KR20230104157A

KR20230104157A - 항-ngf 항체 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR20230104157A
Application number: KR1020237015358A
Authority: KR
Inventors: 리사 마리 버거론; 캐서린 제이. 스트리첼; 개리 에프. 배머트; 그레이엄 베인브릿지
Original assignee: 조에티스 서비시즈 엘엘씨
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2021-10-07
Publication date: 2023-07-07
Also published as: AU2021358987A1; WO2022076712A3; US20220106391A1; CN116568708A; MX2023004020A; EP4225788A2; JP2023544839A; WO2022076712A2; CA3198362A1

Abstract

본 개시내용은 신규 항-NGF 항체, 항원 결합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 개시내용은 NGF 관련 장애의 치료 및/또는 예방, 특히 통증 관리를 위한 본 발명의 신규 항체, 항원 결합 단백질 및/또는 뉴클레오티드의 용도를 추가로 제공한다.

Description

항-NGF 항체 및 그의 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 10월 7일 출원된 미국 가출원 번호 63/088,729에 대한 35 USC 119(e) 하에 이익을 주장하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 종에서 비면역원성이 되도록 변형된 NGF에 특이적으로 결합하는 항-NGF 항원 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NGF 관련 장애, 특히 통증의 치료 및/또는 예방에서 이러한 항원 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.

신경 성장 인자(NGF)는 처음으로 식별된 뉴로트로핀이며, 말초 및 중추 뉴런 둘 다의 발달 및 생존에서의 역할이 잘 특성화되었다. NGF는 말초 교감 및 배아 감각 뉴런 및 기저 전뇌 콜린성 뉴런의 발달에서 중요한 생존 및 유지 인자인 것으로 제시되었다(Smeyne, 등, Nature 368:246-249(1994) 및 Crowley, 등, Cell 76: 1001-101 I(1994)). NGF는 감각 뉴런에서 신경펩티드의 발현을 상향조절하고(Lindsay, 등, Nature 337:362-364(1989)), 그의 활성은 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 다른 구성원과 구조적으로 관련된(Chao, 등, Science 232:518-521(1986)) TrkA 티로신 키나제 수용체 및 p75 공통 뉴로트로핀 수용체(때때로 각각 "고친화성" 및 "저친화성" NGF 수용체로 불림)인 2 개의 상이한 막-결합된 수용체를 통해 매개된다.

신경계에서의 영향 외에도, NGF는 신경계 외부의 과정에 점점 더 연루되었다. 예를 들어, NGF는 혈관 투과성을 향상시키고(Otten, 등, Eur J Pharmacol. 106: 199-201(1984)), T- 및 B-세포 면역 반응을 향상시키고(Otten, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063(1989)), 림프구 분화 및 비만 세포 증식을 유도하고 비만 세포로부터 가용성 생물학적 신호의 방출을 야기하는 것으로 제시되었다(Matsuda, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512(1988); Pearce, 등, J. Physiol. 372:379-393(1986); Bischoff, 등, Blood 79:2662-2669(1992); Horigome, 등, J. Bioi. Chem. 268:14881-14887(1993)). NGF는 비만 세포(Leon, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743(1994)), B-림프구(Torcia, 등, Cell 85:345-356(1996), 각질세포(Di Marco, 등, J. Biol. Chem. 268: 22838-22846)), 평활근 세포(Ueyama, 등, J. Hypertens. 11: 1061-1065(1993)), 섬유아세포(Lindholm, 등, Eur. J. Neurosci. 2:795-801(1990)), 기관지 상피 세포(Kassel, 등, Clin, Exp. Allergy 31:1432-40(2001)), 신장 혈관사이 세포(Steiner, 등, Am. J. Physiol. 261: F792-798(1991)) 및 골격근 근관(Schwartz, 등, J Photochem. Photobiol. B66: 195-200(2002))을 포함한 여러 세포 유형에 의해 생산된다. NGF 수용체는 신경계 외부의 다양한 세포 유형에서 발견되었다. 예를 들어, TrkA는 인간 단핵구, T- 및 B-림프구 및 비만 세포에서 발견되었다.

증가된 NGF 수준과 다양한 염증 상태 사이의 연관성은 인간 환자 뿐만 아니라 여러 동물 모델에서 관찰되었다. 이들은 전신 홍반성 루프스(Bracci-Laudiero, 등, Neuroreport 4:563-565(1993)), 다발성 경화증(BracciLaudiero, 등, Neurosci. Lett. 147:9-12(1992)), 건선(Raychaudhuri, 등, Acta Derm. l'enereol. 78:84-86(1998)), 관절염(Falcim, 등, Ann. Rheum. Dis. 55:745-748(1996)), 간질성 방광염(Okragly, 등, J. Urology 161: 438-441(1999)) 및 천식(Braun, 등, Eur. J Immunol. 28:3240-3251(1998))을 포함한다. 말초 조직에서 지속적으로 상승된 NGF 수준은 통각과민증 및 염증과 연관되고 다수의 관절염 형태에서 관찰되었다. 류마티스성 관절염에 의해 영향을 받은 환자의 활막은 높은 NGF 수준을 발현하는 반면 염증이 없는 활막에서는 NGF가 검출가능하지 않은 것으로 보고되었다(Aloe, 등, Arch. Rheum. 35:351-355(1992)). 유사한 결과가 실험적으로 유도된 류마티스성 관절염이 있는 래트에서 보여졌다(Aloe, 등, Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204(1992)). 상승된 NGF 수준은 비만 세포 수의 증가와 함께 유전자이식 관절염 마우스에서 보고되었다(Aloe, 등, Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143(1993)).

골관절염(OA)은 개에서 가장 흔한 만성 근골격계 질환 중 하나이다. OA의 발달은 주로 외상, 관절 불안정성, 및 고관절 이형성증과 같은 질환에 이차적이다. 골관절염은 전체 관절의 질환 상태이며, 모든 관절 구조의 염증 및 퇴행성 변화는 둘 다 장애 및 파행 및 통증의 임상 징후를 초래한다. 통증은 개과(canine) OA의 가장 중요한 임상 징후이며 구조적 관절 변화, 생화학적 및 분자적 변경, 뿐만 아니라 말초 및 충주 통증 처리 메커니즘 사이의 복합 상호작용의 결과이다. 이 네트워크 내에서, 염증 및 통각과민 매개체(예를 들어 사이토카인, 프로스타글란딘 및 신경매개체)에 의한 말초 통각수용기의 활성화 및 민감화는 관절 통증을 담당하는 주요 말초 메커니즘 중 하나이다.

미국 내에서만 대략 1,450만 마리의 개가 OA로 고통 받는다. 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)은 수의사에 의해 처방된 가장 흔한 약물 범주이지만, 효능 및 내약성에 의해 제한될 수 있다. 시장 조사는 대략 900만 마리의 개가 미국 내에서 NSAID로 치료되고 있음을 나타낸다. 코르티코스테로이드는 드물게 사용되고 전형적으로 단기간 동안 최후의 수단으로 사용된다.

고양이과(feline)에서, OA는 관절 연골 악화, 골극 형성, 뼈 리모델링, 연조직 변화 및 저등급 비화농성 염증을 특징으로 하는, 가동관절 활막 관절의 생리학적 변화이다. 고양이과 OA의 방사선학적 특징이 잘 설명되어 있지만, 질환의 임상 징후는 일반적으로 저조하게 문서화되어 있고 진단되지 않을 수 있다. 고양이에서 파행을 평가하는 데 어려움은 작은 크기 및 타고난 날렵함으로 인해 보상할 수 있다. 그러나, 고양이과 OA의 임상 징후는 체중 감소, 식욕부진, 우울증, 비정상적인 배설 습관, 불량한 털 손질, 공격적 행동 및 과도한 파행으로 점프하는 능력의 점진적인 감소를 포함하는 것으로 여겨진다. 오진에 기반한 고양이과 OA는 일반적으로 치료되지 않은 채로 남아있고 미충족된 수의학적 필요성이다.

본 발명은 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 신규 항-NGF 항원 결합 단백질(본원에서 상호교환가능하게 정의되고 사용된 바와 같은 항체, 항체 단편, 길항제 항체), 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 NGF 관련 장애, 특히 통증의 치료 및/또는 예방에서 상기 항원 결합 단백질 및/또는 뉴클레오티드의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

일 측면에서 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는 서열번호 4(아미노산 서열: GFTLTQYG)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR 1), 서열번호 5(아미노산 서열: VIWATGATD)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR 2) 및 서열번호 6(아미노산 서열: DGWWYATSWYFDV)과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고; 항원 결합 단백질은 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며:

A. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1):

X1-알라닌[A]-세린[S]-글루타민[Q]-X2-이소류신[I]-X3-X4-X5-류신[L]-아스파라긴[N](서열번호 177)

여기서:

X1은 리신(K) 또는 아르기닌(R)을 포함하고,

X2는 세린(S) 또는 아스파르트산(D)을 포함하고,

X3은 아스파라긴(N) 또는 세린(S)을 포함하고,

X4는 히스티딘(H) 또는 아스파라긴(N)을 포함하고,

X5는 티로신[Y] 또는 아스파라긴[N]을 포함함; 및

B. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR 2):

티로신[Y]-X6-세린[S]-X7-X8-히스티딘[H]-세린[S](서열번호 178)

여기서:

X6은 이소류신[I] 또는 트레오닌[T]을 포함하고,

X7은 아르기닌[R] 또는 세린[S]을 포함하고,

X8은 류신[L] 또는 페닐알라닌[F]을 포함함; 및

C. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR 3):

X9-X10-X11-X12-X13-X14-프롤린[P]-X15-X16(서열번호 179)

여기서:

X9는 글루타민[Q] 또는 히스티딘[H]을 포함하고,

X10은 글루타민[Q] 또는 아르기닌[R]을 포함하고,

X11은 글리신[G] 또는 알라닌[A]을 포함하고,

X12는 아스파르트산[D], 세린[S], 트레오닌[T] 또는 아스파라긴[N]을 포함하고,

X13은 히스티딘[H], 트레오닌[T] 또는 메티오닌[M]을 포함하고,

X14는 페닐알라닌[F], 리신[L] 또는 세린[S]을 포함하고,

X15는 아르기닌[R], 티로신[Y] 또는 글리신[G]을 포함하고;

X16은 트레오닌[T] 또는 프롤린[P]을 포함함;

상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는 서열번호 4(아미노산 서열: GFTLTQYG)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR 1), 서열번호 5(아미노산 서열: VIWATGATD)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR 2) 및 서열번호 6(아미노산 서열: DGWWYATSWYFDV)과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고; 항원 결합 단백질은 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며:

A. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1):

(X1)-알라닌[A]-세린[S]-글루타민[Q]-(X2)-이소류신[I]-(X3)-(X4)-(X5)-류신[L]-아스파라긴[N](서열번호 180)

여기서:

X1은 리신(K) 또는 아르기닌(R)을 포함하고,

X2는 세린(S) 또는 아스파르트산(D)을 포함하고,

X3은 아스파라긴(N) 또는 세린(S)을 포함하고,

X4는 히스티딘(H) 또는 아스파라긴(N)을 포함하고,

X5는 티로신[Y] 또는 아스파라긴[N]을 포함함; 및

B. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2):

트레오닌[T]-(X6)-(X7)-류신[L]-(X8)-(X9)(서열번호 181) 여기서:

X6은 트레오닌[T], 히스티딘[H], 세린[S] 또는 알라닌[A]을 포함하고,

X7은 아르기닌[R] 또는 세린[S]을 포함하고,

X8은 글루타민[Q] 또는 히스티딘[H]을 포함하고,

X9는 알라닌[A], 글루타민[Q], 글리신[G] 또는 발린[V]을 포함함; 및

C. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3):

(X10)-(X11)-(X12)-(X13)-(X14)-(X15)-P-(X16)-(X17)(서열번호 182) 여기서

X10은 Q 또는 H를 포함하고,

X11은 Q 또는 R을 포함하고,

X12는 G 또는 A를 포함하고,

X13은 D, S, T 또는 N을 포함하고,

X14는 H, T 또는 M을 포함하고,

X15는 F, L 또는 S를 포함하고,

X16은 R, Y 또는 G를 포함하고,

X17은 T 또는 P를 포함함;

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는 다음을 포함하며:

다음을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):

a. GFTLTQYG(서열번호 4)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR 1):

b. VIWATGATD(서열번호 5)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR 2); 및

c. DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR 3); 및

다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):

d. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQDINHYLN(서열번호 7)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 8)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGDHFPRT(서열번호 9)를 포함하는 CDR 3;

e. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQSISNNLN(서열번호 10)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YISSFHS(서열번호 11)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGDHFPYT(서열번호 12)를 포함하는 CDR 3;

f. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQDINHYLN(서열번호 13)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSSLHS(서열번호 14)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGDHFPRT(서열번호 15)를 포함하는 CDR 3;

g. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQSINHYLN(서열번호 16)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 17)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 18)를 포함하는 CDR 3;

h. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 19)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 20)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 HRATTSPGP(서열번호 21)를 포함하는 CDR 3;

i. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQDINHYLN(서열번호 22)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 23)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 24)를 포함하는 CDR 3;

j. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 25)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 26)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 27)를 포함하는 CDR 3;

k. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 28)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSSLHS(서열번호 29)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 30)를 포함하는 CDR 3;

l. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQSINHYLN(서열번호 31)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YISSFHS(서열번호 32)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQSHTLPYT(서열번호 33)를 포함하는 CDR 3;

m. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQDINHYLN(서열번호 34)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YVTTLHA(서열번호 35)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGDHFPRT(서열번호 36)를 포함하는 CDR 3;

n. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 37)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 KTNSLQT(서열번호 38)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 39)를 포함하는 CDR 3;

o. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 40)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YVTSLHA(서열번호 41)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 42)를 포함하는 CDR 3;

p. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 43)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 44)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGNMFPYT(서열번호 45)를 포함하는 CDR 3;

q. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQDINHYLN(서열번호 46)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 47)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGNMFPYT(서열번호 48)를 포함하는 CDR 3;

r. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:

i. 아미노산 서열 KASQDINHYLN(서열번호 193)을 포함하는 CDR1;

ii. 아미노산 서열 TTRLQA(서열번호 194)를 포함하는 CDR2; 및

iii. 아미노산 서열 QQGDHFPRT(서열번호 195)를 포함하는 CDR 3;

상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 KASQDINHYLN(서열번호 7)의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 8)의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGDHFPRT(서열번호 9)의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 RASQSISNNLN(서열번호 10)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YISSFHS(서열번호 11)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGDHFPYT(서열번호 12)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 KASQDINHYLN(서열번호 13)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSSLHS(서열번호 14)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGDHFPRT(서열번호 15)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 KASQSINHYLN(서열번호 16)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 17)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGSTLPRT(서열번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 RASQDISNYLN(서열번호 19)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 20)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 HRATTSPGP(서열번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 KASQDINHYLN(서열번호 22)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGSTLPRT(서열번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 RASQDISNYLN(서열번호 25)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGSTLPRT(서열번호 27)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 RASQDISNYLN(서열번호 28)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YYTSSLHS(서열번호 29)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGSTLPRT(서열번호 30)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 RASQDISNYLN(서열번호 43)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 44)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGNMFPYT(서열번호 45)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 GFTLTQYG(서열번호 4)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, VIWATGATD(서열번호 5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 DGWWYATSWYFDV(서열번호 6)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 가변 경쇄가 KASQDINHYLN(서열번호 46)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, YTSRLHS(서열번호 47)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 QQGNMFPYT(서열번호 48)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR 3을 포함하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다. 하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 서열번호 160을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역 및 서열번호 158을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체는 서열번호 184를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 개화 항원 결합 단백질, "ZTS-182 m6"을 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 여기서 가변 경쇄는 서열번호 175를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, 가변 중쇄는 서열번호 4와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC VH CDR1), 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC" VH CDR2), 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC" VH CDR3)을 포함하는 상보성 결정 영역 1-3을 포함하고; 여기서 가변 경쇄 서열번호 167과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 168을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 169를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1-3; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내 또는 본 발명의 항원 결합 단백질의 전체 VH 또는 VL 서열의 아미노산 서열 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체. 하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 서열번호 160을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역 및 서열번호 158을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체는 서열번호 184를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 단백질이 키메라 항체, 뮤린 항체, 개화 항체, 고양이화 항체, 말화 항체 또는 인간화 항체를 포함한다는 것을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 키메라 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 개화 항체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서 항원 결합 단백질은 고양이화 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 말화 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 인간화 항체를 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질을 제공하며, 이는 다음을 포함하고:

1) 다음 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH): EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS(서열번호 49); 및

2) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):

a.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT(서열번호 51);

b.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQSISNNLNWFRQKPDGTVKLLIYYISSFHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPYTFGQGT(서열번호 53);

c.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT(서열번호 55);

d.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQSINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT(서열번호 57);

e.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCHRATTSPGPSARV(서열번호 59);

f.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQSINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT(서열번호 61);

g.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT(서열번호 63);

h.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT(서열번호 65);

i.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQSINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYISSFHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSHTLPYTFGQGT(서열번호 67);

j.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYVTSLHAGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT(서열번호 69);

k.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYKTNSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT(서열번호 71);

l.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYVTSLHAGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT(서열번호 73);

m.EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGQAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQGNMFPYTFGGGT(서열번호 75);

n.EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQDINHYLNWYQQKPGQAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQGNMFPYTFGGGT(서열번호 77);

o.DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYTTRLQASGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT(서열번호 175);

상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 서열번호 160을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역 및 서열번호 158을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체는 서열번호 184를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDL ARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 51(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다. 하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 또한 서열번호 160을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역 및 서열번호 158을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체는 서열번호 184를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 53(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQSISNNLNWFRQKPDGTVKLLIYYISSFHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPYTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 55(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하는 항원 결합; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 57(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQSINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 59(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCHRATTSPGPSARV)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 61(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQSINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 63(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 65(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 67(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQSINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYISSFHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQSHTLPYTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 69(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYVTSLHAGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 69(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 71(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYKTNSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 73(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCRASQDISNYLNWFRQKPDGTVKLLIYYVTSLHAGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGSTLPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 75(아미노산 서열: EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGQAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQGNMFPYTFGGGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 77(아미노산 서열: EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQDINHYLNWYQQKPGQAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQGNMFPYTFGGGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 49(아미노산 서열: EVQLVESGGDLARPGGSLKLSCVVSGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVTVIWATGATDYNSALKSRFTVSRDNAMNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 201(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKASQDINHYLNWFRQKPDGTVKLLIYTTRLQASGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 개화 항체를 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 서열번호 85 또는 서열번호 92로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 87, 서열번호 89, 서열번호 또는 서열번호 94로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역 중 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 85(아미노산 서열: DVQLVESGGDLVQPGGSLRLTCVASGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVAVIWATGATDYNSALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGALVTVSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 87(아미노산 서열 DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKASQDINHYLNWYLQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDVGVYYCQQGDHFPRTFGPGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 85(아미노산 서열: DVQLVESGGDLVQPGGSLRLTCVASGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVAVIWATGATDYNSALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGALVTVSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 89(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQDINHYLNWYLQKPGQSPRLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISSVEADDVGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 92(아미노산 서열: DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVAVIWATGATDYNSALKSRFTMSRDNARNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 89(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQDINHYLNWYLQKPGQSPRLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISSVEADDVGVYYCQQGDHFPRTFGQGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 85(아미노산 서열: DVQLVESGGDLVQPGGSLRLTCVASGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVAVIWATGATDYNSALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGALVTVSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 94(아미노산 서열: EIQMTQSPSSLSASPGDRVTITCKASQDINHYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDAATYYCQQGDHFPRTFGGGT)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 92(아미노산 서열: DVQLVESGGDLVKPGGSLRLTCVASGFTLTQYGINWVRQAPGKGLQWVAVIWATGATDYNSALKSRFTMSRDNARNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGWWYATSWYFDVWGQGTLVTVSS)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 87(아미노산 서열: DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKASQDINHYLNWYLQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDVGVYYCQQGDHFPRTFGPGT)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 고양이화 항체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 핵산 서열 서열번호 50(핵산 서열:

을 포함하는 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열의 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열;

및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열:

ㆍ 서열번호 52: 핵산 서열(서열번호 51을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 54: 핵산 서열(서열번호 53을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 56 핵산 서열(서열번호 55를 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 58 핵산 서열(서열번호 57을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 60 핵산 서열(서열번호 59를 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 62 핵산 서열(서열번호 61을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 64 핵산 서열(서열번호 63을 포함하는 아미노산 서열 암호화)

ㆍ 서열번호 66(핵산 서열(서열번호 65를 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 68 핵산 서열(서열번호 67을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 70 핵산 서열(서열번호 69를 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 72 핵산 서열(서열번호 71을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 74 핵산 서열(서열번호 73을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 76 핵산 서열(서열번호 75를 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 78 핵산 서열(서열번호 77을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

ㆍ 서열번호 176 핵산 서열(서열번호 183을 포함하는 아미노산 서열 암호화):

상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 52를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 및 서열번호 54를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 56을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 58을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 60을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 62를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 64를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 66을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 176을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 개화 항원 결합 단백질을 포함하는 항원 결합 단백질을 암호화한다.

추가의 일 측면에서 본 발명은 서열번호 85를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하고 서열번호 86(핵산 서열:

)을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성인 핵산 서열 및 서열번호 88을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 서열번호 87(핵산 서열:

을 포함하는 아미노산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 86을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 90(핵산 서열:

)을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 93(핵산 서열:

)을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열: 및 서열번호 90(핵산 서열:

)을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 86을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 95(핵산 서열:

)를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 93을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 88을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 고양이화 항체를 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 GFSLTGYGVN(서열번호 145)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호 146)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2, 및 DGYYYGTTWYFDV(서열번호 147); GGYDYDVPFFDY(서열번호 151) 및 GGYDYDVSFFDY(서열번호 153)로 이루어진 군으로부터 선택된 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 RASQDISNYLN(서열번호 148) 또는 RSSQSIVHINRHTYLG(서열번호 154)로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1; YTSRLHS(서열번호 149) 또는 GVSNRFS(서열번호 155)로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2; 및 QQGSTLPRT(서열번호 150); QQGNMFPYT(서열번호 152); FQGTHVPFT(서열번호 156); 및 QQGNTLPYT(서열번호 157)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질, 및 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 GFSLTGYGVN(서열번호 145를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호 146)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2, 및 DGYYYGTTWYFDV(서열번호 147을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH): 및 아미노산 서열 RASQDISNYLN(서열번호 148)과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1; 아미노산 서열 YTSRLHS(서열번호 149)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 2; 및 아미노산 서열 QQGSTLPRT(서열번호 150)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질 및 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVKLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYYYGTTWYFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 96)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVMTQSTSSLSASLGDRVTISC RASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGSTLPRTFGGGT(서열번호 100)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다. 하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 97:

를 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 101:

를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSG FSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYYYGTTWYFDVWGAGTTVTV(서열번호 98)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGSTLPRTFGGG(서열번호 102)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 99:

를 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 103을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVKLEESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTG YGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLNISKDNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARGGYDYDVPFFDYWGQGTTLTVSS(서열번호 104)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNMFPYTLGGGT(서열번호 108)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 105를 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 109를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTG YGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLNISKDNSKSQVFLKMDSLQTDDTARYYCARGGYDYDVPFFDYWGQGTTLTV(서열번호 106)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNMFPYTLGGG(서열번호 110)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 107을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 111을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVQLEQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGY GVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYYYGTTWYFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 112)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGSTLPRTFGGGT(서열번호 114)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 113을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 115를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGY TFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGHIDPSDGETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLTGLTSEDSAVYYCARFLPDYWGQGTSVTVSS(서열번호 116)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVLTQTPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSIYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTVSSVEAEDAATYYCQLYDNSPLTFGAGT(서열번호 120)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 117을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 121을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGY TFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGHIDPSDGETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLTGLTSEDSAVYYCARFLPDYWGQGTSVTV(서열번호 118)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSIYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTVSSVEAEDAATYYCQLYDNSPLTFGAG(서열번호 122)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 119를 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 123을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVQLEESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT GYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYYYGTTWYFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 124)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVITQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHINRHTYLGWYLQKPGQSLKLLIYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDMGVYYCFQGTHVPFTFGSGT(서열번호 126)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 125를 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 127을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVKLEESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARGGYDYDVSFFDYWGQGTTLTVSS(서열번호 130)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVLTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKP DGTVKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEHEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGT(서열번호 134)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 131을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 135를 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCT VSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARGGYDYDVSFFDYWGQGTTLTV(서열번호 132)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEHEDIATYFCQQGNTLPYTFGGG(서열번호 136)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 133을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 137을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 QVKLEESGPGLVAPSQSLSIT CTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYYYGTTWYFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 138)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIVLTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGSTLPRTFGGGT(서열번호 140)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열변호 139를 포함하는 가변 중쇄(VH)를 암호화하는 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 141을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 암호화하는 핵산 서열 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 갖는 보존적 아미노산 치환을 암호화하는 임의의 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 EVQLQQSGPGLVAPSQSLSIT CTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDGYYYGTTWYFDVWGAGTTVTVSS(서열번호 142)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGSTLPRTFGGGT(서열번호 144)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 160과 적어도 약 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 160을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 158과 적어도 약 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 158을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 184를 포함하는 항원 결합 단백질의 효과기 기능을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 165와 적어도 약 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 고양이과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 165를 포함하는 고양이과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 162와 적어도 약 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 고양이과 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서 중쇄 불변 영역은 서열번호 162를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서 중쇄 불변 영역은 항원 결합 단백질의 효과기 기능을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 상기 결합 단백질이 투여되는 종 내에서 면역학적 반응을 야기하지 않는다는 것을 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 키메라 항체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 종분화된다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 개화 항원 결합 단백질이다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 고양이화 항원 결합 단백질이다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 말화 항원 결합 단백질이다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 인간화 항원 결합 단백질이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, NGF는 개과 NGF이다. 일 구현예에서, NGF는 고양이과 NGF이다. 일 구현예에서, NGF는 인간 NGF이다. 일 구현예에서, NGF는 설치류 NGF이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 NGF에 특이적으로 결합하고 NGF가 TrkA에 결합하는 것을 방지하여 TrkA를 통한 신호전달을 억제하며, 이는 감각 뉴런을 통한 신호전달을 감소시켜 통증 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 일 구현예에서, NGF는 개과 NGF이다. 일 구현예에서, NGF는 고양이과 NGF이다. 일 구현예에서, NGF는 인간 NGF이다. 일 구현예에서, NGF는 설치류 NGF이다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 면역계에 유의한 부작용을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 개과의 면역계에 대한 유의한 부작용은 없다. 일부 구현예에서, 고양이과에서 면역계에 대한 유의한 부작용은 없다. 일부 구현예에서, 인간의 면역계에 대한 유의한 부작용은 없다

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 상기 항원 결합 단백질이 NGF의 생물학적 기능을 억제한다는 것을 제공한다. 일 구현예에서, 억제는 개과 NGF의 기능적 억제이다. 일 구현예에서, NGF의 억제는 고양이과 NGF의 기능적 억제이다. 일 구현예에서, 억제는 인간 NGF의 기능적 억제이다.

하나 이상의 구현예에서, NGF에 특이적으로 결합하는 단리된 및 재조합 항원 결합 단백질은 NGF 관련 장애를 감소시키거나 제거한다. 일부 구현예에서, NGF 관련 장애는 심혈관계 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 통증 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, NGF 관련 장애는 통증이다. 일부 구현예에서, NGF 관련 장애는 염증이다. 일부 구현예에서 통증의 유형은 만성 통증; 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 신경병성 통증, 골절 통증, 골다공증성 골절 통증, 대상포진후 신경통, 암 통증, 화상으로 인한 통증, 상처와 연관된 통증, 외상과 연관된 통증, 신경병성 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 혈청음성(비류마티스성) 관절병증, 비관절성 류마티즘 및 관절주위 장애와 같은 근골격계 장애와 연관된 통증 및 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 만성 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 골관절염 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 염증성 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 수술후 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 암 통증이다.

하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 사량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인-특이적 항체, 도메인-결실 항체, 융합 단백질, ScFc 융합 단백질, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, ScFv 단편, Fd 단편, 단일 도메인 항체, dAb 단편, 소형 모듈 면역의약품(SMIP) 나노바디(nanobody), 및 IgNAR 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서 상기 항체는 키메라이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 단리된 및 재조합 항원 결합 단백질 중 임의의 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 개과의 면역계에 대한 유의한 부작용을 갖지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 고양이과의 면역계에 대한 유의한 부작용을 갖지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 인간의 면역계에 대한 유의한 부작용을 갖지 않는다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 수의학적 조성물이다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질 중 임의의 하나 이상을 생산하는 숙주 세포를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 중 임의의 하나 이상을 포함하는 벡터를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 중 임의의 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 중 임의의 하나 이상을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 NGF 관련 장애에 대해 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 대상체는 개과, 고양이과, 또는 인간을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 개과를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 고양이과를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간을 포함한다. 일부 구현예에서, NGF 관련 장애는 심혈관계 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 통증 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일부 구현예에서 통증의 유형은 만성 통증; 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 신경병성 통증, 골절 통증, 골다공증성 골절 통증, 대상포진후 신경통, 암 통증, 화상으로 인한 통증, 상처와 연관된 통증, 외상과 연관된 통증, 신경병성 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 혈청음성(비류마티스성) 관절병증, 비관절성 류마티즘 및 관절주위 장애와 같은 근골격계 장애와 연관된 통증 및 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 골관절염 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 염증성 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 만성 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 수술후 통증이다. 일부 구현예에서, 통증의 유형은 암 통증이다.

