이오마커를 확인하는 방법은 다음을 포함할 수 있다:
- 후보 유기 및/또는 무기 바이오마커를 후보 유기 및/또는 무기 화합물과 펩타이드 연결 사이의 상호작용을 허용하는 조건 하에 일정 시간 동안 펩타이드 연결과 접촉시키는 단계; 및
- 펩타이드 연결의 입체형태 변화 및/또는 펩타이드 연결의 절단을 검출하는 단계로서, 상기 검출은 검출 결과를 제공하기 위해 접촉 후에 수행되는 단계; 및
- 검출 결과가 펩타이드 연결의 입체형태 검출된 변화 또는 펩타이드 연결의 검출된 절단일 경우, 유기 및/또는 무기 바이오마커를 선택하여 확인된 유기 및/또는 무기 바이오마커를 제공하는 단계.
이어서, 본 개시내용의 바이오센서는 펩타이드 결합을 검출 가능한 모이어티에 부착하고, 부착 후 그래핀 입자에 대하여 20 nm 이하의 소광 거리에서 검출 가능한 모이어티를 갖도록 선택된 두께의 코팅층을 갖도록 선택된 본 개시내용의 그래핀 코어 입자에 부착함으로써 표적 화합물을 검출하도록 구성될 수 있다. 특히, 표적 화합물이 펩타이드 연결의 입체형태에서 검출된 변화를 가져서 펩타이드 연결 길이의 증가를 초래하는 경우, 코팅층은 부착 후 제공되는 바이오센서에서 검출 가능한 모이어티가 펩타이드 연결 길이의 증가 후 방출 거리에 있도록 구성되며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 이렇게 구축된 바이오센서의 기능은 시험될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
예를 들어, 단백질 바이오마커 및 상응하는 초분자 인식 서열의 확인은 다음 절차에 따라 수행되었다:
1) 표적의 1차 구조를 데이터 뱅크(예를 들어, UniProtKB 또는 단백질 데이터 뱅크)에서 검색하였다.
2) 서울대학교 전산생물학 연구실의 석 박사가 개발한 GalaxyWEB 단백질 구조 예측 클러스터와 같은 단백질 구조 예측 소프트웨어를 이용하여 표적의 3차 구조를 결정한 다음, 정제하였다.
3) 표적에 대한 단클론 항체(MAB) 단편의 1차 구조는 데이터 소스(예를 들어, 단백질 데이터 뱅크, SciFinder 또는 항체 공급업체에서 제공한 정보)에서 검색하였다. 3차 구조는 Galaxy-WEB을 사용하여 생성하였다.
4) 프랑스 파리 소재의 파스퇴르 생물학 IT 센터에서 개발한 Mobyle 플랫폼을 사용하여 표적과 항체 사슬 사이의 도킹 절차를 시뮬레이션한다. 이 절차는 표적의 "진정한" 에피토프를 드러낸다.
5) 이어서, 최종 "사이트 파인더" 절차는 대상체의 에피토프를 항체(Ab) 단편의 개선된 구조에 도킹하는 Mobyle 플랫폼에서 수행된다. 이 구조는 단백질 단백질 상호작용의 예에서 표적에 대한 결합을 실제로 담당하는 Ab 단편의 펩타이드 서열을 드러낸다.
F)
단백질 바이오마커 및 상응하는 초분자 인식 서열의 확인을 위한 예시적인 방법에 추가적으로 또는 이에 대한 대안적으로, 표적의 프로테아제 에피토프를 프로테아제 효소 활성 부위의 개선된 구조에 도킹하는 최종 "사이트 파인더" 절차가 Mobyle 플랫폼에서 수행된다. 이 구조는 표적에 대한 결합을 실제로 담당하는 활성 부위의 펩타이드 서열을 드러낸다
단백질 바이오마커 및 상응하는 초분자 인식 서열의 확인을 위한 예시적인 방법에 추가적으로 또는 이에 대한 대안으로, 프로테아제 표적화를 위한 절단 부위 및 서열은 MEROPS(펩티다아제 데이터베이스)와 같은 이용 가능한 사이트로부터 확인할 수 있다.
단백질 바이오마커 및 상응하는 초분자 인식 서열을 확인하는 예시적인 방법에서, 초분자 인식 서열이 선형인 경우, 이를 합성하여 나노센서의 인식 서열로 사용하였다. 생성된 나노바이오센서의 LOD가 적어도 10-14M이 아닌 경우 선형이 아니므로 또 다른 mAb의 구조 정보를 사용하여 인실리코 절차를 반복하였다.
일부 예시적인 실시양태에서, 많은 유기 분자는 또한 펩타이드와 상호작용하여 그 입체형태를 변화시킬 수 있는 효소와 같은 단백질과 상호작용할 수 있다. 이와 관련하여 모든 효소 억제제는 결합하는 단백질의 입체형태를 변화시킬 수 있다. 예시적인 효소 억제제로는 비펩타이드성 HIV-1 프로테아제 억제제인 티프라나비르, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP), 항암제 메토트렉세이트, 스트렙토마이세스 트랜스펩티다아제에 대한 억제제로서의 페니실린 G가 포함된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 표적 바이오마커와 펩타이드 연결 사이의 상호작용은 펩타이드 연결의 절단을 초래할 수 있다. 특히, 일부 실시양태에서, 표적 바이오마커는 프로테아제를 포함한다. 예시적인 프로테아제에는 세린 프로테아제, 시스테인, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 메탈로프로테이나제 및 아스파라긴 펩타이드 리아제가 포함된다. 일반적으로, 인간 게놈의 알려진 모든 553개의 프로테아제(21개의 아스파르트산, 143개의 시스테인, 186개의 메탈로, 176개의 세린 및 27개의 트레오닌 프로테아제)뿐만 아니라 설치류 모델에서 이들의 유사체는 본 개시내용의 바이오센서로 검출될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다 [26].
일부 실시양태에서, 표적 바이오마커는 펩타이드의 번역후 변형을 수행하는 효소를 포함하며, 이는 생물물리학적 특성(동적, 유효 길이 등)을 변화시킨다. 예로는 아르기나아제(아르기닌을 오르니틴으로 전환) 및 펩타이드의 크기 사슬에 화학 기를 부착하거나 제거하는 모든 효소 그룹이 있다. 예로는 (탈)인산화(키나아제, 포스파타제), 글리코실화 효소(N-글리코실화)-글리코실화, 글리피화, C-글리코실화, 포스포글리코실화, 유비퀴네이트화, S-니트로실화, 메틸라톤, N-아세틸화 및 지질화(C-말단 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI)) 앵커, N-말단 미리스토일화, S-미리스토일화, S-프레닐화)를 할 수 있는 효소가 포함된다.
일부 실시양태에서, 표적 바이오마커는 맞춤형 올리고펩타이드에 결합할 수 있는 단백질(예를 들어, 사이토카인/케모카인)을 포함한다. 결합 사건은 펩타이드의 생물물리학적 특성(동적, 유효 길이 등)을 변화시킨다. 검출될 수 있는 예시적인 바이오마커는 관심 있는 모든 사이토카인, 케모카인, 신호전달 펩타이드(예를 들어, 염증촉진 인자, 항염증 인자, 성장 인자) 및 호르몬을 포함하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 기재된 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 바이오센서의 검출 가능한 구성요소의 일부인 펩타이드 연결은 관심 있는 표적 바이오마커에 특이적으로 결합하도록 선택되며, 이는 당업자가가 이해할 수 있는 바와 같다.
제2 분자에 대한 제1 분자의 결합과 관련하여 본원에 사용된 "특이적", "특이적으로" 또는 "특이성"이라는 어구는 실질적으로 존재할 수 있는 다른 분자와 함께 제1 분자와 제2 분자 각각 사이의 안정한 복합체의 인식, 접촉 및 형성이 실질적으로 적거나 전혀 없는 것과 함께 제1 분자와 제2 분자 사이의 안정한 복합체의 인식, 접촉 및 형성을 지칭한다. 예시적인 특이적 결합은 항체-항원 상호작용, 세포 수용체-리간드 상호작용, 폴리뉴클레오티드 혼성화, 효소 기질 상호작용 및 당업자가 확인할 수 있는 추가의 상호작용이다. 소프트웨어와 같은 컴퓨터 지원 툴과 관련하여 본원에 사용된 "특이적", "특이적으로" 또는 "특이성"이라는 어구는, 예를 들어, 데이터베이스의 서열과 표적 서열의 정렬에 따라 데이터베이스 내의 서열 그룹 중에서 표적 서열(예컨대, 본원에 기재된 마커 중 하나)을 식별할 수 있는 툴을 나타낸다. 표적 서열을 특이적으로 검출하도록 구성된 예시적인 소프트웨어는 Primer-3, PerlPrimer 및 PrimerBlast를 포함한다. 단일 실험에서 여러 분석물을 동시에 측정한다.
일부 실시양태에서, 인식 서열은 표적 단백질에 대한 초분자 인식 서열 또는 컨센서스 서열일 수 있으며, 이는 연결 인식이 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는다(즉, 선택적 결합 부위를 포함함)는 것을 의미한다. 따라서, 인식 서열은 비특이적 결합 모티프를 피한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 올리고펩타이드 연결은 "절단 가능"할 수 있거나 "절단 가능하지 않을" 수 있다. 본원에 기재된 인식 서열은 신속한 진단을 위해 절단 가능한 것이 바람직하다.
본 개시내용의 그래핀 나노바이오센서의 실시양태에서, 펩타이드 연결은 관심 있는 바이오마커에 대한 임의의 다양한 인식 서열 또는 컨센서스 서열을 포함할 수 있으며, 이는 연결 서열이 표적 바이오마커에 대한 특이성을 갖는다(즉, 이에 대한 선택적 결합 및/또는 절단 부위를 포함한다)는 것을 의미한다. 따라서, 연결 서열이 비특이적 결합 모티프를 피한다는 것을 이해할 것이다. 펩타이드 연결은 전형적으로 소광을 위해 그래핀 담체 입자의 적절한 근접성 내에 검출 가능한 모이어티를 위치시키는 짧고 선형적인 올리고펩타이드이다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 연결은 100개 미만의 아미노산 잔기 길이, 바람직하게는 75개 미만의 아미노산 잔기 길이, 보다 바람직하게는 50개 이하의 아미노산 잔기일 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 펩타이드 연결은 더 짧고, 50개 미만인 아미노산 잔기 길이, 보다 바람직하게는 30개 미만의 아미노산 잔기 길이, 더욱 더 바람직하게는 20개 이하의 아미노산 잔기를 가질 것이다.
예를 들어, 본 개시내용의 그래핀 바이오센서에서, 펩타이드 연결은 4 내지 50개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 4 내지 30개의 아미노산 잔기 및 더욱 더 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 범위일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 인식 서열을 분자 간의 비특이적 결합 또는 반응과 구별하기 위한 인식과 관련하여 "특이적 상호작용" 또는 "특이성"에 대한 언급은 올리고펩타이드 서열이 상호작용할 수 있는 특정 표적 바이오마커 세트가 제한적이고, 일부 경우에는 심지어 배타적이어서, 표적 바이오마커를 제외한 임의의 다른 분자와 상당한 속도 또는 빈도로 결합이나 효소 절단이 일어나지 않는다는 것을 의미한다.
특히, 본원에 기재된 실시양태에서, 표적 바이오마커에 대한 펩타이드 연결의 특이성은 펩타이드 연결에 의해 표적화된 특정 바이오마커와 상이한 바이오마커에 대한 펩타이드 연결의 상호작용을 최소화하는 결과를 초래하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
바이오센서는 선택된 인식 서열에 따라 매우 다양한 바이오마커를 표적으로 하도록 구성될 수 있다. 예로는 프로테아제, 키나아제, 아르기나제, 사이토카인/케모카인, 디옥시게나제(예를 들어, 인돌레아민 2,3-디옥시게나제 1 및/또는 트립토판 2,3-디옥시게나제), 에스테라제 등을 포함하는 수많은 효소가 포함되며, 이는 이어서 시험되는 샘플의 특정 건강 상태와 상관관계가 있을 수 있다. 예를 들어, 이러한 바이오마커는 암 또는 전암성 세포 활성, 박테리아 활성, 염증 등의 지표일 수 있으며 문헌에 알려져 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 인식 서열은 표적 분석물(예를 들어, 프로테아제, 에스테라제 등)의 존재 하에 효소 절단을 겪는 효소 기질(펩타이드 서열)을 지칭하는 "컨센서스 서열"을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 심지어 이로 이루어진다. 이러한 컨센서스 서열은, 예를 들어, 미국 특허 제8,969,027호 및 미국 특허 제9,216,154호, 미국 공보 제2017/0219548호에 기재되어 있으며, 각각은 본 개시내용과 모순되지 않는 정도로 본원에 참조로 포함된다. 관련 컨센서스 서열은 본 개시내용의 표에 제공된다. 가이드 패러다임은 매우 많은 프로테아제의 경우 다른 프로테아제보다 표적 프로테아제에 의해 더 빨리 절단될 인실리코로 설계할 수 있다는 것이다.
하나 이상의 실시양태에서, 인식 서열은, 예를 들어, 본 개시내용과 모순되지 않는 정도로 본원에 참조로 포함된 2016년 3월 18일에 출원된 WO 2016/149637에 기재된 바와 같은 효소적 번역후 변형의 검출을 위한 인식 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 심지로 이로 이루어진다. 이 실시예에서, GR7G의 아르기닌은 오르니틴 GO7G로 전환되어 펩타이드의 역학 및 기하학적 확장을 변화시켜 광학 Fe/Fe3O4 나노바이오센서에서 형광 검출을 가능하게 한다. 검출된 다른 번역후 효소는 인데올라민-2,3-디옥시게나제 및 트립토판 2,3-디옥시게나제이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
표적 효소와 같은 표적 바이오마커의 존재 하에, 효소는 (절단 없이) 인식 서열을 변형시키고, 보다 구체적으로는 인식 서열의 1차 구조(아미노산 잔기 및 대사 산물) 및 2차 구조 모두를 변형시킨다. 본원에 사용된 이러한 "변형" 또는 "번역후 변형"은 기질 서열 내의 아미노산 잔기(및 특히 측쇄)를 상이한 형태 및/또는 상이한 잔기로 전환 또는 변형시키는 것을 지칭한다. 이것은, 차례로, 2차 구조를 확장, "펼침" 또는 "풀림" 및/또는 인식 서열의 이동성을 증가 및/또는 감소시킨다. 하나 이상의 실시양태에서, 인식 서열은 화학적 변형 또는 효소 절단 없이 물리적 결합을 검출하는 초분자 인식 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 심지어 이로 이루어진다. 특히, 표적 단백질은 초분자 인식 서열에 선형적으로 결합하여 알파-나선 및/또는 베타-시트 구조와 같은 초기 접힌 2차 구조가 변형되고 선형으로 확장되거나 펼쳐진다. 각각의 경우에, 표적 분석물(예를 들어, 단백질, 효소 등)과 인식 서열의 상호작용은 표적 분석물의 존재를 나타내는 바이오센서에서 검출 가능한 변화를 일으킨다.
하나 이상의 실시양태에서, 인식 서열은, 예를 들어, 본 개시내용과 모순되지 않는 정도로 본원에 참조로 포함된 2015년 7월 27일로 출원된 WO2016/018798에 기재된 바와 같은 염증, 감염, 및/또는 박테리아 활성의 바이오마커에 대한 인식 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 심지어 이로 이루어진다. 이들 실시양태 중 일부에서, 표적 바이오마커는 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, 및 MMP-12 및 MMP-13과 비교하여 MMP-8, MMP-9, MMP-11, MMP-14 및 호중구 엘라스타제와 같은 염증, 감염, 및/또는 박테리아 활성을 나타내는 효소일 수 있다. 염증, 감염 및/또는 박테리아 활성을 부분적으로 나타내는 것으로 간주되는 다른 효소 표적 바이오마커는 카텝신 -B, -D, -E, -K 및 -L 및 우로키나제 플라스미노겐 활성제였으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일반적으로, 프로테아제 및/또는 에스테라제와 같은 효소는 염증, 감염 및/또는 박테리아 활성을 나타내는 예시적인 바이오마커이다. 인식 서열은 특이적으로(예를 들어, 표적 프로테아제에 의해서만 절단 가능한 컨센서스 서열을 사용하여) 또는 일반적으로(예를 들어, 임의의 프로테아제 또는 에스테라제에 의해 절단 가능한 서열을 사용하여) 프로테아제 또는 에스테라제에 의해 절단 가능하도록 선택된다. 연결이 절단되면 입자가 서로 방출되어 시스템에서 검출할 수 있는 스펙트럼 변화가 발생한다.
인식 서열은 전형적으로 검출 가능한 모이어티와 순수 그래핀 담체 입자 사이의 올리고펩타이드 연결의 일부로서 제공된다. 적합한 올리고펩타이드 연결은 전형적으로 말단 카복실산기(C-말단) 및 말단 아민기(N-말단)와 함께 표적 바이오마커에 대한 인식 서열을 포함할 것이다(이로 본질적으로 이루어지거나 심지로 이로 이루어질 것이다). 올리고펩타이드는 또한 C 말단에 티올 기를 포함하고, N 말단에 카복실산기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고펩타이드 링커는 인식 서열에 대한 N-말단에 적어도 10개의 아미노산의 친수성 영역, 및 인식 서열에 대한 C-말단에 연결 영역을 포함하고, 여기서 C-말단 연결 영역은 그의 말단에 티올 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고펩타이드의 C-말단은 시스테인 잔기, 라이신, 또는 아스파르테이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고펩타이드의 N-말단 친수성 영역은 약 1:1의 비율로 과도한 양전하 또는 음전하를 갖는다. N-말단 친수성 영역은 또한 서로 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, C-말단 및 N-말단 연결 영역은 절단할 수 없는(예를 들어, 인식 서열이 아닌) 거의 모든 아미노산 서열로 이루어질 수 있다: (X)n-[인식 서열]-(X)m, 여기서 X는 임의의 아미노산(서열에서 절단 서열을 생성하지 않음)이고, n 및 m 각각은 5 미만이다.
일부 실시양태에서, 인식 서열은 N- 및/또는 C-말단 단부에 하나 이상의 스페이서 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개와 10개 사이의 아미노산(천연 및 비천연, L- 및 D-의 임의의 아미노산 또는 이들의 조합)이 선택된 검출 가능한 모이어티에 따라 올리고펩타이드 사슬 길이를 추가로 연장시키기 위한 스페이서로서 한쪽 또는 양쪽 단부에서 사용할 수 있다. 예로는 N-말단 서열, 예컨대 GAG- 및 C-말단 서열, 예컨대 -AG가 포함된다.
표적 바이오마커에 따라 원하는 인식 서열을 선택하고 합성할 수 있다. 다양한 서열이 또한 문헌에서 이용 가능하거나, 인실리코 결합 연구를 통해 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예시적인 인식 서열은 그의 관련 바이오마커와 함께 아래의 표에 나열되어 있다. 일부 경우에, 제안된 절단 지점은 "-"로 표시된다. 열거된 서열의 변이체가 또한 고려된다
[표 1] 컨센서스 및 인식 서열
a 단핵구 화학유인물질 단백질-1; b 케모카인(C-C 모티프) 리간드 20(CCL20) 또는 간 활성화 조절된 케모카인(LARC) 또는 대식세포 염증 단백질-3(MIP3A); c 과립구 콜로니-자극 인자; d 인터루킨-1-수용체-유사 유형 1; e 대식세포 염증 단백질; f 파골세포 자극 인자-1; g 메탈로프로테이나제 억제제 1; h 흉선 간질 림포포이에틴.
하나 이상의 실시양태에서, 나노센서는 사이토카인 검출에 특이적인 인식 서열로 구성될 수 있다. 이들 실시양태에서, 올리고펩타이드 연결은 관심 있는 사이토카인의 수용체/결합 부위에 대한 선형 초분자 인식 서열(즉, 파라토프)을 포함한다. 사이토카인의 존재 하에, 사이토카인 결합 동안 테더의 스트레칭은 부착된 검출 가능한 입자로부터 신호 변화(예를 들어, 형광 증가)를 유도하며, 이는 검출될 수 있다. 나노센서는 사이토카인 농도를 측정할 수 있다. 예시적인 초분자 인식 서열은 표 2에 나열되어 있다.
[표 2] 단백질 표적 검출을 위한 초분자 인식 서열
a 단핵구 화학유인물질 단백질-1; b 케모카인(C-C 모티프) 리간드 20(CCL20) 또는 간 활성화 조절된 케모카인(LARC) 또는 대식세포 염증 단백질-3 (MIP3A); c 과립구 콜로니-자극 인자; d 인터루킨-1-수용체-유사 유형 1; e 대식세포 염증 단백질; f 파골세포 자극 인자-1; g 메탈로프로테이나제 억제제 1; h 흉선 간질 림포포이에틴; i CD: 분화 클러스터; j ATP-의존성 RNA 헬리카제 DDX3X(인간 기관지 기도 상피 세포 유래); k 알칼리성 포스파타제, 태반형, 포스파타제 PPB1; l 아르기닌―tRNA 리가제, 세포질; m E3 유비퀴틴-단백질 리가제 UBR4(소기도 상피 세포); * 예상 검출 한계(LOD).
일부 실시양태에서, 초분자 인식 서열은 N- 및/또는 C-말단 단부에 하나 이상의 스페이서 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개와 10개 사이의 아미노산(천연 및 비천연, L- 및 D-의 임의의 아미노산, 또는 이들의 조합)이 스페이서로서 한쪽 또는 양쪽 단부에서 사용될 수 있다. 예로는 N-말단 서열, 예컨대 GAG- 및 C-말단 서열, 예컨대 -AG가 포함된다.
일부 실시양태에서, 컨센서스 모티프를 특징으로 하는 서열을 제외하고, 적합한 길이(예를 들어, 적어도 10개의 아미노산 잔기)의 임의의 다른 선형 펩타이드 서열이 초분자 인식 서열에 사용될 수 있다. 펩타이드 합성기 상에서 합성되는 경우, 최대 약 25개의 아미노산 잔기의 펩타이드 서열이 사용될 수 있는 반면, 유기체(예를 들어, 이. 콜리(E. coli))에서 합성된 서열은 길이가 최대 약 300개의 아미노산 잔기일 수 있다. 설계된 모든 서열은 MEROPS와 같은 데이터 뱅크를 사용하여 절단 서열의 존재를 확인해야 한다.
일부 실시양태에서, 엑소좀의 일반적으로 허용되는 표면 마커인 CD9, CD63 및 CD81을 표적으로 하는 펩타이드-앱타머도 개발되었다. 이들은 엑소좀에 결합할 수 있으며 사전 (초)원심분리 없이 나노센서를 사용하여 수집된 생물 표본에서 직접 단리할 수 있다. CD9, CD63 및 CD81을 함께 사용하면 기도 세포와 같은 샘플로부터 발생하는 거의 모든 엑소좀이 포획될 것을 보장할 것이다. 용해 완충액으로 처리한 후, 포획된 엑소좀의 카고를 분석할 수 있다. 엑소좀의 분석은 기술의 또 다른 기존 양상을 제시한다. 소기도 상피 세포와 기관지 기도 상피 세포로부터 발생하는 엑소좀은 프로테아좀(외막의 테트라스파닌 함량(CD9, CD 63, CD81) 포함)에서 상당히 상이하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이오센서는 추가 표적을 검출하기 위한 다양한 센서 기술을 사용하여 이용 가능한 센서 기술에 적합하도록 입자, 올리고펩타이드 연결 등을 변형시킴으로써 기본 나노센서 구조를 적응시키는 유연성을 보여준다. 예를 들어, 프로테아제 활성을 검출하기 위해 나노센서를 제조할 수 있으며, 여기서 본 개시내용의 그래핀 코어 입자는 미국 특허 제8,969,027호에 기재된 펩타이드 연결 및 모이어티와 관련하여 사용되며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 상기 하나 이상과 조합하여 나노센서에서 또한 사용될 수 있는 효소 컨센서스 서열은 하기 표 3에 있는 것을 포함하며, 여기서 절단 지점은 "-"로 표시된다.
[표 3]
일부 실시양태에서, 펩타이드 연결의 컨센서스 서열은 N-말단 스페이서(예를 들어, GAG, GAA, GAP) 및 C-말단 스페이서(예를 들어, GA, AG 또는 EG)를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 그래핀 바이오센서에서, 펩타이드 연결은 검출 가능한 모이어티 또는 표지를 그래핀 코어 입자에 부착하는 데 사용된다.
본원에 사용된 "부착하다" 또는 "부착된"이란 용어는 2개 이상의 구성요소를 함께 유지하기 위해 결합, 링크, 힘 또는 연결(tie)에 의해 연결 또는 결합하는 것을 지칭하며, 이는, 예를 들어, 제1 분자가 제2 분자 또는 물질에 직접 결합되거나 하나 이상의 중간 분자가 제1 분자와 제2 분자 또는 물질 사이에 배치되는 직접 또는 간접 부착을 포함한다.
본원에 사용된 "검출되다" 또는 "검출"이란 용어는 샘플, 반응 혼합물, 분자 복합체 및 기질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공간의 제한된 부분에서 표적의 존재(existence), 존재(presence) 또는 사실의 결정을 나타낸다. 본원에 사용된 "검출되다" 또는 "검출"은 다른 화합물과 상호작용, 특히 결합하는 능력, 또 다른 화합물을 활성화시키는 능력 및 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 식별할 수 있는 추가 특성을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 표적의 화학적 및/또는 생물학적 특성의 결정을 포함할 수 있다. 검출은 정량적 또는 정성적일 수 있다. 검출은 정량화되지 않은 다른 표적 또는 신호에 대한 상대적 존재비(abundance) 측면에서 표적 또는 신호의 품질 또는 종류를 확인하는 것을 언급하거나 이에 관련되거나 이를 포함할 때 "정성적"이다. 검출은 표적 또는 신호의 양(quantity) 또는 양(amount)을 측정(정량화라고도 함)하는 것을 언급하거나 이에 관련되거나 이를 포함할 때 "정량적"이며, 여기에는 표적 또는 신호의 양 또는 비율을 결정하도록 설계된 모든 분석이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 의미에서의 정량적 검출은 표적 바이오마커의 특정량 초과/미만에서 반정량적으로 수행되는 검출을 포함하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 사용된 "검출 가능한 모이어티" 또는 "표지"라는 용어는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 염료, 발색단, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 염료, 금속 이온, 입자, 금속 졸, 리간드(예컨대, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 합텐스) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 검출 가능한 분자를 지칭한다. 결과적으로, 본원에 사용된 "표지화 신호"라는 어구는 표지의 검출을 가능하게 하는 표지로부터 방출되는 신호를 나타내며, 이에는 방사능, 형광, 화학발광, 효소 반응의 결과에서 화합물의 생성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 실시양태에서, 검출 가능한 모이어티는 형광 신호를 방출할 수 있다. 형광 신호라는 용어는 더 짧은 파장의 광원에 의해 전자적으로 여기될 수 있는 화합물에 의해 방출되는 더 긴 파장의 광 신호를 나타낸다.
예시적인 검출 가능한 표지는 광원에 의해 여기되고 형광 신호를 방출할 수 있는 화합물로서, 시각적으로 인지되거나 적절한 기구로 측정될 수 있는 형광 또는 색상 변화와 같은 검출 가능한 신호(예를 들어, 광학 또는 분광학)를 발생시키는 검출 가능한 입자를 포함한다. 본 발명의 검정에 사용하기에 적합한 발색단/발광단은 임의의 유기 또는 무기 염료, 형광단, 인광체, 광흡수 입자(예를 들어, Au, Ag, Pt, Pd), 이들의 조합, 또는 이들의 비자성 금속화 착물을 포함한다. 바람직하게는, 선택된 발색단/발광단은 그래핀 담체 입자보다 작고, 전형적으로 약 20 nm 미만의 입자 크기(가장자리 간(edge-to-edge) 최대 치수, 즉, 직경)를 가질 것이다.
적합한 유기 염료는 쿠마린, 피렌, 시아닌, 벤젠, N-메틸카바졸, 에리트로신 B, N-아세틸-L-트립토판아미드, 2,5-디페닐옥사졸, 루브렌, 및 N-(3-설포프로필)아크리디늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 쿠마린의 구체적인 예로는 7-아미노쿠마린, 7-디알킬아미노 쿠마린, 및 쿠마린 153이 포함된다. 바람직한 벤젠의 예로는 1,4-비스(5-페닐옥사졸-2-일)벤젠 및 1,4-디페닐벤젠이 포함된다. 바람직한 시아닌의 예로는 옥사시아닌, 티아시아닌, 인도시아닌, 메로시아닌 및 카보시아닌이 포함된다. 다른 예시적인 시아닌에는 ECL Plus, ECF, C3-옥사시아닌, C3-티아시아닌 염료(EtOH), C3-티아시아닌 염료(PrOH), C5-인도시아닌, C5-옥사시아닌, C5-티아시아닌, C7-인도시아닌, C7-옥사시아닌, CypHer5, Dye-33, 시아닌(Cy7, Cy7.5, Cy5.0, Cy5.5, Cy3Cy5 ET, Cy3B, Cy3.0, Cy3.5, Cy2), CBQCA, NIR1, NIR2, NIR3, NIR4, NIR820, SNIR1, SNIR2, SNIR4, 메로시아닌 540, 피나시아놀-요오다이드, 1,1-디에틸-4,4-카보시아닌 요오다이드, Stains All, 염료-1041, 또는 염료-304뿐만 아니라 BODIPY 염료가 포함된다.
시아닌 염료는 시아닌 염료의 푀르스터 거리()(Cy3.0 및 Cy3.5의 경우 5-6 nm, Cy5.0 및 Cy5.5의 경우 6-7 nm, Cy7 및 Cy7.5의 경우 대략 7 nm)보다 짧은 펩타이드 연결을 이상적으로 사용하여 다양한 구성으로 부착할 수 있다. 임의의 스페이서(~2.84 nm)와 절단 서열(최대 4 nm)에서 12개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 테더의 최대 길이는 더 짧은 절단 서열(uPA 및 MMP)이 Cy3.x 및 Cy5.x 염료와 함께 사용하기에 적합하다는 것을 나타내는 반면, 카텝신은 바람직하게는 Cy5.x 및 Cy.7.x 염료에 연결되어 소광된 시아닌 염료의 최적 소광을 허용한다. 모든 시아닌의 경우, 방출 최대값은 인간 소변의 자가형광과 관련하여 적색편이된다. 여러 시아닌을 단일 입자에 연결하여 올리고플렉싱 나노플랫폼을 만들고 최대 4개의 효소의 활성을 동시에 측정할 수 있다. 전자기 스펙트럼의 UVA 또는 청색 영역에 있는 4가지 염료 모두 동시에 여기될 수 있거나 각 염료가 개별적으로 여기될 수 있다. 모든 시아닌 염료는 여기 최대값을 가지며, 이는 방출 최대값에 대해 20-25 nm만큼 청색편이된다(형광 단일항 상태의 경우 전형적임). 예시적인 방출 스펙트럼: NS-Cy3.0(λex = 538, λem = 560), NS-Cy5.5(λex = 639, λem = 660), NS-Cy7.0(λex = 740, λem = 760) 및 NS-Cy7.5(λex = 808, λem = 830).
적합한 무기 염료는 금속화 및 비금속화 포르피린, 프탈로시아닌, 클로린(예를 들어, 클로로필 A 및 B), 및 금속화 발색단으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 포르피린은 테트라 카복시-페닐-포르피린(TCPP) 및 Zn-TCPP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 금속화 발색단은 루테늄 폴리피리딜 착물, 오스뮴 폴리피리딜 착물, 로듐 폴리피리딜 착물, 이리듐(III)과 3-(1-메틸벤조이미다졸-2-일)-7-(디에틸아미노)-쿠마린 착물 및 이리듐(III)과 3-(벤조티아졸-2-일)-7 -(디에틸아미노)-쿠마린 착물로 이루어진 군으로부터 선택된다
적합한 형광단 및 인광단은 인광 염료, 플루오레세인, 로다민(예를 들어, 로다민 B, 로다민 6G), 및 안트라센(예를 들어, 9-시아노안트라센, 9,10-디페닐안트라센, 1-클로로-9,10-비스(페닐-에티닐)안트라센)으로 이루어진 군으로부터 선택된다
그래핀 및 유도체의 넓은 UV/Vis 흡수 스펙트럼은 한 번에 하나 이상의 바이오마커를 표적으로 하기 위해 각각의 (상이한) 인식 서열을 갖는 다수의 검출 가능한 표지의 부착을 허용한다. 기능하게 하려면, 함께 부착된 검출 가능한 표지의 여기 스펙트럼과 흡수 스펙트럼 사이에 중첩이 없거나 최소한으로만 중첩되어 입자 간 FRET 및/또는 각 신호의 간섭을 최소화해야 한다. 기본적으로 형광 염료의 모든 조합을 상상할 수 있지만, 작은 스토크스-이동(Stokes-shift)(가장 낮은 여기의 최대값과 형광 밴드 사이의 거리)를 특징으로 하기 때문에 BODIPY 염료가 특히 적합하다. 이 전략의 한 예는 단일 바이오센서와 독립적으로 4개의 바이오마커의 활성을 모니터링하기 위해 각각의 (서로 다른) 서열로 연결된 BODIPY FL(505λex/513λem), BODIPY 530550(534λex/554λem), BODIPY TR(589λex/617λem), BODIPY 630650(646λex/660λem)을 병렬로 사용하는 것이다. 예시적인 BODIPY 염료는 실시예 7에 논의된 것으로 나타난다.
대안적으로, 시아닌 염료 2, 3, 5 및 7은 또 다른 가능한 조합이다. 그러나 시아닌 염료는 푀르스터 반경이 훨씬 더 크며 희석하더라도 서로 간섭할 수 있다.
형광 양자점 및 형광 입자가 사용될 수 있다. 양자점은 주기율표의 II-VI족 또는 III-V족 원소(예를 들어, CdSe, CdTe, InP)의 원자로 구성된 반도체이다. 양자점의 광학 특성은 (일반적으로 안정화되는) 쉘을 합성하여 조작할 수 있다. 이러한 양자점은 코어-쉘 양자점(예를 들어, CdSe/ZnS, InP/ZnS, InP/CdSe)으로 알려져 있다. 동일한 물질이지만 크기가 다른 양자점은 다른 색상의 빛을 방출할 수 있다. 그들의 밝기는 세 가지 공간 치수 모두에서 전자의 구속으로 인한 에너지 준위의 양자화에 기인한다. 벌크 반도체에서 전자-정공 쌍은 각 유형의 반도체에 특징적인 보어 엑시톤 반경(Bohr exciton radius) 내에 결합된다. 양자점은 보어 엑시톤 반경보다 작기 때문에 이산 에너지 준위가 나타난다. 반도체의 가전자대와 전도대 사이의 밴드 갭 ΔE는 나노결정의 크기와 형상의 함수이다. 양자점은 기존의 유기 형광단보다 발광 양자 수율이 약간 낮은 것이 특징이지만, 이들은 흡수 단면적이 훨씬 크고 광퇴색(photobleaching) 속도가 매우 낮다. 양자점의 몰 흡광 계수는 약 105-106 M-1cm-1이며, 이는 유기 염료보다 10-100배 더 크다.
