KR20230100689A - SARS-CoV-2 백신 부스터 조성물 - Google Patents

SARS-CoV-2 백신 부스터 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

SARS-CoV-2 백신 부스터 조성물 {SARS-CoV-2 vaccine booster composition}
본 발명은 SARS-CoV-2 백신 부스터 조성물에 관한 것이다.
2019년 12월 이후 전세계적인 감염이 보고되고 있는 SARS-CoV-2 바이러스는 Coronaviridae family, Betacoronavirus genus Sarbecovirus subgenus에 속하는 바이러스로서, SARS-CoV-2 바이러스 감염은 COVID-19 (coronavirus disease 2019)라고도 불린다. 주된 전파경로는 감염자의 비말과의 밀접접촉인 것으로 알려져 있고, 감염자와 직접 접촉하거나 또는 감염자의 비말 등에 의하여 오염된 물품과 같은 매개체를 만진 후, 손을 씻지 않은 채 눈, 코, 입 등을 만짐으로써 바이러스 전파가 이루어질 수도 있다고 알려져 있다.
SARS-CoV-2 바이러스 표면의 삼량체 (trimer) 당단백질 (즉, 스파이크 (Spike) 단백질) 상단의 수용체 결합 도메인 (Receptor Binding Domain, RBD)이 인체 세포 표면의 ACE2 수용체 단백질에 결합함으로써 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 스파이크 당단백질 단량체 (monomer)는 숙주세포 단백질 분해효소 (protease)에 의하여 S1 서브유닛 및 S2 서브유닛으로 분리된다.
SARS-CoV-2 바이러스의 범세계적 유행으로 인하여 사망자 증가 및 막대한 사회 경제적 피해가 발생하고, 피해가 급증함에 따라 신속한 백신 개발이 요구되어, SARS-CoV-2 감염 예방 또는 증상 완화를 위한 백신 조성물 개발이 수행되고 있다.
미국 등록 특허 공보 US 9630994 B2
Science. 2016 Jul 22;353(6297):389-94.
본 발명의 목적은 투여된 개체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 부스터 백신 조성물로서, 상기 개체는 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 적어도 2회 접종한 이력이 있거나, 백신 조성물을 접종하고 SARS-CoV-2에 감염된 이력이 있는 것인, 부스터 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제1단계; 및 제1단계 이후 14일 이상 경과한 후 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제2단계; 및 제2단계 이후 14일 이상 경과한 후 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제3단계를 포함하는, 투여된 개체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용하기 위한 SARS-CoV-2 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 투여된 개체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 부스터 백신 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 부스터 백신 조성물은 (i) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및 (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는, RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클, 및 (ii) AS03을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 개체는 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 적어도 2회 접종한 이력이 있거나, 백신 조성물을 접종하고 SARS-CoV-2에 감염된 이력이 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 야생형 또는 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 야생형 또는 베타 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 21 및 서열번호 22 중 선택되는 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 야생형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물은 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 RBD 나노파티클 및 AS03을 포함하는 제1 조성물과, 서열번호 22의 RBD 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 RBD 나노파티클 및 AS03을 포함하는 제2 조성물이 혼합된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물은 야생형 및 변이형을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물은 알파, 베타, 델타, 감마 및 오미크론 변이형을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물은 알파, 베타, 델타, 감마 및 오미크론 변이형 중 어느 하나 이상의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 투여 대상 개체가 접종한 백신 조성물은 (i) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및 (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는 RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클, 및 (ii) AS03을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 투여 대상 개체가 접종한 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 야생형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 투여 대상 개체가 접종한 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 투여 대상 개체가 접종한 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 부스터 백신 조성물의 투여 대상 개체가 접종한 백신 조성물에 포함된 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 투여된 개체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용하기 위한 SARS-CoV-2 백신 조성물이다.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제1단계; 및 제1단계 이후 14일 이상 경과한 후 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제2단계; 및 제2단계 이후 14일 이상 경과한 후 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제1단계, 제2단계 및 제3단계의 SARS-CoV-2 백신 조성물은 (i) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및 (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는, RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클, 및 (ii) AS03을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1단계 및 제2단계 사이의 간격은 28일 이상인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제2단계는 제1단계 이후 28일 내지 32일 경과 후 수행되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제2단계 및 제3단계 사이의 간격은 28일 이상인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계는 제2단계 이후 28일 내지 300일 경과 후 수행되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 야생형 또는 베타 변이형의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 21 및 서열번호 22 중 선택되는 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드 단량체는 야생형 또는 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드 단량체는 SARS-CoV-2의 야생형 또는 베타 변이형의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드 단량체는 야생형 또는 베타 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물은 서열번호 21 및 서열번호 22 중 선택되는 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물은 야생형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물은 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제3단계에서 투여되는 SARS-CoV-2 백신 조성물은 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 RBD 나노파티클 및 AS03을 포함하는 제1 조성물과, 서열번호 22의 RBD 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 RBD 나노파티클 및 AS03을 포함하는 제2 조성물이 혼합된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1단계 및 제2단계에서 투여되는 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1단계 및 제2단계에서 투여되는 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 야생형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1단계 및 제2단계에서 투여되는 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1단계 및 제2단계에서 투여되는 백신 조성물에 포함된 제1 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물의 제1단계 및 제2단계에서 투여되는 백신 조성물에 포함된 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 야생형 및/또는 변이형 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 알파, 베타, 델타, 감마 및 오미크론 변이형을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 알파, 베타, 델타, 감마 및 오미크론 변이형 중 어느 하나 이상의 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 (i) RBD 나노파티클 및 (ii) AS03을 약 1:1 의 용량으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 1회 투여량 기준 RBD 나노파티클을 5㎍ 내지 25㎍ 함량으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 근육 주사로 투여되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 약제학적 패키지 또는 키트 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물은 환자에게 투여하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 용어 "및/또는"은 본원에 사용되는 경우에 2가지의 명시된 특색 또는 구성요소 각각을 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 발명에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.
본원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "포함하는" 은, 일부 구체예에서, "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"을 지칭하는 것으로 수정될 수 있다.
본원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
RBD 나노파티클 및 면역증강제
본 발명의 RBD 나노파티클은 다량체성 단백질 조립체로서 "나노 구조체", "RBD 나노 구조체", 또는 "RBD-NP"로도 지칭할 수 있으며, (i) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및 (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 제1 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD); 나노 입자의 구조체 역할을 하는 제1 자가조립 폴리펩타이드; 및 상기 RBD와 상기 제1 자가조립 폴리펩타이드를 연결하는 링커(linker)를 포함하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 RBD 서열은 야생형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열일 수 있다. 다른 예로, 상기 RBD 서열은 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 서열일 수 있다. 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 서열의 일 예로, 서열번호 34 내지 36에 표시된, 베타, 델타 및 오미크론 중 선택되는 바이러스의 RBD 서열을 포함할 수 있다. 상기 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 일 예로, 베타 변이형을 들 수 있다.
일 예로, 상기 RBD 서열은 서열번호 21 내지 24 중 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 RBD 서열은 서열번호 21 또는 서열번호 22의 아미노산 서열 중 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 RBD 서열은 서열번호 21로 표시되는 서열일 수 있다.
상기 제1 폴리펩타이드 단량체는 N-말단 포스파타제 신호 펩타이드 서열 (MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVA)을 더 포함할 수 있다. 복수개의 단리된 제1 폴리펩타이드 단량체는 상호작용을 통해 자가-조립(self-assembly)되어 삼량체(trimer)를 형성할 수 있다. 이러한 조립은 비공유성 단백질-단백질 상호작용 반응을 통해 이루어질 수 있다.
상기 제2 폴리펩타이드는 나노 입자의 구조체 역할을 하는 제2 자가조립 폴리펩타이드 단량체로서, 복수 개의 단리된 제2 폴리펩타이드 단량체는 상호작용을 통해 자가-조립(self-assembly)되어 오량체(pentamer)를 형성할 수 있다. 이러한 조립은 비공유성 단백질-단백질 상호작용 반응을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 제1 폴리펩타이드는 국제특허공보 제2019-169120호에 기재된 폴리펩타이드 중 하나를 제1 자가조립 폴리펩타이드로서 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
다른 예로, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 SARS-CoV-2 RBD에 해당하는 아미노산 서열이 베타 변이형 SARS-CoV-2 RBD 서열로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
본 명세서에서 제1 폴리펩타이드의 일 예시인, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드는, "RBD-Component A", "Component A" 또는 "RBD-I53-50A"로 지칭할 수 있다.
또한, 서열번호 1의 폴리펩타이드에 포함되는 제1 자가조립 폴리펩타이드의 일 예시인 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드는 "I53-50A" 로 지칭할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 다른 예로, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 SARS-CoV-2의 RBD를 코딩하는 서열에 해당하는 영역이 베타 변이형 SARS-CoV-2 의 RBD 서열로 치환된 것일 수 있다. 상기 베타 변이형 SARS-CoV-2의 RBD 서열의 일 예로 서열번호 22의 서열을 들 수 있다.
상기 제2 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있고, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
본 명세서에서 서열번호 2의 폴리펩타이드는 "I53-50B" 또는 "Component B"로 지칭할 수 있다. 상기 제2 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 다량체성 단백질 조립체로의 조립을 교란시키지 않는 임의의 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어 아미노산의 결실, 삽입, 치환 또는 변형을 포함할 수 있다.
상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 국제특허공보 제2019-169120호, 미국 등록 특허 공보 제9630994호, 국제특허공보 제2021-163481호, 국제특허공보 제2021-163438호, 또는 국제출원번호 제PCT/US2021/037341호에 개시된 단백질을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 폴리펩타이드에 포함되는 제1 자가조립 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드로서 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열(국제 특허 공보 제2019-169120호의 서열번호 7, 29, 30, 31 또는 39의 아미노산 서열에 해당함)로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
일 예로, 상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드로서 서열번호 9 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열(국제 특허 공보 제2019-169120호의 서열번호 6, 8, 10, 27, 28, 32, 33 또는 38의 아미노산 서열에 해당함)로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 RBD 나노파티클은 제1 폴리펩타이드의 삼량체와 제2 폴리펩타이드의 오량체가 자가조립하여 형성될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 RBD 나노파티클은 상기 (i) 제1 폴리펩타이드(Component A)의 삼량체를 20개 포함하고, 상기 (ii) 제2 폴리펩타이드(Component B)의 오량체를 12개 포함하는 구조를 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 다량체성 단백질 조립체는 제1 폴리펩타이드(Component A)의 60개 카피 및 제2 폴리펩타이드(Component B)의 60개 카피를 포함한다.
본 발명의 RBD 나노파티클은 이십면체의 대칭구조를 가질 수 있다. 본 발명의 RBD 나노파티클은 약 30 nm 내지 약 70 nm의 직경을 가지며, 이때 내강(lumen) 은 가로로 약 15 nm 내지 약 32 nm일 수 있다. 일 예로, RBD 항원 부분을 제외하고 약 28nm 의 직경을 가질 수 있다.
상기 제1 폴리펩타이드 단량체를 생산하는 세포주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포주일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있으나, 세포주에서 제1 폴리펩타이드 단량체를 발현시키기에 적합한 벡터라면 제한없이 사용될 수 있다.
