KR20230112257A - Pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis comprising lipocalin 2 or its receptor inhibitor as effective component - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하여 간별세포(hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하는 방법, 리포칼린 2를 이용한 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단 및 간섬유화 치료물질 스크리닝 방법에 관한 것으로, 리포칼린 2 수용체 억제제 또는 리포칼린 2 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 비알코올성지방간염에 의해 유도되는 간섬유화 치료제로 사용될 수 있고, 본 발명은 리포칼린 2를 이용한 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단 및 간섬유화 치료물질 스크리닝 방법을 제공하며, 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하여 간별세포(hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis containing lipocalin 2 or its receptor expression inhibitor as an active ingredient, and treating hepatic stellate cells (hepatic stellate cells) by treating the lipocalin 2 receptor inhibitor. ), a method for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis using lipocalin 2 and a method for screening a substance for treating liver fibrosis, using a lipocalin 2 receptor inhibitor or a lipocalin 2 expression inhibitor as an active ingredient. The composition of the present invention containing the composition can be used as a therapeutic agent for liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis. In addition, it is possible to provide a method of inhibiting the activation of hepatic stellate cells by treating with a lipocalin 2 receptor inhibitor.

Description

리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis comprising lipocalin 2 or its receptor inhibitor as effective component}Pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis containing lipocalin 2 or its receptor expression inhibitor as an active ingredient

본 발명은 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하여 간별세포(hepatic stellate cell, HSC)의 활성화를 억제하는 방법; 리포칼린 2를 이용한 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단 및 간섬유화 치료물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis, containing lipocalin 2 or an expression inhibitor of its receptor as an active ingredient; a method of inhibiting activation of hepatic stellate cells (HSC) by treating with the lipocalin 2 receptor inhibitor; It relates to a method for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis using lipocalin 2 and screening a substance for treating liver fibrosis.

지방간은 주로 알코올을 많이 섭취하여 발생하는 알코올성 간 장애에 관련된 것으로 인식되어져 왔다. 알코올성 지방간이란, 알코올 섭취자에 있어서, 간에 지방이 쌓이는 것으로, 간 세포 안에 지방 입자가 관찰되며, 간 세포에 지방(특히, 중성 지방)이 축적되어 간 장애를 일으키는 상태를 말한다. 그러나 최근들어, 알코올 비 섭취자에 있어서도 알코올성 간 장애와 유사한 소견이 나타나는 것이 판명되어 왔다. 이러한 알코올 비 섭취자의 지방성 간 장애의 상태는 대부분 비알코올성 지방성 간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD)이라 할 수 있다.Fatty liver has been recognized as being related to alcoholic liver disease, which is mainly caused by high alcohol consumption. Alcoholic fatty liver refers to a condition in which fat is accumulated in the liver in alcoholics, fat particles are observed in liver cells, and fat (particularly, neutral fat) is accumulated in liver cells to cause liver failure. Recently, however, it has been found that non-alcohol drinkers also have findings similar to those of alcoholic liver disease. The state of fatty liver disease in non-alcohol drinkers is mostly referred to as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).

비알코올성지방간질환(NAFLD)은 간 세포에 대한 중성 지방의 침착이 관찰되는 지방간의 소견으로 판정되지만, 환자의 약 90%는 적절한 식이 요법이나 운동 요법에 의해 증상을 개선할 수 있는 단순성 지방간이다. 그러나 비알코올성지방간질환(NAFLD)의 약 10%에 해당하는 사례는 진행성 병태를 나타내는 비알코올성지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis: NASH)인 것으로 알려져 있다. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is determined by the findings of fatty liver in which deposition of neutral fat on liver cells is observed, but about 90% of patients have simple fatty liver whose symptoms can be improved by proper diet or exercise therapy. However, it is known that approximately 10% of cases of NAFLD are nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which represents a progressive condition.

비알코올성지방간염(NASH)의 병리 조직적 진행 과정은 일반적으로, 지방이 축적된 간세포가 변성 혹은 괴사함으로써, 간 조직에 염증 소견이나 섬유화(線維化; fibrosis)를 수반하는 지방성 간염이 관찰된다. 또한, 비만, 당뇨 등의 대사 증후군, 고지혈증, 고혈압, 고요산혈증 등 다양한 위험 인자를 수반하는 환자들의 경우, 지방간에서 비알코올성지방간염으로의 진행, 더 나아가 보다 위험한 간섬유증, 간경화증(liver cirrhosis), 간암으로 진행할 확률이 보다 높아진다고 할 수 있다. In the pathological and histological progression of non-alcoholic steatohepatitis (NASH), fatty hepatitis accompanied by inflammatory findings or fibrosis in liver tissue is generally observed due to degeneration or necrosis of hepatocytes in which fat is accumulated. In addition, in the case of patients with various risk factors such as obesity, metabolic syndrome such as diabetes, hyperlipidemia, hypertension, hyperuricemia, etc., progression from fatty liver to non-alcoholic steatohepatitis, furthermore, more dangerous liver fibrosis, liver cirrhosis (liver cirrhosis), It can be said that the probability of progressing to liver cancer is higher.

또한, 간섬유증(liver fibrosis)은 만성염증 상태에 있는 간 조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합조직이 과도하게 축적됨으로써, 간 조직에 흉터(scar)가 생기는 질환을 의미한다. 일반적으로 간섬유증은 간경화증과는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없다. 또한, 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나 이러한 간섬유화 기작이 반복적으로 지속되면, 결합조직 간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인 간경화증으로 진행된다.In addition, liver fibrosis refers to a disease in which scars occur in liver tissue due to excessive accumulation of connective tissue such as collagen in the tissue due to repeated damage and regeneration of liver tissue in a chronic inflammatory state. In general, liver fibrosis, unlike cirrhosis, is reversible, consists of thin fibrils, and does not have nodule formation. In addition, if the cause of liver damage disappears, normal recovery may be possible. However, if this liver fibrosis mechanism continues repeatedly, crosslinking between connective tissues increases, thick fibrils accumulate, and the normal structure of the liver lobules is lost to form nodules. It progresses to irreversible liver cirrhosis.

간섬유화를 억제하는 물질로, 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스티글라딘 E2, 비페닐 디메틸디카르복실산, 콜키친, 글루코코티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마-인터페론, 펜톡시필린(pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸)아미드 등이 개발되었지만, 임상에 적용시 작용이 미약하거나 부작용이 심하여, 현재로서는 임상에 사용되고 있는 간섬유화 치료제는 없는 실정이다.Substances that inhibit hepatic fibrosis, such as penicillamine, 16,16-dimethyl prostiglidin E2, biphenyl dimethyldicarboxylic acid, colchicine, glucocorticoid, malotilate, gamma-interferon, pentoxifylline, pyridine-2,4-dicarboxylic-diethylamide, pyridine-2,4-dicarboxylic-di(2-methoxy) Ethyl) amide and the like have been developed, but when applied clinically, the action is weak or the side effects are severe, so there is currently no treatment for liver fibrosis that is used clinically.

한편, 한국등록특허 제2269748호에 간세포 손상 표지자 아시알로 알파-1산 당단백질 측정을 통한 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도 추적 진단용 키트 및 이의 용도가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2112760호에 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용한 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제2204521호에 프로그레뉼린 단백질을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하여 간별세포의 활성화를 억제하는 방법, 리포칼린 2를 이용한 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단 및 간섬유화 치료물질 스크리닝 방법에 관해 개시된 바 없다.On the other hand, Korean Patent No. 2269748 discloses a kit for tracking and diagnosing progressive chronic hepatitis and the degree of hepatic fibrosis through measurement of asialo alpha-1 acid glycoprotein, a marker of liver cell damage, and its use. Korean Patent No. 2112760 discloses a method for diagnosing liver disease using TM4SF5 protein expression change and a method for screening a therapeutic agent for liver disease, and Korean Patent No. 2204521 discloses prevention of liver disease containing progranulin protein Alternatively, although a therapeutic composition is disclosed, a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis containing the expression inhibitor of lipocalin 2 or its receptor of the present invention as an active ingredient, a method for inhibiting activation of hepatic cells by treating with the lipocalin 2 receptor inhibitor, a method for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis using lipocalin 2, and a method for screening a substance for treating liver fibrosis have not been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에 고지방식이를 섭취하여 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염 및 간섬유화를 유도한 후, 혈액 내 리포칼린 2(lipocalin 2, LCN2) 함량, 간 조직에서 LCN2, α-SMA, MMP9 및 pSTAT3 함량이 증가되는 것을 확인하였고, 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에 재조합 LCN2 단백질을 주입한 경우, MMP9, pSTAT3의 함량이 증가하였고, 렙틴 및 LCN2가 함께 결여된 동물모델에서 혈액 내 MMP9, 간 조직 내 MMP9, pSTAT3의 함량이 감소한 것과, 간섬유화가 감소하는 것을 확인하였고, 마우스 대식세포에 LPS를 처리하여 배양한 배지(LTM)를 간별세포에 처리하면 간섬유화 관련 인자의 발현이 증가하고, LTM을 처리하여 활성화시킨 간별세포에 LCN2 수용체 억제제를 처리하면 간별세포의 활성화가 억제되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above needs, and after inducing leptin-deficient non-alcoholic steatohepatitis and hepatic fibrosis by consuming a high-fat diet in ob/ob mice lacking leptin, it was confirmed that lipocalin 2 (LCN2) content in blood and LCN2, α-SMA, MMP9, and pSTAT3 content in liver tissue were increased, and recombinant LCN2 protein was injected into ob/ob mice lacking leptin. In one case, the contents of MMP9 and pSTAT3 were increased, and in an animal model lacking both leptin and LCN2, it was confirmed that the contents of MMP9 in blood, MMP9, and pSTAT3 in liver tissue were reduced, and hepatic fibrosis was reduced. When LPS was treated in mouse macrophages and cultured medium (LTM) was treated with hepatic stellate cells, the expression of hepatic fibrosis-related factors increased. By confirming that it is inhibited, the present invention was completed.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis, containing lipocalin 2 or an expression inhibitor of its receptor as an active ingredient.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체에, 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는 간별세포(hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for inhibiting the activation of hepatic stellate cells, including the step of treating a lipocalin 2 receptor inhibitor in a non-human subject.