코어/쉘 양자점은 낮은 밴드 갭 코어 주위에 높은 밴드 갭 쉘을 가지며, 이는 쉘에 의한 어떠한 흡수 없이도 빛을 방출한다. 쉘은 코어로부터의 표면 비방사성 방출을 부동태화하여 광발광 양자 수율을 향상시키고 자연 분해를 방지한다. I형 양자점(예를 들어, CdSe/ZnS)의 쉘은 코어보다 높은 에너지 전도대와 낮은 에너지 가전자대를 가지므로 코어에 전자와 정공이 모두 갇히게 된다. II형 양자점(예를 들어, CdTe/CdSe, CdSe/ZnTe)의 쉘의 전도대와 가전자대는 모두 코어보다 에너지가 둘 모두 낮거나 둘 모두 높다. 따라서 전자와 정공의 움직임은 1차원으로 제한된다. 코어-쉘 계면에서 엑시톤의 복사 재결합은 II형 방출을 일으킨다. II형 양자점은 밴드 가장자리 근처에서 간접 반도체로 작동하므로 적색과 근적외선에 흡수 테일이 있다. 합금 반도체 양자점(CdSeTe)도 사용할 수 있지만, I형과 II형이 가장 선호된다. 다양할 수 있는 합금 구성과 내부 구조는 입자 크기를 변경하지 않고도 광학적 특성을 조정할 수 있다.
특히 바람직한 양자점은 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점, CdTe/CdSe 코어/쉘 양자점, CdSe/ZnTe 코어/쉘 양자점 및 합금 반도체 양자점(예를 들어, CdSeTe)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 양자점은 직경이 약 10 nm 미만이고, 더욱 더 바람직하게는 직경이 약 2 nm 내지 약 5.5 nm이며, 가장 바람직하게는 직경이 약 1.5 nm 내지 약 4.5 nm이다. 여러 센서(다중 검출)를 생성하기 위해 다른 색상 방출이 필요한 경우, 이는 상이한 방출 파장을 생성하는 양자점 코어의 크기를 변경함으로써 달성할 수 있다. 양자점은 입자와 관련하여 상기 논의된 바와 같이 안정화되거나 불안정화될 수 있다. 양자점을 안정화시키기 위해 바람직한 리간드는 레조르시나렌이다.
본 개시내용의 그래핀 바이오센서에서 유리하게는, 그래핀 코어 입자는 검출 가능한 모이어티의 신호에 대한 소광제 역할을 하므로, 함께 부착된 소광제 입자가 별도로 센서에 추가될 필요가 없다(예를 들어, 담체 입자에 직접 부착됨). 따라서, 다른 센서와 달리, 그래핀 코어 입자에 부착된 입자(검출 가능한 모이어티)는 그래핀 코어 입자 담체 입자와 상호작용하지만, 전형적으로 서로 상호작용하지 않고 감지 기능 측면에서 그래핀 코어 입자와만 상호 작용하도록 (예를 들어, 서로 및 담체 입자에 근접하여) 선택되고 배열된다. (예를 들어, 실시예 섹션에 설명되고 예시된 그래핀 입자에 부착된 펩타이드의 특성 참조).
따라서, 본원에 기재된 실시양태에서, 코어 입자 및 바이오센서는 각각 펩타이드 연결을 통해 순수 그래핀 나노시트 미립자에 적어도 하나의 검출 가능한 모이어티가 부착되는 그래핀 코어 입자를 포함한다. 이 구성에서, 검출 가능한 모이어티는 그래핀에 대한 소광 거리에 있고 검출 가능한 모이어티의 검출 가능한 신호는 중앙 그래핀 나노시트 미립자에 대한 근접성으로 인해 소광되고 약화되거나 검출될 수 없다. 펩타이드 연결은 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 포함하여, 시험된 샘플에 표적 바이오마커가 존재하는 경우 펩타이드 연결과 상호작용하여(그리고 전형적으로 이의 입체형태를 절단하거나 변형하여) 그래핀 입자의 소광이 발생하지 않는 방출 거리로 검출 가능한 모이어티를 가져올 것이다(예를 들어, 검출 가능한 모이어티를 방출하거나 관련 입체형태의 변화에 의해 거리를 변형함으로써). 일단 방출되거나 입체형태 변화를 통해 방출 거리로 이동하면, 검출 가능한 모이어티는 중심 그래핀 나노시트 미립자에 의해 더 이상 소광되지 않으며, 그 신호(또는 그 신호의 변화)를 검출하여 샘플에서 표적 바이오마커의 존재 및/또는 활성을 나타낼 수 있다.
본원에 기재된 대부분의 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 바이오센서에서, 부착된 중합체 층과 함께 부착된 컨센서스 서열의 직경은 20 나노미터를 초과하지 않아서 그래핀이 검출 가능한 모이어티의 신호를 소광하는 그래핀 입자에 대한 소광 거리에서 검출 가능한 모이어티의 배치를 허용한다(실시예 섹션에 예시되고 설명된 중합체의 특성 참조).
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 코어 입자 및/또는 바이오센서 내의 코팅 물질은 표적화 능력을 특징으로 하는 부착된 펩타이드 서열에 대해 최소 2 nm를 허용하도록 18 nm 이하의 두께를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 코어 입자 및/또는 바이오센서 내의 코팅 물질은 코팅 물질에 부착되거나 부착될 가능성이 있는 검출 가능한 구성요소의 크기에 따라 8 내지 17 nm, 2 내지 18 nm, 또는 5 내지 15 nm의 두께를 가지며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 프로테아제 활성 검출을 위한 그래핀 바이오센서에서 펩타이드 길이(A) 및 중합체 층 두께(B)의 허용 가능한 비율은 실시예 31에 예시된 절차에 따라 검출될 수 있다.
표적 바이오마커가 번역후 변형을 수행하는 일부 실시양태에서, 층 두께는 표적에 결합하거나 번역 후 변형 전에 20 nm에 가깝다. 두 경우 모두, 그래핀 입자가 검출 가능한 모이어티를 소광시키지 않는 방출 거리에서 검출 가능한 모이어티를 가져오는 펩타이드 서열을 연장시켜, 테더링된 형광단으로부터 형광 증가를 야기한다.
본 개시내용의 바이오센서는 놀랍게도 특히 그래핀 층이 2 내지 100개의 순수 그래핀, 보다 바람직하게는 프랙탈 순수 그래핀 시트를 포함하고 그래핀 입자의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 최대 100%에 대해 코팅 물질로 코팅된 실시양태에서 높은 안정성뿐만 아니라 관련 신호 검출의 높은 재현성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 실시양태에서, 표적 바이오마커는 높은 재현성으로, 특히 상이한 제조 로트 또는 배치 사이에서 검출된 신호의 변동 계수가 10% 미만으로 검출될 수 있으며, 여기서 신호는 각 로트에 대한 센서 전용 배경 위의 형광 양이다.
본원에 기재된 실시양태에서, 나노 바이오센서의 재현성은 변동 계수로 표현될 수 있는 정의된 생물학적 샘플의 측정 조건을 재현할 수 있는 능력에 의해 결정된다.
따라서, 본 개시내용의 바이오센서의 높은 재현성은 당업자가 수용액에서 화학적으로 안정하도록 변형되고 본 개시내용에 따라 다양한 센서 모이어티에 부착된 코어 입자를 독립적인 조립체로 형성하여 단일 생물학적 샘플로부터 동일한 양의 신호를 생성할 수 있도록 한다. 생물학적 과정을 측정하기 위한 가치를 가지려면 정의된 생물학적 샘플에서 방출되는 신호의 양이 재현 가능해야 한다.
그래핀 층이 2 내지 100개의 순수 그래핀 시트를 포함하고 적어도 90%에 대해 코팅 물질로 코팅된, 본원에 기재된 그래핀 바이오센서의 실시양태에서, 센서의 상이한 제조 로트 또는 배치 사이의 차이는 각 빌드에 대해 10% 미만의 변동 계수를 갖는 신호를 표시할 것으로 예상된다.
특히 재현성을 검출하기 위해, 반응에 추가되는 센서의 양은 바람직하게는 질량에 의존하기 보다는 흡광도를 사용하여 수행된다. 특히, 입자의 농도는 R2 > 0.99의 표준 곡선을 사용하는 흡광도 측정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 조건 하에, 입자의 농도는 CV% < 4%로 조정할 수 있다.
그래핀 층이 그래핀 주사 전자 현미경 및 디지털 광산란 측정을 사용하여 측정될 때 평균 10 내지 5000 nm, 바람직하게는 150 내지 500 nm의 입자를 포함하고 적어도 90%에 대해 코팅 물질로 코팅된 입자의 현탁액이 있는 본원에 기재된 실시양태에서, 재현성은 또한 센서를 포함하는 수성 현탁액의 안정성 측면에서 검출될 수 있으며, 재현성은 설정된 시간 내에 OD650 또는 OD270에서 콜로이드 안정성을 평가하여 평가된다. 입자가 10 nm 내지 5000 nm, 바람직하게는 150 내지 500 nm의 치수를 갖는 실시양태에서, 측정 사이의 OD650의 평균 감소는 24% 이하이며, 바람직한 실시양태에서는 전형적으로 10% 이하이다.
이러한 실시양태에서, 센서의 구성은 센서가 수용액에 균일하게 현탁된 상태로 유지되는 배합물을 허용한다. 이러한 특성은 입자를 균일하게 분포하게 하고, 생물학적 샘플에 존재하는 희귀한 특정 바이오마커와의 후속 상호작용이 펨토몰만큼 낮은 농도로 존재할 수 있게 한다. 안정성은 그래핀 표면의 비극성 성질을 가리는 표면 변형으로 몇 층의 그래핀을 변형함으로써 더욱 뒷받침된다. 이러한 변형은 입자가 수성 환경에서 현탁액 상태로 유지되도록 전하를 도입한다. 적어도 1 mg/ml의 완충 용액에서 센서 제조를 뒷받침하려면 극성 변형의 도입이 필요하다. 적어도 1 mg/ml의 안정적인 용액을 사용하면, 모든 센서를 5 μg/mL와 500 μg/mL 사이의 샘플과 기능 농도로 혼합할 수 있다. 바람직하게는, 센서 농도는 25, 30, 50, 100, 200, 300 μg/mL로 유지된다. 최적의 기능 농도는 특정 구성요소 및 관련 기능을 기반으로 각 센서에 대해 결정할 수 있다. 크기 및 전하 변형 도입의 복합적인 영향은 실온에서 1시간에 걸쳐 그래핀 나노바이오센서의 흡광도가 변하지 않도록 입자의 안정적인 현탁액을 유지하는 용액을 생성하는 것이다. 이러한 용액의 안정성은 실온에서 60분 간격에 걸쳐 OD650 또는 OD270에서 콜로이드 안정성을 평가하여 평가한다. 그래핀 센서는 OD650에서 -20 내지 -26%의 변화를 나타낸다. OD270에서 그래핀 센서의 흡광도는 -17% 내지 -21%의 변화를 나타낼 수 있다. 따라서, 그래핀 센서의 콜로이드 현탁액은 당업계에 알려진 다른 입자보다 더 효율적으로 현탁액에 남아 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 그래핀 입자는 900 nm 이하, 바람직하게는 350 m 이하, 보다 바람직하게는 250 nm 이하의 크기를 가지며, 펨토몰만큼 낮은 농도로 존재하는 표적 바이오마커에 대해 검출이 수행될 수 있다.
본 개시내용의 바이오센서는 또한 놀랍게도, 코팅되지 않은 그래핀의 표면에서 이전에 절단된 검출 가능한 모이어티(예컨대, 형광 염료)의 흡착 및 소광으로 인한 형광 판독값의 간섭을 최소화하기 위해, 특히 그래핀 층이 2 내지 100개의 순수 그래핀, 보다 바람직하게는 프랙탈 순수 그래핀 시트를 포함하고 그래핀 입자의 표면의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 100%에 대해 코팅 물질로 코팅된 실시양태에서 신호 검출의 높은 안정성 및 높은 재현성뿐만 아니라 높은 신호 대 잡음 비율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
특히, 상기 특징을 갖는 바이오센서는 적어도 25의 수용액 중 신호 대 잡음 성능(S:N)을 제공한다. 상기 특징을 갖는 예시적인 바이오센서를 사용하여 수행한 실험에서, 바이오센서에 대한 시간 0에서 센서와 혈청과 함께 인큐베이션된 샘플의 관계는 상대 형광 지수(RFI) 또는 샘플 RFU/검정 대조군 RFU가 평균 4.3 +/- 1.9인 것으로 밝혀졌다. 또한, 수용액에서 최대 90분 동안 유지된 바이오센서는 배경 신호에 유의한 변화가 없으며, 통합 S:N은 여러 바이오센서 로트가 측정됨에 따라 여러 센서에 걸쳐 평균 25에서 46, 159, 312로 증가한다. 따라서 t=0 및 t=60에서 신호 대 잡음 비율을 모두 평가한 통합 S:N은 그래핀 바이오센서의 크기와 용매 오염이 안정화됨에 따라 정의된 자극에 대한 민감도가 3배와 13배 사이로 증가함을 보여준다(대표적인 실시예 44 및 해당하는 도 59 및 도 60 참조). 이 S:N 성능은 센서에 따라 달라지며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
특히, 본원에 기재된 예시적인 나노바이오센서로 수행된 실험에서, 8- 내지 50- 범위의 4개의 상이한 센서(실시예 17, 로트 1 배합물의 도 20, 도 59 참조)를 평균화하여 25배의 개선이 측정되었으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 동일한 4개의 센서가 109- 내지 623배 S:N 범위의 평균 312 SN(실시예 40 및 실시예 43 로트 4 참조)으로 개선되었다. 비교해 보면, 철 입자 센서는 동일한 완충액과 샘플로 동시에 측정된 동일한 4개의 센서에 대해 평균 SN이 20(범위 6- 내지 42-)이었다(실시예 44 참조).
일부 실시양태에서, 바이오센서는 상기 구성 내에서 센서의 상이한 길이 및 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩타이드 테더의 길이는 50개 아미노산을 초과할 수 있다. 이는, 예를 들어, 펩타이드 사슬의 백 벤딩(back-bending)이 방출 거리에서 검출 가능한 모이어티를 가져오는 것으로 예상되는 모든 경우에 가능하다.
일부 실시양태에서, 펩타이드 연결은 본원에서 또한 스페이서 또는 커넥터로 표시된 모이어티를 통해 간접적으로, 본 개시내용의 그래핀 코어 입자의 코팅층 또는 그래핀 표면 및/또는 검출 가능한 모이어티에 부착될 수 있다. 예를 들어, 표 1의 예시적인 펩타이드 연결은 각 서열의 N-말단 앞에 스페이서 GAG를 포함할 수 있고, 스페이서 AG는 C-말단에 사용된다. 본 개시내용의 그래핀 바이오센서에서 적절한 스페이서의 선택은 검출될 표적 바이오마커 및 특정 바이오센서의 소광 거리 및 방출 거리를 고려하여 수행될 수 있으며, 이는 당업자가 이해될 수 있는 바와 같다(실시예 9 참조).
일부 실시양태에서, 펩타이드 연결은 3개 아미노산 스페이서 GAG, 4+4 아미노산 컨센서스 서열 및 2-3개 아미노산 스페이서(G)AG를 포함하는 올리고펩타이드이고, 길이는 5±0.5 nm이다. 일부 실시양태에서, 층의 치수는 2 nm(기능화된 그래핀) + 12 nm(PEI와 같은 코팅 물질) = 14 nm이다. 스페이서를 포함하는 14 nm + 5 nm 펩타이드 연결은 19 nm < 20 nm이다.
일부 실시양태에서, 그래핀 기반 바이오센서는 표면 플라즈몬 공명 및 그래핀 담체 입자와 검출 가능한 모이어티 사이의 FRET에 기반한 검출 방법을 위해 구성된다. FRET는 두 입자 사이의 에너지 전달을 설명한다. 표면 플라즈몬 공명은 입자를 여기시키는 데 사용된다. 초기에 여기 상태에 있는 수용체 입자는 비방사성 쌍극자-쌍극자 결합을 통해 이 에너지를 근접한 수용체 입자에게 전달할 수 있다. 간단히 말해, 검출 가능한 입자가 초기 상태에서 올리고펩타이드에 결합되어 있는 동안, 수용체 입자가 여기되면 첫 번째 방출이 관찰된다. 표적 바이오마커가 인식 서열에 결합 및/또는 절단되면 FRET 변화가 관찰되고 방출 스펙트럼이 변화한다. 전형적으로, 바이오마커에 의해 두 입자 사이의 거리가 변경되면(펩타이드 연결이 절단되거나 길어짐에 따라) 검출 가능한 입자에서 빛이 방출되고 흡수와 방출에서 뚜렷한 청색 이동이 관찰될 수 있다. 이는 두 입자 사이의 거리가 증가하기 때문이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 입자로부터의 신호 강도는 두 입자 사이의 거리가 증가함에 따라 증가한다.
본원에 기재된 바이오센서에서, 그래핀의 광물리적 특성을 고려할 때, 플라즈몬 소광은 플라즈몬 여기 및 소광의 중첩을 특징으로 하는 다른 나노물질과 반대로 지배적이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일반적으로, 바이오센서의 여기는 더 높은 에너지 상태(예를 들어, 수용체 입자)를 갖는 입자를 향한다. 그래핀(및 카복시그래핀)의 흡수 스펙트럼은 UV와 근적외선 사이에서 거의 변하지 않기 때문에, 이 바이오센서는 넓은 광학 영역에서 작동할 수 있다. 검출 가능한 입자의 여기는 유리하게는 약 300 nm와 약 1500 nm 사이에서 수행될 수 있다. 여기는 전형적으로 텅스텐 램프, LED, 레이저 및/또는 생물발광(예를 들어, 루시퍼라제, 레닐라, 녹색 형광 단백질)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적절한 파장의 에너지원으로 수행된다. 펩타이드가 올리고펩타이드 연결을 결합, 절단 또는 화학적으로 변형함에 따라 입자의 흡수 및/또는 방출의 변화는 바이오마커 활성에 따라 약 1분 내지 약 120분, 바람직하게는 약 1분 내지 약 60분, 일부 경우에는 약 1분 내지 약 30분의 기간에 걸쳐 관찰될 것이다. 실제로, 검정은 먼저 표적 바이오마커의 알려진 농도가 있거나 없는 대조 샘플을 사용하여 특정 바이오센서에 대해 보정될 수 있다.
특히, 순수 그래핀 나노시트는 본원에 기재된 코어 입자 내에 있고, 부착은 검출 가능한 모이어티를 본원에 기재된 코어 입자의 화학적으로 변형된 표면에 부착함으로써 수행된다. 코어 입자가 유기 및/또는 무기 분자의 층을 포함하는 실시양태에서, 화학적으로 변형된 표면은 유기 및/또는 무기 분자의 층으로 코팅되고, 부착은 펩타이드 연결을 유기 및/또는 무기 분자의 층에 결합시켜 수행된다.
가장 바람직한 실시양태에서, 부착에는 순수 그래핀 나노시트를 (예를 들어, 초음파처리에 의해) 분산시키는 것이 선행되고, 분산된 순수 그래핀 나노시트에 부착이 수행된다.
바람직한 실시양태에서, 분산은 프랙탈 그래핀을 포함하는 그래핀 입자를 사용하여 수행된다. 이러한 실시양태서, 분산은 제조에 들어가는 그래핀의 집단에서 더 큰 프랙탈의 표시를 감소시키는 데 바람직할 수 있다. 펨토몰 농도에서 표적 바이오마커를 검출하는 일부 실시양태에서, 입자의 입자 집단 크기는 전형적으로 10 nm와 5000 nm 사이, 임의로 50 nm와 500 nm 사이로 입자의 균질하고 안정적인 수용액을 지원한다. 초음파처리를 사용하면 시스템에 에너지를 도입하여 정전기 결합과 프랙탈을 함께 유지하는 반데르발스 힘을 방해한다. 일단 파괴되면 코팅 반응(예를 들어, 중합)이 표시된 대로 집단을 포착한다. 초음파처리는 시스템에 에너지를 도입하는 하나의 메커니즘을 나타내며, 이 중 일부는 더 큰 프랙탈을 파괴하는 데 사용된다. 이것은 초음파처리의 힘에 따라 계속 평형을 이룬다. DMF에서 소수층 그래핀의 200 mL 용액에서 마이크로팁 프로브 초음파처리기를 사용하여 2 kJ와 40 kJ 사이 또는 10 kJ와 20 kJ 사이 또는 보다 바람직하게는 12 kJ와 15 kJ 사이를 도입하면 적합한 입자 집단이 생성된다. 대안적으로, 고전단 균질화기를 사용하여 분산함으로써 프랙탈 집단의 크기를 변형할 수 있다. 대안적으로, 더 큰 프랙탈을 파괴하기 위해 마이크로파를 사용하거나 고압 하에 압출하여 에너지가 가능하게는 공급될 것으로 예상된다. 이러한 방법은 기계적 방법을 사용하여 큰 프랙탈을 분산시켜 전체 집단 크기를 감소시킨다. 대안적으로, 여과 또는 크기 분류 또는 원심분리 하에서의 침강과 같은 크기 선택 기술을 사용하여 50-500 nm를 나타내는 집단을 선택하기 위해 크기 선택이 수행될 것으로 예상된다. 예에는 참조 프로브 초음파처리가 포함되어 있다(실시예 22 및 관련 도 27 및 도 29 참조). 유효 종점은 TEM 또는 광산란 방법과 같은 임의의 방법으로 분산 처리 후 최종 집단의 크기를 결정하여 결정된다. OD270/mg/ml로 측정한 흡광 효율을 사용하여 분산 단계가 포함됨에 따라 >1.0, >2.0 및 >3.0의 효율이 관찰되었다. (바람직한 실시양태에 대한 효율을 나타내는 실시예 40 및 도 55의 관련 데이터 참조).
본원에 기재된 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 입자는 코팅 물질 FGcg의 상응하는 작용기의 부착을 허용하도록 선택되는 작용기 FGg를 제공하도록 작용화된다. 작용기 FGg 및 FGcg의 결합을 통한 코팅 물질의 부착은 바람직하게는 기능화된 그래핀 입자의 분산 후에 수행되며, 그 결과 코어 그래핀 입자는 펩타이드 연결에 제시된 상응하는 작용기 FGp에 결합하도록 구성된 작용기 FGcp를 제시한다.
일부 실시양태에서, 반응식 I 내지 IX에 예시된 바와 같은 적절한 결합 화학에 기초하여, 바이오센서의 합성을 위한 하기 반응식이 설명된다.
반응식 X
여기서 A는 그래핀을 기능화하도록 구성된 시약이고, CM은 개시내용의 의미에서 코팅 물질이고, P는 본 개시내용의 의미에서 펩타이드 연결이고, DM은 검출 가능한 모이어티이다.
반응식 X에 나타낸 바와 같이, 화학식 Xa의 그래핀은 시약 FG1-A-FGg와 반응하며, 여기서 FG1은 그래핀과 반응하거나 반응하도록 만들어진 반응성 작용기이고, FGg는 코팅 물질과 화학적으로 결합될 수 있는 작용기이며, A는 C2 내지 C4 또는 C5 내지 C12의 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 알킬기의 화학적 모이어티이고, 여기서 1 내지 4개의 탄소 원자는 O, S 또는 NH로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 대체될 수 있다. 예시적인 FG1은 가열 조건 하에 니트렌으로 분해되는 -N3(아지드), 디에노필인 말레이미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 FGg는 -COOH 또는 NH2를 포함한다.
화학식 Xb의 기능화된 그래핀은 기능화된 코팅 물질 FGcg-CM-FGcp와 반응하며, 여기서 FGcg는 기능화된 그래핀 상의 FGg와 반응할 수 있는 작용기이다. 따라서, FGg가 -COOH인 경우, 예시적인 FGcg는 NH2일 수 있어 FGg와 아미드 결합을 형성할 수 있다
화학식 Xc의 코팅된 그래핀은 작용기 FGcp를 포함하며, 여기서 FGcp는 기능화된 펩타이드 FGpc-P-FGpd 상에서 FGpc와 반응할 수 있는 작용기이다. 유사하게, 예시적인 FGcp는 -COOH 또는 NH2를 포함한다. 따라서, FGcp가 -COOH인 경우, 예시적인 상응하는 Fpc는 NH2일 수 있어 FGcp와 아미드 결합을 형성할 수 있다.
화학식 Xd의 펩타이드 유도체화된 그래핀은 작용기 FGpd를 포함하며, 여기서, FGpd는 기능화된 검출 모이어티 FGdp-DM 상에서 FGdp와 반응할 수 있는 작용기이다. 유사한 방식으로, 예시적인 FGdp는 -COOH 또는 NH2를 포함한다. 따라서, FGdp가 -COOH인 경우, 예시적인 상응하는 Fpd는 NH2일 수 있어 FGdp와 아미드 결합을 형성할 수 있다.
본원에 기재된 한 쌍의 결합 작용기 중 어느 것이라도, 본원에 기재된 반응식 I 내지 반응식 IX에 예시된 바와 같이, 임의의 다른 결합 작용기와 함께 실시될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 하나의 작용기가 아민 -NH2인 경우, 다른 작용기는 카복실산 이외에, NHS(반응식 V) 또는 옥시란(반응식 IX)일 수 있다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 바람직하게 분산된 입자 상에 코팅을 조립하는 것은, 먼저 코팅층을 그래핀 입자의 표면에 부착하여 아미드, 아민, 에스테르, 에테르, 티오에스테르 또는 티오에스테르 결합과 같은 코팅층 FGcp의 작용기를 나타내는 코팅 입자를 제공하고, 펩타이드 링커 FGp의 대응하는 작용기를 통해 펩타이드 연결을 작용기 FGcp에 부착함으로써 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커를 먼저 중합체에 부착한 다음, 이를 그래핀에 부착한다. 부착은 직접 또는 간접적으로 수행될 수 있으며, 상응하는 작용기에 따라 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 이루어질 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 펩타이드 연결은 그래핀을 직접 부착하도록 구성된 스페이서, 예컨대 (그래핀의 가장자리를 표적으로 하는) EPLQLKM[27] 및 (평평한 그래핀 표면에 흡착하여) 임의의 펩타이드 서열을 순수 그래핀에 고정시키는 HSSYWYAFNNKT[27]를 통해 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 펩타이드 연결은 그래핀에 부착된 티일 라디칼로 산화된 말단 시스테인에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비천연 아미노산은 펩타이드 서열의 N-말단 단부에 테더링되어 결합을 수행할 수 있다(모든 화학은 상기 기재된 바와 같음).
일부 실시양태에서, 코팅 물질은 20 nm 미만의 올리고에틸렌 기, 직경이 20 nm 미만의 스타버스트 덴드리머, 및 블록-공중합체를 포함할 수 있다: 일부 실시양태에서, 블록 공중합체를 포함할 수 있는 코팅 물질이 사용되는 경우, 소수성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리이소부틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 당업자가 식별할 수 있는 추가 중합체는 폴리스티렌의 블록 공중합체에 폴리스티렌-설폰산과 같은 음으로 하전된 중합체가 사용될 때 소수성 및 전하 인력의 조합으로 블록 공중합체의 성분일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 소수성-친수성 블록 공중합체는 또한 그래핀을 잘 분산시키는 용매(예를 들어, 디메틸포름아미드(DMF))에 용해될 수 있다. 초음파처리를 계속하면, H2O가 혼합물에 추가되어 블록 공중합체의 소수성 단부가 그래핀에 결합하도록 한다. 이러한 초분자 부착은 연속적인 H2O 첨가로 인해 증가하는 소수성 감소로 인해 분산액에서 자발적으로 발생한다. 따라서, 이 센서가 수성 용매에 사용되는 한, 이러한 부착 원리는 안정적으로 작동할 것으로 예상된다.
본 개시내용의 의미에서 수용액에서 그래핀 바이오센서의 특성에 따라, 그래핀 바이오센서는 또한 놀랍도록 안정적이며 수성 샘플에서 표적 바이오마커의 고도로 재현 가능한 검출을 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본원에 사용된 "샘플"이라는 용어는 생물학적 환경, 배양액, 조직, 상업적 재조합 단백질, 합성 화합물 또는 그 일부와 같은 표본으로부터의 유체와 같이, 더 많은 양의 어떤 것을 나타내는 제한된 양의 어떤 것을 나타낸다.
본원에 사용된 "표본"이라는 단어는 테스트, 시험 또는 연구에 사용하기 위한 환경으로부터의 물질의 일부를 나타낸다. 환경은 개체를 포함할 수 있다. 명사로 지칭될 때, 검출, 진단 및 치료와 관련하여 본원에 사용된 "개체"라는 용어는 동물, 특히 고등 동물, 특히 포유류와 같은 척추동물, 특히 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단일 생물학적 유기체를 지칭한다. 이러한 경우, 표면에는 요도, 소변, 자궁경부, 질, 직장, 구강인두, 결막 또는 모든 체액과 같은 생체의 조직, 장기 또는 기타 생물학적 물질의 일부가 포함될 수 있다.
특히, 생물학적 샘플은, 샘플링된 개체에서 유사한 세포의 전체 집단을 대표하는, 임의의 생물학적 계통의 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 예시적인 생물학적 샘플은 특히 당업자가 식별할 수 있는 다음을 포함한다: 전정맥 및 동맥혈, 혈장, 혈청, 건조 혈반(dried blood spot), 뇌척수액, 요추 천자, 비강 분비물, 부비동 세척액, 눈물, 각막 긁힘, 타액, 가래 또는 객담, 기관지 내시경 분비물, 경기관 흡인액(transtracheal aspirate), 기관내 흡인액(endotracheal aspiration), 기관지 폐포 세척, 구토, 내시경 생검, 대장 내시경 생검, 담즙, 질액 및 분비물, 자궁내막액 및 분비물, 요도액 및 분비물, 점막 분비물, 활액, 복수, 복막 세척액, 고막 흡인액, 소변, 청결 채취 중간 소변(clean-catch midstream urine), 카테터 삽입 소변, 치골상 흡인액, 신장 결석, 전립선 분비물, 대변, 점액, 고름, 상처 배액, 피부 긁기, 피부 조각 및 피부 생검, 모발, 손톱 조각, 뺨 조직, 골수 생검, 고형 장기 생검, 수술 표본, 고형 장기 조직, 시체 또는 종양 세포. 생물학적 샘플은 샘플 유형에 따라 적절한 멸균 기술 또는 비멸균 기술을 사용하여 얻을 수 있으며, 이는 당업자가 식별할 수 있다. 일부 생물학적 샘플은 면봉을 인체의 표면과 접촉시키고 상기 표면으로부터 일부 물질을 제거하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 인후 면봉, 비강 면봉, 비인두 면봉, 구인두 면봉, 뺨 또는 협측 면봉, 요도 면봉, 질 면봉, 자궁 경부 면봉, 생식기 면봉, 항문 면봉, 직장 면봉, 결막 면봉, 피부 면봉 및 모든 상처 면봉이 포함된다. 생물학적 샘플의 유형과 의도한 분석에 따라, 생물학적 샘플은 샘플 준비 및 분석을 위해 신선하게 사용할 수 있거나 고정액을 사용하여 고정할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 시스템에서, 샘플은 2개 이상의 부분으로 분할될 수 있고/있거나 처리를 통해 처리되어 표적 바이오마커를 풍부하게 하고/하거나 선택된 물질을 제거하여 검출의 품질을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 샘플이라는 용어는 화학적으로 처리되거나 저장, 보존 또는 추가 분석되는 샘플을 포함한다.
그래핀 코어 입자 및 관련 그래핀 바이오센서 조성물, 방법 및 시스템과 관련하여 사용되는 샘플은 수성 샘플이다.
본 개시내용의 의미에서 "수성 샘플"은 물이 용매 또는 주성분인 샘플이다. 특히, 수용액은 전형적으로 실험 기간 동안 센서 및 샘플의 존재 하에 정의된 pH를 유지할 수 있는 농도의 완충 성분을 포함한다.
본원에 기재된 실시양태에서, 적어도 90%의 코팅 물질로 코팅된 2 내지 100개의 순수 그래핀 시트, 바람직하게는 프랙탈 그래핀을 갖는 본 개시내용의 의미에서의 그래핀 바이오센서는 바람직하게는 수성 샘플에서 놀랍도록 안정적이며, 특히 치수가 10 nm 내지 5000, 바람직하게는 150 내지 500 nm인 경우 높은 재현성 및 신호 대 잡음 비율을 특징으로 하는 검출을 제공할 수 있음이 밝혀졌다.
특히, 일부 실시양태에서, 이러한 특징을 포함하는 본 개시내용의 센서는 변동 계수 CV가 3% 미만인 센서 농도(동일한 특징을 갖는 바이오센서 용액의 독립적인 배치)를 복제하는 흡광도를 나타낸다. 이 CV의 달성은 결정된 반응에 균일하게 분포된 상태를 유지하는 센서를 가진 용액을 결정함으로써 얻어진다. 분산 단계(예를 들어, 초음파처리를 사용함)와 용매 제거를 포함하는 방법으로 제조된 나노센서의 제조는 60분 간격으로 15% 미만의 침강으로 콜로이드 안정성을 유지한 센서의 용액을 생성하였다. 특히, 입자 분산 단계 및 용매 제거 단계를 포함하는 방법에 의해 입자가 제공되는 실시양태에서, 침강은 9% 내지 10%에서 관찰되었다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 센서의 재현성은 또한 검정 대조군 및 샘플 둘 모두의 재현 가능한 추정치를 통해 검출될 수 있는데, 이는 이들 두 값이 S:N을 추정하기 위해 나누어지기 때문이다. 본 개시내용의 센서는 20% 미만의 배치 사이의 CV%를 표시한다. 이와 관련하여, 상기 특징을 조합한 본 개시내용의 바이오센서는 3%와 10% 사이의 배치 간 CV%를 제공할 수 있다. 최적으로, 배치 간 CV%는 10% 미만일 것이다. 이는 센서의 독립적인 배치를 준비하고 표준 자극과 일치하는 조건 하에 SN(SM/AC)을 비교하여 평가한다. (실시예 22 및 관련 도 27, 실시예 44 및 관련 도 59 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 바이오센서의 S:N은 낮고 안정적인 검정 대조군 판독값을 유지함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, VarioSkan Lux에서 평가된 바이오센서의 경우, AC는 0.01과 0.1 사이이다. 신호는 센서와 자극에 따라 달라진다. 동일한 자극을 사용하는 임의의 주어진 센서에 대한 샘플 신호는 분산된 용매 경화 센서를 사용하면 15배 향상될 수 있다. 또한, 분산액의 증분 첨가(SN의 평균 6.8배 증가) 및 분산액 및 용매 제거(SN의 평균 15배 증가)는 (1) 초음파처리 또는 3.0 OD270/mg/ml 초과의 흡광 효율에 상응하는 것을 사용하여 분산되고(실시예 40 및 관련 도 55 참조), (2) TGA가 5% 미만(wt%), 가능하면 2% 미만의 총 질량 손실을 측정하도록 용매의 양을 감소시키는 코어 입자(실시예 44 및 관련 도 59 참조)의 조합 사용이 S:N 성능과 관련이 있음을 나타낸다(실시예 21 및 관련 도 25 참조).
