KR20230103336A

KR20230103336A - 바이오필름 생성을 억제하는 신규한 항진균용 조성물

Info

Publication number: KR20230103336A
Application number: KR1020210194152A
Authority: KR
Inventors: 이종승; 이동기
Original assignee: (주)앰틱스바이오; 연세대학교 산학협력단; 한국과학기술연구원
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-07-07

Abstract

본 발명의 화합물 및 이를 포함하는 조성물은 진균의 바이오필름 생성 과정에서 가장 중요한 개시 단계의 형태적 변화를 억제하고, 이 과정에 관여하는 HWP1, ALG3, 및/또는 ECE1의 유도를 억제한다.

Description

바이오필름 생성을 억제하는 신규한 항진균용 조성물 {A novel antifungal composition for inhibiting the development of fungal biofilms}

본 발명은 항진균 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 진균의 바이오필름 생성을 억제하는 항진균용 조성물에 관란 것이다.

진균 감염은 동식물 생태계와 인간의 건강을 심각하게 위협하여 농업, 산업 및 공중 보건에서 많은 경제적 손실을 초래한다. 세계 인구의 4분의 1이 표재성 또는 전신성 진균 감염으로 고통받고 있으며, 매년 약 150 만~ 200만 명이 침습성 진균 감염으로 사망하는 것으로 보고되었다. 이러한 진균 감염은 일반적으로 HIV/AIDS, 암, 당뇨병, 호흡기 질환이 있는 환자와 수술 후 및 이식 후 환자에게 영향을 미친다. 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 칸디다 (Candiida) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종과 같은 기회 감염 진균은 가장 심각한 진균 질병을 일으키는 주요 진균 병원체이다. 이들 진균 병원체 중 칸디다(Candida speciese)는 인간에 가장 널리 분포하는 진균 종이다. 대부분의 칸디다 종은 인간의 위장관, 생식기, 구강 및 피부에 무증상으로 서식한다. 그러나 숙주의 건강상태가 정상 상태에서 벗어나는 경우, 이들 칸디다 종은 인간 면역체계의 변화 또는 미생물군의 변화로 인해 감염을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 전신 칸디다증은 칸디다 균 감염이 혈액, 심장, 뇌, 눈, 뼈와 같은 신체의 여러 기관에 순차적으로 감염되는 칸디다증(candidiasis) 한 형태이다. 이러한 전신 칸디다증은 선진국에서 가장 흔한 진균 감염 형태이며, 침습적 특성 때문에 혈류로 진단하는 것이 어렵다. 칸디다 알비칸스(C. albicans)는 칸디다증을 유발하는 대표적인 진균이며, 이의 형태적 변화는 주요 병독성 인자 중 하나이다. 다양한 환경 조건의 변화로 인해 발생하는 이러한 형태적 변화는 병원체의 체내 침투, 성장 및 독성에 매우 중요하다. 또한 이러한 형태적 변화는 곰팡이의 부착능력에 관여하여 균사를 형성한다. 나아가 서로 얽힐 수 있는 구조로 변화하여 세포외기질을 형성하여 칸디다 알비칸스(C. albicans) 바이오필름(biofilm)을 형성한다. 이에 따라, 칸디다 알비칸스(C. albicans)는 세포 외부로 물질을 내보내고 세포외 기질로 둘러싸인 생존에 유리한 환경을 획득한다.

바이오필름 형성은 미생물의 병원성에 매우 중요한 특성으로 알려져 있다. 특히, 분비된 세포외기질은 약물 내성에 관여한다고 보고되어 있다. 따라서 바이오필름 생성의 억제는 항진균용 약물 개발의 표적이 되고 있다. 현재 임상에서 아졸(azole)과 에키노칸딘(echinocandin)이 칸디다증 치료에 주로 사용되고 있으나, 바이오필름의 생성을 효과적으로 억제하거나 제거하지 못하는 것으로 알려졌다. 이에 본 발명자들은 진균의 바이오필름 생성을 억제하는 약물을 개발하고자 부단히 노력한 결과, 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 화합물 및 이를 포함하는 조성물은 진균 바이오필름 생성 과정에서 가장 중요한 개시 단계의 형태적 변화를 억제하고, 이 과정에 관여하는 HWP1, ALG3, 및/또는 ECE1의 유도를 억제한다.