일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 숙주 세포를, 개화 항원 결합 단백질의 생산을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 개화 항체 항원 결합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 항원 결합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여함으로써 NGF 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 NGF 수준을 검출하거나 정량화하는 방법을 제공하며, 방법은 다음을 포함한다:

(a) 본 발명의 개화 항체, 항원 결합 단백질 또는 단편 중 임의의 하나의 존재 하에 NGF를 함유하는 임상적 또는 생물학적 샘플을 배양하는 단계; 및

(b) 샘플에서 NGF에 결합된 항원 결합 단백질 또는 단편을 검출하는 단계.

일부 구현예에서, 항원 결합 단백질 또는 단편은 검출가능하게 표지된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질 또는 단편은 비표지되고 검출가능하게 표지된 제2 항원 결합 단백질 또는 단편과 조합하여 사용된다. 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질을 포함하는 키트를 포함한다.

도 1 은 항원 결합 부위를 강조하는 마우스 면역글로불린 G(IgG) 분자의 일반적 구조를 개략적으로 나타낸다.
도 2 는 마우스/개과 키메라 IgG의 일반적 구조를 개략적으로 나타낸다.
도 3 은 마우스 IgG의 종분화 또는 "개화(Caninization)", 개과 프레임워크 상에 이식된 마우스 CDR을 나타내는 예시이다.
도 4 는 키메라 경쇄와 완전히 개화된 중쇄의 쌍을 이루는 "헤테로키메라" 모노클로날 항체의 예시이다.
도 5 는 래트, 마우스, 인간, 고양이과 및 개과 NGF 사이의 아미노산 비교를 나타낸다.
도 6 은 마우스 3-5의 면역화 후 생성된 하이브리도마의 연속 희석물의 반응성을 그래프로 나타낸다.
도 7 은 면역화 후 생성된 하이브리도마로부터 테스트된 상청액 각각에 대해 측정된 OD를 그래프로 나타낸다.
도 8 은 선택된 항-NGF 하이브리도마 서브클론을 그래프로 나타낸다.
도 9 는 개과 NGF ELISA 검정에서 단리된 모노클로날 항체를 그래프로 나타낸다.
도 10 은 1.4 mg/kg의 용량에서 8 마리 상이한 개에 대한 ZTS-182 농도-시간 그래프의 개 혈청을 그래프로 나타낸다.
도 11 은 4.0 mg/kg의 용량에서 8 마리 상이한 개에 대한 ZTS-182 농도-시간 그래프의 개 혈청을 그래프로 나타낸다.
도 12 는 12.0 mg/kg의 용량에서 8 마리 상이한 개에 대한 ZTS-182 농도-시간 그래프의 개 혈청을 그래프로 나타낸다.
도 13 은 20.0 mg/kg의 용량에서 8 마리 상이한 개에 대한 ZTS-182 농도-시간 그래프의 개 혈청을 그래프로 나타낸다.
도 14a 는 래트 PC12 세포를 다양한 항-NGF mAb로 처리한 후 신경돌기 길이의 퍼센트 억제를 그래프로 나타낸다.
도 14b 는 래트 PC12 세포를 다양한 항-NGF mAb로 처리한 후 신경돌기 길이를 그래프로 나타낸다.
도 15 는 래트 MIA 검정을 개략도로 나타낸다.
도 16 은 투여된 ZTS-182의 상이한 농도 및 MIA 모델에서 퍼센트 체중 부하를 그래프로 나타낸다.
도 17 은 시간 경과에 따른 ZTS-182 투여 후 활막염후 유도 대 파행 점수를 그래프로 나타낸다.
도 18a 는 3.0 mg/kg의 용량에서 8 마리 상이한 고양이에 대한 ZTS-082 농도-시간 그래프의 고양이 혈청을 그래프로 나타낸다.
도 18b 는 3.0 mg/kg의 용량에서 8 마리 상이한 고양이에 대한 ZTS-082 농도-시간 그래프의 고양이 혈청을 그래프로 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호: 1 은 인간 NGF에 대한 아미노산 서열이다,
서열번호: 2 는 개과 NGF에 대한 아미노산 서열이다,
서열번호: 3 은 고양이과 NGF에 대한 아미노산 서열이다.
서열번호: 4 는 본원에서 01B12H3AHC VH CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR 1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 5 는 본원에서 01B12H3AHC VH CDR 2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR 2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 6 은 본원에서 01B12H3AHC VH CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 7 은 본원에서 01B12H3AHC VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 8 은 본원에서 01B12H3AHC VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 9 는 본원에서 01B12H3AHC VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 10 은 본원에서 QC23L2AL3 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 11 은 본원에서 QC23L2AL3 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 12 는 본원에서 QC23L2AL3 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 13 은 본원에서 QC23L5A VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 14 는 본원에서 QC23L5A VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 15 는 본원에서 QC23L5A VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 16 은 본원에서 QC2301B12L2AL1 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 17 은 본원에서 QC2301B12L2AL1 VL CDR 2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 18 은 본원에서 QC2301B12L2AL1 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 19 는 본원에서 QC2301B12L1AL3 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 20 은 본원에서 QC2301B12L1AL3 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 21 은 본원에서 QC2301B12L1AL3 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 22 는 본원에서 QC2301B12L1AL1 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 23 은 본원에서 QC2301B12L1AL1 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 24 는 본원에서 QC2301B12L1AL1 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 25 는 본원에서 QC2301B12VK VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 26 은 본원에서 QC2301B12VK VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 27 은 본원에서 QC2301B12VK VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 28 은 본원에서 QC2301B12L5AL2 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 29 는 본원에서 QC2301B12L5AL2 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 30 은 본원에서 QC2301B12L5AL2 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 31 은 본원에서 QC23L2AL1 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 32 는 본원에서 QC23L2AL1 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 33 은 본원에서 QC23L2AL1 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 34 는 본원에서 QC23L6A VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 35 는 본원에서 QC23L6A VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 36 은 본원에서 QC23L6A VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 37 은 본원에서 QC23L1A02D9L2 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다
서열번호: 38 은 본원에서 QC23L1A02D9L2 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 39 는 본원에서 QC23L1A02D9L3 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 40 은 본원에서 QC23L6A VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 41 은 본원에서 QC23L6A VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 42 는 본원에서 QC23L6A VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 43 은 본원에서 02B4VL1 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 44 는 본원에서 02B4VL1 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 45 는 본원에서 02B4VL1 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 46 은 본원에서 02B4L1AL1 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 47 은 본원에서 02B4L1AL1 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 48 은 본원에서 02B4L1AL1 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 49 는 본원에서 01B12H3AHC VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 50 은 본원에서 01B12H3AHC VH로 지칭되는 가변 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 51 은 본원에서 QC2301B12L1AL1L3 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 52 는 본원에서 QC2301B12L1AL1L3 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 53 은 본원에서 QC23L2AL3 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 54 는 본원에서 QC23L2AL3 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 55 는 본원에서 QC23L5A VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 56 은 본원에서 QC23L5A VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 57 은 본원에서 QC2301B12L2AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 58 은 본원에서 QC2301B12L2AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 59 는 본원에서 QC2301B12L1AL3 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 60 은 본원에서 QC2301B12L1AL3 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 61 은 본원에서 QC2301B12L1AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 62 는 본원에서 QC2301B12L1AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 63 은 본원에서 QC2301B12VK VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 64 는 본원에서 QC2301B12VK VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 65 는 본원에서 QC2301B12L5AL2 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 66 은 본원에서 QC2301B12L5AL2 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 67 은 본원에서 QC23L2AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 68 은 본원에서 QC23L2AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 69 는 본원에서 QC23L6A VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 70 은 본원에서 QC23L6A VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 71 은 본원에서 QC23L1A02D9L2 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 72 는 본원에서 QC23L1A02D9L2 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 73 은 본원에서 QC2301B12L6AL2 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 74 는 본원에서 QC2301B12L6AL2 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 75 는 본원에서 02B4VL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 76 은 본원에서 02B4VL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 77 은 본원에서 02B4L1AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 78 은 본원에서 02B4L1AL1 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 79 는 본원에서 ZTS-082VH CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR 1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 80 은 본원에서 ZTS-082VH CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR 2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 81 은 본원에서 ZTS-082- VH CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR 3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 82 는 본원에서 ZTS-082 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR 1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 83 은 본원에서 ZTS-082VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR 2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 84 는 본원에서 ZTS-082 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR 3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 85 는 본원에서 H1-23 VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 86 은 본원에서 H1-23 VH로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 87 은 본원에서 KPL VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 88 은 본원에서 KPL VL로 기재되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 89 는 본원에서 L3-K36 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 90 은 본원에서 L3-K36 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 91 은 본원에서 L3-K36 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 92 는 본원에서 H733 VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 93 은 본원에서 H733 VH로 지칭되는 가변 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 94 는 본원에서 K643 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 95 는 본원에서 K643 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 96 은 본원에서 MU-01B12-02B08-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 97 은 본원에서 MU-01B12-02B08-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 98 은 본원에서 Chim-01B12-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산이다.
서열번호 99 는 본원에서 Chim-01B12-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 100 은 본원에서 Mu-01B12-02B08-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 101 은 본원에서 Mu-01B12-02B08-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 102 는 본원에서 Chim-01B12-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 103 은 본원에서 Chim-01B12-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 104 는 본원에서 Mu-02B04-02A08-VH로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 105 는 본원에서 Mu-02B04-02A08-VH로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 106 은 본원에서 Chim-02B04-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 107 은 본원에서 Chim-02B04-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 108 은 본원에서 Mu-02B04-02A08-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 109 는 본원에서 Mu-02B04-02A08-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 110 은 본원에서 Chim-02B04-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 111 은 본원에서 Chim-02B04-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 112 는 본원에서 Mu-15H02-02E01-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 113 은 본원에서 Mu-15H02-02E01-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 114 는 본원에서 Mu-15H02-02E01 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 115 는 본원에서 Mu-15H02-02E01 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오디드 서열이다.
서열번호 116 은 본원에서 Mu-16G01-02F03-02D06-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 117 은 본원에서 Mu-16G01-02F03-02D06-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 118 은 본원에서 Chim-16G01-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 119 는 본원에서 Chim-16G01-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 120 은 본원에서 Mu-16G01-02F03-02D06-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 121 은 본원에서 Mu-16G01-02F03-02D06-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 122 는 본원에서 Chim-16G01-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 123 은 본원에서 Chim-16G01-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 124 는 본원에서 Mu-20D11-02E10-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 125 는 본원에서 Mu-20D11-02E10-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 126 은 본원에서 Mu-20D11-02E10-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 127 은 본원에서 Mu-20D11-02E10-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 128 은 본원에서 Chim-20D11-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 129 는 본원에서 Chim-20D11-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 130 은 본원에서 Mu-26C08-02F06-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 131 은 본원에서 Mu-26C08-02F06-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 132 는 본원에서 Chim-26C08-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 133 은 본원에서 Chim-26C08-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 134 는 본원에서 Mu-26C08-02F06-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 135 는 본원에서 Mu-26C08-02F06-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 136 은 본원에서 Chim-26C08-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 137 은 본원에서 Chim-26C08-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 138 은 본원에서 Mu-30E01-02A11-VH로 본원에서 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 139 는 본원에서 Mu-30E01-02A11-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 140 은 본원에서 Mu-30E01-02A11-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 141 은 본원에서 Mu-30E01-02A11-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 142 는 본원에서 Mu-31F05-02B03-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호 143 은 본원에서 Mu-31F05-02B03-VH로 지칭되는 가변 중쇄를 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 144 는 본원에서 Mu-31F05-02B03-VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 145 는 본원에서 MU 01B12 VH CDR1로 지칭되는 가변 중쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:146 은 본원에서 MU 01B12 VH CDR2로 지칭되는 가변 중쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:147 은 본원에서 MU 01B12 VH CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:148 은 본원에서 MU 01B12 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:149 는 본원에서 MU 01B12 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:150 은 본원에서 MU 01B12 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:151 은 본원에서 MU 02B04 VH CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 152 는 본원에서 MU 02B04 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:153 은 본원에서 MU 26C08 VH CDR3으로 지칭되는 가변 중쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:154 는 본원에서 Mu 20D11 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:155 는 본원에서 MU 20D11 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:156 은 본원에서 MU 20D11 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:157 은 본원에서 MU 26C08 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 158 은 개과 중쇄 불변 영역 IgGB를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 159 는 개과 중쇄 불변 영역 IgGB를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 160 은 개과 경쇄 불변 영역을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 161 은 개과 경쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 162 는 고양이과 중쇄 불변 영역을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 163 은 고양이과 중쇄 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 164 는 고양이과 경쇄 불변 영역을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 165 는 고양이과 경쇄 불변 영역을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 166 은 고양이과 경쇄 불변 영역을 기재하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 167 은 본원에서 Can-182-m6 VL CDR1로 지칭되는 가변 경쇄 CDR1을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 168 은 본원에서 Can-182-m6 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 169 는 본원에서 Can-182-m6 VL CDR3으로 지칭되는 가변 경쇄 CDR3을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 170 은 본원에서 Can-182-m43 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 171 은 본원에서 Can-182-m70 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 172 는 본원에서 Can-182-m72 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 173 은 본원에서 Can-182-m75 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 174 는 본원에서 Can-182-m114 VL CDR2로 지칭되는 가변 경쇄 CDR2를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 175 는 본원에서 Can-182m6 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 176 은 본원에서 Can-182 m6 VL로 지칭되는 가변 경쇄를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열번호: 177 은 서열번호 4의 변이체를 기재하는 아미노산 서열 공식이다.
서열번호: 178 은 서열번호 5의 변이체를 기재하는 아미노산 서열 공식이다.
서열번호:179 는 서열번호 6의 변이체를 기재하는 아미노산 서열 공식이다.
서열번호: 180 은 서열번호 4의 변이체를 기재하는 아미노산 서열 공식이다.
서열번호: 181 은 서열번호 5의 변이체를 기재하는 아미노산 서열 공식이다.
서열번호:182 는 서열번호 6의 변이체를 기재하는 아미노산 서열 공식이다.
서열번호 183 은 본원에서 182m6VL로 지칭되는 가변 경쇄를 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 184 는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 IgGB Fc 영역을 기재하는 아미노산 서열이다.
서열번호:185 는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 IgGB Fc 영역을 암호화하는 핵산 서열이다.

본원에 개시된 발명은 고친화성으로 NGF에 결합하는 항-NGF 항원 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 상기 항원 결합 단백질의 변이체인 NGF에 또한 결합하는 항원 결합 단백질 및 폴리펩티드 뿐만 아니라 이들 항원 결합 단백질의 제조 및 사용 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 또한 상기 항원 결합 단백질 및/또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본원에 개시된 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 항-NGF 항원 결합 단백질을 투여함으로써 통증을 예방하고/하거나 치료하는 방법을 제공한다.

일반 기술

본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등으로 제한되지 않고 그 자체가 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용되는 방법론은 단지 특정 구현예를 기재하려는 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 이는 청구범위에 의해서만 정의된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 기재된 항원 결합 단백질과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양물, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 활용되는 명명법, 및 기술은 잘 알려져 있고 당업계에서 통상적으로 사용되며 단일 설명으로 제한되지 않는다. 상이한 기술이 기재된 것을 대체할 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.

식별된 모든 특허 및 다른 간행물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 기재하고 개시하려는 목적을 위한 참조에 의해 본원에 명시적으로 혼입된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 공개를 위해서만 제공된다

표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질감염(예를 들어 전기천공법, 리포펙션)에 사용된다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 당업계에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있고 기재된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행되지만, 본 명세서 전반에 걸쳐 언급되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌으로 제한되지 않는다, 예를 들어 Sambrook 등 MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL(3^rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) 및 Ausubel 등 Current Protocols in Molecular Biology(New York: Greene Publishing Association J Wiley Interscience), Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed.,1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture(R. 1. Freshney, ed.1987); Introduction to Cell and Tissue Culture(1. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel 등, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis 등, eds., 1994); Current Protocols in Immunology(E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999); Immunobiology(C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies(P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach(P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibidies: a laboratory manual(E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies(M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology(Y. T. DeVita 등, eds., J.B. Lippincott Company, 1993)를 참조한다.

작동예 외에도, 또는 달리 지시된 경우, 본원에 사용되는 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.

정의

본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 본 발명의 맥락에서 사용되는 여러 용어가 정의될 것이다. 이들 용어 외에도, 다른 것들이 필요에 따라 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다. 본원에서 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 당업계의 용어는 당업계에서 인식되는 의미를 가질 것이다.

명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 복수의 이러한 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신경 성장 인자" 및 "NGF"는 NGF의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지하는 신경 성장 인자 및 이의 변이체를 지칭한다.

"NGF 수용체"는 NGF에 의해 결합되거나 활성화되는 폴리펩티드를 지칭한다. NGF 수용체는 TrkA 수용체 및 더 적은 정도로 개과 p75 수용체를 포함한다.

NGF의 "생물학적 활성"은 일반적으로 NGF 수용체에 결합하고/하거나 NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 지칭한다. 비제한적으로, 생물학적 활성은 다음 중 임의의 하나 이상을 포함한다: NGF 수용체(예컨대 TrkA 및/또는 p75)에 결합하는 능력; TrkA 수용체 이량체화 및/또는 자가인산화를 촉진하는 능력; NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화하는 능력; 세포 분화, 증식, 생존, 성장 및 뉴런 형태학의 변화, 시냅스형성, 시냅스 기능, 신경전달물질 및/또는 신경펩티드 방출의 변화 및 손상 후 재생을 포함하는(뉴런의 경우, 말초 및 중추 뉴런 포함) 세포 생리학의 다른 변화를 촉진하는 능력; 마우스 E13.5 삼차 뉴런의 생존을 촉진하는 능력; 및 수술후 통증을 포함한 통증을 매개하는 능력.

본원에 사용된 바와 같이, "항-NGF 항원 결합 단백질"("항-NGF 항체" 및 "항-NGF 길항제 항체"로 상호교환가능하게 명명됨)은 NGF에 결합하고 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로(들)를 억제할 수 있는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 항-NGF 항원 결합 단백질은 NGF 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는 NGF 생물학적 활성을 차단, 길항, 억제 또는 감소(상당히 포함)시키고/시키거나 NGF가 수용체 결합과 같은 수용체 TrkA에 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 유발을 억제하는 결합 단백질 및 항체를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "항-NGF 항원 결합 단백질" 또는 "항-NGF-길항제 항체"는 이전에 식별된 용어, 제목, 및 기능적 상태 및 특성을 모두 포함하며 이에 의해 NGF 자체, NGF 생물학적 활성(본원에 모두 기재된, 골관절염 통증, 염증성 통증, 수술후 통증, 암 통증 등의 임의의 측면을 매개하는 능력에 대한 능력을 포함하나 이에 제한되지 않음), 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 의미있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중화되는 것으로 명시적으로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 항-NGF 길항제 항체는 NGF에 결합하고 NGF 이량체화 및/또는 NGF 수용체(예컨대 TrkA 및/또는 p75)에 대한 결합을 방지한다. 다른 구현예에서, 항-NGF 항원 결합 단백질은 NGF에 결합하고 TrkA 수용체 이량체화 및/또는 TrkA 자가인산화를 방지한다. 항-NGF 길항제 항체의 예는 본원에 제공된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 단백질", "항체" "항원 결합 단백질" 등은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 온전한 면역글로불린을 추가로 제공한다. 온전한 항체는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄를 갖는다. 따라서, 단일 단리된 온전한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 헤테로키메라 항체일 수 있다. 용어 "항원 결합 단백질" "항체' 등은 바람직하게는 모노클로날 항체 및 이의 단편, 및 NGF 단백질에 결합할 수 있는 이의 면역원성 결합 등가물 및 이의 단편을 지칭한다. 용어 항체 및 항원 결합 단백질은 동종 분자, 또는 복수의 상이한 분자 독립체(entity)로 구성된 혈청 생성물과 같은 혼합물을 지칭하는 데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 온전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "항체" 및 "항원 결합 단백질"은 또한 달리 언급되지 않는 한 항체 단편을 포함한다. 예시적인 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 디아바디(diabody), 그들의 항원-인식 단편, 소형 모듈 면역의약품(SMIP) 나노바디, IgNAR 분자 및 항원 결합 단백질 또는 항체 단편 및 임의의 상기 언급된 단편인 것으로 당업자에 의해 인식된 등가물 및 그들의 화학적으로 또는 유전적으로 조작된 대응물, 뿐만 아니라 다른 항체 단편 및 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체 및 항원 결합 단백질은 예를 들어, 전통적인 하이브리도마 기술(Kohler 등, Nature 256:495-499(1975)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 번호 4,816,567), 또는 항체 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 기술(Clackson 등, Nature 352:624-628(1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991))을 통해 제조될 수 있다. 다양한 다른 항체 생산 기술에 대해, Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow 등, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 뿐만 아니라 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 기술을 참조한다.

본원에 정의된 바와 같은 "모노클로날 항체"는 세포의 단일 클론(구체적으로, 하이브리도마 세포의 단일 클론)에 의해 생산된 항체이며 따라서 단일 순수한 동종 유형의 항체이다. 동일한 클론으로부터 생산된 모든 모노클로날 항체는 동일하고 동일한 항원 특이성을 갖는다. 모노클로날 항체는 동종 항체 집단이며 여기서 모노클로날 항체는 항원의 선택적 결합에 수반된 아미노산(자연 발생 및 비자연 발생)으로 구성된다. 모노클로날 항체 집단은 매우 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 용어 "모노클로날 항체"는 온전한 모노클로날 항체 및 전장 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 이의 단편(Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 디아바디, 그들의 항원-인식 단편, 소형 모듈 면역의약품(SMIP) 나노바디, IgNAR 분자 등), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위 및 항원에 결합하는 능력을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체의 공급원 또는 이들이 만들어진 방식(예를 들어 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자이식 동물 등에 의함)과 관련하여 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함하며 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 반면, 나머지 쇄(들)는 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이다. 전형적으로, 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 전형적으로 유전적 조작에 의해 상이한 종에 속하는 항체 가변 및 불변구축된 항체이다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변 세그먼트는 개과 불변 세그먼트에 연결될 수 있다. 도 2는 마우스: 개과 IgG의 일 구현예의 일반적 구조를 개략적으로 나타낸다. 이 구현예에서, 항원 결합 부위는 마우스로부터 유래되는 반면 Fc 영역은 개과이다.

본원에 정의된 바와 같은 용어 "헤테로키메라"는 항체 쇄(중쇄 또는 경쇄)의 하나가 개화된 반면 다른 것은 키메라인 항체를 지칭한다. 도 4는 헤테로키메라 분자의 일 구현예를 도시한다. 이 구현예에서, 개화된 가변 중쇄(여기서 모든 CDR은 마우스이고 모든 FR은 개과임)는 키메라 가변 경쇄(여기서 모든 CDR은 마우스이고 모든 FR은 마우스임와 쌍을 이룬다. 이 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 둘 다 개과 불변 영역에 융합된다.

단순화를 위해, 하기는 "개화된" 항체를 기재하지만, 고양이화, 말화, 인간화 또는 임의의 다른 "종분화된" 항원 결합 단백질에 동일하게 적용될 수 있다. 예로서, "개화"는 비-개과 항원 결합 정보를 공여자 항체에서 덜 면역원성인 개과 항체 수용자로 전달하여 개에서 치료제로서 유용한 치료를 생성하는 방법으로서 정의된다. 개화된 항체는 개과 면역글로불린(수용자 항체)이며 여기서 수용자의 초가변 영역 잔기는 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 닭, 소, 말, 라마, 낙타, 단봉낙타, 상어, 비인간 영장류, 인간, 인간화, 재조합 서열, 또는 원하는 특성, 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 조작된 서열과 같은 비-개과 종(공여자 항체)로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 개과 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-개과 잔기로 대체된다. 더욱이, 개화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. 본원에 기재된 바와 같이, 초가변 영역 및/또는 프레임워크 영역에 대한 변형은 당업계에 알려진 실험에 기반하여 각각 개별적으로 조작된 종분화된(개화된) 항체에 대해 결정되며 상기 실험 전에 예측될 수 없다. 일반적으로, 개화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 적어도 2 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-개과 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 개과 면역글로불린 서열의 것이다. 개화된 항체는 임의적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 개과 면역글로불린의 전체, 또는 적어도 일부를 포함할 것이다. 도 3은 마우스 IgG의 종분화 또는 개화를 나타내는 일 구현예의 예시이다. 이 구현예에서, 마우스 CDR은 개과 프레임워크 서열에 이식된다. 일부 경우에, 초가변 영역의 외부에 있는 마우스 프레임워크 또는 잔기가 그안에 유지된다. 항원 결합 단백질의 개화, 및 개화된 항원 결합 단백질의 개화에 대한 모든 설명은 개념적으로 개화, 고양이화(felinization), 말화(equinization), 인간화(humanization) 등이든 임의의 종분화된 항체에 적용가능할 수 있다.

어구 "재조합 개과 항체", "재조합 고양이과 항체", "재조합 인간 항체" 등은 모두 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 개과(또는 고양이과, 인간 등) 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 개과 면역글로불린 유전자에 대한 유전자이식된 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어 Taylor, L. D., 등(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 개과(또는 고양이과, 인간 등) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 종분화된 항체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개과 항체", "고양이과 항체", "인간 항체" 등은 표적에 대해 생성되고 당업자에게 잘 알려져 있고 본원에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조된 항체(항원 결합 단백질)를 지칭한다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2 개의 동일하나 경쇄(l) 및 2 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디술파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디술파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이에서 달라진다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄간 디술파이드 가교를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH) 뒤이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VL) 및 다른쪽 끝에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. 도 1은 항원 결합 부위를 강조하는 천연 마우스 면역글로불린 G(lgG)의 일반적 구조의 예이다.

본원에서 "모체" 항체는 변이체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 암호화된 것이다. 바람직하게는, 모체 항체는 개과 프레임워크 영역을 가지며, 존재하는 경우, 개과 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모체 항체는 개화된 또는 개과 항체일 수 있다.

항체 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 할당될 수 있다. 현재 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5 개의 주요 클래스가 있고, 이들 중 다수는 하위클래스(이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, 및 IgA₂(마우스 및 인간 지정에 의해 정의된 바와 같음)로 추가로 나눌 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤라고 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 하위단위 구조 및 3차원 구성은 다수의 종에서 잘 알려져 있다. 이들 불변 도메인과 연관된 개별 이소형 및 기능적 활성의 유행은 종 특이적이고 실험적으로 정의되어야 한다.

임의의 척추동물 종의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(K) 및 람다(λ)로 불리는 2 개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다.

항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 알려진 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4 개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어진다. 각 쇄에서 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 다른 쇄의 CDR은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2 가지 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기반한 접근법(즉, Kabat 등 Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, 메릴랜드주 베서스다)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 구조에 기반한 접근법(Chothia 등(1989) Nature 342:877; AI-Iazikani 등(1997) J. Molec. Bioi. 273:927-948)). 본원에 사용된 바와 같이, CDR은 어느 한 접근법 또는 두 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.

용어 "초가변 영역"은 본원에서 사용될 때 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(Kabat, 등(1991), 상기)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"로부터의 그러한 잔기(Chothia and Lesk J. Mol. BioI. 196:901-917(1987)를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 영역"은 항원과 상호작용하고 항원에 대한 특이성 및 친화성을 항체에 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 해당 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원 결합 잔기의 적절한 형태를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 보유한다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 신생아 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어 항체 가변 도메인)과 조합될 Fc 영역을 필요로 하고 이러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위한 당업계에 알려진 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역" 또는 "돌연변이된" 또는 "돌연변이체" Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 보유할 수 있거나 보유하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1 내지 약 10 개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 이들과 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 이들과 적어도 약 95% 서열 동일성을 보유할 것이다. 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역은 또한 항체의 Fc 영역의 기능을 본질적으로 제거할 수 있다. 예를 들어 Fc 영역 돌연변이는 항체의 효과기 기능을 제거할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 항체는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 항체는 더 이상 효과기 기능을 갖지 않는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 FcyRI, FcyRII, 및 FcyRIII 서브클래스의 수용체를 포함하며, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 것이다. FcyRII 수용체는 FcyRIIA("활성화 수용체") 및 FcyRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel 등, 1994, Immunomethods, 4:25-34; 및 de Haas 등, 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41에서 검토되고 있다. "FcR"은 또한 모체 IgG를 태아로 전달하는 역할을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다(Guyer 등, 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim 등, 1994, J. Immunol., 24:249).

본원에 사용된 바와 같은 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 관심 분자의 ADCC 활성은 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것과 같이, 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정에 대한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes 등, 1998, PNAS(USA), 95:652-656에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.