일부 실시양태에서, 적절한 완충액 선택을 수행하여 재현성 및 신호 대 잡음 비율을 증가시킬 수 있다. 완충액 선택은 바이오마커 검출을 위한 가장 적절한 pH 목표를 반영하는 굿 리스트(Good’s list)로부터의 선택에 기초하여 수행될 수 있다. 일염기성 염의 첨가는 첨가된 염의 농도에 따라 어느 정도까지 S:N 성능을 증가시키며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해될 수 있는 바와 같다. 일염기성 염은 S:N 비율을 증가시키는 샘플에 비해 검정 대조군을 감소시킨다. 일염기성 염을 포함하면 VarioSkan Lux에서 평균적으로 검정 대조군이 0.01 RFU와 0.1 RFU 사이로 감소한다. 전반적으로, 시험된 모든 센서에 대한 완충액의 영향은 S:N을 평균적으로 4배(2.5배 내지 6.7배 범위) 증가시킨다(실시예 42 및 관련 도 57 참조). 특정 프로테아제 효소에는 2가 양이온과 같은 완충 보조 인자가 필요하다. 프로테아제 검출을 위한 바람직한 실시양태에서, 완충액은 10 μM 칼슘, 마그네슘 및 아연 2가 이온을 포함한다. 시험된 배합물은 모든 센서에 걸쳐 사용된 생리적으로 관련성이 있는 pH 7.2에 초점을 맞추었다. 그러나, 종양 환경과 세포내 구획은 종종 7.0 미만의 pH를 반영한다. 따라서, 다중 반응에서와 같이 반응 챔버를 공유하는 경우를 제외하고는 pH는 하나의 조건일 필요는 없다. 일부 효소는 산성 조건을 필요로 하며 모든 예에서, pH 7.0과 pH 6.0 및 6.4와 6.8은 카텝신 또는 염증 환경에서 유래한 효소와 같은 효소를 지원할 것으로 예상된다. 수용체 리간드 상호작용은 바람직하게는 생리학적 조건에서 측정되므로 155 mM 및 pH 7.2는 많은 센서 배합물을 광범위하게 지원하는 조건이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 바이오센서는 표적 바이오마커에 특이적인 검출 가능한 모이어티 및 인식 서열을 각각 포함하는 복수의 검출 가능한 구성요소를 포함한다.
이러한 실시양태 중 일부에서, 복수의 검출 가능한 구성요소 중 검출 가능한 구성요소의 인식 서열은 상이한 표적 바이오마커를 특이적으로 인식하도록 구성된다.
따라서, 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 그래핀 바이오센서는 다중 검출을 위해 구성되고 단일 실험에서 다중 분석물을 동시에 측정하도록 구성된다.
특히, 본원에서 사용되는 다중화라는 용어는 동일한 시약 혼합물을 사용하여 동일한 반응에서 2개 이상의 표적 바이오마커가 검출될 수 있는 실시양태를 나타낸다.
나노 바이오센서의 복수의 표적 특이적 검출 가능 구성요소에서, 각각의 검출 가능 모이어티의 여기 스펙트럼은 복수의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소 중 다른 검출 가능 모이어티의 방출 스펙트럼과 최소화된 중첩을 갖는다. 따라서, 이들 실시양태에서, 각각의 검출 가능한 모이어티는 판독을 왜곡할 검출 가능한 모이어티 중에서 FRET 효과를 최소화하기 위해 복수의 검출 가능한 구성요소의 검출 가능한 모이어티의 여기 및 방출 스펙트럼 사이에 중첩이 최소 또는 전혀 중첩되지 않는 특정 바이오마커에 할당된다.
그래핀 센서의 특성 및 특징을 고려하여 다중 검출을 위해 구성된 그래핀 센서에서, 2 내지 100개의 그래핀 시트 및 그래핀 표면의 적어도 90%를 코팅하는 코팅층을 갖는 센서의 다중 능력은 5개 이상의 펩타이드 서열 + 검출 가능한 모이어티로, UV/Vis 스펙트럼에서 가능하게는 최대 10개, 및 전체 전자기 스펙트럼에서 최대 50개이다.
본원에 기재된 그래핀 바이오센서의 일부 실시양태에서, 펩타이드 및 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 형광단)를 포함하는 검출 가능한 성분은 그램당 최대 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰의 농도로 다중 바이오센서에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 바이오마커(예를 들어, 프로테아제)의 펨토몰로부터 마이크로몰까지의 농도 범위에 걸쳐 가장 빠른 신호 증가가 바람직한 경우, 검출 가능한 성분의 농도는 그래핀-나노바이오센서 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰이 될 수 있으며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
따라서, 바이오센서가 다중 바이오센서인 일부 실시양태에서, 나노바이오센서 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰의 검출 가능한 성분 (펩타이드 서열 + 검출 가능한 모이어티의 농도는 다중화 목적으로 사용되는 펩타이드 서열 + 검출 가능한 모이어티의 수로 나누어야 한다. 불균등한 농도의 각각의 검출 가능한 구성요소가 사용되는 경우, 각 펩타이드 서열 + 검출 가능한 모이어티에 대한 모든 부분 농도의 합은 나노바이오센서 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰과 같아야 하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
추가로, 바이오센서가 다중 바이오센서인 일부 실시양태에서, 테더링된 펩타이드 서열 + 검출 가능한 모이어티의 바람직한 농도를 고려하여 표적 바이오마커(예를 들어, 프로테아제)의 펨토몰에서 마이크로몰까지의 농도 범위에 걸쳐 가장 빠른 신호 증가를 얻기 위해 나노바이오센서의 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰이고, 이 농도는 다중화 목적으로 사용되는 검출 가능한 구성요소의 수로 나누어야 한다. 불균등한 농도가 사용되는 경우, 각 펩타이드 서열 + 형광단에 대한 모든 부분 농도의 합은 나노 바이오센서 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰과 같아야 하며; 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
따라서, 본원에 기재된 다중화 나노바이오센서의 일부 바람직한 실시양태에서, 사용된 모든 펩타이드 + 형광단의 합의 농도는 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰 내지 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-7 몰, 바람직하게는 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-4 몰 내지 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-6 몰, 보다 더 바람직하게는 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-5 몰 내지 그램당 2.0 ± 0.25 x 10-5 몰의 범위일 수 있으며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
유사한 다중화 능력은, 각각 상이한 표적 바이오마커에 특이적인 검출 가능한 구성요소를 나타내는 본 개시내용의 복수의 바이오센서를 포함하는 구성요소를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상이하게 조립된 센서들은 반응의 일부로서, 각 센서가 센서로만 정의된 배경 신호보다 더 큰 신호를 여전히 생성할 수 있도록 혼합될 수 있다. 이러한 맥락에서, 표적 바이오마커에 특이적인 바이오센서는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 10개 또는 20개의 상이한 센서와 혼합되어도 여전히 배경보다 더 큰 신호를 생성할 수 있다. 1:20 표시에서, 다중 센서는 예상 값의 5~7% 수준으로 검출 가능하다. 따라서, 다중 센서는 20개 또는 10개 또는 4개 또는 2개 중 1개의 다중 센서에서 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 바이오마커의 다중 검출은 복수의 표적 바이오마커와 연관된 상태의 검출과 관련하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 센서는 폐암의 존재 및 부재에 대한 MMP-9, CTS-K, MMP-2 및 ARG의 다중 검출을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예로, 본 개시내용의 센서는 항염증 사건 및 상태의 검출을 위한 아르기나제 IL-13 및 개체의 염증촉진 사건 및 상태의 검출 및 진단을 위해 IL-6, GCSF, MIP-1, MCP-1의 다중 검출에 사용될 수 있다.
다중 제조를 위한 예시적 프로세서
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 그래핀 코어 입자, 그래핀 바이오센서는 적절한 보조제와 함께 조성물에 포함된다. 본원에 사용되는 "보조제"라는 용어는 활성 성분으로서 조성물에 포함되는 본원에 기재된 그래핀 바이오센서용 용매, 담체, 결합제 또는 희석제로서 일반적으로 작용하는 임의의 다양한 매질을 나타낸다. 특히, 하나 이상의 옥심을 포함하는 조성물은 본원에 기재된 방법 또는 시스템 중 하나에서 사용될 수 있다.
특히, 일부 실시양태에서, 저장 및/또는 사용을 위해, 바이오센서는 전형적으로 임의의 유형의 적합한 희석제, 부형제, 비히클 등일 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매 시스템에 분산될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 없이 대상체에게 투여할 수 있고, 허용할 수 없는 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 포함된 조성물의 다른 구성요소와 해로운 방식으로 상호작용하지 않는다는 점에서 생물학적이지 않다거나 달리 바람직하지 않다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 바이오센서 구성요소의 임의의 분해를 최소화하고 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 (생체내 투여를 위해) 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하도록 선택될 수 있다. 예시적인 담체는 디에틸 에테르, DMF, DMSO 등과 같은 비수성 용액을 포함한다. 바이오센서는 실온 조건에서, 심지어 최대 100℃의 상승된 온도에서도 열화 없이 저장 안정성이 있으며, 특별한 취급 요건 없이(예를 들어, 냉장 보관 없이) 보관 및 배송할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 성분은 수의학적으로 용도 및 인간의 약제학적 용도에 허용되는 성분을 포함하며 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 주사를 통한 투여에 적합한 조성물은 전형적으로 멸균 등장성 수성 완충액 중 용액이다. 예시적인 담체에는 정상(n.) 식염수(~0.9% NaCl), 인산염 완충 식염수(PBS), 멸균수/증류 오토클레이브 물(DAW: distilled autoclaved water) 또는 기타 허용되는 비히클과 같은 수용액이 포함되며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
그래핀 담체 입자는 본 개시내용의 데이터에 기초하여 무기한의 시간 동안 안정적이다. 펩타이드 연결은 또한 장기간(수년) 동안 안정적이다. 검출 가능한 모이어티에 대해 선택된 특정 화합물은 전체 바이오센서의 보관 안정성을 감소시킬 수 있으며, 특정 센서는 원하는 경우 섬세한 검출 가능한 모이어티를 더 오랜 기간 동안 보존하기 위해 보다 조심스러운 조건 하에(예를 들어, 아르곤 하에) 보관될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 바이오센서는 그래핀 담체 입자가 사용될 때까지 저장될 수 있는 순차적인 단계로 제작될 수 있으며, 이때 펩타이드 연결 및 검출 가능한 모이어티가 추가된다(예를 들어, 최종 사용자에게 배송되기 직전에 또는 최종 사용자에 의해 추가된다)는 것이 인식될 것이다. 마찬가지로, 그래핀 담체 입자는 선택된 펩타이드 연결로 사전 접합되어 부착된 검출 가능한 모이어티 없이 저장될 수 있으며 나중에 사용하기 위해 추가될 수 있다. 특히, 그래핀 담체 입자는 잘못된 표지화에 대한 내성이 더 높으며, 여기서 실수로 그래핀 입자 자체에 직접 부착된 검출 가능한 모이어티(연결을 통하지 않음)가 올바르게 부착된 검출 가능한 모이어티를 방해해서는 안된다. 즉, 잘못 부착된 담체 입자의 신호는 담체 입자와의 근접성으로 인해 영구적으로 소광될 것이다. 따라서, 바이오센서는 제조 동안 더 높은 허용 임계값을 가지며, 이는 바이오센서의 이점에 더욱 기여한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 적합한 농도로 본 개시내용의 그래핀 코어 입자 및/또는 바이오센서에 추가되는 성분들을 포함할 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 특히, 본 개시내용의 의미에서 조성물은 전형적으로 제어된 pH에서 용해되는 용액의 pH를 유지하도록 선택된 염 및 완충액(용해되는 용액의 pH를 유지할 수 있는 물질)를 포함할 수 있다. 예시적인 바람직한 실시양태에서, 조성물은 10 μM 2가 양이온 및 155 mM NaCl을 포함하는 5 mM MES뿐만 아니라 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 식별할 수 있는 염 및 완충액의 추가 조합을 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시양태에서, 바이오센서를 마이크로플레이트 웰에 사전 분배되고 사용을 위해 보관/분배될 수 있다. 검정 침니(black chimney) 웰 마이크로플레이트가 특히 이러한 목적에 적합하다. 검정에는 주변 광 간섭과 잡음을 감소시키기 위해 불투명한 마이크로플레이트 구성이 선호된다. 다양한 생물학적 마커의 비침습적 검출 및 정량화 방법도 본원에 기재되어 있다. 이러한 방법은 다양한 병태와 질환을 나타내는 생물학적 마커를 평가하기 위해 가정 또는 현장에서 진료 자원의 필수적인 부분으로 의료 시설에서 수행될 수 있다. 이러한 생물학적 마커 기반 진단은 정밀 의학, 특히 기도 질환, 예를 들어 다른 폐 질환과 폐암을 구별하는 데 수많은 응용분야를 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 동결건조된 형태일 수 있다. 동결건조를 지원하는 보조 시약은 트레헬로오스, 덱스트로오스, 글루코스, 글리신, 스테아린산마그네슘, 미정질 셀룰로오스, 전분(옥수수), 실리콘/이산화티타늄, 스테아르산, 전분글리콜산나트륨, 젤라틴, 활석, 수크로스, 스테아린산칼슘, 포비돈, 예비 젤란틴화 전분(Pregelantinized Starch), HPMC, OPA 제품, 크로스카멜로스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 에티셀룰로오스, 인산칼슘 또는 크로스포비돈을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 그래핀 바이오센서는 생물학적 샘플을 본 개시내용에 따른 임의의 바이오센서와 접촉시켜 반응 용액을 생성하는 단계; 및 반응 용액의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 수성 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하는 방법에 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 수성 샘플은 개체로부터의 생물학적 샘플이다. 이러한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 샘플을 수집하고 분석을 위해 샘플을 처리함으로써 제공될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 샘플의 처리는 전형적으로 검출 시약과 함께 사용하도록 구성된 처리된 수성 샘플을 생성한다. 특히, 반응 용액에서 바이오센서는 표적 바이오마커(샘플에 존재하는 경우)가 바이오센서의 인식 서열과 상호작용하기에 충분한 기간 동안 처리된 생물학적 샘플과 접촉할 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 소변, 타액, 눈물, 가래, 기관지폐포 세척액, 비강 면봉, 호흡 응축액, 모유, 대변, 직장액, 질액 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 한 양상에서, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수집하여 분석을 위해 준비한다. 샘플은 수동으로 수집 및 준비될 수 있으며, 이에는, 예를 들어, 수동 피펫팅 또는 샘플의 혼합/희석, 수동 단백질 스팟 절단, 수동 생검 수집, 수동 채혈, 수동 마이크로웰 로딩이 포함된다. 대안적으로, 자동화된 프로세스가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어, 자동화된 액체 처리기, 자동화된 단백질 스팟 절단기, 자동화된 생검 수집, 자동화된 채혈, 및 자동화된 마이크로웰 로딩의 사용이 포함된다. 생물학적 샘플은 대상체의 건강 상태를 나타내는 생물학적 마커로 사용될 수 있는 본원에 기재된 다양한 효소를 포함하여 관심 있는 생물학적 마커를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 샘플을 반응 용액에 첨가하기 전, 동안 또는 후에 약제학적으로 허용되는 완충액을 첨가하여 관심 있는 바이오마커 및 사용된 특정 검출 가능한 모이어티에 따라 pH를 최적의 수준으로 조정할 수 있다. 예를 들어, HEPES와 같은 약알칼리성 완충액을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 원하는 범위 내에서 조정할 수 있다. 또한, pH를 조정하여 반응을 미세 조정할 수 있다. 예를 들어, MMP 및 카텝신과 같은 특정 효소는 암성 샘플에서 채취할 때 비암성 샘플에 비해 약산성 pH(하한 ~6.6) 하에 더 활성화된다. 따라서, pH는 검정의 출력을 더욱 향상시키기 위해 본 개시내용의 범위 내에서 최적화할 수 있는 파라미터이다. 반응 용액에는 Mg(II), Ca(II) 또는 Zn(II)과 같은 보조 인자를 추가하여 검출을 위한 효소 활성을 더욱 향상시킬 수도 있다.
표적 바이오마커가 샘플에 존재하는 경우, 검출 가능한 모이어티가 형광 또는 색상 변화와 같은 검출 가능한 신호(예를 들어, 광학 또는 분광)를 생성하며, 이를 시각적으로 감지하거나 적절한 기기로 측정할 수 있다. 플레이트 판독기를 사용하여 분석 결과를 검출할 수 있다. 테더링할 때 설명된 바와 같이, 중심 그래핀 입자는 검출 가능한 모이어티의 방출을 소광시킨다. 프로테아제 또는 기타 표적 바이오마커의 존재 시, 중심 입자에서 검출 가능한 모이어티를 분리하는 연결을 절단하거나 검출 가능한 모이어티를 소광 근접성 외부로 확장하는 연결을 변형한다. 검출 가능한 입자는 담체 입자에 대한 근접성에 따라 변화하는 검출 가능한 신호를 생성하며, 이는 검출할 수 있으며 표적 단백질의 활성과 상관관계가 있다. 예를 들어, TCPP의 최대 흡수는 거의 420 nm이므로 저렴한 420 nm LED 또는 다른 종류의 레이저 다이오드를 검출 가능한 모이어티로서 TCPP를 사용하는 바이오센서의 여기를 위해 사용할 수 있다. 바이오센서가 실시예에 예시된 TCPP-그래핀 FRET 쌍에 제한되지 않음을 이해할 것이다. 임의의 FRET 감지 쌍을 사용할 수 있다. 다른 FRET 쌍을 사용하는 경우 여기 파장 및 검출 장치를 그에 따라 변형할 수 있다.
일부 실시양태에서, FRET는 전자기 스펙트럼의 전체 범위에 걸쳐 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 광음향 검출(다양한 형광단의 광음향 반응이 구별될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방사성 동위원소는 그래핀 코어로부터 방출된 후 여과될 수 있다.
일부 실시양태에서, MRI 프로브는 강자성 물질(산화철) 또는 고회전 d- 및 f-블록 금속 착물로 코팅된 그래핀으로부터 방출될 수 있다.
일부 실시양태에서, EPR 프로브는 강자성 물질(산화철) 또는 고회전 d- 및 f-블록 금속 착물로 코팅된 그래핀으로부터 방출될 수 있다.
바이오센서를 사용하는 검정은 펨토몰 이하 수준(리터당 10-15 몰 미만)까지 바이오마커를 검출할 수 있으며, 이는 면역검정과 같은 경쟁 기술보다 적어도 두 자릿수 더 민감하다. 실제로, 최적화되지 않은 바이오센서를 사용하는 작업 예에서 입증된 바와 같이, 프로테아제에 대한 10-16개의 검출 한계(LOD)가 가능하다. 이 기술의 고유한 이점은 한 번의 액체 생검으로 다양한 바이오마커(예를 들어, 여러 프로테아제, 사이토카인 및 키나아제)를 측정할 수 있다는 것이다. 즉, 이 기술은 단일 플랫폼에서 상이한 부류의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 다중화 실시양태에서, 검정이 단일 생물학적 샘플에서 복수의 상이한 유형의 표적 바이오마커를 분석할 수 있도록 복수의 상이한 유형의 검출 가능한 모이어티가 바람직하게 사용된다. 다중 바이오마커를 살펴보면 관련 질환(예를 들어, 폐암 대 다른 질환)을 구별하고 매우 초기 상태의 질환을 검출할 수 있다. 후자는, 예를 들어, 폐암 발견에 중요한데, 3기 또는 4기에 비해 0기 또는 1기에 발견될 때 암 생존율이 크게 증가하기 때문이다.
특히, 본원에 기재된 다중 바이오센서에서, 검출 가능한 구성요소는 함께 부착된 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 형광단)의 여기 및 방출 스펙트럼이 중첩을 최소화하도록 선택된다. 보다 특히, 본원에 기재된 바이오센서의 다중화 실시양태에서 검출 가능한 구성요소의 선택은 형광단과 같은 검출 가능한 모이어티 사이에서 FRET의 발생을 최소화하기 위해 수행된다. 이와 관련하여, 예를 들어, BODIPY 염료와 같은 검출 가능한 모이어티의 선택은 좁은 여기 및 방출 스펙트럼을 모두 나타내기 때문에 매우 적합한 것으로 보이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 수성 샘플은 샘플을 본원에 기재된 하나 이상의 그래핀 바이오센서와 접촉시키는 동안 및/또는 접촉을 수행하기 전에 열 처리될 수 있다.
특히, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오센서가 없는 샘플은 40℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 0.5 내지 3시간 동안 열처리될 수 있다. 바람직하게는, 샘플 또는 혈청은 50℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서 0.5 내지 2시간 동안 열처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 또는 혈청은 55℃의 온도에서 1시간 동안 열처리될 수 있다.
표적 바이오마커를 검출하는 방법의 일부 실시양태에서, 검출은 본원에 기재된 바와 같은 바이오센서의 존재 하에 시험 용액의 가열에 의해 선행된다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오센서가 존재하는 검정 샘플 또는 혈청은 40℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 0.5 내지 3시간 동안 열처리될 수 있다. 바람직하게는, 검정 샘플 또는 혈청은 바이오센서의 존재 하에 50℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서 0.5 내지 2시간 동안 열처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정 샘플 또는 혈청은 바이오센서의 존재 하에 55℃의 온도에서 1시간 동안 열처리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 열처리는 실시예 21에서 예시된 샘플의 열 처리를 위한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 열처리는 검정 전 또는 검정 동안 또는 둘 모두에 샘플에 적용될 수 있다. 열처리의 영향은 검정 대조군에 영향을 미치지 않으면서 샘플 판독값을 특별히 증가시키는 것이다. 따라서, SN은 증가된 특정 신호 때문에 증가한다. 실온과 75℃ 사이의 온도가 효과적이다. 바람직하게는, 샘플을 65℃에서 5 내지 12분 동안 전처리하거나 인큐베이션 기간 동안 41 또는 45℃에서 검정을 수행할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 가열은 일염기성 염을 포함하는 용액에서 수행되고/되거나 pH = 7.2를 유지하는 완충 용액에서의 인큐베이션된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 인큐베이션은 45℃에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이오센서 및/또는 관련 조합은 개체의 표적 상태와 관련된 표적 바이오마커를 검출하도록 구성될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
예를 들어, 하나 이상의 실시양태에서, 나노센서는 (예를 들어, 패널에서) 2개 이상의 프로테아제의 프로테아제 활성 프로파일링에 기초하여 폐 상태를 신속하게 진단하도록 구성될 수 있다. 컨센서스 서열은 그들 각각의 프로테아제에 의한 단백질분해 절단을 경험하거나 번역후 변형 서열의 화학적 구성이 변경된다. 예를 들어, 아르기나제 I + II는 올리고펩타이드의 단백질분해 절단 없이 아르기닌을 오르니틴으로 전환시킨다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 또한 효소적 번역후 변형의 검출을 위해 WO 2016/149637에 기재된 것과 같은 다른 나노센서와 함께 사용하도록 조정될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 나노바이오센서 및 방법은 표적 바이오마커를 검출하여 폐 질환, 암 및 감염을 포함한 수많은 폐 상태를 진단하는 데 사용될 수 있다.
일 양상에서, 만성 염증성 폐 장애(천식, COPD, 섬유증)에 대한 나노바이오센서는 펩타이드 연결에 대한 상응하는 컨센서스 서열과 함께 표 4에 보고된 프로테아제를 표적으로 한다:
[표 4]
*언급된 경우를 제외하고, 서열은 N-말단 GAG 및 C-말단 AG 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폐고혈압(PAH)에 대한 나노바이오센서는 펩타이드 연결에 대한 상응하는 컨센서스 서열과 함께 표 5에 보고된 프로테아제를 표적화하도록 구성될 수 있다:
[표 5]
*언급된 경우를 제외하고, 서열은 N-말단 GAG 및 C-말단 AG 스페이서를 추가로 포함한다.
PAH는 COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 천식, 만성 기관지염 등과 같은 이차 합병증을 유발할 수 있다. PAH에는 MMP-2, -9, 및 -14(MT1-MMP-1)의 세 가지 MMP의 활성이 강화된다. MMP-2 및 MMP-9는 기저막 관련 콜라겐 IV를 절단할 수 있으며 이는 폐혈관의 리모델링을 촉진한다. MMP-14는 막에 결합되어 있지만, 질환 상태의 액체 생검(혈청, BALF 및 잠재적으로 EBC)에서 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노바이오센서는 펩타이드 연결에 대한 상응하는 컨센서스 서열과 함께 표 6에 보고된 프로테아제를 표적으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염의 검출을 위해 설계될 수 있다.
[표 6]
*언급된 경우를 제외하고, 서열은 N-말단 GAG 및 C-말단 AG 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이오센서는 이러한 조건에서 헤마글루티닌(HA)의 절단 시 인플루엔자 바이러스 감염 H1N1(A/Memphis/14/96), H2N9(A/Mallard/Alberta/205/98), 및 H3N2(A/Texas/6/96)를 촉진하는 TMPRSS2(에피테리아신) 및 인간 기도 트립신 유사 펩티다아제(HAT)와 같은 폐의 다른 프로테아제를 검출하도록 구성할 수 있으며, 바이러스 병원체는 "인플루엔자-사이토카인-프로테아제 주기"에서 프로테아제 발현을 자극할 수 있다. 효소는 자이모겐으로 발현되고 이어서 폐의 프로테아제 네트워크에 의해 활성화된다. 그랜자임은 또한 H1N1을 활성화하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 이 패널에 그랜자임 B를 포함시켰다. 후자의 이점은 EBC에서 검출할 수 있다는 것이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 나노바이오센서는 폐에서 칼리크레인의 활성을 표적으로 하는 바이러스 감염을 검출하도록 구성될 수 있다. 칼리크레인(KLK)은 트립신-유사 또는 키모트립신-유사 특이성을 가진 15개의 밀접하게 관련된 분비된 세린 프로테아제로 이루어진 프로테아제 계열이다. KLK-2, KLK-3, KLK-4, KLK-5, KLK-6, KLK-12 및 KLK-15는 건강한 개체의 폐에서 잘 발현되지 않는다. 이 발현 패턴은 바이러스 감염에 반응하여 변화한다. 인플루엔자 감염의 경우, KLK-1, KLK-2, KLK-5의 발현은 증가하는 반면, KLK-13과 KLK-14의 발현은 감소한다. KLK-13은 거의 모든 코로나바이러스(SARS 및 MERS 유형) 감염에서 증가한다. 펩타이드 연결에 대한 예시적인 칼리크레인 및 관련된 상응하는 예시적인 컨센서스 서열이 표 7에 보고되어 있다.
[표 7]
*언급된 경우를 제외하고, 서열은 N-말단 GAG 및 C-말단 AG 스페이서를 추가로 포함한다.
** 는 N-말단 GAG 스페이서 및 C-말단 GA 스페이서를 포함함
***는 N-말단 GAA 스페이서 및 C-말단 AG 스페이서를 포함함
일부 실시양태에서, 바이오센서는 스트렙토코커스 뉴모코커스(Streptococcus pneumococcus) 감염 표적 박테리아 프로테아제의 검출을 위해 구성될 수 있다: 스트렙토코커스 뉴모코커스에 대한 표적 바이오마커인 예시적인 프로테아제 및 펩타이드 연결에 대한 관련된 상응하는 예시적인 컨센서스 서열이 표 8에 보고되어 있다.
[표 8]
** N-말단 GAG 스페이서 및 C-말단 GA 스페이서를 포함함
에스. 뉴모코커스는 폐에서 가장 흔한 박테리아 감염이며, 스트렙토코커스의 전부는 아니더라도 대다수의 스트렙토코커스는 스트렙토코커스 뉴모니아에 IgA1 프로테아제를 발현하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 따라서, 이 프로테아제는 알려진 가장 활동적인 프로테아제 중 하나이며 스트렙토코커스 감염의 경우에만 존재한다. 이는 세균성 폐 감염에 대한 신속한 검사(10분 미만)를 허용할 것이다.
일 양상에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염 검출을 위한 나노바이오센서는 다음과 같은 프로테아제를 표적으로 한다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 대한 표적 바이오마커인 예시적인 프로테아제 및 펩타이드 연결에 대한 관련된 상응하는 예시적인 컨센서스 서열이 표 9에 보고되어 있다.
[표 9]
** N-말단 GAG 스페이서 및 C-말단 GA 스페이서를 포함함
표적 바이오마커로서 사용될 수 있는 추가의 분비된 마이코박테리움 투베르쿨로시스 프로테아제는 MycP1 및 Rv2869(마이코박테리움 투베르쿨로시스)-유사 펩티다아제(RIP-1)이며, 이들은 둘 모두 MtB에 대해 특이적이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노바이오센서는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 검출을 위해 구성될 수 있다. COPD에 대한 표적 바이오마커인 예시적인 프로테아제 및 펩타이드 연결에 대한 관련된 상응하는 예시적인 컨센서스 서열이 표 10에 보고되어 있다.
[표 10]
*언급된 경우를 제외하고, 서열은 N-말단 GAG 및 C-말단 AG 스페이서를 추가로 포함한다.
****는 N-말단 GAP 스페이서 및 C-말단 AG 스페이서를 포함한다.
*****는 N-말단 GAA 스페이서 및 C-말단 EG 스페이서를 포함한다.
COPD의 추가의 표적 바이오마커는 내인성 세린 프로테아제 억제제가 건강한 인간 대상체에서 세린 프로테아제에 대한 폐 조직 보호에 관여한다는 사실에 기초하여 식별 및 선택될 수 있다. 유전성 억제제 결핍은 COPD 발병의 가장 중요한 원인으로 간주되며, 그 다음으로 흡연이 그 뒤를 잇는다. 효과적인 억제제가 없으면 제어되지 않는 단백질분해와 후속되는 폐 손상이 관찰된다. COPD 검출에 가장 중요한 프로테아제는 호중구 엘라스타제, 호중구 유래 MMP-8, 대식세포 유래 MMP-12, 카텝신 G 및 프로테이나제 3이다. 이러한 프로테아제는 콜라겐, 라미닌, 피브릴린, 엘라스틴과 같은 ECM 구성요소를 손상시킬 수 있다. 특히, 폐 엘라스틴의 절단은 폐기종을 유발하며, 이는 COPD 병태생리학의 동인이다. MMP-7은 세포외 프로테오글리칸 데코린을 분해하여 데코린 결합 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)를 방출한다. 따라서, 모든 6개의 프로테아제(NE, MMP-7, -8, -12, CTSG, 프로테이나제 3)의 공동 활성화는 COPD의 검출을 허용한다.
일부 실시양태에서, 나노바이오센서는 프로테아제 패널을 사용하여 폐암을 검출하고 소세포 폐암(SCLC)과 비소세포 폐암(NSCLC) 표적 사이의 구별화를 위해 구성될 수 있다: SCLC 및 NSCLC에 대한 표적 바이오마커인 예시적인 프로테아제 및 펩타이드 연결에 대한 관련된 상응하는 예시적인 컨센서스 서열이 표 11에 보고되어 있다.
[표 11]
*언급된 경우를 제외하고, 서열은 N-말단 GAG 및 C-말단 AG 스페이서를 추가로 포함한다.
******는 N-말단 GAA 스페이서 및 C-말단 AG 스페이서를 포함한다.
일부 실시양태에서, SCLC 및 NSCLC 대 비암성 건강 상태를 검출하기 위한 프로테아제의 선택을 위한 관련 데이터세트뿐만 아니라 SCLC와 NSCLC 간의 구별은 NCBI GEO 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며(본 개시내용의 제출일에 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ 참조), 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 분석에 포함된 데이터세트는 원발성 종양 샘플과 건강한 인간 조직을 모두 포함하는 데이터 세트를 사용하여 인간 암에서 가져왔다. SCLC 및 NSCLC에 대한 예시적인 계산된 p-값은 아래 표 12에 보고되어 있다.
[표 12] NCBI GEO ID로부터 계산된 p-값
이러한 유전자 발현 데이터에 기초하여, 선택된 효소 패널은 SCLC와 NSCLC를 구별할 수 있어야 한다.
각각의 유형의 암에 대한 치료 접근법이 다르기 때문에, SCLC와 NSCLC를 구별하는 것은 중요하다. NSCLC의 주요 하위 유형은 선암종, 편평 세포암종, 및 대세포 암종이다. 상이한 유형의 폐 세포에서 시작되는 이러한 하위 유형은 치료와 예후(전망)가 종종 유사하기 때문에 NSCLC로 함께 그룹화된다. 모든 폐암 중 더 작은 하위 세트는 SCLC이다. 이 하위 세트는 화학 요법 및 방사선 치료에 더 민감하지만, 전체 사망률은 더 높다.
또한, 췌장암과 유사하게, 비암성에서 암성으로 전환하는 동안 프로테아제 시그니처가 뚜렷하게 변화하기 때문에 액체 생검을 통해 0 기 및 1 기 NSCLC를 검출할 수 있다. 원칙적으로, 동일한 프로테아제/아르기나제 선택으로 SCLC와 건강한 조직을 구분할 수 있다. 유전자 발현 차이에 기초하여, MMP10과 카텝신 H는 SCLC와 NSCLC를 구별하는 데 적합한 프로테아제로 선택될 수 있다.
NCBI GEO, Entrez Gene ID, Unigene ID 및 Gene Symbol과 같은 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하여 췌장암과 같은 다른 고형 종양에서 과발현되는 프로테아제를 결정하기 위해 유사한 유전자 발현 분석이 사용될 수 있다. 이 전략은 인간 게놈으로부터 췌장암에 대한 근접 바이오마커일 가능성이 높은 효소 후보를 선택할 수 있다.
이러한 표적 패널 서열 및 검출 플랫폼은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8,969,027호; 제9,682,155호; 제9,731,034호; 및 제9,216,154호뿐만 아니라 2017년 3월 24일에 출원된 동시 계류 중인 WO 2017/165800(US 2020/0300849)에 기재된 것들을 포함하여, 용액 기반 검정, 미세유체 검정, 마이크로웰 검정, 고처리량 검정 등을 포함하여 본 개시내용의 다수의 센서로 구성될 수 있다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 염증성 생물학적 마커는 특정 바이러스, 박테리아 또는 곰팡이 감염의 검출과 함께 검출될 수 있다. 예를 들어, 나노센서는 캡시드 B(AISGSGGSTYYANSVLG(서열번호: 71))에 대한 펩타이드 앱타머, B형 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) B 검출을 위한 인식 서열, 또는 헤모필루스 인플루엔자에 NT(TNLGILHSMVARAVGNNTQG(서열번호: 72)) 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) (GIITYALSGGEIKILAG(서열번호: 73))에 대한 인식 서열을 사용하여 제조할 수 있다. 유사하게, 바이러스 감염을 위한 나노센서는 HIV 검출을 위한 프로테아제 컨센서스 서열(SAVL-LEAT(서열번호: 74), 또는 SQNY-PIVQ(서열번호: 75))을 사용하여 제조될 수 있다.