한국특허등록 제10-2286897호

Genetic control of Candida albicans fiofilm development, Finkel and Mitchell, Nat Rev Microbiol 2011 9(2) Fungal Cell Wall Proteins and Signaling Pathways Form a Cytoprotective Network to Combat Stresses, Chibuike Ibe and Carol A., J. Fungi 2021, 7, 739.

본 발명의 목적은 바이오필름 생성을 억제하는 화합물 및 이를 포함하는 항진균 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 바이오필름 생성과 관련된 진균 유전자 HWP1, ALG3, 및/또는 ECE1의 발현을 억제하는 화합물 및 이를 포함하는 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항진균용 화합물을 포함하는, 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항진균용 화합물을 포함하는, 인간을 제와한 동물의 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물 및 진균 감염증 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항진균용 화합물을 포함하는, 식물에서 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항진균용 화합물을 포함하는, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 진균의 바이오필름 생성을 억제하는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 거울상이성질체 또는 광학이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체 또는 호변이성질체(tautomer), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 부형제를 포함하는 항진균용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C_1-6알킬이고,

X는 할로겐기 (단, 상기 할로겐기는 -F를 제외한다), 할로겐화 C_1-6알킬기 및 할로겐화 C_1-6알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 같거나 상이한 m개(m은 1 내지 5의 정수)의 치환기이다).

이와 관련된 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1에서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C_1-6알킬이고, X는 3,4-Cl인 것인, 항진균용 조성물을 제공한다.

이와 관련된 다른 일 실시예에서, 본 발명은 진균의 바이오필름 생성에 관여하는 유전자로서 HWP1, ALG3 및 ECE1로 구성된 유전자 중 하나 이상의 발현을 조절하는 것인 항진균용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 항진균용 조성물을 포함하는, 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 진균 감염증은 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아우리스(Candida auris), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 및 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 진균 종(sepcies)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 진균 감염증은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 항진균용 조성물은 진균의 바이오필름 생성을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 인간, 동물 및 식물에서 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 화합물 처리에 따른 바이오필름 생성을 억제를 현미경으로 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 화합물 처리에 따른 바이오필름 생성 변화를 OD 값으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 RPMI-1640 배지에서 칸디다 알비칸스의 균사 성장에 대한 본 발명의 화합물의 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 한천 배지에서 칸디다 알비칸스의 균사 성장에 대한 본 발명의 화합물의 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 화합물이 C. albicans의 효모-균사 전환 및 균사 성장에 관여하는 유전자의 발현을 저해 하는지 여부를 확인한 결과이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 기술한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

1. 재료 및 방법

1-1. 본 발명의 화합물 구조 및 합성

본 발명의 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.

상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C_1-6알킬이고,

X는 할로겐기 (단, 상기 할로겐기는 -F를 제외한다), 할로겐화 C_1-6알킬기 및 할로겐화 C_1-6알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 같거나 상이한 m개(m은 1 내지 5의 정수)의 치환기이다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 카이랄성 탄소에 결합된 치환기의 3차원 배열구조에 제한이 없는 화합물로서, 구조적으로 가능한 모든 광학 이성질체 또는 거울상 이성질체 화합물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이의 (R) 또는 (S) 이성질체 단독으로, 또는 이들의 혼합물, 예컨대, 라세미체의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 입체이성질체, 부분입체이성질체 또는 호변이성질체(tautomer)로 제공될 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐 아니라 이로부터 제조될 수 있는, 동일한 효능을 나타내는 용매화물이나 수화물 모두 본 발명의 범주 내로 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물 1의 합성은 본 출원인의 선행특허인 한국특허등록 제10-2282897호 상세히 기술되어 있다. 구체적으로 본 발명의 화합물을 합성하기 위한 반응식은 아래와 같다.

[반응식 a] - 부톡시카보닐 보호기(Boc protecting group)의 도입

노르루신(1.0 당량), Boc 무수물(1.5 당량), 소듐바이카보네이트(1.5 당량)을 증류수와 메탄올 1:1 혼합 용매에 녹여 실온에서 36-48시간 동안 반응시켰다. 혼합물을 진공상태에서 농축시킨 후, 1.0 M 염산으로 물 층의 pH를 2로 조절하였다. 이후, 에틸아세테이트로 추출하여 수득한 유기층의 수분을 소듐 설페이트로 제거하고 진공에서 용매를 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다.

