KR20230103168A

KR20230103168A - Manufacturing method of erythrobacter sp. strain sdw2 producing a novel yellow xanthophyll carptenoid and the method for xanthophyll carotenoid overproduction using this strain

Info

Publication number: KR20230103168A
Application number: KR1020210193830A
Authority: KR
Inventors: 최용준; 정선욱
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-07-07

Abstract

본 발명은 우수한 항산화능을 나타내는 신규 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 신규한 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주를 제공하고 상기 균주를 배양하여 이로부터 신규 잔토필 카로테노이드를 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 신종 SDW2 균주가 생산하는 신규 잔토필 카로테노이드를 포함하는 추출물은 기존 카로테노이드 보다 우수한 항산화능을 나타내므로, 건강보조제, 기능성 화장품, 의약 등에 천연 항산화 원료로써 널리 활용될 수 있다. 또한, SDW2 균주는 상기 카로테노이드의 대량생산 및 상용화를 위한 원천 생물산업 활용소재가 될 수 있다.The present invention provides a novel Erythrobacter sp. SDW2 strain that biosynthesizes novel xanthophyll carotenoids exhibiting excellent antioxidant activity, and relates to a method for mass-producing novel xanthophyll carotenoids therefrom by culturing the strain. Since the extract containing novel xanthophyll carotenoids produced by the novel SDW2 strain provided in the present invention exhibits superior antioxidant activity than conventional carotenoids, it can be widely used as a natural antioxidant raw material for health supplements, functional cosmetics, and medicines. In addition, the SDW2 strain can be a source bioindustry utilization material for mass production and commercialization of the carotenoids.

Description

Marine microorganism Erythrobacter sp. that produces novel xanthophyll carotenoids. SDW2 strain and mass production method of xanthophyll carotenoids using the same {MANUFACTURING METHOD OF ERYTHROBACTER SP. STRAIN SDW2 PRODUCING A NOVEL YELLOW XANTHOPHYLL CARPTENOID AND THE METHOD FOR XANTHOPHYLL CAROTENOID OVERPRODUCTION USING THIS STRAIN}

본 발명은 대한민국 제주시 색달해수욕장 연안 해수로부터 분리된 신규 잔토필 카로테노이드 생산능을 갖는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주 및 이를 이용한 신규 잔토필 카로테노이드 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Erythrobacter sp. SDW2 strain having an ability to produce xanthophyll carotenoids isolated from coastal seawater of Saekdal Beach, Jeju City, Korea, and a novel xanthophyll carotenoid production method using the same.

카로테노이드(Carotenoid)는 8개의 이소프레노이드 (Isoprenoid)로 구성된 생리활성을 가진 유색색소를 의미한다. 현재까지 약 700여 종의 카로테노이드가 발견되었으며, 주로 식물, 곰팡이, 조류, 박테리아등에서 생합성되는 것으로 알려져 있다. 카로테노이드는 그 구조의 골격탄소수에 따라 C₃₀, C₄₀, C₅₀ 계열로 구분되며, 산소 작용기 (oxygenated functional group)의 유무에 따라 카로틴 (carotene) 계열 및 잔토필 (xanthophyll) 계열 카로테노이드로 구분된다. Carotenoids are colored pigments with physiological activity composed of eight isoprenoids. About 700 carotenoids have been discovered so far, and it is known that they are mainly biosynthesized by plants, fungi, algae, and bacteria. Carotenoids are classified into C ₃₀ , C ₄₀ , and C ₅₀ groups according to the number of skeletal carbons in their structure, and classified into carotene and xanthophyll group carotenoids according to the presence or absence of an oxygenated functional group.

현재 상업적으로 이용되는 대표적인 잔토필 카로테노이드는 아스타잔틴(astaxanthin), 루테인(lutein), 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있으며, 이들은 항산화, 항암, 항염 등 인간의 질병 및 건강증진에 유효한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. Representative xanthophyll carotenoids currently used commercially include astaxanthin, lutein, and zeaxanthin, which are believed to have effective functions in promoting human diseases and health, such as antioxidant, anticancer, and anti-inflammatory properties. It is known.

구체적으로, 아스타잔틴은 가장 강력한 항산화제로 붉은색 색소이다. 자외선으로부터 피부를 보호하고 고밀도 지방단백(high-density lipoproteins: HDL)을 증가시키며, 면역 기능성 향상, 구강 암 및 유방 암의 성장을 감소시키는 것으로 알려져 있다.Specifically, astaxanthin is the most powerful antioxidant and is a red pigment. It is known to protect skin from UV rays, increase high-density lipoproteins (HDL), improve immune function, and reduce the growth of oral cancer and breast cancer.

또한, 루테인 및 지아잔틴은 자외선으로부터 눈을 보호하며, 특히 노화와 관련한 눈 질환 연구 결과에서 루테인 및 지아잔틴을 보충했을 때 후기노인성 황반 변성의 악화를 감소시킨다고 알려져 있다. 또한, 백내장과 황반 퇴화를 예방하고, 시각 퇴화 속도를 지연시키는 것으로 알려져 있다.In addition, lutein and zeaxanthin protect the eyes from ultraviolet rays, and in particular, it is known that the deterioration of late age-related macular degeneration is reduced when lutein and zeaxanthin are supplemented in the results of eye disease research related to aging. It is also known to prevent cataracts and macular degeneration and to slow the rate of visual degeneration.

그러나, 화학합성 카로테노이드 소재에 대하여 부작용 및 유해성등의 소비자의 우려가 증대됨에 따라 천연 카로테노이드에 대한 관심이 더욱 증가하고 있는 추세이다. However, as consumers' concerns about side effects and harms of chemically synthesized carotenoid materials increase, interest in natural carotenoids is increasing.

이에, 카로테노이드는 전체 시장의 약 80%의 비중을 차지하고 있는 화학합성 카로테노이드의 대체소재로써 천연 카로테노이드의 생산을 위한 산업 미생물 개발 및 고기능성 신규 카로테노이드 발굴에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. Accordingly, carotenoids are a substitute material for chemically synthesized carotenoids, which account for about 80% of the total market, and research on the development of industrial microorganisms for the production of natural carotenoids and the discovery of new high-functional carotenoids is being actively conducted.

한편, 카로테노이드는 항산화능을 비롯한 카로테노이드 안정성 (stability) 및 생리활성도 (bioactivity)가 카로테노이드 종류에 따라 그 수준의 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 특히, 잔토필계 카로테노이드는 카로틴계 카로테노이드와 유사한 분자구조를 가지고 있으나, 산소원자로 치환된 수소 원자쌍을 가지고 있어, 카로틴계 카로테노이드 보다 더 극성을 띄므로, 체네 흡수율이 높고 카로틴보다 더 우수한 항산화능을 지니는 것으로 알려져 있다. 그 예로써, 대표적인 잔토필계 카로테노이드인 아스타잔틴 (astaxanthin)은 베타카로틴 (β-carotene)보다 약 10배 더 우수한 항산화능을 가진다.Meanwhile, carotenoids are known to show different levels of carotenoid stability and bioactivity, including antioxidant activity, depending on the type of carotenoid. In particular, xanthophyll-based carotenoids have a molecular structure similar to that of carotene-based carotenoids, but have a hydrogen atom pair substituted with an oxygen atom, and are more polar than carotene-based carotenoids, so they have a higher body absorption rate and better antioxidant activity than carotene. It is known to have As an example, astaxanthin, a representative xanthophyll-based carotenoid, has about 10 times more antioxidant activity than beta-carotene.