상기 기재된 전술한 각각의 센서는, 그래핀 코어 입자가 변형 가능한 인식 서열, 프로테아제 컨센서스 서열, 표적 바이오마커와 상호작용하는 번역후 변형 가능한 서열 nt 결합을 통해 부착되는 대체 구성으로 설계될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 실시양태에서, 검출 가능한 입자는 상대적으로 정지 상태를 유지하고 담체 입자에 부착되지만, 소광제 입자는 상기 기재된 바와 같이 입자 사이의 거리 변화에 영향을 미치기 위해 대신에 절단되거나 검출 가능한 입자 및 담체 입자로부터 멀리 이동된다. 언급된 바와 같이, 그래핀 코어 입자와 검출 가능한 입자 사이의 거리가 증가하면(소광제 입자 테더의 절단 또는 연장으로부터) 나노 센서의 신호에서 검출 가능한 변화를 초래한다.
하나 이상의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 센서는 감염된 하기도 상피 세포 감염과 관련된 마커를 검출하여 하부 호흡기 감염을 진단하는 데 사용될 수 있다. 이러한 마커에는 CCL20, TSLP 및 CCL3-L1이 포함된다. 본원에 언급된 바와 같이, 엑소좀 함량은 엑소좀이 상기도 또는 하기도로부터 유래했는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 나아가 대상체의 신체에서 감염 또는 기타 병태가 유래할 수 있는 위치를 파악하는 데 도움을 줄 수 있다. 센서는 만성 폐 질환을 가진 환자에서 환경 위험 평가를 위해 사용될 수 있다. 대기 오염 물질, 오존, 미립자, 아세트알데하이드, 아크롤레인, 포름알데하이드, 담배 연기 및 기타 화합물에 노출되면 호흡기 염증이 유발된다. 사이토카인, 프로테아제 및/또는 키나아제와 같은 마커를 검출하면 하부 호흡기 염증이 나타나는 단계를 식별하여 개인 맞춤형 환경 평가가 가능하다. 나노센서는 천식 염증의 실시간 관리에서 하부 호흡기 염증 측정에도 사용될 수 있다. 생물학적 마커에 관한 상세한 설명 및 중증 천식과 관련된 단백질 발현 패턴의 이해는, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제8,053,199에 기재되어 있다. 현재 항염증제(코르티코스테로이드, IL-13 항체 등)를 투여하고 증상과 악화에 따라 모니터링한다. 사이토카인, 프로테아제 및/또는 키나아제와 같은 하기도 마커를 시험함으로써 환자와 간병인은 실시간으로 염증을 추적하고 그에 따라 치료를 조정할 수 있다. 유사하게, 나노센서는 중증 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 하기도 리모델링을 측정하는 데 사용될 수 있다. 리모델링은 중증 천식 및 COPD를 가진 환자의 하위 세트에서 폐 기능의 점진적 감소와 관련된 과정인 호흡기의 섬유화 과정을 지칭한다. 현재 이용 가능한 치료법이나 진단법은 없다. 현재 후성유전학적 리모델링을 겨냥한 새로운 치료법이 현재 개발되고 있다. 본 발명자들의 방법은 진행성 기도 리모델링을 나타내는 피브로넥틴, IL6 또는 비멘틴의 존재를 검출하고 측정함으로써 임상용 리모델링 억제제의 개발 및 승인을 가능하게 할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 센서는 기회 감염의 검출과 관련하여 사용될 수 있다. 기회 감염은 또한 암 치료를 받고 있거나, 류마티스 관절염 또는 염증성 장 질환 치료를 통해 면역이 억제된 환자 또는 HIV를 가진 환자에게서 중요한 합병증이다. 주폐포자충 폐렴(PCP)은 HIV 환자에게 가장 흔한 감염으로, 현재 침습성 기관지 내시경 검사로만 진단할 수 있다. 침습성 아스페르길루스증은 백혈병에 대한 화학요법을 받는 환자에서 발생하는 기회 폐 감염이다. 나노센서는 백혈병 치료로 면역이 억제된 환자의 기도에 곰팡이가 침입했을 때 별개의 숙주 반응 단백질의 존재를 나타내는 데 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 센서는 또한 폐 이식에서 이식 거부 또는 숙주 대 이식편 질환을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 폐 이식 환자는 집중적인 면역억제 요법으로 치료를 받으며, 의사는 그들이 장기를 거부할 수 있는 너무 많은 면역억제(기회 감염이 발생) 또는 너무 적은 면역억제 사이의 미세한 경계를 치료한다. 이식 환자가 실시간으로 면역 프로파일을 모니터링할 수 있다면 이것은 이식 관리가 훨씬 쉬워질 것이다. 또한 폐암 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위해 나노센서를 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 모바일 바이오센싱은 기도 또는 혈액에서 순환하는 사이토카인, 프로테아제 및/또는 키나아제(예를 들어, MMP, EMT 등)와 같은 암 신호를 검출할 것이다. 여기에는 유리 단백질과 마이크로입자(엑소좀) 내에 포함된 단백질이 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 센서는 단백질 샘플 수집, 처리, 프로파일링 및 검출과 함께 사용될 수 있으며, 본원에 기재된 실시양태는 또한 단백질 수준 발현의 증가 또는 감소와 연관된 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 감염을 평가하기 위해 전통적인 PCR/RT-PCR, 실시간 정량적 PCR/RT-PCR 및 등온 PCR/RT-PCR 방법론과 함께 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 검정은 독립적인 기술로서 및/또는 전통적인 접근법과 함께, 특히 유전자 검사에 의해 위험에 처한 것으로 미리 확인된 위험 그룹에서 사용할 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 센서에 의해 수행되는 검출은 준비된 샘플을 나노센서(및 일반적으로 복수의 나노센서)와 접촉시켜 반응 혼합물을 생성하는 것을 포함한다. 이어서, 나노센서는 적절한 에너지 공급원을 사용하여 조사하거나 여기될 수 있다. 사용되는 파장은 나노센서에 사용되는 입자에 따라 달라진다. 이어서, 입자의 흡수 및/또는 방출의 변화는 표적 바이오마커가 나노센서와 상호 작용할 때(예를 들어, 인식 서열의 결합 및 연장과 같은) 일정 기간에 걸쳐 검출된다.
본원에 기재된 실시양태는 또한 미세유체 및 스마트 장치 플랫폼과 통합된 나노센서에 의존하며, 이는 단순하지만 강력한 형광 또는 광학 판독기로 판독할 수 있다. "미세유체"는 일반적으로 마이크로리터(10-6)에서 피코리터(10-12)에 이르는 소량의 (유체) 샘플을 조작, 제어 및/또는 분석하는 기술을 지칭한다. 일 양상에서, 미세유체 기술은 신속하고 높은 처리량의 샘플 수집, 샘플 처리, 샘플 프로파일링 및 표적 검출을 도입하기 위해 사용된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 미세유체 장치는 스마트폰 또는 스마트 태블릿과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 모바일 컴퓨팅 장치와 인터페이스할 것이다. 모바일 컴퓨팅 장치는 태블릿, 스마트폰, 휴대용 컴퓨터, 랩탑 등을 포함하며, 샘플을 광학적으로 스캔하고 정보를 다른 컴퓨팅 장치로 전송할 수 있다. 이러한 통합 플랫폼은 지루한 수동 샘플 처리 단계와 함께 여러 기기를 사용하는 현재의 "기존" 프로토콜을 혁신할 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 빠른 분석 시간과 다중화 기능을 갖춘 독립형 배터리 구동 진단 플랫폼은 환자와 의료 전문가가 진단 도구로 사용할 수 있는 휴대용 스마트폰 기반 시스템을 사용하여 최소한의 체액 소비(샘플링당 5 μl 미만)로 측정된 양의 통계적 유의성을 달성할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이오센서로 수행되는 검정은 상기 논의된 다양한 센서들 중 둘 이상의 조합을 이용할 수 있다. 중요하게는, 본 개시내용에 따라 이용되는 나노센서는 생물학적 마커와의 특이적 상호작용을 일으키는 초분자 인식 서열, 프로테아제 컨센서스 서열, 번역후 변형 가능한 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "특이적 상호작용"에 대한 언급은 센서의 인식 서열 간의 상호작용을 분자 간의 비특이적 결합 또는 반응과 구별하기 위한 것으로, 올리고펩타이드 서열이 상호작용할 수 있는 특정 표적 분석물 세트가 제한되고 일부 경우에는 심지어 배타적이어서 결합도 효소 절단도 임의의 다른 분자와 상당한 속도로 일어나지 않는다는 것을 의미한다.
본 개시내용의 방법은 층상 그래핀, 유기 및/또는 무기 분자, 검출 가능한 모이어티, 펩타이드 연결, 검출 가능한 성분, 바이오센서, 본원에 기재된 화학 반응을 수행하기 위한 시약뿐만 아니라 당업자가 식별 가능한 추가 성분의 다양한 조합을 포함하는 상응하는 시스템으로 수행될 수 있다.
예시적인 광학 검출 기법이 설명된다. 그러나, 검정을 분석하는 다른 방법이 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일반적으로, 상기 방법은 반응 용액(예를 들어, 마이크로웰 내)을 적절한 에너지 공급원에 노출시키는 것을 포함한다. 사용되는 파장은 바이오센서에 사용되는 검출 가능한 표지에 따라 달라질 것이다. 이어서, 검출 가능한 모이어티로부터의 신호의 위치/존재 및 농도/강도 모두는 검출 가능한 모이어티의 정량적 및 정성적 평가 모두를 위해 적절한 감지 또는 검출 기기로 감지 또는 검출될 수 있다.
본원에 개시된 시스템은 부품 키트 형태로 제공될 수 있다. 바이오센서를 제조하기 위해 본원에 기재된 방법 중 어느 하나를 수행하기 위한 부품 키트에서, 그래핀 입자는 키트에 단독으로 또는 그래핀 입자의 화학적 변환을 수행하기 위한 시약뿐만 아니라 하나 이상의 완충액의 존재 하에 포함될 수 있다. 바이오마커의 검출을 위한 키트에서, 본원에 기재된 하나 이상의 바이오센서는 키트에 단독으로 또는 하나 이상의 바이오마커의 검출을 수행하기 위한 시약뿐만 아니라 하나 이상의 완충액의 존재 하에 포함될 수 있다. 당업자가 식별할 수 있는 추가 구성요소도 포함될 수 있다.
부품 키트에서, 그래핀 입자, 바이오센서 및 시약은 적합한 비히클 담체 또는 보조제와 함께 조성물에 독립적으로 포함될 수 있는 키트에 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 바이오센서는 하나 이상의 적합한 조성물에 검출을 위한 시약과 함께 하나 이상의 조성물에 포함될 수 있다.
추가 구성요소는 표지, 참조 표준, 및 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 식별 가능한 추가 구성요소를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 실시양태에서, 키트의 구성요소는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 적절한 지침서 및 기타 필요한 시약과 함께 제공될 수 있다. 키트는 일반적으로 별도의 용기에 조성물들을 포함할 것이다. 지침서, 예를 들어, 서면 또는 음성 지침서, 종이 또는 전자 지원, 예컨대 CD-ROM, 플래시 드라이브 또는 검정 수행을 위한 지침서의 pdf 사본을 포함하는 URL(Uniform Resource Locator)이 일반적으로 키트에 포함될 것이다. 키트는 또한 사용되는 특정 방법에 따라, 다른 포장된 시약 및 재료(즉, 세척 완충액 등)를 포함할 수 있다.
조성물의 적합한 보조제의 식별 및 키트의 일반적인 제조 및 포장에 관한 추가 세부사항은 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 확인할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용에 따른 방법을 설명한다. 그러나, 이러한 실시예는 예시를 통해 제공되며, 그 안의 어떠한 것도 개시내용의 전체 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 그래핀 및 금속 광화학적 특성
그래핀은 적어도 98%의 탄소를 함유하며, 물 또는 수성 완충액뿐만 아니라 폭기된 수성 완충액에서 티올 작용기(예를 들어, 단백질 및 글루타치온에 제시됨)와도 최소 반응을 보인다. 이러한 특성은 금속/금속 산화물 재료의 특성과는 반대이다.
자외선(UV), 가시광선 및 근적외선(IR) 영역에서 그래핀 UV/V의 흡수는 흑연의 흡수를 초과한다. [28] 특히 적층 그래핀은 원자외선으로부터 중적외선(100 내지 1500 nm)에 이르는 전체 파장 범위에서 빛을 흡수하는 것이 특징이다. [6]
직접 여기가 심/원자외선에서 발생하지만 가시광선 범위에서 그래핀의 표면 플라즈몬은 매우 강하며 부착된 유기 형광 염료 또는 나노입자를 효과적으로 여기시킬 수 없다. [6]
대조적으로, 많은 나노입자(특히 Au, Ag뿐만 아니라 Fe/Fe3O4의 Fe)는 전자기 스펙트럼의 가시광선 범위에서 강한 플라즈몬을 나타내며, 이는 형광단 여기 및 소광에 모두 기여한다.[29, 30] 그래핀에서 스펙트럼의 가시광선 범위에서 플라즈몬 여기는 근처에 부착된 형광 유기 염료로부터 에너지 전달을 통해 발생할 수 있으며 금속 나노구조 및 양자점으로부터도 예상된다.[31]
그래핀의 광물리적 특성으로 인해 형광단당 FRET 수용체를 설계에 통합할 필요가 없다. 이것은 멀티태스킹을 허용하고 나노바이오센서 표면의 과밀화를 방지하여 나노바이오센서를 동역학적으로 상당히 늦출 것이다.
그래핀의 광물리적 특성으로 인해, FRET 쌍 내에서 그래핀을 사용하는 경우, FRET 수용체(예컨대, 형광단)를 보완하기 위해 FRET 수용체를 설계에 통합할 필요가 없다. 이러한 그래핀의 특성은 사용자가 나노바이오센서의 표면에서의 과밀화를 최소화할 수 있게 하며, 이는 나노바이오센서를 동역학적으로 상당히 늦출 것이며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
상기한 것 이외에도, 폭발 그래핀과 같은 일부 형태의 그래핀과 플래시 그래핀의 일부 분획은 SEM(주사 전자 현미경) 및 광산란과 같은 광산란 방법으로 확인할 수 있는 초-응집체 프랙탈 모폴로지를 갖는다.[18, 19]
7개의 층을 포함하는 프랙탈 그래핀의 예시적인 SEM(주사 전자 현미경) 이미지가 도 1에 보고되어 있다. [8]
도 1의 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 적층된 그래핀 층은 Df = 2.5 ± 0.3(상한)과 Df = 1.8 ± 0.4(하한) 사이의 프랙탈 치수를 특징으로 한다. 일반적으로, 폭발 그래핀의 크기 및 표면 변형에 따라, Df = 2.9 ± 0.09와 Df = 2.1 ± 0.09 사이의 임의의 프랙탈 치수를 얻을 수 있다.
폭발 그래핀의 프랙탈 기하학은 빛이 구조 내에 "갇히기" 때문에 향상된 광 흡수를 유발한다. 평평한 그래핀 시트에서 빛은 그래핀을 한 번만 통과하는 반면, 프랙탈 모폴로지 내에서 빛의 반사 및 회절은 다중 흡수 사건을 유발하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
실시예 2: 게요 바이오센서 및 제조 방법
본원에 기재된 바이오센서의 주요 구성요소의 개략도는 그래핀이 디토네이션 그래핀에 의해 제공되고 코어 입자의 코팅이 중합체 코팅에 의해 제공되는 예시적인 실시양태와 관련된 도 2a에 제공된다.
도 2a에 개략적으로 도시된 예시적인 구성에서, 디토네이션 그래핀 응집체의 나노시트는 중합체 코팅의 단층에 의해 코팅된 코어 입자의 그래핀 성분을 제공하기 위해 사용된다. 컨센서스 서열과 검출 가능한 모이어티를 포함하는 펩타이드 연결에 의해 형성된 검출 성분은 중합체 코팅에 대한 부착을 통해 코어 입자에 추가로 부착된다.
도 2a에 개략적으로 도시된 구조를 갖는 바이오센서는 도 2b에 개략적으로 도시된 예시적인 공정과 함께 제공될 수 있다. 도 2b의 개략도에서, 그래핀 표면은, 예를 들어, 복수의 카복실산기로 기능화되거나 얇은 중합체 단층으로 코팅된다. 도 2b의 예시적인 도면에서, 복수의 검출 가능한 모이어티는 각각의 올리고펩타이드 연결을 통해 동일한 담체 입자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 도 2b에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 2개 이상의 상이한 검출 가능한 모이어티는 각각의 표적 바이오마커에 대한 특이성을 갖는 각각의 올리고펩타이드 연결을 통해 동일한 담체 입자에 부착될 수 있다.
특히, 도 2b의 개략도는 새로운 바이오센서의 설계를 나타낸다: A: 카복시그래핀의 합성; B: 아미드 결합을 통한 폴리에틸렌 이민의 화학적 부착; C: 컨센서스 서열(올리고펩타이드)과 형광 염료의 부착(TCPP). TCPP는 수지 위에 있는 동안 올리고펩타이드의 N-말단 단부에 부착된다. 수지로부터 절단하고 HPLC 정제(필요한 경우)한 후, 컨센서스 서열 + TCPP는 C-말단 단부를 통해 폴리에틸렌 이민에 부착된다. 동역학적 이유로 인해, 컨센서스 서열 + TCPP는 올리고펩타이드의 C-말단 단부를 통해 부착된다. 올바른 프로테아제가 존재하면, 컨센서스 서열은 단백질 분해로 절단되고 형광 염료 TCPP + 공유결합으로 부착된 컨센서스 서열의 절반이 방출된다(라이트 스위치 효과(light switch effect)).
중첩된 가장자리가 서로 얽힌 그래핀의 얇은 단일층, 또는 2 내지 3개의 층을 포함하거나 이로 이루어진 나노시트의 보다 정렬된 적층의 추가 개략도가 도 2c에 보고되어 있다.
그래핀 나노시트 미립자의 표면에 걸쳐 첨가된 고밀도 카복실산기의 개략도가 도 2d에 보고되어 있다.
그래핀의 카복실화 공정 및 PEI 중합체 코팅을 통한 검출 가능한 성분의 부착에 관한 추가 세부사항은 실시예 3 내지 실시예 9에 보고되어 있다.
실시예 3: 카복시그래핀의 합성 - 일반적인 공정
본원에서 "카복시그래핀"으로 지칭되는 그래핀 유도체를 합성하기 위해, 디토네이션 그래핀(0.2-0.5) 나노미립자(나노시트 미립자)를 실온에서 무수 디메틸포름아미드(DMF)에 분산시킨다.
분산이 완료된 후, 1차 또는 2차 할로겐을 갖는 카복실산을 첨가한 다음, 무수 아지드화나트륨(NaN3)을 첨가한다. 이어서, 온도를 천천히(1℃/분) 80℃까지 증가시킨다. 20℃와 40℃ 사이에서 친핵성 치환 반응(SN)이 일어나 유기 아지드와 DMF-용해성 할로겐화나트륨이 형성된다. 유기 아지드는 50℃ 초과의 온도에서 이질소(N2)를 방출하고 니트렌 중간체를 형성한다. 니트렌은 질소 바깥쪽 쉘에 8개의 전자가 아닌 6개의 전자를 가지고 있다. 이 반응성 중간체는 그래핀 표면에서 Π-Π 이중 결합과 고리화첨가를 거쳐 안정한 아지란 앵커를 형성한다.
아지란-고리화첨가는 그래핀의 광학적 및 전기적 특성을 손상시키지 않으면서 그래핀 표면에 맞춤형 양의 카복실산을 첨가하는 기회를 제공한다.
예시적인 반응식 및 프로토콜이 실시예 4에 개략되어 있다.
실시예 4: 그래핀 유도체화(카복시그래핀 (CG))
원팟 반응(one-pot reaction)에서 디토네이션 그래핀으로부터 카복시그래핀을 합성하기 위한 예시적인 반응식을 도 3a에 나타낸다.
이 프로토콜은 98.9% C, 0.08% H, 및 1.02% O의 기본 조성을 갖는 디토네이션 합성된 그래핀(0.40) 나노시트 미립자로 시작한다. 이어서, 이 물질을 브로모발레르산 및 아지드화타트륨과 반응시켜 다음과 같이 카복시그래핀(CG)을 생성한다.
1.0 g의 그래핀 나노시트(GN) 미립자를 250 mL 3구 환저 플라스크에서 20℃에서 20 mL DMF에 현탁시켰다. 다음으로, 40℃에서 0.50 g의 5-브로모발레르산(0.0028 mol)과 0.18 g의 NaN3 결정을 GN 현탁액에 첨가하였다. NaN3이 용해된 후, 현탁액을 천천히 80℃(약 1℃/분)까지 가열하고 1시간 동안 교반하였다. N2의 방출이 관찰되었다. 마지막으로, 1시간 후, 현탁액을 실온으로 냉각시키고, 유도체화된 GN을 원심분리(7,000 rpm에서 5분)를 통해 수집하고 DMF로 5회 세척한 다음, 무수 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 생성된 CG는 특성분석을 위해 50℃에서 1시간 동안 건조시킨 다음, 아르곤 하에 보관하였다. 수율: 82%(중량 기준, 총 반응 가정). 카복시그래핀의 원소 분석은 94.22% C, 1.79% H, 1.17% N 및 2.82% O이다. N의 혼입은 첨가 반응이 성공적이었음 나타낸다.
단일 그래핀 나노시트만 나타낸 카복시그래핀의 개략적 구조는 도 3b에 보고되어 있는 반면, 표면에 걸쳐 카복실산기의 고밀도 분포를 나타내는 카복시그래핀 상부층의 측면도는 도 3c에 보고되어 있다.
도 3d에 나타낸 바와 같이, 시차 열중량측정법(DTA)은 100℃ 초과로 가열될 때 4.5 ± 0.5 중량%의 중량 손실을 나타낸다. 100℃ 초과의 온도에서는 그래핀으로부터 예상할 수 있는 것처럼 재료는 사실상 안정적이다. 초기 중량 감소는 카복시그래핀의 바깥쪽 쉘에 부착된 발레르산 단위의 부분적인 손실로 인해 발생한다.
실시예 5: 카복시그래핀(CG)의 적정
100 mg의 카복시그래핀(CG)을 20 mL의 0.100 M NaOH에 현탁시켰다. 현탁액을 300 K에서 5분 동안 교반한 후, 0.100 M HCl 용액을 증분 단계로 첨가하였다. 각 단계에서는 다음 양의 HCl을 첨가하기 전에 평형에 도달했는지 확인한 후(1-5분) pH 측정기를 사용하여 용액의 pH를 기록하였다. 카복시그래핀을 첨가하지 않고 동일한 부피의 NaOH를 사용하여 동일한 절차를 사용하였다.
~7.00의 동일한 pH 값에 대한 2개의 적정 곡선에서 HCl 부피의 차이는 도 4에 나타낸 바와 같이 카복시그래핀의 중량 증분당 이온화된 기(카복실기)의 농도를 제공한다. 이 적정 곡선은 6.1*10-4 몰/g의 산성 기(-COOH)가 있음을 나타낸다(즉, nm2당 4개의 -COOH 기의 표면 밀도). 이는 펜톤 산화 그래핀 산화물의 표면 밀도가 1.7*10-4 몰/g(즉, nm2당 1개의 -COOH 기의 표면 밀도)인 것과 비교하면, 4배 더 높다. 카복시그래핀 표면의 -COOH 기 밀도는 합성된 카복시그래핀에서 -COOH 기당 평균 공간 0.27 nm2에 해당한다. 이것은 표면 -COOH 기를 가진 매우 높은 표지화 밀도에 해당하며, 이러한 카복시그래핀 나노시트 미립자의 훨씬 더 높은 수분산성에 기여한다.
카복시그래핀의 합성은 펜톤 산화 그래핀 산화물과 비교하여 더욱 단순화되고, 반응 시간이 더 빠르다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, 상기 공정에는 본원에 기재된 바이오센서에서 부착된 형광단의 광물리적 특성을 다소 방해할 수 있는 철 염의 첨가를 포함하지 않는다.
실시예 6: 카복시그래핀-폴리에틸렌이민(G-PEI)
폴리에틸렌이민을 카복시그래핀에 테더링하여 폴리에틸렌이민 유도체화 카복시그래핀을 생성하기 위한 예시적인 합성 절차가 아래에 설명되어 있다.
상기 합성한 100 mg의 카복시그래핀을 실온에서 50 mL 환저 플라스크에서 20 mL 무수 DMF에 현탁시켰다. 다음으로, 50 mg의 폴리에틸렌이민, 분지형, 분자량 10,000(PEI), 25 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC), 및 25 mg의 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 카복시그래핀 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후, 카복시그래핀-폴리에틸렌이민(G-PEI)을 원심분리(7000 rpm에서 5분)를 통해 수집하고 DMF로 2회, 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 재료는 각 세척 단계 후 원심분리를 통해 수집하였다. 수율: 65%(중량 기준, 총 반응 가정).
생성된 카복시그래핀-폴리에틸렌이민의 구조의 개략도를 도 5a에 나타내며, 참고용으로 단일 시트만 나타내었다. 생성된 카복시그래핀-PEI의 원소 분석은 다음과 같다: 82.58% C, 4.65% H, 10.65% N 및 2.12% O. N 함량이 크게 증가한 것은 PEI의 첨가 반응이 성공적이었음을 나타낸다. N-함량에 기초하여 본 발명자들은 생성된 카복시그래핀-PEI가 27±2% PEI를 함유하는 것으로 추정한다.
도 5b에 나타낸 시차 열중량측정법 분석(DTA)은 150℃에서 시작하여 전체 온도 범위에 걸쳐 4.5 ± 0.5 중량%의 중량 손실을 나타낸다. 이러한 거동은 카복시그래핀과는 분명히 다르며 폴리에틸렌이민의 연결에 의한 그래핀 나노시트의 안정화와 일치한다.
실시예 7: PEI 코팅된 폭발 그래핀 기반 바이오센서의 합성
테트라(4-카복시페닐)포르피린(TCPP)과 MMP-1에 대한 펩타이드 절단 서열(GAGVPMS-MRGGAG)에 의해 형성된 검출 가능한 성분을 다음 프로토콜에 따라 PEI 코팅된 그래핀 기반 바이오센서에 부착하였다.
상기 합성한 50 mg의 카복시그래핀-PEI를 작은 유리 바이알에서 ~8.1 mL DMF에 현탁시켰다. 다음으로, 5 mg DMAP 및 5 mg EDC를 MMP-1에 대한 펩타이드 절단 서열(GAGVPMS-MRGGAG)과 미리 접합된 ~3.5 mg의 TCPP와 함께 바이알에 첨가하였다. 샘플을 5분 동안 초음파처리하여 모든 것이 DMF에 현탁되도록 하였다. 이어서, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다.
바이오센서를 원심분리(7000 rpm에서 5분)를 통해 수집하고 DMF로 세척한 다음, 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 도 6a는 카복시그래핀-폴리에틸렌이민 기반 바이오센서의 구조를 나타내며, 참고용으로 단일 시트만 나타내었다.
합성된 물질을 분광법을 통해 분석하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 카복시그래핀, 카복시그래핀-PEI 및 MMP-1에 대한 카복시그래핀-바이오센서의 UV/Vis 스펙트럼을 물에서 분석하였다. TCPP 검출 가능한 표지의 Soret 밴드는 ~420 nm에서 명백히 식별할 수 있다. TCPP는 MMP-1에 대한 컨센서스 서열을 포함하는 펩타이드를 통해 폴리에틸렌이민 층에 테더링되어 있다. 135,000 M-1 cm-1의 예상 흡수 계수를 기준으로 TCPP 농도는 카복시그래핀 그램당 1.63 x 10-5 몰이다.
BODIPY FL, BODIPY TR, BODIPY 530550, 및 BODIPY 630650을 포함하여 여기 스펙트럼과 흡수 스펙트럼 사이에 중첩이 없거나 최소한만 중첩되는 BODIPY 염료를 나타내는 상기 개략적으로 나타낸 공정에 추가될 수 있는 추가의 예시적인 검출 가능한 모이어티가 도 6c에 보고되어 있다.
실시예 8: 그래핀 표면의 추가 기능화
이전 실시예에서, 그래핀 표면의 기능화는 카복실산기를 그래핀의 표면에 테더링하기 위해 수행되었다. 폴리에틸렌이민(또는 주로 다른 중합체)은 안정적인 아미드 결합을 통해 카복실산 작용기에 결합되었다.
추가 작용기는, 예를 들어, 카복실기의 변형을 통해 그래핀의 표면에 제공될 수 있다. 당업자는 중합체 또는 단량체를 그래핀 표면에 테더링하는데 적용 가능한 카복실산 반응을 위한 유기 화학[32]의 전체 도구 상자를 사용하여 이러한 기능화를 수행할 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 예시적인 반응을 참조한다:
- 카복실산을 알코올로 전환하고 안정한 에테르 형성
- 카복실산을 에스테르로 전환
- 카복실산을 알데히드로 전환한 다음, 이중 결합으로 전환(위티그형(Wittig-type) 반응)
- 카복실산을 효과적인 이탈기를 갖는 탄소 중심으로 전환시킨 후 핵 치환 반응.
유기 또는 무기 화합물 상의 상응하는 작용기에 결합하도록 구성된 작용기를 제공하기 위해 또는 펩타이드 연결 상에 직접적으로 작용기를 제공하기 위해 사전 기능화가 있거나 없는 그래핀에 추가 반응이 사용될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 이러한 반응은 다음을 포함한다:
- 클릭 반응[33, 34](특히 디엘스-앨더 반응(Diels-Alder reaction)[35, 36]). 이들은 그래핀 표면에서 직접 수행하거나 펩타이드 서열과 표면에 이미 연결된 테더를 연결하기 위해 수행할 수 있다.
- 그래핀 표면에 라디칼(예를 들어, 탄소, 질소, 산소, 및 황 중심) 추가[37, 38]
- 그래핀 표면에 친전자체(예를 들어, 탄소, 질소, 산소, 및 황 중심) 추가[38]
카복시그래핀의 적정 실험 및 분자 모델링에 따라 카복시그래핀을 제공하기 위해 기능화가 수행되는 실시양태에서, 그래핀 표면에 부착된 선형 분자의 가능한 가장 높은 패킹 밀도는 6.0 ± 0.5 x 10-4 몰/g이다. 수분산성이 여전히 관찰될 수 있는 하한은 2.40 ± 0.05 x 10-5 몰/g이다.
상이한 기능화에 대해 추가적인 최대 및 최소 패킹 밀도가 확인될 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다. 치환되지 않은 (순수) 그래핀의 표면 영역을 특징으로 하는 비대칭 나노바이오센서를 합성하는 경우, 이 영역은 그래핀 표면에서 이전에 절단된 형광 염료의 흡착 및 소광으로 인한 입자의 형광 판독값과의 간섭을 최소화하기 위해 상대적으로 10퍼센트보다 크지 않아야 한다.
실시예 9: 카복실화된 그래핀에 대한 펩타이드의 직접 및 간접 부착
검출 가능한 성분을 위한 대체 부착 공정에서, 폴리에틸렌이민 또는 다른 수용성 중합체를 이용하는 대신에, 형광 염료에 연결된 펩타이드 서열은 또한 카복시그래핀의 카복실기에 직접 연결될 수 있다.
일부 경우에, 그래핀 표면에 직접 부착하는 것 이외에 또는 그 대신에, 펩타이드 연결은 카복시에 결합하기 위한 아민기를 제공하는 스페이서 또는 커넥터를 통해 간접적으로 부착될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 도 7의 개략도에 나타낸 바와 같이, 라이신, 오르니틴 또는 스페이서와 접근 가능한 추가 1차 아민을 특징으로 하는 모든 비천연 아미노산을 활용하여 부착을 용이하게 할 수 있다.
스페이서는 입자와 검출 가능한 모이어티 사이의 원하는 거리를 얻기 위해 입자 치수를 제어하면서 원하는 펩타이드 연결과 함께 당업자에 의해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바이오센서의 중심 그래핀 기반 나노구조와 검출 가능한 구성요소(예를 들어, 형광단이 부착된 컨센서스 서열) 사이의 특별한 부류의 "커넥터"는 초분자 시스템이다. 수많은 초분자 호스트-게스트 시스템이 문헌에 발표되어 있다. [39] [40] 다음과 같은 호스트-게스트 시스템이 주목할 만하다:
a) 비오틴/스트렙타비딘 [41]
b) 사이클로덱스트린 및 다양한 숙주 [42]
c) 스토다트-사이클로판(Stoddart-cyclophane) 및 친수성 숙주 [43]
d) 쿠커비투릴(Cucurbituril) 및 맞춤형 숙주 [44]
e) (구조적으로 변형된) DNA 어셈블리 [45]
f) 핵산/펩타이드 하이브리드 [46]
g) 디자이너 펩타이드의 초분자 결합 [47]
실시예 10: 그래핀 표면의 화학적 아미노화 및 펩타이드 연결의 부착
그래핀 표면의 화학적 아미노화를 위한 방향족 치환된 니트렌 반응과 같은 그래핀 표면의 예시적인 추가 화학적 아미노화[20]는 도 8에 개략적으로 설명되어 있다.
예시적인 프로토콜에 따라, 1.0 g의 그래핀 나노시트(GN) 미립자를 250 mL 3구 환저 플라스크에서 20℃에서 20 mL DMF에 현탁시켰다. 다음으로, 40℃에서 0.50 g의 1-아미노-4-브로모 부탄(0.0033 mol)과 0.20 g의 NaN3 결정을 GN 현탁액에 첨가하였다. NaN3이 용해된 후, 현탁액을 천천히 80℃(약 1℃/분)까지 가열하고 1시간 동안 교반하였다. N2의 방출이 관찰되었다. 마지막으로, 1시간 후, 현탁액을 실온으로 냉각시키고, 유도체화된 GN을 원심분리(7,000 rpm에서 5분)를 통해 수집하고 DMF로 5회 세척한 다음, 무수 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 생성된 그래핀아민(GA)을 50℃에서 1시간 동안 특성분석을 위해 건조시킨 다음, 아르곤 하에 보관하였다. 수율: 80%(중량 기준, 총 반응 가정). 카복시그래핀의 원소 분석은 다음과 같다: 95.48% C, 1.86% H, 2.38% N, 0.28% O. N의 혼입은 첨가 반응이 성공적이었음을 나타낸다.
검출 가능한 성분 TCPP-GAG RPFS-MIMG를 첨가하기 위해, 1.00 g의 GA를 교반 막대를 사용하여 플라스크에서 30 mL DMF에 분산시켰다. 0.54 g EDC 및 0.53 g DMAP를 첨가하고 실온에서 용해될 때까지 교반하였다. 0.20 g TCPP-GAG RPFS-MIMG AEG를 첨가하고 반응물을 21시간 동안 교반하였다. CGP 입자를 상기와 같이 원심분리를 사용하여 DMF로 4회 세척하고 에틸-에테르로 3회 세척하였다. MMP 3-TCPP 표지된 입자에 대한 GA-컨센서스 서열을 아르곤으로 플러싱하고 느슨하게 덮은 상태에서 실온에서 48시간 동안 유지하여 건조시켰다. 이 반응은 본 발명의 의미에서 펩타이드 연결(컨센서스 서열, 번역후 변형 및 초분자 결합)이 되도록 설계되고 구성된 모든 펩타이드로 수행될 수 있다.