[반응식 b] - 아민기의 메틸레이션

상기 [반응식 a]로부터 수득한 화합물(1.0 당량)과 아이오도메탄(10 당량)을 테트라하이드로퓨란 용매에 녹이고 소듐 하이드라이드(10 당량)를 0℃에서 아주 천천히 적가하였다. 상기 반응물을 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 에테르 용매로 희석하고 증류수를 첨가하였다. 20% 시트릭 애시드 용액으로 물 층의 pH를 2로 맞추었다. 이후, 에틸아세테이트로 추출하여 수득한 유기층의 수분을 소듐 설페이트로 제거하고 진공에서 용매를 증발시켰다. 수득한 잔류물을 실리카겔을 사용하는 크로마토그래피를 통해 분리, 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

[반응식 c] - 일차아민기 상에서 Boc 보호기의 도입

4-브로모페네틸아민(1.0 당량)을 다이메틸클로라이드 용매에 녹인 후, 포타슘카보네이트(1.5 당량), Boc 무수물(1.05 당량)을 넣고, 실온에서 12-18시간 정도 반응을 진행시켰다. 반응 혼합물을 다이메틸클로라이드에 희석시키고 증류수로 두 번 세척하였다. 유기층을 소듐 설페이트로 건조한 뒤 진공에서 농축하였다. 수득한 잔류물을 헥세인으로 세척한 후, 진공상태에서 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다.

[반응식 d] - 바이페닐아민 염산염 유도체의 합성

상기 [반응식 c]로부터 수득한 화합물, tert-부틸 (4-브로모벤질)카바메이트 또는 tert-부틸 (4-브로모페닐)카바메이트(1.0 당량)와 벤젠보론산(1.5 당량), 소듐 카보네이트(5.0 당량), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0.04 당량)을 탈가스화(degassing)한 톨루엔과 증류수의 2:1 내지 2.5:1 혼합 용매에 녹여 140℃의 온도로 12-18시간 정도 역류 반응시켰ㄴ다. 반응 후, 셀라이트로 여과하여 촉매를 제거하고, 여과된 유기층은 진공상태에서 용매를 증발시켰다. 수득한 잔류물을 실리카겔을 사용하는 크로마토그래피를 통해 분리, 정제하였다. 정제된 결과물을 에틸아세테이트 용매에 녹인 후 4.0 M 염산(6.0-10.0 당량)을 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 수득한 염 형태의 흰 고체는 에틸아세테이트로 세척한 후, 진공상태에서 완전히 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.

[반응식 e] - 혼합 무수물 결합(MAC) 반응

증류된 테트라하이드로퓨란 용매에 상기 [반응식 a]에 따라 합성한 화합물 또는 [반응식 b]에 따라 합성한 화합물(1.0 당량), N-메틸몰폴린(N-methylmorpholine; NMM, 2.5-2.8 당량)을 넣고 15분 동안 교반한 후, 아이소부틸클로로포르메이트(isobutyl chloroformate; IBCF, 1.3 당량)을 첨가한 후 15분 더 교반한 후, 상기 [반응식 d]로부터 수득한 화합물(1.05 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 3-5시간 정도 반응을 진행시켰다. 혼합물을 여과하여 진공상태에서 용매를 증발시켰다. 수득한 잔류물을 실리카겔을 사용하는 크로마토그래피를 통해 분리, 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

[반응식 f] - Boc 보호기의 제거

상기 [반응식 e]로부터 수득한 화합물 유도체(1.0 당량)를 에틸아세테이트 용매에 녹인 후 4.0 M 염산(6.0-10.0 당량)을 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 수득한 염 형태의 흰 고체를 에틸아세테이트로 세척한 후, 진공상태에서 완전히 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.

