KR20230098292A - 진행성 결장직장 선종 및 결장직장 암의 진행 및 위험을 평가하기 위한 계층화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개체의 분변에서 과다 발현된 mRNA 전사체를 확인하는 것에 기반한 개체의 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 위험을 계층화하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 대장내시경에 적합한 개체를 선별하는데 이용할 수 있다. 또한, 본 방법은 계층화한 개체의 치료 용법을 맞춤 설계하는데 이용할 수 있다.
Description
관련 출원 및
문헌에 대한 교차
-참조
본 출원은 2020년 11월 2일자 미국 가출원 63/108,510에 대해 우선권을 주장하며, 그 전체가 본원에 통합된다.
기술 분야
본 발명은 개체의 분변 샘플에 존재하는 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준 변화를 확인하는 것에 기반한 진행성 선종 또는 결장직장 암을 가진 개체의 위험을 평가하기 위한 비-침습적인 방법에 관한 것이다.
결장직장 암 (CRC)은 선별이 평균-위험 개체에서 암 사망을 낮추는 것으로 입증된 소수의 암 유형들 중 하나이다. 실제, 진단 시점에 국소 침입 측면에서 그리고 림프절 및 원위 장기까지의 질환 확산이 중요한 예후 인자로서, 국소 병변이 있는 개체의 경우 5년 생존율은 90% 이상이고, 원위 장기까지 CRC 전이된 개체의 경우에는 ~10%에 불과하다. 즉, 조기 검출이 CRC로 인한 사망을 낮추는데 핵심적인 요소이다. 진행성 선종 (AA) 역시 CRC의 전구 형태로 간주되므로, 이의 검출이 중요한 반면, 비-진행성 선종 (진행된 조직 없이 < 1 cm임)은 결장직장 암의 위험 증가와 관련 없을 수 있다. 분변 잠혈 검사 및 대장내시경과 같은 CRC 및 AA에 대한 여러가지 선별 검사가 권장된다. 대장내시경은 결장직장 병변을 검출하기 위한 골드 표준으로 남아있지만 (CRC에 대한 최대 민감도 95%, AA의 경우 76%), 불편하고 불괘한 시술 절차로 인해 순응도가 최적인 상황은 아니다. 이 절차의 다른 한계는 합병증 위험, 비용 및 접근성이다. 다른 한편으로, 인간 헤모글로빈을 검출하는 분변 면역화학적 검사 (FIT)로도 지칭되는 개선된 면역학적 버전으로서 분변 잠혈 검사가 한동안 성공을 거두었지만, 우수한 특이도 (93-95%)에도 불구하고 낮은 전구 병변 검출율 (CRC의 경우 민감도 66-80%, AA의 경우 10-28%에 불과함)로 인해 그 유효성이 제한적이다. 따라서, 암 및 AA를 특히 조기 단계에 검출하기 위해, CRC 선별 성능을 개선할 수 있는 잠재성을 가진 대안적인 또는 보완적인 전략을 탐색하는 것이 필연적이다.
이러한 맥락에서, 과거 10년간 비-침습적인 방식으로서 분변 검사에서부터 CRC 선별 검사에서 요망되는 측면들을 충족시키고자 하는 개인 맞춤형 CRC 선별을 달성하기까지 수많은 계획들이 착수되었다. 흥미롭게도, 많은 분변-기반의 검사 전략들은 혈액 방출과는 무관한 것으로 보이는 매개변수로서 종양 세포가 높은 비율로 결장-직장 내강으로 박리 된다는 점에 착안한다. 가장 잘 입증된 전략 중 하나는 FDA-승인된 다중-표적 분변 DNA 검사로서, 이는 FIT와 조합하여 분변으로 박리된 CRC 세포로부터 특이적인 DNA 이상을 검출하는 것에 기반한 방식으로, 특이도가 87%로 낮아져 위 양성이 거의 3배 더 높아졌음에도 불구하고, FIT 단독과 비교해 CRC (92.3%) 및 AA (42.4%)의 검출 민감도는 개선되었다. 처음에는 의학계에서 이러한 새로운 방법의 비용-편익이 선별 권고안을 거스르게 할 수도 있지만, CRC 치료, 특히 보다 진행된 질환에 대해 높은 치료 비용을 고려하면, CRC 선별의 비용-효율성이 개선된다. 아울러, AA 검출의 민감도를 현저하게 높이면서도 동시에 합리적인 특이도를 유지할 수 있는 바이오마커 검사에 대한 더 높은 임계 비용이 현재 이용가능한 비-침습적인 검사에 비해 틀림없이 비용-효율적일 것이다.
결장직장 병변으로부터 내강으로 이형성 세포가 상당히 박리된다는 점에 또한 기반하여, 분변에서 잠재적인 바이오마커로서 숙주 mRNA가 조사되었다. 숙주 mRNA는 정제된 박리된 결장세포로부터 단리하거나 또는 분변으로부터 직접 추출하는 경우, 결장직장 암을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 바이오마커 소스인 것으로 밝혀졌다. 표적 mRNA는 종양 또는 주변 점막으로부터 기원하고, 그 발현이 원발성 위치 대 원위 위치가 아니라 박리된 종양 세포의 개수, 염증성 세포의 박리, 종양의 크기 및 종양에서의 전사 발현 수준에 의해 영향을 받는 것으로, 이전에 검증된 바 있다. 보다 최근에는, 다중-표적 RNA 분석의 추가가 CRC 검출의 민감도와 특이도를 모두 현저하게 강화하는 것으로 입증되었다. 액적 디지털 PCR 역시 분변 mRNA 멀티플렉스 분석용 qPCR에 대한 잠재적인 대안으로 평가되었다. 그러나, 다중-표적 분변 mRNA 검사를 검증하기 위해 검사해야 하는 한가지 중요한 문제는 AA 검출과 관련 있는데, 지금까지 ITGA6이 AA 환자의 분변 샘플에 과다 존재하는 것으로 발견된 유일한 표적이다. 잠재적인 임상적인 실행을 위해 평가가 필요한 다른 측면은, mRNA는 분변에서 상대적으로 분해되기 쉬운 것으로 여겨지므로, 실제 보존 환경에서의 검사 완건성이다.
진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 발병 위험이 증가된 개체를 높은 민감도 및/또는 특이도로 식별하기 위한 비-침습적인 방법을 제공하는 것이 요망될 것이다.
Dydensborg AB, Herring E, Auclair J, Tremblay E, Beaulieu J-F. Normalizing genes for quantitative RT-PCR in differentiating human intestinal epithelial cells and adenocarcinomas of the colon. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006;290:G1067-1074.
Beaulieu JF, Herring E, Kanaoka S, Tremblay E. Use of integrin alpha 6 transcripts in a stool mRNA assay for the detection of colorectal cancers at curable stages. Oncotarget 2016;7:14684-92.
Hamaya Y, Yoshida K, Takai T, Ikuma M, Hishida A, Kanaoka S. Factors that contribute to faecal cyclooxygenase-2 mRNA expression in subjects with colorectal cancer. Br J Cancer 2010;102:916-21.
Herring E, Kanaoka S, Tremblay E, Beaulieu JF. A stool multitarget mRNA assay for the detection of colorectal neoplasms. Methods Mol Biol 2018;1765:217-227.
Herring E, Kanaoka S, Tremblay E, Beaulieu JF. Droplet digital PCR for quantification of ITGA6 in a stool mRNA assay for the detection of colorectal cancers. World J Gastroenterol 2017;23:1-8.
본 발명은 개체를 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 가질 상대적인 위험에 대해 계층화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 개체의 분변에 존재하는 결장직장의 상피 세포에서의 차별적인 유전자 발현을 토대로 한다. 또한, 이러한 방법은 분변에서 mRNA 전사체의 상대적인 안정성을 토대로 한다.