실시예 11: 그래핀-내장 카보양이온과 PEI의 2차 아민기의 반응
PEI의 추가 부착 반응은 폭발 그래핀에서 카보양이온과 2차 아민기의 결합을 통해 수행될 수 있다.
폭발 그래핀 0.3에서는 수많은 "구멍"(카보양이온)이 구조에 내장되어 있어 +60 mV의 제타 전위를 유발한다. [8] 표면 근처의 구멍은 상기 나타낸 바와 같이 폴리에틸렌 이민과 반응할 수 있다. 폭발 그래핀과 거의 모든(중합체, 단량체 및 소분자) 알코올, 티올, 아민, 포스핀 및 - 잠재적으로 - 카복실산 사이에서 친핵성 첨가 반응이 발생할 수 있다는 것은 주목할 만하다.
종래의 소수층 그래핀에서는 하이드록실기 및 옥시렌 작용기가 PEI와 반응할 수 있다. 하이드록실기는 제거 후 카보양이온을 형성한 다음, 도 9의 반응식에 따라 반응한다. 옥시렌(산소-함유 3원 고리)은 친핵성 첨가 하에 아민과 반응한다. 이러한 반응은 PEI를 그래핀 층에 공유결합으로 부착될 것이다. 그래핀에 결함(카보양이온)이 존재하는 경우에 PEI를 그래핀에 직접 부착하는 또 다른 가능성이 존재한다. 이것은 PEI의 그래핀 표면으로의 직접 친핵성 부착을 허용한다.
실시예 12: 그래핀 표면에서의 정전기적 인력
폭발 그래핀의 강력한 양전하를 이용하여 설폰산, 아미노설폰산 및 유기 황산염을 특징으로 하는 음이온성 중합체를 그래핀 표면에 흡착시킬 수 있다. 원동력은 정전기 인력이다. 블록 공중합체를 사용하는 경우, 폴리스티렌, 폴리이소부틸렌, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등과 같은 소수성 중합체가 블록 공중합체의 구성요소가 될 수 있음을 주목한다. 이들은 순수 그래핀 표면에 흡착되는 반면, 친수성 성분은 수분 분산성을 매개할 것이다. 폭발 그래핀의 표면 전하가 양수(제타 전위 = + 60 mV)라는 것에 주목한다. [8] 이는 폴리스티렌-설폰산과 같은 음으로 하전된 중합체가 폴리스티렌 등의 블록 공중합체에 사용될 때 소수성과 전하 인력의 조합을 허용한다.
실시예 13: 그래핀의 "클릭 화학"
본원에 기재된 코어 입자의 그래핀 나노시트 표면에 분자의 부착을 가능하게 하는 추가 반응은 클릭 화학에 의해 수행될 수 있다.
"클릭 화학"은 폭발 (및 소수층) 그래핀의 표면에서 수행될 수 있다. 전형적인 반응은 구리 촉매를 필요로 하지 않기 때문에 디엘스-앨더 반응이다. 도 10은 말레이미드-유도체와 그래핀 사이의 디엘스-앨더 반응의 도식을 도시한다. 그러나, 원칙적으로 티올을 표면에 첨가하는 방법뿐만 아니라 라디칼(예를 들어, 탄소, 질소, 산소, 및 황 중심)을 그래핀 표면에 첨가하는 방법 [37, 38], 친전자체(예를 들어, 탄소, 질소, 산소, 및 황 중심)를 그래핀 표면에 첨가하는 방법 [38] 및 당업자가 확인할 수 있는 기타 방법(실시예 8 또한 참조)을 포함한 모든 클릭 반응은, 예를 들어, 문헌[Li et al. 2016 -[48], Namvari et al. 2014 [49] 및 Farivar et al 2021 [50]]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
실시예 14: 바이오센서 및 관련 기능 원리의 용도
관련 용도에 대해 본원에 기재된 바이오센서의 기능적 원리는 도 11에 개략적으로 도시되어 있다.
도 11의 개략도에서는, 표적 바이오마커를 포함하는 생물학적 샘플과의 상호작용 시, 펩타이드 연결이 변경되어(예를 들어, 절단되거나 연장됨) 센서에 사용되는 검출 가능한 모이어티의 검출 가능한 신호의 특징적인 변화, 예를 들어, 형광 스펙트럼의 변화를 초래하는 것을 보여준다. 형광의 관찰 가능한 변화(검출 가능한 모이어티에 따라 증가, 감소, 이동 등)는 바이오마커의 존재 및/또는 활성의 함수이다.
도 11에 개략적으로 나타낸 예시적인 실시양태에서, 컨센서스 서열(올리고펩타이드)의 단백질 분해 절단 시, 부착된 형광단이 방출되어 바이오 센서의 그래핀 코어에 의한 소광을 피한다. 프로테아제 활성의 함수인 형광 증가와 강도가 관찰된다. 입자 기반 바이오센서 대신에, 그래핀을 먼저 고체 지지체(예를 들어, 평면 기재)에 고정하고 그 위에 다른 요소, 예를 들어, 펩타이드 연결, 그리고 검출 가능한 모이어티를 부착하여 평면 센서, 예를 들어, 측면 유동형 센서 또는 고정식 마이크로웰 센서를 생성한다는 점을 제외하고는, 유사한 구성 요소를 사용하여 바이오센서를 구성할 수 있다. 그렇지 않으면 센서는 샘플이 고체 지지체에 추가되고, 샘플에서 표적 바이오마커에 의한 결합 또는 절단이 고체 지지체에 대한 검정에서 검출 가능한 변화를 생성하는 경우와 동일하게 작동할 것이며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
실시예 15: 다중 바이오센서
고전적인 바이오센서 설계는 입자당 하나의 프로테아제-절단 가능한 형광 염료 또는 양자점만을 사용하도록 허용하는 반면, 그래핀 및 유도체의 광범위한 UV/Vis 흡수 스펙트럼은 상이한 프로테아제에 대한 여러 바이오센서의 부착을 허용한다.
도 12는 매트릭스-메탈로프로테이나제-1에 대한 디토네이션-그래핀 기반 바이오센서의 작동 예를 나타낸다. 프로테아제 활성에 대한 그래핀 기반 바이오센서의 작동 원리를 여기에 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 프로테아제(시험된 샘플에 존재하는 경우)는 컨센서스(절단) 서열을 절단하고 형광단을 방출한다. 후자는 그래핀의 소광을 피하여 형광이 측정 가능하게 증가한다("형광단 켜짐"). MMP1에 대한 프로토타입 바이오센서는 효소 농도가 증가하는 샘플에서 시험되었다.
도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, 검출된 신호의 강도는 효소의 농도에 비례하는 것을 알 수 있다. 최적이 아닌 실험 설계 하에서도 이 프로토타입 바이오센서의 예상 검출 한계(LOD)는 여전히 펨토몰 프로테아제 활성이 검출될 수 있음을 보여준다. TCPP가 결합되면 강력한 카복시그래핀 소광으로 인해 형광이 거의 나타나지 않는다. 이어서, 60분 동안 방출되면 그 형광을 검출 가능하다.
실시예 16: 완충 및 표준 반응
프로테아제 효소는 생리학적 조건에서 작용하는 단백질 분해 효소이다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 계열은 복합 2가 양이온을 포함하는 반면, 카텝신 프로테아제는 주로 산성 리소좀 환경에서 활성화된다. 원래 설계된 Fe-NBS 프로토콜의 작동은 10 μM의 2가 양이온이 포함된 25 μM HEPES 완충액에서 준비되었다.
이 시스템은 2가 양이온 요구를 지원하면서 프로테아제 활성을 지원하는 등장성 조건을 포함함으로써 개선된 pH 제어를 통해 보다 강력한 신호를 달성하도록 변경되었다. 또한, 향후 다중화를 허용하기 위해 한 번에 여러 개의 상이한 gNBS 센서와 호환되는 완충액을 구축하는 것이 가능하다는 것을 입증하고자 했다.
이를 위해, 일련의 완충액이 설계되었는데, 이 완충액은 모두 최종 농도 10 μM의 MgCl2, CaCl2 및 ZnCl2를 포함하였다. HEPES 완충액뿐만 아니라 MES, TRIS 및 인산염 완충 식염수도 평가되었다(도 14의 표).
uPA gNBS 및 CTSD gNBS 용액을 물에 300 μg/ml의 10배 작업 농도로 제조하였다. 이들을 초음파처리 워터 배스에서 10분 동안 초음파처리하였다. 도 14에 보고된 각각의 상이한 완충액 배합물에서 gNBS를 1:10으로 희석하였다.
125 μl gNBS 용액을 검정색 96 웰 플레이트에 복제하여 분배하였다. 5 μL 혈청을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 방출된 형광은 421 nm 여기 및 650 nm 방출로 VarioSkan Lux 플레이트 판독기에서 판독되었다. 검정에는 혈청 대신 5 μl의 적절한 완충액이 첨가된 검정 대조군이 포함되었다. gNBS는 두 가지 상이한 정상의 건강한 공여자 혈청 샘플 또는 풀링된 정상 혈청(PNS)과 함께 인큐베이션하였다. 완충액 1은 원래 배합물이었다. 모든 완충 조건에서 프로테아제 활성이 관찰되었다. 결과는 도 15 패널 A(CTDS gNBS) 및 도 15 패널 B(uPA gNBSS)에 보고된다.
PBS 및 MES 완충 배합물에서 훨씬 더 안정적인 pH가 관찰되었으며, pH는 수일 동안 안정적으로 유지되었다. DMSO만이 자극 조건에서 관찰된 RFU를 크게 증가시켰다. 그러나, 주목할만한 것은 NaCl이 포함된 완충액이 배경 및 혈청 신호를 모두 상당히 낮췄다는 것이다. AC를 감소시키면 gNBS의 신호 대 잡음 성능을 높이는 역할을 한다. NaCl을 함유하는 완충액 2, 3, 6, 8 및 9는 모두 원래 완충액에 비해 AC 성능이 상당히 감소하였다.
완충액 9는 신호 대 잡음 성능이 가장 우수한 완충액으로 선택되었다. 이러한 성능은 생리학적 이온 농도의 영향이 제타 전위를 안정화시키고 펩타이드-TCPP 작제물(peptide-TCPP construct)의 자연스러운 입체형태를 가능하게 한다는 결론을 뒷받침하였다. 따라서, 입자 용액의 안정성에 기여하는 제타 전위 안정화는 최적의 효소 조건도 뒷받침한다. NaCl이 제타 전위에 미치는 영향은 도 16에서 관찰할 수 있다. 이러한 관찰을 확인하기 위해 완충액 1, 2 및 9를 사용하여 추가 gNBS에 대해 실험을 반복하였다. uPA, CTSD, MMP10, CTSH에 대한 gNBS 평가는 등장성 염 농도가 포함된 완충액에서 AC 신호가 감소하고 신호 대비 잡음이 가장 높았으며 완충액 9가 완충액 2보다 우수한 성능을 보였다((도 17).
이러한 실험은 본 개시내용의 바이오센서의 특징 이외에, 프로테아제 활성을 검출하는 데 사용되는 gNBS의 효율적인 기능에 대한 이온의 역할을 입증하였다.
특히, 본 개시내용의 센서의 기능은 동일한 사양으로 반복적으로 구축되어 정상 혈청 샘플에서 활성화된 프로테아제 또는 기타 적합한 바이오마커를 측정할 수 있도록 하여, 다양한 배치 및 로트의 센서가 동일한 신호를 생성하도록 제조될 수 있도록 하는 능력에 의존한다.
또한, 완충액 및 제조 조건을 선택하여 최적의 신호 대 잡음 비율을 생성할 수 있다. 이 실험에서, 일염기성 염 이온의 포함은 감소된 완충액 전용 신호에 의해 반영된 잡음의 상당한 감소에 기여하는 것으로 관찰된다(AC 값 도 15 및 도 17 참조).
또한 일염기성 염 이온의 영향은 pH 5.0 내지 pH 8.0의 pH 범위에 걸쳐 입자의 제타 전위를 안정화시키는 것으로 나타났다. 이 범위는 리소좀 또는 기타 산성 환경에서 일반적으로 발현되는 특정 프로테아제 계열 구성원에 대한 자연 작업 환경을 반영한다. 프로테아제 활성은 pH 2.0 내지 pH 10.0의 자연 생물학적 환경을 반영하는 다양한 pH 조건에서 발생할 수 있다. pH 요건에 따라, MES 완충액은 PIPES, MOPS, HEPES, TRIS, 인산염 완충액, 비키니(Bikini), CHES 또는 굿 리스트(Good's list)에서 흔히 볼 수 있는 기타 완충액과 같은 pH 목표에 pKa가 더 적합한 완충액으로 대체할 수 있다.
상기 관찰은 염을 포함하면 센서의 AC 활성이 감소한다는 결론을 뒷받침하였다. 유효 염 농도는 동일한 완충액에서 동일한 센서와 비교하여 1.0 미만의 비율로 관찰될 수 있지만 어떠한 일염기성 염 이온도 없었다(도 18에 나타냄). 15.5 mM과 155 mM 사이의 일염기성 염 이온은 염/무염 조건의 AC 비율을 감소시킨다. 고장식(hypertonic) 염 조건도 마찬가지로 AC를 감소시켜 신호 대 잡음 성능을 증가시킬 수 있다. 높은 염 환경을 반영하는 생리적 조건의 염 농도는 600 mM까지 또는 1 M까지 높을 수 있다.
실시예 17: 초음파처리 단계로 제조된 바이오센서의 제조 및 성능
정의된 비율의 산소의 존재 하에 탄화수소 기재의 기상 디토네이션을 사용하는 디토네이션 반응에서 소수층의 그래핀이 생성될 수 있다. 생성된 그래핀은 0.3의 몰 산소 비율로 폭발할 때 평균적으로 50 nm와 500 nm 사이의 크기의 분지형 프랙탈 응집체로 구성된다.
생성된 입자의 전자 현미경은 도 19a의 예시적인 사진에 의해 도시된 바와 같이 사슬, 시트, 응집체 및 개별 소판으로 다양하게 구성된 그래핀 응집체를 나타낸다.
크기와 형상의 스펙트럼은 gNBS에서 수행된 투과 전자 현미경 분석으로부터 명백하다(도 19b). 도 19b에서 이미지화된 입자는 2020년 12월 30일의 KSU 공개(로트 120120)에 설명된 대로 제조하였다. 이들은 매우 다양한 크기의 불규칙한 형상의 입자를 보여주며, 고배율에서 층의 수는 예상되는 5-25개 층의 그래핀을 반영한다.
프랙탈로서, 개별 입자에 대해 규정된 크기나 형상은 없다. 이들은 디토네이션 과정에서 형성되는 응집체로 구성되어 스펙트럼 내에서 크기와 형상이 무작위이다.
폭발 그래핀의 예시적인 SEM(주사 전자 현미경)을 도 1에 나타낸다. [8] 검정을 위해 gNBS 용액을 제조하기 위해, gNBS가 덩어리가 되어 정의된 질량 농도로 완충액에 재현탁된다. 이어서, 이 용액을 초음파처리 워터 배스에서 분산시킨다. 워터 배스에서의 시간은 최초 개시내용에는 정의되어 있지 않으며 입자의 다양한 수준의 파괴를 초래할 가능성이 있다. 이 차이의 영향은 도 20에서 볼 수 있다. gNBS의 작업 용액이 생성되는 경우, KSU 로트 120120 제제는 일부 입자가 용액 밖으로 침전되는 결과를 초래한다. 이는 초기 제조 공정 동안 그래핀이 효율적으로 분산되지 않아 최종 제품이 불안정해지기 때문이다. 대조적으로, 그래핀이 제조 동안 및 gNBS 조립 전에 프로브 초음파처리에 의해 제조되면 입자는 더 다분산된 상태로 유지된다.
초음파처리가 생성된 gNBS 군집의 분포에 미치는 영향을 더 평가하기 위해, 입자의 분산 특성은 분석 소프트웨어 v7.02를 실행하는 Malvern Instruments의 ZetaSizer에서 분석되었다. 디토네이션 그래핀은 DMF에 직접 용해되거나(초음파처리 없이), Fisherbrand FB705 Sonic Dismemberator로 DMF에서 1시간 동안 초음파처리하여 능동적으로 분산되었다.
생성된 그래핀 용액을 먼저 브로모발레르산 및 아지드화나트륨과 반응시켜 표준 프로토콜을 사용하여 gNBS로 조립하여 카복시그래핀(CG)을 생성하였다(도 21: 패널 A). 이는 EDC와 DMAP를 사용하여 폴리에틸렌이민을 카복시그래핀에 테더링하여 폴리에틸렌이민 유도체화 카복시그래핀을 생성함으로써 추가로 변형된다(도 21, 패널 B). 마지막으로, DMAP 촉매와 함께 EDC 화학을 사용하여 펩타이드-TCPP를 첨가하여 센서를 생성한다; 이 경우 프로테아제 호중구 엘라스타제(NE)에 의해 인식되는 펩타이드를 사용한다. 각 중간체, CG 및 폴리에틸렌이민으로 유도체화된 CG(CGP) 용액을 제조하고 초음파처리 워터 배스에서 10분 동안 처리하여 입자의 효율적인 혼합 및 재분배를 위해 용액을 분산시키고 효과적인 표면 개질 및 수용해도를 보장하였다. PDI 측정은 초음파처리 직후에 수행한 다음, 30분 동안 침강시킨 후 다시 수행하였다.
다분산 지수(PDI) 측정 결과를 도 21에 나타낸다. PDI는 용액 내 입자의 균일성의 척도이다. 데이터는 gNBS를 조립하기 전 1시간 동안 출발 그래핀 물질을 초음파처리 후 입자 크기의 균일성이 더 크다(더 작은 PDI 수)는 것을 보여준다. 이러한 균일성은 NE gNBS 최종 생성물뿐만 아니라 CG 및 CGP 중간체에서도 명백하였다.
이에 더하여, 1.0 g 그래핀 0.3(O-C 비율)의 용액을 추가 처리 없이 20 mL DMF에 용해시켰다. 270 nm에서의 흡광도를 NanoDrop 1000C 분광광도계에서 측정하였다. 이어서, 프로브 초음파처리기를 사용하여 최대 60분 동안 35 강도 수준에서 20초 온(on) 및 10초 오프(off) 펄스를 사용하여 용액을 분산시켰다. 일정 간격으로 샘플을 수집하고 ABS270 nm를 1시간까지 측정하였다. 프로브 초음파처리가 계속됨에 따라, 그래핀의 슬러리는 ABS270 nm 판독을 수행하기 위해 희석해야 할 정도로 두꺼워졌고 판독값은 희석에 맞게 보정되었다. 도 22는 초음파처리 시간이 증가함에 따라 흡광도의 증가를 나타낸다. 더 많은 에너지가 가해짐에 따라 그래핀 프랙탈이 더 작은 입자로 분해되기 때문에 흡광도가 증가한다.
초음파처리 동안 가해지는 에너지로부터 입자 수가 증가함에 따라 전체 입자 크기가 감소하여 빛의 Mie 또는 Rayleigh 산란이 발생하며 이는 UV-vis 스펙트럼에서 투과율 감소로 관찰된다 [51]. 따라서, 그래핀을 초음파처리함에 따라, 제조 공정에 투입되는 질량은 감소하지만 입자 표면적이 전반적으로 증가하기 때문에 부착된 펩타이드-TCPP 입자 수는 동일하거나 더 많은 수를 유지할 수 있다.
프로테아제는 완충액에서 pH 및 화학물질과 같은 환경 변화에 매우 민감하다. 바이오센서의 세척 및 제조 동안 사용된 화학물질이 센서에 남아 있지 않고 본 발명자들이 관찰한 배치 간 변화에 기여하는 것으로 확인되었다. 4개의 CG 제제에 대해 열중량 분석(TGA)을 수행하였다. TGA 기기 TGA5500을 사용하여 질소 환경에서 20℃/분으로 실온(20℃)에서 1000℃까지 온도를 증가시켰다.
입자를 완전히 건조시키기 위해 노력한 제조된 나노센서의 로트에서 질량 손실 백분율의 전반적인 감소가 관찰되었다(도 23의 표).
구체적으로, 원래 KSU 로트 120110에 대한 TGA는 대부분의 질량이 최대 100℃의 온도 간격에서 손실되었으며, 이는 제조에 사용된 용매의 비점과 일치하고 잔류 용매 오염을 나타낸다. 온도 및 건조제를 사용하여 건조하려는 노력을 포함하도록 프로토콜이 변형됨에 따라 질량 손실 백분율이 감소하였다(도 24 및 도 25).
용매가 제거되지 않은 센서는 완전히 기능하기 전에 경화 기간을 거쳐야 하는 것이 관찰되었다. KSU에 의해 제조된 나노센서의 초기 로트의 경우, 이 기간은 주로 높은 AC로 인해 신호/잡음 비율이 유의한 신호를 생성하기에 불충분한 2주로 결정되었다. 대조적으로, 제조 후 37℃에서 밤새 건조 인큐베이션을 포함하여 잔류 용매를 제거하기 위한 노력을 기울여 제조된 나노센서는 제조 후 5일 이내에 강력한 신호를 생성하였다(도 26). 최종 센서 제품의 건조는 잔류 용매를 제거하고 최적의 활성을 드러내는 데 중요한 것으로 간주된다.
잔류 용매는 감소된 신호 대 잡음 성능으로 드러난 센서의 최적 활성화를 억제함으로써 gNBS의 성능에 영향을 미친다. 따라서, 제조 용매의 제거는 TGA를 사용하여 특성화된다. TGA는 방출된 용매의 양을 총 질량의 백분율로 측정한다. 구체적으로, 용매는 20℃와 200℃ 사이 또는 20℃와 400℃ 사이에서 제거된다. 센서의 총 질량에 대한 기여로서 gNBS의 제조로 열적으로 전이된 질량의 기여도가 30% 미만이어야 한다. 최적으로 TGA로 측정한 질량 손실은 10% 또는 5% 미만이어야 한다. 최적으로 TGA로 측정한 질량 손실은 1% 미만이어야 한다.
실시예 18: 배치 간 변형 및 초음파처리의 영향
본원 개시내용에 의해 정의된 바와 같은 제조 프로토콜은 3단계 공정이었다.
첫째, 제1 그래핀을 변형하여 카복시그래핀(CG)을 생성하였다. 이것은 자기 교반 막대를 사용하여 실온 실리콘 오일 배스에 현탁된 250 mL 삼각 플라스크(Erlenmeyer falsk)에 40 mL DMF에 2.0g 디토네이션 합성 그래핀 0.3(O-C 비율)을 분산시켜 달성하였다. 분산 후, 용액의 흡광도를 NanoDrop 2000C 분광광도계에서 측정하였다. 반응 온도를 40℃로 올리고, 1.0 g의 5-브로모발레르산을 그래핀 현탁액에 첨가한 후 0.36 g의 아지드화나트륨 결정을 천천히 첨가하였다. 모든 시약이 용해되면 온도를 천천히 80℃로 올리고, 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 실온으로 냉각시켰다. 현탁액을 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 DMF로 5회 그리고 에틸-에테르로 3회 세척한 후 건조시켰다.
둘째, 폴리에틸렌이민으로 유도체화된 카복시그래핀(CGP) 중간체의 제조를 위해, 교반 막대를 사용하여 플라스크에서 1 g의 CG를 30 mL DMF에 분산시켰다. 0.54 g EDC와 0.53 g DMAP를 첨가하고 실온에서 용해될 때까지 교반하였다. 1.2 g 폴리에틸렌이민을 첨가하고, 반응물을 21시간 동안 교반하였다. CGP 입자를 상기와 같이 원심분리를 사용하여 DMF로 4회 세척하고 에틸-에테르로 3회 세척하였다. CGP 입자를 아르곤으로 플러싱하고 느슨하게 덮은 상태에서 실온에서 48시간 동안 유지하여 건조시켰다.
마지막 단계는 센서 펩타이드-TCPP의 접합이다. 103 mg의 CGP를 초음파처리 워터 배스를 사용하여 16 mL DMF에 1분 동안 분산시켰다. 실온에서 교반하면서 10.5 mg의 EDC와 11 mg의 DMAP를 CGP에 첨가하였다. 이어서, 7 mg의 TCPP 표지된 펩타이드를 첨가하고 반응물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 생성된 gNBS를 DMF로 3회 그리고 에틸-에테르로 3회 세척한 후 아르곤으로 플러싱하였다. 최종 gNBS 생성물을 -20℃에서 보관하였다. 이 프로토콜은 원래 KSU 프로토콜을 반영한다.
초기 프로토콜을 사용하여 그래핀으로 제조된 gNBS는 심지어 같은 날 제조된 배치에서도 로트 간 큰 성능 차이를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 27은 로트 120120 및 NE100을 NE101 및 NE102와 비교함). 작업 용액을 제조할 때 초음파처리 워터 배스를 사용하여 센서를 분산시키면 초음파처리할 때마다 상이한 집단 크기와 입자 수가 생성될 수 있다는 가능성이 고려되었다. 따라서, 제조 전에 입자 크기를 최적화하지 않는 한, gNBS 작업 용액의 반복적인 초음파처리는 분석 결과를 정기적으로 변경할 것이다.
초음파처리가 출발 물질에 미치는 영향을 확인하기 위해 도 28의 표에 요약된 바와 같이 제조를 변형하였다. 출발 그래핀 물질은 원래 프로토콜에 기재된 바와 같이 초음파처리 없이 사용되었고, 교반 막대만을 사용하여 DMF에 분산되거나, 출발 물질은 프로브 초음파처리기를 사용하여 10분 또는 20분 동안 분산되었다(도 28의 표). 분산 후, 입자 수와 표면적 증가로 인해 그래핀의 투입량은 감소했지만 접합 반응에 투입되는 펩타이드 TCPP의 양은 동일하게 유지되었다. KSU 프로토콜을 사용하여 NE gNBS의 1개 로트를 제조하고 출발 그래핀의 프로브 초음파처리를 10분 및 20분 사용하여 2개 로트를 제조하였다.
세 가지 모두 KSU에서 제조된 로트와 비교되었다(도 26). KSU 로트 120120 및 HEB 로트 NE100은 동일한 프로토콜 및 분산 절차를 사용하여 제조되었다. HEB 로트 NE101 및 NE102는 프로브 초음파처리를 포함하여 변형되었다. gNBS는 센서 및 완충액을 포함하지만 혈청은 포함하지 않는 검정 대조군(AC)과 비교하여 정상적인 인간 혈청을 사용하는 표준 조건 하에 평가하였다. 로트 120120 및 HEB 로트 NE100에 대해 배치 1과 배치 2 사이에 평균 244% 차이가 관찰되었다. 대조적으로, 프로브 초음파처리된 로트(NE101 및 NE102)는 배치 간에 평균 132% 차이를 보였다(도 27). 제조 전 초음파처리를 통한 분산은 그래핀 출발 물질에서 더 일관된 입자 크기, 더 작고 더 허용 가능한 PDI(< 0.5)(도 21)로 이어지며 최종 gNBS 센서에서 더 반복 가능한 활성을 생성한다는 결론을 내렸다.
최종 제조에서 입자 크기에 미치는 영향을 확인하기 위해, 워터 배스에서 초음파처리가 완성된 입자에 미치는 영향을 평가하였다. 그래핀(265 nm) 및 TCPP(425 nm)에 대한 ABS 파장에서 제조 동안 초음파처리를 거치지 않은 NE-gNBS에서 평균 259%의 ABS 증가를 보여 상당한 ABS 증가가 관찰되었다.
대조적으로, 초음파처리를 포함하여 제조된 로트에 대한 시간 경과에 따른 ABS의 변화는 동일한 파장에서 시간 경과에 따른 평균 121%의 ABS 변화를 보여주었다(도 29). 결론은 프로브 초음파처리 단계를 포함하여 입자를 제조하면 작업 용액을 제조하는 데 사용되는 워너 배스 초음파처리 단계의 영향을 받지 않는 보다 균일한 현탁액이 생성된다는 것이었다.
실시예 19: 바이오센서의 제조 및 성능
입자의 조립을 위한 바람직한 프로토콜에는 초음파처리 또는 물리적 파괴를 사용하여 입자의 크기 분포를 조정하는 것이 포함된다. 그래핀은 아지란 앵커를 사용하여 표면에 카복실 모이어티를 첨가함으로써 유도체화된다. 이어서, 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 중합체를 첨가하여 표면을 변형한 후 펩타이드 염료 복합체를 접합한다.
본 실시예에서 보고된 일련의 실험을 통해, 대체 제조 프로토콜에 대해 고려될 수 있는 변형을 평가하기 위해 다른 구성요소를 대체함으로써 이러한 단계 및 구성요소의 경계를 찾고자 하였다.
특히, 합성의 제1 단계 동안 발생하는 카복시 표지화의 양을 결정하기 위해 실험을 반복하였다. 0.5 M NaOH 및 HCl 용액은 고순도 HPLC 등급 물을 사용하여 제조하였다. 0.5 M NaOH 용액은 CG를 분산하기 전에 2시간 동안 아르곤으로 탈기시켰다. 탈기 후, 250 mg의 CG를 50 mL의 0.05 M NaOH에 분산시켰다. 샘플을 워터 배스에서 10분 동안 초음파처리한 다음, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 24시간 후, CG 현탁액을 여과하여 CH<를 제거하고 용액(CG 여과된 0.05 M NaOH, 0.05 M NaOH 및 0.05 M HCl)을 밤새 탈기시켰다. 다음으로, 20 mL의 0.05 M HCl을 10 mL 분취량의 CG 처리 및 여과된 NaOH 용액에 첨가하였다. 일단 pH가 안정화된 후 NaOH를 첨가할 때마다 그리고 다음 첨가 전에 pH를 기록하였다. 블랭크의 경우, 0.05 M HCl을 첨가하고 0.05 m NaOH로 역적정(back titration)하여 동일한 방식으로 10 mL의 0.05 M NaOH 용액을 제조하였다. 적정 동안 탈기를 유지하였다. 이 프로토콜을 사용하여 CG 제제는 중화를 위해 블랭크보다 더 많은 NaOH가 필요했으며 이는 산성 작용기의 존재를 암시한다. 반복 실험은 1.765 x 10-4 및 1.8 x 10-4 몰/g 산성 기의 농도를 계산하였다. 원래 추정치보다 낮았지만 그래핀에 산성기가 추가되었음을 뒷받침하였다(도 30 패널 A 및 패널 B).
이러한 관찰을 뒷받침하기 위해, 변형되지 않은 그래핀 및 카복시그래핀의 원소 분석은 출발 그래핀 물질에서 검출할 수 없는 수준의 산소와 수소를 보여주었다(도 31의 표). 카복실화 후, 0.5%와 3.5% 사이에서 검출 가능한 수준의 H와 O가 관찰되었다. 원래 KSU 프로토콜(KSU 및 CG1.0)과 비교하여 산소 함량이 감소한 것으로 확인되었으므로 산소 함량 중 일부는 용매로부터 유래된 것으로 결론을 내렸다. 이를 뒷받침하기 위해, 초음파처리와 건조 프로토콜을 포함한 CG1.2, CG1.3, CG1.4(도 28의 표 참조) 제제를 제조하면 검출된 H와 O의 비율이 더 낮게 나타났다. 비교를 위해, PEI로 유도체화한 CG 생성물(CGP102)은 H, O 및 N의 기여도가 상당히 더 높았다. CG1.0을 사용하여 조립하였다(도 31의 표 참조).
이를 바탕으로, 원래의 pH 적정이 그래핀에 첨가된 카복실산기의 수를 과대평가했으며, 아르곤 탈기 및 역적정을 사용하여 더 정확하게 추정되었다고 결론을 내렸다. 이는 원래 프로토콜로 생성된 제품보다 잔류 용매를 제거하기 위해 노력한 CG 제제의 산소 함량 추정치가 더 낮게 나타난 원소 분석으로 뒷받침되었다. 원소 분석의 차이에도 불구하고, 설명된 모든 프로토콜은 여전히 그래핀에 H 및 O를 주석 처리하고 기능성 바이오센서를 생산할 수 있었다.
바이오센서 조립을 위한 단계를 결정하기 위해, 이전 카복실화 단계 없이 그래핀에 PEI를 추가하는 것을 시험하였다. 첫 번째 경우에, 대조군 uPA gNBS는 그래핀의 카복실화 후 PEI 중합에 의한 표준 프로토콜을 사용하여 조립하였다. 두 번째 예에서는 도 28의 표에서 CGP104에 대해 요약된 바와 같이 243 mg/g EDC 및 247 mg/g DMAP를 사용하였고 500 mg/g PEI를 동일하게 첨가하여 0.3 그래핀을 CG로 대체하였다(uPA-no GC).
이 반응은 RT에서 90분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 세 번째 경우에, 0.3 그래핀을 550 mg/g PEI의 첨가와 함께 DMF에 분산시켰지만 EDC 또는 DMAP 촉매는 첨가하지 않았다. 대신, 반응물을 80℃로 1시간 동안 가열하였다(uPA - 80℃). PEI 첨가가 완료되면 세 가지 제제를 모두 200 프루프(proof) 에탄올로 5회 이상 세척하고 DMF에 재현탁시켰다. 이어서, 세 가지 제제 모두 uPA-TCPP 서열을 사용하여 펩타이드 TCPP에 접합되었다. 세 가지 작제물 모두 RT에서 90분 동안 교반하면서 105 mg/g EDC, 111 mg/g DMAP 및 65 mg/g uPA-TCPP로 처리하였다. 생성된 입자를 에탄올로 세척하고 37℃ 오븐에서 밤새 건조시켰다. 센서는 10 mM MES, 10 μM CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 IS:155에서 200 μg/ml의 용액을 제조하여 시험하였다. 70 μl의 각 작업 용액을 10 μl의 풀링된 정상 혈청과 함께 45℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다.
형광은 425 nm 여기 및 653 nm 발광으로 VarioSkan Lux 플레이트 판독기에서 측정되었다. 세 가지 제제 모두 0.05 미만의 검정 대조군 값을 생성했으며, 풀링된 정상 혈청으로부터 19와 31 사이의 RFU를 가졌다(도 32 참조). 세 가지 센서 모두 비공유 결합 TCPP를 드러내는 처리인 10 mM KOH에 대한 반응 조정에 민감하지 않았다(데이터는 나타내지 않았음).
따라서, 그래핀의 원소 분석은 산소에 대한 검출 한계가 0.5%이므로, CG의 생산과 함께 산소의 양이 검출 가능한 수준으로 증가함에 따라 PEI의 첨가에 대한 표적도 검출 가능하게 된다는 결론을 내렸다. 그러나, 80℃에서 열 기반 응축 또는 촉매와 함께 PEI를 그래핀에 직접 추가하여 생성된 기능성 센서를 고려할 때, 0.3 그래핀이 디토네이션 그래핀에 산소의 존재를 암시하는 센서를 조립하는 데 필요한 적은 수의 PEI 분자를 부착하는 어떤 능력이 있다는 증거가 얻어졌다.