또한, 본 발명은 In addition, the present invention

1) 마우스 대식세포에 LPS를 처리한 후 배양한 배양액을 간별세포에 처리하여 간별세포를 활성화 시키는 단계;1) activating hepatic stellate cells by treating mouse macrophages with LPS and then treating the culture medium with hepatic stellate cells;

2) 상기 단계 1)의 활성화된 간별세포에 간섬유화 치료용 후보 물질을 처리하는 단계;2) treating the activated liver stellate cells of step 1) with a candidate substance for liver fibrosis treatment;

3) 상기 단계 2) 이후에, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및3) after step 2), measuring the expression level of lipocalin 2 protein or mRNA; and

4) 상기 단계 3) 이후에, 상기 단계 2)의 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현을 더 감소시키는 상기 간섬유화 치료용 후보 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 시험관 내에서 상기 후보 물질로부터 간섬유화 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 4) after step 3), comparing the candidate substance of step 2) to the untreated control group, selecting a candidate substance for treating liver fibrosis that further reduces the expression of lipocalin 2 protein or mRNA;

또한, 본 발명은 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin containing an antibody that specifically binds to lipocalin 2 protein as an active ingredient, and a kit for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin containing the composition.

또한, 본 발명은 리포칼린 2 mRNA를 정량적으로 검출하는 제제를 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for diagnosing hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin, including an agent for quantitatively detecting lipocalin 2 mRNA.

또한, 본 발명은 In addition, the present invention

1) 피검 대상으로부터 분리된 시료 내 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 단계; 및1) measuring the amount of lipocalin 2 protein or mRNA in a sample isolated from the test subject; and

2) 상기 단계 1)에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 양을 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단을 위한 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 2) comparing the amount of protein or mRNA measured in step 1) with a normal control group; providing information on the amount of lipocalin 2 protein or mRNA for diagnosis of hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin.

본 발명은 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하여 간별세포(hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하는 방법, 리포칼린 2를 이용한 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단 및 간섬유화 치료물질 스크리닝 방법에 관한 것으로, 렙틴 결여에 의해 비알코올성지방간이 생성된 ob/ob 마우스에 재조합 리포칼린 2 단백질을 처리하면 MMP9 및 pSTAT3 함량을 증가시켜 간섬유화를 유도하고, 렙틴 및 리포칼린 2 유전자가 결여된 동물모델(DKO)은 렙틴만 결여된 동물모델(ob/ob)에 비해 MMP9 및 pSTAT3의 함량이 감소하였으며, 간섬유화가 개선되는 효과가 있었다. 또한, 마우스 대식세포에 LPS를 처리하여 배양한 배지(LTM)를 간별세포에 처리하면 간별세포가 활성화되며 LCN2, 콜라겐 1α, LCN2 수용체(24p3R), α-SMA, pSTAT3 및 MMP9의 발현이 증가하는데, siRNA를 처리하여 LCN2 수용체(24p3R)의 발현을 감소시키면 LCN2, α-SMA, pSTAT3 및 MMP9의 발현이 현저하게 감소하고, 간별세포의 지방 방울의 감소가 적어지며, 세포의 이동이 감소하는 것으로 보아 간별세포의 활성화가 억제되는 효과가 있다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis containing lipocalin 2 or its receptor expression inhibitor as an active ingredient, a method for inhibiting activation of hepatic stellate cells by treating the lipocalin 2 receptor inhibitor, and a method for diagnosing non-alcoholic steatohepatitis-induced liver fibrosis using lipocalin 2 and screening for a substance for treating liver fibrosis, When recombinant lipocalin 2 protein is treated in ob/ob mice with fatty liver, MMP9 and pSTAT3 contents are increased to induce hepatic fibrosis, and in the animal model (DKO) lacking leptin and lipocalin 2 genes, compared to the animal model (ob/ob) lacking only leptin, the contents of MMP9 and pSTAT3 were reduced, and hepatic fibrosis was improved. In addition, when mouse macrophages were treated with LPS and cultured medium (LTM) was treated with hepatocytes, hepatocytes were activated and the expression of LCN2, collagen 1α, LCN2 receptor (24p3R), α-SMA, pSTAT3 and MMP9 increased. The decrease in droplets is reduced, and the movement of cells is reduced, which has the effect of inhibiting the activation of interspecific cells.

도 1은 야생형 마우스(WT) 및 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서, 식이에 따른 간 조직의 변화(A), 간 조직에서의 지방형성 및 간섬유화 정도를 확인하기 위해 염색한 결과(B) 및 이를 정량한 결과(C)이다. ND는 일반식이 마우스이고, HFD는 고지방식이 마우스이다. ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 2는 야생형 마우스(WT) 및 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서, 식이에 따른 혈액 내 LCN2 변화 및 간 조직에서의 LCN2 mRNA 발현 변화(A), 간 조직에서의 LCN2 및 α-SMA 단백질 발현 변화(B)를 확인한 결과이다. ND는 일반식이 마우스이고, HFD는 고지방식이 마우스이다. *, **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 3은 야생형 마우스(WT) 및 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서, 식이에 따른 간 조직에서의 MMP9 단백질 발현 및 STAT3 인산화 정도 변화(A), LCN2+MMP9 Duolink 분석 결과(B) 및 LCN2+MMP9 양성 세포 면적을 정량한 결과(C)이다. ND는 일반식이 마우스이고, HFD는 고지방식이 마우스이다. *, **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 4는 야생형 마우스(WT) 및 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서 LCN2의 역할을 재조합 LCN2(rLCN2)를 처리하여 확인한 결과이다. (A)는 간 조직에서 LCN2, MMP9 단백질 발현 변화 및 STAT3 인산화 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이고, (B)는 이를 정량한 결과이다. ND는 일반식이 마우스이고, HFD는 고지방식이 마우스이다. *, **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 5는 ob/ob 마우스에서 LCN2 결여 및 렙틴 처리에 의한 효과를 확인한 결과이다. (A)는 혈액 내 렙틴 및 LCN2의 함량을 확인한 결과이고, (B)는 간 조직에서의 간섬유화 관련 인자의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이고, (C)는 이를 정량한 결과이다. (D)는 간 조직을 Nile red로 염색한 결과를 확인한 사진이고, (E)는 Nile red로 염색된 부분을 정량한 결과이다. DKO는 렙틴 및 LCN2가 이중으로 결여된 마우스이다. ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 6은 LCN2 결여가 간섬유화에 미치는 영향을 확인한 결과이다. (A)는 간 조직에서 LCN2 및 간섬유화 관련 인자의 단백질 발현을 확인한 결과이고, (B)는 혈액 내 MMP9의 함량을 분석한 결과이며, (C)는 간섬유화 정도를 Sirius red로 염색하여 확인한 결과이다. HFD는 고지방식이 투여를 의미한다. *, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, ***은 p<0.001이다.
도 7은 LPS 처리된 RAW 264.7 세포의 배양 배지(LPS-treated medium, LTM) 처리에 따른 사람세포주 LX-2 세포에서의 간섬유화 관련 인자의 발현 변화를 확인한 것이다. (A)는 LTM의 LCN2 및 TNFα 함량 변화를 확인한 것이고, (B)는 LTM을 LX-2 세포에 처리하는 모식도이고, (C)는 LTM 처리된 LX-2 세포 용해물에서의 α-SMA 발현 변화를 확인한 것이고, (D)는 LTM 처리된 LX-2 세포에서 분비되는 MMP9의 함량을 확인한 결과이다. ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 8은 ob/ob 마우스 1차 간별세포(mHSC)에서 LTM 처리에 따른 간섬유화 관련 인자의 발현 변화를 확인한 것이다. (A)는 간 조직에서 LCN2 및 콜라겐 1α의 mRNA 발현을 확인한 결과이고, (B)는 LTM 처리된 mHSC의 용해물 및 배양액에서의 단백질 발현 변화를 확인한 결과이다. *, **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 9는 LTM 처리에 의해 활성화된 ob/ob 마우스 1차 간별세포(mHSC)에서, LCN2 수용체인 24p3R 발현 억제에 따른 효과를 확인한 결과이다. (A)는 LTM 및 si24p3R 처리에 따른 단백질 발현 변화를 세포 용해물 및 배양액에서 확인한 결과이고, (B)는 Nile red로 염색하여 지방 방울 감소 정도를 확인한 결과이다. *, **, ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 10은 LTM 처리에 의해 활성화된 간별세포에서, LCN2의 24p3R을 통한 간별세포의 세포이동 촉진효과를 LX-2(A) 및 ob/ob 마우스 1차 간별세포(mHSC)(B)에서 확인한 결과이다. ***은 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.001이다.Figure 1 shows changes in liver tissue according to diet (A), staining results (B) and quantification results (C) to confirm the degree of adipogenesis and liver fibrosis in wild-type mice (WT) and ob/ob mice lacking leptin. ND is a normal diet mouse, and HFD is a high fat diet mouse. *** means that there is a statistically significant difference from each other, p<0.001.
Figure 2 shows changes in LCN2 mRNA expression in liver tissue and LCN2 mRNA expression in liver tissue according to diet in wild-type mice (WT) and ob/ob mice lacking leptin, and changes in LCN2 and α-SMA protein expression in liver tissue (B). ND is a normal diet mouse, and HFD is a high fat diet mouse. *, **, *** means that there is a statistically significant difference from each other, * means p <0.05, ** means p <0.01, *** p <0.001.
Figure 3 shows changes in MMP9 protein expression and STAT3 phosphorylation in liver tissue according to diet in wild-type mice (WT) and ob/ob mice lacking leptin (A), results of LCN2+MMP9 Duolink analysis (B), and results of quantifying the area of LCN2+MMP9-positive cells (C). ND is a normal diet mouse, and HFD is a high fat diet mouse. *, **, *** means that there is a statistically significant difference from each other, * means p <0.05, ** means p <0.01, *** p <0.001.
Figure 4 shows the results of confirming the role of LCN2 in wild-type mice (WT) and leptin-deficient ob/ob mice by treating them with recombinant LCN2 (rLCN2). (A) is the result of confirming the LCN2, MMP9 protein expression change and the degree of STAT3 phosphorylation in liver tissue by Western blot, and (B) is the result of quantification thereof. ND is a normal diet mouse, and HFD is a high fat diet mouse. *, **, *** means that there is a statistically significant difference from each other, * means p <0.05, ** means p <0.01, *** p <0.001.
5 is a result confirming the effect of LCN2 deficiency and leptin treatment in ob/ob mice. (A) is the result of confirming the content of leptin and LCN2 in the blood, (B) is the result of confirming the expression of liver fibrosis-related factors in liver tissue by Western blot, and (C) is the result of quantifying them. (D) is a photograph confirming the result of staining the liver tissue with Nile red, and (E) is the result of quantifying the stained area with Nile red. DKO is a mouse doubly lacking leptin and LCN2. *** means that there is a statistically significant difference from each other, p<0.001.
6 is a result confirming the effect of LCN2 deficiency on liver fibrosis. (A) is the result of confirming the protein expression of LCN2 and liver fibrosis-related factors in liver tissue, (B) is the result of analyzing the content of MMP9 in blood, and (C) is the result of confirming the degree of liver fibrosis by staining with Sirius red. HFD means high fat diet administration. *, *** means that there is a statistically significant difference between each other, * is p <0.05, *** is p <0.001.
Figure 7 confirms changes in the expression of liver fibrosis-related factors in human cell line LX-2 cells according to LPS-treated medium (LTM) treatment of RAW 264.7 cells treated with LPS. (A) confirms changes in LCN2 and TNFα content of LTM, (B) is a schematic diagram of LTM treatment of LX-2 cells, (C) confirms changes in α-SMA expression in LTM-treated LX-2 cell lysates, and (D) is the result of confirming the content of MMP9 secreted from LTM-treated LX-2 cells. *** means that there is a statistically significant difference from each other, p<0.001.
Figure 8 confirms changes in the expression of liver fibrosis-related factors according to LTM treatment in ob/ob mouse primary hepatic stellate cells (mHSC). (A) is the result of confirming the mRNA expression of LCN2 and collagen 1α in liver tissue, and (B) is the result of confirming the change in protein expression in the lysate and culture medium of LTM-treated mHSC. *, **, *** means that there is a statistically significant difference from each other, * means p <0.05, ** means p <0.01, *** p <0.001.
9 shows the results of confirming the effect of suppressing the expression of the LCN2 receptor 24p3R in ob/ob mouse primary hepatic stellate cells (mHSC) activated by LTM treatment. (A) is the result of confirming the change in protein expression according to LTM and si24p3R treatment in cell lysate and culture medium, and (B) is the result of confirming the degree of fat droplet reduction by staining with Nile red. *, **, *** means that there is a statistically significant difference from each other, * means p <0.05, ** means p <0.01, *** p <0.001.
10 is a result of confirming the effect of promoting cell migration of hepatic stellate cells through 24p3R of LCN2 in LX-2 (A) and ob/ob mouse primary hepatic stellate cells (mHSC) (B) in hepatic stellate cells activated by LTM treatment. *** means that there is a statistically significant difference from each other, p<0.001.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis, containing lipocalin 2 or an expression inhibitor of its receptor as an active ingredient.