"보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적이 용해되는 것을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템(C1q)의 첫번째 구성요소를 동족 항원과 복합체화된 분자(예를 들어 항체)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods, 202: 163(1996)에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.

항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라고 하는 2 개의 동일한 항원 결합 단편을 생산하며, 각각은 단일 항원 결합 부위, 및 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 이름을 갖는 잔류 "Fc" 단편을 갖는다. 펩신 처리는 2 개의 항원-조합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차 연결할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 산출한다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇 개의 잔기를 첨가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab') 2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.

"Fv'는 완전한 항원-인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이 구성에서는 각 가변 도메인의 3 개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 정의한다. 일괄하여, 6 개의 초가변 영역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위보다 낮은 친화성에도 불구하고, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3 개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같은 "항원"은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질 또는 항체의 CDR에 의해 인식되는 항원성 결정기를 지칭한다. 다시 말해서, 에피토프는 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 임의의 분자의 해당 부분을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항-NGF 항원 결합 단백질/항체/제제가 결합하는 NGF의 영역을 지칭한다.

용어 "항원 결합 도메인," "항체의 활성 단편" 등은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하거나 이에 상보성인 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단백질의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. "에피토프," "에피토프의 활성 단편," 또는 "항원성 결정기" 등은 항체의 항원 결합 도메인과 특이적 상호작용을 담당하는 항원 분자의 일부이다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인(예를 들어 VH 도메인으로 이루어진 소위 Fd 항체 단편)에 의해 제공될 수 있다. 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함할 수 있다(미국 특허 번호 5,565,332).

용어 항체의 "결합 부분"(또는 "항체 부분") 또는 항원 결합 폴리펩티드 등은 하나 이상의 완전한 도메인, 예를 들어, 완전한 도메인의 쌍, 뿐만 아니라 항원, 예를 들어, NGF에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 제시되었다. 결합 단편은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab') 2, Fd, dAb, Fv, 단일 쇄, 단일 쇄 항체, 예를 들어, scFv, 및 단일 도메인 항체(Muyldermans 등, 2001, 26:230-5), 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편이다. F(ab')₂ 단편은 힌지 영역에서 디술파이드 가교에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어지고, Fv 단편은 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진다. dAb 단편은 VH 도메인으로 이루어진다(Ward 등,(1989) Nature 341:544-546). Fv 단편의 2 개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는(단일 쇄 Fv(scFv)로 알려짐(Bird 등, 1988, Science 242:423-426) 단일 단백질 쇄로서 만들어지게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "결합 부분"이라는 용어 내에 포함되도록 의도된다. 디아바디와 같은 단일 쇄 항체의 다른 형태가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 쇄 상의 2 개의 도메인 사이에 쌍을 이루게 하여, 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 강제하고 2 개의 항원 결합 부위를 생성하는, 2가, 이중특이적 항체이다(예를 들어, Holliger, 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 참조). 항체 또는 이의 결합 부분은 또한 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 만들기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, S. M., 등(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오티닐화 scFv 분자를 만들기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov, S. M., 등(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab') 2 단편과 같은 결합 단편은 전체 항체의 각각 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 본원에 기재되고 당업계에 알려진 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다. "이중특이적" 또는 "이중기능성" 항체 외에도, 항체는 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. "이중특이적" 또는 "이중기능성 항체"는 2 개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2 개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 개재 불변 영역을 갖는 2 개의 항원 결합 영역을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai 등, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, 1990.; Kostelny 등, 1992, J. Immunol. 148, 1547-1553을 참조한다.

용어 "복귀 돌연변이"는 개과 항체의 체세포로 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 전부가 상동 생식계열 항체 서열로부터의 상응하는 생식계열 잔기로 대체되는 과정을 지칭한다. 본 발명의 개과 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 가장 높은 상동성을 가진 서열을 식별하기 위해 생식계열 서열과 별도로 정렬된다. 본 발명의 개과 항체에서 차이는 이러한 상이한 아미노산을 암호화하는 정의된 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시킴으로써 생식계열 서열로 복귀된다. 따라서 복귀 돌연변이를 위한 후보로서 식별된 각 아미노산의 역할은 항원 결합에서 직접적 또는 간접적 역할에 대해 조사되어야 하고 돌연변이 후 개과 항체의 임의의 바람직한 특성에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 임의의 아미노산은 최종 개과 항체에 포함되지 않아야 하며; 예로서, 선택적 돌연변이생성 접근법에 의해 식별된 활성 향상 아미노산은 복귀 돌연변이의 대상이 되지 않을 것이다. 복귀 돌연변이의 대상인 아미노산 수를 최소화하기 위해 가장 근접한 생식계열 서열과 상이하지만 제2 생식계열 서열의 상응하는 아미노산과 동일한 것으로 밝혀진 이들 아미노산 위치는 남아있을 수 있되, 단 제2 생식계열 서열은 동일하고 본 발명의 개과 항체의 서열과 동일 선상에 있다. 선택된 표적 프레임워크 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 복귀 돌연변이는 친화성을 복원 및 또는 개선하는 데 필요할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 항체의 "면역특이적" 결합은 항체의 항원-조합 부위와 해당 항체에 의해 인식된 특이적 항원 사이에서 발생하는 항원 특이적 결합 상호작용을 지칭한다(즉, 항체는 ELISA 또는 다른 면역검정에서 단백질과 반응하고, 관련되지 않은 단백질과 검출가능하게 반응하지 않음). 항체 또는 폴리펩티드에 "특이적으로 결합"하거나, "우선적으로 결합"하는(본원에서 상호교환가능하게 사용됨) 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하기 위한 방법이 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 분자는 대체 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 지속기간으로, 및/또는 더 큰 친화성으로 반응하거나 회합하는 경우 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것이라고 한다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력, 더 용이하게, 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합하는 경우 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, NGF 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 NGF 에피토프 또는 비-NGF 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력, 더 용이하게, 및/또는 더 긴 지속기간으로 이 에피토프에 결합하는 항체이다. 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다는 것이 이 정의를 읽음으로써 또한 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 반드시 배타적 결합을 (포함할 수 있지만) 요구하지 않는다. 반드시는 아니지만 일반적으로, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.

항체 결합의 맥락에서 용어 "특이적으로"는 특이적 항원, 즉, 폴리펩티드, 또는 에피토프에 대한 항체의 높은 결합력 및/또는 높은 친화성 결합을 지칭한다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 동일한 항체를 다른 항원에 결합하는 것보다 더 강하다. 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 약하지만, 검출가능한 수준으로(예를 들어, 관심 폴리펩티드에 대해 제시된 결합의 10% 이하) 다른 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 이러한 약한 결합, 또는 배경 결합은 예를 들어 적절한 대조군을 사용함으로써 대상 폴리펩티드에 결합하는 특이적 항체로부터 용이하게 식별가능하다. 일반적으로, 특이적 항체는 10^.7 M 이하, 10^-8M 이하 10^-9M 이하, 10^·10 M 이하, 10^·11 M 이하, 10^.12 M 이하, 또는 10^.13 M 이하 등의 K_d의 결합 친화성으로 항원에 결합한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 단일 항원-조합 부위와 항원성 결정기의 결합 강도를 지칭한다. 친화성은 항체 또는 항원 결합 단백질 조합 부위와 항원 결정인자 사이의 입체화학적 적합의 근접성, 이들 사이의 접촉 면적 크기, 하전된 및 소수성 기의 분포 등에 따라 달라진다. 항체 친화성은 균형 분석 또는 표면 플라즈몬 공명 "SPR" 방법(예를 들어 BIACORE^TM)에 의해 측정될 수 있다 SPR 방법은 표면 플라즈몬 파동이 금속/액체 계면에서 여기될 때 발생하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상에 의존한다. 빛은 샘플과 접촉하지 않는 표면의 측면에서 지시되고 이로부터 반사되며, SPR은 각도와 파장의 특이적 조합에서 반사된 빛 강도를 감소시킨다. 이분자 결합 이벤트는 SPR 신호에서 변화로서 검출되는 표면층에서 굴절률 변화를 야기한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "Kd'는 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 해리 상수, Kd, 및 회합 상수, Ka는 친화성의 정량적 척도이다. 평형 상태에서, 자유 항원(Ag) 및 자유 항체(Ab)는 항원-항체 복합체(Ag-Ab)와 평형 상태를 이루고, 속도 상수, ka 및 kd는 개별 반응의 속도를 정량화한다. 평형 상태에서, ka[Ab][Ag]=kd[Ag-Ab]. 해리 상수, Kd는 다음에 의해 주어진다: Kd=kd/ka=[Ag][Ab]/[Ag-Ab]. Kd는 농도 단위, 보다 전형적으로 M, mM, μM, nM, pM 등을 갖는다. Kd로서 표현되는 항체 친화성과 비교할 때, NGF에 대한 친화성이 클수록 낮은 값으로 표시된다. 회합 상수, Ka는 다음에 의해 주어진다: Ka=ka/kd=[Ag-Ab]/[Ag][Ab]. Ka는 역 농도 단위, 보다 전형적으로 M^-1, mM^-1, μ.M^-1, nM^-1, pM^-1 등을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합력"은 가역적 복합체의 형성 후 항원-항체 결합의 강도를 지칭한다. 항-NGF 항체는 "약 (하한 Kd 값) 내지 약 (상한 Kd 값) 범위의 해리 상수(Kd)로" 결합하는 것과 같이, NGF 단백질에 대한 결합에 대해 Kd의 측면에서 특징될 수 있다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지화 구성요소와의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 정의 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체에 기반하기 때문에, 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있음이 이해된다.

용어 '보존적 아미노산 치환"은 주어진 아미노산 잔기에 대한 임의의 아미노산 치환을 나타내며, 여기서 치환체 잔기는 주어진 잔기와 화학적으로 매우 유사하여 폴리펩티드 기능(예를 들어, 효소적 활성)의 실질적인 감소를 초래하지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 통상적으로 알려져 있고 이의 예는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,790,639, 6,774,107, 6,194,167, 또는 5,350,576에 기재되어 있다. 바람직한 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 하기 6 개 그룹 중 하나 내에서 발생하는 어느 하나일 것이다:

작은 지방족, 실질적으로 비극성 잔기: Ala, Gly, Pro, Ser, 및 Thr;

큰 지방족, 비극성 잔기: lie, Leu, 및 Val; Met;

극성, 음으로 하전된 잔기 및 그들의 아미드: Asp 및 Glu;

극성, 음으로 하전된 잔기의 아미드: Asn 및 Gin; His;

극성, 양으로 하전된 잔기: Arg 및 Lys; His; 및

큰 방향족 잔기: Trp 및 Tyr; Phe.

바람직한 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은 천연 잔기(보존적 치환) 쌍으로 나열된 다음 중 임의의 하나일 것이다: Ala(Ser); Arg(Lys); Asn(Gin; His); Asp(Glu); Gin(Asn); Glu(Asp); Gly(Pro); His(Asn; Gin); Ile(Leu; Val); Leu(Ile; Val); Lys(Arg; Gin; Glu); Met(Leu; Ile); Phe(Met; Leu; Tyr); Ser(Thr); Thr(Ser); Trp(Tyr); Tyr(Trp; Phe); 및 Val(Ile; Leu).

용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자" 등은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고 DNA 및 RNA에서 일련의 뉴클레오티드 염기(또한 "뉴클레오티드"로 불림)를 지칭한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 그들의 유사체를 함유할 수 있다. 용어 "핵산"은 예를 들어, 단일 가닥 및 이중 가닥 분자를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, DNA 분자(예를 들어 cDNA), RNA 분자(예를 들어 mRNA), 재조합 핵산, 플라스미드, 및 다른 벡터, 프라이머 및 프로브일 수 있다. 5'에서 3'(센스) 및 3'에서 5'(안티센스) 폴리뉴클레오티드가 둘 다 포함된다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리-뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 구성요소와의 접합에 의해서와 같이, 중합체화 후 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형은 예를 들어, "캡(cap)", 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 예컨대, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 비하전된 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 결합(예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 사용하는 것들, 예를 들어, 단백질(예를 들어 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)과 같은 펜턴트 모이어티를 함유하는 것들, 인터칼레이터(예를 들어 아크리딘, 솔라렌 등)를 사용하는 것들, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)을 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 결합(예를 들어 알파 아노머성 핵산 등)을 사용하는 것들, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당에 정상적으로 존재하는 임의의 하이드록실 기는 예를 들어, 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호 기에 의해 보호되거나, 활성화되어 추가 뉴클레오티드에 대한 추가 결합을 제조할 수 있거나, 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 아민 또는 1 내지 20 개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 인산화되거나 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 2'-0-메틸-, 2'-0-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스를 포함하는 당업계에 일반적으로 알려진 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사체 형태, 카보사이클릭 당 유사체, 아노머성 당, 아라비노스, 크실로스 또는 릭소오스와 같은 에피머성 당, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 무환식 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대체 연결 기로 대체될 수 있다. 이러한 대체 대체 연결 기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), "(O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈")로 대체되는 구현예를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기서 R 또는 R'은 각각 독립적으로 H 또는 에테르(-0-) 결합을 임의적으로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬(1-20 C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오티드에서 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 바람직하게는 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 벡터는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미하는 발현 제어 서열을 갖는다. 발현 제어 서열은 구성적 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 '작동가능하게 연결된'다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서가 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.

폴리펩티드가 보존적 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있는 것과 마찬가지로, 이의 폴리뉴클레오티드는 보존적 코돈 치환(들)을 함유할 수 있다. 코돈 치환은 발현될 때, 상기 기재된 바와 같이, 보존적 아미노산 치환을 생산하는 경우 보존적인 것으로 간주된다. 아미노산 치환을 초래하지 않는 축퇴 코돈 치환이 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 유용하다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 구현예에서 유용한 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그것과 함께 형질전환될 발현 숙주 세포에 의해 나타낸 코돈 사용 빈도를 근사치화하거나, 달리 이의 발현을 개선하기 위해 축퇴 코돈 치환에 의해 돌연변이될 수 있다.

본원에서 "변이체" 항-NGF 항원 결합 단백질은 모체 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가, 결실, 및/또는 치환에 의해 "모체" 항-NGF 항체 아미노산 서열로부터의 아미노산 서열과 상이하고 모체 항-NGF-항체의 적어도 하나의 원하는 활성을 유지하는 분자를 지칭한다. 변이체 항-NGF는 본원에 기재된 바와 같이 항체의 초가변 영역에 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 원하는 활성은 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 동물에서 NGF 활성을 감소, 억제 또는 중화하는 능력을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 변이체는 모체 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역(들)에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모체 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역에 적어도 하나, 예를 들어 약 1 내지 약 10 개, 및 바람직하게는 약 2 내지 약 5 개의 치환을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변이체는 모체 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 50% 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85% 90% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 사이의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 모체 항체 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로 본원에서 정의된다. 항체 서열로의 N-말단, C-말단, 또는 내부 확장, 결실, 또는 삽입 중 어떤 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다. 변이체는 NGF에 결합하는 능력을 유지하고 바람직하게는 모체 항체와 동일하거나 더 우수한 바람직한 활성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 더 강한 결합 친화성, 동물에서 NGF 활성을 감소, 억제 또는 중화하는 향상된 능력, 및/또는 Trk A 및 p75에 대한 NGF 결합을 억제하는 향상된 능력을 가질 수 있다.

고친화성 NGF 수용체로 간주되는 Trk A는 신경영양성 티로신 키나제 수용체(NTKR) 패밀리의 구성원이다. 이 키나제는 뉴로트로핀 결합 시, MAPK 경로의 구성원 및 그 자체를 인산화하는(자가인산화) 막-결합된 수용체이다. 이 키나제의 존재는 세포 분화를 야기하고 감각 뉴런 하위유형을 명시하는 역할을 할 수 있다. p75 수용체는 저친화성 NGF 수용체로 간주된다.

본원에서 '변이체" 핵산은 "모체" 핵산으로부터의 서열과 상이한 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 서열 분기는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 또는 부가와 같은 돌연변이 변화로부터 초래될 수 있다. 이들 변화는 각각 단독으로 또는 조합하여 주어진 서열에서 1 회 이상 발생할 수 있다.

용어 "단리된"은 물질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질 또는 핵산)이 자연 환경의 구성요소로부터 분리되고/되거나 회수됨을 의미한다. 자연 환경에서 오염 구성요소는 물질에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 핵산과 관련하여, 단리된 핵산은 염색체에서 정상적으로 회합되는 5'에서 3'으로 서열을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 물질은 물질의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로 정제될 것이다. 단리된 물질은 물질의 자연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 동일 반응계에서(in situ) 물질을 포함한다. 그러나, 일반적으로 단리된 물질은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 모두 또한 그들의 자손을 포함하며, 이는 임의의 및 모두 후속 세대이다. 고의적 또는 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손이 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 이종 핵산 서열을 발현하는 맥락에서, "숙주 세포"는 시험관 내에 위치하든 생체 내에 위치하든 원핵 또는 진핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 및 곤충 세포)를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포는 유전자이식 동물에 위치할 수 있다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용자로서 사용될 수 있고 벡터를 복제할 수 있고/있거나 벡터에 의해 암호화된 이종 핵산을 발현할 수 있는 임의의 형질전환가능한 유기체를 포함할 수 있다.

단어 "표지"는 본원에서 사용될 때 항체 또는 핵산에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지 자체는 그 자체로 검출가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소적 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변이를 촉매할 수 있다.

"대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 분자에 의해 영향을 받을 수 있는 치료를 필요로 하는 포유동물을 지칭한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 포유동물은 척추동물을 포함하며, 개과, 고양이과 및 인간과 같은 포유동물이 특히 바람직한 예이다.

"조성물"은 화학적 조성물, 생물학적 조성물 또는 생물치료제(특히 본원에 기재딘 바와 같은 항원 결합 단백질) 및 애쥬번트(adjuvant)와 같이 불활성(예를 들어, 표지), 또는 활성일 수 있는 또 다른 화합물 또는 조성물이든, 활성제의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.

본원에 정의된 바와 같이, 본 발명에 사용하기에 적합한 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 담체는 비제한적으로, 물, 염수, 완충 염수, 포스페이트 완충액, 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 다른 통상적으로 이용되는 희석제, 애쥬번트 및 부형제는 통상적인 기술에 따라 첨가될 수 있다. 이러한 담체는 에탄올, 폴리올, 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 및 주사용 유기 에스테르를 포함할 수 있다. 완충제 및 pH 조절제가 또한 이용될 수 있다. 완충제는 비제한적으로, 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적인 완충제는, 비제한적으로, 유기 산 염, 예컨대 시트르산의 염, 예를 들어 시트레이트, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-Hel, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산, Tris, 트리메트아민 하이드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스, 및 염화나트륨, 락트화 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링커 덱스트로스 등에 기반한 것들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제(예를 들어 EDTA), 불활성 가스 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제가 또한 약제학적 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특성을 갖는, 상기 기재된 구성요소로부터 이러한 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe 등, APhA Publications, 2003과 같은 텍스트를 참조한다.

"치료적 유효량"(또는 "유효량")은 대상체 또는 환자에게 투여될 때 유리하거나 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 활성 성분, 예를 들어, 본 발명에 따른 제제의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 치료적 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "치료적 유효량"은 통증 감각의 경감 또는 감소와 같은 임상 결과를 포함한 유리하거나 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 NGF 관련 병태와 연관된 하나 이상의 매개변수에서 객관적으로 측정된 변화를 생산하는 것이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 수술후 통증, 류마티스성 관절염 통증, 및/또는 골관절염 통증을 포함한 통증을 치료, 개선, 이의 강도 감소 및/또는 예방하기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, "유효량"은 휴식 시 통증(휴식 통증) 또는 기계적으로 유도된 통증(운동 후 통증 포함), 또는 둘 다를 감소시킬 수 있고, 통증이 있는 자극 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 임상 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 간주될 수 있고, 단일 제제는 하나 이상의 다른 제제와 함께, 바람직한 결과를 달성할 수 있거나 달성한 경우, 유효량으로 주어지는 것으로 간주될 수 있다. 물론, 치료적 유효량은 치료되는 특정 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 선택된 특정 화합물, 따라야 할 투약 레지멘, 투여 시기, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적"은 질환, 병태 또는 장애에 대한 치료의 전체 스펙트럼을 포함한다. 본 발명의 "치료적" 제제는 위험이 있는 것으로 식별될 수 있는 동물을 표적하도록 설계된 절차를 혼입하는 것(약리유전학)을 포함하는 예방적 또는 예방 방식으로; 또는 본질적으로 개선 또는 치유되는 방식으로 작용할 수 있거나; 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추는 역할을 할 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체가 치료적 또는 예방적 용도를 위해 제공되는 수의학적 조성물을 특징으로 한다. 본 발명은 특정 항원, 예를 들어, 질환 또는 병태와 연관된 것을 갖는 개 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 본원에 기재된 재조합 항체와 함께, 치료적 유효량의 특정 항원에 특이적인 재조합 항체를 투여하는 것을 포함한다.

치료적 효과를 생산하기에 유용한 항체의 양은 당업자에게 잘 알려진 표준 기술에 의해 결정될 수 있다. 항체는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 완충제 내의 표준 기술에 의해 제공될 것이고, 임의의 바람직한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 모이어티의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입에 의해 또는 국소일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 투여 경로는 비경구이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 또는 복강내 투여를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "통증"은 급성 및 만성 통증을 포함하는 임의의 병인학의 통증, 및 염증성 구성요소를 갖는 임의의 통증을 지칭한다. 통증의 예는 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 신경병성 통증, 골절 통증, 골다공증성 골절 통증, 대상포진후 신경통, 암 통증, 화상으로 인한 통증, 화상 또는 상처와 연관된 통증, 외상과 연관된 통증(외상성 두부 손상 포함), 신경병성 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 혈청음성(비류마티스성) 관절병증, 비관절성 류마티즘 및 관절주위 장애와 같은 근골격계 장애와 연관된 통증, 및 암과 연관된 통증("돌발성 통증" 및 말기 암과 연관된 통증 포함), 말초 신경병증 및 대상포진후 신경통을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 유익하거나 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 급성, 만성, 염증성, 신경병성, 수술후 통증, 류마티스성 관절염 통증, 또는 골관절염 통증을 포함하는 통증의 임의의 측면의 개선 또는 경감. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 통증의 임의의 측면을 포함하여 통증과 연관된 하나 이상의 증상의 중증도 완화, 경감 포함(예컨대 통증의 지속기간 단축, 통증 감수성 또는 감각의 감소).

본원에 기재된 바와 같은 NGF 관련 장애는 심혈관계 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 대사 증후군, 통증 및 염증을 포함하는 장애를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서 NGF 관련 장애는 통증, 특히 만성 통증, 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 신경병성 통증, 골절 통증, 골다공증성 골절 통증, 대상포진후 신경통, 암 통증, 화상으로 인한 통증, 화상 또는 상처와 연관된 통증, 외상과 연관된 통증(외상성 두부 손상 포함), 신경병성 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 혈청음성(비류마티스성) 관절병증, 비관절성 류마티즘 및 관절주위 장애와 같은 근골격계 장애와 연관된 통증, 및 암과 연관된 통증("돌발성 통증" 및 말기 암과 연관된 통증 포함), 말초 신경병증 및 대상포진후 신경통을 지칭한다.

통증의 "발생률 감소"는 임의의 중증도(예를 들어, 아편을 포함하여 이 병태에 일반적으로 사용되는 다른 약물 및/또는 요법에 대한 필요성 및/또는 양(예를 들어, 이에 대한 노출)을 감소시키는 것을 포함할 수 있음), 지속기간, 및/또는 빈도(예를 들어, 개체에서 수술후 통증까지의 시간을 지연시키거나 증가시키는 것을 포함함)를 감소시키는 것을 의미한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 개체는 치료에 대한 반응의 측면에서 달라질 수 있고, 이와 같이, 예를 들어, "개체에서 류마티스성 관절염 통증 또는 골관절염 통증의 발생률 감소 방법"은 해당 특정 개체에서 이러한 발생률의 감소를 야기할 가능성이 있을 수 있다는 합리적인 예상에 근거하여 항-NGF 길항제 항체를 투여하는 것을 반영한다.

통증 또는 통증의 하나 이상의 증상(예컨대 류마티스성 관절염 통증 또는 골관절염 통증)을 "개선하는 것"은 항-NGF 길항제 항체를 투여하지 않은 것과 비교하여 통증의 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선을 의미한다. "개선하는 것"은 또한 증상 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.

통증 또는 통증의 하나 이상의 증상(예컨대 류마티스성 관절염 통증 또는 골관절염 통증)을 "완화하는 것"은 본 발명에 따른 항-NGF 길항제 항체로 치료된 개체 또는 개체 집단에서 수술후 통증의 하나 이상의 바람직하지 않은 임상 징후 정도의 완화를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 통증 발달을 "지연시키는 것"은 수술후 통증, 류마티스성 관절염 통증, 또는 골관절염 통증과 같은 통증의 진행을 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 질환의 병력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 시간일 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분하거나 상당한 지연은 개체에서 통증이 발생하지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 증상의 발달을 "지연시키는" 방법은 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때, 주어진 시간 프레임에서 증상이 발생할 확률을 감소시키고/시키거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 대상체의 통계적으로 유의한 수를 사용하는 임상 연구에 기반한다.

"수술후 통증"("절개후" 또는 "외상후 통증"으로 상호교환가능하게 불림)은 개체의 조직에 절단, 천자, 절개, 열상, 또는 상처(침습성이든 비침습성이든, 모든 수술 절차로부터 일어나는 것 포함)와 같은 외부 외상으로 인해 일어나거나 발생한 통증을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 수술후 통증은 외부의 물리적 외상 없이 발생하는(일어나거나 기원하는) 통증을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 수술후 통증은 내부 또는 외부(말초 포함) 통증이고, 상처, 절단, 외상, 열상 또는 절개는 우연히(외상성 상처와 같이) 또는 고의적으로(수술 절개와 같이) 발생할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "통증"은 통각 및 통증 감각을 포함하고, 통증은 통증 점수 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법을 사용하여, 객관적으로 및 주관적으로 평가될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 수술후 통증은 이질통증(즉, 정상적으로 유해하지 않은 자극에 대한 증가된 반응) 및 통각과민증(즉, 정상적으로 유해하거나 불쾌한 자극에 대한 증가된 반응)을 포함하며, 차례로 본질적으로 열적 또는 기계적(촉각)일 수 있다. 일부 구현예에서, 통증은 열 민감성, 기계적 민감성 및/또는 휴식 통증을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 수술후 통증은 기계적으로 유도된 통증 또는 휴식 통증을 포함한다. 다른 구현예에서, 수술후 통증은 휴식 통증을 포함한다. 통증은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 1차 또는 2차 통증일 수 있다.

본 발명을 기재하기 전에, 본 발명은 특정 방법, 및 기재된 실험적 조건으로 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건이 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이고, 제한하려는 것으로 의도되지 않으므로, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임이 이해되어야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 개시된 발명은 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(본원에 기재된 바와 같이, 용어 "항체", "길항제 항체" "항체 단편" 등으로 상호교환가능하게 사용됨), 및 특히 하이브리도마 또는 파지 디스플레이 기술에 의해 생산된 개화, 고양이화, 인간화 등의 항체 또는 NGF에 특이적으로 결합하여 NGF가 개과 TrkA 및 더 적은 정도로 개과 p75 수용체에 결합하는 것을 방지하는 완전히 "개화된"(종분화된) 모노클로날 항체에 관한 것이며, 따라서 신호전달 경로가 NGF에 의해 활성화되는 것을 방지한다는 점에서 길항제로서 역할을 한다.

NGF는 식별된 최초의 뉴로트로핀이었으며, 말초 및 중추 뉴런 둘 다의 발달 및 생존에서의 역할은 잘 특성화되었다. NGF는 말초 교감 및 배아 감각 뉴런 및 기저 전뇌 콜린성 뉴런의 발달에서 중요한 생존 및 유지 인자인 것으로 제시되었다(Smeyne 등(1994) Nature 368:246-249; Crowley 등(1994) Cell 76:1001-1011). NGF는 감각 뉴런에서 신경펩티드의 발현을 상향조절하고(Lindsay 등(1989) Nature 337:362-364) 그의 활성은 2 개의 상이한 막-결합된 수용체, TrkA 수용체 및 저친화성 p75 공통 뉴로트로핀 수용체로 간주되는 것을 통해 매개된다.

NGF는 상승된 양의 NGF가 상처나거나 병든 조직에 존재하는 NGF 관련 장애에서 상승하는 것으로 제시되었다. NGF 관련 장애는 상처난 조직, 병든 조직 또는 손상된 조직에서 NGF의 상승으로 인한 통증 증가로 정의될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 통증은 본원에 기재된 바와 같이 정의되며, 만성 통증, 염증성 통증, 수술후 절개 통증, 신경병성 통증, 골절 통증, 골다공증성 골절 통증, 대상포진후 신경통, 암 통증, 화상으로 인한 통증, 화상 또는 상처와 연관된 통증, 외상과 연관된 통증(외상성 두부 손상 포함), 신경병성 통증, 만성 통증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 혈청음성(비류마티스성) 관절병증, 비관절성 류마티즘 및 관절주위 장애와 같은 근골격계 장애와 연관된 통증, 및 암과 연관된 통증("돌발성 통증" 및 말기 암과 연관된 통증 포함), 말초 신경병증 및 대상포진후 신경통을 포함한 장애를 지칭한다.