제1 측면에서, 본 발명은 개체에서 개체에 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 있을 위험에 대해 계층화하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 a) 개체로부터 분변 샘플을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 분변 샘플은 개체로부터 유래한 복수의 mRNA 전사체를 포함한다. 본 방법은 또한 b) 복수의 mRNA 전사체로부터 개별 유전자 2 이상의 mRNA 발현 수준을 확인하여 검사 발현 프로파일을 수득하는 단계를 포함한다. 본 방법은 c) 검사 발현 프로파일을 대조군 발현 프로파일과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 대조군 발현 프로파일은 유전자 2 이상의 mRNA 발현 수준을 포함하고, 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 없는 것으로 확인된 대조군 개체로부터 유래한 (일부 구현예에서, 대조군 결장직장 상피 세포로부터 유래할 수 있는) 복수의 대조군 mRNA 전사체로부터 수득된다. 개체의 검사 발현 프로파일이 대조군 발현 프로파일에 비해 증가된 것으로 확인되면, 개체는 대조군 개체와 비교해 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 위험성이 높은 것으로 계층화된다. 일부 구현예에서, 분변 샘플은 하나 이상의 결장직장 상피 세포를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 하나 이상의 결장직장 상피 세포는 복수의 mRNA 전사체를 포함한다. 다른 추가적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자, CEACAM5 유전자 및/또는 MACC1 유전자들 중 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명은 a) 개체로부터 분변 샘플을 제공하는 단계로서, 분변 샘플이 개체로부터 유래한 결장직장 상피 세포 하나 이상을 포함하는 단계, b) 하나 이상의 결장직장 상피 세포로부터 개별 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 확인하여 검사 발현 프로파일을 수득하는 단계로서, 검사 발현 프로파일이 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자, CEACAM5 유전자 및/또는 MACC1 유전자 중 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 포함하는 단계, 및 c) 검사 발현 프로파일을 대조군 발현 프로파일과 비교하는 단계로서, 대조군 발현 프로파일이 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 포함하고 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 없는 것으로 확인된 대조군 개체의 대조군 결장직장 상피 세포로부터 수득한 것인 단계를 포함하는, 개체에서 개체에 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 있을 위험에 대해 계층화하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 단계 b)는 복수의 mRNA 전사체 또는 결장직장 상피 세포로부터 추가적인 유전자 하나 이상 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 포함하며, 여기서 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 PTGS2 유전자 및/또는 ITGA6 유전자의 발현 수준을 추가로 포함한다. 본원에 기술된 방법은 개체가 진행성 결장직장 선종에 걸릴 위험에 대해 계층화하는데 이용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 대안적으로 또는 종합하여, 본원에 기술된 방법은 개체가 결장직장 암에 걸릴 위험에 대해 계층화하는데 이용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 단계 b)는 역-전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하여 검사 발현 프로파일 및/또는 대조군 발현 프로파일의 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 수득하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단계 b)는 정량적인 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)을 이용하여 검사 발현 프로파일 및/또는 대조군 발현 프로파일의 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 수득하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 b)에 앞서, 분변 샘플을 보관하는 것을 추가로 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본 방법은 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체적인 구현예에서, 본 방법은 분변 면역화학 검사 (FIT)를 이용해 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하는 것을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본 방법은 개체의 결장직장 상피 세포에서 결장직장 암의 소인과 관련한 DNA 돌연변이 및/또는 비정상적인 DNA 메틸화 패턴의 존재를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, DNA 돌연변이는 K-RAS 유전자에 위치할 수 있다. 다른 예로, 비정상적인 DNA 메틸화 패턴은 NDRG4 유전자 및/또는 BMP3 유전자에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 CologuardTM 분석을 이용해, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재, DNA 돌연변이의 존재 및/또는 비정상적인 DNA 메틸화 패턴의 존재를 확인하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대장내시경에 적합한 개체를 선별하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 결장직장 암 발병 위험이 높은 것으로 계층화된 개체에 대해 화학요법, 방사선요법 및/또는 수술을 제안 (submitting)하는 것을 추가로 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 개체에서 개체가 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암에 걸릴 위험에 대해 계층화하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 개체의 분변 샘플에서 복수의 mRNA 전사체로부터 개별 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 확인하여 검사 발현 프로파일을 수득하기 위한 2 이상의 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 분변 샘플을 보관하기 위한 용기를 추가로 포함한다. 추가적인 구현예에서, 2 이상의 시약은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자, CEACAM5 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 것이다. 일부 추가적인 구현예에서, 키트는 PTGS2 유전자 및/또는 ITGA6 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 추가의 시약을 하나 이상 더 포함한다. 다른 추가적인 구현예에서, 2 이상의 시약은 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 2 이상의 시약은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 역-전사효소를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하기 위한 추가의 수단 또는 조합으로 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트는 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하기 위해 분변 면역화학 검사 (FIT)와 조합하여 사용될 수 있거나, 또는 이를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 키트는 개체의 결장직장 상피 세포에서 결장직장 암의 소인과 관련있는 DNA 돌연변이 및/또는 비정상적인 DNA 메틸화 패턴의 존재를 확인하기 위한 시약을 추가로 포함하거나 또는 이와 조합하여 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 DNA 돌연변이는 K-RAS 유전자에 위치한다. 추가적인 구현예에서, 비정상적인 DNA 메틸화 패턴은 NDRG4 유전자 및/또는 BMP3 유전자에 위치한다. 또 다른 일부 추가적인 구현예에서, 키트는 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재, DNA 돌연변이의 존재 및/또는 비정상적인 DNA 메틸화 패턴의 존재를 확인하기 위해 CologuardTM 및/또는 ColoalertTM 분석을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 이와 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명의 특성을 일반적으로 기술하였는바, 이제 예시로서 바람직한 구현예를 보여주는 첨부된 도면을 참조하게 될 것이다:
도 1은 I-III 기의 결장직장 암 (CRC) 또는 진행성 선종 (AA)을 앓고 있는 환자의 분변 샘플에 과다 존재하는 것으로 밝혀진 선택 mRNA 표적에 대한 검출 및 분석을 예시한 것이다. A 및 B의 결과는 대조군 환자와 비교해 각각 카피수 및 점수의 중앙값 (사분위수 범위)을 나타낸다. 크루스칼-왈리스 검정을 이용하여, ** P< 0.001에서 *** P<0.0005.
(도 1a) (좌측 패널) S100A4의 경우, CRC 환자의 분변에 과다 존재하는 것으로 식별된 표적 6종 중 하나로서, 대조군 (Ctrl) 또는 AA 환자 대비 I-III 기 CRC에서 유의한 증가가 관찰되었다. (우측 패널) CEACAM5의 경우, AA 또는 CRC 환자의 분변에 과다 존재하는 것으로 식별된 표적 3종 중 하나로서, 대조군 (Ctrl) 대비 I-III 기 CRC 및 AA에서 유의한 증가가 관찰되었다.
(도 1b) 점수는 CRC 병변에 대해 표적 총 6종 (좌측)과 AA 및 CRC 병변을 식별하는 표적 3종 (우측)을 조합한 알고리즘을 적용해 대조군과 비교해 계산하였다.
(도 1c) CRC에 대한 표적 (좌측) 및 AA 및 CRC에 대한 표적 (우측) 군 2종을 보여주는 ROC (receiver operating characteristics) 곡선 분석. 곡선 하 면적 (AUC) 값이 표시된다.
도 2는 AA 또는 CRC 환자를 검출하기 위한 표적 5종의 최적화된 조합에 대한 ROC 곡선 분석을 예시한 것이다. AUC를 나타내고, 민감도와 특이도는 %로 표시한다 (95% CI).
(도 2a) AA 및 CRC를 검출하기 위해 식별된 표적 3종 CEACAM5, ITGA6 및 MACC1과, AA 및 CRC에 대해 CRC를 검출하기 위한 더 강한 표적 2종 PTGS2 및 S100A4의 조합에 대한 ROC 곡선 분석.
(도 2b) 도 2a와 동일하나 FIT 구성요소를 포함하는 조합.
도 3은 5일간에 걸친 분변 샘플에서의 표적 안정성 분석을 보여준다. 표적 안정성은 다양한 보존 환경에서 검사하였으며, 표적 검출은 4℃ (1-5d 4℃) 및 실온 (1-5d RT)에서 해동 사이클을 적용하거나 (F/T 5d -20) 또는 적용하지 않으면서 (5d -20℃) -20℃에서 유지한 샘플에서 5일 동안 모니터링하였다.
(도 3a) PTGS2에 의해 예시된 바와 같이, 카피 수는 대조군 분변 샘플 (Ctrl)과 CRC 환자로부터 수득한 샘플 둘다에서 5일간 비교적 안정적으로 유지되었다.
(도 3b) 전반적으로 표적들이 냉각 조건에서 비교적 안정적이고 실온에서도 3일간 안정적임을 보여주는, 검사 표적 4종 PTGS2, CEACAM5, ITGA2 및 ITGA6을 포함한 누적 점수.
도 4는 I-III 기 결장직장 암 (CRC) 또는 진행성 선종 (AA)을 가진 환자의 분변 샘플에 과다 존재하는 것으로 확인된 선택 mRNA 표적에 대한 검출 및 분석을 제시한다. S100A4 (도 1A)에 대해 확인된 바와 같이, 대조군 (Ctrl) 대비, IIII 기 CRC에서 기타 표적 5종 GADD45B, ITGA2, MYBL2, MYC 및 PTGS2에서 유의한 증가가 관찰되었으며, 표적 3종 CEACAM5 (도 1A) ITGA6 및 MACC1의 경우에는 I-III 기 CRC 또는 AA 환자의 샘플에서 대조군 (Ctrl)과 비교해 유의한 증가가 관찰되었다. 그 결과는 대조군 환자에 대비 카피 수의 중앙값 (사분위수 범위)으로 나타낸다. 크루스칼-왈리스 검정을 이용하여, * P< 0.05에서 *** P<0.0005.
(도 4a) 입수한 샘플에 따른 GADD45B의 카피수.
(도 4b) 입수한 샘플에 따른 ITGA2의 카피수.
(도 4c) 입수한 샘플에 따른 MYBL2의 카피수.
(도 4d) 입수한 샘플에 따른 MYC의 카피수.
(도 4e) 입수한 샘플에 따른 PTGS2의 카피수.
(도 4f) 입수한 샘플에 따른 ITGA6의 카피수.
(도 4g) 입수한 샘플에 따른 MACC1의 카피수.
도 5는 5일간에 걸친 분변 샘플에서의 표적 안정성 분석에 대한 추가적인 정보를 제시한다. 표적 안정성은 도 3에서와 같이 다양한 보존 환경에서 CEACAM5, ITGA2 및 ITGA6에 대해 검사하였다. 카피 수 (copu nb)는 4℃ (1-5d 4℃) 및 실온 (1-5d RT)에 해동 사이클을 적용하거나 (F/T 5d -20) 또는 적용하지 않으면서 (5d -20℃) 5일 동안 분변 샘플에서 평가하였다.
(도 5a) 보관 일수에 따른 대조군 (좌측 패널) 또는 CRC (우측 패널) 샘플에서의 ITGA6 카피 수.
(도 5b) 보관 일수에 따른 대조군 (좌측 패널) 또는 CRC (우측 패널) 샘플에서의 CEACAM5 카피 수.
(도 5c) 보관 일수에 따른 대조군 (좌측 패널) 또는 CRC (우측 패널) 샘플에서의 ITGA2 카피 수.
도 1은 I-III 기의 결장직장 암 (CRC) 또는 진행성 선종 (AA)을 앓고 있는 환자의 분변 샘플에 과다 존재하는 것으로 밝혀진 선택 mRNA 표적에 대한 검출 및 분석을 예시한 것이다. A 및 B의 결과는 대조군 환자와 비교해 각각 카피수 및 점수의 중앙값 (사분위수 범위)을 나타낸다. 크루스칼-왈리스 검정을 이용하여, ** P< 0.001에서 *** P<0.0005.
(도 1a) (좌측 패널) S100A4의 경우, CRC 환자의 분변에 과다 존재하는 것으로 식별된 표적 6종 중 하나로서, 대조군 (Ctrl) 또는 AA 환자 대비 I-III 기 CRC에서 유의한 증가가 관찰되었다. (우측 패널) CEACAM5의 경우, AA 또는 CRC 환자의 분변에 과다 존재하는 것으로 식별된 표적 3종 중 하나로서, 대조군 (Ctrl) 대비 I-III 기 CRC 및 AA에서 유의한 증가가 관찰되었다.