상기 제2 폴리펩타이드 단량체를 생산하는 세포주는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포주일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 pET 계열의 벡터일 수 있고, 예를 들어 pET29b+ 벡터일 수 있으나, 세포주에 제2 폴리펩타이드 단량체를 발현시키기에 적합한 벡터라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 서열번호 19로 표시되는 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 서열번호 20으로 표시되는 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 아미노산 서열 또는 염기 서열은, 서열 목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 여기서, "실질적인 동일성"은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열로서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상동성을 갖는 서열이며, 이들 상동성 범위에 있는 아미노산 서열 또는 염기서열도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에 도입되어 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀 (episome)으로 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단을 말한다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 같은 발현 조절 요소(element) 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈을 표적 단백질을 암호화하는 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 구체적으로는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다
본 발명의 일 구체예에 따른 상기 제1 폴리펩타이드 단량체를 생산하는 세포주의 숙주세포는 진핵세포이다. 상기 진핵세포는 진균세포 (fungus), 식물세포 또는 동물세포를 포함한다. 진균세포의 예로는 효모, 그 예로 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)의 효모, 일 예로 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 를 들 수 있다. 또한, 동물세포의 예로는 곤충세포 또는 포유동물 세포가 있고, 구체적인 동물세포의 예로는 HEK293, 293T, NSO, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Skn-sh, CaSki, C33A 등이 있다. 또한, 통상의 기술분야에 잘 알려져 있는 적당한 세포주들은 ATCC (American Type Culture Collection)와 같은 세포주 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 상기 제1 폴리펩타이드 단량체를 생산하는 세포주의 숙주세포는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)일 수 있으며, 일 예로 재조합 아데노-관련 바이러스 (recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV)에 의하여 Glutamine Synthetase 유전자의 6번 엑손이 넉아웃 (Knock-out)된 HD-BIOP3 세포를 사용할 수 있다.
상기 숙주세포에 상기 제1 폴리펩타이드 단량체를 코딩하는 유전 서열을 갖는 발현 벡터를 도입하기 위해서는 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법이든 사용할 수 있고, 숙주세포에 따라 통상의 기술분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 열충격법 (Heat Shock), 전기천공법 (Electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 RBD 나노파티클과 함께 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장성 작용제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립되지 않는 것을 제외하고는, 치료 또는 약학적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 완제의약품과 면역증강제로 구성된다. 완제의약품에는 주성분인 RBD 나노파티클 외에 완충제, 안정제 및 용제를 포함할 수 있다. 완충제로는 염화나트륨, 트로메타민을 사용할 수 있고, 안정제로는 L-아르기닌, 백당(수크로스 또는 자당)을 사용할 수 있다. 면역증강제로는 보조제, 안정제, 등장화제 및 완충제의 조합을 포함하는 조성물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "면역증강제"는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 본 발명의 백신 조성물은 RBD 나노파티클과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 다양한 면역증강제를 포함하며, 본 발명의 면역증강제는 AS03일 수 있다. 본 발명의 AS03은 폴리소르베이트-80, 스쿠알렌 및 알파-토코페롤을 포함한다.
본 발명에 있어서, 면역증강제는 보조제, 안정제, 등장화제 및 완충제를 포함하는 것일 수 있다.
상기 보조제는 스쿠알렌 및 알파-토코페롤을 모두 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "보조제"는 수중유(W/O) 에멀젼을 포함하는 의미 이다. 상기 스쿠알렌은 스쿠알렌, 이의 유사체 또는 임의의 약학적으로 허용가능한 오일을 포함한다. 상기 알파-토코페롤은 알파-토코페롤 또는 이의 유사체 및 유도체를 포함한다.
상기 스쿠알렌(2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산)은 상어간유에서 대량으로, 그리고 올리브유, 밀배아유, 쌀겨오일, 및 이스트에서 소량으로 발견되는 불포화 오일이다.
상기 스쿠알렌은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 약 5 mg 내지 15 mg으로 포함될 수 있고, 6 mg 내지 14mg, 7 mg 내지 13 mg, 8 mg 내지 12 mg, 9 mg 내지 11 mg, 10 mg 내지 11 mg로 포함될 수 있으며, 약 10 mg 내지 11 mg로 첨가될 수 있다. 만일 상기 스쿠알렌이 5 mg 미만으로 포함되면 충분한 면역원성 유도가 어렵고, 15 mg를 초과하여 포함되면 세포의 지질 대사 교란 가능성이 증가하는 문제점이 있다. 스쿠알렌을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 알파-토코페롤은 스테롤에 해당하며, 본 발명에 적용가능한 다른 스테롤로는 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 에르고칼시페롤을 들 수 있다.
상기 알파-토코페롤은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 약 5 mg 내지 15 mg으로 포함될 수 있고, 6 mg 내지 14mg, 7 mg 내지 13 mg, 8 mg 내지 12 mg, 9 mg 내지 12 mg, 10 mg 내지 12 mg로 포함될 수 있으며, 10 mg 내지 12 mg로 첨가될 수 있다. 알파-토코페롤을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 안정제는 폴리소르베이트 80을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "안정제"는 계면활성제를 포함하는 의미이다. 본 발명에 적용가능한 다른 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 21, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 61, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85, PEG3350 및 그의 혼합물일 수 있다.
상기 폴리소르베이트 80은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 약 1 mg 내지 10 mg으로 포함될 수 있고, 약 2 mg 내지 9 mg, 3 mg 내지 8 mg, 4 mg 내지 7 mg, 4 mg 내지 6 mg, 4 mg 내지 5 mg로 포함될 수 있으며, 4 mg 내지 5 mg로 포함될 수 있다. 폴리소르베이트 80을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 등장화제는 염화나트륨 및 염화칼륨 모두를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "등장화제"는 백신을 액상으로 체내에 투여할 때 체내에서 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하는 제제를 나타낸다.
상기 염화나트륨은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 100 mM 내지 150 mM로 첨가될 수 있고, 103 mM 내지 147 mM, 106 mM 내지 144 mM, 109 mM 내지 141 mM, 112mM 내지 138 mM, 115 mM 내지 135 mM, 118 mM 내지 132 mM, 120 mM 내지 129 mM, 120 mM 내지 126 mM, 또는 120 mM 내지 123 mM으로 포함될 수 있고, 120 mM 내지 123 mM 으로 포함될 수 있다. 염화나트륨을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 염화칼륨은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 약 0.1 mM 내지 10 mM로 포함 될 수 있고, 0.5 mM 내지 9 mM, 1 mM 내지 8 mM, 1.5 mM 내지 7 mM, 2 mM 내지 6 mM, 2 mM 내지 5 mM, 2 mM 내지 4 mM, 또는 2 mM 내지 3 mM으로 포함될 수 있고, 2 mM 내지 3 mM 으로 포함될 수 있다. 염화칼륨을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 완충제는 인산나트륨 및 인산칼륨 모두를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "완충제"는 첨가되는 용액 내에서 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 하는 제제를 나타낸다.
상기 인산나트륨은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 약 4 mM 내지 12 mM로 포함될 수 있고, 4.5 mM 내지 11.5 mM, 5 mM 내지 11 mM, 5.5 mM 내지 10.5 mM, 6 mM 내지 10 mM, 7 mM 내지 9.5 mM, 7 mM 내지 9 mM, 7 mM 내지 8.5 mM, 7 mM 내지 8 mM로 포함될 수 있으며, 7 mM 내지 8 mM로 포함될 수 있다. 인산나트륨을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 인산칼륨은 면역증강제 0.25 ml에 대하여, 약 0.01 mM 내지 5 mM로 포함될 수 있고, 0.05 mM 내지 4.5 mM, 0.1 mM 내지 4 mM, 0.5 mM 내지 3.5 mM, 1 mM 내지 3 mM, 1 mM 내지 2 mM로 포함될 수 있고, 1 mM 내지 2 mM로 포함될 수 있다. 인산칼륨을 상기 범위 내로 면역증강제에 포함시키면, 항원으로 사용되는 RBD 나노파티클의 면역원성을 향상시킬 수 있다(실시예 1).
상기 면역증강제는 보조제로서 스쿠알렌 및 알파-토코페롤을 포함하고, 안정제로서 폴리소르베이트 80을 포함하며, 등장화제로서 염화나트륨 및 염화칼륨을 포함하고, 완충제로서 인산나트륨 및 인산칼륨을 포함할 수 있다. 또는 상기 면역증강제에 사용되는 성분들의 2개 이상의 조합이 상기 RBD 나노파티클과 함께 제형화되고, 접종되었을 때 사스-코로나바이러스-2에 대해서 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 면역증강제를, 항원인 상기 RBD 나노파티클과 혼합하여 접종하면, IgG항체가와 중화항체가가 증가하므로 사스-코로나바이러스-2 감염증 예방 효과가 우수하다(실시예 1).
일 예로, 상기 면역증강제 및 상기 RBD 나노파티클은 각각 별도 용기에 보관될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 면역증강제; 및 상기 RBD 나노파티클, 염화나 트륨, 트로메타민, L-아르기닌 및 백당을 포함하는 완제의약품은 각각 별도의 용기에 보관되는 형태로 제공되며, 사용 직전에 혼합하여 백신 접종에 사용될 수 있다.
AS03의 경우 에멀젼(emulsion) 형태로 존재하기 때문에 별도의 용기에 포함되어 제공됨으로써 백신과 혼합액으로 인해 물성 변화를 가져올 가능성을 낮출 수 있고 백신의 항원물질 안정성을 확보하는 데 도움을 줄 수 있다.
다른 예로, 상기 면역증강제는 상기 완제의약품과 혼합되어 보관될 수 있다.
상기 면역증강제는 상기 RBD 나노파티클의 1회 용량에 대하여, 0.5배 내지 3배의 용량으로 혼합될 수 있고, 0.6배 내지 2.9배, 0.7배 내지 2.8배, 0.8배 내지 2.7배, 0.9배 내지 2.6배, 1.0배 내지 2.5배, 1.1배 내지 2.4배, 1.2배 내지 2.3배, 1.3배 내지 2.2배, 1.4배 내지 2.1배, 1.5배 내지 2.0배, 1.6배 내지 1.9배, 1.7배 내지 1.8배의 용량으로 혼합될 수 있고, 0.7배 내지 1.5배, 1.0배 내지 1.2배의 용량으로 혼합될 수 있고, 1:1의 용량으로 혼합될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 면역증강제를 상기 범위 내로 포함하면, IgG항체가와 중화항체가가 증가하므로 사스-코로나바이러스-2 감염증 예방 효과가 우수하다(실시예 1).