상기 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제는 리포칼린 2 또는 이의 수용체에 특이적인 항체 또는 압타머; 및 리포칼린 2 또는 이의 수용체 유전자에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 miRNA;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 리포칼린 2 수용체 유전자에 특이적인 siRNA인 것이며, 더 바람직하게는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 si24p3R인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. The expression inhibitor of lipocalin 2 or its receptor may be an antibody or aptamer specific to lipocalin 2 or its receptor; And siRNA, shRNA, or miRNA specific for lipocalin 2 or its receptor gene; It may be one or more selected from the group consisting of, preferably, siRNA specific for the lipocalin 2 receptor gene, more preferably one or more si24p3R selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the liver fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis is preferably induced by nonalcoholic steatohepatitis lacking leptin, but is not limited thereto.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may include pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents in addition to active ingredients, and these carriers are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, and methylhydroxybenzoate. ethyl alcohol, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil, but are not limited thereto. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.

본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. A suitable dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, administration route, excretion rate and response sensitivity.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, etc. may be administered.

본 발명의 약학 조성물은 간섬유화의 억제 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the inhibition and treatment of hepatic fibrosis.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.The concentration of the active ingredient included in the composition of the present invention can be determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the required period, etc., and is not limited to a specific range of concentration.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in a unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art, or by placing it in a multi-dose container. At this time, the formulation may be prepared as any one formulation selected from injections, creams, sprays, ointments, warnings, lotions, liniments, pastas, and cataplasmas, and may additionally include a dispersing agent or a stabilizer.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체에, 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는 간별세포(hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inhibiting the activation of hepatic stellate cells, including the step of treating a lipocalin 2 receptor inhibitor in a non-human subject.

상기 리포칼린 2 수용체 억제제는 리포칼린 2 수용체에 특이적인 항체 또는 압타머; 리포칼린 2 수용체 유전자에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 miRNA; 및 수용체 길항제(antagonist)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 리포칼린 2 수용체 유전자에 특이적인 siRNA인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. The lipocalin 2 receptor inhibitor may be an antibody or aptamer specific for the lipocalin 2 receptor; siRNA, shRNA or miRNA specific for the lipocalin 2 receptor gene; And it may be at least one selected from the group consisting of a receptor antagonist, preferably a siRNA specific to the lipocalin 2 receptor gene, but is not limited thereto.

간별세포의 활성화를 억제하면 간별세포의 활성화에 의해 유도되는 간섬유화의 진행이 억제되는 효과가 있다. Inhibiting the activation of hepatic stellate cells has the effect of suppressing the progress of hepatic fibrosis induced by the activation of hepatic stellate cells.

또한, 본 발명은 In addition, the present invention

1) 마우스 대식세포에 LPS를 처리한 후 배양한 배양액을 간별세포에 처리하여 간별세포를 활성화 시키는 단계;1) activating hepatic stellate cells by treating mouse macrophages with LPS and then treating the culture medium with hepatic stellate cells;

2) 상기 단계 1)의 활성화된 간별세포에 간섬유화 치료용 후보 물질을 처리하는 단계;2) treating the activated liver stellate cells of step 1) with a candidate substance for liver fibrosis treatment;

3) 상기 단계 2) 이후에, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및3) after step 2), measuring the expression level of lipocalin 2 protein or mRNA; and

4) 상기 단계 3) 이후에, 상기 단계 2)의 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현을 더 감소시키는 상기 간섬유화 치료용 후보 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 시험관 내에서 상기 후보 물질로부터 간섬유화 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 4) after step 3), comparing the candidate substance of step 2) to the untreated control group, selecting a candidate substance for treating liver fibrosis that further reduces the expression of lipocalin 2 protein or mRNA;

상기 단계 1)의 마우스 대식세포에 LPS를 처리한 후 배양한 배양액은 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS를 20~28시간 동안 처리하여 획득한 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 RAW 264.7 세포에 LPS를 24시간 동안 처리하여 획득한 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. The culture medium after treating the mouse macrophages in step 1) with LPS is preferably obtained by treating RAW 264.7 cells, which are mouse macrophages, with LPS for 20 to 28 hours, and more preferably RAW 264.7 cells. It is obtained by treating LPS for 24 hours, but is not limited thereto.

상기 단계 3)에서, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현 이외에 추가로 MMP9 및 α-SMA의 단백질 및 mRNA 발현; 및 STAT3 인산화 정도 중에서 선택된 하나 이상의 수준을 측정하여 대조군과 비교할 수 있다. In the above step 3), in addition to lipocalin 2 protein or mRNA expression, MMP9 and α-SMA protein and mRNA expression; And the level of one or more selected from the degree of STAT3 phosphorylation can be measured and compared with the control group.

상기 간섬유화 치료물질은 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도되는 간섬유화를 치료하는 물질인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. The substance for treating liver fibrosis is a substance for treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin, comprising an antibody that specifically binds to lipocalin 2 protein as an active ingredient.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 모두 포함 가능하다. In one embodiment of the present invention, the antibody may include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.

본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체 상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs)이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.In order to increase the speed and convenience of diagnosis, the diagnostic composition of the present invention may be provided in an immobilized state on a suitable carrier or support using various methods known in the art. Examples of suitable carriers or supports include agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposomes, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide, polysterine, gabbro, filter paper, ion exchange resins, plastic films, plastic tubes, glass, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymers, amino acid copolymers, ethylene-maleic acid copolymers, nylon, cups, flat packs. Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes. The support may have any conceivable shape, for example spherical (bead), cylindrical (inside a test tube or well), planar (sheet, test strip).

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin comprising the composition.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 혈청 시료 중의 LCN2 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 혈청 시료가 적용되는 샘플 패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출 패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 제공될 수 있다.The diagnostic kit may be provided in the form of, for example, a lateral flow assay kit based on immunochromatography to detect the LCN2 protein in serum samples. The lateral flow assay kit may be provided with a sample pad to which a serum sample is applied, a release pad coated with an antibody for detection, a membrane (e.g., nitrocellulose) or strip for development in which the sample is moved and separated and an antigen-antibody reaction occurs, and an absorption pad.

또한, 본 발명은 리포칼린 2 mRNA를 정량적으로 검출하는 제제를 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for diagnosing hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin, including an agent for quantitatively detecting lipocalin 2 mRNA.

상기 mRNA 정량 검출은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택된 방법을 통한 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다. The mRNA quantitative detection is preferably performed through a method selected from among RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, and DNA chip, but is not limited thereto.

상기 제제는 리포칼린 2 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있지만, 이에 제한하는 것은 아니다. The preparation may include, but is not limited to, primers for preparing cDNA corresponding to lipocalin 2 mRNA, reverse transcriptase, Taq polymerase, PCR primers, and dNTPs.

또한, 본 발명은 In addition, the present invention

1) 피검 대상으로부터 분리된 시료 내 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 단계; 및1) measuring the amount of lipocalin 2 protein or mRNA in a sample isolated from the test subject; and

2) 상기 단계 1)에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 양을 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단을 위한 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 2) comparing the amount of protein or mRNA measured in step 1) with a normal control group; providing information on the amount of lipocalin 2 protein or mRNA for diagnosis of hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin.

상기 시료는 간 조직, 혈청, 혈장, 혈액 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.The sample is preferably any one selected from the group consisting of liver tissue, serum, plasma, blood and urine, but is not limited thereto.

상기 단계 1)에서, 리포칼린 2 이외에 추가로 MMP9 단백질 또는 mRNA의 양을 측정할 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다. In step 1), the amount of MMP9 protein or mRNA may be additionally measured in addition to lipocalin 2, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail using examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it is obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.

재료 및 방법Materials and Methods

동물animal

수컷 야생형(WT) C57BL/6J 및 렙틴 결핍 ob/ob 마우스는 (주)중앙실험동물(Central Laboratory Animal, Inc., 서울, 한국)에서 구입하였다. Male wild-type (WT) C57BL/6J and leptin-deficient ob/ob mice were purchased from Central Laboratory Animal, Inc. (Seoul, Korea).