본 발명의 구현예에서, NGF 장애는 대상체(인간, 개과 및 고양이과.)에서 골관절염으로서 정의된다. 골관절염(OA)은 개과에서 관절 연골의 손실 및 연골하 뼈의 후속 노출을 특징으로 하는 지발-진행성 퇴행성 관절 질환이다. 이것은 결국 관절 통증을 특징으로 하는 자기 영속성 잠행성 장애를 초래한다. 새로운 뼈 형성은 만성 염증, 및 움직임과 통증을 둘 다 제한하려는 시도에서 국소 조직 손상에 대한 반응으로 발생한다. 거시적으로, 관절 연골의 손실, 관절 공간의 협소화, 연골하 뼈의 경화증, 및 관절 골증식체의 생산이 있다(Veterinary Focus: Vol 17 No 3; 2007)

개과 및 고양이과와 같은 상이한 종에서, 1차 OA의 발병은 품종에 따라 달라진다. 개과의 경우, 평균 발병 연령은 로트와일러(Rottweiler)에서 3.5 세이고 푸들(Poodle)에서 9.5 세이며 예를 들어, 다른 품종 뿐만 아니라 혼합 품종의 경우 발병 범위가 광범위하다. 발달성 정형외과 질환 및 연관된 골관절염은 개에서 가장 흔한 관절 질환이며, 관절 질환 및 부속 골격 내의 관련 문제에 대한 의료 방문의 약 70%를 차지한다. 사례의 22%는 1 세 이하의 개였다. OA의 발병률은 외상 뿐만 아니라 비만, 노화 및 유전적 이상에 의해 증가된다. 특히, 연령은 관절염 사례의 >50%가 8-13 세 사이의 개에서 관찰되는 OA 발병 인자일 수 있다. 근골격계 질환은 노인 환자에서 매우 흔하며, 노령견의 거의 20%가 정형외과 장애를 나타낸다. >8 세의 래브라도 리트리버(Labrador Retriever)에서, 여러 관절(팔꿈치, 어깨, 엉덩이, 무릎)의 OA가 전형적이다. 추가로, 개과의 크기가 또한 OA 발병에서 역할을 한다. 관절염이 있는 개의 45%는 대형종 개이다. 이들 중에서, >50%가 거대종 개인 반면, 28%만이 중형종 개이고 27%가 소형종 개이다. 개과에서 OA 통증의 경감을 위한 약제학적 개입의 필요성이 매우 높다.

본원에서 언급된 바와 같이, 상승된 NGF 수준은 특히 OA에서 NFG 관련 장애를 나타낸다. 상승된 NGF 수준은 비만 세포 수의 증가와 함께 유전자이식 관절염 마우스에서 보고되었다(Aloe, 등, Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143(1993)). PCT 공개 번호 WO 02/096458은 염증성 병태(예를 들어, 류마티스성 관절염)와 같은 다양한 NGF 관련 장애를 치료하는 데 특정 특성의 항 NGF 항체의 사용을 개시한다. 인간 종양 괴사 인자 유전자를 보유하는 관절염 유전자이식 마우스에 주사된 정제된 항-NGF 항체는 비만 세포 수의 감소, 뿐만 아니라 관절염 마우스의 활막 내의 히스타민 및 물질 P 수준의 감소를 야기하는 것으로 보고되었다(Aloe 등, Rheumatol. Int. 14: 249-252(1995)). NGF 항체의 외인성 투여는 관절염 마우스에서 발생하는 TNFα의 향상된 수준을 감소시키는 것으로 제시되었다(Marmi 등, Rheumatol. Int. 18: 97-102(1998)). 설치류 항-NGF 길항제 항체가 보고되었다. 예를 들어 Hongo 등, Hybridoma(2000) 19(3): 215-227; Ruberti 등(1993) Cell. Molec. Neurobiol. 13(5): 559-568을 참조한다. 그러나, 설치류 항체가 비-뮤린 포유동물에서 치료적으로 사용될 때, 항-뮤린 항체 반응은 치료된 개체의 상당한 수에서 발생한다. 따라서, 특히 OA를 치료하는 데 사용하기 위한 개과용 본 발명의 항-NGF 길항제 항체를 포함하는, 항-NGF 길항제 항원 결합 단백질에 대한 심각한 필요성이 있다.

항체의 특성은 매우 매력적인 치료제를 만들도록 하지만, 다수의 제한이 있다. 대다수의 모노클로날 항체(mAb)는 이전에 언급된 바와 같이 설치류 기원의 것이다. 이러한 항체가 상이한 종에 투여될 때, 환자는 이러한 외인성 항체에 대한 자신의 항체 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 반응은 결국 항체의 중화 및 제거를 초래할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 마우스는 모노클로날 항체의 생산에 배타적으로 사용된다. 일반적으로 처음에 마우스에서 특정 종에 의해 생산된 항체를 사용하는 것의 한 가지 문제는 상기 항체로 치료되는 비-뮤린 대상체가 마치 외래 물질인 것처럼 마우스 항체와 반응하여 마우스 항체에 대한 새로운 항체 세트를 생성한다는 점이다. 마우스 항체는 비-뮤린, 예를 들어 개과, 면역계에 의해 외래로 "보여진" 다음, 대상체는 분자에 대한 면역 반응을 일으킨다. 당업자는 대상체를 항원 특이적 항체로 치료할 수 있어야 하지만, 해당 항체 종에 특이적일 필요성을 인식할 것이다. 종간 항체 투여, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체를 개과에 투여하여 생성된 반응의 일환은 발진과 같은 가벼운 형태에서, 신부전과 같은 보다 극단적이고 생명을 위협하는 반응까지 범위일 수 있다. 이 면역 반응은 또한 치료의 효과를 감소시키거나, 대상체가 마우스 항체를 함유하는 후속 치료를 받는 경우 향후 반응을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 항체의 "개화"에 의해 이 단점을 극복하는 것을 제시한다. 특히, 이 과정은 면역글로불린 가변 도메인의 프레임워크 영역에 초점을 맞추지만, 또한 가변 도메인의 상보 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 이 과정에 대한 실시를 가능하게 하는 단계 및 축소가 본 개시내용에 기재되어 있다.

동물로부터의 모노클로날 항체(본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질, 길항제 항체 등이며 용어는 상호교환적으로 사용됨)를 변형시켜 종에 대한 치료적 투여를 위해 덜 면역원성이 되게 하는 과정은 적극적으로 추구되었고 다수의 간행물에 기재되었다(예를 들어 Antibody Engineering: A practical Guide. Carl A. K. Borrebaeck ed. W.H. Freeman and Company, 1992). 그러나, 이 과정은 최근까지 비-인간, 특히 개과에 대한 치료제 또는 진단제 개발에 적용되지 않았다. 사실상, 개과 가변 도메인에 대해 거의 공개되지 않았다. Wasserman and Capra, Biochem. 6, 3160(1977)은 개과 IgM 및 개과 IgA 중쇄 둘 다의 가변 영역의 아미노산 서열을 결정하였다. Wasserman and Capra, Immunochem. 15, 303(1978)은 개과 IgA로부터 K 경쇄의 아미노산 서열을 결정하였다. McCumber and Capra, Mol. Immunol. 16, 565(1979)는 개과 뮤 쇄의 완전 아미노산 서열을 개시한다. Tang 등, Vet. Immunology Immunopathology 80, 259(2001)는 단일 개과 IgG-A y 쇄 cDNA 및 4 개의 개과 IgG-A y 쇄 단백질 서열을 개시한다. 인간, 마우스, 돼지, 및 소 IgG의 보존적 영역으로부터 설계된 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 개과 비장 cDNA 라이브러리의 PCR 증폭을 기재한다. 개과 항체에 이용가능한 정보의 부족은 개과 질환 치료를 위한 치료제로서 개발을 방해하였다.

이러한 언급된 제한은 "종분화"로 알려진 조작 기술의 개발을 촉진하였고 치료 항체의 "인간화" 측면에서 당업자에게 잘 알려져 있다. 인간화 항체는 비인간 면역글로불린로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체 또는 이의 단편으로 생성될 수 있다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기가 특이성, 친화성, 및 효능과 같은 원하는. 특성을 갖는, 마우스와 같은 비인간 종의 CDR의 잔기(즉 "공여자 항체" 또는 "기원 종 항체")로 대체된 인간 항체(즉 "수용자 항체" 또는 "표적 종 항체")이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 이 인간화 전략은 인간화 항체의 제조에 대해 보고된 바와 같이 "CDR 이식"으로 언급된다(Winter, 미국 특허 번호 5,225,539). 선택된 표적 프레임워크 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 복귀 돌연변이는 친화성을 복원 및 또는 개선하는 데 필요할 수 있다. 구조-기반 방법은 또한 예를 들어 미국 특허 출원 일련 번호 10/153,159 및 관련 출원에서 인간화에 대해 기재된 바와 같이, 인간화 및 친화성 성숙에 이용될 수 있다. 항체 결정 구조에 기반한 컴퓨터 모델링 뿐만 아니라, 여러 항체의 인간화에 필요한 필수 프레임워크 잔기의 비교는 "버니어 구역(Vernier zone) 잔기"로 불리는 프레임워크 잔기 세트를 밝혀냈다(Foote, J. Mol. Biol. 224:487-499(1992)). 또한, VH-VL 계면 구역에서 여러 잔기는 항원에 대한 친화성을 유지하는 데 중요한 것으로 제안되었다(Santos, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 60: 169-94(1998); Kettleborough, 등, Protein Engin., 4:773-783(1991)). 개에서 사용하기 위한 항체의 "개화"를 위한 유사한 전략은 US 7,261,890에 기재되어 있다.

대안적으로, 인간화 항체는 개별 인간 프레임워크 영역의 풀(예를 들어 라이브러리)에 이식된 비인간 서열로부터의 CDR을 함유할 수 있다. 이 새로 조작된 항체는 원래 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있다. 항체 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된다. 이 측면을 수행하기 위한 방법론은 일반적으로 프레임워크 셔플링으로 기재된다(Dall'Acqua, Methods, 36:43-60(2005)). 더욱이, 인간화 항체는 공여자 종에 대해 높은 상동성을 갖는 적어도 2 개의 인간 항체 생식계열 서열로부터 유래된 2 개 이상의 프레임워크 영역의 서열을 함유할 수 있다. 이 방법을 사용하여 설계된 항체는 하이브리드 항체로 기재되고(Rother 등, 미국 특허 번호 7,393,648) 인간화 이외의 종분화, 예를 들어 개화에 적용가능할 수 있다.

상기 기재된 접근법은 공여자 종으로부터 CDR을 받도록 조작된 표적 종의 하나 이상의 항체 가변 중쇄 또는 가변 경쇄로부터 본질적으로 전체 프레임워크 영역을 활용한다. 이 접근법은 또한 개화와 동일한 방식으로 고양이과에 투여될 때 항체를 덜 항원성으로 만들도록 고양이화할 때 활용된다. 일부 경우에, 가변 영역에서 선택된 잔기의 복귀 돌연변이를 사용하여 CDR의 제시를 향상시킨다. 항체에서 비천연 서열에 대한 대상체의 면역원성 반응을 최소화하면서, 동시에 효능을 충분하게 유지하도록 항체의 항원 결합 영역을 보존하는 항체를 설계하는 것은 과제인 것으로 입증되었다.

단백질을 표적화하는 치료용 항체를 개발하기 위한 또 다른 과제는 상이한 종의 상동 단백질에 대한 에피토프가 빈번하게 상이하고, 다른 단백질과의 교차 반응성에 대한 가능성이 또한 상이하다는 점이다. 결과적으로, 치료될 특정 종에서 특이적 표적에 대해 항체를 제조하고, 테스트하고 개발해야 한다.

항체는 항체 분자의 가변 영역과의 상호작용에 의해 항원에 대한 특이적 에피토프의 결합을 통해 항원을 표적한다. 더욱이, 항체는 다양한 생물학적 활성을 매개, 억제(길본 발명의 항성 항-NGF 항원 결합 단백질의 경우에서와 같음) 및/또는 개시하는 능력을 갖는다. 치료용 항체에 대한 광범위한 기능이 있으며, 예를 들어, 항체는 작용제 또는 길항제로서 수용체-리간드 상호작용을 조절할 수 있다. 항체 결합은 세포 성장, 사이토카인 생산, 또는 세포자멸사를 자극하기 위해 세포내 신호전달을 개시할 수 있다. 항체는 Fe 영역에 결합된 제제를 특이적 부위로 전달할 수 있다. 항체는 또한 항체-매개 세포독성(ADCC), 보체-매개 세포독성(CDC), 및 식세포 작용을 도출한다. 또한 ADCC, CDC, C1q 결합 및 식세포 작용 기능이 제거된 경우 변경된 항체가 있다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 항체는 상기 항체의 효과기 기능을 변경하는 항체의 Fc 영역에서의 변경을 포함한다.

개화 및 고양이화

본원에 사용된 바와 같이, "개화된 항체"는 개과에 의해 생산되고/되거나 당업계에 알려져 있거나 본원에 개시된 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 고양이화 과정에 대해 동일한 과정이 수행되었으며 본원의 설명에 적용되어야 한다. 단순화하기 위해, 개화는 주로 예로 사용될 것이지만, 이들 예는 개과에만 제한되지 않는다. 동일한 개념 및 설계가 다른 항원 결합 단백질, 예를 들어 고양이과, 및 인간 등의 종분화에 적용된다). 개화된 항체의 이 정의는 적어도 하나의 개과 중쇄 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 개과 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 항체의 "종분화" 그 자체, 및 특히 항체의 인간화는 당업자에게 잘 알려진 연구 분야이다. 인간화를 넘어서는 항체의 종분화가 임의의 다른 종에서 효과적일 수 있는 치료용 항체를 산출하는지 여부는 최근까지 알려져 있지 않았다. 본 발명은 각각 개와 고양이에서 치료적 용도를 위한 항-NGF 항원 결합 단백질의 개화 및 고양이화를 예시한다.

키메라 항체는 적어도 2 개의 상이한 종으로부터의 서열을 포함한다. 일 예로서, 재조합 클로닝 기술은 비-수용자 항체(즉, 항원으로 면역화된 공여자 종에서 제조된 항체)로부터 항원 결합 부위를 함유하는 가변 영역 및 수용자 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역을 포함하기 위해 사용될 수 있다.

종분화된(개화된, 고양이화된 등) 항체는 키메라 항체의 한 유형이며 여기서 항원 결합에 책임이 있는 가변 영역 잔기(즉, 상보성 결정 영역의 잔기, 줄여서 상보성 결정 영역, 또는 항원 결합에 참여하는 임의의 다른 잔기)는 비-개과(또는 비-고양이과) 종으로부터 유래되는 반면, 나머지 가변 영역 잔기(즉, 프레임워크 영역의 잔기) 및 불변 영역은 적어도 부분적으로 개과(또는 고양이과) 항체 서열로부터 유래된다. 종분화된 항체의 프레임워크 영역 잔기 및 불변 영역 잔기의 하위세트는 비-개과(또는 고양이과) 공급원으로부터 유래될 수 있다. 종분화된 항체의 가변 영역은 또한 종분화된 것(즉, 종분화된 경쇄 또는 중쇄 가변 영역)으로 기재된다. 비-종분화된 종은 전형적으로 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류, 또는 다른 비-개과 또는 비-고양이과 포유동물 종과 같이 항원으로 면역화하는 데 사용되는 종이다.

상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합에 참여하는 항체 가변 영역의 잔기이다. CDR을 식별하기 위한 여러 넘버링 시스템이 통상적으로 사용된다. Kabat 정의는 서열 가변성에 기반하고, Clothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기반한다. AbM 정의는 Kabat와 Clothia 접근법 사이의 절충안이다. 본 발명의 종분화된 항체는 하나 이상의 CDR을 포함하도록 구축될 수 있다. 또한 추가로, CDR은 SMIP 및 작은 항체 모방체와 같은 합성 분자에서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

프레임워크 잔기는 초가변 또는 CDR 잔기 이외의 항체 가변 영역의 잔기이다. 프레임워크 잔기는 본 발명의 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 유사한 개과 프레임워크와 같은, 자연 발생 개과(예를 들어, 그러나 고양이과 및 인간과 같은 다른 종과 개념적으로 적용가능하다. 단순화를 위해 개과는 대표 종으로 사용될 것이지만 예는 이와 같은 개과로 제한되지 않는다) 항체로부터 유래될 수 있다. 개별 서열 중에서 공통(consensus)을 나타내는 인공 프레임워크 서열이 또한 사용될 수 있다. 개화를 위한 프레임워크 영역을 선택할 때, 개과에서 광범위하게 나타나는 서열은 덜 조밀한 서열에 비해 바람직할 수 있다. 개과 프레임워크 수용자 서열의 추가의 돌연변이는 항원 접촉에 관여하는 것으로 여겨지는 뮤린 잔기 및/또는 항원 결합 부위의 구조적 무결성에 관여하는 잔기를 복원하거나, 항체 발현을 개선하기 위해 만들어질 수 있다.

CDR의 이식은 수용자 항체(예를 들어, 개화 항체 또는 원하는 프레임워크 잔기를 포함하는 다른 항체)의 하나 이상의 CDR을 공여자 항체(예를 들어 비-개과 항체)의 CDR로 대체함으로써 수행된다. 수용자 항체는 후보 수용자 항체와 공여자 항체 사이의 프레임워크 잔기의 유사성에 기반하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 개과 프레임워크 영역은 관련 비-개과 항체의 각 프레임워크 영역과 실질적인 서열 상동성을 갖는 것으로 식별되고, 비-개과 항체의 CDR은 상이한 개과 프레임워크 영역의 합성물에 이식된다.

이용가능한 아미노산 서열 데이터의 분석과 조합된 항체-항원 복합체의 3차원 구조의 분석은 CDR 내의 각 위치에서 발생하는 아미노산 잔기의 구조적 비유사성에 기반하여 서열 가변성을 모델링하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 CDR은 또한 2 개의 CDR 영역 및 프레임워크 영역을 포함하는 작은 항체 모방체에서 활용될 수 있다(Qui 등 Nature Biotechnology Vol 25;921-929; August 2007).

CDR의 이식을 위한 수용자 프레임워크 또는 줄여서 CDR은 원하는 잔기를 도입하도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 수용자 프레임워크는 임의적으로 하나 이상의 위치에서 비-개과 공여자 잔기를 갖는 개과 공통 서열의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 이식 후, 항체 결합 및 기능성을 최적화하기 위해 공여자 및/또는 수용자 서열에서 추가의 변화가 이루어질 수 있다. 예를 들어 국제 공개 번호 WO 91/09967을 참조한다.

본 발명은 본 발명의 항체를 발현하는 세포 및 세포주를 추가로 제공한다. 대표적인 숙주 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포, 및 COS 세포와 같은 박테리아, 효모, 포유동물 및 인간 세포를 포함한다. 이종 작제물을 숙주 세포로 형질전환한 후 안정한 세포주를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 대표적인 비-포유동물 숙주 세포는 곤충 세포를 포함한다(Potter 등(1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112). 항체는 또한 유전자이식 동물(Houdebine(2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) 및 유전자이식 식물(Schillberg 등(2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45)에서 생산될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 항체의 다른 부분, 예를 들어 불변 영역을 예를 들어 결실, 부가, 또는 치환함으로써 변형된 모노클로날, 키메라 및 종분화된 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 항체는 다음과 같이 변형될 수 있다: (i) 불변 영역을 결실시킴; (ii) 불변 영역을 또 다른 불변 영역, 예를 들어, 항체의 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시키는 것을 의미하는 불변 영역, 또는 또 다른 종 또는 항체 클래스로부터의 불변 영역으로 대체함; 또는 (iii) 예를 들어, 글리코실화 부위의 수, 효과기 세포 기능, Fc 수용체(FcR) 결합, 보체 고정 등을 변경시키기 위해 불변 영역의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 항체는 항체의 효과기 기능을 변경하는 변경된 Fc 영역을 포함한다.

항체 불변 영역을 변경하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 변경된 기능, 예를 들어 세포 상의 FcR, 또는 보체의 C1 구성요소와 같은 효과기 리간드에 대한 변경된 친화성을 갖는 항체는 항체의 불변 부분의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 대체함으로써 생산될 수 있다(예를 들어, EP 388,151 A1, 미국 특허 번호 5,624,821 및 미국 특허 번호 5,648,260 참조, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함됨).

예를 들어, 명시된 잔기(들)를 측쇄에 적절한 기능성을 갖는 잔기(들)로 대체하거나, 글루타메이트 또는 아스파르테이트와 같은 하전된 작용기, 또는 아마도 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 알라닌과 같은 방향족 비극성 잔기를 도입함으로써 FcR(예를 들어 Fc 감마 R1), 또는 C1q 결합을 위한 항체의 Fc 영역의 친화성을 변경하는 것이 가능하다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821 참조). 항체 또는 이의 결합 단편은 세포독소, 치료제, 또는 방사성 금속 이온과 접합될 수 있다. 일 구현예에서, 접합되는 단백질은 항체 또는 이의 단편이다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 비제한적인 예는 칼리키아미신, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 및 이의 유사체, 또는 상동체를 포함한다. 치료제는 항대사물(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 및 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP), 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 모이어티를 단백질에 접합하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

조성물, 유도된 조성물, 및 조성물의 제조 방법

본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 항원 결합 단백질(본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "항체", "항체 단편", "길항제 항체" 등), 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약제학적 조성물을 포함한 조성물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 NGF에 결합하는 하나 이상의 항체, 항원 결합 단백질 또는 폴리펩티드(이는 항체일 수 있거나 아닐 수 있음), 및/또는 NGF에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 잘 알려진 완충제를 포함하는 약제학적으로/수의학적 허용되는 부형제와 같은 적합하 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 단리된 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 구현예를 포함한다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 구현예를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 NGF에 특이적으로 결합하는 신규 항원 결합 단백질을 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 항원 결합 단백질은 항체 또는 항체 단편으로 정의된다. 하나 이상의 구현예에서, 항원 결합 단백질은 개화, 고양이화, 말화 또는 인간화된다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 개과, 고양이과 또는 인간 NGF에 결합한다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체이다. 일 구현예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 NGF에 결합하고 수용체 Trk A 및 더 적은 정도로 p75에 대한 결합 및 활성화를 방지하여, 본원에 기재된 바와 같은 신호전달 캐스케이드를 방지한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 서열번호 4(아미노산 서열: GFTLTQYG)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR 1), 서열번호 5(아미노산 서열: VIWATGATD)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR 2) 및 서열번호 6(아미노산 서열: DGWWYATSWYFDV)과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질을 제공하고; 항원 결합 단백질은 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며:

다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1):

(X1)-알라닌[A]-세린[S]-글루타민[Q]-(X2)-이소류신[I]-(X3)-(X4)-(X5)-류신[L]-아스파라긴[N]

여기서:

X1은 리신(K) 또는 아르기닌(R)을 포함하고,

X2는 세린(S) 또는 아스파르트산(D)을 포함하고,

X3은 아스파라긴(N) 또는 세린(S)을 포함하고,

X4는 히스티딘(H) 또는 아스파라긴(N)을 포함하고,

X5는 티로신[Y] 또는 아스파라긴[N]을 포함함; 및

다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2):

트레오닌[T]-(X6)-(X7)-류신[L]-(X8)-(X9) 여기서:

X7은 아르기닌[R] 또는 세린[S]을 포함하고,

X8은 글루타민[Q] 또는 히스티딘[H]을 포함하고,

다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3):

(X10)-(X11)-(X12)-(X13)-(X14)-(X15)-P-(X16)-(X17) 여기서

X10은 Q 또는 H를 포함하고,

X11은 Q 또는 R을 포함하고,

X12는 G 또는 A를 포함하고,

X13은 D, S, T 또는 N을 포함하고,

X14는 H, T 또는 M을 포함하고,

X15는 F, L 또는 S를 포함하고,

X16은 R, Y 또는 G를 포함하고,

X17은 T 또는 P를 포함함;

상기 항원 결합 단백질의 임이의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 항원 결합 단백질, "H3AQC2301B12L1AL1L3"(또는 "ZTS-182")을 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 여기서 가변 경쇄는 서열번호 51을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, 가변 중쇄는 서열번호 4와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC VH CDR1), 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC" VH CDR2), 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC" VH CDR3)을 포함하는 상보성 결정 영역 1-3을 포함하고; 여기서 가변 경쇄 서열번호 7과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("QC2301B12L1AL1L3" VL CDR1), 서열번호 8을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("QC2301B12L1AL1L3" VL CDR2), 및 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("QC2301B12L1AL1L3" VL CDR3)을 포함하는 상보성 결정 영역 1-3; 및 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내 또는 본 발명의 항원 결합 단백질의 전체 VH 또는 VL 서열의 아미노산 서열 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 항원 결합 단백질, "H3AQC2301B12L1AL1L3" 또는 "ZTS-182"를 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 50을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고 가변 경쇄는 서열번호 52를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공하거나, 여기서 유전자 코드의 축퇴가 고려된다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 가변 중쇄 및 서열번호 52를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 가변 경쇄를 포함하는 단리된 및 재조합 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공하거나 여기서 유전자 코드의 축퇴가 고려되며; 서열번호 161을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된 개과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고 서열번호 159를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된 개과 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 185를 포함하는 효과기 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 50을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된 가변 중쇄 및 핵산 서열 서열번호 52에 의해 암호화된 가변 경쇄를 포함하는 단리된 및 재조합 항원 결합 단백질; 및 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공하거나 여기서 유전자 코드의 축퇴가 고려되며; 서열번호 161을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 개과 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고 서열번호 159를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 개과 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서 본 발명은 서열번호 185를 포함하는 효과기 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 서열번호 4(아미노산 서열: GFTLTQYG)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR 1), 서열번호 5 (아미노산 서열: VIWATGATD)와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR 2) 및 서열번호 6(아미노산 서열: DGWWYATSWYFDV)과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같이, 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하고 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하여 NGF의 생물학적 활성을 차단하는 항원 결합 단백질을 제공하고; 항원 결합 단백질은 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며:

(X1)-A-S-Q-(X2)-I-(X3)-(X4)-(X5)-L-N 여기서:

X1은 K 또는 R을 포함하고,

X2는 S 또는 D를 포함하고,

X3은 N 또는 S를 포함하고,

X4는 H 또는 N을 포함하고,

X5는 Y 또는 N을 포함함; 및

T-(X6)-(X7)-L-(X8)-(X9) 여기서:

X6은 T, H, S 또는 A를 포함하고,

X7은 R 또는 S를 포함하고,

X8은 Q 또는 H를 포함하고,

X9는 A, Q, G 또는 V를 포함함; 및

(X10)-(X11)-(X12)-(X13)-(X14)-(X15)-P-(X16)-(X17) 여기서

X10은 Q 또는 H를 포함하고,

X11은 Q 또는 R을 포함하고,

X12는 G 또는 A를 포함하고,

X13은 D, S, T 또는 N을 포함하고,

X14는 H, T 또는 M을 포함하고,

X15는 F, L 또는 S를 포함하고,

X16은 R, Y 또는 G를 포함하고,

X17은 T 또는 P를 포함함;

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 개화된 항원 결합 단백질, "ZTS-182 m6"을 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 여기서 가변 경쇄는 서열번호 175를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, 가변 중쇄는 서열번호 4와 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC VH CDR1), 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC" VH CDR2), 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열("01B12H3AHC" VH CDR3)을 포함하는 상보성 결정 영역 1-3을 포함하고; 여기서 가변 경쇄 서열번호 167과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 168을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열번호 169를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1-3; 및 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내 또는 본 발명의 항원 결합 단백질의 전체 VH 또는 VL 서열의 아미노산 서열 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체. 하나 이상의 구현예에서 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 160을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 경쇄 불변 영역 및 서열번호 158을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체는 서열번호 184를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능 돌연변이를 포함하는 개과 중쇄 불변 영역을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 개화된 항원 결합 단백질, "ZTS-182m6"을 제공하며; 여기서 가변 중쇄는 서열번호 50을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고 가변 경쇄는 서열번호 176을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공하거나, 여기서 유전자 코드의 축퇴가 고려된다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 고양이화된 항원 결합 단백질, ZTS-082-1B를 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 85("H1-23" VH)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 가변 경쇄는 서열번호 87("KPL")을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 고양이화된 항원 결합 단백질, ZTS-082-1C를 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 85("H1-23" VH)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 가변 경쇄는 서열번호 89("L3-K36" VL)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 개화된 항원 결합 단백질, ZTS-082-361을 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 92("H733")를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 가변 경쇄는 서열번호 89("L3-K36")를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 고양이화된 항원 결합 단백질, ZTS-082-2D를 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 85("H1-23" VH)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 가변 경쇄는 서열번호 94("K643" VL)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명은 단리된 및 재조합 고양이화된 항원 결합 단백질, ZTS-082-2E를 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열번호 92("H733" VH)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 가변 경쇄는 서열번호 87("KPL" VL)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.