[반응식 g] - 아민기의 다이메틸레이션

상기 [반응식 f]로부터 수득한 화합물(1.0 당량)을 메탄올에 녹이고, 트리에틸아민(6.0 당량)을 첨가한 후, 포름알데하이드(37% by weight solution, 1.0-2.5당량)와 10% 팔라듐 촉매(0.1-0.5당량)를 차례로 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 셀라이트로 여과하여 촉매를 제거하고, 여과된 유기층은 진공상태에서 증발시켜 흰 고체를 얻었다. 얻어진 결과물을 메탄올과 다이에틸에테르로 재결정하여 표제 화합물을 수득하였다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산가염이 유용하다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 화학식 1의 화합물과 동등한 약리활성을 나타내는, 예컨대, 항진균 활성을 나타내는 화학식 1의 화합물의 염이면 제한없이 모두 사용 가능하다.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 입체이성질체, 부분이성질체, 거울상이성질체, 광학이성질체, 호변이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항진균용 조성물을 제공한다. 이와 관련된 또 다른 양태로서, 본 발명은 진균의 바이오필름 생성을 억제하는 항진균용 조성물을 제공한다. 이와 관련된 또 다른 일 구현예에서, 본 발명은 진균의 바이오필름 생성과 관련된 유전자 HWP1, ALG3, 및/또는 ECE1의 발현을 억제하는 항진균용 조성물을 제공한다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 기회 감염성 진균류에 대한 항진균 활성을 발휘할 수 있으므로, 항진균 조성물로 사용될 수 있으며, 나아가 진균 감염 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "예방"은 상기 약학 조성물의 투여로 대상 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 상기 약학 조성물의 투여로 대상 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

예컨대, 본 발명의 약학적 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 진균 감염 질환의 비제한적인 예에는 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아우리스(Candida auris), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 균에 의한 감염 질환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 진균 감염 질환은 칸디다 알비칸스 균에 의한 진균 감염증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 항진균용 조성물은 유효성분으로서 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있고, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 일 구현예에서, 본 발명의 상기 화합물은 바람직하게는 국소 또는 경구 투여된다. 국소 투여될 경우, 본 발명의 화합물의 치료 유효량은 0.00001 내지 약 20%(w/w), 바람직하게는 0.001 내지 3% 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 경구 투여될 경우, 본 발명의 상기 화합물의 치료 유효량은 0.01 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 내지 약 300 mg/kg 일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 진균 감염 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 본 발명의 항진균용 조성물이 투여되는 개체는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 항진균 활성을 통해 진균 감염에 의해 유도되는 질환의 치료 효과를 나타내는 것이므로, 기존의 치료제와 병행하여 투여함으로써 시너지적인 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 아미노알칸산에 바이페닐기를 도입한 유도체 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미한다.

1-2. 균주 (strain) 정보

칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 균주를 YPD배지(Sigma-Aldrich)에서 배양하였다. Candida albicans SC5314 균주(연세대학교 반용선 교수로부터 분양)는 바이오필름 분석, 균사 분석 및 유전자 발현 분석을 포함한 시험관 내 분석에 사용되었다. ATCC90028 균주는 생체 내 약물 효능 시험을 위한 마우스 감염에 사용되었다.

1-3. 바이오필름 분석 (Biofilm assay)

Candida albicans SC5314 세포를 30 ℃에서 2 ㎖의 YPD배지에서 하룻밤 배양하였다. 세포를 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich)에 최종 농도 10⁶cells/㎖로 현탁하고, 200 μL의 현탁액을 약물 처리 유무에 관계없이 평평한 바닥 96웰 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 90분 동안 인큐베이션하고 PBS로 3회 세척하였다. 다음, 37 ℃에서 웰에 바이오필름으로 남아 있는 세포에 대해 200 ㎕의 신선한 RPMI 1640으로 추가로 인큐베이션했습니다. 24시간 후, 웰의 바닥면을 현미경(장비명, 제조사)으로 촬영하고 OD를 플레이트 판독기에서 측정했다. 각 데이터 포인트는 독립적인 실험을 나타낸다.

1-4. 효모-균사 전환 분석 (yeast-to-hyphae switching assay)

밤새 배양된 SC5314 세포를 신선한 YPD에 접종하고 OD600이 0.8에 도달할 때까지 30 ℃ 진탕 인큐베이터에서 추가로 인큐베이션하였다. 배양된 세포를 PBS로 3회 세척하고 PBS에 희석된 50% RPMI-1640에 재현탁시켰다. 샘플을 각 시점에서 2% 포르말린으로 고정하였다.

1-5. 플레이트에서 균사 성장 분석 (Hyphal growth assay on plate)

Candida albicans SC5314 세포를 30 ℃, 2 ㎖의 YPD 배지에서 밤새 배양하였다. 세포를 계수하고, 10,000개의 세포를 60 ㎜ 플레이트 (#10060, SPL, 한국) 내에 5 ㎖ 10% FBS 한천 배지내로 접종하였다. 플레이트를 37 ℃에서 24시간 더 인큐베이션하였다.