(도 1b) 점수는 CRC 병변에 대해 표적 총 6종 (좌측)과 AA 및 CRC 병변을 식별하는 표적 3종 (우측)을 조합한 알고리즘을 적용해 대조군과 비교해 계산하였다.
(도 1c) CRC에 대한 표적 (좌측) 및 AA 및 CRC에 대한 표적 (우측) 군 2종을 보여주는 ROC (receiver operating characteristics) 곡선 분석. 곡선 하 면적 (AUC) 값이 표시된다.
도 2는 AA 또는 CRC 환자를 검출하기 위한 표적 5종의 최적화된 조합에 대한 ROC 곡선 분석을 예시한 것이다. AUC를 나타내고, 민감도와 특이도는 %로 표시한다 (95% CI).
(도 2a) AA 및 CRC를 검출하기 위해 식별된 표적 3종 CEACAM5, ITGA6 및 MACC1과, AA 및 CRC에 대해 CRC를 검출하기 위한 더 강한 표적 2종 PTGS2 및 S100A4의 조합에 대한 ROC 곡선 분석.
(도 2b) 도 2a와 동일하나 FIT 구성요소를 포함하는 조합.
도 3은 5일간에 걸친 분변 샘플에서의 표적 안정성 분석을 보여준다. 표적 안정성은 다양한 보존 환경에서 검사하였으며, 표적 검출은 4℃ (1-5d 4℃) 및 실온 (1-5d RT)에서 해동 사이클을 적용하거나 (F/T 5d -20) 또는 적용하지 않으면서 (5d -20℃) -20℃에서 유지한 샘플에서 5일 동안 모니터링하였다.
(도 3a) PTGS2에 의해 예시된 바와 같이, 카피 수는 대조군 분변 샘플 (Ctrl)과 CRC 환자로부터 수득한 샘플 둘다에서 5일간 비교적 안정적으로 유지되었다.
(도 3b) 전반적으로 표적들이 냉각 조건에서 비교적 안정적이고 실온에서도 3일간 안정적임을 보여주는, 검사 표적 4종 PTGS2, CEACAM5, ITGA2 및 ITGA6을 포함한 누적 점수.
도 4는 I-III 기 결장직장 암 (CRC) 또는 진행성 선종 (AA)을 가진 환자의 분변 샘플에 과다 존재하는 것으로 확인된 선택 mRNA 표적에 대한 검출 및 분석을 제시한다. S100A4 (도 1A)에 대해 확인된 바와 같이, 대조군 (Ctrl) 대비, IIII 기 CRC에서 기타 표적 5종 GADD45B, ITGA2, MYBL2, MYC 및 PTGS2에서 유의한 증가가 관찰되었으며, 표적 3종 CEACAM5 (도 1A) ITGA6 및 MACC1의 경우에는 I-III 기 CRC 또는 AA 환자의 샘플에서 대조군 (Ctrl)과 비교해 유의한 증가가 관찰되었다. 그 결과는 대조군 환자에 대비 카피 수의 중앙값 (사분위수 범위)으로 나타낸다. 크루스칼-왈리스 검정을 이용하여, * P< 0.05에서 *** P<0.0005.
(도 4a) 입수한 샘플에 따른 GADD45B의 카피수.
(도 4b) 입수한 샘플에 따른 ITGA2의 카피수.
(도 4c) 입수한 샘플에 따른 MYBL2의 카피수.
(도 4d) 입수한 샘플에 따른 MYC의 카피수.
(도 4e) 입수한 샘플에 따른 PTGS2의 카피수.
(도 4f) 입수한 샘플에 따른 ITGA6의 카피수.
(도 4g) 입수한 샘플에 따른 MACC1의 카피수.
도 5는 5일간에 걸친 분변 샘플에서의 표적 안정성 분석에 대한 추가적인 정보를 제시한다. 표적 안정성은 도 3에서와 같이 다양한 보존 환경에서 CEACAM5, ITGA2 및 ITGA6에 대해 검사하였다. 카피 수 (copu nb)는 4℃ (1-5d 4℃) 및 실온 (1-5d RT)에 해동 사이클을 적용하거나 (F/T 5d -20) 또는 적용하지 않으면서 (5d -20℃) 5일 동안 분변 샘플에서 평가하였다.
(도 5a) 보관 일수에 따른 대조군 (좌측 패널) 또는 CRC (우측 패널) 샘플에서의 ITGA6 카피 수.
(도 5b) 보관 일수에 따른 대조군 (좌측 패널) 또는 CRC (우측 패널) 샘플에서의 CEACAM5 카피 수.
(도 5c) 보관 일수에 따른 대조군 (좌측 패널) 또는 CRC (우측 패널) 샘플에서의 ITGA2 카피 수.
본 발명은 개체의 분변 샘플에서 복수의 유전자의 발현 수준을 결정함으로써 개체가 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 가질 상대적인 위험에 대해 계층화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의해 계층화될 수 있는 개체는 포유류일 수 있으며, 일부 구현예에서 인간일 수 있다. 개체는 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 발병 소인에 대해 이전에 조사되었을 수 있거나 또는 조사되지 않았을 수 있다. 개체는 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암에 대해 이전에 치료받았을 수 있거나 또는 치료받지 않았을 수 있다.
일부 구현예에서, 진행성 결장직장 선종이 있을 위험을 계층화하기 위해 본 방법을 수행하는 경우, 민감도는 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 높을 수 있다. 다른 구현예에서, 결장직장 암이 있을 위험을 계층화하기 위해 본 방법을 수행하는 경우, 민감도는 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 높을 수 있다.
광의적으로, 본 발명의 방법은 개체를 2가지 군으로 계층화할 수 있다: 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 있을 위험이 높은 개체들로 구성된 제1 군 (예, 고 위험 군), 그리고 진행성 선종 또는 결장직장 암이 있을 위험이 낮은 개체들로 구성된 제2 군 (예, 저 위험 군). 일부 구현예에서, 본 방법은 또한 고 위험 군을 2가지 하위 군으로 계층화할 수 있다: 진행성 결장직장 선종이 있을 위험이 높은 개체들로 구성된 제1 하위 군 (예를 들어, 진행성 결장직장 선종 또는 AA 하위 군), 그리고 결장직장 암이 있을 위험이 낮은 개체들로 구성된 제2 하위 군 (예를 들어, 결장직장 암 또는 CRC 하위 군). 본 방법은 개체의 분변에 존재하는 서로 다른 유전자 2종 이상의 mRNA 전사체의 과다 발현을 토대로 한다. 고 위험 군, AA 하위 군 또는 CRC 하위 군으로 계층화된 개체는 맞춤화된 권고 및 치료를 처방받을 수 있다. 예를 들어, 고 위험 군, 특히 CRC 하위 군에 속하는 개체는 대장내시경을 수행하도록 권고받을 수 있거나, 및/또는 대장내시경을 받을 수 있다. 다른 예로, 고 위험 군, 특히 CRC 하위 군에 속하는 개체는 화학요법, 방사선 요법 또는 수술을 받도록 권장될 수 있거나, 및/또는 화학요법, 방사선요법 또는 수술을 받을 수 있다. 저 위험 군으로 계층화된 개체는 맞춤화된 권고 및 치료를 받을 수 있다.
본원에 기술된 방법은 개체로부터 유래한 세포 하나 이상에서 유전자들의 조합의 발현 수준을 평가하고 이러한 유전자가 개체에서 수득한 분변 샘플에서 과다 발현되는 지를 확인하는 것을 토대로 한다. 본 방법에 제공되는 mRNA 전사체는 개체의 분변 샘플에 존재한다. 일부 구현예에서, mRNA 전사체는 결장직장 상피 세포로부터 박리될 수 있으며, 무세포성 방식으로 분변 샘플에서 검출할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, mRNA 전사체는 박리되어 분변 샘플에 존재하는 결장직장 상피 세포 하나 이상에 존재할 수 있는 것으로 이해된다. mRNA 전사체 및/또는 이를 포함하는 결장직장 상피 세포는 개체에 존재할 수 있는 진행성 결장직장 선종(들) 또는 악성 상피 종양(들)로부터 박리될 수 있다. 아래 실시예에서 mRNA 전사체가 분변 샘플에서 안정적이고, 분변 샘플이 이전에 보관되었음에도 불구하고 위험을 계층화하는데 편리하게 이용할 수 있는 것으로, 놀랍게도 밝혀졌다.
따라서, 본 방법은, 제1 단계로서, 개체로부터 분변 샘플을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 분변 샘플은 개체로부터 결장직장 상피 세포로부터 유래한 복수의 mRNA 전사체를 포함한다. 일 구현예에서, 개체의 분변 샘플은 개체의 결장직장 상피로부터 유래한 세포 하나 이상 (또는 일부 구현예에서, 복수의 세포)을 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 상피 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 결장의 상피로부터 유래하거나 또는 박리되고, 예를 들어, 세포는 결장 세포로도 언급되는 결장 상피 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 직장의 상피로부터 유래하거나 또는 박리되고, 예를 들어, 세포는 직장 상피 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 결장 또는 직장으로부터 유래하거나 또는 박리되고, 이는 결장직장 상피 세포이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 개체의 분변 샘플을 수득하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 개체로부터 수득한 분변 샘플에 대해 직접 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 방법은 가공 처리된 분변 샘플에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 적당한 용액 (일부 구현예에서, RNase 저해제를 함유할 수 있음)으로 희석하거나 및/또는 여과한 분변 샘플에 대해 수행할 수 있다. 이와 같이, 본 방법은 일부 구현예에서 분변 샘플을 희석 및/또는 여과하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플은 다음 단계 (예, 확인하는 단계)에 앞서 보관할 수 있다. 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플은 냉동 온도 (예, -25℃ 내지 -15℃, 일부 구현예에서, -18℃)에서, 냉장 온도 (예, 0℃ 내지 10℃, 일부 구현예에서, 4℃) 및/또는 실온 (예, 20℃ 내지 30℃, 일부 구현예에서, 23℃)에서 보관할 수 있다. 이와 같이, 본 방법은 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플을 수득 또는 가공 처리한 후, 그리고 추가적으로 특정화하기 전, 보관하는 것을 포함할 수 있다. 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플은 mRNA 발현 수준을 확인하기에 앞서 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 그보다 긴 기간 동안 보관할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플을 mRNA 발현 수준을 확인하기에 앞서 보관하는 것을 포함할 수 있다.