최근, 해양 유래 미생물로부터 유용 잔토필 카로테노이드를 발굴하고 이를 대량으로 생산하고자하는 연구가 활발히 수행되고 있다. 해양 미생물 유래 잔토필은 해양 미생물의 극한 서식지 (낮은 온도, 고염, 자외선등)로부터 생존하기 위해 합성되는 천연대사물질 중 하나로 우수한 생리활성과 함께 인체에 다양한 기능을 수행한다고 보고된 바 있다. Shindo등은 신규 해양 미생물인 플라보박테리아시애 (Flavobacteriaceae) o4OKA-13-27과 YM6-073균주가 신규 잔토필 카로테노이드인 사프로잔틴 (Saproxanthin)과 믹솔 (mixol)을 생산한다는 것을 발견하였고, 이들은 육상 미생물 유래 잔토필인 지아잔틴보다 약 2.2배 이상 높은 지질산화(lipid oxidation) 억제 활성을 지니는 것을 확인하였다. 또한, 해수에서 발견된 극한환경미생물 데이노코쿠스 종 AJ005균주로부터 아스타잔틴 보다 2배이상 높은 항산화능을 가진 신규 카로테노이드 데이노잔틴이 발견되었다. Recently, studies to discover useful xanthophyll carotenoids from marine-derived microorganisms and to mass-produce them have been actively conducted. Xanthophylls derived from marine microorganisms are one of the natural metabolites synthesized to survive in the extreme habitats of marine microorganisms (low temperature, high salt, ultraviolet rays, etc.), and have been reported to perform various functions in the human body with excellent physiological activity. Shindo et al. found that novel marine microorganisms, Flavobacteriaceae strains o4OKA-13-27 and YM6-073, produced novel xanthophyll carotenoids, saproxanthin and mixol, which It was confirmed that the lipid oxidation inhibitory activity was about 2.2 times higher than that of zeaxanthin, a xanthophyll derived from terrestrial microorganisms. In addition, a new carotenoid, deinoxanthin, having an antioxidant activity twice as high as that of astaxanthin was found from the extreme environmental microorganism Deinococcus sp. strain AJ005 found in seawater.

그러나, 상기 잔토필 카로테노이드를 생산하는 해양 미생물들은 대부분 클로로필 a (chlorophyll a) 및 카로테이드 전구체등 기타 중간대사체 (carotenoid intermediates)를 동시에 생산하므로 목적하는 카로테노이드의 순도가 낮아 추가적인 정제과정을 거쳐야 하며, 이에 따른 생산수율이 매우 낮은 한계가 존재한다. However, since most of the marine microorganisms that produce the xanthophyll carotenoids simultaneously produce other intermediates such as chlorophyll a and carotenoid precursors, the purity of the desired carotenoid is low and requires additional purification. Accordingly, there is a limitation in that the production yield is very low.

따라서, 우수한 항산화능을 갖는 높은 순도의 잔토필을 생산하는 미생물의 발굴은 식품, 화장품, 의약 등 다양한 산업분야에 유용한 용도를 갖는 천연 카로테노이드의 대량 생산에 활용할 수 있고, 공급의 측면에서 높은 경제성 및 상용화에 매우 유리할 것으로 사료된다. 이에, 본 발명자들은 높은 순도, 높은 생산성 및 우수한 항산화능을 가진 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 균주를 발굴하고자 노력하여 신규한 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) 균주를 발견하였다.Therefore, the discovery of microorganisms that produce high-purity xanthophylls with excellent antioxidant activity can be used for mass production of natural carotenoids that have useful uses in various industrial fields such as food, cosmetics, and medicine. It is considered to be very advantageous for commercialization. Accordingly, the present inventors tried to discover a strain biosynthesizing xanthophyll carotenoids with high purity, high productivity, and excellent antioxidant activity, and found a novel Erythrobacter sp. strain.

본 발명의 목적은 우수한 항산화능 및 고순도의 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 신규 미생물을 제공하는 것이며, 구체적으로는 신규 잔토필 카로테노이드를 생산하는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a novel microorganism capable of biosynthesizing xanthophyll carotenoids with excellent antioxidant activity and high purity, and specifically, to provide an Erythrobacter sp. SDW2 strain that produces novel xanthophyll carotenoids.

본 발명의 또 다른 목적은 잔토필 카로테노이드 대량생산을 위한 상기 미생물의 배양 방법 및 잔토필 카로테노이드의 추출 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for culturing the microorganisms and a method for extracting xanthophyll carotenoids for mass production of xanthophyll carotenoids.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제주 색달해수욕장 연안으로부터 해수샘플을 채취하고, Marine agar 배지에서 색소를 띄는 신규 해양 미생물을 순수분리하여 잔토필 카로테노이드 (xanthophyll carotenoid)를 생산할 수 있는 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁된 에리스로박터 종 (Erythrobacter sp.) SDW2 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention collects seawater samples from the coast of Saekdal Beach in Jeju, and purely separates new marine microorganisms with pigments from Marine agar medium to produce xanthophyll carotenoids, Accession No. KACC 81198BP Provided is an Erythrobacter sp. SDW2 strain deposited with .

또한, 본 발명은 배양배지 최적화를 통한 에리스로박터 종 SDW2 균주를 배양하는 단계를 포함하는 잔토필 카로테노이드 (xanthophyll carotenoid) 생산 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing xanthophyll carotenoids comprising culturing an Erythrobacter sp. SDW2 strain through optimization of the culture medium.

또한, 본 발명은 에리스로박터 종 SDW2 균주 또는 상기 균주의 배양액으로부터 얻은 추출물 및 이의 항산화용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides an extract obtained from an Erythrobacter sp. SDW2 strain or a culture medium of the strain, and an antioxidant composition thereof.

본 발명에서 순수분리한 해양 미생물 Erythrobacer sp. SDW2 균주 (이하 SDW2 균주)는 95% 이상의 고순도 및 우수한 항산화능을 지닌 노란색의 신규 잔토필 카로테노이드를 생합성 할 수 있으며, 상기 미생물의 배지조성 및 배양조건의 최적화로 단시간 (48시간) 배양에 높은 균체 생산에 이르는 데에 성공하였다. 또한, 균체로부터 추출을 통해 얻은 고순도의 신규 잔토필 카로테노이드는 기존의 강력한 항산화능을 지닌 카로테노이드인 베타-카로틴, 루테인, 푸코잔틴, 푸코잔티놀, 아스타잔틴, 데이노잔틴 보다 더 높은 항산화능을 가진 것으로 확인되었다. The marine microorganism Erythrobacer sp. SDW2 strain (hereafter referred to as SDW2 strain) can biosynthesize new yellow xanthophyll carotenoids with high purity of 95% or more and excellent antioxidant activity, and can produce high cell mass in a short time (48 hours) culture by optimizing the culture medium composition and culture conditions of the above microorganisms. Successfully reached production. In addition, high-purity new xanthophyll carotenoids obtained through extraction from cells have higher antioxidant activity than beta-carotene, lutein, fucoxanthin, fucoxanthinol, astaxanthin, and deinoxanthin, which are existing carotenoids with strong antioxidant activity. confirmed to have

따라서, 본 발명의 신규 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 SDW2 균주는 우수한 생산효율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공하며, 기존 카로테노이드 보다 우수한 항산화능을 가져 식품, 화장품, 의약 등의 고부가가치 산업에 활용될 것으로 기대된다. Therefore, the SDW2 strain that biosynthesizes the novel xanthophyll carotenoids of the present invention is shown to have excellent production efficiency, thereby reducing production costs, and has superior antioxidant activity compared to existing carotenoids, so it is used in high value-added industries such as food, cosmetics, and medicine. expected to be