LCN2-결핍 ob/ob 이중 녹아웃(DKO) 마우스를 생성하기 위해 이형(heterozygous) ob/ob 마우스를 LCN2 녹아웃 마우스(미국 메릴랜드주 잭슨 연구소)와 교배하여 이형 LCN2+/-/ob+/- 마우스를 얻었으며, 이를 추가로 교배하여 DKO 마우스를 제작하였고, 4주령 마우스의 꼬리 끝에서 분리된 gDNA(genomic DNA)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 유전자형을 확인하였다. To generate LCN2-deficient ob/ob double knockout (DKO) mice, heterozygous ob/ob mice were mated with LCN2 knockout mice (Jackson Laboratory, Maryland, USA) to obtain heterozygous LCN2+/-/ob+/- mice, which were further mated to construct DKO mice, and gDNA (genomic DNA) isolated from the tail end of 4-week-old mice was used to confirm genotype through polymerase chain reaction (PCR). .

모든 마우스는 12시간 명/암 주기로 바이러스가 없는 시설에 수용되었고, 동물 실험은 국립보건원 실험동물 사용 지침에 따라 수행되었으며, 본 동물실험은 경상대학교 동물연구 동물보호위원회(GNU)의 승인(GNU-190701-M0033)을 얻은 후 수행되었다. All mice were housed in a virus-free facility with a 12-hour light/dark cycle, and animal experiments were performed according to the guidelines for the use of laboratory animals at the National Institute of Health.

고지방식이(HFD) 비만 마우스 모델의 경우, 최소 5주령의 수컷 WT, ob/ob 및 DKO 마우스에게 20주 동안 고지방식이를 섭취시켰고, 대조군으로는 정상식이(ND)를 섭취시켰다. In the case of the high-fat diet (HFD) obese mouse model, male WT, ob/ob and DKO mice at least 5 weeks of age were fed a high-fat diet for 20 weeks, and were fed a normal diet (ND) as a control group.

ob/ob 및 DKO 마우스에서 렙틴 주사의 효과를 확인하기 위해 10주령부터 4주 동안 재조합 렙틴(2mg/kg)을 주 2회 복강 내 주사하였다. To confirm the effect of leptin injection in ob/ob and DKO mice, recombinant leptin (2 mg/kg) was intraperitoneally injected twice a week for 4 weeks from 10 weeks of age.

재조합 리포칼린 2(rLCN2) 치료 모델의 경우, 22주령 수컷 WT 및 ob/ob 마우스에 희생 전 3일 동안 rLCN2(2.2mg/mL)를 복강내 주사하였다. For the recombinant lipocalin 2 (rLCN2) therapeutic model, 22-week-old male WT and ob/ob mice were intraperitoneally injected with rLCN2 (2.2 mg/mL) for 3 days prior to sacrifice.

재조합 mCherry-LCN2 및 렙틴-ABD 제조 및 정제Preparation and purification of recombinant mCherry-LCN2 and leptin-ABD

제한 효소(Nde1, EcoR1 및 Nhe1)는 New England BioLabs(Ipswich, MA, USA)에서 구입하였다. 아가로스, 카나마이신, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드, 류펩틴 및 트립신 억제제는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. BL21(DE3) E. coli 컴피턴트 세포(competent cell) 및 BCA 단백질 분석 키트는 Thermo Fisher Scientific(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. LB 브로스는 Difco(Sparks, MD, USA)에서 구입하였다.Restriction enzymes (Nde1, EcoR1 and Nhe1) were purchased from New England BioLabs (Ipswich, MA, USA). Agarose, kanamycin, isopropyl-β-D-thiogalactoside, leupeptin and trypsin inhibitors were purchased from Sigma-Aldrich. BL21(DE3) E. coli competent cells and BCA protein assay kits were purchased from Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). LB broth was purchased from Difco (Sparks, MD, USA).

pET28a-mCherry-LCN2 벡터는 'mCherry 및 LCN2'-암호화 유전자(1314bp; GenScript, Piscataway, NJ, USA로부터 입수한 pUC57-mini 벡터에 삽입)를 Nde1 및 EcoR1으로 절단하고 선형화된 pET28a 벡터(Merck Millipore, Billerica, MA, USA)에 결찰(ligation)하여 구축하였다. The pET28a-mCherry-LCN2 vector was constructed by digesting the 'mCherry and LCN2'-encoding genes (1314 bp; inserted into the pUC57-mini vector obtained from GenScript, Piscataway, NJ, USA) with Nde1 and EcoR1 and ligation into the linearized pET28a vector (Merck Millipore, Billerica, MA, USA).

유사하게, pET28a-SUMO-렙틴-ABD로 명명된 SUMO-태그가 붙은 렙틴-ABD(렙틴-ABD) 발현 벡터는 Nde1 및 Nhe1이 있는 pUC-57 미니-렙틴(GenScript)으로부터 '인간 렙틴' 유전자(510 bp)를 절단(digestion)하고, 선형화된 pET28a-SUMO-ABD 벡터에 결찰하여 준비하였다. Similarly, a SUMO-tagged leptin-ABD (leptin-ABD) expression vector named pET28a-SUMO-leptin-ABD was prepared by digesting the 'human leptin' gene (510 bp) from pUC-57 mini-leptin (GenScript) with Nde1 and Nhe1 and ligation to the linearized pET28a-SUMO-ABD vector.

mCherry-LCN2의 발현을 위해 pET28a-mCherry-LCN2 형질전환된 BL21(DE3) E. coli 세포의 콜로니를 50mL LB 배지(80μg/mL 카나마이신 함유)에 접종하여 스타터 배양물을 제조하였고, 상기 스타터 배양물을 250rpm으로 진탕하면서 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 배양 후, 스타터 배양물을 1L의 신선한 LB 배지(80㎍/mL 카나마이신 포함)에 첨가하고, 동일한 배양 조건에서 배양하였다. 600nm(OD600)에서 자외선 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1에 도달하면 isopropyl-β-D-thiogalactoside를 첨가하여(최종 농도: 0.5mM) 단백질 발현을 유도하였다. 발현 유도 후, 추가로 4시간 동안 배양하였고, 배양 후, 원심분리를 통해 세포를 수확하였으며, 수확된 세포를 60mL 용해 완충액[20mM 포스페이트, 300mM NaCl, 1% 류펩틴, 및 1% 대두 트립신 억제제(Sigma-Aldrich; pH 7)]에 재현탁시켰다. 용해성 mCherry-LCN2를 포함하는 상층액 분획을 Talon®금속 친화성 수지(Clontech, Mountain View, CA, USA)에 로딩하고 세척 완충액(20mM PBS 및 300mM NaCl; pH 7)으로 세척한 뒤, 결합된 mCherry-LCN2는 용출 완충액(20mM PBS, 300mM NaCl, 및 300mM 이미다졸; pH 7)을 사용하여 용리하였다. For expression of mCherry-LCN2, starter cultures were prepared by inoculating colonies of pET28a-mCherry-LCN2-transformed BL21(DE3) E. coli cells into 50 mL LB medium (containing 80 μg/mL kanamycin), and incubated at 37° C. for at least 16 hours with shaking at 250 rpm. After cultivation, the starter culture was added to 1 L of fresh LB medium (containing 80 μg/mL kanamycin) and cultured under the same culture conditions. UV absorbance was measured at 600 nm (OD600), and when the absorbance value reached 1, isopropyl-β-D-thiogalactoside was added (final concentration: 0.5 mM) to induce protein expression. After induction of expression, incubation was performed for an additional 4 hours, and after incubation, cells were harvested by centrifugation, and the harvested cells were resuspended in 60 mL lysis buffer [20 mM phosphate, 300 mM NaCl, 1% leupeptin, and 1% soybean trypsin inhibitor (Sigma-Aldrich; pH 7)]. The supernatant containing the solubility mCherry-lcn2 loads the talon ® metal affinity resin (Clontech, Mountain View, CA, USA) and washing with a washing charging buffer (20mm PBS and 300mm nacl; pH 7), and then the combined mcherry-lcn2 is a dissolution buffer (20mm) PBS, 300mm NACL, and 300mm imidazole; pH 7) were fulfilled.

렙틴-ABD의 생산은 mCherry-LCN2와 동일한 절차를 사용하여 수행하였다. Production of leptin-ABD was performed using the same procedure as mCherry-LCN2.

mCherry-LCN2 및 leptin-ABD는 모두 E. coli로부터 가용성 단백질로 발현되었으며, 최종 생성물의 평균 생산 수율은 각각 25 및 5.7mg/L였다.Both mCherry-LCN2 and leptin-ABD were expressed as soluble proteins from E. coli , and the average production yields of the final products were 25 and 5.7 mg/L, respectively.

혈청 대사 매개변수(serum metabolic parameter) 측정Measurement of serum metabolic parameters

혈청 LCN2, MMP9 및 렙틴은 마우스 LCN2, MMP9, 렙틴(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.Serum LCN2, MMP9, and leptin were measured using mouse LCN2, MMP9, and leptin (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ELISA kits according to the manufacturer's protocol.

조직 적출 및 조직학적 분석Tissue removal and histological analysis

조직학적 분석을 위해 마우스를 졸레틸(zoletil)로 마취하고 0.1M PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드로 관류하였다. 간 및 췌장을 포함한 조직은 적출한 후, 4℃에서 12시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하였고, 파라핀에 포매한 다음 5㎛ 섹션으로 절단하였다. For histological analysis, mice were anesthetized with zoletil and perfused with 4% paraformaldehyde diluted in 0.1 M PBS. Tissues including liver and pancreas were excised, fixed in 4% paraformaldehyde at 4° C. for 12 hours, embedded in paraffin, and cut into 5 μm sections.

간 중성지방(triglyceride, TG) 확인을 위한 Nile red(Sigma-Aldrich) 염색, 조직학적 섬유증 확인을 위한 Picro-Sirius red(SigmaAldrich) 염색 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 냉동 및 파라핀 포매 간 절편에서 각각 수행되었다. Nile red (Sigma-Aldrich) staining to check liver triglyceride (TG), Picro-Sirius red (SigmaAldrich) staining and hematoxylin and eosin (H&E) staining to check histological fibrosis were performed on frozen and paraffin-embedded liver sections, respectively.

i-Solution(IMT i-Solution, Inc., Vancouver, BC, Canada)을 사용하여 3개의 섹션에서 Nile red 양성 영역(250 ×250μ㎡)의 백분율을 측정하였다. The percentage of Nile red positive area (250 × 250 μm 2 ) was measured in three sections using i-Solution (IMT i-Solution, Inc., Vancouver, BC, Canada).