더 적은 단계를 필요로 하거나 더 효율적일 수 있는 PEI를 그래핀에 결합하는 추가 방법도 평가되었다. 변형된 테트라 에틸렌 글리콜(TEG), 아지도아세트산 NHS 에스테르 또는 아지도아세트산과 같은 브로모발레르산 링커 단계에 대한 대체물이 확인되었다. 이러한 분자는 브로모발레르산 + 아지드 대신 아지도기와 카복실레이트 또는 아민기를 제공한다.
125 mg 그래핀을 프로브 초음파처리하여 22.5 mL DMF에 넣고 60℃로 가열하는 실험을 수행하였다. PEI는 60 mg 10k MW PEI를 3 ml DMF에 첨가한 다음, 270 mg 아지도아세트산 NHS 에스테르를 첨가하여 제조하였다. 혼합물을 60℃로 가열하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 활성화된 PEI 용액을 그래핀에 첨가하고, 온도를 60℃에서 80℃로 10분에 걸쳐 상승시켰다. 1시간 동안 반응을 계속하고 에탄올 세척 및 건조를 사용하여 정제하였다. 두 번째 제조는 동일한 방식으로 이루어졌지만 10k MW PEI를 1.2k MW PEI로 대체하였다. 그 후, 두 작제물 모두 RT에서 90분 동안 교반하면서 105 mg/g EDC, 111 mg/g DMAP 및 65 mg/g uPA-TCPP로 처리하였다. 생성된 입자를 에탄올로 세척하고 37℃ 오븐에서 밤새 건조시켰다. 센서는 10 mM MES, 10 μM CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 IS:155에서 200 μg/ml의 용액을 제조하여 시험하였다. 70 μl의 각 작업 용액을 10 μl의 완충액, 50 mg/mL 아세틸화 BSA 또는 풀링된 일반 혈청과 함께 45℃에서 90분 동안 검은색 384웰 플레이트에서 인큐베이션하였다.
형광은 425 nm 여기 및 653 nm 발광으로 VarioSkan Lux 플레이트 판독기에서 측정되었다(도 33). 두 PEI 제제 중 하나로 만든 uPA 센서의 유사한 활성화가 관찰되었다. 이 관찰은 분자량이 상이한 중합체를 선택하여 그래핀 소광제와 형광체 사이의 거리를 감소시킴으로써 그래핀 백본으로부터 펩타이드와 관련 염료의 거리를 조작할 수 있음을 나타낸다. 이는 더 짧은 푀르스터 반경을 가지거나 더 효율적인 형광단인 더 효율적인 형광 염료로 변경할 때 필요할 것이다. 이 실험은 또한 브로모발레르산 이외의 앵커를 사용할 수 있는 능력도 확인한다.
현재, 그래핀 기반 바이오센서의 조립은 일련의 표면 개질 반응으로 이루어지며, 이는 하기 변형을 사용하여 수행된다: 그래핀에서 카복시그래핀으로 카복시그래핀-PEI에서 그래핀 바이오센서로. 이러한 복잡한 합성 과정을 감소시키기 위해, 바이오센서 조립 전에 그래핀의 단일 표면 변형을 조사했는데, 그 방법은 아래에 기재되어 있다.
실온에서 환저 플라스크에서 50 mL의 증류 및 탈기된 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(Fisher Scientific Cat#: D119-20)에 1 g의 0.3 디토네이션 그래핀을 분산시켜 소규모 반응을 시작하였다. 이어서, 이 분산 용액을 40℃까지 가열하고 556 μL(0.0028 mol)의 아지도-TEG3-아민(BroadPharm Cat#: BP-20580)을 천천히 첨가하였다. 이어서, 온도를 80℃로 증가시키고 반응 용액을 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고 원심분리(8000 rpm 속도에서 5분)를 통해 샘플을 수집하였다. 마지막으로, G-TEG3아민 생성물을 DMF로 5회, 무수 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 생성된 G-TEG3아민을 아르곤으로 추가 건조시키고, -20℃에서 보관하였다.
다음 단계는 G-PEI 바이오센서에 대해 확립된 것과 동일한 최적화된 조건에 따라 조립된 G-TEG3아민을 사용하여 MMP1 바이오센서를 조립하는 것이었다. 이를 위해, 두 가지 용액을 제조하였다: 1) 3.75 mg의 TCPP-MMP1 펩타이드, 5 mg의 EDC, 및 5 mg의 DMAP를 2 mL의 증류 및 탈기된 DMF에 용해시키고, 2) 50 mg의 G-TEG3 아민을 2 mL의 증류 및 탈기된 DMF에 분산시켰다. 두 용액을 모두 초음파처리 워터 배스에서 초음파처리하고(3분) 완전히 용해될 때까지 볼텍싱(vortexed)하였다. 이어서, 용액 1)과 2)를 혼합하고 용액을 추가로 초음파처리(3분)하여 모든 것이 DMF에 현탁된 상태로 유지되도록 하였다. 이어서, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 24시간 후, 바이오센서를 원심분리(8000 rpm에서 8분)를 통해 수집하고 DMF로 3회 그리고 디에틸 에테르로 3회 세척하였다. 마지막으로, 바이오센서를 아르곤으로 건조시키고, -20℃에서 보관하였다.
바이오센서가 조립되면, NanoBrook 90Plus PALS를 사용하여 동적 광산란(DLS) 및 제타 전위 측정을 수행하였다. 이를 위해, 고순도 물(HPLC 물, Fisher Cat#: W7-4)을 사용하여 0.03 mg/mL의 MMP1 용액을 제조하였다. 평균 크기(DLS), 다분산 지수 및 제타 전위 표면 전하를 나타낸다(도 34의 표). 결과는 바이오센서가 4.36 mV의 약간 양전하, 713.30 nm의 평균 직경 크기, 0.147의 PDI를 갖는 것으로 나타났다.
다음 실험은 두 바이오센서, G-PEI MMP1 대 G-TEG3아민 MMP10을 나란히 비교한 것이었다. 이 실험을 위해, 각 MMP1 바이오센서의 0.03 mg/mL 용액을 HEPES 완충액(10 μmol/L의 Ca2+, Mg2+, Zn2+가 풍부한 25 μmol/L HEPES 완충액, pH 7.20)을 사용하여 제조하였다. 바이오센서 용액을 제조한 후, pH는 G-TEG3아민의 경우 7.40, G-PEI의 경우 7.52로 증가했기 때문에 0.1M HCl 용액을 사용하여 두 용액 모두 pH를 7.20으로 조정하였다.
세 가지 용액을 제조하여(아래에 기재된 바와 같이) 96웰 플레이트(Greiner Bio-one, 마이크로플레이트 96웰, PS, F-바닥, 검은색 비결합; 품목 번호: 655900)에 이중으로 플레이팅하였다.
- 용액 1: 샘플 대조군(125 μL의 HEPES 완충액 + 5 μL의 수집된 대조군 혈청 -S, P, 또는 풀링됨)
- 용액 2: 검정 대조군(HEPES 완충액 중 125 μL의 바이오센서 용액 + 5 μL의 HEPES 완충액)
- 용액 3: 검정(HEPES 완충액 중 125 μL의 바이오센서 용액 + 5 μL의 수집된 대조군 혈청 - S, P, 또는 풀링됨).
용액을 플레이팅한 후, 96웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 형광 강도를 1시간 인큐베이션 동안 15분마다 측정하였다. 형광 강도는 BioTek Synergy H1 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다(exc = 425 ± 10 nm, em: 650 ± 20 nm). 도 35는 각 대조군 혈청(S, P, 및 풀링됨)에 대해 MMP1 G-PEI 및 MMP1 G-TEG3 아민 바이오센서에 대해 15분마다 측정한 형광 강도를 나타낸다. G-TEG3아민에 대해 1시간 인큐베이션 후 측정된 가장 높은 강도는 G-PEI 바이오센서와 비교하여 시험된 3개의 대조군 혈청 모두에서 더 높았다.
또한, 3개의 대조군 혈청 샘플 모두로 시험된 두 바이오센서에 대해 거의 선형 경향에 따라 시간 경과에 따라 강도가 증가하였다. 도 36 패널 (A)는 각 대조군 혈청으로 시험된 두 바이오센서로 1시간 인큐베이션 후 측정된 강도를 나타낸다. 여기서 G-PEI 대 G-TEG3 아민을 비교하여 강도의 차이를 확인할 수 있으며 이는 G-PEI에 비해 G-TEG3아민에 대해 대조군 혈청 S 및 P보다 거의 2배 더 높았다. 또한, 도 36 패널 (B)에 요약된 바와 같이 분석 대조군에 대한 강도는 G-PEI에 비해 G-TEG3아민에 대해 더 낮았다는 점도 언급해야 한다. 전반적으로, G-TEG3아민 기반 바이오센서는 낮은 검정 대조군과 혈청에 대한 더 큰 특이적 신호로 향상된 신호/잡음 측정을 생성한다.
상기 실험을 고려할 때, 폭발 합성된 그래핀은 소수성이고 사실상 물 또는 수성 완충액에 분산될 수 없고 (그리고 계면활성제가 유기 염료의 형광 양자 수율을 방해하기 때문에), 원하는 안정성을 얻기 위해서는 친수성 코팅을 추가해야 한다는 결론을 내렸다.
이것은 니트렌 첨가를 통해 그래핀 적층의 표면에 카복실산기를 부착함으로써 달성될 수 있다 [52]. 대안적으로, 아민 말단 올리고에틸렌 글리콜은 니트렌 첨가를 통해 폭발 그래핀의 표면에 부착될 수 있다.
이 카복실산에 폴리에틸렌 이민이 부착된다. 대안적으로, 아민기를 폭발 그래핀의 표면에 부착한 다음, 카복실산기를 표시하는 중합체에 부착할 수 있다.
대안적으로, 중합체에 대한 아지드기를 갖는 그래핀 첨가를 위해 전구체가 결합될 수 있고, 이어서 중합체를 그래핀 표면에 고정시킬 수 있다.
부착된 유기 코팅(중합체, 올리고에틸렌 글리콜)은 다음과 같은 기능을 갖는다:
친수성 코팅이 없으면, 그래핀 나노바이오센서는 수성 완충액에 분산될 수 없다. 바이오센서의 달성 가능한 농도는 코팅의 화학적 성질과 코팅과 그래핀에 대한 질량비에 크게 의존한다.
코팅은 수성 완충액에 분산될 때 바이오센서의 안정성을 담당하며, 바이오센서의 그래핀 코어는 매우 안정적이다.
PEI의 크기와 구조는 컨센서스 서열의 단백질 분해 절단 시 관찰된 형광 증가를 담당한다. 일반적으로, 푀르스터 공명 에너지 전달(FRET)은 그래핀(수용체)과 부착된 유기 형광단 사이에서 발생한다. FRET의 효능은 거리에 따라 달라진다. 따라서, PEI의 구조(분지형 대 선형)가 중요하다. 그러나, 그래핀(특히 그래핀 적층)은 UV로부터 근적외선 영역으로 빛을 효율적으로 흡수한다. Bian 등(2016)의 이론 연구에 따르면, 그래핀 단층 주변의 소광 영역은 약 20 nm로 확장된다 [53]. 이 "푀르스터 부피" 내에서 강력한 소광이 발생하여 TCPP 형광을 매우 강력하게 감소시킨다. 푀르스터 부피로부터 벗어나면 TCPP가 방출되기 시작한다.
실시예 20: 다중 그래핀 바이오센서
동일한 반응 웰에서 다수의 상이한 센서를 실행할 가능성이 고려되었다. 그래핀은 넓은 스펙트럼의 빛을 흡수한다(도 37). 따라서, 다수의 상이한 펩타이드-염료 서열이 단일 그래핀 입자 상에 조립될 수 있거나, 상이한 단일 펩타이드-염료로 각각 표지된 다수의 센서가 함께 혼합될 수 있다.
본 개시내용의 바이오센서의 다중화 능력은 이후의 시스템 - 2개의 독립적으로 표시된 입자를 혼합함 - 을 사용하여 평가되었다. 호중구 엘라스타제(NE) 및 아르기나제(ARG)에 대한 펩타이드는 FAM 또는 TAMRA로 다양하게 표지되었다. 펩타이드-FAM 또는 펩타이드-TAMRA는 이러한 염료의 형광 효율 증가로 인해 절반의 밀도로 접합하는 것만 변형하여 펩타이드-TCPP의 제조 공정에 직접 대체되었다. 따라서, 펩타이드를 35 mg/g CGP로 첨가하였다(도 28의 참조 표). gNBS 작업 용액은 10 mM MES, 10 μM CaCl2, MgCl2, ZnCl2, IS:155로 구성된 검정 완충액에 NE-FAM, NE-TAMRA 또는 uPA-TCPP gNBS를 대량으로 넣어 제조하였다. 125 μl의 작업 용액과 증분량의 각 gNBS를 검정색 96웰 플레이트에 분배하고 검정 대조군(AC)을 위한 완충액을 사용하여 단일 웰에서 자극하거나 5 μl의 풀링된 정상 혈청을 사용하여 3회 자극하였다. 플레이트를 45℃에서 VarioSkan Lux에서 인큐베이션하였다(도 38 및 도 39). FAM의 경우 Ex496/Em526, Ex555/Em586을 사용하여 90분에 걸쳐 각 반응에 대해 형광을 관찰하였다. 대안적으로, 상기와 같은 KSU 제조 프로토콜을 사용하여 MMP7 및 MMP9 펩타이드를 로다민-B에 접합하고 70 mg/g에서 CGP에 접합하였다. gNBS 작업 용액은 10 mM MES, 10 μM CaCl2, MgCl2, ZnCl2, IS:155에서 30 μg/mL gNBS의 최종 농도로 제조하였고, 125 μl 반응을 검은색 96웰 플레이트에 3회 설정하고 37℃에서 60분 동안 5 μl 혈청 또는 완충액만(AC)으로 인큐베이션하였다. 형광은 Ex535/Em570에서 BioTek Synergy H1 FL800 플레이트 판독기에서 측정되었다(도 39).
이러한 관찰은 그래핀이 다수의 상이한 염료에 대해 효과적인 소광제로서 작용할 수 있다는 모델을 뒷받침한다. 다수의 상이한 센서가 다양한 염료로 구축될 수 있고 이러한 염료가 별도의 반응에서 그래핀 백본에 의해 성공적으로 소광될 수 있음을 입증한 후, 동일한 반응에서 다수의 염료가 관찰될 수 있음을 입증하고자 했다.
상기와 같은 gNBS 제조 프로토콜을 위해 입력 펩타이드 염료 기여를 35 mg/g CGP로 절반으로 줄인 Arg-FAM 및 NE-TAMRA gNBS를 다시 제조하였다. gNBS 작업 용액은 10 mM MES, 10 μM CaCl2, MgCl2, ZnCl2, IS:155로 구성된 검정 완충액에 400 μg/ml Arg-FAM 또는 NE-TAMRA gNBS를 대량으로 넣어 제조하였다. 80 μl 반응물은 35 μl 단일 센서와 35 μl 완충액 또는 35 μl의 각 센서를 혼합하여 두 센서 중 하나의 최종 농도 200 μg/ml로 384w 검정색 플레이트에 설정하였다. 10 μl의 풀링된 일반 혈청 또는 완충액을 각 센서 용액에 추가하였다.
센서를 모두 3회 자극하고 45℃에서 90분 동안 인큐베이션하고 10분 간격으로 측정하였다. 각 웰은 496/526 nm(FAM) 및 555/586 nm(TAMRA)에서 측정되었다(도 4c).
개별 센서와 다중화 센서가 모두 검출될 수 있으며, 두 센서가 모두 존재할 때 약간의 소광에 대한 증거가 있지만 한 센서로부터 다른 채널로 신호 검이 없음에 주목되었다(두 채널 중 하나에서 단일 형광과 다중 형광 비교). 또한 Arg-FAM은 단일 및 다중 반응에서 배경이 상승되는 것으로 나타났다. 이는 고효율 염료를 사용할 때 접합된 펩타이드의 양이 그래핀 백본의 소광 용량을 초과할 수 있음을 나타내는 것으로 해석되었다.
이 잡음은 표지화 수준을 낮추어 완화될 수 있다. 대안적으로, FAM 염료와 그래핀 사이의 연결 화학이 짧아지면 FAM이 FRET 파트너에 더 가까워지고 소광이 개선될 것이다. 이러한 맥락에서, 도 32에 기재된 바와 같이 10k MW PEI를 1.2k MW PEI로 대체하는 것이 실행 가능한 솔루션으로 고려되었다.
염료 표지된 펩타이드를 그래핀 백본에 접합하여 그래핀 백본이 부착된 염료를 효과적으로 소광하도록 하기 위해, PEI와 같은 중합 또는 TEG 또는 아지도아세트산 NHS 에스테르 또는 동가물에 의한 직접 접합의 조합을 사용하는 것이 고려되었다.
펩타이드-염료 접합체가 그래핀의 20 nm 내에서 유지되는 한, 이 화학에 대한 변형은 상기 예시한 바와 같이 효과적일 것으로 예상된다 [53] [54]. 따라서, 선택한 염료의 양자 효율에 따라 염료의 효율적인 소광을 최적화하기 위해 중합 또는 접합 화학을 최적화하여 염료 접합체와 그래핀 백본 사이의 거리를 변경하여 신호 대 잡음 성능을 변경할 수 있다. 이러한 접합 선택은 또한 펩타이드-염료 복합체의 이차 접합을 허용하고 그래핀 입자의 가용화를 지원하기 위해 카복실산, 아미노 또는 알코올 측쇄와 같은 충분한 하전된 기에 기여해야 한다.
마지막으로, NE-FAM gNBS 반응은 96w 검은색 플레이트에서 수행되고 VarioSkan Lux 플랫폼에서 분석되는 하나의 검정과 96웰 PCR 플레이트에서 NE-FAM gNBS를 사용하여 StepOnePlus PCR 플랫폼에서 분석되는 다른 검정으로 이중으로 설정되었다(도 31). 배경 신호의 부재와 인큐베이션 시간과 형광 사이의 선형 관계는 두 플랫폼 모두에서 분명하게 나타나며, 이러한 유형의 gNBS 검정이 정량적 PCR 플랫폼과 같은 형광계보다 훨씬 더 널리 분포된 실험실 장비에서 실행될 수 있는 가능성을 높인다.
실시예 21: 혈청의 열처리
프로테아제 효소를 열 불활성화하여 이러한 반응의 특이성을 입증하기 위한 실험을 설계하였다. 이를 위해, 두 개의 서로 다른 대조군 혈청 샘플을 55℃에서 1시간 동안 열처리하였다. 열처리된 혈청과 미처리된 혈청을 표준 조건을 사용하여 MMP10 및 CTSH gNBS와 함께 인큐베이션하였다. 혈청과 두 센서 모두에서 RFU의 완만한 상승이 예기치 않게 관찰되었다. (도 42 패널 A). 두 대조군 혈청을 65℃에서 10분 동안 처리하여 실험을 반복하였다(임의의 더 긴 간격은 혈청의 침전을 야기하였다). 또한, 센서 반응에서 최종 EDTA 농도가 5 mM이 되도록 혈청을 EDTA로 처리하였다. 본 발명자들은 또한 이 관찰을 얼마나 일반화할 수 있는지 알아보기 위해 MMP10 gNBS를 MMP2로 대체하였다(도 42 패널 B). 혈청을 EDTA로 처리하면 다른 보고서와 일치하게 활성이 완만하게 감소하였다 [55]. 대조적으로, 혈청을 65℃에서 열처리하면 혈청과 두 센서 모두에서 활성이 크게 증가하였다. EDTA를 첨가하면 처리되지 않은 혈청에서와 마찬가지로 상승된 활성이 완만하게 감소했으며, 이러한 영향은 MMP2 센서에서 더 두드러졌다. 따라서, 놀랍게도 혈청을 상승된 온도에서 처리하면 gNBS 신호를 증가시킬 수 있는 추가 프로테아제 활성이 드러난다. 이러한 변화가 자이모겐이 활성화됨에 따라 발생하는 추가 활성화 사건의 결과인지 확인하기 위해, 본 발명자들은 65℃로 10분 동안 열처리된 풀링된 정상 혈청 또는 복제 샘플로 CTSH gNBS를 자극하였다. 반응은 처음 1시간 후 30분 간격으로 240분에 걸쳐 측정하였다. 미처리 혈청과 열처리 혈청의 활성은 둘 모두 해당 기간 동안 선형 반응으로 유지되었다(도 43). 추가 자이모겐이 활성화되면, 시간이 경과함에 따라 동역학이 증가할 것으로 예상할 수 있다. 그러나, 동역학에 변화가 있다는 어떠한 증거도 보이지 않았다.
이 결론을 뒷받침하기 위해, 열처리가 풀링된 정상 혈청 센서 활성에 미치는 영향을 18개의 프로테아제 바이오센서에서 평가하였다(도 44). 검정 대조군(RFI > 0.05)보다 상당히 높은 신호를 가진 모든 센서는 65℃ 열처리된 혈청을 사용했을 때 평균 3.2배의 활성 증가를 보여주었다.
마지막으로, MMP12 및 CTSD gNBS는 5 mM MES, 10 μM 양이온 및 IS:155의 125 μl 작업 용액에서 준비하였다. 이들은 5 μl 완충액(검정 배경)으로 자극하거나 5 μl PNS로 3회 자극하였다. 복제 플레이트를 조립하고 각 복제 플레이트를 VarioSkan Lux에서 37℃, 41℃ 또는 45℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 동안 10분 간격으로 형광을 측정하였다. 샘플 배경 측정은 125 μL의 완충액(센서 없음)에 5 μL의 혈청을 첨가하여 인큐베이션한 웰의 결과를 보여주었다. 이 실험 부문에서, 측정 전에 혈청을 열처리하지 않았다. 대신, 반응은 증분 온도에서 수행되었다.
각 온도 증분은 MMP12 및 CTSD gNBS 둘 모두에 대해 추가 활성을 나타냈는데, 41℃ 인큐베이션은 37℃보다 더 많은 형광을 생성하고 45℃는 41℃보다 더 많은 형광을 생성하였다(도 45). MMP12 및 CTSD의 경우, 이전에 열처리하지 않은 혈청에서 검정 온도를 41℃로 증가시키면 RFU가 거의 2배(각각 1.7배 및 1.9배)가 되었다. 검정 온도를 45℃로 증가시키면 RFU가 3배(3.1배)가 되었다. 이러한 조건 하에 센서의 배경 신호 또는 샘플 배경의 상승은 없었다. 비교를 위해, 본 발명자들은 또한 혈청을 65℃에서 5분간 전처리하고 65℃의 전처리와 상승된 검정 온도를 모두 적용했을 때 신호 대 잡음에 미치는 영향을 비교하였다(도 45의 열린 기호와 닫힌 기호 비교).
혈청을 65℃에서 전처리하면 열처리된 혈청에 비해 신호가 2.3배 증가한다. 또한 검정을 위한 2.3배 및 2.0배 신호는 이후에 각각 41℃ 및 45℃에서 실행된다. 따라서, 혈청을 전처리하고 상승된 온도에서 프로테아제 검정을 실행하면 별도의 추가 메커니즘을 사용하여 신호 대 잡음을 개선한다.
프로테아제 효소의 열 안정성과 관련하여, 활성 MMP2 효소는 70℃와 78℃에서 두 가지 비가역적 전개 온도를 갖는 것으로 보고되었으며; 여기에 사용된 온도보다 상당히 높다 [56]. 프로테아제 활성을 조절하도록 설계된 억제제 계열은 더 큰 온도 민감성을 나타내고 이러한 반응을 더 높은 온도에서 작동하면 억제제 영향이 감소할 가능성이 고려되었다. 상승된 온도의 영향은 신호:잡음 비율의 상당한 개선에 함께 기여하는 검정의 여러 측면을 변경하는 것으로 결론지었다.
프로테아제 효소의 안정성과 온도 증가에 대한 억제 단백질의 상대적 불안정성은 억제된 효소에 대한 활성의 비율을 변경할 것으로 예상된다. 상승된 온도는 상승된 온도에서 효소 동역학을 상승시켜 프로테아제 활성의 검출을 향상시킨다. 또한, 증가된 온도는 입자 주변에서 관찰되고 본원에 기재된 단백질 코로나를 변형시키는 것으로 예상된다(도 46).
침전을 야기하기 전에 혈청 내 다른 단백질을 변성시킬 온도와 프로테아제 활성에 대한 개선 사이의 균형을 맞추는 온도 의존성의 기울기가 예상되었다. 검정 전 또는 검정 동안 혈청을 인큐베이션하는 것은 모두 신호 대 잡음 비율을 증가시키는데 효과적이다. 41℃ 또는 45℃ 또는 50℃ 또는 55℃ 또는 60℃ 또는 65℃ 또는 70℃ 또는 75℃ 또는 이러한 목표 사이의 간격이 원하는 영향에 효과적인 것으로 간주되어 왔다.
실시예 22: 음성 대조군
단백질이 입자 주변에 응집할 때 형성되는 코로나를 설명하는 잘 설명된 문헌이 있다 [57]. 어떠한 활성도 없는 단백질 용액이 배경 신호를 생성하고 기여하는 것으로 나타날 수 있는 여부를 시험하기를 원했다. 이러한 센서의 대부분은 프로테아제 특이적 절단이 필요하다는 것을 상기한다.
아르기나제는 번역 후 표적을 변형시키는 효소로서 예외이다. gNBS 시스템에서 아르기나아제는 아르기닌을 오르니틴과 요소로 전환한다. 이러한 변형은 구조를 변경하고 펩타이드가 그래핀의 푀르스터 반경 외부에 말단 TCPP 염료를 배치하도록 한다. 따라서, 배경 성능에 대한 일반 단백질 코로나의 기여를 이해하는 것이 중요하다. 단백질을 음성 대조군으로 사용하여 신호 대 잡음을 이해하기 위해 18 gNBS에서 175개의 인간 혈청 샘플을 평가하였다. 각 gNBS를 MES 검정 완충액(10 mM MES, 10 μM 양이온, 155 mM NaCl, pH 7.2)에서 덩어리가 되었다. 125 μL의 각 gNBS 작업 용액을 3개의 웰에 추가하였다. 5 μL 혈청을 중복 웰에 추가하고 5 μL 완충액을 제3 웰에 추가하였다.
센서 없이 125 μL의 완충액에 추가된 5 μL의 혈청과 함께 샘플만 있는 대조군도 포함되었다. 또한, 각 센서 세트는 20 mg/mL 아세틸화된 BSA 용액 5 μL로 자극되었다. 플레이트를 느슨하게 덮고 45℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후, VarioSkan Lux 플레이트 판독기에서 Ex/Em 425/653 nm에서 500 ms 동안 형광을 측정하였다(도 24). 단 한 가지 예외(Arg gNBS)를 제외하고 모든 gNBS에서 얻은 평균 형광은 BSA 반응보다 상당히 더 컸다. 단 하나의 센서에서만 BSA 대조군 이하의 신호를 가진 혈청 샘플을 가졌다. BSA 대조군은 완충액에서만 센서에 의해 나타내는 형광의 양을 측정하는 데 사용된 검정 대조군보다 상당히 더 컸다. 본 발명자들은 이 음성 대조군이 gNBS의 비특이적 성능을 훨씬 더 가치 있게 반영하는 것으로 해석한다. Arg gNBS의 활성에 대한 온도의 영향은 이 센서의 최적 온도가 45℃ 미만임을 증명할 수 있다.
실시예 23: 동결건조
반복 가능하고 재현 가능한 성능을 유지하는 것은 효과적인 신호 대 잡음을 유지하는 데 있어 핵심이다. MES 작업 완충액에서 uPA, CTSE, CTSK 및 NE gNBS의 준비가 제공되었으며 세 가지 상이한 부형제 배합물을 사용하여 동결건조된 플레이트를 준비하였다. 동일한 로트의 정상 혈청을 사용하여 다른 날에 플레이트를 시험하고, 동일한 플레이트에 추가된 습식 화학 배치와 비교하였다.
두 설정 모두에서 감소된 변동 계수에 의해 측정된 바와 같이, 습식 시약과 비교할 때, 검정 간 및 검정내 정밀도의 개선이 관찰되었다(도 47). 따라서, 더 높은 정밀도를 유지하면 프로테아제 활성을 측정하여 여러 측정에 걸쳐 더 반복 가능한 신호를 생성할 수 있다. 이러한 정밀도는 검정 설정에서 일정한 신호 대 잡음 성능을 유지하는 데 필요하다. 일관되고 반복 가능하며 재현 가능한 프로테아제 활성 측정을 통해, 프로테아제 표적 패널에서 프로테아제 활성 간의 관계를 조합하여 정상 환자로부터 유래된 혈청과 다양한 염증 병태의 스펙트럼을 가진 환자를 구별할 수 있다.
실시예 24: 그래핀 바이오센서의 임상 성능
임상 샘플에서 gNBS의 성능을 평가하였다. 제1 코호트에서는 유럽 사이트에서 256명의 대상체가 누적되어 폐암(n=89) 또는 비폐암(n=167)으로 분류되었다. 혈청 샘플을 열 순환기에서 65℃에서 12분 동안 열처리하고, 15℃로 냉각시켰다. MES 검정 완충액(5 mM MES, 10 μM 양이온, pH 7.20, 154 mM NaCl)은 센서에 따라 0.1-0.15의 최종 ABS425nm로 조정된 각 gNBS로 작업 용액을 만드는 데 사용되었다. 이 제제를 워터 배스에서 10분 동안 초음파처리하고 125 μL를 복제 웰에 분배하였다. 5 μl의 열처리 혈청을 복제 웰과 단일 혈청 전용 대조군에 추가하였다. 각 플레이트에 센서 전용 검정 대조군이 포함되었다.
플레이트를 느슨한 호일로 덮고 37℃ 인큐베이터에 90분 동안 두었다. 형광은 Ex/Em 425/653 nm에서 판독값을 취하여 VarioSkan Lux에서 판독되었다. LC 및 비LC 대상체에 대해 관찰된 평균 형광이 보고되었다(도 48의 표). 폐암 환자와 비폐암 환자에서 프로테아제 활성의 일반적인 감소가 기록되었다. 환자의 병기 및 질환의 하위 유형은 이 관찰에 영향을 미치지 않았다. 유사하게, 비-LC 환자에는 유방암, 결장직장암 및 혈액학적 악성종양을 가진 9명의 환자가 포함되었는데 이들 대상체는 이 분석에 포함되지 않았지만 비-LC 분석에 혼동을 주지 않았다. 175명의 대상체의 제2 코호트는 "US SST-18" 코호트의 일부로 모집되었다.
이 실험에서 모든 비-LC 대조군은 LC 코호트에 대한 사례 대조군인 년간 20갑 초과의 흡연 습관을 가진 연령 일치 공여자였다. LC 코호트에서, 대부분의 LC 샘플은 치료받지 않은 1기 대상체로부터 채취하였다. 이 실험에서는 본 발명자들은 EU가 아닌 미국에서 유래된 샘플인 다른 VarioScan Lux 형광계인 센서의 제2 로트를 시험하였다. gNBS가 덩어리가 되어 용액을 MES 검정 완충액(10 mM MES, 10 μM 양이온, pH 7.20, 155 mM NaCl)에서 센서에 따라 0.1-0.15의 최종 ABS425nm로 조정하였다. 125 μl의 검정 완충액 또는 각 gNBS를 함유하는 검정 완충액을 96w 검정 플레이트에 로딩하였다.
플레이트를 느슨한 호일로 덮고 45℃ 90분 동안 인큐베이션하였다. 형광은 Ex/Em 425/653 nm(500 ms)에서 1회 종점을 사용하여 VarioSkan Lux에서 판독되었다. LC 샘플에서 전체 프로테아제 활성의 동일한 현저한 감소가 관찰되었다(도 48의 표). 폐암의 RFU를 다양한 비폐암 코호트와 비교하는 스튜던트 양측 이분산 t-테스트를 계산하였다. 현재 계산은 두 코호트와 모든 센서에 걸쳐 2.6e-6과 2.6e-27 사이의 p-값을 제공하였다. 이 관찰의 영향은 이러한 센서를 많은 다양한 방식으로 구성하여 질환의 존재를 검출하는 매우 강력한 능력으로 진단 잠재력을 달성할 수 있다는 가능성이다.
도 49는 폐암 및 비-폐암 샘플의 RFU를 비교하는 스튜던트 양측 이분산 t-테스트에 대한 p-값의 표를 나타낸다.
실시예 25: 바이오센서를 제조하기 위한 예시적인 방법 및 시스템
입자를 조립하기 위한 예시적인 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
1) 디메틸 포름아미드(DMF)에 소수층의 그래핀 덩어리를 분산시켜 용액을 수득하는 단계
2) 그래핀 1 g당 10-15 kJ를 사용하여 1시간에 걸쳐 프로브 초음파처리기를 사용하여 용액을 최대 1시간 동안 초음파처리하는 단계
3) 카복실화된 그래핀(CG)을 얻기 위해 본원에 기재된 바와 같이 아지드화나트륨 및 브로모발레르산과의 친핵성 치환 반응을 사용함으로써 카복실화된 표면을 유도하도록 그래핀 표면을 기능화하여 카복실화된 그래핀(CG)을 수득하는 단계
4) CG를 DMF 또는 에탄올로 세척하여 반응물을 제거하는 단계
5) PEI로 조립된 코어 입자의 경우, CG를 DMF에 재현탁하여 CG/DMF 용액을 수득하는 단계
6) 초음파처리를 사용하여 CG/DMF를 분배하는 단계
7) 예시적인 폴리에틸렌이민(PEI)의 경우, 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드, (EDC) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 정의된 비율로 사용하여 PEI를 RT에서 1-2시간 동안 접합하는 단계
8) 생성물을 에탄올로 광범위하게 세척하여 코어 입자를 수득하는 단계
9) 코어 입자를 주변 온도에서 30분 동안 건조시키고 37℃에서 24-48시간 동안 코어 입자를 추가로 건조시키는 단계
상응하는 시스템은 다음을 포함할 수 있다:
a) 층상 그래핀;
b) 그래핀의 변형, 중합체 부착 및 후속 센서 부착을 위한 시약;
c) 초음파처리, 프로브 초음파처리, 고전단 혼합기를 사용한 물리적 분산, 분산을 위한 장치(예를 들어, 전자레인지);
d) 조립에 사용되는 그래핀의 농도를 표준화하기 위한 흡광도 측정 도구(예를 들어, Nanodrop 분광광도계); 및/또는
e) 센서를 건조하기 위한 센서 제조용 장치(예를 들어, 일부 경우에 진공 또는 건조 챔버로 보완된 오븐).
실시예 26: 본 개시내용의 바이오센서로 바이오마커를 검출하기 위한 예시적인 시스템
본 개시내용에 따른 하나 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 다음 구성요소를 포함하는 시스템으로 수행될 수 있다:
1) 나노 센서. 이것은 단일 센서 또는 다중 센서일 수 있다. 센서는 용액으로 제공되며 각 센서의 작업 용액에 대해 정의된 흡광도를 사용하여 작업 농도로 조정할 수 있다. 또는 센서는 불투명한 96 또는 384웰 플레이트에 사전에 동결건조하여 제공할 수 있다.