도 1은 Marine agar 배지에서 순수배양 된 Erythrobacter sp. SDW2 균주를 나타낸 도이다.
도 2는 Erythrobacter sp. SDW2 균주의 분류학적 계통도를 나타낸 도이다.
도 3a은 Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 추출된 잔토필의 UV-Visible 스펙트럼 분석그래프이다.
도 3b는 Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 메탄올로 추출된 신규 잔토필의 HPLC분석 그래프 및 Thin layer chromatography (TLC) 결과를 나타낸 도이다.
도 3c은 Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 추출된 신규 잔토필의 LC-MS분석 그래프이다.
도 4는 잔토필계 카로테노이드 생합성 경로를 나타낸 도이다.
도 5는 신규 잔토필과 기존 카로테노이드의 HPLC분석 그래프이다.
도 6a는 탄소원에 따른 Erythrobacter sp. SDW2의 생장곡선 그래프이다.
도 6b는 탄소원에 따른 Erythrobacter sp. SDW2의 신규 잔토필의 생산량 (Titer)와 세포건조중량당 생산량 (Content)를 비교 그래프이다.
도 7은 기존 카로테노이드와 신규 잔토필의 두 종의 활성산소종 (DPPH, ABTS)에 대한 소거능을 비교한 그래프이다.Figure 1 is pure cultured Erythrobacter sp. It is a diagram showing the SDW2 strain.
2 shows Erythrobacter sp. It is a diagram showing the taxonomic phylogeny of the SDW2 strain.
Figure 3a shows Erythrobacter sp. This is a UV-Visible spectrum analysis graph of xanthophylls extracted from the SDW2 strain.
3b shows Erythrobacter sp. It is a diagram showing the HPLC analysis graph and thin layer chromatography (TLC) results of the new xanthophylls extracted with methanol from the SDW2 strain.
3c shows Erythrobacter sp. It is a graph of LC-MS analysis of novel xanthophylls extracted from SDW2 strain.
4 is a diagram showing a xanthophyll-based carotenoid biosynthetic pathway.
5 is a graph of HPLC analysis of new xanthophylls and existing carotenoids.
Figure 6a shows Erythrobacter sp. This is the growth curve graph of SDW2.
Figure 6b shows Erythrobacter sp. It is a graph comparing the new xanthophyll production (Titer) and the production per cell dry weight (Content) of SDW2.
Figure 7 is a graph comparing the scavenging ability of two types of active oxygen species (DPPH, ABTS) of existing carotenoids and new xanthophylls.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 제주 연안의 해수로부터 신규 분리 동정한 에리스로박터 종 (Erythrobacter sp.) 균주를 제공한다.The present invention provides an Erythrobacter sp. strain newly isolated and identified from seawater off the coast of Jeju.

상기 에리스로박터 종 균주는 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁된 Erythrobacter sp. SDW2 균주(이하 SDW2 균주)이다. The Erythrobacter sp. strain is Erythrobacter sp. SDW2 strain (hereinafter referred to as SDW2 strain).

상기 SDW2 균주는 Marine broth(기산바이오, MB-M1512) 및 Bacto agar(BD, 프랑스)를 정제수에 용해하여 제조된 Marine agar 배지에 제주 연안으로부터 채취한 해수를 멸균된 식염수에 희석하여 희석액을 도말하고 35 내지 39℃, 36 내지 38℃ 및 36.5 내지 37.5℃에서 5 내지 9일 및 6 내지 8일간 배양한 후, 생장한 여러 콜로니 가운데 노란색을 띄는 콜로니만 취하여, 새로운 Marine agar 배지에 계대하여 노란색 색소를 지닌 단일 종의 미생물만을 순수분리하여 얻은 것이다(도 1).The SDW2 strain is prepared by dissolving Marine broth (Kisan Bio, MB-M1512) and Bacto agar (BD, France) in purified water, and diluting seawater collected from the coast of Jeju with sterilized saline, and smearing the diluted solution After culturing at 35 to 39℃, 36 to 38℃ and 36.5 to 37.5℃ for 5 to 9 days and 6 to 8 days, only yellow colonies were taken out of the many colonies grown and subcultured to a new Marine agar medium to obtain yellow pigment. It was obtained by pure isolation of only a single species of microorganisms (FIG. 1).

상기 Marine broth는 주성분으로 MgCl₂, MgSO₄, peptone 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.The marine broth includes, but is not limited to, MgCl ₂ , MgSO ₄ , peptone, etc. as main components.

상기 과정에서 수득한 미생물의 동정을 위하여 DNA를 추출하고 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재된 16s universial primer를 이용하여 수득된 미생물의 16s rRNA 유전자 염기서열(약 1.5kb, 서열번호 3)을 PCR로 분석하였다(표 1).To identify the microorganisms obtained in the above process, DNA was extracted and the 16s rRNA gene sequence (about 1.5 kb, SEQ ID NO: 3) of the obtained microorganisms was obtained by PCR using the 16s universal primers described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. analyzed (Table 1).

상기 과정으로부터 수득된 16s rRNA 유전자 염기서열로 NCBI BLAST program을 이용하여 상기 미생물의 종을 파악하였고, Mega 7.0 program을 이용한 계통분석을 통하여 제주 연안 해수로부터 분리된 노란색 색소를 띄는 미생물은 Erythrobacter sp. SDW2로 명명하였다(도 2).The 16s rRNA gene sequence obtained from the above process was used to identify the species of the microorganism using the NCBI BLAST program, and through phylogenetic analysis using the Mega 7.0 program, the yellow-pigmented microorganism isolated from the seawater off the coast of Jeju was Erythrobacter sp. It was named SDW2 (FIG. 2).

본 발명자들은 상기 Erythrobacter sp. SDW2 균주를 국립농업과학원 미생물은행 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁하였다.The inventors of the Erythrobacter sp. The SDW2 strain was deposited with the Korean Agricultural Culture Collection (KACC) under the accession number KACC 81198BP.

상기 SDW2 균주는 잔토필 카로테노이드(xanthophyll carotenoid)를 생산할 수 있고, 이를 순도 95% 이상 100% 이하, 예를 들어, 96% 이상 97% 이하, 97% 이상 98% 이하, 98% 이상 99% 이하, 99% 이상 100% 이하의 고순도로 얻을 수 있다.The SDW2 strain can produce xanthophyll carotenoid, which has a purity of 95% or more and 100% or less, for example, 96% or more and 97% or less, 97% or more and 98% or less, 98% or more and 99% or less, It can be obtained with high purity of 99% or more and 100% or less.

상기 SDW2 균주로부터 수득된 추출물을 300 nm에서 700 nm사이의 파장으로 microplate reader (Biotek, Winooski, VY, USA)을 이용하여 흡광도를 스캔한 결과, 450 nm 및 480nm 부근에서 높은 흡광도를 보이는 이중 피크 그래프를 나타내었다. 이는 일반적인 노란색을 띄는 잔토필 카로테노이드(푸코잔틴, 푸코잔티놀, 아스타잔틴, 노스토잔틴, 지아잔틴, 베타크립토잔틴 등)는 450 nm 및 480nm 부근에서 높은 흡광도를 보이는 이중 피크 그래프를 나타내는 것과 동일하였고, 이를 통해 SDW2 균주로부터 수득된 추출물에 잔토필 카로테노이드가 포함되어 있는 것을 확인하였다(도 3a).As a result of scanning the absorbance of the extract obtained from the SDW2 strain using a microplate reader (Biotek, Winooski, VY, USA) at a wavelength between 300 nm and 700 nm, a double peak graph showing high absorbance around 450 nm and 480 nm showed This is the same as that of typical yellow xanthophyll carotenoids (fucoxanthin, fucoxanthinol, astaxanthin, nostoxanthin, zeaxanthin, beta-cryptoxanthin, etc.) showing a double peak graph showing high absorbance around 450 nm and 480 nm. Through this, it was confirmed that xanthophyll carotenoids were included in the extract obtained from the SDW2 strain (FIG. 3a).

상기 순도는 SDW2 균주로부터 수득된 추출물을 TCL 분석과 HPLC 분석을 수행한 결과, 단일 밴드 및 약 1.9 min의 머무름 시간(retention time)에서 95.2% area 가장 높은 단일 피크가 검출되는 것을 통해 확인하였다(도 3b). 이는 고순도의 단일 화합물이 나온 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 신규한 SDW2 균주를 통해 추가적인 정제과정 없이 고순도의 잔토필 카로테노이드를 얻을 수 있다는 장점을 가진다. The purity was confirmed through TCL analysis and HPLC analysis of the extract obtained from the SDW2 strain. As a result, a single band and a single peak with the highest 95.2% area were detected at a retention time of about 1.9 min (Fig. 3b). This means that a single compound of high purity came out. Therefore, the present invention has the advantage of obtaining high-purity xanthophyll carotenoids without an additional purification process through the novel SDW2 strain.