본 발명은 재조합 항원 결합 단백질, 일부 경우에 모노클로날 항체, 및 본원에 기재된 바와 같은 항체 단편 및 임상 투여 및 진단 절차를 포함하는 과학적 절차에서 이들의 용도를 제공한다. 분자 생물학 방법 및 재조합 기술이 도래함에 따라, 재조합 수단에 의해 항체 및 항체-유사 분자를 생산하여 이에 의해 항체의 폴리펩티드 구조에서 발견된 특이적 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열을 생성하는 것이 가능하다. 이러한 항체는 상기 항체의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 유전자 서열을 클로닝하거나 상기 폴리펩티드 쇄를 직접 합성하여 생성될 수 있으며, 합성된 쇄를 어셈블리하여 특이적 에피토프 및 항원성 결정기에 대한 친화성을 갖는 활성 사량체(H2L2) 구조를 형성할 수 있다. 이것은 상이한 종 및 공급원으로부터 항체를 중화하는 것을 특징으로 하는 서열을 갖는 항체의 용이한 생산을 허용하였다.

항체의 공급원, 재조합적으로 어떻게 구축되는지, 또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 어떻게 합성되는지, 유전자이식 동물, 실험실 또는 상업적 크기의 대형 세포 배양물을 사용하거나, 유전자이식 식물을 사용하거나, 과정의 임의의 단계에서 살아있는 유기체를 이용하지 않는 직접 화학적 합성에 상관 없이, 모든 항체는 유사한 전반적인 3-차원 구조를 갖는다. 이 구조는 종종 H2L2로 주어지고 항체가 통상적으로 2 개의 경쇄(L) 아미노산 및 2 개의 중쇄(H) 아미노산을 포함한다는 사실을 지칭한다. 두 쇄는 구조적으로 상보적인 항원성 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 갖는다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 'V" 영역으로 언급되고 항원성 특이성이 상이한 항체로부터 아미노산 서열의 차이를 특징으로 한다. H 또는 L 쇄의 가변 영역은 항원성 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 영역"은 항원과 상호작용하고 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 해당 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원 결합 잔기의 적절한 형태를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다. 항원 결합 영역을 제공하는 H 또는 L 쇄의 가변 영역 내에는 특이성이 상이한 항체 사이의 극단적인 가변성으로 인해 "초가변"으로 불리는 더 작은 서열이 있다. 이러한 초가변 영역은 또한 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로 언급된다. 이러한 CDR 영역은 특정 항원성 결정기 구조에 대한 항체의 기본적 특이성을 설명한다.

CDR은 가변 영역 내의 아미노산의 비인접 스트레치를 나타내지만, 종과 관계 없이, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내의 이러한 중요한 아미노산 서열의 위치상 위치는 가변 쇄의 아미노산 서열 내에 유사한 위치를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체 각각의 가변 중쇄 및 경쇄는 3 개의 CDR 영역을 가지며, 각각은 서로 비인접하다. 모든 포유동물 종에서, 항체 펩티드는 불변(즉, 고도로 보존됨) 및 가변 영역을 함유하고, 후자 내에는, CDR 및 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에 있지만 CDR 외부에 있는 아미노산 서열로 구성된 소위 "프레임워크 영역"이 있다.

본 발명은 상기 기재된 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 유전자 코드는 축퇴되기 때문에, 하나 초과의 코돈이 특정 아미노산을 암호화하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 코드를 사용하여, 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열이 식별될 수 있으며, 각각은 아미노산을 암호화할 수 있을 것이다. 특정 올리고뉴클레오티드가 사실상 실제 암호화 서열을 구성할 확률은 비정상적인 염기 쌍 관계 및 특정 코돈이 항-NGF 항체 또는 부분을 발현하는 진핵 또는 원핵 세포에서 실제로 사용되는(특정 아미노산을 암호화하기 위함) 빈도를 고려하여 추정될 수 있다. 이러한 "코돈 용법 규칙"은 Lathe, 등, 183 J. Molec. Biol. 1-12(1985)에 개시되어 있다. Lathe의 "코돈 용법 규칙"을 사용하여, 단일 뉴클레오티드 서열, 또는 항-NGF 서열을 암호화할 수 있는 이론상 "가장 개연성있는" 뉴클레오티드 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열 세트가 식별될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체 코딩 영역은 또한 본원에 기재된 항체 및 펩티드의 변이체(작용제)를 생성하는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 기존 항체 유전자를 변경시킴으로써 제공될 수 것으로 또한 의도된다. 이러한 변이체는 항-NGF 항체 또는 펩티드의 아미노산 서열에 결실, 부가 및 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 치환의 하나의 부류는 보존적 아미노산 치환이다. 이러한 치환은 항-NGF 항체 펩티드에 주어진 아미노산을 유사한 특징의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 전형적으로 보존적 치환으로 보이는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu, 및 lie 중에서 하나를 또 다른 것으로 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn과 Gin 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환, 방향족 잔기 Phe, Tyr 중에서 대체 등이다. 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵할 가능성을 고려하는 지침은 Bowie 등, 247 Science 1306-10(1990)에서 밝혀졌다.

변이체 항-NGF 항원 결합 단백질 또는 항체 단편은 완전히 기능할 수 있거나 하나 이상의 활성에서 기능이 부족할 수 있다. 완전히 기능적 변이체는 전형적으로 보존적 변이 또는 중요하지 않은 잔기 또는 중요하지 않은 영역에서 변이만을 함유한다. 기능적 변이체는 또한 기능의 변화가 없거나 미미한 변화를 초래하는 유사한 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 대안적으로, 이러한 치환은 기능에 어느 정도 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 비기능적 변이체는 전형적으로 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역전, 또는 절두 또는 중요한 잔기 또는 중요한 영역에 치환, 삽입, 역전, 또는 결실을 함유한다.

기능에 필수적인 아미노산은 부위 지정 돌연변이생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이생성과 같이 당업계에 알려진 방법에 의해 식별될 수 있다. Cunningham 등, 244 Science 1081-85(1989). 후자의 절차는 분자의 각 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그런 다음 생성된 돌연변이체 분자는 에피토프 결합 또는 시험관내 ADCC 활성과 같은 생물학적 활성에 대해 테스트된다. 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 또한 결정학, 핵 자기 공명, 또는 광친화성 표지화와 같은 구조적 분석에 의해 결정될 수 있다. Smith 등, 224 J. Mol. BioI. 899-904(1992); de Vos 등, 255 Science 306-12(1992).

더욱이, 폴리펩티드는 종종 20 개의 "자연 발생" 아미노산 이외의 아미노산을 함유한다. 또한, 말단 아미노산을 포함하는 많은 아미노산은 처리 및 다른 번역후 변형과 같은 자연적 과정에 의해, 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 알려진 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴(heme) 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디술파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스틴 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마 카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가, 및 유비퀴틴화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 변형은 당업자에게 잘 알려져 있고 과학적 문헌에 매우 상세하게 기재되었다. 특히 여러 통상적인 변형, 예를 들면, 글리코실화, 지질 부착, 황화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 하이드록실화 및 ADP 리보실화가 Proteins-Structure and Molecular Properties(2nd ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman & Co., NY, 1993)와 같은 가장 기본적인 텍스트에 기재되어 있다. Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12(Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter 등 182 Meth. Enzymol. 626-46(1990); 및 Rattan 등 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62(1992)과 같이, 이 주제에 대한 많은 상세한 리뷰가 이용가능하다.

따라서, 본 발명의 항체 및 펩티드는 또한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 암호화된 것이 아닌 유도체 또는 유사체를 포함한다. 유사하게, 아미노산 서열에서 부가 및 치환 뿐만 아니라 방금 기재된 변경, 및 변형은 NGF 항원 및/또는 이의 에피토프 또는 펩티드의 아미노산 서열에 동일하게 적용가능할 수 있고, 따라서 본 발명에 의해 포함된다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 모노클로날 항체를 암호화하는 유전자는 NGF의 인식에서 특이적으로 효과적이다.

항체 유도체

항체 유도체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 항체의 "유도체"는 일반적으로 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유한다. 단백질의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자에 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 이작용성 제제로의 유도체화는 항체 또는 단편을 수불용성 지지체 매트릭스 또는 다른 거대분자 담체에 가교하는 데 유용하다.

유도체는 또한 표지된 방사성으로 표지된 모노클로날 항체를 포함한다. 예를 들어, 방사성 요오드(251,1311), 탄소(4C), 황(35S), 인듐, 삼중수소(H³) 등; 모노클로날 항체와 비오틴 또는 아비딘, 효소, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코아밀라제, 카르복실산 무수화제, 아세틸콜린 에스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 또는 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제의 접합체; 및 또한 모노클로날 항체와 생물발광제(예컨대 루시퍼라제), 화학발광제(예컨대 아크리딘 에스테르) 또는 형광제(예컨대 피코빌리단백질)의 접합체 사용.

본 발명의 또 다른 유도체 이작용성 항체는 2 개의 상이한 항원성 기를 인식하는 2 개의 별개의 항체의 부분을 조합함으로써 생성된 이중특이적 항체이다. 이것은 가교 또는 재조합 기술에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 모이어티는 생체내 반감기를 증가시키기 위해(예를 들어, 혈류로부터 제거되는 시간을 연장함으로써 항체 또는 이의 일부에 첨가될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어, PEG 모이어티를 첨가하는 것(페길화라고도 함)을 포함하고, 당업계에 잘 알려져 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 20030031671을 참조한다.

항체의 재조합 발현

일부 구현예에서, 대상 모노클로날 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에 직접 도입되고, 세포는 암호화된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건 하에 인큐베이션된다. 대상 핵산이 세포에 도입된 후, 세포는 항체의 발현을 허용하기 위해 일반적으로 37℃에서, 때때로 선택 하에, 약 1-24 시간의 기간 동안 전형적으로 인큐베이션된다. 일 구현예에서, 항체는 세포가 성장하고 있는 배지의 상청액으로 분비된다. 전통적으로, 모노클로날 항체는 뮤린 하이브리도마 계통에서 천연 분자로서 생산되었다. 그 기술 이외에, 본 발명은 모노클로날 항체의 재조합 DNA 발현을 제공한다. 이것은 개화된 항체뿐만 아니라 선택 숙주 종에서 다양한 항체 유도체 및 융합 단백질의 생산을 허용한다.

본 발명의 적어도 하나의 항-NGF 항체, 부분 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 결찰을 위한 뭉툭한 단부 또는 엇갈린 단부 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절한 경우 점착성 단부 채우기, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 및 적절한 리가제로의 결찰을 포함하는 통상적인 기술에 따라 벡턴 DNA로 재조합될 수 있다. 이러한 조작을 위한 기술은 예를 들어 Maniatis 등, MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL,(Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 및 1989)에 의해 개시되어 있고, 상기 Ausubel 등 1993은 모노클로날 항체 분자 또는 이의 항원 결합 영역을 암호화하는 핵산 서열을 구축하는 데 사용될 수 있다.

DNA와 같은 핵산 분자는 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 이러한 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"된 경우 폴리펩티드를 "발현할 수 있다"고 한다. 작동가능한 결합은 조절 DNA 서열 및 발현하고자 하는 DNA 서열이 회수가능한 양으로 항-NGF 펩티드 또는 항체 부분으로서 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 결합이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 속성은 유사한 분야에서 잘 알려진 바와 같이 유기체마다 달라질 수 있다. 예를 들어 상기 Sambrook 등, 2001; 상기 Ausubel 등, 1993을 참조한다.

따라서 본 발명은 원핵 또는 진핵 세포에서 항-NGF 항체 또는 펩티드의 발현을 포함한다. 적합한 숙주는 생체내, 또는 동일 반응계에서 박테리아, 효모, 곤충, 진균, 조류 및 포유동물 세포를 포함한 박테리아 또는 진핵 숙주, 또는 포유동물, 곤충, 조류 또는 효모 기원의 숙주 세포를 포함한다. 포유동물 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이 기원일 수 있지만, 임의의 다른 포유동물 세포가 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 수용자 숙주에서 자가 복제할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 혼입될 것이다. 임의의 광범위하게 다양한 벡터가 이 목적을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 Ausubel 등, 1993을 참조한다. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는 데 중요한 요인은 다음을 포함한다: 벡터를 함유하는 수용자 세포가 벡터를 함유하지 않은 수용자 세포로부터 인식되고 선택될 수 있는 용이성; 특정 숙주에서 바람직한 벡터의 카피 수; 및 상이한 종의 숙주 세포 사이에서 벡터를 "왕복"할 수 있는 것이 바람직한지 여부.

당업계에 알려진 원핵 벡터의 예는 이. 콜라이(E. coli)(예를 들어, pBR322, CoIE1, pSC101, pACYC 184 등과 같으나 이에 제한되지 않음)에서 복제할 수 있는 것과 같은 플라스미드를 포함한다. 이러한 플라스미드는 예를 들어, 상기 Maniatis 등, 1989; 상기 Ausubel 등, 1993에 개시되어 있다. 바실러스(Bacillus) 플라스미드는 pC194, pC221, pT127 등을 포함한다. 이러한 플라스미드는 Gryczan에 의해, THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329(Academic Press, NY, 1982)에 개시되어 있다. 적합한 스트렙토마이세스(Streptomyces) 플라스미드는 plJ101(Kendall 등, 169 J. Bacteriol. 4177-83(1987), 및 phLC31과 같은 스트렙토마이세스 박테리오파지(Chater 등, SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54(Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986)를 포함한다. 슈도모나스(Pseudomonas) 플라스미드는 John 등, 8 Rev. Infect. Dis. 693-704(1986); lzaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42(1978); 및 상기 Ausubel 등, 1993에서 검토된다.

대안적으로, 항-NGF 항체 또는 펩티드를 암호화하는 cDNA의 발현에 유용한 유전자 발현 요소는 (a) 예를 들어 SV40 초기 프로모터(Okayama 등, 3 Mol. Cell. BioI. 280(1983), 라우스 육종 바이러스 LTR(Gorman 등, 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777(1982), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl 등, 41 Cell 885(1985)과 같으나 이에 제한되지 않는 바이러스 전사 프로모터 및 그들의 인핸서 요소; (b) SV40 후기 영역에서 유래된 것들과 같은 스플라이스 영역 및 폴리아데닐화 부위(Okayarea 등, 1983), 및 (c) SV40에서와 같은 폴리아데닐화 부위(Okayama 등, 1983)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

면역글로불린 cDNA 유전자는 발현 요소로서 SV40 초기 프로모터 및 그의 인핸서, 마우스 면역글로불린 H 쇄 프로모터 인핸서, SV40 후기 영역 mRNA 스플라이싱, 토끼 S-글로빈 개재 서열, 면역글로불린 및 토끼 S-글로빈 폴리아데닐화 부위, 및 SV40 폴리아데닐화 요소를 사용하여, Weidle 등, 51 Gene 21(1987)에 의해 기재된 바와 같이 발현될 수 있다. 부분 cDNA, 부분 게놈 DNA(Whittle 등, 1 Protein Engin. 499(1987≫로 구성된 면역글로불린 유전자의 경우, 전사 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스일 수 있고, 프로모터 인핸서는 사이토메갈로바이러스 및 마우스/인간 면역글로불린일 수 있고, mRNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화 영역은 천연 염색체 면역글로불린 서열일 수 있다.

일 구현예에서, 설치류 세포에서 cDNA 유전자의 발현을 위해, 전사 프로모터는 바이러스 LTR 서열이고, 전사 프로모터 인핸서는 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서 및 바이러스 LTR 인핸서 중 어느 하나 또는 둘 다이고, 스플라이스 영역은 31 bp보다 큰 인트론을 함유하고, 폴리아데닐화 및 전사 종결 영역은 합성되는 면역글로불린 쇄에 상응하는 천연 염색체 서열에서 유래된다. 다른 구현예에서, 다른 단백질을 암호화하는 cDNA 서열은 상기 언급된 발현 요소와 조합되어 포유동물 세포에서 단백질의 발현을 달성한다.

각 융합된 유전자는 발현 벡터에서 어셈블리되거나, 이에 삽입될 수 있다. 그런 다음 키메라 면역글로불린 쇄 유전자 산물을 발현할 수 있는 수용자 세포는 항-NGF 펩티드 또는 키메라 H 또는 키메라 L 쇄-암호화 유전자로 단독으로 형질감염되거나, 키메라 H 및 키메라 L 쇄 유전자로 공동 형질감염된다. 형질감염된 수용자 세포는 혼입된 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 배양되고 발현된 면역글로불린 쇄 또는 온전한 항체 또는 단편이 배양물로부터 회수된다.

일 구현예에서, 항-NGF 펩티드 또는 키메라 H 및 L 쇄, 또는 이의 부분을 암호화하는 융합된 유전자는 별도의 발현 벡터로 어셈블리된 다음 수용자 세포를 공동 형질감염시키는 데 사용된다. 대안적으로, 키메라 H 및 L 쇄를 암호화하는 융합된 유전자는 동일한 발현 벡터 상에 어셈블리될 수 있다. 발현 벡터의 형질감염 및 키메라 항체의 생산을 위해, 수용자 세포주는 골수종 세포일 수 있다. 골수종 세포는 형질감염된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 면역글로불린을 합성, 어셈블리 및 분비할 수 있고 면역글로불린의 글리코실화를 위한 메커니즘을 보유한다. 골수종 세포는 마우스의 복막강 또는 배양물에서 성장될 수 있으며, 여기서 분비된 면역글로불린은 복수로부터 수득될 수 있다. 다른 적합한 수용자 세포는 인간 또는 비인간 기원의 B 림프구, 인간 또는 비인간 기원의 하이브리도마 세포, 또는 종간 헤테로하이브리도마 세포와 같은 림프구 세포를 포함한다.

본 발명의 키메라, 개화된 항체 작제물 또는 항-NGF 폴리펩티드를 운반하는 발현 벡터는 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트-침전, 및 디에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란과 같은 다가양이온으로의 적용과 같은 이러한 생화학적 수단, 및 전기천공법, 직접 미세주사, 및 미세발사체 충격과 같은 이러한 기계적 수단을 포함하는 임의의 다양한 적합한 수단에 의해 적절한 숙주 세포로 도입될 수 있다. Johnston 등, 240 Science 1538(1988).

효모는 면역글로불린 H 및 L 쇄의 생산을 위해 박테리아보다 상당한 이점을 제공할 수 있다. 효모는 글리코실화를 포함하는 번역후 펩티드 변형을 수행한다. 효모에서 원하는 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있는 강력한 프로모터 서열 및 높은 카피 수 플라스미드를 활용하는 다수의 재조합 DNA 전략이 현재 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물 유전자 산물의 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 보유하는 펩티드(즉, 프리-펩티드)를 분비한다. Hitzman 등, 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. BioI.(프랑스 몽펠리에, 1982).

효모 유전자 발현 시스템은 항-NGF 펩티드, 항체 및 어셈블리된 뮤린 및 키메라, 헤테로키메라, 개화된, 항체, 단편 및 이의 영역의 생산, 분비 및 안정성 수준에 대해 일상적으로 평가될 수 있다. 효모가 글루코스가 풍부한 배지에서 성장될 때 다량으로 생산되는 해당 효소를 코딩하는 능동적으로 발현되는 유전자로부터의 프로모터 및 종결 요소를 혼입하는 임의의 일련의 효모 유전자 발현 시스템이 활용될 수 있다. 알려진 해당 유전자는 또한 매우 효율적인 전사 제어 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자의 프로모터 및 종결인자 신호가 활용될 수 있다. 효모에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA의 발현을 위한 최적의 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다수의 접근법을 취할 수 있다. Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985)을 참조한다.

박테리아 균주는 또한 본 발명에 의해 기재된 항체 분자 또는 펩티드의 생산을 위한 숙주로서 활용될 수 있다. 숙주 세포와 호환성인 종에서 유래된 레플리콘(replicon)을 함유하는 플라스미드 벡터 및 제어 서열이 이들 박테리아 숙주와 관련하여 사용될 수 있다. 벡터는 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 특이적 유전자를 가지고 있다. 박테리아에서 클로닝된 면역글로불린 cDNA에 의해 암호화된 뮤린, 키메라, 헤테로키메라, 개화된 항체, 단편 및 영역 또는 항체 쇄의 생산을 위한 발현 플라스미드를 평가하기 위해 다수의 접근법을 취할 수 있다(상기 Glover, 1985; 상기 Ausubel, 1993; 상기 Sambrook, 2001; Colligan 등, eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY(1994-2001); Colligan 등, eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY(1997-2001) 참조.

숙주 포유동물 세포는 시험관내 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 포유동물 세포는 리더 펩티드 제거, H 및 L 쇄의 접힘 및 어셈블리, 항체 분자의 글리코실화, 및 기능적 항체 단백질의 분비를 포함한 면역글로불린 단백질 분자에 대한 번역후 변형을 제공한다. 상기 기재된 림프 기원의 세포 외에도, 항체 단백질의 생산을 위한 숙주로서 유용할 수 있는 포유동물 세포는 Vero(ATCC CRL 81) 또는 CHO-K1(ATCC CRL 61) 세포와 같은 섬유아세포 기원의 세포를 포함한다. 많은 벡터 시스템이 포유동물 세포에서 클로닝된 항-NGF 펩티드 H 및 L 쇄 유전자의 발현에 이용가능하다(상기 Glover, 1985 참조). 완전한 H2L2 항체를 수득하기 위해 상이한 접근법을 따를 수 있다. 완전한 사량체 H2L2 항체 및/또는 항-NGF 펩티드에 H 및 L의 세포내 회합 및 결합을 달성하기 위해 동일한 세포에서 H 및 L 쇄를 공동 발현하는 것이 가능하다. 공동 발현은 동일한 숙주에서 동일하거나 상이한 플라스미드를 사용함으로써 발생할 수 있다. H 및 L 쇄 및/또는 항-NGF 펩티드 둘 다에 대한 유전자는 동일한 플라스미드에 배치된 다음, 세포에 형질감염시켜, 두 쇄를 발현하는 세포를 직접 선택할 수 있다. 대안적으로, 세포를 먼저 하나의 쇄, 예를 들어 L 쇄를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 다음, 생성된 세포주를 두번째 선택가능한 마커를 함유하는 H 쇄로 형질감염시킬 수 있다. 어느 한 경로를 통해 항-NGF 펩티드 및/또는 H2L2 분자를 생산하는 세포주는 추가로 선택가능한 마커와 함께 펩티드, H, L, 또는 H + L 쇄의 추가의 카피를 암호화하는 플라스미드로 형질감염되어 어셈블리된 H2L2 항체 분자의 더 높은 생산 또는 형질감염된 세포주의 향상된 안정을 갖는 세포주를 생성할 수 있다.

재조합 항체의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다, 숙주 세포는 면역글로불린 발현 카세트 및 선택가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 풍부화된 배지에서 1-2 일 동안 성장시킨 다음, 선택 배지로 전환할 수 있다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정하게 통합하고 성장하게 하여 결국 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 초점을 형성한다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물/구성요소의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.

일단 본 발명의 항체가 생산되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특이적 항원에 대한 친화성, 및 크기화 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 많은 구현예에서, 항체는 세포에서 배양 배지로 분비되고 배양 배지로부터 수확된다.

약제학적 및 수의학적 적용

본 발명의 본원에 기재된 바와 같은 항-NGF 항원 결합 단백질 또는 항체 단편은 예를 들어 개 및 고양이에서 NGF 관련 장애의 치료에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및, 활성 성분으로서, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 항체는 상이한 종을 수용하기 위해 키메라, 헤테로키메라, 개화, 고양이화, 말화, 인간화 또는 종분화될 수 있다. 온전한 면역글로불린 또는 이들의 결합 단편, 예컨대 Fab가 또한 구상된다. 본 발명의 항체 및 이의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다.

본 발명의 항-NGF 항체 및/또는 펩티드는 개별 치료제로서 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 선택된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행에 기초하여 선택된 약제학적 담체와 함께 투여된다. 본원에 개시된 항체의 투여는 비경구 주사(예컨대 복강내, 피하, 또는 근육내 주사)를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해, 경구로, 또는 기도 표면에 항체(전형적으로 약제학적 제형으로 운반됨)의 국소 투여에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면에 국소 투여는 비강내 투여(예를 들어, 점적기, 면봉, 또는 흡입기 사용)에 의해 수행될 수 있다. 기도 표면에 항체의 국소 투여는 또한 흡입 투여에 의해, 예컨대 에어로졸 현탁액으로서 항체를 함유하는 약제학적 제형의 호흡가능한 입자(고체 및 액체 입자 둘 다 포함)를 생성한 다음, 대상체가 호흡가능한 입자를 흡입하게 함으로써 수행될 수 있다. 약제학적 제형의 호흡가능한 입자를 투여하기 위한 방법 및 장치는 잘 알려져 있고, 임의의 통상적인 기술이 이용될 수 있다.

일부 바람직한 구현예에서, 항체는 비경구 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여를 위해, 항-NGF 항체 또는 펩티드는 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로서 제형화될 수 있다. 예를 들어 비히클은 수성 담체와 같은 허용되는 담체에 용해된 항체의 용액 또는 이의 칵테일일 수 있으며 이러한 비히클은 물, 염수 링거 용액, 덱스트로스 용액, 트레할로스 또는 수크로스 용액, 또는 5% 혈청 알부민, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이다. 리포솜 및 고정 오일과 같은 비수성 비히클이 또한 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균되고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들 조성물은 통상적인 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같이 적절한 생리학적 조건에 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형에서 항체의 농도는 광범위하게, 예를 들어 중량 기준 약 0.5% 미만, 일반적으로 적어도 약 1% 내지 많게는 15% 또는 20%로 달라질 수 있고 선택되는 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 기반하여 주로 선택될 것이다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충제 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 통상적으로 사용되는 기술에 의해 멸균된다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 알려져 있거나 명백할 것이며, 예를 들어, REMINGTON'S PHARMA. SCI.(15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 항체는 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역 글로불린에 효과적인 것으로 나타났다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실을 야기할 수 있고 사용 수준은 보상하기 위해 조정될 수 있어야 함이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 재발 방지 및/또는 기존 질환에 대한 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 이 기술 분야의 표준 참고 텍스트인 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES의 가장 최신판에 기재되어 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 질환 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지 또는 완화시키기에 충분한 양으로 이미 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효 용량" 또는 "치료적 유효량"으로 정의된다. 이 용도에 효과적인 양은 질환의 중등도 및 대상체의 자체 면역계의 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 개과-유사 항체 및 본 발명의 항체에 의해 달성되는 외부 물질의 최소화 및 "외래 물질" 거부의 낮은 가능성을 고려하여, 이들 항체를 실질적인 과량으로 투여하는 것이 가능할 수 있다.

투여되는 투여량은 물론 특정 제제의 약력학적 특징, 및 이의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강, 및 체중; 동시 치료에 대한 증상 종류의 속성 및 정도, 치료 빈도, 및 원하는 효과와 같은 알려진 요인에 따라 달라질 것이다.

비제한적인 예로서, 개 및 고양이에서 NGF-관련 병리의 치료는 필요에 따라 투여량 범위에서 본 발명의 항-NGF 항체의 격주 또는 월간 투여량으로 제공될 수 있다. 개과 치료 용도를 위한 항체의 예는 본 발명에 따라 강력한 생체내 항-NGF 활성을 갖는 고친화성(이들은 또한 결합력이 높을 수 있음) 항체, 및 이의 단편, 영역 및 유도체이다. 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 임의의 경우, 약제학적 제형은 대상체를 효과적으로 치료하기에 충분한 본 발명의 항체(들)의 양을 제공하여야 한다.

진단 적용

본 발명은 또한 NGF 관련 장애가 있는 것으로 알려져 있거나 의심되는 종, 특히 개과 및 고양이과에서 NGF를 검출하기 위한 진단 방법에서 사용하기 위한 상기 항-NGF 항체 및 펩티드를 제공한다. 본 발명의 구현예에서 NGF 관련 장애는 통증이다. 또 다른 구현예에서, NGF 관련 장애는 골관절염이다. 본 발명의 항-NGF 항체 및/또는 펩티드는 샘플에서 NGF, 또는 항-NGF 항체를 검출하거나 정량화하는 면역검정에 유용하다. NGF에 대한 면역검정은 전형적으로 NGF에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출가능하게 표지된 고친화성(또는 높은 결합력) 항-NGF 항체 또는 폴리펩티드의 존재 하에 임상적 또는 생물학적 샘플을 인큐베이션하고, 샘플 내 결합되어 있는 표지된 펩티드 또는 항체를 검출하는 것을 포함한다. 다양한 임상 검정 절차가 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S(Voller 등, eds., Univ. Park, 1981)을 참조한다. 이러한 샘플은 조직 생검, 혈액, 혈청, 및 배설물 샘플, 또는 동물 대상체로부터 수집되고 하기 기재된 바와 같이 ELISA 분석을 거친 액체를 포함한다. 따라서, 항-NGF 항체 또는 폴리펩티드는 니트로셀룰로스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정화할 수 있는 또 다른 고체 지지체에 고정될 수 있다. 그런 다음 지지체를 적합한 완충액으로 세척한 후 검출가능하게 표지된 NGF 특이적 펩티드, 항체 또는 항원 결합 단백질로 처리할 수 있다. 그런 다음 고체 상 지지체를 완충액으로 재차 세척하여 결합된 펩티드 또는 항체를 제거할 수 있다. 그런 다음 고체 지지체 상에 결합된 표지의 양은 알려진 방법 단계에 의해 검출될 수 있다.