2) 완충액: 센서 활성은 최적의 완충액에 의해 지원된다. 이 완충액은 용액 또는 다중 웰 플레이트에서 동결건조된 케이크로 제공될 수 있다. 완충액에는 정의된 pH로 용액을 안정화시키는 성분이 포함되어 있다. 현재 구성에서 이 pH는 7.2이다. 최적의 pH는 존재하는 센서와 효소 건강 및 활성을 지원하는 데 필요한 최적의 pH에 따라 달라질 수 있다.
바람직하게는, 완충액에는 일염기성 이온도 함유될 것이다. 일염기성 용액은 효소 건강을 지원하고 입자의 분산을 지원하기 위해 이온 완충화를 제공한다. 또한, 펩타이드 구성은 일염기성 염 농도에 의해 영향을 받을 것이다.
일반적으로, 완충액에는 효소 활성에 필요한 이온이 함유될 것이다. 프로테아제 효소의 예에서, MMP는 2가 양이온을 필요로 하는 효소이므로 완충액에는 선택된 2가 양이온으로 보충된다.
추가 구성요소는, 예를 들어, 다음을 포함한다:
3) 농도 범위에서 포함된 염료로 구성된 표준 곡선. 이러한 표준 곡선은 (사용된 형광계에 따라 달라지는) 상대 형광 단위를 염료의 농도로 전환하는 데 사용될 것이다. 표준 곡선은 다중화 반응을 위한 여러 다양한 염료를 포함할 수 있었다. 따라서, 표준 곡선은 키트를 많은 다양한 플랫폼에서 사용할 수 있도록 한다. 대안적으로, 상대적 형광이 사용될 수 있다.
추가적으로 또는 대안으로, 시스템은 또한 다음을 포함할 수 있다.
4) 기능 센서의 존재를 입증하기 위한 대조군. 이러한 대조군에는 알려지고 입증된 활성을 갖는 혈청 샘플을 포함될 수 있다. 그들은 활성이 알려진 정제된 효소일 수도 있다. 그들은 펩타이드를 가수분해하여 염료를 비효소적으로 방출하도록 설계된 화학물질일 수 있다.
시스템은 다음을 추가로 포함할 수 있다:
5) 실험 기간 동안 멀티웰 플레이트를 일정한 온도로 유지할 수 있는 인큐베이터. 일부 형광계의 경우, 이 인큐베이션 기능이 포함되어 있다. 플레이트는 실험 기간 동안 또는 최대 5분 동안 25℃ 또는 37℃ 또는 41℃ 또는 45℃ 또는 50℃ 또는 55℃ 또는 60℃ 또는 60℃에서 유지될 필요가 있다.
6) 반응 동안 방출된 형광의 양을 결정하기 위한 형광계. 이 형광은 일반적으로 종점으로 측정되지만, 변화율이 1분 또는 5분 또는 15분 또는 30분 또는 60분의 간격으로 측정되도록 동역학적으로 측정될 수도 있다.
7) 정의된 애플리케이션에 특정한 알고리즘. 진단 상태를 설명하기 위해 센서 활성을 통합하려면 정의된 활동을 해석하고 샘플에 분류를 할당하는 알고리즘이 필요하다. 이 알고리즘은 애플리케이션 및 센서에 특정될 것이다.
특히 구성요소 1 내지 4 및 7)은 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 부품 키트에 포함될 수 있다.
다중 검출의 경우, 추가 고려사항은 다음과 같다: 염료 선택, 센서와 다중 염료의 조합은 염료 사이에 FRET가 없도록 보정된다. 또한, 센서를 단일 입자에 부착할지 아니면 별도의 입자에 부착하여 혼합할지 여부에 따라, 입자의 최종 농도는 반응물과 상호작용하고 반응을 구동하기에 충분한 입자가 있지만 방출된 신호를 소광시킬 정도로 그래핀 입자가 너무 많지 않도록 최적화되어야 한다. 또한, 혼합 센서의 경우, 두 효소 표적의 최적 활성을 위해 타협하는 완충액이 있어야 한다. 신호의 재현성은 모든 반응에 대한 환경을 재현하는 데에 따라 달라진다. 따라서, 분광광도계로 정의된 센서 농도뿐만 아니라 안정적인 pH와 정의된 염 농도를 가진 완충액을 제공하면 환경을 복제하고 배치 간 안정성을 지원할 수 있다(도 27 참조).
실시예 27: 시험 용액에서 바이오센서의 안정성, 재현성 신호 대 잡음 비율 및 다중 능력
gNBS 센서를 제조하는 동안, 소수층의 그래핀이 센서 시약에 공유 결합된다. 공유결합으로 조립되는 그래핀 입자는 수용액에서 분해되지 않는다. 그 결과, 입자는 수용액에서 pH 드리프트를 야기하지 않는 것으로 관찰되며, 본원에 기재된 바와 같이, 입자는 수용액에서 분산될 수 있다.
그래핀 기반 센서의 구조적 이점의 두 번째 측면은 혈청의 존재 하에 수용액에서 각 나노센서 계열의 신호 대 잡음 성능에 반영된다. 시간 0에서는 t=0에서 효소를 절단하여 어떠한 형광도 방출할 시간이 없었기 때문에 형광 신호의 상당한 방출을 예상하지 못할 것이다. 또한, 혈청을 추가하면 신호의 증가는 시스템의 감도와 일관되게 낮은 잡음에 따라 달라지므로 신호를 구별할 수 있다. FeNBS와 gNBS 모두에 대해 t=0에서 센서와 혈청으로 인큐베이션된 샘플의 관계를 평가한 결과 두 가지 차이점이 발견되었다.
완충액만 존재하는 센서를 사용하는 검정 대조군은 FeNBS에 대한 센서에 따라 60분에 걸쳐 신호가 약간 증가하는 것으로 나타났다. 이 증가는 2배 정도이다. 대조적으로 수용액에서 최대 90분 동안 유지된 gNBS는 배경 신호에 상당한 변화를 나타내지 않는다. 그러나, 초음파처리로 준비되지 않았거나 용매가 제거되지 않은 gNBS의 S:N 성능은 t=0에서 S:N이 감소하는 반면 시간이 경과함에 따라 더 낮은 신호를 생성한다. 따라서, gNBS 센서의 성능은 t=0에서 더 나은 S:N과 자극과 함께 인큐베이션에서 향상된 S:N 검출에 따라 달라진다.
보다 중요하게는, t=0에서 그래핀 NBS의 신호:잡음이 계산될 때, 샘플 형광을 검정 대조군 형광으로 나누어 측정할 때 낮은 신호 대 잡음이 관찰된다. gNBS 센서는 t=0에서 검정 대조군과 샘플 사이에 더 작은 차이를 나타낸다. t=0에서의 S:N은 프로브 초음파처리 또는 광범위한 건조를 사용하여 제조되지 않은 로트의 여러 다른 그래핀 센서에 대해 4.1 +/- 1.6 (1 S.D)이다(이들 예에서, CTSB, uPA, CTSK, CTSD, CTSE, MMP12, MMP13, MMP15, NE, MMP3, MMP9).
대조적으로, 초음파처리와 건조가 포함됨에 따라, t=0에서의 S:N은 6.9-7.6으로 증가하고 FeNBS와 크게 다르지 않다. 그러나, 혈청으로 60분 동안 자극한 후, 예를 들어, FeNBS 센서 CTSB의 경우, t=60에서 S:N은 2.0이었다. CG KSU 로트 120120으로 만든 CTSB의 경우, t=60에서 SN은 9.8이었다. HEB CTSB100의 경우 SN은 12.0이었고, HEB CTSB101의 경우 SN=18.5이었고, CTSB102의 경우 SN=27이었다. 따라서, 용매 제거 및 초음파처리가 제조에 포함되기 때문에, 이 예에서는 단일 혈청 샘플로 밝혀진 효소 활성의 양이 2.0에서 27로 증가한다.
S:N 성능 차이는 t=0 성능 및 주어진 샘플에 대해 시간 경과에 따라 생성된 상대 신호 모두에서 명백하다. 따라서, S:N은 임의의 개별 센서의 상이한 성능에 의존하지 않는다. 오히려 그것은 특정 효소 활성이 아닌 백본에 대해 일반화할 수 있다. 용매 제거 및 초음파처리의 포함을 반영하는 다양한 gNBS 로트를 사용한 단일 실험에서 FeNBS와 gNBS를 비교하였다. gNBS의 S:N 성능은 용매 제거 및 초음파처리를 반영하여 제조 프로토콜을 반복할 때마다 증가한다.
시험 용액을 정의할 때, 최적의 배합물은 센서의 안정성의 척도인 최상의 S:N 성능을 조정하고, 시간이 경과함에 따라 활성의 최상의 동역학적 증가를 나타내며, 이는 효소 활성을 위한 건강한 환경의 제공을 반영한다.
이 균형은 MES를 사용하여 7.2의 pH 환경에서 최적화되는 것으로 관찰되었다. 일염기성 염의 포함은 155 mM로 포함될 때 효소 활동을 위한 생리학적 환경을 유지하였다. 그러나, 0 mM 내지 1 M의 일염기성 염 농도 범위도 센서의 S:N에 영향을 미친다. 도 14에 보고된 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 일염기성 염 농도가 증가하면 60분에서 검정 대조군 신호를 감소시킨다. 따라서, 입자에만 기인하는 "잡음"은 염 농도가 증가함에 따라 낮아진다. 입자 잡음을 감소시키고 생리적 조건에서 효소 활성을 지원하는 농도로 155 mM을 사용하였다.
실시예 28: 가열 단계가 있는 실시양태에서 시험 용액에서 바이오센서의 안정성, 재현성 신호 대 잡음 비율 및 다중 능력
인큐베이션 전에 혈청에 적용하거나 37℃ 초과로 상승된 온도에서 검정이 수행될 때 열처리의 영향이 관찰되었다. 전형적인 센서의 경우, 본 실시예에서 MMP10에서, 검정 전에 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 열처리하면 SM/AC S:N은 열처리하지 않은 경우 1.2이고 열처리한 경우 1.3이다. 따라서, 낮은 신호 대 잡음은 열처리로 증가하지 않는다. 혈청 존재 시 인큐베이션한 후, 처리하지 않은 혈청의 신호는 90분 후 14.1 SM/AC로 증가하였다. 대조적으로, 열처리된 샘플 SM/AC는 신호 강도가 190% 증가한 26.8까지 증가하였다. 따라서, 열처리의 영향은 t=0 신호에서는 명백하지 않으면, 오히려 열처리(도 44)와 증가된 검정 온도(도 45) 모두 더 많은 효소 활성을 제공하여 측정된 동역학적 간격에 걸쳐 더 큰 신호를 초래한다. 증가된 온도(65℃)로 전처리하면 효소 활성이 평균 3.2배 증가한다. 마찬가지로 검정은 45℃에서 인큐베이션했을 때 신호는 평균 3.1배 증가했고, 41℃에서 인큐베이션했을 때 신호는 1.7 에서 1.9배 증가하였다. 이러한 변화는 모든 센서에서 관찰되었으며 측정된 활성의 증가는 온도에 따라 달라졌다. 따라서, 41℃는 37℃보다 더 많은 활성을 보였다. 45℃는 41℃보다 더 많은 활성을 보였다.
온도 조절 기능이 있는 오븐 또는 형광계에서 온도를 설정하고 유지하였다. 상승된 온도는, 상승된 온도에서 효소 동역학이 상승하여 프로테아제 활성의 검출을 개선시킨다. 또한, 증가된 온도는 입자 주변에서 관찰되고 본원에 기재된 단백질 코로나를 변형시킬 것으로 예상된다(도 46).
프로테아제 활성에 대한 개선과 온도와의 균형을 맞추는 온도 의존성의 기울기가 예상되며, 이는 침전을 유발하기 전에 혈청의 다른 단백질을 변성시킬 것이다. 검정 전 또는 검정 동안 혈청을 인큐베이션하는 것은 모두 신호 대 잡음 비율을 증가시키는데 효과적이다. 41℃ 또는 45℃ 또는 50℃ 또는 55℃ 또는 60℃ 또는 65℃ 또는 70℃ 또는 75℃의 온도 또는 이러한 목표 사이의 간격이 원하는 영향에 효과적인 것으로 간주되어 왔다.
실시예 29: 폭발 그래핀 PEI 코어 입자
아래의 예시적인 실험 절차는 폭발 그래핀을 사용하여 논의된다 [12] [58]. 그러나, 거의 모든 소수층 그래핀은 바이오센서 바이오마커 검출의 합성을 위해 사용될 수 있으며, 이와 관련하여, 사용된 그래핀 시트 또는 집합체는 물에 분산 가능한 크기(직경 1 마이크로미터 미만)이다.
폭발 그래핀은 전형적으로 5-7 층의 적층 그래핀으로 이루어진다. 각 층의 대략적인 직경은 150 nm이다. [8] 카복시그래핀을 형성하는 표면 반응은 그래핀 적층물의 두 외부 표면과 잠재적으로 일부 가장자리만을 표적으로 한다.
폴리에틸렌 이민은 카복시그래핀 표면에서 카복실산기에 공유 결합될 수 있다(카복실산기의 밀도: pH 적정에 따라 그램당 1.76 ± 0.6 x 10-4 몰 -COOH기).
실시예 30: 그래핀 입자에 부착된 중합체 또는 다른 유기 또는 무기 구조의 특성화 특징
폴리에틸렌 이민은 매우 친수성이다(컨센서스 log P = -1.94, H2O 1 리터당 1.2 x 105 그램 초과의 수용해도, 이는 그래핀 입자를 수성 완충액에 분산시키는 데 필요함). [59]
원칙적으로, 컨센서스 log P < 0 또는 H2O 1 리터당 1.0 x 103 그램 초과의 수용해도를 특징으로 하는 올바른 크기의 모든 중합체를 부착할 수 있다. [23] 그래핀의 광물리적 특성[53]은 부착된 유기 형광단, 금속 입자 및 양자점을 최대 20 nm의 거리에서 소광할 수 있으며, 이는 알려진 다른 에너지 전달 거리(푀르스터 공명 에너지 전달(FRET) 및 플라즈몬 소광)보다도 더 크다. [53]
결과적으로, 부착된 중합체 층 + 함께 부착된 컨센서스 서열의 직경은 20 nm를 초과하지 않는다. 그렇지 않으면, 부착된 형광단의 형광은 효소 방출 시 증가하지 않을 것이다. 이 추정에 적용 가능한 도 50으로 보고된 에멀젼 중합체에 대한 분자량 대 입자 직경(Loebach (1975), 도 1 [60])의 플롯에 따르면, 최대 20 nm의 직경을 특징으로 하는 중합체의 허용 질량 범위는 0.5 내지 1.7 x 106 (Mn) 내지 0.5 내지 3.0 x 106 (Mw)이다. 그러나, 직경이 최대 20 nm까지 늘어날 수 있으므로 더 작은 중합체를 사용할 수도 있다.
실시예 31: 펩타이드의 부착
펩타이드는 크기에 따라 올리고펩타이드(2-20개 잔기)와 폴리펩타이드(20개 초과 잔기)로 분류할 수 있다. 단백질은 길이가 50개를 초과하는 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. [61] 펩타이드의 평균 길이는 펩타이드의 2D 구조(알파 나선 또는 무정형)에 따라 아미노산당 0.35 내지 0.40 nm로 추정할 수 있다. [61] 베타 시트를 형성하는 펩타이드는 효소 절단 시 방출 동역학이 매우 느리기 때문에 바이오센서 설계에 적합하지 않다는 점에 주목한다. 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드는 2D 구조에 따라 길이가 17.5 내지 20 nm이다. 또한 이러한 펩타이드에는 펩타이드를 그래핀 또는 그래핀이 부착된 유기 또는 무기 쉘의 표면에 고정하거나 형광단(유기 염료 또는 나노구조)을 부착하기 위해 비천연 아미노산을 사용할 수 있다는 점에 주목해야 한다.
도 51은 프로테아제 활성 검출을 위한 그래핀 바이오센서에서 펩타이드 길이(A)와 중합체 층 두께(B)의 허용 가능한 비율을 나타낸다. 최대 층 두께(펩타이드 + 중합체)는 20 nm를 초과할 수 없다. 사이토카인/케모카인 및 아르기나제 검출용 그래핀 바이오센서에서, 층 두께는 표적에 결합하거나 번역 후 변형되기 전에 20 nm에 가깝다. 두 사건 모두 펩타이드 서열을 연장하여 테더링된 형광단으로부터 형광 증가를 야기한다.
원칙적으로 그래핀 입자는 무기 수용성 쉘(예를 들어, 메조다공성 실리카 나노층)로 둘러싸일 수 있다.[62] 이 경우, 유기 및 무기 나노층의 두께 요건은 동일하다: 메조다공성 실리카 쉘 + 펩타이드 서열의 최대 직경은 20 nm보다 작거나 같아야 한다.
실시예 32: 부착 유기 분자
작용기를 나타내는 유기 및 무기 화합물은 하나 이상의 상응하는 작용기를 나타내도록 화학적으로 변형된 그래핀 표면에 부착될 수 있다.
예를 들어, 수용성 유기 분자의 단일층, 예를 들어, OH 작용기를 나타내는 올리고에틸렌 글리콜은 니트렌기를 첨가하여 변형된 그래핀을 얻고 NH2 작용기를 나타냄으로써 변형된 그래핀의 표면에 테더링될 수 있다.
중합체 대신에, 예를 들어 올리고에틸렌 글리콜과 같은 수용성 유기 분자의 단일층이 도 52에 나타낸 바와 같이 그래핀 표면에 테더링될 수 있다. 원칙적으로, log P 및 수용해도에 대한 요건은 유기 중합체와 동일하다.
분자 모델링(Chemdraw 3D)에 따르면, 아미노-테트라에틸렌 글리콜 아지드(NH2-TEG-N3)의 최대 직경은 1.5 nm임에 주목한다. 따라서, 이러한 예시적인 실시양태에서 테트라에틸렌 글리콜 단위의 크기는 1.4 nm이다. 따라서, 글리콜 단위(-O-CH2-CH2-)의 수는 58개 미만으로 총 길이가 20 nm를 초과하지 않도록 한다.
그래핀 입자를 코팅하여 센서를 구성할 때, 올리고펩타이드의 길이는 올리고에틸렌 옥사이드 테더의 길이에서 빼야 할 것이다.
원칙적으로, 20 nm 에너지 전달 소광 거리 요건을 충족하는 한, 그래핀의 표면에 부착될 수 있고 필요한 수용해도(log P < 0 또는 H2O 1 리터당 1.0 x 103 그램 초과의 수용해도) [23]를 준수하는 모든 선형 또는 분지형 분자를 사용할 수 있음에 주목한다.
당업자는 그래핀 표면의 작용기에 상응하는 작용기를 나타내는 상이한 유기 또는 무기 물질에 대해 상기 실시예를 변형할 수 있을 것이다. 특히, 코팅 물질 및 펩타이드 연결의 구성이 20 nm 에너지 전달 소광 거리 요건을 준수하는 한, 당업자는 그래핀 표면에 부착될 수 있고 수성 용매에서 목표 분산성(1 mL당 0.1 mg 초과)을 달성하는
임의의 선형 또는 분지형 분자와 관련 그래핀 코어 입자가 본 개시내용의 바이오센서를 제공하는 데 사용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
실시예 33: 카복시그래핀(CG)의 적정
250 mg의 카복시그래핀(CG)을 50 mL의 0.05 M NaOH(HPLC 물을 사용하여 제조하고 2시간 동안 아르곤으로 탈기시킨 NaOH 용액)에 분산시켰다. 카복시그래핀 현탁액을 10분 동안 초음파처리하고, 300 K에서 24시간 동안 교반하였다. 24시간 교반한 후, 현탁액을 여과하여 카복시그래핀을 제거하고, 모든 용액(카복시그래핀 여과 용액, 0.05 M HCl 및 0.05 M NaOH)을 아르곤으로 밤새 탈기시켰다. 다음 날 적정을 시작하기 전에, 표준 pH 용액을 사용하여 pH 측정기를 보정하였다. 20 mL의 0.05 M HCl을 카복시그래핀 여과 용액으로부터 10 mL 분취량에 첨가하고, 0.05 M NaOH로 역적정하였다(증분 단계에 첨가). NaOH의 다음 첨가 전에 pH 측정기가 안정화된 후 NaOH를 각각 첨가한 후 pH를 기록하였다. 블랭크 적정의 경우, 카복시그래핀과 동일한 방법으로 10 mL의 0.05 M NaOH를 제조하고 20 mL의 0.05 M HCl을 첨가하고, 0.05 M NaOH로 역적정하였다.
~7.00의 동일한 pH 값에 대한 두 적정 곡선에서 NaOH 부피의 차이는 도 53에 나타낸 바와 같이 카복시그래핀의 중량 증분당 이온화된 기(카복실기)의 농도를 제공한다.
카복시그래핀 여과 용액과 블랭크 모두에 대해 적정 동안 아르곤을 사용한 탈기가 유지되었다는 것을 언급해야 한다.
~7.00의 동일한 pH 값에 대한 두 적정 곡선에서 HCl 부피의 차이는 카복시그래핀의 중량 증분당 이온화된 기(카복실기)의 농도를 제공한다. 이 적정 곡선은 1.765 x 10-4 및 1.8 x 10-4 mol/g의 산성 기(-COOH)가 있음을 나타낸다(즉, nm2당 4개의 -COOH 기의 표면 밀도).
실시예 34: 신호 대 잡음 비율
신호 대 잡음 비율을 증가를 담당하는 구조적 특징은 프랙탈 그래핀과 테더링된 검출 가능한 모이어티 형광 염료(TCPP 및 더 높은 형광 양자 수율을 갖는 기타 염료)의 그래핀 표면으로부터 20 nm 미만의 거리를 유지하도록 구성된 코팅 및 펩타이드 연결을 포함하도록 바이오센서를 구성하는 것을 포함한다.
대부분의 컨센서스 서열은 13개의 아미노산 잔기를 특징으로 하며, 그 길이는 5 ± 1 nm가 된다. 공유결합으로 부착된 PEI 층의 두께는 10 nm이다. 결과적으로, TCPP 형광단의 평균 위치는 20 nm의 임계값보다 훨씬 낮다.
본원에 기재된 바이오센서로 달성할 수 있는 신호 대 잡음 비율의 추가 예는 실시예 19(도 33 및 도 35 및 명세서의 관련 부분 참조), 실시예 28(도 46 및 명세서의 관련 부분 참조) 및 실시예 46(도 54 및 명세서의 관련 부분 참조)에 예시되어 있다. 이들 실시예는 그래핀 표면과 테더링된 형광단 사이의 거리를 20 nm 미만으로 유지하는 모든 실시양태의 작동성을 나타내며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
실시예 35: 바이오센서용 코어 그래핀 입자의 제조 방법
본 개시내용에 따른 코어 입자를 제조하기 위한 예시적인 절차:
단계 1: 필요한 UV/Vis 흡수 거동(UV로부터 중적외선(100 내지 1500 nm)까지의 강한 방출)을 확보하기 위해 디토네이션 그래핀 또는 소수층 그래핀을 선택하는 단계.
단계 2: 그래핀 입자를 수성 완충액에 분산 가능하게 만들기 위해, 예를 들어, 유기 또는 무기 쉘을 포함하는 등 그래핀 표면의 화학적 변형을 수행하는 단계.
생성된 유기 또는 무기 쉘은 그래핀의 소광 특성으로 인해 직경이 20 nm 미만인 크기를 갖는다.
생성된 입자의 주요 특성화 단계는 다음과 같다:
단계 1: UV/Vis 흡수 분광법, 클로로포름에서 200 내지 1500 nm 범위; 물질이 그래핀인지를 확인하기 위한 RAMAN 및 XRD, 물질이 98++ 탄소인지를 확인하기 위한 원소 분석, 그래핀 나노플레이크의 크기 분포를 확인하기 위한 TEM, 그래핀의 프랙탈 특성을 확인하기 위한 SEM.
단계 2: 그래핀 주변의 유기 또는 무기 쉘의 작용기를 특성화하기 위한 FTIR, 물질이 그래핀인지를 확인하기 위한 RAMAN 및 XRD, 그래핀 코어 + 쉘의 화학적 조성을 확인하기 위한 원소 분석, 그래핀 나노플레이크의 크기 분포를 확인하기 위한 TEM, 그래핀의 프랙탈 특성을 확인하기 위한 SEM. 고체 상태 NMR은 그래핀 내에 수소 원자가 없기 때문에 교차 분극이 사용될 때 쉘만의 화학적 구성을 보여준다. [63]
실시예 36: 본 개시내용의 바이오센서의 제조 방법
본 개시내용의 바이오센서를 제조하기 위한 예시적인 절차는 다음 단계를 포함한다:
단계 1: 필요한 UV/Vis 흡수 거동(UV로부터 중적외선(100 내지 1500 nm)까지의 강한 방출)을 확보하기 위해 디토네이션 그래핀 또는 소수층 그래핀을 선택하는 단계.
단계 2: 유기/무기 쉘을 포함시켜 수성 완충액에 분산될 수 있도록 그래핀 표면의 화학적 변형을 수행하는 단계. 생성된 유기 또는 무기 쉘은 그래핀의 소광 특성으로 인해 직경이 2 0 nm 미만이어야 한다.
단계 3: 필요한 펩타이드 서열을 합성하고 펩타이드 서열의 N-말단 단부에 형광단을 추가한다. 이어서, 수지로부터 펩타이드 + 형광단이 절단된다.
단계 4: 펩타이드 + 형광단을 유기 또는 무기 쉘에 부착한다.
실시예 37: 본 개시내용의 바이오센서로 바이오마커를 검출하는 방법
본 개시내용의 방법에 따라 바이오마커를 검출하기 위한 예시적인 방법은 다음을 포함한다:
1) 그래핀에 부착된 형광단의 최적 범위를 선택하는 단계. 펩타이드 + TCPP의 최적 농도는 100 mg의 카복시그래핀에 대해 7.3 mg이었다. 그 결과 카복시그래핀-PEI 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰의 펩타이드 + TCPP(형광단)가 생성된다. 그보다 높은 로딩에서 효소 동역학에 대한 입체 간섭으로 인해 바이오센서는 상당히 느리게 반응한다. 상한(활성 프로테아제 1 x 10-10 몰 L-1의 존재 시 활성이 1시간 이내에 검출될 수 없을 때)은 카복시그래핀-PEI 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰 펩타이드+TCPP(형광단)이다. 하한(신호 소실)은 카복시그래핀-PEI 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-7 몰 펩타이드 + TCPP(형광단)이다.
2) 정의된 수성 완충액에 바이오센서를 분산시키는 단계. 바이오센서 용액의 최적 농도 범위는 1 mL당 0.1 내지 0.03 ㎎이며, 1 mL당 0.3 ㎎이 가장 높은 형광 강도를 나타낸다.
3) 정의된 완충액에 액체 생검(혈액, 혈장, 혈청, 타액, 기관지 폐포 세척액, 호기 호흡 응축물)을 첨가하는 단계. 표적 효소 또는 단백질의 농도는 펨토몰 이하(10-16 몰 L-1) 내지 마이크로몰(10-6 몰 L-1) 범위여야 한다.
4) 분산된 바이오센서 + 액체 생검을 정의된 온도에서 정의된 시간 동안 인큐베이션하거나, 정의된 온도 또는 온도 간격에서 시간에 따른 형광의 증가를 기록하는 단계
단백질 분해 활성 측정을 위한 모든 바이오센서는 고도로 선택적인 컨센서스 서열을 특징으로 한다. 아르기나아제 측정을 위한 바이오센서는 펩타이드를 연장시키는 번역 후 변형(합성 후 변형: 아르기닌에서 오르니틴으로)에 의존한다. 표적 펩타이드가 단백질 수용체에 결합하면 전자의 길이도 연장된다. 형광단과 그래핀 사이의 모든 거리 증가는 그래핀으로부터 20 nm의 거리를 초과하는 경우 형광(및 후속 활성 검출)의 증가로 이어진다. 그렇지 않으면, 형광 소광이 지배적일 것이다.
실시예 38: 본 개시내용의 바이오센서로 바이오마커를 다중 검출하는 방법
원칙적으로, 분산된 바이오센서의 농도 범위와 액체 생검의 준비는 하나 또는 여러 종의 검출에 대해 동일하다. 동역학적 양상(효소가 펩타이드 서열에 도달해야 함)으로 인해, 그래핀 표면에서 펩타이드 + 형광단의 최대 밀도를 증가시킬 수 없다.
상기 논의된 바와 같이, 펩타이드 + TCPP(형광단)의 가능한 최고 농도는 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰이고, 최적 농도(펨토몰에서 마이크로몰 프로테아제 작용 농도 범위에서 가장 빠른 신호 증가)는 카복시그래핀-PEI 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰의 펩타이드 + TCPP(형광단)이다. 멀티태스킹을 달성하기 위해 여러 펩타이드 서열 + 다른 형광단을 사용하는 경우, 최적의 반응 동역학을 보장하기 위해 이들 분획은 카복시그래핀-PEI 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰의 펩타이드 + TCPP(형광단)까지 추가해야 한다. 더 느린 센서의 경우, 펩타이드 + 다른 형광단의 총 농도(모든 분획)는 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰이다.
그래핀 주위의 쉘에 펩타이드 + 형광단보다 더 많은 것을 부착하는 방법은 1) 단계적 첨가, 2) 모든 펩타이드 + 형광단을 병렬로 첨가하는 방법을 포함한다. 두 접근법 모두의 경우, 화학물질 첨가 조건이 최적화되어야 한다.
여러 펩타이드 + 형광단을 화학적으로 부착한 후 여러 세척 절차(DMF에서 3회 재분산 후 원심분리 후, 디메틸 에테르에서 3회 재분산 + 원심분리 후, 아르곤 하에 40℃에서 24시간 동안 건조)를 거친다. 멀티태스킹 바이오센서를 분석에 사용되는 완충액에 분산시키고, 부착된 형광단의 농도를 분석 완충액에서 동일한 염료의 보정 곡선을 사용하여 UV/Vis 흡수 분광법으로 측정한다.
또한, 그래핀의 표면 전하를 감소시키기 위해 추가 변형을 수행하여 상기 기재된 기능화 대신에 또는 이외에 양이온성 중합체를 결합시키는 데 적합하도록 할 수 있다.
실시예 39: 그래핀 입자의 특징 및 바이오센서의 추가 구성요소
그래핀을 수분산성으로 만들고/하거나 앵커링을 허용하는 모든 표면 반응 또는 충분한 수용성(컨센서스 log P < 0, 또는 H2O 1 리터당 1.0 x 103 그램 초과의 수용해도[23])의 유기 리간드 또는 중합체가 적합하다. 메조다공성 실리카와 같은 대안적인 무기 쉘을 사용하여 그래핀을 분산시킬 수도 있다.
유기 또는 무기 코팅에 대한 가장 중요한 인자는 수용해도, 펩타이드 + 검출 가능한 모이어티 성분을 부착하기 위한 작용기의 존재, 그리고 부착 시 형광단의 소광을 용이하게 하기 위해 그래핀 주위의 20 nm 미만 두께의 요건이다.
펩타이드 연결과 관련하여, 특이성은 사용된 펩타이드 서열로부터 발생한다. 수지 상에 있는 동안 펩타이드의 N-말단 위치에 다른 형광단이 부착된다. 대안적으로, 형광단을 C-말단 단부에 부착할 수도 있지만, 이 방법은 더 복잡하고 비용이 많이 든다(그러나 실행 가능하다).
다중화는 액체 생검의 효소 및 단백질과 각각의 공동 부착된 펩타이드의 상호작용에 의해 달성되는데, 왜냐하면 프로테아제 및 그 각각의 컨센서스 서열과 일치하는 경우 절단 및 후속 형광 증가가 훨씬 더 빠르게 일어나기 때문이다. 펩타이드 서열과 각각의 단백질 표적을 표적화하는 성공적인 결합 사건에 대해서도 마찬가지이다.
부착된 염료로부터의 형광 이외에, 추가의 검출 가능한 신호는 다음을 포함한다:
1) 부착된 나노구조체와 염료로부터의 인광
2) 원칙적으로, 여기는 다광자 여기에 의해 달성될 수 있음
3) 부착된 나노구조체와 염료로부터의 광음향 시그니처
4) 그래핀 표면에서 절단되어 분석될 방사성 동위원소
5) 높은 스핀 d- 또는 f-블록 금속을 가진 산화물로 덮여있거나 다른 안정한 라디칼에 공동 테더링된 그래핀으로부터 방출될 안정한 라디칼(EPR 프로브).
6) 높은 스핀 d- 또는 f-블록 금속 양이온 또는 초분자적으로 결합된 높은 스핀 d- 또는 f-블록 금속 양이온을 가진 산화물로 덮인 그래핀으로부터 방출될 MRI 프로브.
실시예 40: 분산 및 용매 제거가 그래핀 바이오센서의 흡광 효율에 미치는 영향
KSU 프로토콜, KSU 프로토콜의 HEB 복제, 초음파처리된 프로토콜(로트 3) 및 용매 오염을 제거한 초음파처리된 프로토콜(로트 4)을 반영하는 나노센서의 로트 1, 2, 3 및 4를 반영하는 그래핀 바이오센서의 용액을 각각 155 mM NaCl을 함유하는 5 mM MES pH 7.4에서 작업 용액으로 준비하였다. 센서를 25 μg/mL의 농도로 준비하였다. 작업 용액을 준비하고 워터 배스에서 용액 1 mL당 1분 동안 초음파처리하였다. 샘플은 2 μL를 3회 샘플링하기 직전에 한 번 볼텍싱하였다. 나노드롭에서 250 nm에서 650까지의 흡광도를 측정하여 흡광도를 설정하였다. 이어서, 샘플을 어떠한 교반도 하지 않고 1시간 동안 그대로 두었다. 60분 후, 센서 용액에 50% 깊이까지 담긴 피펫 팁으로 2 μL 샘플을 채취하였다. 이 t=60 샘플에 대해 흡광도 스펙트럼을 반복하였다. 그래프는 NE 및 MMP15 바이오센서의 4개 로트 각각에 대한 흡광도 스펙트럼을 보여준다. 흡광 효율은 바이오센서 1 mg/ml당 260 nm에서의 흡광도로 계산된 표에 표시되어 있다. 분석은 센스가 준비 동안 초음파 처리되고 용매를 제거하기 위해 건조됨에 따라 센서의 흡광도가 증가하는 것을 보여준다. 이러한 관찰은 측정된 바이오센서에 의존하지 않는다. (도 55 참조).