이후, SDW2 균주의 색소 추출물의 LC-MS분석 이온 스펙트럼 분석 결과 C₄₀H₅₆O₅의 화학식(분자량 616.4 g/mol)을 갖는 것으로 예측되었다(도 3c). 이는 기존에 보고된 잔토필계 카로테노이드인 푸코잔티놀(Fucoxanthinol, C₄₀H₅₆O₅)과 같은 화학식과 분자량을 나타낸다. 그러나, 카로테노이드 생산 박테리아 중 현재까지 푸코잔티놀을 생합성하는 균주는 보고된 바 없으며, 특히 Erythrobacter sp. 내에서 푸코잔티놀의 전구체인 푸코잔틴을 생산한 사례 또한 존재하지 않은 바, SDW2 균주가 생산하는 잔토필 카로테노이드는 푸코잔티놀과 같은 물질이라 예상하기 어렵다.Then, as a result of LC-MS analysis and ion spectrum analysis of the pigment extract of SDW2 strain, it was predicted to have a chemical formula of C ₄₀ H ₅₆ O ₅ (molecular weight 616.4 g/mol) (FIG. 3c). It represents the same chemical formula and molecular weight as fucoxanthinol (C ₄₀ H ₅₆ O ₅ ), a previously reported xanthophyll-based carotenoid. However, among carotenoid-producing bacteria, no strain that biosynthesizes fucoxanthinol has been reported so far, especially Erythrobacter sp. There is also no case of producing fucoxanthin, a precursor of fucoxanthinol, within the bar, so it is difficult to predict that xanthophyll carotenoids produced by the SDW2 strain are the same as fucoxanthinol.

이에, Erythrobacter sp. SDW2의 유전체 분석을 통해 상기 미생물의 카로테노이드 합성경로를 분석한 결과, 상기 균주는 지아잔틴 (Zeaxanthin, C₄₀H₅₆O₂) 생합성경로 및 합성 유전자등 잔토필계 카로테노이드 생합성경로를 갖는 것으로 확인되었다(도 4). Accordingly, Erythrobacter sp. As a result of analyzing the carotenoid synthesis pathway of the microorganism through genome analysis of SDW2, it was confirmed that the strain has a xanthophyll-based carotenoid biosynthetic pathway such as a zeaxanthin (C ₄₀ H ₅₆ O ₂ ) biosynthetic pathway and synthetic genes ( Fig. 4).

또한, SDW2균주가 생산하는 색소추출물과 지아잔틴, 루테인, 푸코잔틴, 푸코잔티놀과 함께 분석한 HPLC 분석결과, SDW2의 카로테노이드는 상기 잔토필 카로테노이드들과는 서로 다른 머무름 시간에서 검출되는 것을 확인한 바 (도 5), SDW2 균주가 생합성하는 주요 카로테노이드는 지아잔틴을 전구체로하여 생합성된 신규 잔토필 카로테노이드임을 최종적으로 확인하였다. In addition, as a result of HPLC analysis of the pigment extract produced by the SDW2 strain and zeaxanthin, lutein, fucoxanthin, and fucoxanthinol, it was confirmed that the carotenoids of SDW2 were detected at different retention times from those of the xanthophyll carotenoids (Fig. 5), it was finally confirmed that the main carotenoid biosynthesized by the SDW2 strain was a novel xanthophyll carotenoid biosynthesized using zeaxanthin as a precursor.

또한, 본 발명은 Marine broth 및 Bacto agar를 정제수에 용해하여 Marine agar 배지를 제조하는 단계; 상기 Marine agar 배지에 해수샘플 희석액을 도말하여 배양하는 단계; 및 색을 띄는 콜로니를 분리하고 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻는 단계를 포함하는 에리스로박터 종 SDW2 균주 배양 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of preparing a Marine agar medium by dissolving Marine broth and Bacto agar in purified water; smearing and culturing the diluted seawater sample on the marine agar medium; and isolating and subculturing colored colonies to obtain a single colony.

상기 Marine agar 배지는 Marine broth:Bacto agar의 특정 질량(g)비로 혼합하고 1 ℓ의 정제수에 용해하여 제조한다. 여기서, 상기 질량(g)비는 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The marine agar medium is prepared by mixing marine broth:bacto agar in a specific mass (g) ratio and dissolving in 1 liter of purified water. Here, the mass (g) ratio may be 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, or 4:1, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 배양 방법으로 얻은 상기 단일 콜로니를 Marine broth에 교반하며 배양하는 단계; 상기 배양 후 원심분리하여 세포를 회수하여 동결건조하는 단계; 및 상기 동결건조 후 얻은 균체에 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합물 중 어느 하나의 용매를 첨가하는 단계를 포함하는 에리스로박터 종 SDW2 균주 추출물 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of stirring and culturing the single colony obtained by the culture method in Marine broth; recovering the cells by centrifugation after the culturing and freeze-drying; And it provides a method for preparing an Erythrobacter sp. SDW2 strain extract comprising the step of adding any one solvent of methanol, ethanol, and mixtures thereof to the cells obtained after lyophilization.

상기 용매 중 메탄올은 100%, 90%, 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 최적의 추출 효율을 갖는 비율을 사용할 수 있다.Methanol in the solvent may be a 100%, 90%, 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, or 10% solution, but is not limited thereto, and a ratio having an optimal extraction efficiency may be used. can

상기 용매 중 에탄올은 100%, 90%, 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 최적의 추출 효율을 갖는 비율을 사용할 수 있다.Ethanol in the solvent may be a 100%, 90%, 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, or 10% solution, but is not limited thereto, and a ratio having an optimal extraction efficiency may be used. can

상기 용매 중 이들의 혼합물은 메탄올:에탄올이 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5 부피비일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 최적의 추출 효율을 갖는 부피비를 사용할 수 있다.The mixture of these solvents may be methanol: ethanol in a volume ratio of 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, or 5:5, but is not limited thereto, and a volume ratio having optimal extraction efficiency may be used. there is.

또한, 본 발명은 상기 배양 방법으로 얻은 상기 단일 콜로니를 탄소원을 첨가한 Marine broth에 배양하는 단계를 포함하는 에리스로박터 종 SDW2 균주의 대량 생산 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for mass-producing an Erythrobacter sp. SDW2 strain comprising culturing the single colony obtained by the above culturing method in marine broth to which a carbon source is added.

상기 SDW2 균주의 높은 균체량을 수득하기 위해 Marine broth를 기본배지로 하고, 상기 탄소원으로 글루코오스 (glucose), 프럭토즈 (fructose), 글리세롤 (glycerol), 수크로즈 (sucrose), 자일로즈 (xylose)를 첨가하여 교반배양 하면서 SDW2 균주를 생장시킨다. 그 결과, 탄소원이 포함되지 않은 marine broth에서 배양된 SDW2 균주의 최종 균체량 대비 글루코오스, 수크로즈, 자일로즈가 포함된 marine broth에서는 높은 최종 균체량을 나타내었다. 따라서, SDW2 균주의 최대 균체생산을 위한 탄소원으로 글루코오스, 수크로즈, 자일로즈가 적합함을 확인하였다(도 6a 및 6b).In order to obtain a high cell mass of the SDW2 strain, Marine broth is used as a basal medium, and glucose, fructose, glycerol, sucrose, and xylose are added as the carbon source The SDW2 strain is grown while stirring and culturing. As a result, compared to the final cell mass of SDW2 strain cultured in marine broth without carbon source, the final cell mass was higher in marine broth containing glucose, sucrose, and xylose. Therefore, it was confirmed that glucose, sucrose, and xylose were suitable as carbon sources for maximal cell production of the SDW2 strain (FIGS. 6a and 6b).

또한, 본 발명은 상기 에리스로박터 종 SDW2 균주 추출물 제조 방법에 의해 제조된 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides an antioxidant composition comprising the extract prepared by the method for preparing the extract of the Erythrobacter sp. SDW2 strain.

본 발명의 일 실험예에서 자유라디칼 (free radical)인 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를 이용하여 SDW2가 생합성하는 잔토필 카로테노이드의 항산화능을 확인하고, 상업적으로 활용되고 있는 다른 잔토필 카로테노이드들과 비교하였다. In one experimental example of the present invention, using free radicals, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) The antioxidant capacity of xanthophyll carotenoids biosynthesized by SDW2 was confirmed and compared with other commercially available xanthophyll carotenoids.

그 결과, 본 발명의 SDW2 균주가 생산한 신규 잔토필 카로테노이드는 다른 잔토필 카로테노이드들 보다 약 25.8% ~ 60.6% 더 우수한 항산화능을 가진 것으로 확인되었다(도 7).As a result, it was confirmed that the novel xanthophyll carotenoid produced by the SDW2 strain of the present invention had about 25.8% to 60.6% better antioxidant activity than other xanthophyll carotenoids (FIG. 7).