(가공 처리되거나 및/또는 보관되었을 수 있는) 분변 샘플이 입수되면, 그 분변 샘플에 존재하는 세포 하나 이상으로부터 개별 유전자 2 이상의 발현 수준을 확인한다. 개별 유전자 2 이상의 발현 수준은 각 유전자로부터 발현되는 mRNA의 (상대적인) 양을 결정함으로써 구해진다. 유전자의 조합에 대한 발현 수준의 결정은 동시에 (멀티플렉스 형태로) 또는 후속적으로 이루어질 수 있다. 유전자의 조합에 대한 발현 수준의 결정은 각 유전자와 관련한 mRNA 전사체의 역 전사, 조합물의 각 유전자와 관련한 cDNA 분자의 증폭, 및/또는 조합물의 각 유전자와 관련한 mRNA 전사체/cDNA 분자에 대한 (프라이머 또는 프로브일 수 있는) 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 포함할 수 있다. mRNA 전사체를 역-전사하고 증폭시키는 방법에 대한 구현예에서, 이의 (상대적인) 양은 증폭된 핵산 분자와 관련한 신호를 검출하고, 이를 선택적으로 정량함으로써 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 mRNA 전사체를 cDNA 분자로 변환하기 위해 역-전사 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 추가적인 구현예에서, 본 방법은 cDNA 분자의 개수를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 본 방법은 cDNA 분자의 개수를 정량하기 위해 정량적인 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 본 방법은 cDNA 분자의 개수를 정량하기 위해 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 발현 수준은 절대량으로 제시될 수 있거나 또는 정규화된 양 (normalized amount)(예를 들어, 수 또는 세포 또는 그 발현이 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 세포에서 변동되지 않는 것으로 공지된 다른 mRNA 전사체 또는 mRNA 전사체들의 조합을 기준으로 한 양)으로 제시될 수 있다. 본 방법이 정규화된 양을 제시하는 일부 구현예에서, 본 방법은 mRNA 발현 수준이 결정된 세포의 수를 결정하거나, 및/또는 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플에서 하우스홀드 유전자 하나 이상의 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 발현 수준은 다른 것에 대한 비율로서 제시될 수 있다.
확인하는 단계는 유전자 2 이상의 mRNA 발현 수준을 포함하고 그 발현이 정량화된 검사 발현 프로파일을 제공한다. 검사 발현 프로파일은 CEA 부착 분자 5 (CEACAM5, CD66e 또는 CEA로도 지칭됨, Gene ID 1048)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 증식 정지 및 DNA 손상 유도성 β 유전자 (GADD45B, GADD45BETA 또는 MYD118로도 지칭됨, Gene ID: 4616)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 인테그린 서브유닛 α 2 유전자 (ITGA2, BR, CD49B, GPIa, HPA-5, VLA-2 또는 VLAA2로도 지칭됨, Gene ID: 3673)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 MET 전사 조절자 MACC1 (MACC1, 7A5 또는 SH3BP4L로도 지칭됨, Gene ID: 346389)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 MYB 프로토-온코진 유사 2 유전자 (MYBL2, B-MYB 또는 BMYB로도 지칭됨, Gene ID: 4605)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 MYC 프로토-온코진, bHLH 전사 인자 (MYC, MRTL, MYCC, bHLHe39 또는 c-Myc로도 지칭됨, Gene ID: 4609)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 S100 칼슘 결합 단백질 A4 (S100A4, 18A2, 42A, CAPL, FSP1, MTS1, P9KA 또는 PEL98로도 지칭됨, Gene ID: 6275)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 일부 추가의 선택적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 β-2-마이크로글로불린 유전자 (B2M 또는 IMD43로도 지칭됨, Gene ID 567)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 일부 추가의 선택적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 인테그린 서브유닛 α 1 유전자 (ITGA1, CD49a 또는 VLA1로도 지칭됨, Gene ID: 3672)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6 및 MACC1의 mRNA 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6, MACC1 및 B2M의 mRNA 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 PTGS2 및 S100A4의 mRNA 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6, MACC1, PTGS2 및 S100A4의 mRNA 발현 프로파일을, 선택적으로 B2M의 mRNA 발현 프로파일과 조합하여, 포함할 수 있다.
일부 선택적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 인테그린 서브유닛 α 6 유전자 (ITGA6, CD49f, ITGA6B 또는 VLA-6로도 지칭됨, Gene ID: 3655)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 검사 발현 프로파일이 ITAGA6 유전자 전사체의 α- 및/또는 β-이소형의 mRNA 발현 수준을 포함하는 것도 가능하다. 일부 선택적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제 2 유전자 (PTGS2, COX-2, COX2, GRIPGHS, PGG/HS, PGHS-2, PHS-2 또는 hCox-2로도 지칭됨, Gene ID: 5743)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다.
일부 구체적인 구현예에서, 검사 발현 수준은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5종을 포함할 수 있다.
검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 2종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 3종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 4종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 5종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 6종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 7종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 8종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 9종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 10종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 11종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 12종 이상의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다.
감사 발현 프로파일이 확보되면, 이를 대조군 발현 프로파일과 비교한다. 대조군 발현 프로파일은 검사 발현 수준에 존재하는 유전자 2 이상의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 대조군 발현 프로파일은 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 겪지 않은 것으로 확인된 대조군 개체 (예를 들어, 건강한 대조군 개체)로부터 수득한 하나 이상의 mRNA 전사체 및/또는 세포 (예, 하나 이상의 상피 세포, 추가적인 구현예에서, 하나 이상의 결장직장 상피 세포)로부터 수득되거나 또는 유래할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 비-진행성 결장직장 선종이 있으나 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 없는 대조군 개체로부터 유래한 하나 이상의 mRNA 전사체 및/또는 세포로부터 수득되거나 또는 유래할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 일부 구현예에서, 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 있을 수 있는 개체의 건강한 (예를 들어, 비-암성) 조직으로부터 유래한 하나 이상의 mRNA 전사체 및/또는 세포로부터 수득되거나 또는 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군 개체는 위험을 계층화하는 개체와 나이 및 성별 측면에서 매칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 대조군 개체 여러 명으로부터 수득하거나 또는 유래한다. 일부 추가의 구현예에서, 본 방법은 대조군 개체로부터 2 이상의 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 결정하여 대조군 발현 프로파일을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
대조군 발현 프로파일은 CEA 부착 분자 5 (CEACAM5, CD66e 또는 CEA로도 지칭됨, Gene ID 1048)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 증식 정지 및 DNA 손상 유도성 β 유전자 (GADD45B, GADD45BETA 또는 MYD118로도 지칭됨, Gene ID: 4616)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 인테그린 서브유닛 α 2 유전자 (ITGA2, BR, CD49B, GPIa, HPA-5, VLA-2 또는 VLAA2로도 지칭됨, Gene ID: 3673)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 MET 전사 조절자 MACC1 (MACC1, 7A5 또는 SH3BP4L로도 지칭됨, Gene ID: 346389)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 MYB 프로토-온코진 유사 2 유전자 (MYBL2, B-MYB 또는 BMYB로도 지칭됨, Gene ID: 4605)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 MYC 프로토-온코진, bHLH 전사 인자 (MYC, MRTL, MYCC, bHLHe39 또는 c-Myc로도 지칭됨, Gene ID: 4609)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 대조군 발현 프로파일은 S100 칼슘 결합 단백질 A4 (S100A4, 18A2, 42A, CAPL, FSP1, MTS1, P9KA 또는 PEL98로도 지칭됨, Gene ID: 6275)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6 및 MACC1의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6, MACC1 및 B2M의 mRNA 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 PTGS2 및 S100A4의 mRNA 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6, MACC1, PTGS2 및 S100A4의 mRNA 발현 프로파일을, 선택적으로, B2M의 mRNA 발현 프로파일과 조합하여, 포함할 수 있다.
일부 선택적인 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 인테그린 서브유닛 α 6 유전자 (ITGA6, CD49f, ITGA6B 또는 VLA-6로도 지칭됨, Gene ID: 3655)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대조군 발현 프로파일이 ITAGA6 유전자 전사체의 α- 및/또는 β-이소형의 mRNA 발현 수준을 포함하는 것도 가능하다. 일부 선택적인 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제 2 유전자 (PTGS2, COX-2, COX2, GRIPGHS, PGG/HS, PGHS-2, PHS-2 또는 hCox-2로도 지칭됨, Gene ID: 5743)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 일부 추가의 선택적인 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 β-2-마이크로글로불린 유전자 (B2M 또는 IMD43로도 지칭됨, Gene ID 567)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다. 일부 추가의 선택적인 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 인테그린 서브유닛 α 1 유전자 (ITGA1, CD49a 또는 VLA1로도 지칭됨, Gene ID: 3672)의 mRNA 발현 수준을 포함할 수 있다.
일부 구체적인 구현예에서, 대조군 발현 수준은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 적어도 1종, 2종, 3종, 4종 또는 5종 포함할 수 있다.
대조군 발현 프로파일은 검사 발현 프로파일에 또한 보고된 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 2종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 3종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 4종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 5종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 6종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 7종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 8종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 9종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 10종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 11종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 발현 프로파일은 본원에 기술된 임의의 유전자들 중 적어도 12종의 조합의 mRNA 발현 수준을 포함한다.