본 발명의 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역을 형성하거나 유지하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 야기하는 바이러스를 의미한다. 따라서 본 발명의 면역원성 조성물 또는 이를 포함하는 백신 조성물, 부스터 조성물은 COVID-19(코로나바이러스감염증-19) 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스는 SARS-CoV-2로 분류될 수 있는 모든 변이 형태 또한 제한 없이 포함하며, 그 예시로 알파(예를 들어 B.1.1.7), 베타(예를 들어 B.1.351), 감마 (예를 들어 P.1, P.1.1, P.1.2), 델타(예를 들어 B.1.617.2), 엡실론(예를 들어 B.1.427, B.1.429) 에타(예를 들어 B.1.525), 이오타(예를 들어 B.1.526), 카파(예를 들어 B.1.617.1), 제타(예를 들어 P.2), 뮤(예를 들어 B.1.621, B.1.621.1), 오미크론(예를 들어 B.1.1.529 및 BA 계통) 변이로 칭해지는 변이를 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스는 알파, 베타, 감마, 델타 및 오미크론 변이형 바이러스 중 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 야생형 SARS-CoV-2 바이러스는 우한주(Wuhan strain)으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 바이러스의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열과 관련된 정보는 공지된 데이터베이스, 예를 들어 NCBI Genbank, GISAID와 같은 데이터베이스로부터 수득하거나 수득하거나 한국질병관리청(KCDC) 산하 국가병원체자원은행에서 제공하는 바이러스를 분양받아 분석함으로써 수득할 수 있다. 그 예로, 야생형 우한주(Wuhan/WIV04/2019, BetaCoV/Korea/KCDC03/2020)의 정보는 GISAID accession ID: EPI_ISL_402124에서, 베타 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 정보는 GISAID accession ID: EPI_ISL_712096에서, 델타 변이형 SARS-CoV-2 바이러스의 정보는 GenBank Accession ID: QTW89558.1에서 얻을 수 있다.
본 발명의 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 면역학적으로 활성인 성분은 RBD 나노파티클일 수 있다.
본 발명의 "부스터 백신 조성물"은 보호 면역을 증진, 연장 또는 유지하기 위해 환자에게 투여되는 일정 용량의 면역원을 포함하는 조성물을 의미한다. 상기 부스터 백신 조성물은 IgG 항체가와 중화항체의 하향 조절을 극복하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물, 부스터 백신 조성물이 투여되는 개체는 임의의 포유동물일 수 있고, 구체적으로 사람일 수 있다.
본 발명의 부스터 백신 조성물이 투여되는 대상은 기존에 백신을 접종함으로써 면역원성 물질에 노출되어 보호 면역을 이미 형성한 바 있는 개체일 수 있다. 이 때 기존 백신 접종 시점과 시간적 차이를 두고 투여되는 백신 조성물을 "부스터 백신 조성물"로 지칭할 수 있다. 일 예로 본 발명의 부스터 백신 조성물이 투여되는 개체는 기존에 백신을 2회 이상 접종한 이력이 있을 수 있고, 예를 들어 백신 접종을 2회 수행한 대상일 수 있다.
본 발명의 조성물은 주입 또는 주사 (예: 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 경막내, 십이지장내, 복강내 등)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 비내, 질, 직장, 경구, 또는 경피로 투여될 수 있다. 다른 예로, 백신 조성물은 "바늘-없는" 전달 시스템에 의해 투여될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 조성물은 근육 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물이 2회 이상 투여될 경우, 조성물이 투여되는 시간적 간격은 예를 들어 14일 이상일 수 있다.
일 예로, 본 발명의 부스터 백신 조성물은 마지막 백신 접종일로부터 28일 이상 경과된 시점에 투여될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 부스터 백신 조성물은 마지막 백신 접종일로부터 28일 내지 300일이 경과된 시점에 투여될 수 있다.
일 예로, 개체가 기존에 면역원성 물질에 노출된 경험이 없을 경우 백신 조성물을 3회 이상 투여할 수 있다. 상기 투여에 있어서, 첫 번째 투여와 두 번째 투여 간의 시간적 간격은 14일 이상일 수 있고, 예를 들어 28일 이상일 수 있다. 그 예로 28일 내지 32일 일 수 있다. 상기 투여에 있어서, 두 번째 투여와 세 번째 투여 간의 시간적 간격은 14일 이상일 수 있고, 예를 들어 28일 이상일 수 있다. 그 예로, 28일 내지 300일일 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여되는 대상이 기존에 노출된 적이 없는 변이형 SARS-CoV-2 바이러스에 대해서도 보호 면역을 형성하는 효과가 있으므로, 개체에 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물이 투여되는 용량은 인종, 양육 (breed), 치수, 신장, 체중, 연령, 환자의 전체적 건강 상태, 제형의 유형, 투여 방식 또는 방법 등을 포함하여 많은 변수에 의존적일 수 있다. 일 예로, 본 발명의 조성물은 1회 용량 당 RBD 나노파티클을 약 5 μg 또는 25μg 함량으로 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 조성물은 1회 용량 당 RBD 나노파티클을 약 10 μg 또는 25μg 함량으로 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 조성물은 0.25 ml당 SARS-CoV-2 RBD 나노파티클 약 5 μg, 10 μg 또는 25μg 함량으로 포함할 수 있다. 이때 투여되는 AS03은 상기 RBD 나노파티클을 포함하는 조성물과 동일한 부피로 투여될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 조성물은 SARS-CoV-2 RBD 나노파티클을 5 μg, 10 μg 또는 25μg 함량으로 포함하는 0.25 ml RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클 조성물; 및 AS03 0.25ml를 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 용어 "예방" 이란 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적 패키지 또는 키트 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 패키지 또는 키트는 피험자에게 투여하는 수단 및/또는 완충제, 바이알, 테플론 백 또는 면역원성 조성물의 주입에 통상 사용되는 주입 백을 추가로 포함하는 것으로 상정된다. "수단"은 시린지, 주사 니들, 캐뉼라, 카테터, 주입 백, 운반체, 바이알, 완충제, 안정화제, 본 발명의 각 용량 및 주입액의 제조에 있어서 숙련가를 보조하는 서면 지침으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제품을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 부작용 없이 IgG 항체가와 중화항체를 높은 수준으로 유지하도록 하므로 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 면역을 형성하거나 높은 수준으로 유지되도록 한다. 또한 변이형 SARS-CoV-2 감염에 대해서도 면역을 형성할 수 있으므로 진화 패턴에서 발생할 수 있는 다양한 변이형 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 효과적인 예방이 가능하다.
도 1은 부스터샷에 의한 SARS-CoV-2 우한주에 대한 면역 형성 효과를 FRNT50 IU/mL로 확인한 것이다.
도 2는 부스터샷에 의한 SARS-CoV-2 우한주에 대한 면역 형성 효과를 FRNT50 Original scale로 확인한 것이다.
도 3은 부스터샷에 의한 SARS-CoV-2 우한주에 대한 면역 형성 효과를 ELISA IgG Ab titer, BAU/mL 로 확인한 것이다.
도 4는 부스터샷에 의한 SARS-CoV-2 우한주에 대한 면역 형성 효과를 ICS Assy로 확인한 것이다. ICS Assay는 전체 81명의 참가자 중 17명에 대해서만 수행하였다.
도 5는 부스터샷에 의한 SARS-CoV-2 오미크론 변이주에 대한 면역 형성 효과를 FRNT50 Original scale로 확인한 것이다.
도 6은 프라임 백신만 접종한 경우와 비교하여 부스터샷 접종 시의 이상 반응(AE: adverse event)을 확인한 결과이다.
도 7은 실시예 3에 기재된 바와 같이 마우스에 백신을 3회 접종하여 2주, 5주, 8주 시점에 혈청 시료를 분석한 면역원성 시험 결과이다.
도 8은 실시예 3에 기재된 바와 같이 마우스에 1차 면역 이후 8주차에 채취한 혈청 시료를 이용한 CPE 기반 중화 실험을 수행한 결과이다.
도 9 내지 11은 실시예 3에 기재된 바와 같이 마우스에 백신을 3회 접종한 후 공격 시험을 수행하여, 체중, 체온, 생존율을 기록한 결과이다.
도 12는 마우스에서의 생바이러스 공격 (live virus challenge) 실험 결과 폐에서의 바이러스 부하(virus load) 수준을 나타낸 것이다.
도 13은 마우스에서의 바이러스 부하(virus load: 맨 위), 사이토카인 분석(중간) 및 폐 조직병리학 (아래)을 관찰한 결과이다.
도 14는 영장류 모델에서 RBD 특이적 IgG의 역가를 확인한 결과이다.
도 15 및 도 16은 영장류 모델에서 야생형 및 변이형 SARS-CoV-2에 대한 PBNA 측정 결과로, 도 15는 야생형, 델타 및 베타 변이형, 도 16은 오미크론 변이형 및 야생형 SARS-CoV-2에 대한 결과이다.
도 17은 영장류 모델에서 RBD 항원에 특이적으로 반응하는 IFN-감마 분비 T 세포를 확인한 결과이다.
도 18 및 도 19는 각각 영장류 모델의 비강 스왑(도 18) 및 기관지 폐포 (Bronchoalveolar Lavage: 도 19)에서 측정한 바이러스 부하를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: RBD 나노파티클의 제조
SARS-CoV-2 바이러스의 표면의 삼량체(trimer) 당단백질은 스파이크 당단백질이라고도 불리며, 삼량체 당단백질의 상단에 있는 수용체 결합도메인(Receptor binding domain, RBD)이 인체 세포 표면의 ACE2 수용체 단백질에 결합함으로써 감염을 일으킨다. 상기 RBD는 나노 파티클과 조합되어 RBD-나노파티클로 제조된다.
상기 RBD-나노파티클은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 Component A의 조립된 삼량체 20개와 서열번호 2로 표시되는 Component B의 오량체 12개의 자가조립(self-assemble)에 의하여 형성된다. 상기 RBD-Component A는 는 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질의 RBD, 나노입자의 구조체 역할을 하는 I53-50A, RBD와 I53-50A를 연결하는 링커 (GGSGGSGSGGSGGSGSEKAAKAEEAAR)로 구성된다.
재조합 나노파티클 코로나바이러스 백신을 제조하기 위해, RBD-Component A 단백질 제조에는 CHO 세포주(Stable cell line)를 사용하고, Component B 단백질 제조를 위해 대장균 세포주를 사용하였으며, 각 성분의 제조에 대해서는 하기 제조예 1-1 및 1-2에 상세하게 설명하였다.
1-1. RBD-Component A 단백질 제조
SARS-CoV-2 백신의 항원으로 사용되는 RBD-Component A 생산을 위해 영국 HORIZON Discovery 사에서 분양 받은 HD-BIOP3 세포주를 숙주세포로 사용하였다. 또한, Donor plasmid (pJV145)에 SalI/NotI 제한 효소 반응을 이용해 합성한 RBDComponent A cDNA (NT-SARS-CoV-2RBD-I53-50A-16GS-he)를 삽입하여 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560)를 제작하였다. 상기 M-2560 벡터는 서열번호 19로 표시되는 DNA 서열을 갖는다. 재조합 발현 벡터 plasmid (M-2560) 내 주요 유전자 위치 및 기능에 대한 정보는 표 1에 요약되어 있다.
발현 벡터 내 유전자 위치 정보
Nucleotide position 440-593 SV40 early promoter
Nucleotide position 668-1,789 GS gene
Nucleotide position 2,257-2,319 3' PiggyBac transposon-specific right ITR(inverted terminal repeat sequence)
Nucleotide position 2,951-2,985 5' PiggyBac transposon-specific left ITR
Nucleotide position 3,275-4,477 cHS4 insulator gene
Nucleotide position 4,484-4,955 mCMV promoter
Nucleotide position 6,264-7,667 NT-SARS-CoV-2RBD-I53-50A-16GS-he
CHO 세포주 유래 Component A 중간체 원액은 통상의 단백질 발현 및 정제 방법에 의해 얻었다. CHO 세포주 유래 Component A 중간체 원액에 대한 peptide mapping 분석 결과 100 %의 peptide coverage를 확보하였으며 예상되는 펩티드 서열과 상호 동등함을 확인하여, 중간체 원액이 목적하는 Component A 단백질임을 확인하였다.