상기 조성물은 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.The composition includes, but is not limited to, health functional food compositions, cosmetic compositions, pharmaceutical compositions, and the like.

본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 에리스로박터 종 SDW2 균주 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. The health functional food of the present invention includes components commonly added during food preparation, and includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, and seasonings. For example, when prepared as a drink, a flavoring agent or natural carbohydrate may be included as an additional ingredient in addition to the Erythrobacter sp. SDW2 strain extract as an active ingredient.

본 발명의 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.The health functional food of the present invention may be formulated as one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules and liquid formulations by further including one or more of carriers, diluents, excipients and additives. Examples of foods to which the extract of the present invention can be added include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health functional foods, and the like.

본 발명에서 화장료 조성물은 기능성 화장료 조성물임을 특징으로 한다. 기능성 화장료 조성물이란, 특정 피부의 관리와 예방을 위해 특정 기능을 강조해 만든 화장료 조성물, 또는 유전적, 환경적 요인에 의한 각종 피부질환의 예방과 적당한 관리를 위한 화장료 조성물을 말한다.In the present invention, the cosmetic composition is characterized in that it is a functional cosmetic composition. Functional cosmetic composition refers to a cosmetic composition made by emphasizing a specific function for the management and prevention of specific skin, or a cosmetic composition for preventing and appropriately managing various skin diseases caused by genetic and environmental factors.

본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 화장료 조성물은 주름 예방 및 개선 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있는데, 특히 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 헤어컨디셔너, 젤, 스킨로션, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 모이스처 로션, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the cosmetic composition according to one embodiment of the present invention, the cosmetic composition can be used in various ways such as cosmetics and face washes having wrinkle preventing and improving effects. , hair tonic, shampoo, hair conditioner, gel, skin lotion, skin toner, astringent, lotion, moisture lotion, nutrient cream, moisture cream, hand cream, foundation, nutrient essence, sunscreen, soap, cleansing foam, cleansing lotion, body It may be a cosmetic composition having any one formulation selected from the group consisting of lotion and body cleanser, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be provided as a pharmaceutical composition including an active ingredient alone or including one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.

본 발명에서 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.In the present invention, "pharmaceutically acceptable" means exhibiting non-toxic properties to cells or humans exposed to the composition.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.The composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it is preferable to select an injection method for external skin application or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection. , but is not limited thereto.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 0.01~1000mg/kg/day로, 바람직하게는 0.1~500㎎/kg/day로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The preferred dosage of the composition of the present invention varies depending on the condition and body weight of the patient, the severity of the disease, the type of drug, the route and duration of administration, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for desirable effects, the composition is preferably administered at 0.01 to 1000 mg/kg/day, preferably 0.1 to 500 mg/kg/day, but is not limited thereto. The administration may be administered once a day or divided into several times. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following Examples and Experimental Examples. However, the following examples and experimental examples are only for exemplifying the present invention, but the present invention is not limited thereto.

실시예 1. 해수샘플로부터 신규 잔토필 생합성능을 갖는 미생물의 분리동정Example 1. Isolation and identification of microorganisms having novel xanthophyll biosynthetic ability from seawater samples

실시예 1-1. 색소 생산 해양 미생물의 순수 배양 및 염기서열 분석Example 1-1. Pure culture and sequencing of pigment-producing marine microorganisms

37.35 g의 Marine broth (기산바이오, MB-M1512), 15 g의 Bacto agar (BD, 프랑스)를 1 ℓ의 정제수에 용해하여 Marine agar 배지를 제조 후 121℃에서 15분간 가압멸균 하였다. Marine agar medium was prepared by dissolving 37.35 g of Marine broth (Kisan Bio, MB-M1512) and 15 g of Bacto agar (BD, France) in 1 ℓ of purified water, followed by autoclaving at 121°C for 15 minutes.

상기 제조된 배지에 제주 연안 (33°14’42.2 “N 126°24’41.7 "E)으로부터 채취한 해수를 멸균된 식염수에 희석하여 100 ㎕의 희석액을 도말하고 37℃에서 7일간 정치 배양하였다. 배양 이후, 생장한 여러 콜로니 가운데 노란색을 띄는 콜로니만 취하여, 새로운 Marine agar 배지에 2 내지 3 회 계대하여 노란색 색소를 지닌 단일 종의 미생물만을 순수분리하였다(도 1). 이후, 상기 과정에서 수득한 미생물의 동정을 위하여 순수배양된 미생물의 DNA를 추출하고 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재된 16s universial primer를 이용하여 PCR을 수행하여 수득된 미생물의 서열번호 3으로 기재된 약 1.5kb의 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다(표 1). Seawater collected from the coast of Jeju (33 ° 14'42.2 "N 126 ° 24'41.7 "E) was diluted in sterilized saline on the prepared medium, and 100 μl of the diluted solution was smeared and cultured at 37 ° C. for 7 days. After culturing, only yellow colonies were taken out of several colonies grown, and subcultured 2 to 3 times to a new marine agar medium to isolate only a single species of microorganisms with yellow pigment in pure water (FIG. 1). For the identification of microorganisms, the DNA of pure cultured microorganisms was extracted and PCR was performed using the 16s universal primers described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the 16s rRNA gene base of about 1.5 kb described in SEQ ID NO: 3 of the microorganism obtained was obtained. Sequences were analyzed (Table 1).

서열번호sequence number 이름name 서열(5'→3')Sequence (5'→3') 1One 16s universial primer F16s universal primer F agagtttgatcmtggctcagagagtttgatcmtggctcag 22 16s universial primer R16s universal primer R tacggytaccttgttacgactttacggytaccttgttacgactt

상기 과정으로부터 수득된 16s rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였다(GenBank accession number: MZ437366). NCBI BLAST program을 이용하여 상기 미생물의 종을 파악하였고, Mega 7.0 program을 이용한 계통분석을 통하여 제주 연안 해수로부터 분리된 노란색 색소를 띄는 미생물은 Erythrobacter sp. SDW2로 명명하였다(도 2). The 16s rRNA gene sequence obtained from the above process was registered in NCBI GenBank (GenBank accession number: MZ437366). The species of the microorganisms were identified using the NCBI BLAST program, and through phylogenetic analysis using the Mega 7.0 program, the yellow-pigmented microorganisms isolated from seawater off the coast of Jeju were Erythrobacter sp. It was named SDW2 (FIG. 2).

본 발명자들은 신규 잔토필을 생산하는 상기 Erythrobacter sp. SDW2 균주를 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁하였다.The present inventors found that the Erythrobacter sp. The SDW2 strain was deposited with the National Institute of Agricultural Sciences microorganism bank (Korean Agricultural Culture Collection, KACC) under accession number KACC 81198BP.

실시예 1-2. SDW2 균주가 생합성하는 색소의 추출Example 1-2. Extraction of pigments biosynthesized by SDW2 strain

상기 실시예 1-1에서 수득된 SDW2 균주의 단일콜로니를 Marine broth 3 ㎖에 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 1%의 배양액을 새로운 50 ㎖의 Marine broth에 재접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 48시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 15분간, 4℃, 10,000 rpm의 조건으로 원심분리하여 세포를 회수하고, 동결건조 후 수득된 균체에 5 ㎖의 메탄올를 첨가하여 균체로부터 색소를 완전히 추출하였다. 수득된 추출물은 0.25 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 여과지를 이용하여 여과하여 세포잔여물이 최종제거된 순수 추출물을 수득하였다. A single colony of the SDW2 strain obtained in Example 1-1 was cultured in 3 ml of Marine broth with stirring at 200 rpm for 24 hours. After culturing, 1% of the culture medium was re-inoculated into 50 ml of fresh Marine broth and cultured while stirring for 48 hours at 37°C and 200 rpm. After culturing, the culture solution was centrifuged for 15 minutes at 4° C. and 10,000 rpm to recover cells, and 5 ml of methanol was added to the obtained cells after freeze-drying to completely extract the pigment from the cells. The obtained extract was filtered using a filter paper having a pore size of 0.25 μm to obtain a pure extract from which cell residues were finally removed.