Sirius red 염색의 경우, 재수화된 섹션을 8분 동안 헤마톡실린으로 염색하고 1시간 동안 Sirius red 용액으로 염색하였다. 염색 후 절편을 100% 알코올에서 직접 탈수하고 자일렌(xylene)으로 제거한 다음 수지 매질에 장착하였다. 섹션은 BX53 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 시각화하였다. For Sirius red staining, rehydrated sections were stained with hematoxylin for 8 minutes and then with Sirius red solution for 1 hour. After staining, the sections were directly dehydrated in 100% alcohol, removed with xylene, and mounted in a resin medium. Sections were visualized with a BX53 light microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

그룹당 3~5마리 마우스의 5~14 필드(배율 x100)에서 Sirius red 양성 영역을 ImageJ 소프트웨어(버전 1.52a, NIH, Bethesda, MD, USA)로 정량화하였다. 데이터는 Sirius red에 대해 양성으로 염색된 백분율 영역으로 표시하였다. Sirius red-positive areas in 5-14 fields (magnification x100) of 3-5 mice per group were quantified with ImageJ software (version 1.52a, NIH, Bethesda, MD, USA). Data are expressed as percentage area stained positive for Sirius red.

비알코올성지방간질환(NAFLD) 활동 점수 측정 Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) activity score measurement

NAFLD 활성 점수는 간 지방증(0-3), 소엽 염증(0-3) 및 간세포 팽창(0-2)에 대한 점수의 비가중 합계로 정의하였다. The NAFLD activity score was defined as the unweighted sum of the scores for hepatic steatosis (0-3), lobular inflammation (0-3) and hepatocyte expansion (0-2).

비알코올성지방간 질환non-alcoholic fatty liver disease 점수 기준score criteria 점수score 지방증
(steatosis)steatosis
(steatosis) <5% hepatocyte involved<5% hepatocyte involved 00 5~33% hepatocyte involved5-33% hepatocyte involved +1+1 34~66% hepatocyte involved34-66% hepatocyte involved +2+2 >66% hepatocyte involved>66% hepatocyte involved +3+3 소엽염증
(lobular inflammation)Lobular inflammation
(lobular inflammation) No fociNo foci 00 1 foci per X 200 field1 foci per X 200 fields +1+1 2~4 foci per X 200 field2 to 4 foci per X 200 field +2+2 >4 foci per X 200 field>4 foci per X 200 fields +3+3 간세포풍선변성
(hepatocellular ballooning)Hepatocellular balloon degeneration
(hepatocellular ballooning) NoneNone 00 few balloooned cellsfew ballooned cells +1+1 many cells/prominent ballooningmany cells/prominent ballooning +2+2

Duolink 근접 결찰 분석Duolink proximity ligation assay

Duolink 근접 결찰 분석(PLA; Sigma-Aldrich)은 ob/ob 마우스의 파라핀 포매 간 절편에서 LCN2와 MMP9 사이의 상호 작용을 분석하기 위해 사용되었다. Duolink proximity ligation assay (PLA; Sigma-Aldrich) was used to analyze the interaction between LCN2 and MMP9 in paraffin-embedded liver sections of ob/ob mice.

차단(blocking) 후 절편을 염소 항-LCN2(ab31289) 및 토끼 항-MMP9(ab38898) 또는 항-LCN2(R&D 1857) 및 항-24p3R(PA5-20543)로 반응시켰다. 그 후, 절편을 PLA 프로브 항토끼 MINUS(DUO92005) 및 PLA 프로브 항염소 플러스(DUO92003)와 함께 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. Duolink 분석을 수행한 후 섹션을 DAPI(Invitrogen)로 염색한 후, 세척하였고, mounting 용액을 사용하여 커버 슬립에 mounting하였다. 절편 이미지는 BX51-DSU 현미경(Olympus)으로 확인하였다. After blocking, the sections were reacted with goat anti-LCN2 (ab31289) and rabbit anti-MMP9 (ab38898) or anti-LCN2 (R&D 1857) and anti-24p3R (PA5-20543). Then, the sections were reacted with PLA probe anti-rabbit MINUS (DUO92005) and PLA probe anti-goat Plus (DUO92003) at 37° C. for 1 hour. After performing Duolink analysis, sections were stained with DAPI (Invitrogen), washed, and mounted on cover slips using mounting solution. Slice images were confirmed with a BX51-DSU microscope (Olympus).

세포 배양cell culture

대식세포 세포주인 RAW 264.7 및 인간 간별세포(hepatic stellate cell, HSC)인 LX-2(SigmaAldrich)는 10% 소 태아 혈청(Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 포함된 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO2 가습 배양기에서 배양하였다. RAW 264.7, a macrophage cell line, and LX-2 (SigmaAldrich), a human hepatic stellate cell (HSC), were cultured in a DMEM medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) containing 10% fetal bovine serum (Gibco) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco) at 37°C, 5% CO 2 in a humidified incubator.

한편, LCN2의 분비를 위해, RAW 264.7 세포를 지질 다당류(LPS; 100ng/mL, SigmaAldrich)로 자극하였다. LCN2 유도 활성화를 위해 RAW 264.7 세포를 LPS로 24시간 동안 처리하였고 LCN2를 포함하는 배지를 LX-2 세포 또는 1차 마우스 HSC(mHSC)와 함께 배양하였다. Meanwhile, for secretion of LCN2, RAW 264.7 cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS; 100 ng/mL, SigmaAldrich). For LCN2-induced activation, RAW 264.7 cells were treated with LPS for 24 hours and cultured with LX-2 cells or primary mouse HSC (mHSC) in LCN2-containing medium.

간 세포 및 1차 mHSC의 분리 및 배양Isolation and culture of liver cells and primary mHSCs

간세포 및 mHSC는 효소 소화 및 밀도 구배 원심분리에 의해 ob/ob 마우스에서 분리되었다. 간략히, 세포는 EGTA, 프로나제(pronase; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 및 콜라게나제 NB4G(Nordmark Pharma GmbH, Uetersen, Germany)를 사용한 인시투 간 관류(in situ liver perfusion) 후 DNase Ⅰ(Thermo Fisher Scientific)이 포함된 용액 내에서 밀도 구배 원심분리에 의해 간 조직으로부터 분리되었다.Hepatocytes and mHSCs were isolated from ob/ob mice by enzymatic digestion and density gradient centrifugation. Briefly, cells were isolated from liver tissue by density gradient centrifugation in a solution containing DNase I (Thermo Fisher Scientific) after in situ liver perfusion with EGTA, pronase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) and collagenase NB4G (Nordmark Pharma GmbH, Uetersen, Germany).

분산된 세포 현탁액을 70μm 세포 여과기(strainer)로 여과하고, 100×g에서 3분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛과 상등액을 각각 실질(parenchymal, PC) 및 비실질(non-parenchymal, NPC)로 나눠 분획하였다. The dispersed cell suspension was filtered through a 70 μm cell strainer, centrifuged at 100 × g for 3 minutes, and the cell pellet and supernatant were fractionated into parenchymal (PC) and non-parenchymal (NPC), respectively.

PC 분획을 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution; Gibco)에서 4회 세척하였고, 조간세포 정제를 위해 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific)이 포함된 RIPA 용해 완충액(50mM Tris-HCl; pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트, 150mM NaCl, 1 mM EDTA)에서 용해시켰다. The PC fraction was washed 4 times in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; Gibco) and lysed in RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl; pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) containing protease and phosphatase inhibitor cocktails (Thermo Fisher Scientific) for hepatocyte purification.

또한, NPC 분획을 580×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 세척하고 15% OptiPrep(Sigma-Aldrich)에 재현탁한 다음 충분히 혼합한 후 15mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 그런 다음, 11.5% OptiPrep 5mL 및 2mL HBSS를 세포 현탁액에 개별적으로 조심스럽게 층으로 쌓았다. 그런 다음 세포 분획을 1400×g에서 20분 동안 원심분리한 후 튜브를 두 개의 층(첫 번째 층의 mHSC 분획과 두 번째 층의 Kupffer 세포 분획)으로 나누었다. Kupffer 세포 분획을 HBSS로 세척하고 RIPA 용해 완충액에서 용해하여 정제하였다. mHSC 분획은 반으로 나누어 절반은 RIPA 용해 완충액에 용해하였고, 나머지 절반은 10% 소 태아혈청(Gibco) 및 항생제(Gibco)가 보충된 DMEM에 현탁 및 유지하였다. mHSC의 순도는 분리 하루 후, RT-PCR에 의해 평가 및 추정되었으며, 순도 98% 이상을 유지하였다. In addition, the NPC fraction was centrifuged at 580×g for 10 minutes, the pellet was washed, resuspended in 15% OptiPrep (Sigma-Aldrich), thoroughly mixed, and transferred to a 15mL centrifugal tube. Then, 5 mL of 11.5% OptiPrep and 2 mL HBSS were carefully layered individually on the cell suspension. The cell fraction was then centrifuged at 1400 x g for 20 minutes and the tube was divided into two layers (mHSC fraction in the first layer and Kupffer cell fraction in the second layer). The Kupffer cell fraction was purified by washing with HBSS and lysing in RIPA lysis buffer. The mHSC fraction was divided in half, half was lysed in RIPA lysis buffer, and the other half was suspended and maintained in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and antibiotics (Gibco). The purity of mHSC was evaluated and estimated by RT-PCR one day after isolation, and the purity was maintained at 98% or higher.