1-2. Component B 단백질 제조
Component B 단백질 제조를 위해 Thermofisher 사에서 분양받은 대장균 BL21 균주를 사용하였다. Component B 단백질 발현을 위한 벡터로 pET29b+를 사용하였다. pET29b+에 Component B 단백질의 유전자가 삽입되면 총 5.7kb의 서열 (벡터: 5.4kb)의 I53-50B 벡터가 제조된다. 상기 벡터는 카나마이신 저항성 유전자 및 락토즈(Lactose) 및 그 유도체에 의해 전사가 유도되는 Lac 오페론(Operon) 및 람다 파지유래의 T7 프로모터(Promoter) 영역, 다중클로닝부위 (Multiple cloning site) 등으로 구성되어 있다. 다중클로닝 부위에는 여러 제한효소 서열을 가지고 있어서 항원단백질의 도입을 위한 주요한 역할을 하는 부위이다. 상기 I53-50B 벡터는 서열번호 20으로 표시되는 DNA 서열을 갖는다. I53-50B 벡터 내 주요 유전자 정보를 하기 표 2에 나타낸다.
Nucleotide position 12-467 f1 origin
Nucleotide position 560-1375 KanR
Nucleotide position 1471-2144 pUCorigin
Nucleotide position 4598-4675 LacI promoter
Nucleotide position 4988-5007 T7promotor
Nucleotide position 5007-5031 Lac operator
Nucleotide position 5076-5549 I53-50B
Nucleotide position 5645-5688 T7terminator
대장균 유래 Component B 중간체 원액은 통상 단백질 발현 및 정제 방법에 의해 얻었다. Component B 중간체 원액의 아미노산 서열은 이론적 아미노산 서열과 100 % 일치함을 확인하였다.
1-3. 재조합 RBD 나노파티클 원액 제조
제조된 Component A 중간체 원액 및 Component B 중간체 원액을 이용하여 조립 공정을 통해 재조합 RBD 나노파티클 원액(원료의약품)을 제조하였다.
1-3-1. 재조합 RBD 나노파티클 원액 제조
Component A 원액 및 Component B 의 반응 비율이 몰 농도 기준으로 1 : 1.1 이 되도록 혼합하여 조립하였다. 이때 반응조건은 상온, 1시간, 80 rpm의 교반속도로 반응하며 반응이 완료되면 반응액은 0.2 μm 필터로 여과하였다. 여과된 assembly 반응액을 0.7m2 면적의 300kDa MWCO(Molecular weight cut-off) 멤브레인이 장착된 접선유동여과(Tangential flow filtration)시스템을 이용하여 4 kg으로 농축(Ultrafiltration)하고, 농축액 10배 부피의 50 mM 트리스 완충액을 이용하여 완충액교환(Diafiltration)을 실시하여 회수하였다. 이 때, 막간차압(Transmembrane pressure, TMP)은 1 bar 이하로 유지하였다. 한외여과 회수액을 0.2 μm 필터로 여과하여 -70℃이하 초저온 냉동고에서 보관하였다.
1-3-2. 재조합 RBD 나노파티클 원액의 입자 형태 확인
재조합 RBD 나노파티클 원액은 Component A 중간체 원액 및 Component B 중간체 원액의 결합에 의해 형성되는 입자 형태의 분자이다. 이러한 입자 형태의 분자는 컴퓨터적으로 설계되어 적절한 결합이 발생하였을 경우 일정한 크기의 분자를 형성하게 된다. 단백질의 분자크기를 측정하는 방법 중, 일반적으로 이용되고 있는 방법은 동적광산란(Dynamic Light Scattering) 방법으로 이를 통해 형성된 나노파티클 분자 크기를 측정하여 적절한 구조를 형성하였는지 확인할 수 있다. Component A 중간체 원액 및 Component B 중간체 원액을 이용하여 조립 공정을 통해 제조된 나노파티클 원액의 크기를 동적광산란법에 의해 측정한 결과 이론적 예측 수치인 40 ~ 70 nm의 크기를 갖는 것을 확인하였다.
1-4. RBD 나노파티클 AS03 제형의 제조
제형(formulation) 공정을 통해서 최종 원액을 제조하였다. 상기 제형 공정에서 면역 증강제로서, 보조제, 안정제, 등장화제 및 완충제를 포함하는 조성물인 AS03(GSK)을 사용하였다. 수산화알루미늄은 최종 원액에 미리 혼합하였다. 최종 원액은 RBD 나노파티클 AS03 제형으로 명명하였다.
실시예 1. RBD 나노파티클 AS03 제형의 면역원성 확인
실험은 19세 내지 85세의 연령의 80명의 성인을 대상으로 수행하였다. 연구개입(study intervention)은 본 연구 프로토콜에 따른 연구 참가자들에게 부여된다고 여겨지는 임의의 조사 개입, 제품, 플라시보 또는 의료 장비로 정의된다. 표 3에 면역증강제로서 AS03(GSK)을 혼합하기 위해 사용되는 원료의약품(완제의약품)(0.25 ml)의 분량 및 규격을 나타내고, 표 4에 AS03이 혼합된 원료의약품(0.5ml)(이하, RBD 나노파티클 AS03 제형)의 분량 및 규격을 나타내며, 표 5에 AS03이 혼합되지 않은 원료의약품(0.5ml)의 분량 및 규격을 나타낸다. 표 6에 개입된 원료의약품의 정보를 나타낸다.
AS03 혼합시 사용되는 원료의약품(0.25 ml)의 분량 및 규격
원료명 고함량
(25 μg/dose1))		 저함량
(10 μg/dose1))
주성분 재조합 코로나-19 표면항원단백 나노파티클 (제조예 1의 RBD 나노파티클) 25 μg1) 10 μg1)
완충제 염화나트륨 2.192 mg 2.192 mg
완충제 트로메타민 1.514 mg 1.514 mg
안정제 L-아르기닌 4.355 mg 4.355 mg
안정제 백당 12.5 mg 12.5 mg
용제 주사용수 적량 적량
1) 재조합 코로나-19 표면항원단백질(RBD)로서 분량
AS03이 혼합된 원료의약품(0.5ml)의 분량 및 규격
RBD 나노파티클 0.25 ml
원료명 고함량
(25 μg/dose1))		 저함량
(10 μg/dose1))
주성분 재조합 COVID-19 표면항원단백 나노파티클 (제조예 1의 RBD 나노파티클) 25 μg1) 10 μg1)
완충제 염화나트륨 2.192 mg 2.192 mg
완충제 트로메타민 1.514 mg 1.514 mg
안정제 L-아르기닌 4.355 mg 4.355 mg
안정제 백당 12.5 mg 12.5 mg
용제 주사용수 적량 적량
면역증강제 AS03 0.25 ml
보조제 스쿠알렌 10.69 mg 10.69 mg
보조제 알파-토코페롤 11.86 mg 11.86 mg
안정제 폴리소르베이트 80 4.86 mg 4.86 mg
등장화제 염화나트륨 121 mM 121 mM
등장화제 염화칼륨 2.38 mM 2.38 mM
완충제 인산나트륨 7.14 mM 7.14 mM
완추žy 인산칼륨 1.30 mM 1.30 mM
용제 주사용수 적량 적량
1) 재조합 코로나-19 표면항원단백질(RBD)로서 분량
AS03이 혼합되지 않은 원료의약품(0.5ml)의 분량 및 규격
원료명 고함량
(25 μg/dose1))		 저함량
(10 μg/dose1))
주성분 재조합 코로나-19 표면항원단백 나노파티클 25 μg1) 10 μg1)
완충제 염화나트륨 4.383 mg 4.383 mg
완충제 트로메타민 3.029 mg 3.029 mg
안정제 L-아르기닌 8.71 mg 8.71 mg
안정제 백당 25 mg 25 mg
용제 주사용수 적량 적량
1) 재조합 코로나-19 표면항원단백질(RBD)로서 분량
개입 명칭 SARS-CoV-2 재조합 단백질 나노파티클 백신(RBD 나노파티클)-AS03
유형 백신
용량(dose) 제형 SARS-CoV-2의 외부 표면에 드러난 RBD, 즉 자가조립 단백질 나노파티클
1회 투여량 AS03으로 보조되거나/보조되지 않은 RBD 나노파티클(RBD 10 μg 또는25 μg/용량); 총 주사 부피는 0.5mL임.
정량(dosage) 수준 RBD 나노파티클(단독 투여): 0.5mL당 SARS-CoV-2 RBD 나노파티클 10μg 또는 25μg
RBD 나노파티클(AS03 혼합 투여): 0.25 ml당 SARS-CoV-2 RBD 나노파티
클 10 μg 또는 25μg , AS03: 0.25 ml
투여 경로 근육내 주사
보관 조건 2~8℃
백신 접종 연구에는 식염수 플라시보(0.5ml), AS03이 혼합된 RBD 나노파티클 또는 AS03이 혼합되지 않은 RBD 나노파티클을 사용하였고, 이때 RBD 나노파티클에서 RBD 함량은 10ug 또는 25ug이다. 플라시보, RBD 나노파티클-AS03 제형, RBD 나노파티클을 각각 근육내로 2회 주사하였다. RBD 나노파티클 백신을 AS03으로 1:1 비율로 보조하도록 하기 위해, AS03을 약 3ml 포함하고 있는 바이알로부터 AS03을 0.35ml 빼내었고, AS03 0.35ml을 RBD 나노파티클(용량당 RBD 10ug 또는 25ug)을 0.35ml 포함하고 있는 다른 바이알로 넣었다. 각 투여에서, RBD 나노파티클을 단독으로 0.65ml 포함하는 바이알, 또는 AS03과 혼합된 RBD 나노파티클을 0.7ml 포함하는 바이알, 또는 생리식염수 20ml 앰플 중 어느 하나로부터 0.5ml을 빼내었다. 상기 바이알 또는 앰플 내의 잔여 부피는 폐기하였다. 본 백신 연구는 팔 윗쪽의 어깨세모근에 28일 간격으로 0일차, 28일차에 주사하였다.
표 7에 AS03 제형의 실험 대상을 나타낸다. 표 7의 배정된 군(intention-totreat set, ITT군), 안정성군(safety set), 모든 분석 대상자군(full analysis set, FA군), 계획서 순응 임상시험대상자군(per protocol set, PP군)은 의약품 임상시험에서 널리 알려진 분석 모집단이다. 분석 모집단은 임상시험에 참여한 피험자 중에 통계분석에 포함되는 피험자들의 집단을 의미한다.
RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 RBD 나노파티클 10 ug RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 RBD 나노파티클 25 ug 플라시 보 합계
무작위배정, n 20 10 20 10 20 80
ITT군, n (%) 20 (100.00) 10 (100.00) 20 (100.00) 10 (100.00) 20 (100.00) 80 (100.00)
안정성군, n (%) 20 (100.00) 10 (100.00) 20 (100.00) 10 (100.00) 20 (100.00) 80 (100.00)
FA군, n (%) 20 (100.00) 10 (100.00) 20 (100.00) 10 (100.00) 20 (100.00) 80 (100.00)
PP군으로부터 제외된 기준, n (%) 0 (0.00) 0 (0.00) 2 (10.00) 1 (10.00) 1 (5.00) 4 (5.00)
참여자가 백신 접종 스케줄을 완료하지 않음 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 1 (10.00) 0 (0.00) 1 (1.25)
참여자가 적절한 시간대에 연구 개입을 받지 않음 0 (0.00) 0 (0.00) 1 (5.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 1 (1.25)
혈액 샘플 중 어느 하나가 채취되지 못했거나, 7차 방문까지 적절한 시간대에 채취되지 못 함(4차 방문 후 28일+5) 0 (0.00) 0 (0.00) 1 (5.00) 0 (0.00) 1 (5.00) 2 (2.50)
PP군, n (%) 20 (100.00) 10 (100.00) 18 (90.00) 9 (90.00) 19 (95.00) 76 (95.00)
ITT군 (%): (ITT군의 수 / 무작위배정된 참가자의 수) * 100
안정성군 (%): (안정성군의 수 / ITT군의 수) * 100
FA군 (%):(FA군의 수 / 안정성군의 수) * 100
PP군으로부터 제외된 기준 (%): (PP군으로부터 제외된 각 기준의 수/ FA군의 수) * 100
PP군 (%):(PP군의 수 / FA군의 수) * 100
1-1. IgG 항체의 기하평균역가 및 혈청변환율로 면역원성 확인
상기 표 7에 기재된 실험 대상에 RBD 나노파티클 AS03 제형(10 μg 또는 25μg) 및 RBD 나노파티클 단독(10 μg 또는 25 μg)를 각각 투여한 후 ELISA로 SARS-CoV-2-RBD에 대한 IgG 항체의 기하평균역가(Geometric Mean titer) 및 혈청변환율(Seroconversion rate)을 확인하였다. 기하평균역가(Geometric mean titer, GMT)는 모든 값을 곱하고 이 수치의 n차 루트 값을 취해(여기서 n은 가용한 자료가 있는 시험대상자의 수), 시험대상자 집단에 대한 평균 항체 역가를 계산하는 방법이다. 기하평균증가비율(Geometric Mean Fold Rise, GMFR)은 백신 접종 전 베이스 라인 대비 백신 접종 후 기하평균농도 또는 기하평균역가의 증가비율을 나타낸다. 95% 신뢰구간(confidence interval, CI)이며, 신뢰구간은 모집단 평균과 목표값의 차이가 될 수 있는 값의 범위를 제공한다. 표 8에 RBD 나노파티클 AS03 제형(저함량 및 고함량) 및 RBD 나노파티클 단독 투여에 대한 IgG 항체의 기하평균역가 및 혈청변환율을 나타내며, 표 8에서 "P-값 vs 플라시보"의 결과의 "t"는 "t-검정(t-test)"결과를 나타낸다. t-검정은 평균을 비교할 수 있는 통계 가설 검정이다.
RBD 나노파티클 10ug
AS03 제형
(N=20)		 RBD 나노파티클 10ug
(N=10)		 RBD 나노파티클 25ug
AS03 제형 (N=18)		 RBD 나노파티클 25ug
(N=9)		 플라시보
(N=19)
기하평균역가(GMT) 및 혈청변환율 베이스라인
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 11.81±1.56 10.95±1.61 12.34±1.62 13.10±1.46 10.74±1.61
95% CI (하한, 상한) (9.58, 14.55) (7.78, 15.40) (9.71, 15.67) (9.77, 17.57) (8.54, 13.49)
P-값 vs 플라시보 0.5218 t 0.9175 t 0.3823 t 0.2821 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 0.6709 t 0.7732 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 0.7478 t
4차 방문 (1차 백신 접종 4주 후)
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 192.85±1.88 37.72±2.03 212.06±2.10 33.57±1.70 13.58±1.64
95% CI (하한, 상한) (143.40, 259.35) (22.74, 62.56) (146.66, 306.62) (22.28, 50.59) (10.68, 17.26)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t 0.0001 t <0.0001 t 0.0002 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 <0.0001 t 0.6728 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 <0.0001 t
GMFR±표준 편차 16.33±2.31 3.45±1.91 17.19±2.41 2.56±1.77 1.26±1.59
95% CI (하한, 상한) (11.03, 24.17) (2.17, 5.47) (11.10, 26.62) (1.65, 3.98) (1.01, 1.58)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t 0.0018 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 <0.0001 t 0.8552 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 <0.0001 t
6차 방문 (2차 백신 접종 2주 후)
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 2,613.48±1.76 155.30±3.05 3,089.00±1.61 187.38±3.02 10.71±1.71
95% CI (하한, 상한) (2,005.78, 3,405.31) (70.02, 344.47) (2,435.08, 3,918.53) (80.13, 438.13) (8.28, 13.86)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 <0.0001 t 0.3346 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 <0.0001 t
GMFR±표준 편차 221.31±2.18 14.19±2.58 250.39±1.85 14.30±2.96 1.00±1.76
95% CI (하한, 상한) (153.81, 318.44) (7.21, 27.92) (184.42, 339.95) (6.20, 32.98) (0.76, 1.31)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 <0.0001 t 0.5935 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 <0.0001 t
7차 방문 (2차 백신 접종 4주 후)
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 2,039.93±1.70 132.64±2.76 2,366.09±1.60 167.21±2.69 14.37±1.71
95% CI (하한, 상한) (1,589.58,
2,617.87)		 (64.23,
273.91)		 (1,871.90,
2,990.75)		 (78.05,
358.21)		 (11.10,
18.60)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 <0.0001 t 0.3717 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 <0.0001 t
GMFR±표준 편차 172.74±2.03 12.12±2.37 191.79±1.88 12.76±2.74 1.34±1.77
95% CI (하한, 상한) (124.00, 240.64) (6.54, 22.47) (140.21, 262.34) (5.88, 27.70) (1.02, 1.76)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t <0.0001 t
P-값 vs RBD 나노파티클 10ug AS03 제형 <0.0001 t 0.6350 t
P-값 vs RBD 나노파티클 25ug AS03 제형 <0.0001 t
표 8에 기재된 바와 같이, 본 발명의 RBD 나노파티클 AS03 제형을 1차 및 2차 백신 접종한 후 IgG 항체의 GMT가 베이스라인 대비 현저히 증가하여 유의한 면역원성을 나타내었다. RBD 나노파티클 AS03 제형 저함량 및 고함량 모두, GMT가 2차 접종 2주 후 베이스라인 대비 크게 증가하였고, 2차 접종 후 4주가 경과되어도 증가된 GMT가 유지되는 것이 확인되었고, RBD 나노파티클 AS03 제형 저함량 대비 고함량에서 보다 높은 GMT가 확인되었다. 또한, 동일한 시간대에서, 예를 들면 2차 백신 접종 2주 후 결과에서와 같이, RBD 나노파티클 AS03 제형은 RBD 나노파티클이 단독 투여된 경우 대비 IgG 항체의 GMT가 최대 16배 이상 현저히 높게 나타났다. 상기 수치는 영국 국립바이오의약품연구소(NIBSC)의 회복기 환자 혈청 (WHO Reference Panel, First WHO International Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 immunoglubulin, NIBSC code: 20/268)과 비교 시 상당히 높은 수준의 항체가로서, 본 발명의 백신 조성물은 사스-코로나바이러스-2를 대상으로 하는 백신으로서의 효과가 현저히 우수한 것을 확인하였다.
이를 통해, RBD 나노파티클 AS03 제형이 RBD 나노파티클 단독 투여한 경우에 비해서 면역원성이 높으므로 RBD 나노파티클 AS03 제형을 SARS-CoV-2 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있는 것을 알 수 있다.
1-2. 중화 항체의 기하평균역가 및 혈청변환율로 면역원성 확인
상기 표 7에 기재된 실험 대상에 RBD 나노파티클 AS03 제형(10 μg 또는 25μg) 및 RBD 나노파티클 단독(10 μg 또는 25 μg)를 각각 투여한 후 ELISA로 SARS-CoV-2-RBD에 대한 IgG 항체의 기하평균역가(Geometric Mean titer) 및 혈청변환율(Seroconversion rate)을 확인하였다. 표 9에 RBD 나노파티클 AS03 제형(10 μg 또는 25 μg) 및 RBD 나노파티클 단독(10 μg 또는 25 μg)에 대한 중화 항체의 기하평균역가 및 혈청변환율을 나타낸다. 중화 항체는 바이러스와 결합하여 세포로 침투하지 못하도록 무력화시키는 항체이므로 중화항체가는 면역원성 확인에 중요한 지표이다.
　 RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 (N=20) RBD 나노파티클 10 ug (N=10) RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 (N=18) RBD 나노파티클 25 ug (N=9) 플라시보 (N=19)
기하평균역가(GMT) 및 혈청변환율 베이스라인
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 19.13±1.49 21.01±1.58 20.97±1.53 18.85±1.36 19.95±1.63
95% CI (하한, 상한) (15.89, 23.02) (15.16, 29.12) (16.96, 25.91) (14.86, 23.91) (15.78, 25.21)
P-값 vs 플라시보 0.7685 t 0.7832 t 0.7434 t 0.7516 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 0.5659 t 0.4962 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 0.5121 t 　
4차 방문 (1차 백신 접종 4주 후)
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 91.95±3.03 32.79±2.45 90.08±2.78 25.76±1.91 24.22±2.03
95% CI (하한, 상한) (54.70, 154.58) (17.28, 62.23) (54.15, 149.85) (15.68, 42.35) (17.23, 34.05)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t 0.3256 t <0.0001 t 0.8264 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 0.0167 t 0.9532 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 0.0027 t 　
　 　 　 　 　 　
GMFR±표준 편차 4.81±3.23 1.56±2.42 4.30±3.03 1.37±1.68 1.21±2.52
95% CI (하한, 상한) (2.77, 8.33) (0.83, 2.94) (2.48, 7.45) (0.92, 2.04) (0.78, 1.90)
P-값 vs 플라시보 0.0003 t 0.4862 t 0.0006 t 0.7241 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 0.0126 t 0.7642 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 0.0012 t 　
　 　 　 　 　 　
6차 방문(2차 백신 접종 2주 후)
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 1,787.58±2.90 83.47±4.47 1,984.01±2.31 70.09±4.58 19.47±1.54
95% CI (하한, 상한) (1,086.58, 2,940.83) (28.62, 243.48) (1,309.60, 3,005.71) (21.76, 225.80) (15.82, 23.96)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t 0.0134 t <0.0001 t 0.0362 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 <0.0001 t 0.7408 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 <0.0001 t 　
　 　 　 　 　 　
GMFR±표준 편차 93.45±3.06 3.97±4.09 94.63±2.46 3.72±4.36 0.98±1.44
95% CI (하한, 상한) (55.34, 157.79) (1.45, 10.88) (60.54, 147.93) (1.20, 11.53) (0.82, 1.16)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t 0.0117 t <0.0001 t 0.0263 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 <0.0001 t 0.9699 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 <0.0001 t 　
　 　 　 　 　 　
7차 방문(2차 백신 접종 4주 후)
n 20 10 18 9 19
GMT±표준 편차 1,315.13±2.87 68.52±3.85 1,574.05±2.87 69.18±4.89 19.24±1.46
95% CI (하한, 상한) (802.48, 2,155.28) (26.12, 179.79) (932.54, 2,656.85) (20.43, 234.28) (16.03, 23.09)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t 0.0157 t <0.0001 t 0.0425 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 <0.0001 t 0.6030 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 <0.0001 t 　
　 　 　 　 　 　
GMFR±표준 편차 68.75±2.91 3.26±4.15 75.08±3.50 3.67±4.97 0.96±1.60
95% CI (하한, 상한) (41.72, 113.30) (1.18, 9.02) (40.29, 139.90) (1.07, 12.58) (0.77, 1.21)
P-값 vs 플라시보 <0.0001 t 0.0249 t <0.0001 t 0.0376 t 　
P-값 vs RBD 나노파티클 10 ug AS03 제형 　 <0.0001 t 0.8163 t 　 　
P-값 vs RBD 나노파티클 25 ug AS03 제형 　 　 　 <0.0001 t 　
표 9에 기재된 바와 같이, 본 발명의 RBD 나노파티클 AS03 제형을 1차 및 2차 백신 접종한 후 중화 항체의 GMT가 베이스라인 대비 현저히 증가하여 유의한 면역원성을 나타내었다. RBD 나노파티클 AS03 제형 저함량 및 고함량 모두, GMT가 2차 접종 2주 후 베이스라인 대비 크게 증가하였고, 2차 접종 후 4주가 경과되어도 증가된 GMT가 유지되는 것이 확인되었고, RBD 나노파티클 AS03 제형 저함량 대비 고함량에서 보다 높은 GMT가 확인되었다. 또한, 동일한 시간대에서, 예를 들면 2차 백신 접종 2주 후 결과에서와 같이, RBD 나노파티클 AS03 제형은 RBD 나노파티클이 단독 투여된 경우 대비 중화 항체의 GMT가 최대 28배 이상 현저히 높게 나타났다. 상기 수치는 영국 국립바이오의약품연구소(NIBSC)의 회복기 환자 혈청 (WHO Reference Panel, First WHO International Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 immunoglubulin, NIBSC code: 20/268)과 비교 시 상당히 높은 수준의 항체가로서, 본 발명의 백신 조성물은 사스-코로나바이러스-2를 대상으로 하는 백신으로서의 효과가 현저히 우수한 것을 확인하였다.