그런 후, 검사 발현 프로파일에 제시된 mRNA 발현 수준이 대조군 발현 프로파일에 제시된 대응되는 mRNA 발현 수준보다 높은지를 결정하기 위해 비교를 수행한다. 이러한 비교는 유전자별로 수행된다. 예를 들어, 검사 발현 프로파일이 CEACAM5 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다면, 이러한 발현 수준은 대조군 발현 프로파일에서 CEACAM5 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교한다. 만일 검사 발현 프로파일에서 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준이 대조군 발현 프로파일에서 동일한 유전자 2종의 mRNA 발현 수준보다 높은 것으로 결정된다면, 이는 계층화되는 개체가 대조군 개체와 비교해 진행성 선종 또는 결장직장 암이 있을 위험이 높은 것을 의미한다. 만일 대조군 발현 프로파일에서 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준이 검사 발현 프로파일에서 동일한 유전자 2종의 mRNA 발현 수준보다 낮은 것으로 결정된다면, 이는 계층화되는 개체가 대조군 개체와 비교해 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 있을 위험이 높은 것임을 의미한다.
전술한 바와 같이, 본원에 기술된 방법을 또한 이용해, 개체에 진행성 결장직장 선종이 있을 위험에 대해 계층화할 수 있다. 이러한 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 추가적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 본 방법은 계층화 대상 개체 및/또는 대조군 개체에서 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 본 방법은 계층화 대상 개체 및/또는 대조군 개체에서 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 본 방법은 검사 발현 프로파일과 대조군 발현 프로파일 간에 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 검사 발현 프로파일과 대조군 발현 프로파일 간에 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 만일 검사 발현 프로파일에 제시된 유전자 (예를 들어, CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자) 적어도 하나, 적어도 2 또는 3종 모두의 mRNA 발현 수준이 대조군 발현 프로파일에서 대응되는 mRNA 발현 수준에 대해 증가된 것으로 결정된다면, 이는 계층화되는 개체가 진행성 결장직장 선종이 있을 위험이 대조군 개체에 비해 높은 것을 의미한다. 만일 대조군 발현 프로파일에 제시된 유전자 (예를 들어, CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자) 적어도 하나, 적어도 2 또는 3종 모두의 mRNA 발현 수준이 검사 발현 프로파일에서 대응되는 mRNA 발현 수준에 대해 감소된 것으로 결정된다면, 이는 계층화되는 개체가 진행성 결장직장 선종이 있을 위험이 대조군 개체에 비해 높은 것을 의미한다.
전술한 바와 같이, 본원에 기술된 방법은 개체에 결장직장 암이 있을 위험에 대해 계층화하는데 이용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 추가적인 구현예에서, 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 본 방법은 계층화 대상 개체 및/또는 대조군 개체에서 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 본 방법은 계층화 대상 개체 및/또는 대조군 개체에서 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 본 방법은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 검사 발현 프로파일과 대조군 발현 프로파일 간에 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 검사 발현 프로파일과 대조군 발현 프로파일 간에 비교하는 것을 포함할 수 있다. 만일 검사 발현 프로파일에 제시된 유전자 (예를 들어, S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자) 적어도 하나, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종 또는 5종 모두의 mRNA 발현 수준이 대조군 발현 프로파일에서 대응되는 mRNA 발현 수준에 대해 증가된 것으로 결정된다면, 이는 계층화되는 개체가 결장직장 암이 있을 위험이 대조군 개체에 비해 높은 것을 의미한다. 만일 대조군 발현 프로파일에 제시된 유전자 (예를 들어, S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자) 적어도 하나, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종 또는 5종 모두의 mRNA 발현 수준이 검사 발현 프로파일에서 대응되는 mRNA 발현 수준에 대해 감소된 것으로 결정된다면, 이는 계층화되는 개체가 결장직장 암이 있을 위험이 대조군 개체에 비해 높은 것을 의미한다.
본원에 기술된 계층화 방법은 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 진단하는 것을 돕기 위해 사용되는 기타 방법 및 분석과 함께 이용할 수 있다. 당해 기술 분야에서는, 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 가진 개체가 비-진행성 선종을 가진 개체 또는 건강한 개체에서와 비교해 분변에 혈액 성분인 헤모글로빈이 더 빈번하게 존재하는 것으로, 인정되고 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 계층화 방법은 방법의 민감도를 높이기 위해 헤모글로빈의 존재 확인과 조합하여 이용할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 따라서 분변 샘플 또는 가공 처리된 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 분변 면역화학적 검사 (FIT)를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 추가적인 구현예에서, 본 방법은 guaic-기반의 분변 잠혈 검사 (guaic-based fecal occult blood test, gFOBT)를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 추가적인 구현예에서, 본 방법은 CologuardTM 및/또는 ColoAlertTM 검사를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 멀티-표적 mRNA에 기반한 본 발명의 방법을 기타 분석과 조합하는 경우에 한가지 강점은 FIT 또는 gFOBT, CologuardTM 및/또는 ColoAlertTM 등의 기타 비-침습적인 방법과 비교해 mRNA 표적을 이용해 진행성 선종을 더 높은 수준으로 검출할 수 있다는 것이다.
계층화 대상이 되는 개체는 진행성 선종 또는 결장직장 암이 존재하는 것으로 이전에 확정되었을 수 있다. 예를 들어, 계층화 대상 개체의 분변에서 헤모글로빈의 존재가 이전에 확정되었을 수 있다. 일부 구현예에서, 계층화 대상 개체는 (mRNA 발현 수준을 확인하기 위해 사용된 것과 동일하거나 또는 다를 수 있는) 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확정하기 위해 이전에 FIT 또는 gFOBT 검사를 받았을 수 있다. 일부 구현예에서, 계층화 대상 개체는 그/그녀 분변에 헤모글로빈이 있는 것으로 이전에 확정되었을 수 있다.
또한, 일부 DNA 돌연변이가 개체의 진행성 선종 또는 결장직장 암 발병 소인을 (대조군 개체와 비교해) 증가시키는 것으로 인정되고 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 계층화 방법은 본원에 기술된 방법의 민감도를 높이기 위해 개체의 세포 게놈에서 하나 이상의 DNA 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인하는 것과 조합하여 이용할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 개체의 게놈에서 하나 이상의 (예를 들어, 결손, 삽입 및/또는 중복일 수 있는) DNA 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 하나 이상의 DNA 돌연변이는 진행성 선종 또는 결장직장 암의 발병 소인의 증가와 관련 있는 것이다. 예를 들어, DNA 돌연변이는 NDRG4 유전자, BMP3 유전자 및/또는 K-RAS 유전자에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 개체의 세포에서 하나 이상의 DNA 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 CologuardTM 검사를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
계층화 대상 개체는 이전에 진행성 선종 또는 결장직장 암이 존재하는 것으로 진단받았을 수 있다. 예를 들어, 계층화 대상 개체의 세포(들)에 하나 이상의 DNA 돌연변이의 존재가 이전에 확정되었을 수 있다. 일부 구현예에서, 계층화 대상 개체는 이전에 개체의 세포에서 DNA 돌연변이의 존재를 확정하기 위해 CologuardTM 검사를 받았을 수 있다.
또한, 진행성 선종 및 악성 결장직장 종양은 인 시추로 가시화할 수 있으며, 의사가 개체에 진행성 결장직장 선종 및 결장직장 암이 있는지를 결정하는데 도움을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 계층화 방법은 개체의 결장직장 관의 일부분을 가시화하는 것과 조합하여 이용할 수 있다. 결장직장 관은 대장내시경, 유연한 S자 대장검사 (flexible sigmoidoscopy) 및/또는 CT 대장조영술을 이용해 가시화할 수 있다. 일부 구현예에서, 결장직장 관은 대장내시경을 이용해 가시화할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 진행성 결장직장 선종(들) 및/또는 악성 결장직장 종양(들)의 존재를 확인하기 위해 개체의 결장직장 관의 일부 또는 전체를 가시화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 계층화 대상 개체는 이전에 결장직장 관 일부 또는 전체에 대한 가시화 시술을 받았을 수 있다.
대안적으로, 본원에 기술된 방법은 개체의 결장직장 관을 가시화하기 전에 이용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 이용해, 계층화 대상 개체를 대장내시경과 같은 촬상을 수행할 고 위험 군 또는 CRC 하위 군으로 우선 순위를 정할 수 있다. 촬상 기법은 일부 개체에는 불편할 수 있거나, 또는 일부 지리학적 지역에서는 이용성이 제한적일 수 있다. 이와 같이, 특정 상황에서는, 개체가 고 위험 군 또는 CRC 하위 군에 속해, 어느 개체에 이러한 촬상 분석이 유용한지 우선순위를 정할 필요가 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 고 위험 군 또는 CRC 하위 군으로 계층화된 개체에, 의사가 그/그녀를 진단하는데 돕기 위해 수행되는 결장직장 관에 대한 촬상 분석 (예, 대장내시경)을 권고하는 것을 포함한다.
또한, 본원에 기술된 방법은 임상 시험에서 개체를 참여시키거나 또는 제외하거나 또는 이를 임상 시험의 치료 군으로 할당하기 위해 임상 시험의 맥락에서도 이용할 수 있다.
또한, 진행성 선종 및 악성 결장직장 종양은 병리학 분석 (예, 조직 분석)으로 검출할 수 있으며, 의사가 개체에 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 있는지를 결정하는데 도움이 될 수 있는 것으로, 인정되고 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 계층화 방법은 진행성 결장직장 선종 또는 악성 결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 개체의 조직에 대한 병리학적 분석과 조합하여 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 계층화 대상 개체의 조직은 이전에 병리학적 분석을 받았을 수 있다.