실시예 1-3. UV 스펙트럼, TLC, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 및 LC-MS 분석을 통한 SDW2 추출물의 성상분석Example 1-3. Characterization of SDW2 Extracts by UV Spectrum, TLC, High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and LC-MS Analysis

먼저, 실시예 1-2에서 수득된 색소 추출물에 UV 스펙트럼을 조사하였다.First, the pigment extract obtained in Example 1-2 was irradiated with UV spectrum.

구체적으로, 200 ㎕의 추출액을 96-well clear plate에 넣고, 300 nm에서 700 nm사이의 파장으로 microplate reader (Biotek, Winooski, VY, USA)을 이용하여 스캔하였다. 그 결과, 추출물은 일반적인 노란색을 띄는 잔토필 카로테노이드 (노스토잔틴, 지아잔틴, 베타크립토잔틴등)와 같은 450 nm과 480nm의 파장을 가장 높게 흡수하는 것으로 확인되었다(도 3a). Specifically, 200 μl of the extract was put into a 96-well clear plate and scanned using a microplate reader (Biotek, Winooski, VY, USA) at a wavelength between 300 nm and 700 nm. As a result, it was confirmed that the extract had the highest absorption of wavelengths of 450 nm and 480 nm, such as typical yellow xanthophyll carotenoids (nostoxanthin, zeaxanthin, beta-cryptoxanthin, etc.) (FIG. 3a).

이후, 상기 추출물은 실리카겔이 코팅된 TLC (Merck, KGaA, Darmstadt) plate와 전개액 (ethyl acetate:hexane, 6:4, v/v)을 이용하여 TCL 분석과 HPLC [Agilent 1260 Infinity II (Agilent Corp., Santa Clara, CA, USA)] 분석을 수행하였다. 추출물의 분리를 위한 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18 5 ㎛(4.6 x 150 ㎜)를 사용하였고, 컬럼온도는 30℃, 유속은 1 ㎖/min으로 설정하고, UV파장은 450nm로 설정하여 10분간 분석하였다. 준비된 추출물은 5 ㎕를 주입하였다. 이동상은 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올이 40:50:10으로 배합된 것을 사용하였다. Then, the extract was subjected to TCL analysis and HPLC [Agilent 1260 Infinity II (Agilent Corp. ., Santa Clara, CA, USA)] analysis was performed. A Zorbax Eclipse XDB-C18 5 ㎛ (4.6 x 150 mm) column was used for separation of the extract, the column temperature was set to 30 ° C, the flow rate was set to 1 ml / min, and the UV wavelength was set to 450 nm and analyzed for 10 minutes did 5 μl of the prepared extract was injected. As the mobile phase, a combination of acetonitrile, methanol and isopropanol in a ratio of 40:50:10 was used.

그 결과, 도 3b에 나타낸 것과 같이 SDW2의 색소 추출물은 약 1.9 min의 머무름 시간(retention time)에서 95.2% area, 2.3 min의 머무름 시간에서 4.6% area에 해당하는 피크가 각각 검출됨을 확인하였다. 특히, 1.9min의 머무름 시간에서 가장 높은 피크가 검출됨을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 3b, it was confirmed that the pigment extract of SDW2 detected peaks corresponding to 95.2% area at a retention time of about 1.9 min and 4.6% area at a retention time of 2.3 min, respectively. In particular, it was confirmed that the highest peak was detected at a retention time of 1.9 min.

상기의 결과는 카로테노이드를 생산하는 Erythobacter 종인 E. flavus KJ5, E. longus, 및 E. nanhaesediminis 과는 달리 SDW2 균주는 주요 카로테노이드로 95% 이상의 순도를 가지는 카로테노이드 생합성하는 것으로 확인되었고, 이는 기존의 해양 미생물 카로테노이드의 추가적인 정제과정을 배제할 수 있어 높은 경제성을 가지는 장점을 가진다. The above results confirmed that, unlike E. flavus KJ5, E. longus, and E. nanhaesediminis, which are Erythobacter species that produce carotenoids, the SDW2 strain is the main carotenoid and biosynthesizes carotenoids with a purity of 95% or more, which is It has the advantage of having high economic efficiency because it can exclude the additional purification process of carotenoids.

이후, SDW2 균주의 색소 추출물의 LC-MS분석 이온 스펙트럼 분석결과 617.42 m/z [M+H], 599.42 m/z [M-H₂O]에서 검출됨을 확인하였고, 그 결과 C₄₀H₅₆O₅의 화학식(분자량 616.4 g/mol)을 갖는 것으로 예측되었다(도 3c).이는 기존에 보고된 잔토필 카로테노이드인 푸코잔티놀(Fucoxanthinol, C₄₀H₅₆O₅)과 같은 화학식과 분자량을 나타낸다.Then, as a result of LC-MS analysis and ion spectrum analysis of the pigment extract of SDW2 strain, it was confirmed that it was detected at 617.42 m/z [M+H] and 599.42 m/z [MH ₂ O]. As a result, C ₄₀ H ₅₆ O ₅ It was predicted to have the formula (molecular weight 616.4 g/mol) (FIG. 3c).It represents the same chemical formula and molecular weight as fucoxanthinol (C ₄₀ H ₅₆ O ₅ ), a previously reported xanthophyll carotenoid.

그러나, 카로테노이드 생산 박테리아 중 현재까지 푸코잔티놀을 생합성하는 균주는 보고된 바 없으며, 특히 Erythrobacter종내에서 푸코잔티놀의 전구체인 푸코잔틴을 생산한 사례 또한 존재하지 않은 바, SDW2균주가 생산하는 카로테노이드는 푸코잔티놀도 같은 물질이라 예상하기 어렵다. However, among carotenoid-producing bacteria, no strain that biosynthesizes fucoxanthinol has been reported so far, especially within the Erythrobacter species. Since there is no case of producing fucoxanthin, a precursor of fucoxanthinol, it is difficult to predict that the carotenoid produced by the SDW2 strain is the same as fucoxanthinol.

또한, SDW2균주가 생산하는 색소추출물과 지아잔틴, 루테인, 푸코잔틴, 푸코잔티놀과 함께 분석한 HPLC 분석결과, SDW2의 카로테노이드는 상기 잔토필 카로테노이드들과는 서로 다른 머무름 시간에서 검출되는 것을 확인한 바(도 5), SDW2 균주가 생합성하는 주요 카로테노이드는 지아잔틴을 전구체로하여 생합성된 신규 잔토필 카로테노이드계 색소임을 최종적으로 확인하였다.In addition, as a result of HPLC analysis analyzed together with the pigment extract produced by the SDW2 strain, zeaxanthin, lutein, fucoxanthin, and fucoxanthinol, it was confirmed that the carotenoids of SDW2 were detected at different retention times from those of the xanthophyll carotenoids (Fig. 5), it was finally confirmed that the main carotenoid biosynthesized by the SDW2 strain was a novel xanthophyll carotenoid-based pigment biosynthesized using zeaxanthin as a precursor.

실시예 2. 탄소원 종류에 따른 Example 2. According to the type of carbon source Erythrobacter Erythrobacter sp. SDW2 균주의 균체생산 및 잔토필 카로테노이드 생산sp. Cell production of SDW2 strain and xanthophyll carotenoid production

상시 실시예 1-1에서 순수 분리된 SDW2 균주의 높은 균체량을 수득하기 위해 Marine broth를 기본배지로 하고, 각각 5 g/L의 글루코오스 (glucose), 프럭토즈 (fructose), 글리세롤 (glycerol), 수크로즈 (sucrose), 자일로즈 (xylose)이 포함된 50 ㎖의 marine broth를 준비하여 24시간 동안 배양된 SDW2 균체액을 1% (v/v)가 되도록 접종하여, 30℃, 200 rpm의 조건으로 48시간 동안 교반배양 하면서 600nm의 흡광도에서 SDW2 균주의 생장양상을 관찰하였다.In order to obtain a high cell mass of the SDW2 strain purely isolated in Example 1-1, Marine broth was used as a basal medium, and each of 5 g / L of glucose, fructose, glycerol, water Prepare 50 ml of marine broth containing sucrose and xylose, and inoculate SDW2 cell body fluid cultured for 24 hours to 1% (v / v), at 30 ° C and 200 rpm. The growth pattern of the SDW2 strain was observed at an absorbance of 600 nm while stirring the culture for 48 hours.