이를 통해, RBD 나노파티클 AS03 제형이 RBD 나노파티클 단독 투여한 경우에 비해서 면역원성이 높으므로 RBD 나노파티클 AS03 제형을 SARS-CoV-2 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 2. RBD 나노파티클 AS03 제형의 백신 부스터 조성물로서의 이용 및 면역 형성 확인
제조예에서 제조한 RBD 나노파티클 25ug-AS03 제형을 백신 부스터 조성물로 이용하여 개체에 면역이 형성되는지를 확인하였다.
19세 내지 85세의 연령의 81명의 성인을 대상으로 수행하였다. 1차 및 2차 백신 접종은 앞선 실시예 1과 동일하게 진행하였고 2차 접종 대략 7.5 개월 이후 3차 접종을 수행하였다. 베이스라인(Visit 2), 2차 접종 2주 후(Visit 6), 2차 접종 3개월 후(Visit 8), 2차 접종 7.5개월 후(부스터 샷 접종 전; Visit 1B), 및 부스터샷 접종 2주 후(Visit 3B)를 측정 시점으로 하여 우한주에 대한 면역 반응을 확인한 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 부스터샷 접종 2주 후 (visit 3B)그룹의 FRNT 확인 결과, 2차 접종 3개월 후(Visit 8), 2차 접종 7.5개월 후(부스터 샷 접종 전; Visit 1B) 에 비해 각각 7.83, 42.3 - fold 증가한 중화항체가를 확인하였다. 세포성면역원성(CD4+ Tcell)의 경우, 접종 7.5개월 후(visit 1B) 그룹에 비해 사이토카인 (IFN-r, IL-2, TNF-a, IL-4)분비 T 세포가 상대적으로 높게 관찰 되었다. 세포성면역원성(CD8+ Tcell)의 경우 큰 차이를 보이지 않았다.
또한, 2차 접종 2주 후(Visit 6), 2차 접종 7.5개월 후(부스터 샷 접종 전; Visit 1B), 및 부스터샷 접종 2주 후(Visit 3B)를 측정 시점으로 하여 오미크론 변이주에 대한 면역 반응을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다. 부스터샷 접종 2주 후(Visit 3B)의 중화항체가를 산출한 결과, 2차 접종 2주 후(Visit 6), 2차 접종 7.5개월 후(부스터 샷 접종 전; Visit 1B)에 비해 각각 24.79, 71.58-fold 증가한 값을 확인 하였다.
부스터샷 접종 시 나타나는 이상반응을 확인한 결과 명시되지 않은 이상반응의 경우 오히려 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 3. RBD 나노파티클 AS03 제형의 백신 부스터 조성물로서의 이용 및 변이주에 대한 면역 형성 추가 검증 (마우스 실험)
실시예 3-1. 실험 재료 및 방법
제조예에서 제조한 RBD 나노파티클 25ug-AS03 제형을 백신 부스터 조성물로 이용하여 변이형 SARS-CoV-2에 대해서도 면역이 형성되는지를 확인하였다.
5주령 hACE2 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 Jackson Laboratory로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 면역 그룹을 아래 표 10과 같이 나누어 마우스에 실험하였다. 3주 간격으로 면역을 형성하였다. 하기 표에서 GBP510-Wu의 경우 제조예 1에서 제조한 RBD 나노파티클과 동일하고, GBP510-Beta는 제조예 1의 RBD-Component A의 SARS-CoV-2 RBD 서열을 베타 바이러스의 RBD 서열로 대체하여 제조하였으며, GBP510-Bivalent는 GBP510-Wu 및 GBP510-Beta를 혼합 투여하였다.
공격 시험에는 우한주와 알파, 베타, 감마 및 델타 변이주를 사용하였다. 각 그룹에 대한 투여량 등은 표 12에 기재하였다.
1차 면역 2차 면역 3차 면역 공격 시험 바이러스
그룹 1 GBP510-Wu GBP510-Wu Wuhan, Alpha, Beta, Gamma, Delta
그룹 2 GBP510-Wu GBP510-Wu GBP510-Wu
그룹 3 GBP510-Wu GBP510-Wu GBP510-Beta
그룹 4 GBP510-Wu GBP510-Wu GBP510-Bivalent
SARS-CoV-2 variant (WHO 명명) 바이러스 정보
Wuhan (WT) BetaCoV/Korea/KCDC03/2020
Alpha hCoV-19/Korea/KDCA51463/2021; GRY: B.1.1.7
Beta hCoV-19/Korea/KDCA55905/2021; GH: B.1.351
Gamma hCoV-19/Korea/KDCA95637/2021; GR: P.1
Delta hCoV-19/Korea/KDCA5439/2021; G: B.1.617.2
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 10 - Wild-type SARS-CoV-2
2 RBD-NP-WT x 2 5 10 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 10 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 10 AS03
5 RBD-NP-WT x 2 + Bivalent x 1 5
(Bivalent; 5 of RBD-NP-WT and 5 of RBD-NP-Beta)		 10 AS03
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 10 - Alpha variant
2 RBD-NP-WT x 2 5 10 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 10 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 10 AS03
5 RBD-NP-WT x 2 + Bivalent x 1 5
(Bivalent; 5 of RBD-NP-WT and 5 of RBD-NP-Beta)		 10 AS03
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 10 - Beta variant
2 RBD-NP-WT x 2 5 10 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 10 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 10 AS03
5 RBD-NP-WT x 2 + Bivalent x 1 5
(Bivalent; 5 of RBD-NP-WT and 5 of RBD-NP-Beta)		 10 AS03
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 10 - Gamma variant
2 RBD-NP-WT x 2 5 10 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 10 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 10 AS03
5 RBD-NP-WT x 2 + Bivalent x 1 5
(Bivalent; 5 of RBD-NP-WT and 5 of RBD-NP-Beta)		 10 AS03
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 10 - Delta variant
2 RBD-NP-WT x 2 5 10 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 10 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 10 AS03
5 RBD-NP-WT x 2 + Bivalent x 1 5
(Bivalent; 5 of RBD-NP-WT and 5 of RBD-NP-Beta)		 10 AS03
채혈은 2주, 5주, 8주 마다 진행하였으며, 각 시점 당 채취된 혈청 시료를 분석하여 GBP510 백신의 면역원성에 대해 확인하였다. 실험 결과를 도 7에 나타내었다. 또한 1차 면역 이후 8주차에 채취한 혈청 시료를 이용하여 CPE 기반 중화 시험을 수행하였으며, 결과를 도 8에 나타내었다.
3차 면역 이후 1주 후, 9주차에 사스-코로나바이러스-2 Wuhan 및 변이주를 마우스에게 1x104 PFU/head로 비강으로 감염시켰으며, 14일간 생존율, 체중, 체온 변화를 관찰하여 결과를 도 9 내지 11에 나타내었다.
또한, hACE2-Tg 마우스로부터 폐 조직을 회수하여 전체 RNA를 추출하고 qRT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 30초간 변성 후, 95℃에서 5초, 60℃에서 20초를 45회 반복하였다. 사용된 프라이머 정보는 다음과 같다.
E gene: forward primer, 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3';
E gene: reverse primer, 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3';
probe [FAM]5'-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'[BHQ1];
RdRp gene: forward primer 5'-ATGAGCTTAGTCCTGTTG-3';
RdRp gene: reverse primer 5'-CTCCCTTTGTTGTGTTGT-3';
probe [HEX]5'-AGATGTCTTGTGCTGCCGGTA-3'[BHQ1]
반응 사이클 완료 후 온도를 0.2℃/15초의 속도로 65℃에서 95℃까지 올렸다. 용해 곡선을 작성하기 위해 매 5초마다 형광을 측정하였다. 대조군으로 주형이 없는 샘플을 사용하였다. Bio-Rad CFX Manager, version 2.1 소프트웨어를 사용하였으며 바이러스 수치(Viral burden)는 바이러스 RNA의 표준 cDNA 주형과 비교하여 바이러스 RNA의 절대 카피수를 계산한 다음 총 RNA 나노그램당 바이러스 RNA의 카피수로 나타냈다. 결과는 도 12에 나타내었다.
실시예 3-2. 실험 결과
도 7에 나타낸 바와 같이, 2주, 5주, 8주차에 항원 특이적 총항체가가 대조군 대비 높은 수준으로 확인되었으며, 3차 면역 이후 높은 수준의 2차 면역 그룹 대비 더 높은 항체가를 유도한 것이 확인되었으며, 그 차이는 통계적으로 유의미하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 2차 면역 대비 GBP510-Wu, GBP510-Beta, GBP510-Bivalent 3차 면역 시 각 12배, 6배, 7배의 중화항체가가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 9 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, 공격 시험 결과 3차 면역 그룹뿐만 아니라 2차 면역 그룹 또한 바이러스 감염에서 모두 살아 남았으며, 체중 및 체온의 변화가 유의미하지 않아 GBP510 면역으로 형성된 보호면역을 잘 확인할 수 있었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 3차 면역 그룹뿐만 아니라 2차 면역 그룹에서도 바이러스 수치(viral load)가 유의미하게 낮아진 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 및 폐 조직에서의 바이러스 수치, 조직병리학 및 사이토카인 분석
실시예 4-1. 재료 및 방법
실시예 3과 동일한 스케줄로 hACE2 TG 마우스에 1차 백신 투여 후 63일 경과하였을 때 SARS-CoV-2 우한주 또는 델타 변이형을 1 x 104 PFU/mouse 투여하여 공격 실험을 수행하였다. 공격실험 5일 후 폐 조직을 회수하고 바이러스 수치, 조직병리학 및 사이토카인 분석을 수행하였다.