특정 군 또는 특정 하위 군으로 계층화되면, 그 개체는 개체에 속하는 증상을 완화하거나 또는 병태를 치료하는데 적합한 맞춤화된 치료학적 용법을 처방받을 수 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 방법은 고 위험 군으로 계층화된 개체에서 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 (예, 대장암 또는 직장암)을 치료하는데 이용할 수 있다. 치료는 개체에 라운드 1회 이상의 화학요법 (예를 들어, 5-플루오로우라실, 루코보린 (leucovorin), 카파시타빈 (capacitabine), 이리노테칸 (irinotecan) 및/또는 옥살리플라틴 (oxaliplatin))을, 선택적으로는 치료 항체와 조합하여, 제안하는 것을 포함할 수 있다. 치료는 개체에 방사선 요법을 1회 이상의 라운드로 제안하는 것을 포함할 수 있다. 치료는 개체에 수술 (예, 진행성 결장직장 선종 또는 악성 결장직장 종양의 외과적 절제)을 제안하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법을 이용해, 화학요법 1회 이상, 방사선요법 1회 이상을 시술받았거나 및/또는 이미 하나 이상의 진행성 결장직장 선종 또는 하나 이상의 결장직장 악성 종양을 제거하기 위한 수술을 시술받은 개체에 대해 치료 용법을 맞춤 설계할 수 있다. 이러한 구현예에서, 본 방법을 이용해, 개체가 전-암성 또는 암성 결장직장 세포를 가질 위험이 있는지, 또는 제공된 치료가 전-암성 또는 암성 결장직장 세포를 가질 위험을 낮추는데 충분한지를 확인할 수 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 방법은, 개체에 제1선 요법 또는 수술이 적어도 1회 이상 시술된 후, 그리고 추가적인 요법을 시술하기 전, 또는 추가적인 수술을 제시하기 전에, 이용할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 의사가 더 공격적인 또는 덜 공격적인 치료학적 또는 외과적 용법이 필요한지를 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
또한, 본 발명은 계층화 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 검사 발현 프로파일에 제시된 유전자 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 또는 그 보다 많은 수의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 수단 (예, 시약)을 포함한다. 예를 들어, 키트는 발현을 확인하는 mRNA에 대응하는 cDNA 분자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 하나 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 또는 그보다 많은 수로 포함할 수 있다. 키트는 CEA 부착 분자 5 (CEACAM5, CD66e 또는 CEA로도 지칭됨, Gene ID 1048)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 증식 정지 및 DNA 손상 유도성 β 유전자 (GADD45B, GADD45BETA 또는 MYD118로도 지칭됨, Gene ID: 4616)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 인테그린 서브유닛 α 2 유전자 (ITGA2, BR, CD49B, GPIa, HPA-5, VLA-2 또는 VLAA2로도 지칭됨, Gene ID: 3673)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 MET 전사 조절자 MACC1 (MACC1, 7A5 또는 SH3BP4L로도 지칭됨, Gene ID: 346389)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 검사 발현 프로파일은 MYB 프로토-온코진 유사 2 유전자 (MYBL2, B-MYB 또는 BMYB로도 지칭됨, Gene ID: 4605)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트 프로파일은 MYC 프로토-온코진, bHLH 전사 인자 (MYC, MRTL, MYCC, bHLHe39 또는 c-Myc로도 지칭됨, Gene ID: 4609)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 S100 칼슘 결합 단백질 A4 (S100A4, 18A2, 42A, CAPL, FSP1, MTS1, P9KA 또는 PEL98로도 지칭됨, Gene ID: 6275)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 추가의 선택적인 구현예에서, 키트는 β-2-마이크로글로불린 유전자 (B2M 또는 IMD43로도 지칭됨, Gene ID 567)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 추가의 선택적인 구현예에서, 키트는 인테그린 서브유닛 α 1 유전자 (ITGA1, CD49a 또는 VLA1로도 지칭됨, Gene ID: 3672)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 키트는 CEACAM5, ITGA6 및 MACC1의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 검사 발현 프로파일은 CEACAM5, ITGA6, MACC1 및 B2M의 mRNA 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트는 PTGS2 및 S100A4의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트는 CEACAM5, ITGA6, MACC1, PTGS2 및 S100A4의 mRNA 발현 수준을, 선택적으로 B2M의 mRNA 발현 프로파일과 조합하여, 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 선택적인 구현예에서, 키트는 인테그린 서브유닛 α 6 유전자 (ITGA6, CD49f, ITGA6B 또는 VLA-6로도 지칭됨, Gene ID: 3655)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 키트는 ITAGA6 유전자 전사체의 α- 및/또는 β-이소형의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함하는 것도 가능하다. 일부 선택적인 구현예에서, 키트는 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제 2 유전자 (PTGS2, COX-2, COX2, GRIPGHS, PGG/HS, PGHS-2, PHS-2 또는 hCox-2로도 지칭됨, Gene ID: 5743)의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 키트는 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 시약 하나 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상 또는 5종 이상을 포함할 수 있다.
키트는 일부 구현예에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위한 중합효소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 역-전사 단계를 수행하기 위한 프라이머를 또한 포함할 수 있다. 키트는, 일부 추가적인 구현예에서, 역-전사 단계를 수행하기 위한 역전사효소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 mRNA 전사체의 정량적인 PCR 검출을 가능하기 위해 증폭 단계 중에 절단되도록 고안된 프로브 (예를 들어, Taqman® 프로브)를 포함할 수 있다. 키트는 또한 확인하는 단계 이전에 개체로부터 분변 샘플 및/또는 분변 샘플을 보관하기 위한 용기를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 수단을 이용해 검사 발현 프로파일을 입수하기 위한 설명서를 포함한다. 또한, 키트는 진행성 선종 또는 결장직장 암에 걸릴 위험을 토대로 분석 중인 분변 샘플의 개체를 계층화하는 방법에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이나, 이는 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것일 뿐 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
환자 및 샘플. 환자 샘플 2세트를 사용하였다. 샘플 첫번째 세트는 하마마쓰 의과 대학에서 환자 및 건강한 대조군으로부터 고지에 입각한 서면 동의를 구한 후 수집하였다. 실험은 하마마쓰 의과대학의 기관 연구 윤리 위원회로부터 허가받았다. 이 세트에 대한 모든 정보는 이전의 실험으로부터 제공받았다 (Herring et al., 2018; Beaulieu et al., 2016; Herring et al., 2017). 간략하게는, 본 발명에서 이용한 실험 코호트는 대장내시경과 조직병리학에 의해 진단된 최장 치수 10 mm 이상으로서 정의되는 AA 환자 24명과 CRC 환자 78명 (I 기 24명, II 기 32명, III 기 22명), 그리고 건강한 대조군 32명을 포함하였다. 대조군 및 AA의 경우, 대장내시경하기 전에 분변 샘플을 수집하였다. 모든 환자들과 대조군에 대해 개시된 바와 같이 면역화학적 분변 잠혈 검사 (iFOBT)를 수행하였다 (Beaulieu et al., 2016).
샘플의 2번째 세트는 셔브룩 중앙 대학 병원 (CHUS)에서 대장내시경과 조직병리학에 의해 CRC II기 또는 III기로 진단된 환자 3명과 건강한 대조군 3명으로부터 고지에 입각한 서면 동의를 받아 수집하였다. 실험은 CHUS의 기관 연구 윤리 위원회로부터 허가받았다. 이 샘플 세트는 mRNA 표적 안정성 시험에 이용하였다. 각 샘플을 13개의 분액으로 나누어 다양한 조건 하에 최대 5일간 다음과 같이 보관하였다: #1, 5일간 -80℃, 대조군; #2, 5일간 -20℃; #3, 5일간 -20℃, 해동/냉동 사이클 수행; #4-8, 1-5일간 4℃ 및 #9-13, 1-5일간 23℃.
RNA 단리, 역 전사, 예비 증폭 및 PCR 증폭. 이전에 개시된 바와 같이 분변 샘플로부터 RNA를 단리해 역 전사하였다 (Hamaya et al., 2010; Dydensborg et al., 2006). 예비 증폭을 위해 TaqMan PreAmp 마스터 키트 (Life Technology)를 이용해, TaqMan 유전자 발현 분석 (Herring et al., 2017)으로 분석하기 위한 특이적인 증폭산물에 대한 비-편향된 멀티플렉스 예비 증폭을 수행하였다. 상업적으로 구입가능한 TaqMan 프라이머 및 프로브 혼합물을 이전에 기술되고 표 1에 상세히 기술된 바와 같이 사전 선정한 표적 27종에 대한 예비 증폭에 이용하였다. 정량적인 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)은 TaqMan 유전자 발현 분석을 이전에 언급된 조건에서 이용해 수행하였다 (Herring et al., 2018).
표 1. 검사한 특이적인 표적에 대한 목록. 모든 프라이머 및 프로브 혼합물은 대조군, AA 및 CRC를 비롯한 분변 샘플 서브세트에 대해 먼저 검사하여, 분변에서 항상 검출가능한 것을 선정하였다. 샘플 전체 세트에 대한 추가적인 분석으로, CRC 및 AA 또는 CRC 단독에서만 특이적으로 농화된 표적을 선정가능하였다.
| 유전자 명 | TaqMan 분석 I.D. | 분변에서 항상 검출 유무 | 과다 존재 | |
| CRC 단독 | AA 및 CRC | |||
| B2M | Hs00984230_m1 | Y | Y | |
| BGN | Hs00156076_m1 | |||
| CEACAM5 | Hs00944025_m1 | Y | Y | |
| CTNNB1 | Hs00355049_m1 | |||
| DYNC2H1 | Hs00941787_m1 | |||
| FAP | Hs00990806_m1 | |||
| GADD45B | Hs00169587_m1 | Y | Y | |
| GLI1 | Hs00171790_m1 | |||
| HMAN1B1 | Hs01032463_m1 | |||
| HNRNPA2B1 | Hs00955384_m1 | |||
| INHBA | Hs04187260_m1 | |||
| ITGA1 | Hs00235006_m1 | Y | ||
| ITGA2 | Hs01673848_m1 | Y | ||
| ITGA6A | Hs01041013_m1 | Y | Y | |
| ITGA6 | Hs01041011_m1 | Y | Y | |
| KI67 | Hs01032434_m1 | |||
| KIF3A | Hs01126351_m1 | |||
| KIF7 | Hs00419527_m1 | |||
| MACC1 | Hs00766186_m1 | Y | Y | |
| MLH1 | Hs00179866_m1 | Y | ||
| MSH1 | Hs00954125_m1 | Y | ||
| MTR | Hs01090031_m1 | |||
| MYBL2 | Hs00942543_m1 | Y | Y | |
| MYC | Hs00153408_m1 | Y | Y | |
| PTGS2 | Hs00153133_m1 | Y | Y | |
| S100A4 | Hs00243202_m1 | Y | Y | |
| VDAC2 | Hs01075603_m1 | |||
데이터 제시 및 통계 분석. 분변 mRNA 데이터는 반응물의 ㎕ 당 카피수로서 계산할 수 있다. 각 전사체에 대해 표준 참조 곡선은 NanoDrop 1000 분광광도계 (NanoDrop, Wilmington, DE, USA)에서 정량한 표적 서열의 cDNA 원액 용액의 연속 5배 희석액을 이용하여 작성하였다. Prism 8을 통계학적 계산에 이용하였다. 분변 대조군 및 AA 및 I-III 기 CRC 병변을 가진 환자에서 비교 mRNA 발현 (카피 수)은 사분위수 범위의 중앙값으로서 나타내었으며, 크루스칼-왈리스 검정과 이후 둔의 다중 비교 검정으로 분석하였다. ROC (receiver operating characteristic) 곡선 하 면적을 계산해 각 마커에 대해 95% 신뢰구간으로 %로 표시되는 민감도와 특이도를 확립하였다. 점수는 각 마커에 대해 ROC 곡선으로부터 확립한 컷-오프 값 3개를 토대로 0-3의 척도로 계산하였다: 이전에 확립된 바와 같이 (낮은 컷-오프는 민감도 80%에 해당하고, 중간 컷-오프는 특이도 90%에 해당하고, 높은 컷-오프는 특이도 99%에 해당). 통계학적 유의성은 P < 0.05로 정의하였다.