"고체 상 지지체" 또는 "담체"는 펩티드, 항원, 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 지칭한다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 속성은 본 발명의 목적을 위해 어느 정도 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 NGF 또는 항-NGF 항체에 결합할 수 있는 한 사실상 임의의 가능한 구조적 구성을 가질 수 있다. 따라서, 지지체 배열은 비드에서와 같이 구형, 또는 테스트 튜브의 내부 표면, 또는 막대의 외부 표면에서와 같이 원통형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 시트, 배양 접시, 테스트 스트립 등과 같이 평평할 수 있다. 예를 들어, 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함할 수 있다. 당업자는 항체, 펩티드 또는 항원에 결합하기 위한 많은 다른 적합한 담체를 알고 있거나, 일상적인 실험에 의해 동일한 것을 확인할 수 있다. 잘 알려진 방법 단계는 주어진 로트의 항-NGF 펩티드 및/또는 항체 또는 항원 결합 단백질의 결합 활성을 결정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험에 의해 작동 및 최적 검정 조건을 결정할 수 있다.

NGF-특이적 펩티드 및/또는 항체를 검출가능하게 표지화하는 것은 효소 면역검정(EIA), 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에서 사용하기 위한 효소에 연결함으로써 달성될 수 있다. 연결된 효소는 노출된 기질과 반응하여 예를 들어, 분광 광도, 형광 광도 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 본 발명의 NGF-특이적 항체를 검출가능하게 표지하는 데 사용될 수 있는 효소는 말레이트 데하이드로게나제, 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타5-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 데하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린스테라제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. NGF-특이적 항체를 방사성으로 표지함으로써, 방사선면역검정(RIA)을 사용하여 NGF를 검출하는 것이 가능하다. Work 등, LAB. TECHNIQUES & BIOCHEM. IN MOLEC. BIO(No. Holland Pub. Co., NY, 1978) 참조. 방사성 동위원소는 감마 계수기 또는 신틸레이션 계수기의 사용과 같이 이러한 수단에 의해 또는 자동방사선촬영에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 ³H, ¹²⁵I,¹³¹I, ³⁵S, 및 ¹⁴C를 포함한다.

또한 NGF-특이적 항체를 형광 화합물로 표지하는 것이 가능하다. 형광 표지된 항체가 적절한 파장 길이의 빛에 노출되면, 그의 존재는 형광으로 인해 검출될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 형광 표지화 화합물 중에는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민이 있다. NGF-특이적 항체 또는 항원 결합 단백질은 또한 ¹²⁵Eu와 같은 형광-방출 금속, 또는 란탄나이드 계열의 다른 것을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 이러한 금속 킬레이트화 기를 사용하여 NGF 특이적 항체에 부착될 수 있다.

NGF-특이적 항체는 또한 화학발광 화합물에 커플링함으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 그런 다음 화학발광으로 표지된 항체의 존재는 화학 반응 과정 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 유용한 화학발광 표지화 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 써로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.

마찬가지로, 생물발광 화합물을 사용하여 본 발명의 NGF-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩티드, 또는 유도체를 표지할 수 있다. 생물발광은 촉매적 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광의 한 유형이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 표지화 목적을 위한 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라제 및 에쿠오린이다.

NGF-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩티드, 또는 유도체의 검출은 예를 들어, 검출가능한 표지가 방사성 감마 방출체인 경우 신틸레이션 계수기에 의해, 또는 예를 들어, 표지가 형광 물질인 경우 형광측정기에 의해 달성될 수 있다. 효소 표지의 경우, 검출은 효소에 대한 기질을 이용하는 비색 방법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과 비교하여 기질의 효소적 반응 정도를 육안으로 비교하여 달성될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 상기 검정에 의해 검출되는 NGF는 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. NGF를 함유하는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 소변, 대변, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출물 또는 균질액 등과 같은 생물학적 유체이다. 본 발명은 이들 샘플만을 사용하는 검정으로 제한되지 않지만, 당업자가 본 명세서에 비추어 다른 샘플의 사용을 허용하는 적합한 조건을 결정하는 것이 가능하다.

동일 반응계 검출은 동물 대상체에서 조직학적 표본을 제거하고, 이러한 표본에 본 발명의 표지된 항체의 조합을 제공함으로써 달성될 수 있다. 항체(또는 이의 부분)는 생물학적 샘플에 표지된 항체(또는 부분)를 적용하거나 중첩시킴으로써 제공될 수 있다. 이러한 절차를 사용하는 것을 통해, NGF의 존재뿐만 아니라 검사된 조직에서 NGF의 분포를 결정하는 것이 가능하다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 임의의 광범위하게 다양한 조직학적 방법(예컨대 염색 절차)이 이러한 동일 반응계 검출을 달성하기 위해 변형될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.

본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는 "2-부위" 또는 "샌드위치" 검정으로도 알려져 있는 면역측정 검정에서 활용하기 위해 채택될 수 있다. 전형적인 면역측정 검정에서, 표지되지 않은 항체(또는 항체의 단편)의 양은 테스트 중인 유체에서 불용성인 고체 지지체에 결합되고 검출가능하게 표지된 가용성 항체의 양은 고체 상 항체, 항원, 및 표지된 항체 사이에 형성된 3원 복합체의 검출 및/또는 정량화를 허용하기 위해 첨가된다.

항체는 샘플에서 NGF를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하거나 NGF를 발현하는 세포의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 형광 현미경, 유세포 측정, 또는 형광측정 검출과 커플링된 형광으로 표지된 항체(하기 참조)를 이용하는 면역형광 기술에 의해 달성될 수 있다. 진단 목적을 위해, 항체는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 개과 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 같은 항체와 반응성인 다른 표지된 항체(제2 항체)와 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체는 직접 표지될 수 있다. 방사성핵종, 플루오르, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(특히 합텐) 등과 같은 광범위하게 다양한 표지가 이용될 수 있다. 이전에 논의된 것과 같은 수많은 유형의 면역검정이 이용가능하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 중요하게는, 본 발명의 항체는 개과에서 NGF 관련 장애를 진단하는 데 도움이 될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체는 반려 동물에서 NGF의 과발현을 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 중요한 면역조직화학 도구를 제공할 수 있다. 본 발명의 항체는 유전자 발현 프로필을 측정하는 데 매우 적합한 항체 어레이에 사용될 수 있다.

키트

또한 대상 방법을 실시하기 위한 키트가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 키트는 본 발명의 하나 이상의 항체, 이를 암호화하는 핵산, 또는 이를 함유하는 세포를 적어도 포함한다. 본 발명의 항체는 일반적으로 동결건조된 형태로 용기에 제공될 수 있다. 표지 또는 독소에 접합되거나, 접합되지 않을 수 있는 항체는 전형적으로 Tris, 포스페이트, 카보네이트 등과 같은 완충제, 안정화제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 등과 함께 키트에 포함된다. 일반적으로, 이들 물질은 활성 항체의 양을 기준으로 5% wt 미만으로 존재하고, 일반적으로 다시 항체 농도를 기준으로 적어도 약 0.001% wt의 총량으로 존재할 것이다. 빈번하게, 활성 성분을 희석하기 위해 불활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직할 것이며, 여기서 부형제는 총 조성물의 약 1% 내지 99% wt로 존재할 수 있다. 1차 항체에 결합할 수 있는 2차 항체가 검정에서 이용되는 경우, 이것은 일반적으로 별도의 바이알에 존재할 것이다. 2차 항체는 전형적으로 표지에 접합되고 상기 기재된 항체 제형과 유사한 방식으로 제형화된다. 키트는 일반적으로 또한 사용 지침 세트를 포함할 것이다.

본 발명은 이제 하기 비제한적인 예에 의해 추가로 기재될 것이다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되고 뒷받침된다. 그러나, 이들 실시예는 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 추가로 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 반대로, 당업자는 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구범위의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 다른 구현예, 변형, 및 등가물이 있음을 용이하게 이해할 것이다.

실시예 1

개과 NGF(cNGF)의 합성 및 정제

개과 프리-프로- β-NGF(서열번호:2)를 증폭하기 위해 적절한 제한 부위가 있는 PCR 프라이머를 설계하였다. β-NGF 유전자를 EcoRV/KpnI 부위를 통해 플라스미드 pCTV927(Chromos 표적화 플라스미드)에 클로닝하였다.　pCTV927/β-NGF 플라스미드를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 형질감염 시약을 사용하여 Chromos 시스템 인터그라제 pSIO343을 암호화하는 플라스미드와 함께 CHOK1SV 세포에 공동 형질감염시켰다.　개별 안정한 클론을 발현에 대해 분석하고 높은 발현 클론은 후속 정제를 위한 확장 및 발현을 위해 선택하였다. 이들 형질감염으로부터 생산된 개과 β-NGF(cNGF)를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 초기 정화(cleanup)를 통과 배치(flow-through batch) 모드로 Q 세파로스 FF(GE Healthcare #17-0510-01)에서 수행하였다.　정화된 상청액을 물과 1:1로 희석하고 1 M Tris를 사용하여 pH를 8.5로 조정하였다. 희석된 샘플을 Q 세파로스 FF와 150:1의 비율로 >1.5 시간 동안 혼합하였다.　그런 다음 수지를 침강시키고 결합되지 않은 부분을 수집하였다. cNGF를 양이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하였으며; 이를 다시 물과 1:1로 희석하고 20 mM Tris, pH 8.5로 사전 평형화된 SP-세파로스 FF(GE Healthcare #17-0729-01)에 로딩하였다.　로딩 후, 컬럼을 세척한 다음 20 컬럼 부피에 걸쳐 0 내지 210 mM NaCl(각각 20 mM Tris, pH 8.5)의 선형 구배를 통해 용출시켰다. 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 풀링하고, 4℃에서 PBS에 대해 투석하였다(3.5K mw).　투석액을 수집하고, 멸균 여과하고, 280 nm에서 흡광도를 통해 농도를 측정하였다(1 mg/mL = 1.48 A₂₈₀).

실시예 2

신경 성장 인자(NGF)를 인식하는 마우스 모노클로날 항체의 식별

당업자에게 잘 알려진 절차에 따라 CHO 세포에서 생산된 재조합 cNGF로 암컷 CF-1 마우스의 표준 면역화를 사용하여 마우스 모노클로날 항체를 식별하였다. 면역화된 마우스로부터의 역가를 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 결정하였다. cNGF(100 ng/웰)를 폴리스티렌 마이크로플레이트에 고정화하고 포획 항원으로서 사용하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청을 0.05% tween-20(PBST)을 함유하는 포스페이트 완충 염수에 희석하고 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 결합된 마우스 항-cNGF 항체의 존재를 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-마우스 2차 항체(Kirkegard & Perry Laboratories, Inc.(KPL, Inc.), 메릴랜드주 게이더스버그)로 검출하였다. 발색 기질(ABTS 2- Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, Inc., 메릴랜드주 게이더스버그)을 첨가하고 실온(RT)에서 10 분 인큐베이션 후, 각 웰의 흡광도를 450 nm 및 490nm의 광학 밀도(OD)에서 결정하였다. cNGF로 면역화된 단일 마우스("3-5")의 항체 반응은 도 6에 제시되어 있다. 이 마우스로부터의 공여자 비장세포의 풀을 융합에 사용하였다.

직접 ELISA를 통해 항-cNGF 결합에 대한 융합 및 스크리닝 후, 경쟁 ELISA를 사용하여 개과 TrkA 수용체의 가용성 형태에 cNGF 결합을 억제하는지 여부를 결정하기 위해 87 개의 웰을 선택하였다. cTrkA-Fc(1 μg/ml) 100 μl를 ELISA 플레이트의 carb/bicarb 완충액에 밤새 플레이팅하였다. 그런 다음 검정 플레이트를 PBS 중 1% BSA 200 μl로 차단하고 4C에서 인큐베이션하였다. 하이브리도마 상청액을 순수 상태, 및 PBS에 1:10 및 1:50 희석으로 테스트하였다. 상청액 희석액 75 ul를 비오티닐화 NGF 75 ul(0.2 μg/ml)에 첨가하여 0.1 ug/ml의 최종 농도를 달성하고 폴리프로필렌 플레이트에서 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 1 시간 인큐베이션 후 플레이트를 4C로 옮기고 추가 15 분 동안 인큐베이션하였다.　그런 다음 차단된 검정 플레이트를 차가운 PBST로 세척하고 각 상청액:NGF 혼합물 100 ul를 TrkA 검정 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이 검정 플레이트를 4C에서 1 시간 동안 인큐베이션하고,　 차가운 PBST로 세척한 다음 최종 인큐베이션을 위해 스트렙타비딘 HRP를 RT에서 1 시간 동안 첨가하였다. ABTS 기질을 첨가한 후 플레이트를 PBS 대조군 웰에 대해 OD = 1.0으로 전개하였다. 최대 cNGF:ctrkA 결합을 나타내는 양성 대조군의 OD 신호와 비교하여 cNGF에 결합하고 cTRKa 수용체에 결합하는 능력을 억제할 수 있는 항체를 함유하는 상청액을 식별하였다. 이 경쟁 ELISA의 데이터는 (도 7)에 기재되어 있다. 이들 검정의 선택된 히트를 정제하고, ELISA로 확인하고, 제한 희석으로 서브클로닝하여 순수한 항-cNGF 항체를 생성하였다(도 8).

실시예 3

하이브리도마로부터 유래된 항-cNGF 항체의 효능

인간 티로신 키나제 A 수용체(TrkA)를 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에서 세포외 신호-조절 키나제 1 및 2(pERK 1/2) 신호전달의 cNGF 유도 인산화의 각 항체에 의한 퍼센트 억제를 결정함으로써 효능을 평가하였다. 항체를 HBSS에 희석하고 HBSS/0.1% BSA 중 60 ng/ml cNGF와 함께 실온에서 1 시간 동안 미리 인큐베이션하였다. 1 시간 공동 인큐베이션 후, mAb/cNGF 혼합물 50 uL를 50 uL HBSS에서 이전에 혈청 고갈된 인간 TrkA 세포에 첨가하고 37C에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 상청액을 제거하고, 세포를 용해하고, Surefire AlphaScreen 키트(Perkin Elmer)를 통해 pERK 신호를 평가하였다. 개과 NGF의 최종 농도는 15 ng/ml(EC80)였다. 검정에서 최대 반응은 cNGF 단독의 존재(mAb 없음) 하에 측정된 ERK 1/2 인간화로 정의된다. 최소 반응은 ERK 1/2 인산화의 기저 수준(자극 없음)으로 정의된다. 항-NGF 항체에 대해 계산된 IC₅₀ 값 및 최대 억제 반응의 백분율은 하기 표 1에 기재되어 있다.

표 1

실시예 4

마우스 항-cNGF 항체를 암호화하는 DAN 서열

리보핵산(RNA)을 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 RNEASY-미니 키트(Qiagen, Inc., 메릴랜드주 제르맨타운)를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 단리하였다. 각 하이브리도마로부터의 100만 개의 동결된 세포를 원심분리에 의해 수확하고 RNA를 프로토콜에 기재된 방법에 따라 RNEASY 스핀 컬럼을 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. RNA를 각 컬럼으로부터 용출하고 정량화 및 cDNA 제조에 즉시 사용하였다. GeneQuant pro 분광광도계(GE Healthcare, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA를 순도 및 수율에 대해 분석하였다. 단리 후, 남아있는 RNA를 추가 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.

마우스 면역글로불린(Ig) 가변 도메인의 증폭을 위해 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조업체의 지침(EMD Chemicals, Inc., 뉴저지주 깁스타운)에 따라 사용하였다. 제조업체의 지침에 따라 써모스크립트(thermoscript) RT 키트(Invitrogen Corp., 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 역 전사(RT)에 의해 총 하이브리도마 RA로부터 cDNA를 제조하였다. 각 하이브리도마의 RNA 200-400 ng을 3' Ig 불변 영역 프라이머를 함유하는 개별 반응 튜브에 첨가하였다. 3' 불변 Ig 프라이머는 가변 Ig 영역에 근접하게 위치하여 마우스 항체의 가변 영역을 나타내는 첫번째 가닥 cDNA를 전사할 것이다. 각 하이브리도마 RNA에 대해, 개별 RT 반응을 3' 불변 중쇄 및 3' 불변 카파 경쇄 프라이머를 사용하여 수행하였다.

각 하이브리도마의 cDNA를 서열 결정의 목적을 위해 가변 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 cDNA를 증폭시키기 위한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 주형으로 사용하였다. 다중 반응을 마우스 Ig 가변 도메인의 신호 서열-코딩 영역에 어닐링하도록 설계된 축퇴 5' 프라이머 또는 프라이머 풀을 사용하여 각 PCR에 대해 수행하였다. 별도의 PCR 반응을 뮤린 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역의 증폭을 위한 축퇴 프라이머 또는 프라이머 풀로 수행하였다. PCR을 제조업체의 프로토콜에 따라 Expand High Fidelity DNA 폴리머라제 키트(Roche Diagnostics Corp., 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 cDNA 반응물 1 ul로 수행하였다. PCR에 대한 열순환 매개변수는 다음과 같았다; 94℃ 2 분, 35 주기(94℃ 15 초, 55℃ 30 초, 72℃ 1 분), 72℃ 7 분. PCR로부터 증폭된 단편을 1% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 분리하고 Qiagen 겔 추출 키트(Qiagen, Inc., 메릴랜드주 제르맨타운)를 사용하여 정제하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 정방향 프라이머는 pUC19 플라스미드로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 EcoRI 또는 SalI(New England Biolabs(NEB), Inc., 매사추세츠주 입시치) 부위 및 역 중쇄 및 경쇄 가변, HindIII(NEB Inc., 매사추세츠주 입시치)을 혼입한다. 정제된 PCR 단편 및 pUC19 플라스미드를 상기 제한 엔도뉴클레아제로 37℃에서 1-2 시간 동안 분해하였다. 분해 후, PCR 단편을 Qiaquick PCR 정화 키트(Qiagen, Inc., 메릴랜드주 제르맨타운)를 사용하여 정제하였다. 분해된 플라스미드를 1% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 분리하고 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 가변 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 DNA를 나타내는 정제된 PCR 단편을 T4 DNA 리가제 및 결찰 완충액(NEB, Inc., 매사추세츠주 입시치)을 사용하여 4℃에서 밤새 pUC19 플라스미드에 결찰시켰다. 각 결찰 반응물 3 ul를 사용하여 이. 콜라이 TOP10 세포(Invitrogen Corp., 캘리포니아주 칼즈배드)를 형질전환하였다.

플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen 미니 프렙 키트(Qiagen 27106)를 사용하여 각 하이브리도마의 가변 영역을 나타내는 양성 클론으로부터 단리하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 BigDye 서열분석 반응(Applied Biosystems by Life Technologies Corp., 캘리포니아주 칼즈배드)을 사용하여 각 클로닝된 삽입물에 대한 DNA 서열을 증폭하기 위해 M13 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. 서열분석 반응물을 제조업체의 프로토콜에 따라 96 웰 정제 키트(Zymo Research, 캘리포니아주 어바인)를 사용하여 정제하였다. 샘플을 ABI-3730 모세관 시퀀서(sequencer)에 로딩하고 생성된 서열 자취를 완전한 오픈 리딩 프레임의 존재에 대해 Sequencher(GeneCodes v. 4.2)를 사용하여 분석하였다.

양성 하이브리도마로부터 식별된 서열은 다음과 같이 나열된다(CDR은 밑줄 표시됨):

표 2

실시예 5

키메라 항체 구축

항체는 2 개의 이종이량체 단백질의 동종이량체 쌍으로 구성된다. 이종이량체의 각 단백질 쇄(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄)는 가변 도메인 및 불변 도메인으로 이루어진다. 각 가변 도메인은 항원 결합에 기여하는 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. CDR은 항체 상의 결합 부위의 적절한 공간 제시를 위한 스캐폴드를 제공하는 프레임워크 영역에 의해 가변 도메인에서 분리된다. 종합해서, CDR 및 프레임워크 영역은 동족 항원에 결합하는 항체 능력에 기여한다.

키메라 항체는 개과 IgG 분자의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 이식된 마우스 항체(상기 서열 분석으로부터 결정됨)의 가변 서열(CDR 및 프레임워크 둘 다)로 이루어진다. 가변 도메인이 항원 결합을 담당하므로, 개과 불변 영역에 전체 마우스 가변 도메인을 이식하는 것은 cNGF 면역원에 결합하는 항체의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.

중쇄 및 경쇄 가변 영역의 정확한 서열이 식별되었음을 동시에 확인하고 재조합, 균질 물질을 생산하기 위해, 포유동물 발현 시스템에서 키메라 항체를 생산하기 위한 발현 벡터를 생성하였다. 합성 DNA 작제물을 하이브리도마 01B12, 16G01, 02B04, 20D11, 및 26C08로부터 유래된 항체 서열의 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하도록 설계하였다(상기 서열 목록 및 서열 설명 참조). 고유한 측면 제한 엔도뉴클레아제 부위, Kozak 공통 서열 및, 분비 리더 서열을 각 합성 유전자 작제물에 혼입하여 포유동물 세포주로부터 재조합 항체의 발현 및 분비를 용이하게 하였다. 각 가변 도메인을 함유하는 유전자를 각각 GenBank 수탁 번호 AF354265 및 XP_532962의 서열에 기반한 개과 IgG 중쇄(IgG 65 e- 서열번호: 186) 또는 경쇄(서열번호: 190) 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 플라스미드에 클로닝하였다.

CMV 프로모터의 제어 하에, 각 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 표준 리포펙타민 방법을 사용하여 HEK 293 세포에 공동 형질감염시켰다. 발현 6 일 후, 키메라 mAb를 단백질 정제를 위한 표준 방법에 따라 MabSelect SuRe 단백질 A 수지(GE Healthcare, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 일시적으로 형질감염된 HEK293F 세포 상청액 30ml로부터 정제하였다. 용출된 분획을 풀링하고, 10,000 공칭 MW 컷오프 Nanosep Omega 원심분리 장치(Pall Corp., 뉴욕주 포트 워싱턴)를 사용하여 ~500ul까지 농축하고, 1x PBS, pH7.2에서 4℃에서 밤새 투석하고 추가 사용을 위해 4℃에서 저장하였다.

HEK 293 세포로부터의 발현을 나타내는 키메라 mAb를 이들이 다수 종(개과, 인간, 및 래트)으로부터의 NGF에 결합하는 친화성에 대해 추가로 분석하였다. 역학 결합 매개변수를 표면 플라즈몬 공명(SPR)-Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 평가하였다(도 9). 2.3 μg/ml NGF를 CM5 센서에서 대략 350 공명 단위의 최종 표면 밀도를 위해 아민 커플링(EDC-NGF 혼합물에 의한 카르복실 기 활성화 및 에탄올아민에 의한 과잉 반응성 기 탈활성화)에 의해 고정화하였다. 각 mAb의 3-배 연속 희석(낮은 mAb 농도로 인해, 20 - 0.25 nM)을 200 초 동안 측정한 후 30 μl/분의 유속으로 300 초의 확장된 해리 기간을 측정하였다. 글리신 pH1.5 및 NaOH로 재생을 수행하였다. 데이터는 이중 참조 후 1:1 결합 모델을 사용하여 Biacore T200 평가 소프트웨어로 분석하였다: 참조 유동 세포를 고정화된 NGF를 함유하는 유동 세포에서 뺀 다음 완충액 단독 주입을 뺐다. 친화도 <E-12는 기기의 검출 정량 하한치 미만이다.

실시예 6

항체 종분화 전략

항-약물 항체(ADA)의 생성은 모노클로날 항체를 포함하는 임의의 생체치료 단백질에 대한 효능 상실과 연관될 수 있다. 문헌의 포괄적인 평가는 모노클로날 항체의 종분화가 mAb가 면역원성이 되는 경향을 감소시킬 수 있음을 제시하였지만, 면역원성 완전 인간 mAb 및 비-면역원성 키메라 mAb의 예를 발견할 수 있었다. 본원에 제공된 마우스 항 NGF 모노클로날 항체에 대한 ADA 형성과 연관된 위험을 완화시키는 것을 돕기 위해, 개화 및 고양이화 전략을 이용하였다. 종분화 전략은 CDR 이식을 위한 가장 적절한 개과 항체 프레임워크 서열을 식별하는 것에 기반한다. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 각각 이용가능한 모든 개과 및 고양이과 서열의 광범위한 분석 후, IgG 가변 영역의 서열을 마우스 mAb에 대한 이들의 상동성에 기반하여 선택하였다. 마우스 전구체 mAb로부터의 CDR을 사용하여 천연 개과 CDR을 대체하였다. 목표는 생체내에서 면역원성의 잠재력을 최소화하기 위해 완전 개과 프레임워크를 사용하여 고친화성 및 세포-기반 활성을 유지하는 것이었다. 불변 영역은 생물물리학적 및 기능적 특성에 기반하여 선택하였다. 인간 IgG1과 기능적으로 유사한 개과 "IgG-B"(Bergeron 등 Vet Immunology and Immunopathology Vol 157, Issues 1-2, January 15, 2014) 키메라 mAb와 마찬가지로, 서열번호 184 및 서열번호 160 개과 불변 영역을 사용하였다.

실시예 7

항-cNGF mAb 01B12 및 02B04의 개화 및 최적화

키메라 형태로서 가장 높은 효능을 나타내는 2 개의 mAb, 01B12 및 02B04를 개화를 위해 선택하였다. mAb 01B12 및 02B04의 개화된 가변 중쇄 및 경쇄를 나타내는 합성 뉴클레오티드 작제물을 제조하였다. 각 가변 쇄를 각각의 개과 중쇄 또는 카파 불변 영역을 함유하는 플라스미드에 서브클로닝한 후, HEK 293 세포에서 항체 발현을 위해 플라스미드를 공동 형질감염시켰다. cNGF에 대한 결합은 초기에 ELISA 및 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 특성화하였다. 개화 후 결합을 유지하는 것으로 나타난 항체를 Biacore를 사용하여 친화도에 대해 TrkA 세포 기반 검정에서 기능적 활성에 대해 추가로 분석하였다). 01B12의 개화 형태는 하기 표 3에 제시되어 있으며 여기서 뮤린 CDR은 식별된 개과 프레임워크 영역에 이식되었고 중쇄 및 경쇄의 모든 조합은 상기 기재된 바와 같이 일시적 HEK 세포에서 발현되었다. 01B12의 경우, CDR에 대한 돌연변이는 개화에 필요하였고 키메라 형태로 관찰된 효능 및 발현을 유지하는 데 필요하였다. 높은 수율 및 cNGF에 대한 높은 친화성을 갖는 개화된 mAb를 진행하기 위해 식별하였다. 각 개화된 항체를 최적화하기 위한 합리적인 설계 및 돌연변이생성을 통해 개화된 02B04 및 01B12 둘 다에 대한 추가의 cDR 돌연변이를 제조하였다. 하기 표 3은 작제물 및 생성된 mAb의 효능을 나타낸다.

표 3

상기 나열된 특성에 기반하여, H3AQC2301B12L1AL1L3은 ZTS-00103182로 개명하였고 본원에서 ZTS-182로 지칭될 것이며, 이 항원 결합 단백질은 하기 기재된 바와 같이, 추가로 특성화하였다.

실시예 8

'182의 Fc 영역

ZTS-182에 대한 Fc 영역은 개과 IgGB(Vet Immunol Immunopathol. 2014 Jan 15;157(1-2):31-41) 서열번호 158의 변형된 버전이며 반감기, 생물물리학적 특성, 및 효과기 기능 부족에 대해 선택되었다. Bergeron 등에 보고된 바와 같이, 개과 IgGB는 개과 FcRn에 대한 우수한 친화성을 가지며 하류 처리에 적합한 생물물리학적 특성을 갖는다. 개과 Fc 단독으로 수행된 시차 주사 열량측정법(DSC)은 불변 영역의 열 안정성이 대략 70℃ 및 83℃임을 나타낸다. 이러한 용융 온도는 판매된 인간화 mAb에 대해 보고된 온도보다 더 높거나 유사하다.

ADCC 및 CDC 활성을 제거하기 위해 개과 IgGB의 CH2 도메인에 3 개의 점 돌연변이를 만들었다. 돌연변이된 Fc는 본원에서 IgGB(e-)로 언급되며 서열번호 184를 포함한다. NGF는 가용성 표적이지만, 효과기 기능을 항-NGF 항체로부터 제거하여 임의의 잠재적 비-특이적 표적 또는 효과기-기능 연관 부작용으로부터 보호하였다. 이들 돌연변이는 이 mAb의 면역원성에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 효과기 기능을 제거하기 위한 Fc에 대한 돌연변이는 FcRn 또는 단백질 A 결합에 영향을 미치지 않았다. 개과 FcγRI 및 FcγRIII에 대한 감소된 결합뿐만 아니라 ADCC 활성의 감소가 관찰되었다. C1q 단백질은 보체 캐스케이드의 첫번째 단백질이며 세포가 보체 의존적 세포독성(CDC)을 겪는데 필요하다. IgGB(e-)는 C1q 단백질에 결합하지 않는다.