탄소원이 포함되지 않은 marine broth에서 배양된 SDW2는 48시간 동안 약 3.2 (Optical density at 600 nm wavelength, O.D₆₀₀)의 최종 균체량을 나타내었다. 글리세롤과 프럭토즈는 균체생장향상에 영향을 주지 않았으며, 글루코오스, 수크로즈, 자일로즈가 포함된 marine broth에서는 각각 7.4, 7, 6.4로 확인되었다. 따라서, SDW2 균주의 최대 균체생산을 위한 탄소원으로 글루코오스가 가장 적합함을 확인하였다(도 6a).SDW2 cultured in marine broth containing no carbon source showed a final cell mass of about 3.2 (Optical density at 600 nm wavelength, OD ₆₀₀ ) for 48 hours. Glycerol and fructose did not affect cell growth improvement, and in marine broth containing glucose, sucrose, and xylose, the values were 7.4, 7, and 6.4, respectively. Therefore, it was confirmed that glucose is most suitable as a carbon source for maximal cell production of the SDW2 strain (FIG. 6a).

또한, 상기 과정에서 배양한 각각의 SDW2 균주를 원심분리를 통해 회수하고, 동결건조하여 수분을 모두 제거한 뒤 5 ㎖의 메탄올을 첨가하여 현탁하였다. 현탁액은 다시 원심분리와 여과를 통해 순수 추출물로 분리하고 HPLC를 통해 각각 탄소원을 첨가한 marine broth에서 배양된 SDW2 균주의 잔토필 카로테노이드 생산량을 측정하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이 최대 균체 생산량을 나타내었던 조건인 글루코오스가 포함된 marine broth에서 SDW2 균주는 약 263 mg/L, 균체량 g당 48.1 mg의 잔토필 카로테노이드를 생산하는 것으로 확인되었다. In addition, each SDW2 strain cultured in the above process was recovered through centrifugation, lyophilized to remove all moisture, and then suspended by adding 5 ml of methanol. The suspension was again separated into pure extracts through centrifugation and filtration, and the production of xanthophyll carotenoids of the SDW2 strain cultured in marine broth to which each carbon source was added was measured by HPLC. As shown in FIG. 6B, it was confirmed that the SDW2 strain produced about 263 mg/L, 48.1 mg of xanthophyll carotenoids per g of cell mass in marine broth containing glucose, which was the condition for maximum cell production.

이는 다른 탄소원이 포함된 조건보다 더 우수한 생산성을 보이며 특히, 탄소원이 포함되지 않은 배지보다 약 69.1% (mg/L 단위 기준)향상된 생산성을 나타내는 것으로 확인되었다. 탄소원 종류에 따른 SDW2 균주의 균체량 및 잔토필 카로테노이드 생산능을 표 2에 나타내었다.This shows better productivity than other carbon sources, and in particular, it was confirmed that the productivity was improved by about 69.1% (based on mg/L units) than the medium without carbon sources. Table 2 shows the cell mass and xanthophyll carotenoid production ability of the SDW2 strain according to the type of carbon source.

탄소원 별 Erythrobacter sp. SDW2의 균체량 및 잔토필 카로테노이드 생산능 Erythrobacter sp. Cell mass and xanthophyll carotenoid production capacity of SDW2 탄소원carbon source 균체량 (OD600)Bacterial mass (OD600) 잔토필 카로테노이드 생산량 (mg/L)Xanthophyll Carotenoid Production (mg/L) 세포건중량당 잔토필 카로테노이드 생산량 (mg/g dcw)Xanthophyll carotenoid production per cell dry weight (mg/g dcw) marine broth onlymarine broth only 3.2 ± 0.23.2 ± 0.2 79.8 ± 2.179.8 ± 2.1 48.1 ± 0.348.1 ± 0.3 GlucoseGlucose 7.4 ± 0.27.4 ± 0.2 263 ± 12.9263 ± 12.9 89.7 ± 5.489.7 ± 5.4 GlycerolGlycerol 3.4 ±0.73.4±0.7 83.2 ± 0.383.2 ± 0.3 47.2 ± 1.747.2 ± 1.7 FructoseFructose 4.4 ±0.74.4±0.7 122.3 ± 1.2122.3 ± 1.2 63.6 ± 2.863.6 ± 2.8 XyloseXylose 6.4 ±0.46.4 ±0.4 186.5 ± 2.2186.5 ± 2.2 68 ± 4.668±4.6 SucroseSucrose 7.0 ±0.67.0±0.6 234.8 ± 22.1234.8 ± 22.1 80.7 ± 11.680.7 ± 11.6

실험예 1. Experimental example 1. ErythrobacterErythrobacter sp. SDW2 균주로부터 생산된 신규 잔토필 카로테노이드의 항산화능 확인. sp. Confirmation of antioxidant activity of novel xanthophyll carotenoids produced from SDW2 strain.

자유라디칼 (free radical)인 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를 이용하여 SDW2가 생합성하는 잔토필 카로테노이드의 항산화능을 확인하고, 상업적으로 활용되고 있는 다른 잔토필 카로테노이드들과 비교하였다. Xanthophyll biosynthesized by SDW2 using free radicals 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) The antioxidant activity of carotenoids was confirmed and compared with other commercially available xanthophyll carotenoids.

구체적으로는 상기 실시예 2의 SDW2 균주의 잔토필 카로테노이드 생산 최적 배양조건에서 수득된 SDW2 균체로부터 메탄올을 이용하여 잔토필 카로테노이드를 추출한 뒤, 20 mg/L의 농도가 되도록 이를 정량하였다. Specifically, xanthophyll carotenoids were extracted from the SDW2 cells obtained under optimal culture conditions for xanthophyll carotenoid production of the SDW2 strain of Example 2 using methanol, and then quantified to a concentration of 20 mg/L.

데이노잔틴은 데이노코쿠스 라디오두란스 DX균주 (Deinococcus radiodurans R1 야생형 균주에서 CrtB 및 DXS 유전자가 과발현하도록 제작된 균주, KR102160203)로부터 추출하여 표준품으로 사용하였다. 또 다른 잔토필 카로테노이드는 표준품을 사용하였으며, 그 종류는 아스타잔틴 (cayman, 미국), 푸코잔틴, 푸코잔티놀, 루테인 (Sigma, 미국)을 각각 20 mg/L 사용하였으며, 양성대조군으로 20 mg/L 농도의 아스코브산 (대정화금, 한국)을 사용하였다. DPPH (TCI,일본)용액은 최종농도 0.2 mM가 되도록 메탄올에 용해하여 제조하였고, ABTS (Sigma, USA)용액은 ABTS 분말을 7mM의 농도가 되도록 메탄올에 용해하고, 2.45 mM 과황산칼륨 용액 (potassium persulfate, 대정화금)과 1:1 비율로 혼합하여 상온에서 24시간 암반응하여 제조하였다. Deinoxanthin was extracted from Deinococcus radiodurans DX strain (a strain designed to overexpress CrtB and DXS genes in Deinococcus radiodurans R1 wild type strain, KR102160203) and used as a standard product. Another xanthophyll carotenoid was used as a standard product, and astaxanthin (cayman, USA), fucoxanthin, fucoxanthinol, and lutein (Sigma, USA) were used at 20 mg/L each, and 20 mg as a positive control /L concentration of ascorbic acid (Daejeong Chemical & Gold, Korea) was used. DPPH (TCI, Japan) solution was prepared by dissolving in methanol to a final concentration of 0.2 mM, and ABTS (Sigma, USA) solution was prepared by dissolving ABTS powder in methanol to a concentration of 7 mM, and 2.45 mM potassium persulfate solution (potassium It was prepared by mixing with persulfate, Daejeong Chemical Gold) in a 1:1 ratio and reacting in the dark at room temperature for 24 hours.