1-6. 발현 분석 (expression analysis)

Candida albicans SC5314 세포를 신선한 YPD에 접종하고 OD600이 0.8에 도달할 때까지 30 ℃, YPD 배지에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 YPD 내 10% FBS로 재현탁 한 후 37 ℃에서 추가로 인큐베이션하고 각 시점별로 샘플링하였다. 총 RNA를 추출하고 qRT-PCR을 위한 cDNA를 합성에 사용하였다. 각 유전자의 Ct 값은 하우스키핑 유전자(ACT1, EFB1 및 PMA1)의 Ct 값으로 정상화하였다. 상대적 발현을 t = 0에서의 발현 수준과 비교한 폴딩-변화(fold-change)로 나타냈다. 통계적 유의성은 Turkey 가설 검정에 의한 일원 ANOVA 분석으로 분석하였다. (*<0.05, **<0.005 각 기초 발현 대비)

1-7. 칸디다증 동물모델에서 생체 내 약물 효능 시험

Candida albiancs ATCC90028 세포를 7주령 수컷 ICR 마우스(오리엔트바이오, 한국)의 꼬리 정맥에 접종 (마우스당 2 ⅹ 10⁶ 세포) 하였다. 양성대조로서 플루코나졸(Fluconazole, FCZ)을 경구 투여하였다. 통계는 Prism 8.0을 이용하여 Log-rank(Mantel-Cox) test로 계산하였다.

2. 결과

2-1. 본 발명의 화합물 처리에 따른 C. albicans 바이오필름 생성 억제

CLSI 가이드라인 따른 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 테스트를 RPMI-1640 기반 배지에서 수행하였다. C. albicans에 대한 본 발명의 화합물의 MIC 값은 약 4 ㎍/㎖ 였다. 본 발명의 화합물은 C. albicans의 성장뿐만 아니라 바이오필름 생성도 억제하는 것으로 확인되었다. 이에 본 발명의 화합물 처리에 따른 C. albicans 바이오필름 변화를 측정하기 위해 C. albicans의 바이오필름 분석을 수행하였다. 바닥이 평평한 배양접시에서 C. albicans의 성장을 현미경(Nikon, eclipse Ti)으로 관찰한 결과, 본 발명의 화합물 처리가 바이오필름 생성을 억제한 것을 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타냈다. 또한 광학 밀도를 통해 바이오필름 생성을 정량적으로 측정하고 비교하였다 (도 2 참조).

2-2. 본 발명의 화합물 처리에 따른 바이오필름 생성의 지연

효모에서 균사로의 전환은 C. albicans의 주요 병독성 중 하나이며, 이러한 이형성은 세포외 분비 및 부착에 관여하는 단백질과 함께 바이오필름 생성의 핵심 요소이다. 이에 본 발명자들은 C. albicans의 효모에서 균사로의 전이와 균사 성장에 대한 본 발명의 화합물의 효과를 조사하였다. 액체 배지에서 효모-균사로의 전환은 매우 빠르게 진행되었다. PBS에 50%로 희석한 RPMI-1640 배지에서 30분 내에 균사가 생성되기 시작하였으며, 이후 균사 생장이 활발하게 수행됨을 확인하였다 (도 3, 상부 패널). 특히, 이러한 변화는 균사에 의한 긴 세포 형태로 인해 세포가 가라앉을 때 더 부서지기 쉬우며, 응집 없이 표면에서 돌출되는 것으로 관찰되었다 (도 3, 하부 패널). 반면에, 본 발명의 화합물 처리군에서는 효모에서 균사로의 전환이 비교적 느리게 발생하였다. 특히, 본 발명의 화합물을 MIC 농도 (4 ㎍/㎖)로 처리한 경우, 미처리군에 비해 약 1시간 정도 변화가 느린 것으로 나타났다 (도 3). 이 지연은 고체 배지에서 보다 더 명확하게 관찰되었다. 소태아혈청을 첨가한 한천 (agar) 배지에서 C. albicans는 균사 생장과 효모세포 증식이 활발하여 콜로니 밖으로 성장하였다 (도 4). 반면에 본 발명의 화합물을 처리한 플레이트에서는 균사 성장이 억제되었다 (도 4). 특히, 본 발명의 화합물을 고농도로 처리한 군에서는 콜로니의 크기가 작았고, 효모에서 균사로의 전이가 전혀 일어나지 않았다. 이러한 현상은 농도 의존적으로 확인되었으며 플루코나졸에서도 유사하게 관찰되었다 (도 4). 결론적으로, 본 발명의 화합물은 C. albicans의 효모에서 균사로의 전이를 억제하여 바이오필름 개시를 억제하는 효과가 있었다.