실시예 9

개화된 ZTS-182의 약동학/약력학 분석

28 일 간격으로 투여된 2 개의 피하(SC) 용량 및 1 개의 정맥내(IV) 용량으로 이루어진 용량 레지멘을 사용하여 4-8 마리 정상 비글 개에서 약동학을 평가하였다. 이 설계는 절대 생체이용률 데이터를 제공하고 원치않은 면역원성 스팟을 식별하고 ADA 검정을 수행하지 않고도 일시적인지 지속적인지 여부를 결정하는 것을 그래프로 가능하게 하는 이점을 갖는다.

ZTS-182를 1.4 mg/kg으로 4 마리 수컷 및 4 마리 암컷 개에 투여하였다(도 10). 농도-시간 프로필의 중첩을 보정한 후 계산된 피하 생체이용룰은 평균 약 81% ± 13%였다. 제거율은 평균 6.2 ± 1.0　mL/d/kg이었고 최종 반감기는 9.3 ± 0.9 일이었다.

관련 연구에서, 용량 당 0, 4, 12, 및 20　mg/kg으로 4 마리 수컷 및 4 마리 암컷 비글 개의 그룹에 28 일 간격으로 투여된 ZTS-182의 3 회 SC 용량 후 매주 1 회 혈철 샘플을 수집하였다. 이들 고용량에서의 약동학은 기재된 PK 연구의 약동학과 일치하였으며 반복 투약은 약간의 축적만을 초래하였다. 반감기는 2 개의 저용량에서 대략 8 일이고 고용량에서 7 일이었다(도 11-13)

ZTS-00103182에 대한 노출은 여러 연구로부터 하기 표 4에 표로 작성한 용량 정규화 Cmax 및 AUC 데이터에 기반하여, 넓은 용량 범위에 걸쳐 용량 비례 방식으로 증가하였다. 표적 매개 배치의 증거는 명백하지 않았다.

표 4

실시예 10

VL CDR2의 직접 돌연변이

ZTS-182의 결합 및 기능적 특성에 영향을 미치기 위한 노력으로 가변 경쇄의 CDR2 내에서 일련의 합리적으로 설계된 직접 돌연변이를 수행하였다. 위치 2,3, 5 및 6은 하기 표 5에 나열된 바와 같이 돌연변이되었다. 하기 나열된 VL은 서열번호 49와 쌍을 이루었다.

표 5

본원에서 이전에 기재된 바와 같이, 결합 및 기능적 검정은 둘 다 표 5에 나열된 각각의 항체를 사용하여 수행하였으며, 이에 대한 데이터는 표 6(cNGF 결합) 및 7(TF-1 증식 억제)에 나타내었다. 전체 VL에 대한 서열은 서열번호 51과 동일하며, 표 6에 나열된 CDR2 아미노산만 상이하다.

표 6

표 7

실시예 11

신경돌기 파생물 억제 검정

신경돌기 파생물(outgrowth)은 기능적 신경 회로 발달 및 신경계 재생에서 핵심 과정이다. 래트 크롬친화세포종-12(PC12) 세포주는 부신 크롬친화세포종 세포(크롬친화성 세포의 악성 대응물)로부터 유래되고 신경 분화 및 기능의 조사를 위한 잘 확립된 모델 시스템을 나타낸다. 신경 성장 인자(NGF)와 같은 가용성 인자를 사용한 처리는 뉴런-유사 세포를 분화하도록 PC12 세포를 자극한다. NGF로 PC12 세포를 처리하면 TrkA 수용체의 활성화를 통해, 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 패밀리의 부분인 세포외 신호-조절 키나제 1 및 2(ERK1/2)의 활성화를 유도한다. ERK1/2의 활성화는 PC12 세포에서 신경돌기 신장 및 뉴런-유사 표현형 특성의 발달을 야기한다. TrkA 수용체에 결합하는 NGF의 억제는 이 검정에서 신경돌기 파생물의 억제를 초래해야 한다.

PC12 세포를 37℃에서 5% 소 태아 혈청(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬), 5% 말 혈청(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 성장 배지[듀벨코의 변형된 이글 배지(DMEM)]에서 유지하였다. 세포 성장 검정 또는 신경돌기 파생물 검정을 위해, PC12 세포를 세포 성장 검정을 위해 24-웰 조직 배양 플레이트에, 또는 신경돌기 파생물 검정을 위해 콜라겐 유형 IV-코팅된 24-웰 배양 플레이트에 웰 당 1 x 10⁴ 개 세포로 성장 배지에 시딩하고, 24 시간 동안 성장시켰다. 그런 다음 세포를 세포 성장 검정을 위해 지속적으로 성장 배지에서 배양하거나 신경돌기 파생물 검정을 위해 분화 배지(1% 말 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM)에 배치하였다. PC12 세포를 10ng/ml의 래트 NGF로 자극한 다음 다양한 농도의 ZTS-182 또는 ZTS-182m6으로 자극하였다. 웰 당 테스트된 항체의 상위 농도는 하기 표 8에 제시된 바와 같이 0.5 mg/ml였다. PC12 세포를 조사하고 측정하였다. 신경돌기 길이의 함수로서 ZTS-182 및 ZTS-182m6 항체 둘 다의 퍼센트 억제를 나타내는 신경돌기 파생물의 억제를 도 14a 및 14b에 제시된 바와 같이, 용량 의존적 방식으로 관찰하였다.

표 8

실시예 12

래트 MIA 모델에서 종분화된 항원 결합 단백질의 평가

골관절염(OA)은 관절 통증 및 관절 연골의 진행성 손실을 특징으로 하는 퇴행성 관절 질환이다. MIA(나트륨 모노요오드 아세테이트)의 관절 내 주사는 OA를 모방한 연골하 뼈 병변의 진행과 함께 관절 연골의 손실을 유도한다. 이 모델은 설치류 종에서 OA-유사 병변을 재현하는 신속하고 최소로 침습적인 방법을 제공한다.

골관절염의 래트 MIA 모델에서 MIA의 1 회 용량으로 종분화된(예를 들어 개화된, 고양이화된 등) 항-NGF 항체의 진통 효과는 개화된 모노클로날 항체 ZTS-182를 연구 동안 연구 7 일 및 연구 14 일에 2 회 투약함으로써 입증하였다. 통증을 지속된 통증에 대한 체중 부하 테스트 및 기계적 통각과민증에 대한 관절 압축(Randall Selitto) 테스트를 사용하여 평가하였다. 래트 MIA 절차의 도식에 대해 도 14를 참조한다.

테스트 그룹 및 용량 수준.

하기 표는 연구를 포함하는 실험 그룹을 나열한다

표 9

연구 설명:

표 10

결과는 동물이 2 개의 뒷다리에 기댄 체중의 총량에서 주입된 오른쪽 다리 또는 온전한 왼쪽 다리에 기댄 체중의 백분율로 계산하고 나타내었다. 온전한 왼쪽 다리에서 주입된 오른쪽 다리를 뺀 두 값의 차이를 계산하였다. 체중 부하 테스트는 동물이 뒷다리로 체중을 지탱하는 능력을 측정한다. 정상적 상태에서 동물은 체중을 양쪽 뒷다리에 동일하게 가한다(오른쪽 다리에 50% 및 왼쪽 다리에 50%). 따라서, 각 다리에 가해진 체중 백분율의 차이는 0%에 가까울 것이다. 동물이 통증을 경험함에 따라, 이 상황은 바뀐다. 동물은 통증이 없는 다리에 더 많은 체중을 가하고 통증이 있는 다리에 더 적은 체중을 가하는 경향이 있다. 결과적으로, 양쪽 다리에 가해진 체중 백분율의 차이는 증가하였다.

기계적 통각과민증(Randall-Selitto 테스트):

그램으로 표현되는 기계적 역치는 Randall-Selitto를 사용하여 래트에서 측정하였다. 뒷발에 압력을 가하여 테스트를 수행하였다. 모터를 활성화시키는 페달을 누름으로써, 선형 눈금에서 일정한 비율로 힘을 증가하였다. 통증이 발의 움츠림을 나타내거나 소리를 내는 경우, 페달을 즉시 풀고 통각 역치를 저울에서 판독한다.

체중 :

동물의 체중을 연구 시작 시(-1 일) 및 연구 내내 주 1 회; 즉, -1, 7, 14, 21 및 27 일에 측정하였다.

통계/데이터 평가:

평가는 주로 모든 처리된 그룹 대 비히클 대조군의 그룹에서 백분율(%)로 표현된 체중 부하로 기록된 상대적 변화에 기반하였다. 적절한 경우, 일원 ANOVA 이어서 Tukey 검정에 의한 데이터 분석을 적용하여 치료 효과의 유의성을 결정하였다. 도 16은 상기 언급된 MIA 모델에서 래트에 0.5, 2.0 및 4.0 mg/kg의 ZTS-182를 투여한 후 체중 부하를 측정함으로써 래트가 통증을 견디는 능력에 대한 ZTS-182의 용량 의존적 긍정적 효과를 입증한다. 이러한 결과는 통증 완화에서 ZTS-182의 효능을 분명하게 입증한다.

실시예 13

개화된 항-NGF 항원 결합 단백질의 투여 후 파행에 대한 효과

연조직에서의 염증 과정은 골관절염의 하나의 유의한 구성요소로서 잘 인식되어 있다. 활액막염 통증 모델에서, 단일 뒷무릎에서 활액 막의 일시적인 염증은 박테리아 지질다당류(LPS)의 관절 내 주사를 통해 유도된다. 정량화가능한 파행은 활액막염 유도 2 시간 이내에 발생하고, 3-4 시간에 정점에 달하고, 6 시간까지 약해지고 24 시간 후 완전히 해결된다. 이 모델은 통증 제어를 위한 표적을 조사하는 데 일상적으로 사용되었다.

개과 LPS 활액막염 모델에서 정맥내 주사에 의해 온전한 수컷 비글에 1 회 투여된 5 mg/kg 용량의 ZTS-182는 위약 및 양성 대조군과 비교하여 파행을 감소시켰다. 효능을 LPS 활액막염 유도 3 및 5 시간 후에 측정하였다. 활액막염 유도를 또한 활액막염 유도 3 및 5 시간 후 측정된 효능으로 반대쪽 뒷무릎에서 14 일째에 수행하였다.

도 16은 7 일째 및 14 일째에 활맥막염 유도 3 및 5 시간 후에 처리 그룹에 대해서 파행 VAS에 대한 최소 제곱 평균(표준 오차 포함)을 나타낸다. 5 mg/kg 개화된 aD11 및 위약 사이의 차이는 활액막염 유도 후 7 일째에 3(p < 0.001), 용량 투여 후 171 시간 및 5 시간(p < 0.0001), 뿐만 아니라 14 일째에 5 시간(p = 0.0005)에 통계적으로 유의하였다. 활액막염 유도 후 7 일째에 3 시간(p = 0.0297) 및 5 시간(p = 0.0180)에 5 mg/kg ZTS-00103182와 위약을 비교하는 파행 평가는 활액막염 유도 후 14 일째에 3 시간(p=0.03130) 5 시간(p=0.0057)에 기록된 것과 마찬가지로, 통계적으로 유의하였다.

실시예 14

고양이화 전략

고양이에서 항-약물 항체(ADA) 형성과 연관된 위험을 완화하는 것을 돕기 위해, ZTS-182 개과 모노클로날 항체 CDR 서열을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 고양이과 생식계열 항체 서열에 이식하였다. 이 고양이화 전략은 CDR 이식을 위한 가장 적절한 고양이과 생식계열 항체 서열을 식별하는 것에 기반한다. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 모든 이용가능한 고양이과 생식계열 서열의 광범위한 분석 후, 개과 ZTS-182에 대한 상동성에 대해 생식계열 후보를 선택하였고, 개과 ZTS-182로부터의 CDR을 사용하여 천연 고양이과 CDR을 대체하였다. 목적은 시험관내에서 면역원성의 잠재력을 최소화하기 위해 완전 고양이과 프레임워크를 사용하여 고친화성 및 세포-기반 활성을 유지하는 것이었다. 고양이화된 mAb를 포유동물 발현에 최적화하고, 발현시키고 SPR을 통해 NGF에 결합하는 능력에 대해 특성화하였다. 이들 결과는 실시예 14 아래에 기재되어 있다. 고양이화 후 신뢰할 수 있는 발현 수준 및 NGF에 결합하는 능력을 둘 다 보유하는 mAb만이 추가 특성화를 위해 진행되었다. 일시적으로 발현하지 않거나 NGF에 결합하는 능력을 상실한 mAb는 진행되지 않았다.

실시예 15

개과 ZTS-182 항체의 고양이화

mAb 개과 ZTS-182의 고양이화된 가변 중쇄 및 경쇄를 나타내는 재조합 작제물을 제조하였다. 각 가변 쇄를 각각의 고양이과 중쇄 또는 카파 불변 영역을 함유하는 플라스미드에 서브클로닝한 후, 플라스미드를 HEK 293 세포에서 항체 발현을 위해 공동 형질감염시켰다. 본 발명의 고양이과 중쇄 불변 영역은 임의의 특정 하위유형으로 제한되지 않지만, 일부 구현예에서 고양이과 중쇄 불변 영역은 fel IgG1a 서열번호 162]로 기재된다. 고양이과 카파 경쇄 불변 영역은 임의의 특정 서열로 제한되지 않지만, 본 발명의 일부 구현예에서 고양이과 카파 불변 영역은 서열번호 165로 기재된다.

고양이과 NGF에 대한 선택된 고양이화된 항-NGF 항체의 친화도를 SPR(표면 플라즈몬 공명), Biacore 3000을 사용하여 측정하였다. 고양이화된 mAb와 고양이과 NGF의 회합 및 해리 역학을 상이한 농도에서 측정하였다. KD 평형 결합 상수는 표 11에 보고되어 있다.

선택된 고양이화된 mAb를 또한 NGF 기능 검정에서 테스트하였다. mAb와 NGF를 사전 인큐베이션한 후, 인간 TrkA(NGF에 대한 수용체)를 발현하는 세포주를 도입한다. 수용체의 활성화는 TrkA에 결합하는 NGF의 mAb 억제에 대한 용량 반응의 지표로서 측정될 수 있는 세포내 신호전달(pERK-1/2)의 캐스케이드를 초래한다. 표 11은 고양이화된 mAb가 모두 1nM 범위에서 IC₅₀을 가짐을 나타낸다. 이러한 세포-기반 데이터는 Biacore 데이터와 일치하므로 NGF에 대한 매우 강력한 mAb를 나타내며, 따라서 친화성 성숙의 필요성을 피한다.

표 11

실시예 16

고양이화된 항-NGF 항원 결합 단백질의 약동학

3 마리 수컷 및 5 마리 암컷 도메스틱 쇼트 헤어 고양이의 그룹에 3.0 mg/kg으로 투여된 ZTS-082를 28 또는 29 일 간격으로 피하로 2 회 및 정맥내로 2 회 투약하였다. 84 일 연구 기간 동안 사망, 부작용, 또는 과민 반응은 발생하지 않았다. 농도-시간 프로필에 기반하여, 어떤 동물에서도 항-약물 항체가 발생하지 않은 것으로 보였다. ZTS-082는 대략 10.4 ± 2.9 일의 반감기를 가졌다. 피하 투여 후, 생체이용률은 대략 76% ± 21%였고 정점 혈청 농도는 투약 후 1-7 일에 관찰되었다.

고양이과 혈청에서 '자유' ZTS-082를 Gyrolab XP™ 기기에서 자동화된 샌드위치 리간드 결합 검정을 사용하여 검정하였다. 핵심 시약은 비오틴-표지된 개과 NGF 및 Alexa Fluor® 표지된 AffiniPure 염소 항-고양이 IgG, Fc Fragment Specific을 포함하였다. 고양이과 혈청에서 품질 관리 샘플을 준비하였다. 0.1-100 μg/mL 범위에 이르는 표준을 고양이과 혈청에서 매일 준비하였다. 표준, QC, 및 연구 샘플을 PBST에서 2% BSA로 1:40으로 희석하고 동일한 부피의 Rexxip AN™ 완충액(Gyros, Inc.으로 추가로 희석하였다. 비오틴-NGF 포획 시약을 Gyrolab Bioaffy 200 nL CD의 스트렙타비딘-코팅된 비드에 적용하였다. 세척 후, 샘플을 적용한 후, 추가로 세척한 다음, Alexa Fluor-항-고양이 IgG 검출 항체를 적용한 후, 추가로 세척하였다. 5-매개변수 로지스틱 곡선을 사용한 표준의 회귀에 의해 Gyros Evaluator를 사용하여 형광 신호를 분석하였다. 정량 범위는 0.391-100 μg/mL였다. 0.50, 5.0, 및 50 μg/mL ZTS-082를 함유하는 혈청 QC의 역산된 농도는 각각 평균 대략 0.553, 4.65 및 50.5 μg/mL였다(각각 n=4).

연구 과정에 걸쳐 반감기에 비정상적인 변화가 관찰되지 않았으므로 ZTS-082를 투여한 임의의 동물이 항-약물 항체를 발생시키는 것으로 보이지 않았다(도 1)7a 및 b).

정맥내 투여 후, ZTS-082의 제거율은 평균 대략 4.0 ± 1.2 mL/d/kg이었고 반감기는 평균 대략 10.4 ± 2.9 일이었다. 피하 생체이용률은 대략 76% ± 21%(두 SC 용량의 평균)였다. 정점 혈청 농도는 피하 투여 후 1-7 일에 관찰되었다.