결장직장 암성 병변에서 보고된 과다 발현을 토대로 정한 특이적인 표적 스물일곱(27)종을 스크리닝하였다. 샘플 30건의 서브세트 (대조군 10건, AA 10건 및 CRC 10건)를 이용한 이들 예비 평가 결과, 14종이 결장직장 병변을 가진 환자의 분변에서 늘 검출되었다 (표 1). 잘 검출되지 않는 표적에 대해 다른 프라이머 및 프로브 혼합물로 추가로 검사를 시도하였지만, 임상 분석에서 멀티플렉스 PCR 용량이 제조사에 따라 표적 4-5건으로 제한됨을 고려해 14종만으로도 검증 분석을 수행하기에 충분한 것으로 보여 추가로 조사하진 않았다.
건강한 대조군 (32명)과 결장직장 병변을 가진 환자 (AA 24명 및 CRC 78명)로부터 입수한 샘플 132건 세트를 대상으로 표적 14종에 대한 추가적인 조사를 수행하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, CRC 환자의 샘플들에서 다수의 표적이 유의하게 과다 존재하는 반면, AA 또는 CRC 환자에서는 몇개만 존재하는 것으로 밝혀졌다. S100A4를 이용해 예시한 바와 같이 (도 1A), GADD45B, ITGA2, MYBL2, MYC 및 PTGS2 (도 4)를 또한 포함한 제1 군의 전사체의 중앙 카피 수는 대조군과 비교해 CRC 환자의 분변에서 유의하게 증가된 것으로 확인되었으며, CEACAM5 (도 1A), ITGA6 및 MACC1 (도 4)을 비롯한 단 3종은 AA 환자에서도 과다 존재하는 것으로 확인되었다.
다음으로 2개의 마커 군에서 점수를 계산하였다. 카피 수는 표적에 따라 MYC의 경우 ~200에서 CEACAM5의 경우 40,000까지 상당히 다양하였으므로, 전술한 바와 같이 표적의 컷-오프 값을 토대로 각 환자 샘플에 대해 0-3 값을 할당함으로써 모든 표적들에 대해 개별 점수를 구하였다. 그 후, 대조군 및 AA 또는 CRC 환자에서 2개의 마커 군 각각에 대해 총 점수를 구하였다. 도 1B에 나타낸 바와 같이, 제1 군의 마커 6종에 대한 총 점수는 CRC 환자의 샘플을 대조군의 샘플에 비해 유의하게 인지하는 반면, 제2 군의 마커 3종에 대한 총 점수는 CRC 또는 AA 환자의 샘플을 대조군의 샘플과 구별하였다. 2개의 군에서 ROC 곡선을 구하였다 (도 1C). 제1 군에서, CRC에 대한 곡선 하 면적 (AUC)은 특이도 95%에 대해 민감도 89%에 해당하는 0.970이었으며, AA의 경우에는 (특이도 95%에 대해) 민감도 58%인 0.825에 불과하였다. 제2 군에서는, CRC의 경우 AUC가 0.914이고, AA의 경우 0.917이고, 민감도는 각각 (특이도 95%에 대해) 79% 및 75%이었다.
AA의 75%가 제2 군의 마커 3종 (즉, CEACAM5, ITGA6 및 MACC1)을 이용해 검출할 수 있었음을 고려하여, 제1 군에 속하는 마커들의 다양한 조합을 포함시켜 표적 최대 5종을 이용해 CRC 검출을 개선하고자 하였다 (표 2). 그 결과, 마커 2종, 즉 S100A4 및 PTGS2의 추가는 CRC 검출율을 (특이도 95%에 대해) 최대 89%로 유의하게 개선하였다 (도 2A). 흥미롭게도, FIT의 결과를 다중-표적 점수와 조합하여 고려한 결과, CRC 검출율은 (특이도 97%에 대해) 최대 95%로 더욱 높아졌지만, AA 검출에는 유의한 효과가 없었다 (도 2B).
표 2. 최상의 표적 조합 선정. 민감도 및 특이도는 최적 컷-오프 값을 토대로 결정하였다. AUC: 곡선 하 면적, AA: 진행성 선종, CRC: I, II 및 III 기 결장직장 암.
| AA | CRC | |||||||||
| AUC | 민감도 | 특이도 | 유덴 지수 | 특이도 >95%에 대한 민감도 | AUC | 민감도 | 특이도 | 유덴 지수 | 특이도 >95%에 대한 민감도 | |
| GADD45B/ITGA2/MYBL2/MYC/ PTGS2/S100A4 | .819 | 79.1 | 87.10 | .66 | 45.30 | .969 | 85.19 | 96.97 | .86 | 85.19 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1 | .917 | 91.67 | 83.87 | .76 | 75.00 | .914 | 79.01 | 96.97 | .76 | 79.01 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+GADD45B | .900 | 75.00 | 87.88 | .63 | 70.83 | .923 | 79.01 | 96.97 | .76 | 79.01 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+ITGA2 | .900 | 79.17 | 90.91 | .70 | 70.83 | .929 | 83.95 | 96.97 | .81 | 83.95 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+MYBL2 | .915 | 79.17 | 93.94 | .73 | 75.00 | .924 | 85.19 | 93.94 | .79 | 80.25 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+MYC | .918 | 83.33 | 93.94 | .77 | 66.67 | .939 | 85.19 | 94.94 | .79 | 80.25 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+PTGS2 | .905 | 79.17 | 90.32 | .70 | 66.67 | .944 | 86.42 | 93.55 | .80 | 81.48 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+ S100A4 | .910 | 79.17 | 93.94 | .73 | 75.00 | .952 | 86.42 | 93.94 | .80 | 81.48 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+ITGA2/S100A4 | .897 | 79.17 | 90.91 | .69 | 70.83 | .958 | 86.42 | 93.94 | .80 | 82.72 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+ITGA2/PTGS2 | .890 | 75.00 | 93.55 | .69 | 66.67 | .952 | 87.65 | 93.55 | .81 | 83.95 |
| CEACAM5/ITGA6/MACC1+PTGS2/S100A4 | .910 | 83.33 | 87.10 | .70 | 75.00 | .961 | 88.89 | 96.77 | .86 | 88.89 |
| S100A4/PTGS2 | .773 | 70.80 | 78.79 | .50 | 29.17 | .949 | 93.75 | 78.78 | .73 | 80.25 |
궁극적인 목표가 임상 상황에서 다중-표적 mRNA 분변 검사의 실행 가능성을 평가하는 것임을 감안하여, 임상 현실을 모방하는 다양한 보존 조건에 노출시켜 분변 샘플에서 mRNA 표적의 안정성을 평가하였다. 분변 샘플은 대조군 3명과 CRC로 진단된 환자 3명으로부터 입수하였다. 분변에서 동정된 표적들 중 4종, 즉 상기에서 동정된 각 군 당 2개를 검사용으로 선정하였다: CEACAM5, ITGA6, ITGA2 및 PTGS2. 검사 조건은 5일간, 해동 사이클을 동반 및 비-동반한 -20℃에서의 일반적인 냉동, 4℃에서 보존 및 실온 (23℃)에서 보존을 포함한다. PTGS2 (도 3A), 아울러 CEACAM5, ITGA6 및 ITGA2 (도 5)에 대해 나타낸 바와 같이, mRNA 표적은 5일간의 모든 냉동 및 냉각 조건에서 매우 안정적인 것으로 확인되었으며, PTGS2와 같은 일부 마커들에서는 실온에서 약간의 변화가 관찰되었다 (도 3A). 데이터의 점수 수집 결과, 적어도 3일간 주위 온도를 비롯한 모든 조건들에서 표적들의 상대적인 안정성이 검증되었다 (도 3B).
본 실시예에서, 다중-표적 분변 mRNA 검사는 결장직장 암을 가진 환자를 검출하는 강력한 분석법이고, 고 위험 선종을 또한 검출하는데 이의 유용성이 입증된 것으로 나타났다. 절차의 한가지 관심사는 표적 단 5종을 선정하여 고 민감도 및 특이도를 달성할 수 있었으므로, 위장 감염을 조사하기 위해 클리닉에서 이미 시행 중인 방식인 분변 샘플의 멀티플렉스 PCR과 호환된다는 점을 고려하면, 이의 상대적인 단순성이다.
본원에 제시된 다중-표적 분변 mRNA 검사의 한가지 장점은 전사체를 통상적인 추출 방법에 의해 분변으로부터 직접 단리하므로, 즉 RNA 추출 및 가공 처리하기 전 박리된 결장직장 세포에 대한 농화 프로토콜을 요하는 절차에 비해 자동화하기 적합하다는 것이다. 다른 장점은 분석을 최적화하는데 필요한 표적의 개수가 상대적으로 적다는 것이다. 이러한 개념 증명 연구의 중요한 부분이 CRC에서 과다 존재하는 것으로 보이는 특히 AA 환자의 샘플을 식별하기 위한 특이적인 표적을 찾은 다음 AA 및 CRC를 둘다 검출할 수 있는 가장 우수한 조합을 선별하는 것이었음에 주목할만하다.