2-3. 본 발명의 화합물(22h)의 균사 성장 관련 유전자 발현 억제

C. albicans의 효모-균사 전환 및 균사 성장에 관여하는 유전자는 이전 연구를 통해 보고된 바 있다. 먼저, C. albicans의 약물에 대한 반응은 다중 약물 수송체를 코딩하는 CDR1 및 CDR2 유전자의 유도에 의해 확인되었다 (도 5A). 유사하게, 유착에 관여하는 EFG1 유전자의 발현은 혈청 유도 하에서 부분적으로 증가하였지만, 화합물 (22h) 처리에 의해서는 변화가 없었다 (도 5B). 바이오필름 생성 개시와 관련된 광범위한 범주에서 TEC1, BCR1, ALS3, HWP1 및 ECE1의 유전자 발현 수준이 혈청 유도에 의해 증가되었다 (도 5C). ALS3, HWP1 및 ECE1의 발현 유도가 화합물 22h 처리에 의해 억제되었다 (도 5C). 혈청에 의해 발현이 유도된 유전자 중에서 이들 3개 유전자만 그 발현 수준이 감소하였다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물 22h가 C. albicans의 혈청 유도 조건에서 ALS3, HWP1 및 ECE1의 유전자 발현 억제를 통해 바이오필름 생성 개시를 억제함을 뒷받침한다.

2-4. C. albicans 전신 감염 마우스 모델에서 화합물(22h) 효능

본 발명의 화합물(22h)가 C. albicans의 전신 감염에 효과적인지 여부를 확인하였다. 마우스 전신 감염 모델은 정맥주사를 통해 많은 수의 C. albicans 세포를 마우스에 주입하여 유도하였다. ICR 마우스(7주령 암컷, 군당 7마리)에 C. albicans 2 x 10⁶cells를 투여하여 모든 마우스사 1주 내에 사망하도록 하였다. 본 발명의 화합물 투여군에 대한 양성대조군으로서 플루코나졸을 경구 투여한 후 치료 효능을 확인하였다. 본 발명의 화합물(22h)은 용량 의존적으로 생존력 증가를 보여주었다. 특히, 화합물 22h를 20 mpk 또는 30 mpk 경구 처리한 경우, 전신 칸디다증이 유도된 마우스의 생존이 유의성 있게 증가하였다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 칸디다 알비칸의 바이오필름 생성의 개시를 지연시키고 바이오필름을 억제할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 칸디다 알비칸에 의한 카디다증의 치료에 이용될 수 있다.

Claims

진균의 바이오필름 생성을 억제하는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 거울상이성질체 또는 광학이성질체, 입체이성질체, 부분입체이성질체 또는 호변이성질체(tautomer), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 부형제를 포함하는 항진균용 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C_1-6알킬이고,
X는 할로겐기 (단, 상기 할로겐기는 -F를 제외한다), 할로겐화 C_1-6알킬기 및 할로겐화 C_1-6알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 같거나 상이한 m개(m은 1 내지 5의 정수)의 치환기이다).
제1항에 있어서,
상기 바이오필름 생성의 억제는 HWP1, ALG3 및 ECE1로 구성된 진균 유전자의 하나 이상의 발현을 조절하는 것에 의한 것인, 항진균용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 화학식 1에서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C_1-6알킬이고, X는 3,4-Cl인 것인, 항진균용 조성물.
제1항 또는 제2항의 항진균용 조성물을 포함하는, 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 진균 감염증이 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아우리스(Candida auris), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 및 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 진균 종(sepcies)에 의한 것인, 항진균용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 진균 감염증이 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의한 것인, 항진균용 조성물.
제1항 또는 제2항의 항진균용 조성물을 포함하는, 인간을 제외한 동물에서 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물.
제1항 또는 제2항의 항진균용 조성물을 포함하는, 식물에서 진균 감염증의 예방, 치료 또는 예방 및 치료를 위한 항진균용 조성물.
제1항 또는 제2항의 항진균용 조성물을 포함하는, 화장료 조성물.