SEQUENCE LISTING <110> ZOETIS SERVICES LLC BERGERON, LISA M STRIETZEL, CATHERINE J BAINBRIDGE, GRAEME BAMMERT, GARY F <120> ANTI-NGF ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> ZP000330 <140> 63/088729 <141> 2021-10-04 <160> 185 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile 20 25 30 Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu 165 170 175 Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val 195 200 205 Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg 210 215 220 Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg 225 230 235 240 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> CANINE <400> 2 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Arg Ala Glu Pro His Pro Glu Ser His Val Pro Ala Gly His Ala Ile 20 25 30 Pro His Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val 85 90 95 Ala Ala Asp Ala Gln Asp Leu Asp Leu Glu Ala Gly Ser Thr Ala Ser 100 105 110 Val Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Val Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu 165 170 175 Thr Lys Cys Arg Asp Pro Thr Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val 195 200 205 Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg 210 215 220 Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Arg 225 230 235 240 Ala <210> 3 <211> 241 <212> PRT <213> FELINE <400> 3 Met Ser Met Leu Ser Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Pro Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Ala Ile 20 25 30 Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Thr Pro Ala Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Gln Gly Leu Asp Leu Glu Ala Gly Gly Ala Ala Ser 100 105 110 Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Val Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu 165 170 175 Thr Lys Cys Arg Asp Pro Thr Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val 195 200 205 Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg 210 215 220 Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Arg 225 230 235 240 Ala <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> MURINE <400> 4 Gly Phe Thr Leu Thr Gln Tyr Gly 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> MURINE <400> 5 Val Ile Trp Ala Thr Gly Ala Thr Asp 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> MURINE <400> 6 Asp Gly Trp Trp Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 7 Asp Gly Trp Trp Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 8 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 9 Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 10 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 11 Tyr Ile Ser Ser Phe His Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 12 Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 13 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 14 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 15 Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 16 Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 17 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 18 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 19 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 20 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 21 His Arg Ala Thr Thr Ser Pro Gly Pro 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 22 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 23 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 24 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 25 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 26 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 27 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 28 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 29 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 30 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 31 Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 32 Tyr Ile Ser Ser Phe His Ser 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 33 Gln Gln Ser His Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 34 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 35 Tyr Val Thr Thr Leu His Ala 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 36 Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 37 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 38 Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 39 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 40 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 41 Tyr Val Thr Ser Leu His Ala 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 42 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 43 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 44 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 45 Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 46 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 47 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 48 Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 49 <211> 181 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Ala Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Leu Thr Gln Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Thr Val Ile Trp Ala Thr Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Met Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Trp Trp Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 130 135 140 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser 180 <210> 50 <211> 425 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 50 ccaccatgaa gcacctgtgg ttctttctgc tgctggtggc cgctcccaga tgggtgctga 60 gcgaggtgca gctggtggaa tctggcggcg acctggccag acctggcggc agcctgaagc 120 tgagctgcgt ggtgtccggc ttcaccctga cccagtacgg catcaactgg gtccgccagg 180 cccctggcaa gggcctgcag tgggtcacag tgatctgggc caccggcgcc accgactaca 240 acagcgccct gaagtcccgg ttcaccgtgt ctcgggacaa cgccatgaac accgtgtacc 300 tgcagatgaa cagcctgcgg gtggaagata ccgccgtgta ctactgcgcc agagacggct 360 ggtggtacgc caccagctgg tacttcgacg tgtggggcca gggcacactg gtcacagtct 420 cgagc 425 <210> 51 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 52 <211> 639 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 52 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga gcccgggcga accggcgagc 60 attagctgca aagcgagcca ggatattaac cattatctga actggtttcg ccagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctgc gcattagccg cgtggaagcg 240 gatgatgcgg gcgtgtatta ttgccagcag ggcgatcatt ttccgcgcac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa acgcaacgat gcgcagccgg cggtgtatct gtttcagccg 360 agcccggatc agctgcatac cggcagcgcg agcgtggtgt gcctgctgaa cagcttttat 420 ccgaaagata ttaacgtgaa atggaaagtg gatggcgtga ttcaggatac cggcattcag 480 gaaagcgtga ccgaacagga taaagatagc acctatagcc tgagcagcac cctgaccatg 540 agcagcaccg aatatctgag ccatgaactg tatagctgcg aaattaccca taaaagcctg 600 ccgagcaccc tgattaaaag ctttcagcgc agcgaatgc 639 <210> 53 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ile Ser Ser Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 54 <211> 372 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 54 aagcttgcca ccatggtgct gcagacacag gtgttcatct ctctgctgct gtggattagt 60 ggagcctacg gcgacatcgt gatgacccag acacctctgt cactgagcgt gtccccaggg 120 gaacccgcct ctatcagttg ccgggccagc cagagcatca gcaacaacct gaactggttc 180 agacagaagc cagatgggac cgtcaagcta ctgatctact acatcagctc gttccacagc 240 ggagtgccct ctcgcttttc aggcagcggg tccggaacag actttactct gcggatctcc 300 agagtggaag ccgacgatgc tggcgtgtac tattgccagc agggcgacca cttcccctac 360 accttcggcc ag 372 <210> 55 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 56 <211> 425 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 56 ccaccatgaa gcacctgtgg ttctttctgc tgctggtggc cgctcccaga tgggtgctga 60 gcgaggtgca gctggtggaa tctggcggcg acctggccag acctggcggc agcctgaagc 120 tgagctgcgt ggtgtccggc ttcaccctga cccagtacgg catcaactgg gtccgccagg 180 cccctggcaa gggcctgcag tgggtcacag tgatctgggc caccggcgcc accgactaca 240 acagcgccct gaagtcccgg ttcaccgtgt ctcgggacaa cgccatgaac accgtgtacc 300 tgcagatgaa cagcctgcgg gtggaagata ccgccgtgta ctactgcgcc agagacggct 360 ggtggtacgc caccagctgg tacttcgacg tgtggggcca gggcacactg gtcacagtct 420 cgagc 425 <210> 57 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 58 <211> 372 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 58 gccaccatgg tgctgcagac acaggtgttc atctctctgc tgctgtggat tagtggagcc 60 tacggcgaca tcgtgatgac ccagacacct ctgtcactga gcgtgtcccc aggggaaccc 120 gcctctatca gttgcaaggc cagccagagc atcaaccact acctgaactg gttcagacag 180 aagccagatg ggaccgtcaa gctactgatc tactacacat caaggctgca ttcaggagtg 240 ccctctcgct tttcaggcag cgggtccgga acagacttta ctctgcggat ctccagagtg 300 gaagccgacg atgctggcgt gtactattgc caacagggga gtaccctgcc caggaccttc 360 ggccagggta cc 372 <210> 59 <211> 101 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 59 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys His Arg Ala Thr Thr Ser Pro Gly 85 90 95 Pro Ser Ala Arg Val 100 <210> 60 <211> 365 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 60 gccaccatgg tgctgcagac acaggtgttc atctctctgc tgctgtggat tagtggagcc 60 tacggcgaca tcgtgatgac ccagacacct ctgtcactga gcgtgtcccc aggggaaccc 120 gcctctatca gttgcagagc ttctcaagat attagcaact atctgaattg gttcagacag 180 aagccagatg ggaccgtcaa gctactgatc tactacacat caaggctgca ttcaggagtg 240 ccctctcgct tttcaggcag cgggtccgga acagacttta ctctgcggat ctccagagtg 300 gaagccgacg atgctggcgt gtactattgc cacagggcga ccacttcccc cggaccttcg 360 gccag 365 <210> 61 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 61 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 62 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 62 gccaccatgg tgctgcagac acaggtgttc atctctctgc tgctgtggat tagtggagcc 60 tacggcgaca tcgtgatgac ccagacacct ctgtcactga gcgtgtcccc aggggaaccc 120 gcctctatca gttgcagagc ttctcaagat attagcaact atctgaattg gttcagacag 180 aagccagatg ggaccgtcaa gctactgatc tactacacat caaggctgca ttcaggagtg 240 ccctctcgct tttcaggcag cgggtccgga acagacttta ctctgcggat ctccagagtg 300 gaagccgacg atgctggcgt gtactattgc caacagggga gtaccctgcc caggaccttc 360 ggccag 366 <210> 63 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 63 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 64 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 64 gccaccatgg tgctgcagac acaggtgttc atctctctgc tgctgtggat tagtggagcc 60 tacggcgaca tcgtgatgac ccagacacct ctgtcactga gcgtgtcccc aggggaaccc 120 gcctctatca gttgcagagc ttctcaagat attagcaact atctgaattg gttcagacag 180 aagccagatg ggaccgtcaa gctactgatc tactacacat caaggctgca ttcaggagtg 240 ccctctcgct tttcaggcag cgggtccgga acagacttta ctctgcggat ctccagagtg 300 gaagccgacg atgctggcgt gtactattgc caacagggga gtaccctgcc caggaccttc 360 ggccag 366 <210> 65 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 65 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 66 <211> 639 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 66 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga gcccgggcga accggcgagc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtttcg ccagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat accagcagcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctgc gcattagccg cgtggaagcg 240 gatgatgcgg gcgtgtatta ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa acgcaacgat gcgcagccgg cggtgtatct gtttcagccg 360 agcccggatc agctgcatac cggcagcgcg agcgtggtgt gcctgctgaa cagcttttat 420 ccgaaagata ttaacgtgaa atggaaagtg gatggcgtga ttcaggatac cggcattcag 480 gaaagcgtga ccgaacagga taaagatagc acctatagcc tgagcagcac cctgaccatg 540 agcagcaccg aatatctgag ccatgaactg tatagctgcg aaattaccca taaaagcctg 600 ccgagcaccc tgattaaaag ctttcagcgc agcgaatgc 639 <210> 67 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 67 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ile Ser Ser Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 68 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 68 gccaccatgg tgctgcagac acaggtgttc atctctctgc tgctgtggat tagtggagcc 60 tacggcgaca tcgtgatgac ccagacacct ctgtcactga gcgtgtcccc aggggaaccc 120 gcctctatca gttgcaaggc cagccagagc atcaaccact acctgaactg gttcagacag 180 aagccagatg ggaccgtcaa gctactgatc tactacatca gctcgttcca cagcggagtg 240 ccctctcgct tttcaggcag cgggtccgga acagacttta ctctgcggat ctccagagtg 300 gaagccgacg atgctggcgt gtactattgc cagcagagcc acaccctgcc ctacaccttc 360 ggccag 366 <210> 69 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 69 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Val Thr Ser Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 70 <211> 639 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 70 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga gcccgggcga accggcgagc 60 attagctgca aagcgagcca ggatattaac cattatctga actggtttcg ccagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat gtgaccagcc tgcatgcggg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctgc gcattagccg cgtggaagcg 240 gatgatgcgg gcgtgtatta ttgccagcag ggcgatcatt ttccgcgcac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa acgcaacgat gcgcagccgg cggtgtatct gtttcagccg 360 agcccggatc agctgcatac cggcagcgcg agcgtggtgt gcctgctgaa cagcttttat 420 ccgaaagata ttaacgtgaa atggaaagtg gatggcgtga ttcaggatac cggcattcag 480 gaaagcgtga ccgaacagga taaagatagc acctatagcc tgagcagcac cctgaccatg 540 agcagcaccg aatatctgag ccatgaactg tatagctgcg aaattaccca taaaagcctg 600 ccgagcaccc tgattaaaag ctttcagcgc agcgaatgc 639 <210> 71 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 71 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 72 <211> 639 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 72 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga gcccgggcga accggcgagc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtttcg ccagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttataaa accaacagcc tgcagaccgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctgc gcattagccg cgtggaagcg 240 gatgatgcgg gcgtgtatta ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa acgcaacgat gcgcagccgg cggtgtatct gtttcagccg 360 agcccggatc agctgcatac cggcagcgcg agcgtggtgt gcctgctgaa cagcttttat 420 ccgaaagata ttaacgtgaa atggaaagtg gatggcgtga ttcaggatac cggcattcag 480 gaaagcgtga ccgaacagga taaagatagc acctatagcc tgagcagcac cctgaccatg 540 agcagcaccg aatatctgag ccatgaactg tatagctgcg aaattaccca taaaagcctg 600 ccgagcaccc tgattaaaag ctttcagcgc agcgaatgc 639 <210> 73 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 73 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Val Thr Ser Leu His Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 74 <211> 639 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 74 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga gcccgggcga accggcgagc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtttcg ccagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat gtgaccagcc tgcatgcggg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctgc gcattagccg cgtggaagcg 240 gatgatgcgg gcgtgtatta ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa acgcaacgat gcgcagccgg cggtgtatct gtttcagccg 360 agcccggatc agctgcatac cggcagcgcg agcgtggtgt gcctgctgaa cagcttttat 420 ccgaaagata ttaacgtgaa atggaaagtg gatggcgtga ttcaggatac cggcattcag 480 gaaagcgtga ccgaacagga taaagatagc acctatagcc tgagcagcac cctgaccatg 540 agcagcaccg aatatctgag ccatgaactg tatagctgcg aaattaccca taaaagcctg 600 ccgagcaccc tgattaaaag ctttcagcgc agcgaatgc 639 <210> 75 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 75 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 76 <211> 367 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 76 ggccaccatg agtgttccta cccaagtgct gggactgctg ctgctgtggc tgacagatgc 60 tcggtgcgag atagtcatga cccagtcacc ggcatctctg agcctgagcc aggaagagaa 120 ggtaactatc acgtgtcggg cctctcagga cattagcaac tacctgaatt ggtatcagca 180 gaaaccagga caggccccca agttgttgat atactacact tcccgcctgc acagtggggt 240 cccctcccga ttcagcggat ccgggtccgg cacggacttc agctttacta tctccagttt 300 ggagcccgaa gatgttgctg tgtattactg tcagcagggt aatatgtttc cgtatacatt 360 cggcgga 367 <210> 77 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 77 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 78 <211> 378 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 78 agcttggcca ccatgagtgt tcctacccaa gtgctgggac tgctgctgct gtggctgaca 60 gatgctcggt gcgagatagt catgacccag tcaccggcat ctctgagcct gagccaggaa 120 gagaaggtaa ctatcacgtg taaggccagc caggacatca accactacct gaactggtat 180 cagcagaaac caggacaggc ccccaagttg ttgatatact acacttcccg cctgcacagt 240 ggggtcccct cccgattcag cggatccggg tccggcacgg acttcagctt tactatctcc 300 agtttggagc ccgaagatgt tgctgtgtat tactgtcagc agggtaatat gtttccgtat 360 acattcggcg gaggtacc 378 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 79 Gly Phe Thr Leu Thr Gln Tyr Gly 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 80 Val Ile Trp Ala Thr Gly Ala Thr Asp 1 5 <210> 81 <211> 13 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 81 Asp Gly Trp Trp Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 82 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 83 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 84 Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 85 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 85 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Gln Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ala Thr Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Trp Trp Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 420 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 86 atggagtggt cttgggtctt tctgttcttt ctgagtgtta ccaccggcgt gcactcagac 60 gtgcagctgg tggaatctgg cggcgacctg gtgcagcctg gcggctctct gagactgacc 120 tgcgtggcct ccggcttcac cctgacccag tacggcatca actgggtgcg acaggcccct 180 ggcaagggcc tgcagtgggt ggccgtgatc tgggccaccg gcgccaccga ctacaactcc 240 gccctgaagt cccggttcac catcagccgg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaactccc tgaaaaccga ggacaccgcc acctactact gcgccaggga cggctggtgg 360 tacgccacct cctggtactt cgacgtgtgg ggccagggcg ctctggtgac agtctcgagc 420 <210> 87 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 87 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr 100 <210> 88 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 88 atgagtgttc ctacccaagt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga tgctcggtgc 60 gacatcgtga tgacccagac cccactgtcc ctgtccgtga cacctggcga gcctgcctcc 120 atctcctgca aggcctccca ggacatcaac cactacctga actggtatct gcagaagccc 180 gacggcaccg tgaagctgct gatctactac acctcccggc tgcactccgg cgtgccctcc 240 agattctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctgc ggatctcccg ggtggaagcc 300 gacgacgtgg gcgtgtacta ctgccagcag ggcgaccact tcccccggac ctttggccct 360 ggtacc 366 <210> 89 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 89 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 90 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 90 atgagtgttc ctacccaagt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga tgctcggtgc 60 gacatcgtga tgacccagac accactgtct ctgcctgtaa ctccgggaga accagccagc 120 attagttgta aggctagcca ggacatcaac cactatctga actggtatct gcagaaacct 180 ggccaatcac cgcgcctgct gatctattac acctctcgac tgcattctgg agtcccatcc 240 aggttctcag ggtccgggtc cggcactgac ttcaccttgc gcatatcttc agtggaagcc 300 gatgacgtcg gagtttacta ttgtcaacag ggcgaccact ttccacggac attcggacag 360 ggtacc 366 <210> 91 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 91 atgagtgttc ctacccaagt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga tgctcggtgc 60 gacatcgtga tgacccagac accactgtct ctgcctgtaa ctccgggaga accagccagc 120 attagttgta aggctagcca ggacatcaac cactatctga actggtatct gcagaaacct 180 ggccaatcac cgcgcctgct gatctattac acctctcgac tgcattctgg agtcccatcc 240 aggttctcag ggtccgggtc cggcactgac ttcaccttgc gcatatcttc agtggaagcc 300 gatgacgtcg gagtttacta ttgtcaacag ggcgaccact ttccacggac attcggacag 360 ggtacc 366 <210> 92 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 92 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Gln Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Ala Thr Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Trp Trp Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 420 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 93 atggagtggt cttgggtctt tctgttcttt ctgagtgtta ccaccggcgt gcactcagac 60 gtgcagctgg tggaatctgg cggcgacctg gtgaaacctg gcggctctct gagactgacc 120 tgcgtggcct ccggcttcac cctgacccag tacggcatca actgggtgcg acaggcccct 180 ggcaagggcc tgcagtgggt ggccgtgatc tgggccaccg gcgccaccga ctacaactcc 240 gccctgaagt cccggttcac catgagccgg gacaacgccc ggaacaccct gtacctgcag 300 atgaactccc tgaaaaccga ggacaccgcc acctactact gcgccaggga cggctggtgg 360 tacgccacct cctggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctggtgac agtctcgagc 420 <210> 94 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 94 Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 95 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 95 atgagtgttc ctacccaagt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga tgctcggtgc 60 gagatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtccgcct ctcccggcga cagagtgaca 120 atcacatgca aggcctccca ggacatcaac cactacctga actggtatca gcagaagccc 180 ggcaaagtgc ctaagctgct gatctactac acctcccggc tgcactccgg cgtgccctcc 240 agattctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctggaaccc 300 gaggacgccg ccacctacta ctgccagcag ggcgaccact tcccccggac ctttggcgga 360 ggtacc 366 <210> 96 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 96 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 97 <211> 363 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 97 gaagtgaaac tgcaggaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cgatggctat 300 tattatggca ccacctggta ttttgatgtg tggggcgcgg gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 98 <211> 119 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 98 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 115 <210> 99 <211> 357 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 99 caggtgcagc tgaaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cgatggctat 300 tattatggca ccacctggta ttttgatgtg tggggcgcgg gcaccaccgt gaccgtg 357 <210> 100 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 100 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 101 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 101 gatattgtga tgacccagag caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcacca ttaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggcggc 300 ggcacc 306 <210> 102 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 102 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 103 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 103 gatattgtga tgacccagag caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcacca ttaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggcggc 300 ggcacc 306 <210> 104 <211> 120 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 104 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 105 <211> 360 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 105 gaagtgaaac tggaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gaacattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatggata gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cggcggctat 300 gattatgatg tgccgttttt tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagcagc 360 <210> 106 <211> 120 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 106 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 107 <211> 360 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 107 gaagtgaaac tggaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gaacattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatggata gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cggcggctat 300 gattatgatg tgccgttttt tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagcagc 360 <210> 108 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 108 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Leu Gly Gly Gly Thr 100 <210> 109 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 109 gatattgtga tgacccagac caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcaacatgt ttccgtatac cctgggcggc 300 ggcacc 306 <210> 110 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 110 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Leu Gly Gly Gly Thr 100 <210> 111 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 111 gatattgtga tgacccagac caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcaacatgt ttccgtatac cctgggcggc 300 ggcacc 306 <210> 112 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 112 Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 113 <211> 363 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 113 gaagtgcagc tggaacagag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cgatggctat 300 tattatggca ccacctggta ttttgatgtg tggggcgcgg gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 114 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 114 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 115 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 115 gatattgtgc tgacccagag caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcacca ttaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggcggc 300 ggcacc 306 <210> 116 <211> 114 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 116 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Leu Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 117 <211> 342 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 117 gaagtgcagc tgcaggaaag cggcgcggaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaactg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc aactattgga tgcattgggt gaaacagcgc 120 ccgggccagg gcctggaatg gattggccat attgatccga gcgatggcga aacccattat 180 aaccagaaat ttaaagataa agcgaccctg accgtggata aaagcagcag caccgcgtat 240 atgcagctga ccggcctgac cagcgaagat agcgcggtgt attattgcgc gcgctttctg 300 ccggattatt ggggccaggg caccagcgtg accgtgagca gc 342 <210> 118 <211> 114 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 118 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Leu Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 119 <211> 342 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 119 gaagtgcagc tgcaggaaag cggcgcggaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaactg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc aactattgga tgcattgggt gaaacagcgc 120 ccgggccagg gcctggaatg gattggccat attgatccga gcgatggcga aacccattat 180 aaccagaaat ttaaagataa agcgaccctg accgtggata aaagcagcag caccgcgtat 240 atgcagctga ccggcctgac cagcgaagat agcgcggtgt attattgcgc gcgctttctg 300 ccggattatt ggggccaggg caccagcgtg accgtgagca gc 342 <210> 120 <211> 103 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 120 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Tyr Asp Asn Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 100 <210> 121 <211> 309 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 121 gatattgtgc tgacccagac cccggcgatt atgagcgcga gcccgggcga aaaagtgacc 60 atgacctgcc gcgcgagcag cagcgtgagc agcatttatc tgcattggta tcagcagaaa 120 ccgggcagca gcccgaaact gtggatttat agcaccagca acctggcgag cggcgtgccg 180 gcgcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc agctatagcc tgaccgtgag cagcgtggaa 240 gcggaagatg cggcgaccta ttattgccag ctgtatgata acagcccgct gacctttggc 300 gcgggcacc 309 <210> 122 <211> 103 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 122 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Tyr Asp Asn Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 100 <210> 123 <211> 309 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 123 gatattgtgc tgacccagac cccggcgatt atgagcgcga gcccgggcga aaaagtgacc 60 atgacctgcc gcgcgagcag cagcgtgagc agcatttatc tgcattggta tcagcagaaa 120 ccgggcagca gcccgaaact gtggatttat agcaccagca acctggcgag cggcgtgccg 180 gcgcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc agctatagcc tgaccgtgag cagcgtggaa 240 gcggaagatg cggcgaccta ttattgccag ctgtatgata acagcccgct gacctttggc 300 gcgggcacc 309 <210> 124 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 124 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 125 <211> 363 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 125 gaagtgcagc tggaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cgatggctat 300 tattatggca ccacctggta ttttgatgtg tggggcgcgg gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 126 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 126 Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ile 20 25 30 Asn Arg His Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 <210> 127 <211> 321 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 127 gatattgtga ttacccagac cccgctgagc ctgccggtga gcctgggcga tcaggcgagc 60 attagctgcc gcagcagcca gagcattgtg catattaacc gccataccta tctgggctgg 120 tatctgcaga aaccgggcca gagcctgaaa ctgctgattt atggcgtgag caaccgcttt 180 agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240 agccgcgtgg aagcggaaga tatgggcgtg tattattgct ttcagggcac ccatgtgccg 300 tttacctttg gcagcggcac c 321 <210> 128 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 128 Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ile 20 25 30 Asn Arg His Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 <210> 129 <211> 321 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 129 gatattgtga ttacccagac cccgctgagc ctgccggtga gcctgggcga tcaggcgagc 60 attagctgcc gcagcagcca gagcattgtg catattaacc gccataccta tctgggctgg 120 tatctgcaga aaccgggcca gagcctgaaa ctgctgattt atggcgtgag caaccgcttt 180 agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240 agccgcgtgg aagcggaaga tatgggcgtg tattattgct ttcagggcac ccatgtgccg 300 tttacctttg gcagcggcac c 321 <210> 130 <211> 120 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 130 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 131 <211> 360 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 131 gaagtgaaac tggaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cggcggctat 300 gattatgatg tgagcttttt tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagcagc 360 <210> 132 <211> 120 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 132 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 133 <211> 360 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 133 gaagtgaaac tggaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cggcggctat 300 gattatgatg tgagcttttt tgattattgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagcagc 360 <210> 134 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 134 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu His 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 135 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 135 gatattgtgc tgacccagac caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat accagccgct ttcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacat 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcaacaccc tgccgtatac ctttggcggc 300 ggcacc 306 <210> 136 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 136 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu His 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 137 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 137 gatattgtgc tgacccagac caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttattat accagccgct ttcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacat 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcaacaccc tgccgtatac ctttggcggc 300 ggcacc 306 <210> 138 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 138 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 139 <211> 363 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 139 caggtgaaac tggaagaaag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cgatggctat 300 tattatggca ccacctggta ttttgatgtg tggggcgcgg gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 140 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 140 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 141 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 141 gatattgtgc tgacccagac caccagcagc ctgagcgcga gcctgggcga tcgcgtgacc 60 attagctgcc gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120 gatggcacca ttaaactgct gatttattat accagccgcc tgcatagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tatagcctga ccattagcaa cctggaacag 240 gaagatattg cgacctattt ttgccagcag ggcagcaccc tgccgcgcac ctttggcggc 300 ggcacc 306 <210> 142 <211> 121 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 142 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 143 <211> 363 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 143 gaagtgcagc tgcagcagag cggcccgggc ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc ggctatggcg tgaactgggt gcgccagccg 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcatg atttggggcg atggcagcac cgattataac 180 agcgcgctga aaagccgcct gagcattagc aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg 240 aaaatgaaca gcctgcagac cgatgatacc gcgcgctatt attgcgcgcg cgatggctat 300 tattatggca ccacctggta ttttgatgtg tggggcgcgg gcaccaccgt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 144 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 144 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 <210> 145 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 145 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn 1 5 10 <210> 146 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 146 Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 147 <211> 13 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 147 Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 148 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 148 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 149 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 150 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 151 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 151 Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Pro Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 152 Gln Gln Gly Asn Met Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 153 Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Ser Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 154 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ile Asn Arg His Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 155 Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 156 Phe Gln Gly Thr His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 157 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 158 <211> 335 <212> PRT <213> CANINE <400> 158 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 159 <211> 1005 <212> DNA <213> CANINE <400> 159 gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300 agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaagcg 360 gcgggagcac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420 agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480 atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540 cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600 aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660 actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720 cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005 <210> 160 <211> 106 <212> PRT <213> CANINE <400> 160 Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 161 <211> 318 <212> DNA <213> CANINE <400> 161 ggccagccga aagcgagccc gagcgtgacc ctgtttccgc cgagcagcga agaactgggc 60 gcgaacaaag cgaccctggt gtgcctgatt agcgattttt atccgagcgg cgtgaccgtg 120 gcgtggaaag cggatggcag cccggtgacc cagggcgtgg aaaccaccaa accgagcaaa 180 cagagcaaca acaaatatgc ggcgagcagc tatctgagcc tgaccccgga taaatggaaa 240 agccatagca gctttagctg cctggtgacc catgaaggca gcaccgtgga aaaaaaagtg 300 gcgccggcgg aatgcagc 318 <210> 162 <211> 335 <212> PRT <213> FELINE <400> 162 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln 145 150 155 160 Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 195 200 205 Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala 225 230 235 240 Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln 260 265 270 Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser 275 280 285 Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 163 <211> 1005 <212> DNA <213> FELINE <400> 163 gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60 gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120 tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180 gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240 ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300 acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgagatg 360 cttggaggac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420 cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480 atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540 cagttcaaca gcacctaccg tgtggtcagt gtcctcccca tcctacacca ggactggctc 600 aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660 accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720 caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780 cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840 acgaccccgc cccagctgga cagcgacggg acctacttcg tgtacagcaa gctctcggtg 900 gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960 cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005 <210> 164 <211> 110 <212> PRT <213> FELINE <400> 164 Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp 1 5 10 15 Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln 65 70 75 80 Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Leu Val Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu 100 105 110 <210> 165 <211> 110 <212> PRT <213> FELINE <400> 165 Arg Ser Asp Ala Gln Pro Ser Val Phe Leu Phe Gln Pro Ser Leu Asp 1 5 10 15 Glu Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Ile Val Cys Ile Leu Asn Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Glu Val Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Val Gln 35 40 45 Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ser Thr Thr Glu Gln Asn Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Gln 65 70 75 80 Ser His Glu Lys Phe Ser Cys Glu Val Thr His Lys Ser Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Leu Val Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Glu 100 105 110 <210> 166 <211> 336 <212> DNA <213> FELINE <400> 166 cggagtgatg ctcagccatc tgtctttctc ttccaaccat ctctggacga gttacataca 60 ggaagtgcct ctatcgtgtg catattgaat gacttctacc ccaaagaggt caatgtcaag 120 tggaaagtgg atggcgtagt ccaaaacaaa ggcatccagg agagcaccac agagcagaac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacga tgtccagtac ggagtaccaa 240 agtcatgaaa agttctcctg cgaggtcact cacaagagcc tggcctccac cctcgtcaag 300 agcttccaga ggagcgagtg tcagagagag tgatga 336 <210> 167 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 167 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 168 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 168 Thr Thr Arg Leu Gln Ala 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 169 Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 170 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 170 Thr His Ser Leu His Asn 1 5 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 171 Thr Ser Ser Leu His Gly 1 5 <210> 172 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 172 Thr Ser Ser Leu His Gln 1 5 <210> 173 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 173 Thr Ser Ser Leu His Val 1 5 <210> 174 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 174 Thr Ala Ser Leu His Gln 1 5 <210> 175 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 175 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Thr Arg Leu Gln Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 176 <211> 306 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 176 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga gcccgggcga accggcgagc 60 attagctgca aagcgagcca ggatattaac cattatctga actggtttcg ccagaaaccg 120 gatggcaccg tgaaactgct gatttatacc acccgcctgc aggcgagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctgc gcattagccg cgtggaagcg 240 gatgatgcgg gcgtgtatta ttgccagcag ggcgatcatt ttccgcgcac ctttggccag 300 ggcacc 306 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Y-(X6)-S-(X7) -(X8)-H-S <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> REPLACE= Ior T <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> REPLACE= R or S <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> REPLACE= L or F <400> 178 Tyr Xaa Ser Xaa Xaa His Ser 1 5 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> (X9) -(X10) -(X11) -(X12) -(X13) -(X14)-P-(X15) -(X16) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> REPLACE= Q or H <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> REPLACE= Q or R <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> REPLACE= G or A <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> REPLACE= D,S,T or N <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> REPLACE= H,T or M <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> REPLACE= F, L or S <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> REPLACE= R,Y, or G <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> REPLACE= T or P <400> 179 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 1 5 <210> 180 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> (X1)-A-S-Q-(X2)-I-(X3) -(X4) -(X5)-L-N <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> REPLACE= K or R <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> REPLACE=S or D <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> REPLACE=N or S <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> REPLACE=H or N <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> REPLACE=Y or N <400> 180 Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Leu Asn 1 5 10 <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> T-(X6) -(X7)-L-(X8) -(X9) <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> REPLACE= T,H,S, or A <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> REPLACE= R or S <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> REPLACE= Q or H <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> REPLACE= A,Q,G or V <400> 181 Thr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> (X10) -(X11) -(X12) -(X13) -(X14) -(X15)-P-(X16) -(X17) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> REPLACE= Q or H <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> REPLACE= Q or R <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> REPLACE= G or A <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> REPLACE= D,S,T or N <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> REPLACE= H,T or M <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> REPLACE= F,L or S <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> REPLACE=R,Y or G <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> REPLACE= T or P <400> 182 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 1 5 <210> 183 <211> 102 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> RECOMBINANT <400> 183 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Arg Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Thr Arg Leu Gln Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp His Phe Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 100 <210> 184 <211> 335 <212> PRT <213> CANINE <400> 184 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 185 <211> 1005 <212> DNA <213> CANINE <400> 185 gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60 agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120 tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180 ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240 ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300 agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaagcg 360 gcgggagcac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420 agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480 atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540 cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600 aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660 actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720 cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780 cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840 accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900 gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960 cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005

Claims

신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서,
a. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
i. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1);
ii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2);
iii. 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3); 및
b. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
i. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1):
(X1)-A-S-Q-(X2)-I-(X3)-(X4)-(X5)-L-N(서열번호 177) 여기서:
X1은 K 또는 R을 포함하고,
X2는 S 또는 D를 포함하고,
X3은 N 또는 S를 포함하고,
X4는 H 또는 N을 포함하고,
X5는 Y 또는 N을 포함함; 및
ii. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2):
Y-(X6)-S-(X7)-(X8)-H-S(서열번호 178) 여기서:
X6은 I 또는 T를 포함하고
X7은 R 또는 S를 포함하고
X8은 L 또는 F를 포함함; 및
iii. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3):
(X9)-(X10)-(X11)-(X12)-(X13)-(X14)-P-(X15)-(X16) 서열번호 179 여기서
X9는 Q 또는 H를 포함하고,
X10은 Q 또는 R을 포함하고,
X11은 G 또는 A를 포함하고,
X12는 D, S, T 또는 N을 포함하고,
X13은 H, T 또는 M을 포함하고,
X14는 F, L 또는 S를 포함하고,
X15는 R, Y 또는 G를 포함하고,
X16은 T 또는 P를 포함함; 및
상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 항원 결합 단백질.
신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서,
a. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
i. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1);
ii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2);
iii. 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3); 및
b. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
i. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1):
(X1)-A-S-Q-(X2)-I-(X3)-(X4)-(X5)-L-N(서열번호 180) 여기서:
X1은 K 또는 R을 포함하고,
X2는 S 또는 D를 포함하고,
X3은 N 또는 S를 포함하고,
X4는 H 또는 N을 포함하고,
X5는 Y 또는 N을 포함함; 및
ii. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2):
T-(X6)-(X7)-L-(X8)-(X9)(서열번호 181) 여기서:
X6은 T, H, S 또는 A를 포함하고,
X7은 R 또는 S를 포함하고,
X8은 Q 또는 H를 포함하고,
X9는 A, Q, G 또는 V를 포함함; 및
iii. 다음을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3):
(X10)-(X11)-(X12)-(X13)-(X14)-(X15)-P-(X16)-(X17)(서열번호 182)
여기서
X10은 Q 또는 H를 포함하고,
X11은 Q 또는 R을 포함하고,
X12는 G 또는 A를 포함하고,
X13은 D, S, T 또는 N을 포함하고,
X14는 H, T 또는 M을 포함하고,
X15는 F, L 또는 S를 포함하고,
X16은 R, Y 또는 G를 포함하고,
X17은 T 또는 P를 포함함; 및
상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 항원 결합 단백질.
신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서,
a. 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
i. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1);
ii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2);
iii. 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3); 및
b. 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(VL):
i. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 8을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
ii. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 10을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 11을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 12를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
iii. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 13을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 14를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 15를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
iv. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 16을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1
2. 서열번호 17을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2
3. 서열번호 18을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
v. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 19를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 20을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 21을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
vi. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 22를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 23을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 24를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
vii. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 25를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 26을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 27을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
viii. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 28을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 29를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 30을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
ix. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 31을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 32를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 33을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
x. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 34를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 35를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 36을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
xi. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 37을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 38을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 39를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
xii. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 40을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 41을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 42를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
xiii. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 43을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 44를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 45를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
xiv. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 46을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 47을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 48을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
xv. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
1. 서열번호 167을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
2. 서열번호 168을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
3. 서열번호 169를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
상기 항원 결합 단백질의 임의의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 또는 제3항에 있어서,
a. 가변 중쇄가 다음을 포함하고:
i. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
ii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
iii. 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
b. 가변 경쇄가 다음을 포함하고:
i. 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
ii. 서열번호 8을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
iii. 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환를 갖는 이의 임의의 변이체인, 항원 결합 단백질.
제1항 또는 제3항에 있어서,
a. 가변 중쇄가 다음을 포함하고:
i. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1
ii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
iii. 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
b. 가변 경쇄가 다음을 포함하고:
i. 서열번호 13을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
ii. 서열번호 14를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
iii. 서열번호 15를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체인, 항원 결합 단백질.
제2항 또는 제3항에 있어서,
a. 가변 중쇄가 다음을 포함하고:
i. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1
ii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
iii. 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
b. 가변 경쇄가 다음을 포함하고:
i. 서열번호 167을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
ii. 서열번호 168을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
iii. 서열번호 169를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
상기 항원 결합 단백질의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 영역 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체인, 항원 결합 단백질.
신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서,
a. 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및
b. 서열번호 51; 서열번호 53; 서열번호 55; 서열번호 57; 서열번호 59; 서열번호 61; 서열번호 63; 서열번호 65; 서열번호 67; 및 서열번호 175로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및
상기 항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역 중 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 항원 결합 단백질.
신경 성장 인자(NGF)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질로서,
a. 서열번호 85 또는 서열번호 92로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및
b. 서열번호 87, 서열번호89, 서열번호 또는 서열번호 94로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 및
상기 항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역 중 하나에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 종분화되는 것인, 항원 결합 단백질.
제9항에 있어서, 상기 종분화된 항원 결합 단백질이 개화, 고양이화 또는 인간화된 항원 결합 단백질인, 항원 결합 단백질.
제10항에 있어서, 상기 종분화된 항원 결합 단백질이 개화된 것인, 항원 결합 단백질.
제10항에 있어서, 상기 종분화된 항원 결합 단백질이 고양이화된 것인, 항원 결합 단백질.
제10항에 있어서, 상기 종분화된 항원 결합 단백질이 인간화된 것인, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합이 NGF와 TrkA 사이의 결합을 억제하는 것인, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 NGF의 생물학적 기능을 억제하는 것인, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 NGF-관련 장애를 감소시키거나 제거하는 것인, 항원 결합 단백질.
제16항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 심혈관계 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 대사 증후군, 통증 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항원 결합 단백질.
제17항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 통증인, 항원 결합 단백질.
제18항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 통증 장애이고 골관절염 통증, 류마티스성 관절염 통증, 수술 및 수술후 통증, 절개 통증, 일반 염증성 통증, 암 통증, 외상 통증, 신경병성 통증, 신경통, 당뇨병성 신경병증 통증, 류마티스 질환과 연관된 통증, 근골격계 질환과 연관된 통증, 내장 통증, 및 위장관 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항원 결합 단백질.
제19항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 골관절염 통증을 포함하는 것인, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 모노클로날 항체; 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 사량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인-특이적 항체, 도메인-결실 항체, 융합 단백질, ScFc 융합 단백질, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, ScFv 단편, Fd 단편, 단일 도메인 항체, dAb 단편, 소형 모듈 면역의약품(SMIP) 나노바디, 및 IgNAR 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항원 결합 단백질.
제21항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 모노클로날 항체인, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질의 치료적 유효량, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 생산하는 숙주 세포.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 보존적 아미노산 치환을 코딩하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는 단리된 핵산.
서열번호 50; 서열번호 52; 서열번호 54; 서열번호 56; 서열번호 58; 서열번호 60; 서열번호 62; 서열번호 64; 서열번호 66; 서열번호 68; 서열번호 86; 서열번호 88; 서열번호 90; 서열번호 93; 서열번호 95; 및 서열번호 176으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 보존적 아미노산 치환을 코딩하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는 단리된 핵산.
제25항 또는 제26항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제27항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제26항 또는 제27항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
제28항 또는 제29항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 항원 결합 단백질을 생산하는 조건 하에 배양하는 단계, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항원 결합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 생산하는 방법.
제30항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 NGF-관련 장애에 대해 대상체를 치료하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 심혈관계 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 비만, 2형 당뇨병, 대사 증후군, 통증 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 통증인, 방법.
제33항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 통증 장애이고 골관절염 통증, 류마티스성 관절염 통증, 수술 및 수술후 통증, 절개 통증, 일반 염증성 통증, 암 통증, 외상 통증, 신경병성 통증, 신경통, 당뇨병성 신경병증 통증, 류마티스 질환과 연관된 통증, 근골격계 질환과 연관된 통증, 내장 통증, 및 위장관 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제34항에 있어서, 상기 NGF-관련 장애가 골관절염 통증을 포함하는 것인, 방법.
제23항의 약제학적 조성물을 투여함으로써 대상체에서 NGF 활성을 억제하는 방법.
제36항에 있어서, 상기 대상체가 개과, 고양이과 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.