전체 실험은 mHSC를 분리한 후, 1~2회 계대 후 5~7일 이내에 실시하였다. mHSC의 LTM 및 si24p3R에 따른 영향을 확인하기 위해, 세포를 24시간 동안 20nM 24p3R siRNA로 형질감염시켰고, 이어서 세포를 혈청 결핍 배지에서 배양하거나 LPS 처리 배지(LTM)로 24시간 동안 처리한 후 Nile red(SigmaAldrich) 염색을 하였다. 핵은 DAPI(Invitrogen)로 대조염색하였다. VectaMount(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 슬라이드를 장착하고 BX51-DSU 현미경(Olympus)을 사용하여 대표적인 이미지를 촬영하였다. i-Solution(IMT i-Solution, Inc.)을 사용하여 3개 분야에서 Nile red 양성 면적(250×250μ㎡)의 백분율을 측정하였다.The entire experiment was conducted within 5 to 7 days after isolating mHSCs and passaging 1 to 2 times. To confirm the effect of LTM and si24p3R on mHSC, cells were transfected with 20 nM 24p3R siRNA for 24 hours, and then the cells were cultured in serum-depleted medium or treated with LPS-treated medium (LTM) for 24 hours, followed by Nile red (SigmaAldrich) staining. Nuclei were counterstained with DAPI (Invitrogen). Slides were mounted with VectaMount (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) and representative images were taken using a BX51-DSU microscope (Olympus). The percentage of Nile red positive area (250×250 μm 2 ) was measured in three fields using i-Solution (IMT i-Solution, Inc.).

rLCN2 처리rLCN2 treatment

mHSC는 1, 3 또는 5μg/mL rLCN2를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.mHSCs were cultured for 24 hours after treatment with 1, 3 or 5 μg/mL rLCN2.

siRNA 형질감염siRNA transfection

인간 또는 마우스 24p3R의 siRNA 표적은 Bioneer Corp.(대전, 한국)에서 구입하였다. siRNA 및 scrambled RNA 서열은 하기 표 2에 개시된 바와 같다. 세포는 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 24p3R siRNA 또는 대조군 스크램블 siRNA로 형질감염시켰다. siRNA targets of human or mouse 24p3R were purchased from Bioneer Corp. (Daejeon, Korea). siRNA and scrambled RNA sequences are as set forth in Table 2 below. Cells were transfected with 24p3R siRNA or control scrambled siRNA using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.

서열번호 1SEQ ID NO: 1 사람 si24p3R 서열 senseHuman si24p3R sequence sense 5'-GUGUUGACCUGGGUGUCUA-3'5'-GUGUUGACCUGGGUGUCUA-3' 서열번호 2SEQ ID NO: 2 사람 si24p3R 서열 antisenseHuman si24p3R sequence antisense 5'-UAGACACCCAGGUCAACAC-3'5′-UAGACACCCAGGUCAACAC-3′ 서열번호 3SEQ ID NO: 3 마우스 si24p3R 서열 senseMouse si24p3R sequence sense 5'-GUGUUGACCUUGGUGUCUA-3'5'-GUGUUGACCUUGGUGUCUA-3' 서열번호 4SEQ ID NO: 4 마우스 si24p3R 서열 antisenseMouse si24p3R sequence antisense 5'-UAGACACCAAGGUCAACAC-3'5′-UAGACACCAAGGUCAACAC-3′ 서열번호 5SEQ ID NO: 5 scrambled RNA 서열scrambled RNA sequences 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3'5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3'

* LX-2세포주는 사람유래 세포주이므로 사람 si243R서열을 사용하였고, mHSC세포는 ob/ob마우스 유래 세포이므로 마우스 si243R서열을 사용함* Since the LX-2 cell line is a human-derived cell line, human si243R sequence was used, and mHSC cells were ob/ob mouse-derived cells, so mouse si243R sequence was used.

세포 이동(migration) 분석Cell migration assay

24p3R siRNA로 형질감염된 mHSC를 배양 삽입물(ibidi culture insert 2 well, ibidi GmbH, Martinsried, Germany)에 웰당 1×105 세포 밀도로 분주하였다. 그 후, 16시간 동안 세포를 부착시킨 다음, 배양 삽입물(culture insert)을 제거하고, 세포를 혈청-고갈 배지 또는 LTM과 함께 24시간 동안 배양하였다. LX-2 세포는 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃의 6웰 플레이트에서 배양하였고, 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 세포를 20nM 24p3R siRNA로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포는 단층 긁기 전에 16시간 동안 기아상태로 두었다. 상처를 입은 단층은 이후에 혈청이 결핍된 배지에서 배양되거나 24시간 동안 LTM으로 처리하였다. 상처 또는 긁힌 부위는 Olympus IX71 위상차 도립현미경으로 모니터링되었고 면적은 ImageJ 소프트웨어(버전 1.52a)를 사용하여 계산하였다. mHSC transfected with 24p3R siRNA were seeded into culture inserts (ibidi culture insert 2 well, ibidi GmbH, Martinsried, Germany) at a density of 1×10 5 cells per well. Thereafter, the cells were allowed to attach for 16 hours, the culture insert was removed, and the cells were cultured for 24 hours with serum-starved medium or LTM. LX-2 cells were cultured in 6-well plates at 37° C. in a 5% CO 2 humidified incubator, and upon reaching confluency, cells were transfected with 20 nM 24p3R siRNA. After 24 hours, cells were starved for 16 hours before monolayer scraping. Wounded monolayers were then cultured in serum-starved medium or treated with LTM for 24 hours. Wounds or scrapes were monitored with an Olympus IX71 phase-contrast inverted microscope and areas were calculated using ImageJ software (version 1.52a).

RNA 분리 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)RNA isolation and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

TRIzol 시약(Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 간에서 총 RNA를 추출하였고 RevertAid First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 역전사하였다. RT-PCR은 LightCycler 480 Instrument II(Roche Diagnostics GmbH)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭은 특정 프라이머와 함께 iQ™ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 수행하였고, 상대 정량화는 ΔΔCt 공식을 사용하여 계산하였다. 상대적인 mRNA 발현은 교정(calibrator) 샘플에 대한 배수 변화로 표현하였으며, 모든 샘플을 이중으로 실행하고 평균값을 계산하였다. Total RNA was extracted from the liver using TRIzol reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA) and reverse transcribed using the RevertAid First Strand cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientific). RT-PCR was performed using a LightCycler 480 Instrument II (Roche Diagnostics GmbH). PCR amplification was performed using iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, USA) with specific primers, and relative quantification was calculated using the ΔΔCt formula. Relative mRNA expression was expressed as fold change relative to the calibrator sample, all samples were run in duplicate and the average value was calculated.

조직 분류 및 웨스턴 블롯 분석Tissue sorting and western blot analysis

단백질 추출을 위해 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific)이 있는 T-PER 용해 완충액(Thermo Fisher Scientific)에서 냉동 간을 균질화하였다. 세포질 및 핵 분획 준비를 위해, 간은 빙냉 용해 완충액(10mM HEPES-KOH; pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 프로테아제 억제제) 및 고염 추출 완충액(20mM HEPES-KOH; pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 420mM NaCl, 0.2mM EDTA, 25% 글리세롤, 프로테아제 억제제, 0.5mM DTT)에서 각각 균질화되었다. 단백질 농도는 BCA 분석(Thermo Fisher Scientific)으로 측정하였다.Frozen livers were homogenized in T-PER lysis buffer (Thermo Fisher Scientific) with protease and phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) for protein extraction. For preparation of cytoplasmic and nuclear fractions, livers were lysed in ice-cold lysis buffer (10 mM HEPES-KOH; pH 7.9, 1.5 mM MgCl 2 , 10 mM KCl, protease inhibitors) and high salt extraction buffer (20 mM HEPES-KOH; pH 7.9, 1.5 mM MgCl 2 , 420 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 25% glycerol , protease inhibitor, 0.5 mM DTT), respectively. Protein concentration was determined by BCA assay (Thermo Fisher Scientific).

사용된 1차 항체는 표 2에 개시된 바와 같다. β-액틴은 단백질 수준을 정량화하기 위한 로딩 대조군으로 사용되었다. 강화된 화학발광 기질(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였고, LAS-4000 기기(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 화학발광을 분석하였다. 농도계 분석에는 Multi-Gauge V 3.0 이미지 분석 프로그램(Fujifilm)을 사용하였다.Primary antibodies used are as described in Table 2. β-actin was used as a loading control to quantify protein levels. Protein bands were detected using an enhanced chemiluminescent substrate (Pierce, Rockford, IL, USA), and chemiluminescence was analyzed using a LAS-4000 instrument (Fujifilm, Tokyo, Japan). For densitometry analysis, Multi-Gauge V 3.0 image analysis program (Fujifilm) was used.

AntibodyAntibody CompanyCompany Catalog No.Catalog No. Dilution(s)Dilution(s) ApplicationsApplications SourceSource LCN2LCN2 R&DR&D AF1857AF1857 1:1000, 1:200, 1:1001:1000, 1:200, 1:100 WB, IF, DuolinkWB, IF, Duolink GoatGoat LCN2LCN2 R&DR&D AF3508AF3508 1:2001:200 IF, IP, IHCIF, IP, IHC GoatGoat LCN2LCN2 AbcamAbcam ab31289ab31289 1:201:20 DuolinkDuolink GoatGoat α-SMAα-SMA SigmaSigma A5228A5228 1:10001:1000 WB, IFWB, IF MouseMouse MMP9MMP9 AbcamAbcam ab38898ab38898 1:1000, 1:201:1000, 1:20 WB, DuolinkWB, Duolink RabbitRabbit pSTAT3pSTAT3 Cell SignalingCell Signaling #9131, #9145#9131, #9145 1:1,0001:1,000 WBWB RabbitRabbit STAT3STAT3 Cell SignalingCell Signaling #9139#9139 1:1,0001:1,000 WBWB MouseMouse 24p3R24p3R InvitrogenInvitrogen PA5-20543PA5-20543 1:1000, 1:1001:1000, 1:100 WB, DuolinkWB, Duolink RabbitRabbit β-actinβ-actin SigmaSigma A5441A5441 1:1,0001:1,000 WBWB MouseMouse TNF-αTNF-α AbcamAbcam ab9739ab9739 1:1,0001:1,000 WBWB MouseMouse IL-6IL-6 Santa CruzSanta Cruz sc-57315sc-57315 1:1,0001:1,000 WBWB MouseMouse

WB, western blot; IF, immunofluorescence; IHC, immunohistochemistryWB, western blot; IF, immunofluorescence; IHC, immunohistochemistry

통계 분석statistical analysis

통계 분석은 PRISM 7.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 각 그룹 차이는 짝지어지지 않은 스튜던트 t-검정 또는 일원 및 이원 ANOVA에 이어 Tukey의 사후 검정을 사용하여 결정하였고, 모든 값은 평균±평균의 표준 오차(S.E.M.)로 표시하였다. p-값<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. Statistical analysis was performed using PRISM 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Each group difference was determined using an unpaired Student's t-test or one-way and two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, and all values were expressed as mean ± standard error of the mean (S.E.M.). A p-value <0.05 was considered statistically significant.