실시예 41: 완충액 배합물이 그래핀 바이오센서의 신호 대 잡음 성능에 미치는 영향
uPA 나노센서의 용액은 물에 300 μg/ml의 10배 작업 농도로 준비하였다. 이 용액을 초음파처리 워터 배스에서 10분간 초음파처리하였다. 나노센서는 도 14에 보고된 각각의 상이한 완충액 배합물에서 1:10으로 희석되었다. 125 μl 바이오센서 용액을 검은색 96 웰 플레이트에 복제하여 분배하였다. 5 μL 혈청을 추가하고 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 방출된 형광은 VarioSkan Lux 플레이트 판독기에서 421 nm 여기 및 650 nm 방출로 판독되었다. 검정에는 혈청 대신 5 μl의 적절한 완충액을 첨가한 분석 대조군이 포함되었다. 바이오센서는 2개의 상이한 정상 건강 공여자 혈청 샘플 또는 풀링된 정상 혈청(PNS)과 함께 인큐베이션되었다. 완충액 1은 원래 배합물이었다. 프로테아제 활성은 모든 완충 조건에서 관찰되었다. S:N은 SM/AC 비율을 보여주는 S:N의 추정치로서 도 56(uPA 바이오센서)에 보고되어 있다. NaCl이 포함된 완충액이 배경 신호와 혈청 신호를 모두 현저히 낮추는 것으로 나타났다. AC를 감소시키는 것은 gNBS의 신호 대 잡음 성능을 높이는 역할을 한다. NaCl이 포함된 완충액 7과 8은 원래 완충액에 비해 AC 성능이 현저히 감소하였다. 이로 인해 SN 성능이 증가하였다.
실시예 42: 완충액 배합물 및 열처리가 그래핀 바이오센서의 신호 대 잡음 성능에 미치는 영향
18가지 바이오센서의 작업 용액을 10 μM 2가 양이온 및 155 mM NaCl로 보충된 HEPES 또는 MES 완충액에서 준비하였다. 샘플을 65℃에서 12분 동안 열처리(MES 기준선)하거나 열처리하지 않고(HEPES 기준선) 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 90분 후, 방출된 형광을 VarioSkan Lux에서 평가하고 SM/AC에 따라 S:N 성능을 계산하였다. 일염기성 염 이온을 추가하기 위한 프로토콜 변경의 영향, MES 완충액을 사용한 보다 강력한 pH 제어는 VarioSkan 플랫폼에서 AC를 평균 0.10 RFU 이하로 감소시키는 것으로 나타났다. 더 낮은 AC 이외에 보다 안정적인 pH 제어는 HEPES 기준선보다 평균 4배 증가된 S:N 계산을 생성하였다(도 57 참조).
실시예 43: 그래핀 바이오센서의 콜로이드 안정성
KSU 프로토콜, KSU 프로토콜의 HEB 복제, 초음파 처리된 프로토콜(로트 3) 및 용매 오염을 제거하는 초음파처리된 프로토콜(로트 4)의 로트 1, 2, 3, 4를 반영한 NE 또는 MMP15 그래핀 바이오센서 용액을 각각 155 mM NaCl을 함유하는 5 mM MES pH7.4의 작업 용액으로 준비하였다. 센서를 25 μg/mL의 작업 농도로 준비하였다. 비교기로서 동일한 완충액을 사용하여 300 μg/mL의 작업 농도로 Fe 바이오센서 제제도 준비하였다. 작업 용액을 준비하고 워터 배스에서 용액 1 mL당 1분 동안 초음파처리하였다. 샘플은 2 μL를 3회 샘플링하기 직전에 한 번 볼텍싱하였다. 나노드롭에서 250 nm에서 650까지의 흡광도를 측정하여 흡광도를 설정하였다. 이어서, 샘플을 어떠한 교반도 하지 않고 1시간 동안 그대로 두었다. 60분 후, 센서 용액에 50% 깊이까지 담긴 피펫 팁으로 2 μL 샘플을 채취하였다. 이 t=60 샘플에 대해 흡광도 스펙트럼을 반복하였다. 성능은 OD270 또는 OD650에서 흡광 효율의 백분율 변화로 표시된다.
분석은 각 로트 준비와 함께 60분에 걸쳐 흡광도의 감소하는 변화에 반영된 용매를 제거하기 위해 준비 동안 초음파처리되고 건조됨에 따라 센서의 안정성이 증가하는 것을 보여준다. 이 관찰은 측정된 바이오센서에 의존하지 않는다. (도 58).
실시예 44: 그래핀 바이오센서의 다양한 제조 프로토콜에 대한 신호 대 잡음 평가
KSU 프로토콜, KSU 프로토콜의 HEB 복제, 초음파처리된 프로토콜(로트 3) 및 용매 오염을 제거하는 초음파처리된 프로토콜(로트 4)의 로트 1, 2, 3, 4를 반영한 NE, CTSB 또는 MMP12 그래핀 바이오센서의 용액을 각각 155 mM NaCl 및 10 μM 2가 양이온을 함유하는 5 mM MES pH7.4의 작업 용액으로 준비하였다. 센서를 25 μg/mL의 작업 농도로 준비하였다. 비교기로서 동일한 완충액을 사용하여 300 μg/mL의 작업 농도로 Fe 바이오센서 제제도 준비하였다. 같은 날 동일한 혈청으로 바이오센서를 자극하였다(도 59의 패널 A, B, C 및 도 59의 패널 D).
45℃에서 60분 후 방출된 형광을 VarioSkan Lux에서 측정하였다. 서로 다른 날에 4개의 바이오센서에서 초음파처리(로트 3 및 4)와 용매 제거(로트 4)의 영향이 t=60 S:N을 명확하게 보여주고 증가시켰다. (t=60 RFI(도 59, 패널 B 및 도 61) 참조). 자극을 받지 않은 그래핀 나노센서와 Fe 나노센서의 안정성을 파악하기 위해, 시간 0과 시간 60에서 S:N의 비율도 계산하였다. 세 가지 다른 측정에서 세 가지 다른 바이오센서의 경우, t=60/0 S:N 비율은 로트 3과 로트 4에서 크게 증가하였다(도 59, 패널 C 및 D). 모든 배열이 Fe 바이오센서보다 더 강력한 S:N 성능을 생성하는 것으로 나타났다(도 61).
실시예 45: 그래핀 바이오센서를 위한 다양한 제조 프로토콜에 대한 신호 대 잡음 평가
형광 염료 FAM으로 표지된 TCPP 및 NE로 표지된 CTS-K용 그래핀 바이오센서의 용액은 10 μM 2가 양이온 및 155 mM NaCl, pH 7.25를 포함하는 10 mM MES 용액에서 각각 50 μg/ml로 구성되었다. CTSK-TCPP 바이오센서의 용액을 부피 비율로 혼합하여 5% NE-FAM, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% 또는 100% NE-FAM 바이오센서의 혼합물을 생성하였다. 70 μL의 각 혼합물을 384웰 플레이트에서 10 μL 풀링된 정상 혈청으로 3회 자극하고 45℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후 422/650 및 496/526 nm에서 형광을 측정하여 각각 TCPP 및 FAM을 검출하였다.
데이터를 분석하여, 알려진 센서의 혼합물에 기초하여 센서의 각 희석에서 검출 가능한 신호의 백분율을 결정하였다. 그래프는 TCPP에 대한 예상 신호와 관찰된 신호를 보여준다(도 60).
다른 센서에 대해 독립적으로 별도의 신호를 생성하는 경쟁 센서에서 센서를 1:20으로 희석한 경우에도 TCPP 또는 FAM 표지된 센서의 매우 효율적인 검출이 관찰되었다.
이러한 결과는 다중 반응에서 1:20 혼합물로 존재하는 센서를 안정적으로 검출할 수 있다는 결론을 뒷받침하며, 이는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같다.
실시예 46: 그래핀 기반 바이오센서의 합성: G-PEI 및 G-TEG3아민
2개의 상이한 절단 가능한 펩타이드 서열을 2개의 상이한 염료로 표지하고, MMP-9(GAGVPLS-LYSGAG) (서열번호: 132)는 TCPP로 표지하고, 제2 MMP-9(GCDDHAAG-LLGLDG) (서열번호: 132)는 로다민 B로 표지하였다. 이들은 다음 프로토콜에 따라 그래핀 기반 바이오센서인 G-PEI 및 G-TEG3아민에 부착하였다.
25 mg의 카복시그래핀-PEI 또는 그래핀-TEG3아민을 초음파처리하여 작은 유리 바이알에서 4 mL의 DMF에 현탁하였다. 이어서, 각 바이알에 대해 2.5 mg의 DMAP, 2.5 mg의 EDC, ~1.75 mg의 TCPP 및 로다민 B 표지된 펩타이드를 첨가하였다. 샘플을 5분 동안 초음파처리하고 실온에서 밤새 교반하였다.
다음 날, 각 바이오센서를 원심분리(7000 rpm에서 5분)를 통해 수집하고 DMF로 2회 세척하고 디에틸 에테르로 3회 세척하였다.
각 바이오센서를 3개의 상이한 대조군 혈청 샘플과 함께 인큐베이션하여 37℃에서 60분에 걸쳐 인큐베이션하여 TCPP(425 nm 여기 및 650 nm 방출) 및 로다민 B(535 nm 여기 및 570 nm 방출) 모두에 대한 형광 강도를 측정하였다.
도 54는 60분 인큐베이션 기간 내에 두 바이오센서 모두에 대해 15분마다 측정된 형광 강도를 나타낸다. 결과는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 상응하는 형광단 모두에 대해 형광 강도가 증가하여 각 대조군 혈청 샘플과 함께 인큐베이션된 G-PEI 및 G-TEG3아민 바이오센서 모두에 대해 60분에서 가장 높은 강도에 도달함을 입증하였다. 이러한 결과는 2개의 상이한 형광단을 사용한 두 바이오센서의 성공적인 조립을 입증하였다.
실시예 47: 다중 센서 제조 방법
다중 그래핀 바이오센서는 단계적 첨가 또는 경쟁적 합성에 의해 제조될 수 있다.
UV/Vis/Near IR 범위의 최대 수는 가상 비중첩 여기 및 방출 스펙트럼의 요건으로 인해 10이다.
그래핀을 둘러싼 쉘에 테더링된 올리고펩타이드의 최적 밀도는 바이오센서 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰 펩타이드 + 형광단이다. 그보다 높은 로딩에서 효소 동역학에 대한 입체 간섭으로 인해 바이오센서는 상당히 느리게 반응한다. 상한(활성 프로테아제 1 x 10-10 몰 L-1의 존재 시 활성이 1시간 이내에 검출될 수 없을 때)은 바이오센서 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-3 몰 펩타이드 + 형광단이다. 하한(신호의 소실)은 바이오센서 그램당 1.0 ± 0.25 x 10-7 몰 펩타이드 + 형광단이다.
멀티태스킹 센서의 합성은 다음과 같이 달성될 수 있다:
1) 그래핀 주위 쉘에 최대 10개의 상이한 펩타이드 + 형광단의 경쟁적 결합. 결합은 동일한 시간 간격 동안 형성된다. 펩타이드 + 형광단의 결과 분포는 통계적이다.
2) 각각의 펩타이드 + 형광단을 별도로 첨가한 후 정제한다.
두 접근법 모두 첨가되는 시약의 농도 및 반응 시간 측면에서 최적화될 수 있다. 경쟁적 합성은 시간 소모가 적다.
실시예 48: 표적 바이오마커에 대한 특이적인 펩타이드 연결을 확인하기 위한 일반 프로토콜:
프로테아제에 대한 컨센서스 서열에 대한 원본 정보는 데이터베이스 MEROPS로부터 얻는다 [64]. 모든 프로테아제에 대해 최대 25개의 상이한 컨센서스 서열 후보가 구축된다. 폴란드 바르샤바 대학의 Kolinski 연구 그룹이 제공하는 컴퓨터 서비스인 CAPS-dock을 사용하여 인간 프로테아제의 활성 센터에 가장 잘 맞는 컨센서스 서열을 선택할 수 있었다 [65].
CABS-dock은 펩타이드의 완전한 유연성과 수용체 백본의 작은 변동을 허용하는 도킹 검색 및 선호 결합 부위 결정을 수행한다. CABS-dock 시뮬레이션은 최적화가 완료되면 단백질 데이터 뱅크(PDB) 호환 좌표로 되돌아가는 거친-과립화 단백질 모델을 사용하여 수행된다.
키나아제의 경우, 인산화 부위 부근의 관련 펩타이드 서열은 UNIPROT로부터 이용할 수 있다. 사이토카인/케모카인의 경우, 사이토카인/케모카인 수용체의 구조는 UNIPROT로부터 이용할 수 있다. CAPS-dock을 사용한 도킹 실험은 더 강한 결합 올리고펩타이드를 찾기 위해 이러한 수용체에서 관련 아미노산의 점 돌연변이를 안내할 수 있다. 모든 인실리코 유래 올리고펩타이드는 바이오센서에서 시험된다.
요약하면, 본원에는 바이오센서 및 관련 코어 입자, 조성물, 방법 및 시스템을 제공하는데, 여기서는 하나 초과의 순수 그래핀 시트가 유기 또는 무기 물질의 코팅층으로 코팅되어 코어 그래핀 입자를 제공하고, 여기서 검출 가능한 모이어티 및 펩타이드 연결을 포함하는 검출 가능한 성분은 펩타이드 연결의 결합을 통해 부착된다.
상기 기재된 실시예는 당업자에게 본 개시내용의 바이오센서, 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템의 실시양태를 만들고 사용하는 방법에 대한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제공된 것이며, 발명자들이 그들의 개시내용으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 당업자는 청구범위의 다양한 실시양태 및 범위에 따라 표적 화합물 제거제, 핵산 제거제, 고체 매트릭스 및 장치에 기초하여 예시된 바이오센서, 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템의 특징을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
배경, 요약, 도면의 간단한 설명, 상세한 설명 및 실시예를 포함하여 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자의 수준을 나타낸다.
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본 개시내용에서 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 그러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시되고 설명된 특징의 등가물 또는 그 일부를 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 개시내용의 재료, 조성물, 시스템 및 방법의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인지된다. 따라서, 본 개시내용의 바이오센서, 코어 입자, 재료, 조성물, 방법 및 시스템이 실시양태, 예시적 실시양태 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 설명되었지만, 본원에 기재된 개념의 변형 및 변경이 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 이를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명시하지 않는 한 복수 참조 대상을 포함한다. "복수"라는 용어는 내용에 달리 명시되지 않는 한 둘 이상의 대상을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용에서 마쿠시 그룹 또는 기타 그룹이 사용되는 경우, 그룹의 모든 개별 구성원과 그룹의 모든 조합 및 가능한 하위 조합이 개별적으로 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도되었다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재되고 예시된 구성요소 또는 재료의 모든 조합은 본 개시내용의 재료, 조성물, 시스템 및 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 특별히 예시된 것 이외의 방법, 장치 요소 및 재료가 과도한 실험에 의존하지 않고도 본 개시내용의 재료, 조성물, 시스템 및 방법을 실시하는 데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 이러한 방법, 장치 요소 및 재료의 모든 당업계에 알려진 기능적 등가물은 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도되었다.
또한, 본 설명은 또한 본 개시내용의 다양한 실시양태와 관련된 특정 파라미터를 정량화하기 위해 수치 범위를 사용한다. 예를 들어, 온도 범위, 주파수 범위, 시간 범위 또는 조성물 범위와 같이 본 명세서에서 범위가 제공될 때마다, 모든 중간 범위 및 모든 하위 범위뿐만 아니라, 주어진 범위에 포함된 모든 개별 값이 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도된다. 특히. 수치 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위는 범위의 하한값만을 인용하는 청구범위 제한뿐만 아니라 범위의 상한값만을 인용하는 청구범위 제한을 문자 그대로 지원하는 것으로 해석되어야 한다는 점을 이해해야 한다. 예를 들어, 약 10 내지 약 100의 개시된 수치 범위는 "약 10 초과"(상한 없음)를 인용하는 청구항과 "약 100 미만"(하한 없음)을 인용하는 청구항에 대한 문자적인 지원을 제공한다.
본원에 개시된 범위 또는 그룹의 임의의 하나 이상의 개별 구성원은 본 개시내용의 청구범위로부터 제외될 수 있다. 본원에 예시적으로 기재된 개시내용은, 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들이 없이 적합하게 실시될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 어구는 2개 이상의 항목의 목록에 사용될 때, 나열된 항목 중 임의의 하나를 단독으로 사용할 수 있거나 나열된 항목 중 2개 이상의 조합을 사용할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 조성물이 성분 A, B 및/또는 C를 함유하거나 배제하는 것으로 기재되는 경우, 조성물은 A 단독; B 단독; C 단독; A와 B의 조합; A와 C의 조합; B와 C의 조합; 또는 A, B 및 C의 조합을 포함하거나 배제할 수 있다.
본 개시내용에서 "선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명되는 상황이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있음을 의미하므로 설명에는 본 개시내용에 제공된 지침에 따라 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다. 예를 들어, "선택적으로 치환된"이라는 어구는 비수소 치환기가 주어진 원자 상에 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 의미하며, 따라서 설명은 비수소 치환기가 존재하는 구조 및 비수소 치환기가 존재하지 않는 구조를 포함한다. "선택적으로 치환된"이라는 문구는 "치환된 또는 비치환된"이라는 어구와 상호 교환적으로 사용되는 것이 이해될 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 선택적으로 치환된 그룹은 그룹의 각각의 치환 가능한 위치에 치환기를 가질 수 있으며, 임의의 주어진 구조에서 하나 초과의 위치가 특정 그룹으로부터 선택된 하나 초과의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 예상되는 치환기의 조합은 본 개시내용의 관점에서 화합물의 바람직한 특징을 고려하여, 그리고 안정하거나 화학적으로 실행 가능한 화합물의 형성을 초래하는 특징을 고려하여 확인될 수 있다. 본원에 사용된 "안정한"이라는 용어는 화합물의 생성, 검출 및 특정 실시양태에서 본 개시내용에 개시된 하나 이상의 목적을 위한 회수, 정제 및 사용을 허용하는 조건에 노출될 때 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다.
본 개시내용의 재료, 조성물, 시스템 및 방법의 다수의 실시양태가 기술되었다. 본원에 제공된 특정 실시양태는 본 개시내용의 재료, 조성물, 시스템 및 방법의 유용한 실시양태의 예이며, 본 개시내용의 재료, 조성물, 시스템 및 방법은 본 개시내용에 제시된 장치, 장치 구성요소, 방법 단계의 수많은 변형을 사용하여 수행될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백할 것이지만, 본 방법에 유용한 방법 및 장치는 다수의 선택적 구성 및 처리 요소 및 단계를 포함할 수 있다.
특히, 본 개시내용에서 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시양태는 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
참조
SEQUENCE LISTING <110> KANSAS STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> PRISTINE GRAPHENE BASED BIOSENSOR FOR BIOMARKER DETECTION AND RELATED CORE PARTICLES, MATERIALS COMPOSITIONS METHODS AND SYSTEMS <130> P2672-PCT <150> US 63/131,972 <151> 2020-12-30 <160> 133 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic supramolecular recognition sequence <400> 1 Cys Gln Glu Gln Phe Trp Trp 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic supramolecular recognition sequence <400> 2 Pro Tyr Phe Pro Arg Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Trp Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic supramolecular recognition sequence <400> 3 Cys Cys Ile Gln Asn Gln 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic supramolecular recognition sequence <400> 4 Ala Trp Tyr Gln Pro Gln Phe Glu 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 95 Leu Tyr Tyr Val Ser Leu Ser Pro 1 5 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 96 Ser Tyr Tyr Val Ser Leu Ser Pro 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 97 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 98 Glu Ala Phe Arg Ser Thr Gly Ala 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 99 Gly Thr Ser Arg Ser Ala Gly Gly 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 100 Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Gly Gly 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 101 Ile Glu Ser Lys Ile Asn Gly Gly 1 5 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 102 Val Arg Ser Arg Ile Val Lys Gly 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 103 Thr Gln Pro Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 104 Ala Leu Gly Arg Lys Leu Val Gly 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 105 Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro 1 5 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 106 Val Lys Ala Ala Ser Leu Gly Lys 1 5 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic enzyme consensus sequence <400> 107 Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys 1 5 10 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 108 Gly Leu Ala Gly Leu Val Gly Pro 1 5 <210> 109 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 109 Asp Ala Phe Lys 1 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 110 Thr Ser Glu Glu Ile Arg Gly Gly 1 5 <210> 111 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 111 Ser Leu Leu Ile Phe Arg Ser Trp Ala Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 112 Ser Gly Lys Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu 1 5 10 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 113 Ser Gly Ser Pro Ala Phe Leu Ala Lys Asn Arg 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 114 Ser Gly Lys Pro Ile Ile Phe Phe Arg Leu 1 5 10 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 115 Gly Ala Phe Arg Met Cys Ala Gly 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 116 Glu Phe Val Arg Ser Pro Thr Pro 1 5 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 117 Gln Phe Val Arg Ser Pro Ser Gly 1 5 <210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 118 Ala Lys Leu Lys Ala Glu Asn Asn 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 119 Glu Gly Leu Gly Gln Ala Gly Asn 1 5 <210> 120 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 120 Gly Lys Lys Gly Ala Val Gly Glu 1 5 <210> 121 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 121 Gly Phe Phe Phe Trp Ala Leu Gly 1 5 <210> 122 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 122 Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln 1 5 <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 123 Gly Ala Gly Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly Ala Gly 1 5 10 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 124 Gly Pro Ser Gly Leu Gln Thr Gly 1 5 <210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 125 Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val 1 5 10 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 126 Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val 1 5 10 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 127 Ile Pro Glu Ser Leu Arg Ala Gly 1 5 <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 128 Glu Ser Asp Ala Ser Gln Thr Gly 1 5 <210> 129 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 129 Ser Gly Ala Ser Ala Cys 1 5 <210> 130 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 130 Ser Gly Arg Ser Ala 1 5 <210> 131 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic eptide <400> 131 Lys Gly Thr Ser Lys Gly Arg Thr Gly Leu Ile Pro Ser Asn Tyr Val 1 5 10 15 Ala Glu Gln Ala Glu Ala Gly 20 <210> 132 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 132 Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Gly 1 5 10 <210> 133 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 133 Gly Ala Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Gly 1 5 10

Claims (48)

  1. 그래핀 코어 입자로서,
    순수(pristine) 그래핀 나노시트 표면을 갖는 순수 그래핀 나노시트 및
    상기 순수 그래핀 나노시트 표면의 적어도 50%를 덮고 있는 코팅층
    을 포함하고,
    상기 코팅층은 25℃에서 1 중량%의 물에 대한 용해도를 갖는 유기 및/또는 무기 화합물을 포함하고,
    상기 유기 및/또는 무기 화합물은 순수 그래핀 나노시트에 부착되어 상기 코팅층을 형성하고,
    여기서 상기 순수 그래핀 나노시트 및/또는 상기 코팅층의 유기 및/또는 무기 화합물은 수용액에서 상응하는 작용기와 결합할 수 있는 작용기를 제공하도록 구성되는, 그래핀 코어 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 그래핀 코어 입자는 10 nm 내지 5000 nm의 평균 크기를 가지며, 코팅 물질은 상기 그래핀 입자의 표면의 적어도 85%를 코팅하는, 그래핀 코어 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 그래핀 코어 입자는 2 내지 100개의 순수 그래핀 시트를 포함하고, 상기 입자는 900 nm 이하, 바람직하게는 350 nm 이하, 보다 바람직하게는 250 nm의 평균 크기를 갖는, 그래핀 코어 입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 그래핀 코어 입자는 2 내지 100개의 순수 그래핀 시트를 포함하고, 코팅 물질은 그래핀 입자의 표면의 적어도 90%를 코팅하는, 그래핀 코어 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그래핀 코어 입자는 5 내지 25개의 순수 그래핀 시트를 포함하는, 그래핀 코어 입자.
  6. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그래핀 코어 입자는 5 내지 7개의 순수 그래핀 시트를 포함하는, 그래핀 코어 입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순수 그래핀 나노시트는 150 nm의 평균 크기를 갖는 입자를 형성하는, 그래핀 코어 입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅 물질은 유기 중합체를 포함하는, 그래핀 코어 입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유기 중합체는 폴리에틸렌이민, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, (메트)아크릴레이트- 및 (메트)아크릴아미드 중합체뿐만 아니라 폴리스티렌-카복실산 및 폴리스티렌-아민 중 하나 이상을 포함하고, 다른 바람직한 코팅은 화학적으로 변형된 올리고에틸렌 글리콜, 및 올리고이민, 및 스타버스트(starburst) 덴드리머인, 그래핀 코어 입자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅 물질은 상기 그래핀 시트의 표면의 적어도 99%를 덮고 있는, 그래핀 코어 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅 물질은 표적화 능력을 특징으로 하는 부착된 펩타이드 서열에 대해 최소 2 nm를 허용하기 위해 18 nm 이하의 두께를 갖는, 그래핀 코어 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅 물질은 8 내지 17 nm, 2 내지 18 nm, 또는 5 내지 15 nm의 두께를 갖는, 그래핀 코어 입자.
  13. 표적 바이오마커를 검출하도록 구성된 그래핀 바이오센서로서, 상기 그래핀 바이오센서는
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 그래핀 코어 입자, 및 형광 신호를 방출할 수 있는 검출 가능한 모이어티를 포함하고, 상기 검출 가능한 모이어티는 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 포함하는 펩타이드 연결을 통해 코어 입자에 부착되고,
    여기서 상기 코팅층 및 상기 펩타이드 연결은 그래핀 나노시트가 검출 가능한 모이어티의 형광 신호를 소광하는, 그래핀 나노시트와 검출 가능한 모이어티 사이의 소광 거리를 설정하도록 구성되고,
    여기서 상기 펩타이드 연결은 인식 서열의 표적 바이오마커에 의한 인식 시, 그래핀 나노시트와 검출 가능한 모이어티 사이의 방출 거리를 설정하도록 추가로 구성되며, 여기서 상기 그래핀 나노시트는 검출 가능한 모이어티의 형광 신호를 소광하지 않으며,
    여기서 상기 표적 바이오마커 특이적 펩타이드 연결 및 상기 검출 가능한 모이어티는 따라서 상기 표적 바이오마커에 의한 펩타이드 연결의 변형 시 검출 가능한 형광 신호를 방출하도록 구성된 표적 특이적 검출 가능한 구성요소를 형성하는, 그래핀 바이오센서.
  14. 제13항에 있어서, 상기 인식 서열은 프로테아제, 키나아제, 아르기나아제, 사이토카인/케모카인, 디옥시게나아제, 에스테라제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커에 특이적인, 그래핀 바이오센서.
  15. 제14항에 있어서, 상기 프로테아제는 세린, 아스파르틸, 시스테인, 메탈로프로테이나제, 카스파제, 우로키나제, 카텝신, 카스파제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 그래핀 바이오센서.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커는 암성 또는 전암성 세포 활성, 박테리아 활성, 감염, 염증, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 나타내는, 그래핀 바이오센서.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 가능한 모이어티는 유기 염료, 무기 염료, 형광단, 인광단, 광 흡수 입자, 양자점, 이들의 조합, 및 이들의 금속화 착물로 이루어진 군으로부터 선택되는 발색단/발광단인, 그래핀 바이오센서.
  18. 제17항에 있어서, 상기 발색단/발광단은 쿠마린, 피렌, 시아닌, BODIPY 염료, 벤젠, N-메틸카바졸, 에리트로신 B, N-아세틸-L-트립토판아미드, 2,5-디페닐옥사졸, 루브렌, 및 N-(3-설포프로필)아크리디늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 염료인, 그래핀 바이오센서.
  19. 제17항에 있어서, 상기 발색단/발광단은 포르피린, 프탈로시아닌, 클로린, 및 금속화 발색단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 무기 염료인, 그래핀 바이오센서.
  20. 제19항에 있어서, 상기 포르피린은 테트라 카복시-페닐-포르피린(TCPP) 및 Zn-TCPP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 그래핀 바이오센서.
  21. 제17항에 있어서, 상기 발색단/발광단은 인광 염료, 플루오레세인, 로다민, 및 안트라센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광단 또는 인광체인, 그래핀 바이오센서.
  22. 제17항에 있어서, 상기 양자점은 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점, CdTe/CdSe 코어/쉘 양자점, CdSe/ZnTe 코어/쉘 양자점, 및 합금 반도체 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 그래핀 바이오센서.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 단일층은 폴리에틸렌이민, 폴리카프로락톤, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, (메트)아크릴레이트- 및 (메트)아크릴아미드 중합체, 폴리스티렌-카복실산, 폴리스티렌-아민, 덱스트란, 풀루란, 키토산, 알기네이트, 셀룰로오스, 및 히알루론산, 및 이들의 혼합물 또는 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 그래핀 바이오센서.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코어 입자는 약 50 nm 내지 약 500 nm의 크기를 갖는, 그래핀 바이오센서.
  25. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 펩타이드 연결을 통해 그래핀 코어 입자에 부착된 복수의 검출 가능한 구성요소를 포함하는, 그래핀 바이오센서.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 각각 갖는 각각의 펩타이드 연결을 통해 상기 중심 담체 입자에 부착된 적어도 2개의 상이한 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 그래핀 바이오센서.
  27. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 그래핀 코어 입자 및 상기 코어 입자에 부착된 복수의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소를 포함하는 다중 그래핀 바이오센서로서,
    여기서 각각의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소는 형광 신호를 방출할 수 있는 검출 가능한 모이어티에 의해 형성되며, 상기 검출 가능한 모이어티는 표적 바이오마커에 특이적인 인식 서열을 포함하는 펩타이드 연결에 부착되고,
    여기서 각각의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소에서, 상기 펩타이드 연결은 코어 입자의 코팅층과 조합하여 검출 가능한 모이어티와 그래핀 시트 코어 입자 사이의 소광 거리를 제공하도록 구성되고, 여기서 상기 그래핀 나노시트는 검출 가능한 모이어티의 형광 신호를 소광시키고,
    여기서 각각의 검출 가능한 구성요소의 표적 바이오마커에 대한 인식 서열은 표적 바이오마커를 특이적으로 검출하도록 구성되고, 복수의 검출 가능한 구성요소는 복수의 상이한 표적 바이오마커를 특이적으로 검출하도록 선택되는, 다중 그래핀 바이오센서.
  28. 제27항에 있어서, 최대 10개의 표적 특이적 검출 가능한 구성요소를 포함하고, 각각의 검출 가능한 구성요소는 UV/Vis/NIR 스펙트럼의 전체 범위에 걸쳐 검출 가능한, 검출 가능한 모이어티를 나타내는, 다중 그래핀 바이오센서.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 바이오센서 그램당 1.6 ± 0.2 x 10-5 몰의 밀도로 표적 특이적 검출 가능한 구성요소 올리고펩타이드를 포함하는, 다중 그래핀 바이오센서.
  30. 적합한 보조제와 조합하여 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 하나 이상의 코어 입자 및/또는 하나 이상의 그래핀 바이오센서를 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이고, 상기 보조제는 약제학적으로 허용되는 보조제인, 조성물.
  32. 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하는 방법으로서,
    생물학적 샘플을 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 그래핀 바이오센서와 접촉시켜 반응 용액을 생성하는 단계; 및
    상기 반응 용액의 변화를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    상기 반응 용액을 여기 광원에 노출시키는 단계; 및
    상기 샘플에서 상기 바이오마커의 활성의 함수로서 검출 가능한 모이어티의 흡수 또는 방출 스펙트럼의 변화를 검출하는 단계.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 변화는 상기 접촉 전의 흡수 또는 방출 스펙트럼에 비해 상기 접촉 후 상기 검출 가능한 모이어티의 최대 흡수 또는 방출의 청색-이동을 포함하는, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변화는 상기 접촉 전에 상기 검출 가능한 모이어티의 흡수 또는 방출 스펙트럼에 비해 새로운 가시 색상 또는 발광 밴드의 출현을 포함하는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 샘플을 상기 바이오센서와 함께 90분 미만, 바람직하게는 60분 미만의 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 그 안에 복수의 마이크로웰을 포함하는 마이크로플레이트를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로웰 중 하나 이상은 그 안에 분포된 복수의 상기 바이오센서를 포함하는 것인 단계, 및 상기 생물학적 샘플을 상기 마이크로웰에 첨가하여 각각의 상기 마이크로웰에서 각각의 반응 용액을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계는 샘플 및/또는 시험 용액의 가열이 선행되는, 방법.
  39. 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 바이오센서 및 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항의 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 검출하는 방법에서 동시 조합 또는 순차적 사용을 위한 시약을 포함하는, 시스템.
  40. 생물학적 샘플에서 복수의 바이오마커의 활성의 다중 검출 방법으로서, 상기 방법은
    생물학적 샘플을 복수의 바이오마커에 특이적인 검출 가능한 구성요소를 제시하도록 구성된 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 다중 바이오센서와 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 반응 용액을 생성하기 위해 수행되는 것인 단계; 및 상기 반응 용액의 변화를 검출하는 단계 및/또는
    상기 생물학적 샘플을 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 다중 바이오센서와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 다중 바이오센서 각각은 복수의 바이오마커 중 하나의 바이오마커에 특이적인 펩타이드 연결을 제시하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 검출은 샘플 및/또는 시험 용액의 가열이 선행되는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 샘플은 복수의 샘플을 포함하고, 상기 접촉은 복수의 샘플과 동시에 수행되는, 방법.
  43. 생물학적 샘플에서 복수의 바이오마커 활성의 다중 검출을 위한 시스템으로서, 상기 시스템은
    제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 다중 바이오센서 및/또는 바이오센서를 포함하고, 이들 각각은 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 생물학적 샘플에서 바이오마커의 활성을 다중 검출하는 방법에서 복수의 바이오마커 중 하나의 바이오마커에 특이적인 펩타이드 연결뿐만 아니라 선택적으로 동시 조합 또는 순차적 사용을 위한 복수의 시약을 제시하는 것인 시스템.
  44. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 그래핀 코어 입자의 제조 방법으로서, 상기 방법은 그래핀 표면을 갖는 순수 그래핀 나노시트를 제공하는 단계; 및 상기 그래핀 표면을 유기 및/또는 무기 분자의 층으로 코팅하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 그래핀 코어 입자를 제조하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은 그래핀 표면을 갖는 순수 그래핀 나노시트와 화학적으로 변환하기 위한 시약을 포함하며, 상기 그래핀 표면은 코팅층으로 코팅된 순수 그래핀 나노시트를 제공하기 위한 것인 시스템.
  46. 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항의 바이오센서를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항의 그래핀 코어 입자를 제공하는 단계 및 펩타이드 연결을 통해 검출 가능한 모이어티를 그래핀 표면에 부착시키는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제62항에 있어서, 상기 부착 단계는 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 그래핀 코어 입자를 분산시키는 것이 선행되고, 상기 부착 단계는 분산된 그래핀 코어 입자를 펩타이드 연결에 부착된 검출 가능한 모이어티를 포함하는 검출 가능한 구성요소와 접촉시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  48. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항의 바이오센서를 제조하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은 그래핀 표면을 갖는 순수 그래핀 나노시트, 펩타이드 연결, 검출 가능한 모이어티 및 상기 펩타이드 연결을 통해 검출 가능한 모이어티를 그래핀 표면에 부착하기 위한 시약를 포함하는 시스템.
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US9127515B2 (en) * 2010-10-27 2015-09-08 Baker Hughes Incorporated Nanomatrix carbon composite
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WO2014090313A1 (en) * 2012-12-13 2014-06-19 Universitaet Ulm Nanoparticle with a molecularly imprinted coating
US9440857B2 (en) 2013-05-10 2016-09-13 Kansas State University Research Foundation Process for high-yield production of graphene via detonation of carbon-containing material
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AU2016329919B2 (en) * 2015-10-02 2023-05-18 Lemonex Inc. Quencher containing water soluble polymer-conjugated nanomaterial and use thereof
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