실시예 4 에서 사용한 마우스 정보는 다음과 같다.
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 3 - Wild-type SARS-CoV-2
2 RBD-NP-WT x 2 5 3 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 3 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 3 AS03
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 3 - Delta variant
2 RBD-NP-WT x 2 5 3 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 5 3 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 5 3 AS03
조직병리학 분석은 10% 중성 완충 포르말린으로 관류(perfused)된 큰 폐엽(big lung love)을 사용하였다. SARS-CoV-2 바이러스 감염 5일 후 폐 조직을 파라핀에 포매하고 4μm 절편을 준비하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 폐 염증 및 배상세포(goblet cell) 과형성은 기존 알려진 emiquantitative scoring system을 이용해 등급을 매겼다. 염증세포 침윤 수준을 등급매기기 위해 세기관지 주위 (peri-bronchiole) 및 혈관 주위 염증을 다음 5점 등급 시스템에 기초하여 맹검 평가하였다: 0, 정상; 1, 저등급 세포 유입, 조직 병리 없음; 2, 낮은 수준에서 중간 수준의 세포 유입, 낮은 수준의 조직 손상; 3, 중간 정도의 세포 유입, 낮은 등급의 조직 손상; 4, 중등도 내지 높은 세포 유입, 현저한(marked) 조직 손상; 5, 높은 세포 유입, 심각한(significant) 조직 병리.
염증과 관련된 사이토카인 분석은 SARS-CoV-2 바이러스 감염 후 5일째에 수집된 BALF(Bronchoalveolar Lavage Fluid) 샘플을 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 300μL의 PBS로 BALF를 샘플링한 후 샘플을 마우스 염증 분석 패널의 분석 버퍼와 1:1 비율로 희석하였다. 프리믹스 비드를 웰 플레이트로부터 웰 전체에 넣고 실온에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 다음 상층액을 버리고 200 μL의 세척 버퍼를 웰 플레이트로부터 전체 웰에 넣고 세척하였다. 상층액을 버리고 세척 단계를 두 번 반복하였다. 다음으로 실온에서 1분 동안 인큐베이션하고 나서 25 μL의 검출 항체를 전체 웰에 넣고 실온에서 40분 동안 배양하였다. 다음으로 25 μL의 SA-PE 시약을 전체 웰에 넣고 실온에서 20~30분 동안 배양하였다. 200 μL의 세척 버퍼를 웰 플레이트로부터 전체 웰에 넣고 실온에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 버리고 세척 단계를 두 번 반복하였다. 150 μL의 PBS를 전체 웰에 넣고 전체 샘플을 튜브로 옮겼다. 150 μL의 PBS를 전체 웰에 추가한 후 400 μL의 Raw bead를 준비하고 형광 비드와 혼합하였다. LEGENDplexTMData Analysis Software를 이용해 제조사 지침에 따라 데이터 분석을 수행하였다.
바이러스 공격 실험 이후, 폐 조직을 추출하여 PRNT(Plaque reduction neutralization assay) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 바이러스 공격 실험 후 폐 조직을 추출하여 균질화(homogenize)하고 5,000 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 수집했다. Vero E6 세포를 12-웰 플레이트에 웰당 2Х105 개 세포로 시드하고 10% 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM에서 배양했다. 세포의 컨플루언시 이후 세포를 무혈청 DMEM으로 세척하고 폐 조직의 SARS-CoV2를 포함하는 일련의 150ul 희석 상청액으로 감염시켰다. 세포를 15분마다 간헐적으로 진탕하면서 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 접종물을 흡인한 후, 12-웰 플레이트의 세포를 2% FBS가 포함된 1X MEM에서 1% 저융점 아가로스(low-melting agarose)로 오버레이(overlay)하였다. 플라크가 나타날 때까지 플레이트를 48-72시간 동안 배양하였고, 세포를 실온에서 1시간 동안 4% 중성 완충 포르말린으로 고정하고 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 바이러스 역가는 다음과 같이 계산하였다: PFU/ml = (추가된 바이러스의 평균 플라크 수/부피[ml]) Х 희석 계수. 폐 조직에서 감염성 SARS-CoV-2의 최종 역가는 폐 조직 그램당 감염성 SARS-CoV-2 플라크로 표현하였다.
실시예 4-2. 실험 결과
실험 결과는 도 13에 나타내었다. 게놈 dna 분석 및 플라크 분석 결과 대조군(vehicle)에서 높은 수준의 바이러스 부하가 측정된 반면, 백신 접종 그룹에서는 현저히 낮거나 검출할 수 없는 수준의 바이러스 부하를 확인하였다. 백신 접종은 야생형(우한주) 뿐만 아니라 델타 변이주에 대해서도 보호 효능을 나타내었다.
또한 BALF 샘플에서 분비된 사이토카인의 염증 수준을 분석한 결과, 염증성 사이토카인은 백신 접종에 의해 감소되었다. 이는 백신 접종이 염증 진행을 억제하는 것을 시사한다. 또한, 염증의 중요한 지표인 TNF-a 및 IL-6은 거의 검출할 수 없었고, 염증성 단핵구 모집과 관련된 MCP-1 케모카인은 백신군에서 현저하게 낮게 검출되었다. 이는 백신 접종이 염증성 사이토카인 분비로부터 개체를 보호할 수 있음을 시사한다.
조직병리학적 분석 결과, 2~3회 투여한 백신군에서 대조군보다 폐 조직의 염증이 낮은 수준으로 검출되었으며, 백신 조성물의 독성은 검출되지 않았다.
실시예 5. RBD 나노파티클 AS03 제형의 백신 부스터 조성물로서의 이용 및 변이주에 대한 면역 형성 추가 검증 (영장류 실험)
제조예에서 제조한 RBD 나노파티클 25ug-AS03 제형을 비인간 영장류(Non-human primates; NHPs)를 이용하여 면역하였고, 백신 부스터 조성물로서의 효과를 검증하였다.
실시예 5-1. 재료 및 방법
2-5세의 히말라야 원숭이(Rhesus macaques)를 각 그룹에 6마리씩 배정하였다. RBD 나노파티클 백신을 28일 간격으로 2회 또는 3회 근육주사하였다. 1차 접종 후 14일, 28일, 42일, 56일, 70일 및 77일째에 혈액을 채취하였다.
77일에 상기 원숭이의 비강 및 비강 기관 내 (intranasally and intratracheally)에 델타 변이주를 5 x 105 TCID/head로 공격 시험하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 ELISpot 분석을 수행하여 세포 매개 면역 반응을 조사하였다. 백신의 보호 효능은 임상 징후 및 바이러스 부하로 평가하였다.
SARS-CoV-2의 RBD와 스파이크 단백질로 면역화되고 공격 시험된 예전 연구(DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03530-2)의 혈청 샘플을 수집하여 야생형(우한주)과 오미크론 슈도바이러스에 대한 중화 항체 역가 테스트에 사용하였다. 3-9세의 히말라야 원숭이를 각 그룹에 5마리씩 배정하였다. 면역화는 0일 및 21일에 수행하였고, 혈청 샘플은 42일차에 수집하였다. 항원은 전술한 제조예에서 제조한 AS03 어쥬번트된 RBD나노파티클과, HexaPro trimer(DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03530-2)를 사용하였다.
Groups Sample Antigen conc. (mcg/dose) No. of animals Adjuvant Challenge strain
1 Vehicle 0 6 - Delta variant
2 RBD-NP-WT x 2 25 6 AS03
3 RBD-NP-WT x 3 25 6 AS03
4 RBD-NP-WT x 2 + RBD-NP-Beta x 1 25 6 AS03
특이적 IgG ELISA를 통한 전체 항체 역가의 측정은 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. 야생형(우한주), 베타 또는 델타 변이형 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 재조합 단백질을 1 X DBPS (1 μg/mL)로 준비하고 1 μg/mL 항원을 96웰 플레이트에 100 μL/well 로 분주하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척용액 300 μL/well으로 1회 세척하고 블로킹 버퍼를 350 μL/well로 가하여 상온에서 2-3시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 블로킹 용액을 버리고 플레이트를 건조하였다. 각 그룹의 열-불활성화된 혈장을 준비하고 블로킹 버퍼를 이용하여 단계적으로 희석하였다. 희석된 혈장을 웰에 가하고 상온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세척용액 300 μL/well 로 3회 세척하였다. 항-원숭이(anti-macaque) IgG HRP (1μg/mL)를 가하고 암실 조건으로 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 세척용액 300 μL/well 로 3회 세척하였다. TMB 기질을 100 μL/well로 가한 다음 정지용액을 100 μL/well 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그리고 나서 UV/VIS Microplate Reader (분광 광도계)를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 항체 역가는 다음과 같이 계산하였다: 각 샘플에 대해, ELISA 종말점 역가는 Graphpad Prism software를 이용하여 four-parameter logistic curve fit을 사용하여 450nm에서 0.2의 흡광도 값을 생성하는 혈장 희석액의 역수(reciprocal)를 계산하였고, Log10 종점 역가를 수득하였다. 실험 결과는 도 14에 나타내었다.
중화 항체 역가의 측정(슈도바이러스 기반 중화 분석: 야생형, 베타, 델타)은 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. 패키징 플라스미드 psPAX2, 루시퍼라제 리포터 플라스미드 pLenti-CMV Puro-Luc 및 야생형 또는 변이체의 pcDNA3.1-SARS CoV-2 SΔCT를 발현하는 스파이크 단백질을 리포펙타민 2000에 의해 HEK293T 세포에 공동 형질감염시켜 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 SARS-CoV-2를 제조하였다. SARS-CoV-2 의 슈도바이러스는 야생형 우한주 (Wuhan/WIV04/2019, GISAID accession ID: EPI_ISL_402124), 베타 변이주(GISAID accession ID: EPI_ISL_712096) 또는 델타 변이주(GenBank Accession ID: QTW89558.1)의 스파이크를 이용하여 생성되었다. 감염 후 48시간이 지난 뒤 원심분리 및 0.45 μm 필터로 여과하여 슈도바이러스가 포함된 상청액을 얻었다. 혈장 샘플의 중화 활성을 결정하기 위해 96 웰 플레이트에 HEK293T-hACE2 세포를 1.75 x 104 cells/well 밀도로 분주하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 열 불활성화 혈장 샘플의 3배 연속 희석액을 준비하고 슈도바이러스 50μL와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 HEK293T-hACE2 세포에 첨가하였다. 감염 48시간 후, 제조업체의 지침에 따라 Steady-Glo Luciferase Assay에서 세포를 용해하였다. SARS-CoV-2 중화 역가는 바이러스 대조군 샘플이 있는 웰의 평균에 비해 상대 광 단위(relative light unit: RLU)의 50% 감소가 관찰되는 샘플 희석포인트로 정의되었다. 실험 결과는 도 15에 나타내었다.