실시예 1. 간 손상에서 LCN2의 발현Example 1. Expression of LCN2 in liver damage

비알코올성지방간염 및 이로 인한 간섬유화시 LCN2의 발현을 확인하였다. 도 1에 개시된 바와 같이 Nile red로 염색하여 지방의 형성 정도를 확인하였을 때, 고지방식이(HFD)에 의해 지방간이 유도되었고, 렙틴 결여 마우스인 ob/ob 마우스는 일반식이(ND) 및 고지방식이(HFD) 모두에서 지방간이 유도되었다. 또한, Sirius red로 염색하여 섬유화 정도를 확인한 결과, 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스는 야생형 마우스(WT) 및 일반식이를 섭취한 ob/ob 마우스에 비해 간섬유화가 현저하게 진행된 것을 확인하였다. Expression of LCN2 was confirmed in non-alcoholic steatohepatitis and liver fibrosis caused by it. As shown in Figure 1, when the degree of fat formation was confirmed by staining with Nile red, fatty liver was induced by a high fat diet (HFD), and ob / ob mice, which are leptin-deficient mice, had a normal diet (ND) and high fat diet. Fatty liver was induced in both (HFD). In addition, as a result of confirming the degree of fibrosis by staining with Sirius red, it was confirmed that liver fibrosis was significantly progressed in ob/ob mice fed a high-fat diet compared to wild-type mice (WT) and ob/ob mice fed a normal diet.

이들 동물모델의 혈액으로부터 LCN2의 발현을 확인한 결과, 도 2A에 개시된 바와 같이, 야생형 마우스에 비해 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서 혈액 내 LCN2의 발현이 증가하였고, 간섬유화가 많이 진행된 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스에서 LCN2의 발현이 현저하게 증가되어 있었다. 또한, 간 조직에서 LCN2의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과, 혈액 내 LCN2 발현 변화와 유사하게 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스의 간 조직에서 LCN2의 발현이 현저하게 증가되어 있었다. As a result of confirming the expression of LCN2 in the blood of these animal models, as shown in FIG. 2A, the expression of LCN2 in the blood was increased in ob/ob mice lacking leptin compared to wild-type mice, and the expression of LCN2 was markedly increased in ob/ob mice fed a high-fat diet with advanced hepatic fibrosis. In addition, as a result of confirming the change in mRNA expression of LCN2 in liver tissue, LCN2 expression was significantly increased in liver tissue of ob/ob mice fed a high-fat diet, similar to the change in LCN2 expression in blood.

간 조직에서 LCN2 단백질 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 도 2B에 개시된 바와 같이 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스에서 LCN2의 단백질 발현이 현저하게 증가하였고, 간 조직의 α-SMA의 발현도 증가되어 있었다. As a result of confirming LCN2 protein changes in liver tissue by Western blot, as shown in FIG. 2B, the protein expression of LCN2 was significantly increased in ob/ob mice fed a high-fat diet, and the expression of α-SMA in liver tissue was also increased.

이를 통해 LCN2가 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염의 α-SMA와 연관된 간섬유화 신호전달에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.Through this, it was confirmed that LCN2 plays an important role in α-SMA-related liver fibrosis signaling in non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin.

실시예 2. 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스의 간섬유화에서 LCN2의 역할 규명Example 2. Identification of the role of LCN2 in liver fibrosis in ob/ob mice fed a high-fat diet

LCN2가 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스의 간섬유화를 어떻게 조절하는지 확인하였다. 간 조직에서 간섬유화 중요 인자인 MMP9의 발현을 확인한 결과, 도 3A에 개시된 바와 같이 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스에서 MMP9의 발현이 현저하게 증가하였고, LCN2 및 MMP9이 조절하는 것으로 알려진 STAT3의 인산화도 증가되어 있었다. We confirmed how LCN2 regulates liver fibrosis in ob/ob mice fed a high-fat diet. As a result of confirming the expression of MMP9, an important factor for hepatic fibrosis, in liver tissue, as shown in FIG. 3A, the expression of MMP9 was significantly increased in ob/ob mice fed a high-fat diet, and phosphorylation of STAT3 known to be regulated by LCN2 and MMP9 was also increased.

Duolink 분석을 통해 LCN2 및 MMP9 양성 세포를 확인한 결과, 도 3B 및 3C에 개시된 바와 같이, LCN2 및 MMP9 양성 세포가 고지방식이를 섭취한 ob/ob 마우스에서 확연히 증가되어 있었다. As a result of confirming LCN2 and MMP9-positive cells through Duolink analysis, as shown in FIGS. 3B and 3C, LCN2- and MMP9-positive cells were significantly increased in ob/ob mice fed a high-fat diet.

이를 통해 LCN2 연관된 MMP9/STAT3 신호전달이 비알코올성지방간의 간섬유화 진행에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. Through this, it was confirmed that LCN2-related MMP9/STAT3 signaling plays an important role in the progression of liver fibrosis in non-alcoholic fatty liver.

실시예 3. LCN2 과발현에 의한 MMP9/STAT3 변화 확인Example 3. Confirmation of MMP9/STAT3 changes by LCN2 overexpression

재조합 LCN2 단백질을 마우스 복강에 3일 동안 1일 1회(2.2mg/mL) 주입한 후, LCN2에 의한 MMP9 단백질 발현 변화 및 STAT3 인산화 정도를 확인하였다. After injecting the recombinant LCN2 protein into the mouse peritoneal cavity once a day (2.2 mg/mL) for 3 days, the change in MMP9 protein expression and the degree of phosphorylation of STAT3 by LCN2 were confirmed.

그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 LCN2 단백질이 증가하면 MMP9의 단백질 발현 및 STAT3의 인산화 정도도 증가하였고, 이러한 증가는 야생형 마우스 대비 렙틴이 결여된 ob/ob 마우스에서 현저하였다. As a result, as shown in FIG. 4, when the LCN2 protein increased, the protein expression of MMP9 and the degree of phosphorylation of STAT3 also increased, and this increase was remarkable in ob/ob mice lacking leptin compared to wild-type mice.

실시예 4. 렙틴이 있는 조건에서, LCN2 결여에 의한 MMP9/STAT3 변화 확인Example 4. Confirmation of MMP9/STAT3 changes by lack of LCN2 in the presence of leptin

렙틴 및 LCN2가 이중으로 결여된 동물모델(DKO)을 제작한 후, 렙틴이 있는 조건에서 LCN2 결여에 의한 비알코올성지방간염에서 유도된 간섬유화 개선 정도를 확인하였다. After constructing an animal model (DKO) lacking leptin and LCN2, the degree of improvement in liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis by LCN2 deficiency was confirmed in the presence of leptin.

DKO 마우스 및 ob/ob 마우스에 렙틴을 투여한 후, 혈액 내 렙틴 및 LCN2의 함량을 확인한 결과, 도 5A에 개시된 바와 같이, 혈액 내에서 렙틴은 양 그룹 간 차이가 거의 없었고, ob/ob 마우스에서 검출된 LCN2가 DKO 마우스에서는 검출되지 않는 것을 확인하였다. After administering leptin to DKO mice and ob/ob mice, the contents of leptin and LCN2 in the blood were confirmed. As shown in FIG. 5A, there was little difference in leptin between the two groups, and it was confirmed that LCN2 detected in ob/ob mice was not detected in DKO mice.

상기 동물모델의 간 조직에서 LCN2 및 이와 연관된 인자의 발현 및 인산화 정도를 확인한 결과, 도 5B 및 C에 개시된 바와 같이, 렙틴 투여시, LCN2 존재 유무에 따른 MMP9의 발현, α-SMA의 발현 및 STAT3의 인산화 정도의 변화가 미미하였고, 도 5D 및 E에 개시된 바와 같이, 지방의 생성 정도 및 간섬유화 정도에서도 LCN2 결여에 의한 차이가 거의 없었다. As a result of confirming the expression and phosphorylation level of LCN2 and related factors in the liver tissue of the animal model, as shown in FIGS. 5B and C, when leptin was administered, the expression of MMP9, α-SMA expression, and the degree of phosphorylation of STAT3 were insignificant according to the presence or absence of LCN2. As shown in FIGS.

이를 통해 렙틴의 투여는 LCN2가 결여된 마우스에서 MMP9/STAT 3을 통한 간의 α-SMA 관련 간섬유화를 촉진시키지 못한다는 것을 확인하였다. Through this, it was confirmed that administration of leptin did not promote hepatic α-SMA-related hepatic fibrosis through MMP9/STAT 3 in LCN2-deficient mice.

실시예 5. LCN2 결여에 의한 MMP9/STAT3 변화 및 간섬유화 정도 확인Example 5. Confirmation of MMP9/STAT3 changes and degree of hepatic fibrosis by LCN2 deficiency

렙틴 및 LCN2가 이중으로 결여된 동물모델(DKO)에서, LCN2 결여에 의한 MMP9/STAT3 변화 및 간섬유화 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 6A에 개시된 바와 같이, 간 조직에서 LCN2의 결여에 의해 MMP9 및 STAT3의 인산화가 현저하게 감소하는 것을 확인하였고, 도 6B에 개시된 바와 같이 혈액 내 MMP9의 함량 또한 감소한 것을 확인하였다. In an animal model lacking leptin and LCN2 (DKO), MMP9/STAT3 changes and the degree of hepatic fibrosis due to LCN2 deficiency were confirmed. As a result, as shown in FIG. 6A, it was confirmed that the phosphorylation of MMP9 and STAT3 was significantly reduced by the lack of LCN2 in liver tissue, and as shown in FIG. 6B, it was confirmed that the content of MMP9 in the blood was also reduced.

또한, 도 6C에 개시된 바와 같이 Sirius red 염색을 통해 간섬유화 정도를 확인한 결과, DKO 마우스의 간섬유화 정도가 ob/ob 마우스 대비 현저하게 감소한 것을 확인하였다. In addition, as shown in FIG. 6C, as a result of confirming the degree of liver fibrosis through Sirius red staining, it was confirmed that the degree of liver fibrosis in DKO mice was significantly reduced compared to ob/ob mice.

이를 통해 LCN2의 결여는 MMP9/STAT3 신호전달을 하향조절하며, 고지방식이 ob/ob 마우스에서 비알코올성지방간염의 진행을 개선하는 것을 확인하였다. Through this, it was confirmed that the lack of LCN2 down-regulates MMP9/STAT3 signaling, and that the high-fat diet improves the progression of NASH in ob/ob mice.