SDW2 균주로부터 생합성된 잔토필 카로테노이드의 항산화능을 시험하기 위하여 100 ㎕의 각각의 자유라디칼(ABTS, DPPH)용액을 96 well titer plate에 분주하고, 미리 제조된 20 mg/L의 SDW2 균주 추출물 및 상기 다른 잔토필 카로테노이드들 각각 100 ㎕를 첨가한 뒤, 암조건 (dark condition)에서 30분간, 반응하고 이를 517nm 파장(DPPH)과 734nm 파장(ABTS)에서 각각의 흡광도를 측정하였다. In order to test the antioxidant capacity of xanthophyll carotenoids biosynthesized from the SDW2 strain, 100 μl of each free radical (ABTS, DPPH) solution was dispensed into a 96 well titer plate, and the previously prepared 20 mg/L SDW2 strain extract and the above After adding 100 μl of each of the other xanthophyll carotenoids, they were reacted for 30 minutes under dark conditions, and their absorbances were measured at 517 nm wavelength (DPPH) and 734 nm wavelength (ABTS), respectively.

측정된 흡광도는 일련의 계산식[(Control_{A517nm (또는 A734nm)} - Sample_{A517 (또는 A734nm)}/Control_{A517nm (또는 A734nm)})X 100]을 통하여 DPPH 또는 ABTS 소거능 (%)을 계산하였다. 도 7 에 나타난 바와 같이 SDW2가 생산한 신규 잔토필 카로테노이드는 다른 잔토필계 카로테노이드들 보다 약 25.8% ~ 60.6% 더 우수한 항산화능을 가진 것으로 확인되었다.The measured absorbance was calculated through a series of formulas [(Control _{A517nm (or A734nm)} - Sample _{A517 (or A734nm)} / Control _{A517nm (or A734nm)} ) X 100] to calculate DPPH or ABTS scavenging activity (%). As shown in FIG. 7, it was confirmed that the novel xanthophyll carotenoids produced by SDW2 had about 25.8% to 60.6% higher antioxidant activity than other xanthophyll-based carotenoids.

농업생명공학연구원Agricultural Biotechnology Research Institute KACC81198BPKACC81198BP 2021120920211209

<110> University of Seoul Industry Cooperation Foundation <120> MANUFACTURING METHOD OF ERYTHROBACTER SP. STRAIN SDW2 PRODUCING A NOVEL YELLOW XANTHOPHYLL CARPTENOID AND THE METHOD FOR XANTHOPHYLL CAROTENOID OVERPRODUCTION USING THIS STRAIN <130> 2021P-12-023 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s universial primer F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s universial primer R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erythrobacter sp. SDW2 <400> 3 tgctacacat gcagtcgaac gaagccttcg ggcttagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt 60 gggaacctgc ctttaggttc ggaataactc agagaaattt gagctaatac cggataatgt 120 cttcggacca aagatttatc gcctttagat gggcccgcgt aggattagct agttggtggg 180 gtaaaggcct accaaggcga cgatccttag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg 240 gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300 gaaagcctga tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt 360 taccagggat gataatgaca gtacctggag aataagctcc ggctaactcc gtgccagcag 420 ccgcggtaat acggagggag ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag 480 gcggcttttt aagtcagggg tgaaatcccg gggctcaacc ccggaactgc ccttgaaact 540 ggaaagctag aatactggag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga 600 tattcggaag aacaccagtg gcgaaggcga ctcactggac agttattgac gctgaggtgc 660 gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgata 720 actagctgtc cgggttcatg gaacttgggt ggcgcagcta acgcattaag ttatccgcct 780 ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc acaagcggtg 840 gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac cagcctttga catcctagga 900 cgacttctgg agacagattt cttcccttcg gggacctagt gacaggtgct gcatggctgt 960 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtcctt 1020 agttgccatc attaagttgg gcactttaag gaaactgccg gtgataatgg ggatgacgtc 1080 aagtcctcat ggcccttaca ggctgggcta cacacgtgct acaatggcaa ctacagtggg 1140 cagctatccc gcgagggtga gctaatctcc aaaagttgtc tcagttcgga ttgttctctg 1200 caactcgaga gcatgaaggc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1260 acgttcccag gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggatt cacccgaagg 1320 cagtgcgcta accgcaagga ggcagct 1347 <110> University of Seoul Industry Cooperation Foundation <120> MANUFACTURING METHOD OF ERYTHROBACTER SP. STRAIN SDW2 PRODUCING A NOVEL YELLOW XANTHOPHYLL CARPTENOID AND THE METHOD FOR XANTHOPHYLL CAROTENOID OVERPRODUCTION USING THIS STRAIN <130> 2021P-12-023 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 16s universal primer F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 16s universal primer R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1347 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Erythrobacter sp. SDW2 <400> 3 tgctacacat gcagtcgaac gaagccttcg ggcttagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt 60 gggaacctgc ctttaggttc ggaataactc agagaaattt gagctaatac cggataatgt 120 cttcggacca aagatttatc gcctttagat gggcccgcgt aggattagct agttggtggg 180 gtaaaggcct accaaggcga cgatccttag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg 240 gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300 gaaagcctga tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt 360 taccagggat gataatgaca gtacctggag aataagctcc ggctaactcc gtgccagcag 420 ccgcggtaat acggagggag ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag 480 gcggcttttt aagtcagggg tgaaatcccg gggctcaacc ccggaactgc ccttgaaact 540 ggaaagctag aatactggag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga 600 tattcggaag aacaccagtg gcgaaggcga ctcactggac agttattgac gctgaggtgc 660 gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgata 720 actagctgtc cgggttcatg gaacttgggt ggcgcagcta acgcattaag ttatccgcct 780 gggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc acaagcggtg 840 gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac cagcctttga catcctagga 900 cgacttctgg agacagattt cttcccttcg gggacctagt gacaggtgct gcatggctgt 960 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtcctt 1020 agttgccatc attaagttgg gcactttaag gaaactgccg gtgataatgg ggatgacgtc 1080 aagtcctcat ggcccttaca ggctgggcta cacacgtgct acaatggcaa ctacagtggg 1140 cagctatccc gcgagggtga gctaatctcc aaaagttgtc tcagttcgga ttgttctctg 1200 caactcgaga gcatgaaggc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1260 acgttcccag gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggatt cacccgaagg 1320 cagtgcgcta accgcaagga ggcagct 1347

Claims

Erythrobacter sp. SDW2 strain deposited with accession number KACC 81198BP.

According to claim 1,
Erythrobacter sp. SDW2 strain, characterized in that the strain can produce xanthophyll carotenoid.

According to claim 2,
The Erythrobacter sp. SDW2 strain, characterized in that the purity of the xanthophyll carotenoids is 95% or more and 100% or less.

According to claim 2,
Erythrobacter sp. SDW2 strain, characterized in that the xanthophyll carotenoids have antioxidant activity.

preparing a marine agar medium by dissolving marine broth and bacto agar in purified water;
smearing and culturing the diluted natural sample on the marine agar medium; and
A method for culturing an Erythrobacter sp. SDW2 strain, comprising the step of isolating and subculturing colored colonies to obtain a single colony.

culturing the single colony obtained by the culturing method of claim 5 in marine broth while stirring;
recovering the cells by centrifugation after the culturing and freeze-drying; and
Erythrobacter sp. SDW2 strain extract manufacturing method comprising the step of adding any one solvent of methanol, ethanol and mixtures thereof to the cells obtained after the lyophilization.

A method for mass-producing an Erythrobacter sp. SDW2 strain, comprising the step of culturing the single colony obtained by the culturing method of claim 5 in marine broth to which a carbon source is added.

According to claim 7,
The carbon source is glucose, fructose, glycerol, sucrose, xylose Mass production method of Erythrobacter species SDW2 strain, characterized in that it comprises any one or more .

An antioxidant composition comprising an extract prepared by the method for preparing an Erythrobacter sp. SDW2 strain extract of claim 6.

A method for producing xanthophyll carotenoid, comprising the step of culturing the Erythrobacter sp. SDW2 strain of claim 1.

According to claim 11,
The culturing step is a method for producing xanthophyll carotenoids, characterized in that a high cell production rate is exhibited in a short time (48 hours) by optimization of medium composition and culture conditions.