야생형(우한주) 및 오미크론에 대한 중화 항체 역가의 측정(슈도바이러스 기반 중화 분석(Pseudovirus-based neutralization assay: PBNA))는 다음과 같이 수행하였다. 먼저 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 SARS-CoV-2 슈도바이러스를 생성하였다. HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 야생형 및 오미크론 변이체(B.1.1.529) 유래 스파이크 당단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 1일 후 세포를 VSV(G*ΔG-luciferase)로 감염시키고 2시간 뒤 DMEM으로 5회 세척하고 항-VSV-G 항체가 보충된 배지를 첨가하였다. 슈도타입 바이러스는 접종 18-24시간 후 수확하였고 2,500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 정화하고, 0.45 μm 컷오프 멤브레인을 통해 여과하고, 30 kDa 컷오프 멤브레인으로 10회 농축하고, 분주하여 -80℃에서 보관하였다. HEK239T-hACE2 세포를 4 x 104 cells/well의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 분주하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 열 불활성화 혈장 시료의 12-포인트 3배 연속 희석액을 준비하고 슈도바이러스와 혼합하였다. 혼합물은 37℃에서 45분간 인큐베이션한 후 HEK239T-hACE2 세포에 첨가하였다. 감염 17-20시간 후, 세포는 One-Glo-EX 기질로 용해되었고 암실에서 5-10분간 인큐베이션한 다음 판독되었다. Prism (GraphPad) 을 이용하여 상대적 루시퍼라제 단위를 플롯팅하고 정규화하였다. log(inhibitor) 대 정규화 반응의 비선형 회귀를 이용하여 curve fit으로부터 IC50값을 결정하였다. 실험 결과는 도 16에 나타내었다.
세포 매개 면역에 대한 평가는 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. ELISpot 분석은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)를 사용하여 수행되었다. SARS-CoV-2 WT 또는 변이형의 스파이크 단백질에 걸쳐 11개 아미노산이 겹치는 15개의 펩타이드로 펩타이드 풀을 구성하였다. ELISpot 플레이트를 5 μg/well의 마우스 항-인간 IFN-γ 단클론 항체로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. SARS-CoV-2 펩타이드를 준비하여 1 μg/well 농도로 플레이트하고 세포 2 x 105 cells/well을 플레이트에 가하였다. 펩타이드와 세포를 37℃에서 18-24시간 배양하였다. 양성 대조군 웰은 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)을을 함유한 세포, 음성 대조군 웰은 배지를 함유한 세포였다. 플레이트는 ELISpot wash buffer (물 1L에 11% 10x DPBS, 0.3% Tween20)를 이용해 세척되었고 비오틴이 연결된 토끼 항-인간 IFN-γ 다클론 항체(1μg/mL)와 함께 2시간 동안 배양되었다. 플레이트를 2회 세척하고 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 2 μg/mL과 함께 2시간 동안 배양하였다. 최종 세척 후 NBT/BCIP 기질 용액을 7분간 첨가하였다. 기질을 버리고 플레이트를 물로 세척한 후 어두운 곳에서 24시간 동안 건조시켰다. Cellular Technologies Limited Immunospot Analyzer를 이용해 플레이트를 스캔하고 계수하였다. 실험 결과는 도 17에 나타내었다.
폐 조직의 바이러스 부하 측정 (서브게노믹 DNA 분석)은 구체적으로 다음과 같이 실시하였다. 바이러스 부하는 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage: BAL) 및 비강 스왑(nasal swab: NS)으로부터 정량화되었다. RNA 추출은 제조사 지침에 따라, IndiSpin QIAcube HT Pathogen Kit를 사용하여 QIAcube HT에서 수행되었다. 표준 희석액과 추출된 RNA 샘플을 제조사 지침에 따라 25℃ 10분, 42℃ 1시간, 85℃ 5분의 주기 조건에 따라 SuperScript VILO Master Mix 를 이용하여 역전사하였다. SARS-CoV-2 E 유전자 서브게놈 RNA (subgenomic RNA; sgRNA) 는 역전사 중합효소 연쇄반응에 의해 처리되었다. 사용된 프라이머 및 프로브는 다음과 같다.
probe [VIC]5'-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'[MGB];
E gene forward primer 5'-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3';
E gene reverse primer 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'.
서브게놈 E 유전자의 유전자 단편을 먼저 합성하여 표준을 작성하였다. E 유전자 sgRNA를 타겟팅하는 서열을 이용하여 Taqman 커스텀 유전자 발현 분석을 디자인하였다. 프라이머와 프로브는 두 변이체에 대해 동일하게 반응하였다. 이어서 유전자 단편을 pcDNA3.1+ 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 삽입된 유전자는 AmpliCap-Max T7 High Yield Message Maker Kit 를 이용하여 인비트로에서 RNA로 전사되었다. 1x1010 카피 내지 1x10-1 카피 범위의 표준 로그 희석액이 RT-PCR 분석을 위해 준비되었다. QuantStudio 6 and 7 Real-Time PCR Systems에서 초기 변성 95℃ 20초 이후, 95℃ 1초, 60℃ 20초로 45회 반복되는 조건으로 샘플 및 표준에 대해 반응이 2회 수행되었다. 표준 곡선을 사용하여 mL 당 또는 스왑당 서브게놈 RNA를 계산하였다. 정량 분석의 민감도는 mL 당 또는 스왑당 50카피였다. 실험 결과는 도 18 및 도 19에 나타냈다.
실시예 5-2. 실험 결과
2회 또는 3회 면역화 후, ELISA를 수행하여 혈청 내 야생형(우한주), 베타 또는 델타 RBD에 특이적인 IgG 항체의 역가를 측정하였다(도 14). RBD 특이적 IgG 항체가 면역화된 모든 NHP에서 유도되었다. 3차 접종군에서 높은 역가가 관찰된 반면, 3차 접종을 하지 않은 군에서는 역가가 점차 감소하였다.
총 항체 분석과 유사하게, 3차 접종 후 중화항체 역가가 높게 유도된 반면, 3차 접종을 하지 않은 군에서는 점차 감소하였다. PBNA 분석 결과는 또한 백신 접종이 야생형 및 변이형 SARS-CoV-2에 대해 중화 항체를 높은 수준으로 유도한다는 것을 나타내며, 특히 RBD-NP의 부스터 주사가 SARS-CoV-2 야생형 및 변이형 (베타, 델타 및 오미크론)에 대해 충분한 교차 보호를 제공한다는 사실을 나타낸다(도 15 및 도 16).
마우스를 이용한 연구 결과와 유사하게, SARS-CoV-2 변이형에 대한 총 항체 및 중화 항체 역가는 3차 백신 접종에 의해 개선되었으며, 이를 통해 부스터샷 접종이 다양한 변종 바이러스에 대한 방어력을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본원 제조예의 RBD 또는 재조합 스파이크 단백질로 2회 면역화한 후의 중화항체 역가를 비교한 결과, 본원 제조예의 RBD 를 투여한 군에서 오미크론 변이형에 대한 중화항체가 더 높게 형성되는 것을 확인하였다(도 16). 이는 본원발명의 조성물을 이용한 부스터샷 접종이 오미크론 변이체에 대한 방어력을 제공한다는 사실을 의미한다.
1차 접종 후 70일째에 전혈에서 분리한 PBMC에 자극 항원을 처리하여 IFN-γ를 분비하는 T 세포를 확인한 ELISpot 분석 결과 야생형, 델타 또는 베타 펩타이드에 특이적으로 반응하는 T 세포의 수가 백신 접종군에서 증가하였음을 확인하였다. 또한 IFN-γ 분비 T 세포는 2회 투여군에 비해 3회 투여군에서 유의미하게 증가하였다 (도 17).
1차 접종 후 77일째에 원숭이의 비강 및 비강 기관 내 (intranasally and intratracheally)에 델타 변이주 (B.1.617.2) 를 5 x 105 TCID/head로 공격 시험하고 10일 뒤 비강 스왑 및 기관지 폐포를 수집하여 서브게놈 RNA 카피를 이용하여 바이러스 부하를 확인한 결과, 3회 투여군에서 특이적으로 바이러스 제거가 가속화되었다 (도 18 및 도 19).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 투여된 개체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 부스터 백신 조성물로서,
    상기 부스터 백신 조성물은
    (i) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는,
    RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클, 및
    (ii) AS03을 포함하며,
    상기 개체는 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 적어도 2회 접종한 이력이 있거나, 백신 조성물을 접종하고 SARS-CoV-2에 감염된 이력이 있는 것인, 부스터 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부스터 백신 조성물의 (i) (a) 의 제1 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 21 및 서열번호 22 중 선택되는 RBD 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2는 야생형 및 변이형 바이러스를 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변이형 SARS-CoV-2 바이러스는 알파, 베타, 델타, 감마 및 오미크론 변이형 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 개체가 접종한 백신 조성물은
    (i) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는,
    RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클, 및
    (ii) AS03을 포함하는 것인, 조성물.
  6. SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제1단계; 및
    제1단계 이후 14일 이상 경과한 후 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제2단계; 및
    제2단계 이후 14일 이상 경과한 후 SARS-CoV-2에 대한 백신 조성물을 투여하는 제3단계를 포함하는, 개체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용하기 위한 SARS-CoV-2 백신 조성물로,
    상기 제1단계, 제2단계 및 제3단계의 SARS-CoV-2 백신 조성물은
    (i) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체가 3개 조립된 삼량체(trimer); 및
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체가 5개 조립된 오량체(pentamer)를 포함하는,
    RBD(Receptor Binding Domain) 나노파티클, 및
    (ii) AS03을 포함하는 것인, 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1단계 및 제2단계, 제2단계 및 제3단계 사이의 간격은 28일 이상인 것인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제3단계는 제2단계 이후 28일 내지 300일 경과 후 수행되는 것인, 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 제2단계는 제1단계 이후 28일 내지 32일 경과 후 수행되는 것인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제3단계의 SARS-CoV-2 백신 조성물의 (i) (a) 의 제1 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 21 및 서열번호 22 중 선택되는 RBD 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 제3단계의 SARS-CoV-2 백신 조성물은
    서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 RBD 나노파티클 및 AS03을 포함하는 조성물과, 서열번호 22의 RBD 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 단량체; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 RBD 나노파티클 및 AS03을 포함하는 조성물이 혼합된 것인, 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 상기 제1단계 및 제2단계의 SARS-CoV-2 백신 조성물은 서열번호 21의 RBD 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 SARS-CoV-2 야생형 및 변이형에 대한 면역 반응을 유도하거나 유지하기 위한 방법에 사용되는 것인, 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 변이형은 알파, 베타, 델타, 감마 및 오미크론 변이형 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
  15. 제6항에 있어서, 상기 백신 조성물은 상기 (i) 및 (ii)를 1:1의 용량으로 포함하는 것인, 조성물.
  16. 제6항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 1회 투여량에 포함된 RBD 나노파티클은 5㎍ 내지 25㎍인, 조성물.
  17. 제6항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 근육 주사로 투여되는, 조성물.
  18. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 패키지 또는 키트 형태로 제공되는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물을 환자에게 투여하는 수단을 포함하는 것인, 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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