실시예 6. LPS 처리된 마우스 대식세포 배지(LTM)에 의한 간별세포 활성화 확인Example 6. Confirmation of liver stellate cell activation by LPS-treated mouse macrophage medium (LTM)

LPS 처리된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 배양 배지(LPS-treated medium, LTM)에 의한 간별세포의 활성화를 확인하였다. 도 7A에 개시된 바와 같이 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 배양하면 배양 배지에서 LCN2, TNFα 및 IL-6의 함량이 증가하는 것을 확인하였고, 상기 배양 배지를 도 7B에 개시된 바와 같이 간별세포주인 LX-2 세포에 처리한 결과, 도 7C 및 7D에 개시된 바와 같이, LTM 처리된 LX-2 세포는 세포 용해물 내 α-SMA의 발현이 증가하였고, MMP9의 배양액으로의 분비가 증가하였다. Activation of hepatocytes by LPS-treated mouse macrophage RAW 264.7 culture medium (LPS-treated medium, LTM) was confirmed. As shown in FIG. 7A, when RAW 264.7 cells were treated with LPS and cultured, it was confirmed that the contents of LCN2, TNFα, and IL-6 in the culture medium increased. As a result of treating the culture medium with LX-2 cells, a hepatic cell line, as shown in FIG. Secretion increased.

이후, ob/ob 마우스 유래 1차 마우스 간별세포(mHSC)에서도 LTM 처리에 의해 간별세포의 활성화가 일어나는지 확인하였다. 그 결과, 도 8A에 개시된 바와 같이 간 조직의 LCN2의 발현 및 콜라겐 1α의 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 도 8B에 개시된 바와 같이, LTM 처리에 의해 세포 용해물 내 LCN2, 이의 수용체인 247p3R, α-SMA 및 STAT3 단백질 발현 및 STAT3 인산화 정도가 증가하였고, 세포 배양 배지에서 MMP9 및 LCN2 단백질 발현이 증가된 것을 확인하였다. Subsequently, it was confirmed whether activation of hepatic stellate cells by LTM treatment also occurs in primary mouse hepatic stellate cells (mHSCs) derived from ob/ob mice. As a result, as shown in FIG. 8A, it was confirmed that the expression of LCN2 in liver tissue and the mRNA expression of collagen 1α were increased, and as shown in FIG. 8B, LTM treatment increased the expression of LCN2, its receptor 247p3R, α-SMA and STAT3 protein and the degree of phosphorylation of STAT3 in the cell lysate, and it was confirmed that MMP9 and LCN2 protein expression increased in the cell culture medium.

이를 통해 LCN2는 STAT3 연관된 신호전달 및 MMP9의 분비를 통해 간별세포의 활성화를 직접적으로 조절한다는 것을 확인하였다. Through this, it was confirmed that LCN2 directly regulates the activation of hepatic cells through STAT3-related signaling and secretion of MMP9.

실시예 7. LTM 처리에 의해 활성화된 간별세포에서, LCN2의 24p3R을 통한 간별세포의 세포이동 촉진효과Example 7. In hepatic stellate cells activated by LTM treatment, cell migration promotion effect of hepatic stellate cells through 24p3R of LCN2

활성화된 간별세포에서 분비된 LCN2의 역할을 확인하기 위해, siRNA를 이용하여 LCN2 수용체인 24p3R의 발현을 저해하였다. 그 결과, 도 9A에 개시된 바와 같이 LTM 처리에 의해 증가되었던 세포 내 LCN2, α-SMA, STAT3 단백질 발현 및 STAT3 인산화 정도가 si24p3R 처리에 의해 감소하였고, MMP9 및 LCN2의 세포 외 분비가 감소하는 것을 확인하였다. In order to confirm the role of LCN2 secreted from activated hepatic stellate cells, expression of the LCN2 receptor 24p3R was inhibited using siRNA. As a result, as shown in FIG. 9A, the intracellular LCN2, α-SMA, and STAT3 protein expressions and STAT3 phosphorylation levels, which were increased by LTM treatment, were decreased by si24p3R treatment, and it was confirmed that the extracellular secretion of MMP9 and LCN2 was decreased.

또한, 간별세포는 활성화되며 지방 방울이 감소하는데, 지방 방울을 Nile red 염색을 통해 확인한 결과, 도 9B에 개시된 바와 같이, LTM 처리에 의해 증가된 간의 지방 방울 감소효과가 si24p3R 처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다. In addition, hepatic stellate cells were activated and fat droplets were reduced. As a result of confirming the fat droplets through Nile red staining, as shown in FIG. 9B, it was confirmed that the increased liver fat droplet reduction effect by LTM treatment was inhibited by si24p3R treatment.

활성화된 간별세포는 손상된 간 조직으로 이동하여 MMP9을 분비함으로써 간섬유화를 촉진하는데, 도 10에 개시된 바와 같이, LTM 처리에 의해 증가된 세포 이동이 si24p3R 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. Activated hepatic stellate cells migrate to damaged liver tissue and secrete MMP9 to promote hepatic fibrosis. As shown in FIG. 10 , it was confirmed that the increased cell migration by LTM treatment was reduced by si24p3R treatment.

이를 통해 분비된 LCN2는 렙틴이 결여된 조건에서 LCN2/24p3R을 통해 간별세포를 활성화시키고, 세포의 이동을 촉진하며, 24p3R의 발현을 억제하면 간별세포의 활성화가 억제되는 것을 확인하였다. It was confirmed that secreted LCN2 activates hepatic cells through LCN2/24p3R in the absence of leptin, promotes cell migration, and suppresses 24p3R expression to inhibit liver stellate cell activation.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis comprising lipocalin 2 or its receptor inhibitor as effective component <130> PN21510 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human si24p3R sense <400> 1 guguugaccu gggugucua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human si24p3R antisense <400> 2 uagacaccca ggucaacac 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse si24p3R sense <400> 3 guguugaccu uggugucua 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse si24p3R antisense <400> 4 uagacaccaa ggucaacac 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled RNA <400> 5 ccuacgccac caauuucgu 19 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis comprising lipocalin 2 or its receptor inhibitor as effective component <130> PN21510 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> human si24p3R sense <400> 1 gugugaccu gggugucua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> human si24p3R antisense <400> 2 uagacaccca ggucaacac 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> mouse si24p3R sense <400> 3 gugugaccu ugugucua 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> mouse si24p3R antisense <400> 4 uagacaccaa ggucaacac 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> scrambled RNA <400> 5 ccuacgccac caauuucgu 19

Claims (13)

리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis, containing lipocalin 2 or an expression inhibitor of its receptor as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제는 리포칼린 2 또는 이의 수용체에 특이적인 항체 또는 압타머; 및 리포칼린 2 또는 이의 수용체 유전자에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 miRNA;로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물.The method of claim 1, wherein the expression inhibitor of lipocalin 2 or its receptor is an antibody or aptamer specific to lipocalin 2 or its receptor; And Lipocalin 2 or its receptor specific siRNA, shRNA or miRNA; Pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis, characterized in that at least one selected from the group consisting of. 제1항에 있어서, 상기 간섬유화는 렙틴이 결여된 조건의 비알코올성지방간염으로부터 유도된 것을 특징으로 하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물.The pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis according to claim 1, wherein the hepatic fibrosis is induced from non-alcoholic steatohepatitis in a leptin-deficient condition. 인간을 제외한 개체에, 리포칼린 2 수용체 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는 간별세포(hepatic stellate cell)의 활성화를 억제하는 방법.A method of inhibiting the activation of hepatic stellate cells, comprising: treating a non-human subject with a lipocalin 2 receptor inhibitor. 1) 마우스 대식세포에 LPS를 처리한 후 배양한 배양액을 간별세포에 처리하여 간별세포를 활성화 시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 활성화된 간별세포에 간섬유화 치료용 후보 물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
4) 상기 단계 3) 이후에, 상기 단계 2)의 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA 발현을 더 감소시키는 상기 간섬유화 치료용 후보 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 시험관 내에서 상기 후보 물질로부터 간섬유화 치료물질을 스크리닝하는 방법.1) activating hepatic stellate cells by treating mouse macrophages with LPS and then treating the culture medium with hepatic stellate cells;
2) treating the activated liver stellate cells of step 1) with a candidate substance for liver fibrosis treatment;
3) after step 2), measuring the expression level of lipocalin 2 protein or mRNA; and
4) After step 3), comparing the candidate substance of step 2) to the untreated control group, selecting the candidate substance for treating liver fibrosis that further reduces the expression of lipocalin 2 protein or mRNA; A method of screening a liver fibrosis treatment substance from the candidate substance in vitro. 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 조성물.A composition for diagnosing hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin, comprising an antibody that specifically binds to lipocalin 2 protein as an active ingredient. 제6항의 조성물을 포함하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트.A kit for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin comprising the composition of claim 6. 리포칼린 2 mRNA를 정량적으로 검출하는 제제를 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트.A kit for diagnosing hepatic fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis lacking leptin, comprising an agent for quantitatively detecting lipocalin 2 mRNA. 제8항에 있어서, 상기 mRNA 정량 검출은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택된 방법을 통한 것을 특징으로 하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트.The kit for diagnosing liver fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin according to claim 8, wherein the mRNA quantitative detection is performed by a method selected from among RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, and DNA chip. 제8항에 있어서, 상기 간섬유화 진단용 키트는 리포칼린 2 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단용 키트.The kit for diagnosing liver fibrosis induced by nonalcoholic steatohepatitis lacking leptin according to claim 8, wherein the kit for diagnosing liver fibrosis comprises a primer for preparing cDNA corresponding to lipocalin 2 mRNA, a reverse transcriptase, Taq polymerase, a primer for PCR, and dNTP. 1) 피검 대상으로부터 분리된 시료 내 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 양을 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는, 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단을 위한 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 정보를 제공하는 방법.1) measuring the amount of lipocalin 2 protein or mRNA in a sample isolated from the test subject; and
2) comparing the amount of protein or mRNA measured in step 1) with a normal control group; a method for providing information on the amount of lipocalin 2 protein or mRNA for diagnosis of hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin. 제11항에 있어서, 상기 시료는 간 조직, 혈청, 혈장, 혈액 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단을 위한 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 11, wherein the sample is any one selected from the group consisting of liver tissue, serum, plasma, blood, and urine. Lipocalin 2 protein for diagnosis of hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin. A method for providing information on the amount of mRNA. 제11항에 있어서, 상기 단계 1)에서, 리포칼린 2 이외에 추가로 MMP9 단백질 또는 mRNA 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 렙틴이 결여된 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 진단을 위한 리포칼린 2 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 11, wherein the amount of MMP9 protein or mRNA is additionally measured in addition to lipocalin 2 in step 1) for diagnosing hepatic fibrosis induced by non-alcoholic steatohepatitis lacking leptin. A method for providing information on the amount of protein or mRNA of lipocalin 2.
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