본 실험에서 mRNA 표적 단 5종만으로도, AA 환자로부터 입수한 샘플의 75%와 CRC 환자로부터 입수한 샘플의 89%를 특이도 ≥95%를 적용해 검출할 수 있었음을 기술한다는 점에서 흥미롭다. 다른 검사와 공정한 비교를 허용하기 위해 위양성 5% 미만이 달성되는 이러한 최적의 특이도를 이용해 데이터를 표시하도록 선정하였다. 부수적으로, FIT 구성요소를 mRNA 데이터에 통합하면 CRC 민감도가 최대 95%까지 높아지므며, 이는 박리된 세포의 기원과 분변 혈액의 기원이 다를 가능성이 있다는 사실과 일치한다. 전반적으로, 다중-표적 분변 mRNA-FIT 검사는 AA 75%, CRC 95%를 위양성율 4% 미만으로 검출할 수 있다. 이러한 수치는 결장직장 암성 병변에 대한 임의의 다른 선별 검사에 비해 양호하다. FIT 구성요소를 포함할 경우에 알 수 있는 바와 같이, 표적 유형의 다양성은 민감도를 높인다.
또 다른 발견은 AA 대 CRC를 예측하기 위한 인자를 포함할 가능성으로, 그래서 대장내시경에 앞서 적절한 정보를 제공할 수 있다. 실제, 별도로 고려한 바, AA를 예측하기 위해 선정한 표적 3종의 조합, 즉 CEACAM5, ITGA6 및 MACC1은, AA 및 CRC에 대해 각각 75% 및 79%의 민감도 (특이도 95%에 대해)를 제공하였으며, CRC 검출을 개선하기 위해 선정한 표적 2종, 즉 S100A4 및 PTGS2는 AA 및 CRC 예측에서 각각 민감도 29% 및 80% (특이도 95%에 대해)를 제공하였는데, 이는 AA 및 CRC에 대한 개별 표적 레퍼토리를 이용해 대장내시경에 대한 환자 계층화를 개선할 수 있음을 시사해준다. 다중-표적 분변 mRNA 검사에서 양성으로 식별된 환자들에서 S100A4 및 PTGS2 점수에 대한 특이 분석은, 예를 들어, S100A4 및 PTGS2 점수가 >4.5인 환자가 AA일 확률 17% 대 CRC일 확률 73%인 것을 고려하면, AA 환자를 CRC 환자와 구별하는데 일조할 수 있다.
마지막으로, 표적 안정성 평가 결과, 다중-표적 분변 mRNA 검사를 수행하기 위한 분변 샘플 채집물에는 특별한 조건이 요구되지 않으며, 적어도 3일간, 심지어 실온에서도 비교적 안정한 것으로 드러났다. 이러한 비교적 놀라운 관찰 결과는 일부 분변 내 숙주 mRNA의 주 소스인 박리된 세포에서 mRNA 분해가 방지될 가능성이 원인일 수 있다. 또 다른 일부분은 mRNA 표적을 선정하는데 이용된 공정으로부터 기인한다. 부수적으로, 선정한 표적 27종 중 단 절반만 분변 샘플에서 증폭되었다는 점은 놀라운 결과가 아니다. 이들 표적에 대한 효율적인 증폭은 비교적 짧고 온전한 mRNA 서열을 요하는 분변 샘플에 대한 통상적인 qPCR과 비교해 민감도 및 특이도가 더 높은 것으로 밝혀진 TaqMan 유전자 발현 분석의 이용에 또한 기인한 것이다.
결론적으로, 본 실시예는 치유가능한 결장직장 암 및 전암성 병변을 가진 환자를 식별하기 위한 바이오마커로서 숙주 mRNA의 유용성을 입증해준다.
본 발명은 구체적인 구현예를 들어 기술되었지만, 청구항의 범위는 본 실시예에 기술된 바람직한 구현예로 제한되어서는 안되며, 본 기술 내용 전체와 일치하는 가장 광의적인 해석을 제공하여야 하는 것으로 이해될 것이다.
Claims (33)
- 개체에서 개체가 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 가질 위험에 대해 계층화하는 방법으로서,
a) 개체로부터 분변 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 분변 샘플이 상기 개체로부터 유래한 복수의 mRNA 전사체를 포함하는 것인, 단계;
b) 상기 복수의 mRNA 전사체로부터 개별 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 확인하여 검사 발현 프로파일을 수득하는 단계; 및
c) 상기 검사 발현 프로파일을 대조군 발현 프로파일과 비교하는 단계로서, 상기 대조군 발현 프로파일은 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 포함하고 상기 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암이 없는 것으로 확인된 대조군 개체로부터 유래한 복수의 대조군 mRNA 전사체로부터 수득되는 것인, 단계를 포함하고,
개체의 검사 발현 프로파일이 대조군 발현 프로파일에 비해 발현이 증가된 유전자를 2 이상 포함하는 것으로 확인되면, 그 개체는 대조군 개체와 비교해 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암 위험이 높은 것으로 계층화하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 분변 샘플이 하나 이상의 결장직장 상피 세포를 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 결장직장 상피 세포가 상기 복수의 mRNA 전사체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일이 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자, CEACAM5 유전자 및/또는 MACC1 유전자 중 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)는 상기 복수의 mRNA 전사체에서 하나 이상의 추가의 유전자에 대해 mRNA 발현 수준을 확인하는 것을 포함하고, 상기 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일이 PTGS2 유전자 및/또는 ITGA6 유전자의 발현 수준을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일이 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검사 발현 프로파일 및 대조군 발현 프로파일이 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)는 상기 검사 발현 프로파일 및/또는 대조군 발현 프로파일의 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 입수하기 위해 역-전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)는 상기 검사 발현 프로파일 및/또는 대조군 발현 프로파일의 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 입수하기 위해 정량적인 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)을 이용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 이전에 분변 샘플을 보관하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하기 위해 분변 면역화학적 검사 (FIT)를 이용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 개체의 결장직장 상피 세포에서 결장직장 암의 소인과 관련한 비정상적인 DNA 메틸화 패턴 및/또는 DNA 돌연변이의 존재를 확인하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 DNA 돌연변이는 적어도 하나가 K-RAS 유전자에 위치한, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 비정상적인 DNA 메틸화 패턴이 NDRG4 유전자 및/또는 BMP3 유전자에 위치한, 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재, DNA 돌연변이의 존재 및/또는 비정상적인 DNA 메틸화 패턴의 존재를 확인하기 위해 CologuardTM 분석을 이용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 대장내시경에 적합한 환자를 선별하기 위한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 결장직장암의 발병 위험이 높은 것으로 계층화된 개체에 대해 화학요법, 방사선요법 및/또는 수술을 제안하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결장직장 암이 결장암인, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방법. 상기 결장직장 암이 직장암인, 방법.
- 개체에서 개체가 진행성 결장직장 선종 또는 결장직장 암을 가질 위험에 대해 계층화하기 위한 키트로서, 상기 키트는 복수의 mRNA 전사체로부터 개별 유전자 2종 이상의 mRNA 발현 수준을 확인하여 개체의 분변 샘플에서 검사 발현 프로파일을 수득하기 위한 2 이상의 시약을 포함하는, 키트.
- 제21항에 있어서, 분변 샘플을 보관하기 위한 용기를 추가로 포함하는, 키트.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 2 이상의 시약이 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자, CEACAM5 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 것인, 키트.
- 제23항에 있어서, PTGS2 유전자 및/또는 ITGA6 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 하나 이상의 추가의 시약을 더 포함하는, 키트.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2 이상의 시약이 CEACAM5 유전자, ITGA6 유전자 및/또는 MACC1 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 것인, 키트.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2 이상의 시약이 S100A4 유전자, GADD45B 유전자, ITGA2 유전자, MYBL2 유전자, MYC 유전자 및/또는 PTGS2 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 것인, 키트.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 역-전사효소를 추가로 포함하는, 키트.
- 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하기 위한 수단을 추가로 포함하는, 키트.
- 제28항에 있어서, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재를 확인하기 위해 분변 면역화학적 검사 (FIT)를 이용하는 것을 추가로 포함하는, 키트.
- 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 개체의 결장직장 상피 세포에서 결장직장암의 소인과 관련한 비정상적인 DNA 메틸화 패턴 및/또는 DNA 돌연변이의 존재를 확인하기 위한 시약을 추가로 포함하는, 키트.
- 제30항에 있어서, 상기 DNA 돌연변이는 적어도 하나가 K-RAS 유전자에 위치한, 키트.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 비정상적인 DNA 메틸화 패턴이 NDRG4 유전자 및/또는 BMP3 유전자에 위치한, 키트.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 분변 샘플에서 헤모글로빈의 존재, DNA 돌연변이의 존재 및/또는 비정상적인 DNA 메틸화 패턴의 존재를 확인하기 위해 CologuardTM 및/또는 ColoalertTM 분석을 추가로 포함하는, 키트.
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| Dydensborg AB, Herring E, Auclair J, Tremblay E, Beaulieu J-F. Normalizing genes for quantitative RT-PCR in differentiating human intestinal epithelial cells and adenocarcinomas of the colon. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006;290:G1067-1074. |
| Hamaya Y, Yoshida K, Takai T, Ikuma M, Hishida A, Kanaoka S. Factors that contribute to faecal cyclooxygenase-2 mRNA expression in subjects with colorectal cancer. Br J Cancer 2010;102:916-21. |
| Herring E, Kanaoka S, Tremblay E, Beaulieu JF. A stool multitarget mRNA assay for the detection of colorectal neoplasms. Methods Mol Biol 2018;1765:217-227. |
| Herring E, Kanaoka S, Tremblay E, Beaulieu JF. Droplet digital PCR for quantification of ITGA6 in a stool mRNA assay for the detection of colorectal cancers. World J Gastroenterol 2017;23:1-8. |
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