KR20230097412A

KR20230097412A - 보베리아 바시아나 jef-232 또는 보베리아 바시아나 jef-544 균주를 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물

Info

Publication number: KR20230097412A
Application number: KR1020210186895A
Authority: KR
Inventors: 김재수; 임예람; 박소은; 이수연; 오기훈
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 주식회사 팜한농
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-07-03

Abstract

본 발명은 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) JEF-232 또는 보베리아 바시아나 JEF-544 균주를 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 보베리아 바시아나 균주는 다양한 흡즙성 해충에 높은 살충효과를 나타낼 뿐만 아니라, 높은 잎 정착성, 빠른 mycosis를 통한 2차 감염 유도가 가능하며, 곡물배양을 통해 열안정성이 높은 포자를 대량생산 할 수 있고, 알, 유충 및 성충 등 모든 령기에서 높은 살충효과를 나타낼 수 있으며, 구체적으로 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주 모두는 목화진딧물 및 점박이응애에 대한 살충효과가 매우 뛰어나므로 흡즙성 해충 방제용 살충제로써 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

보베리아 바시아나 JEF-232 또는 보베리아 바시아나 JEF-544 균주를 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물{Composition for controlling sucking pests comprising Beauveria JEF-232 or Beauveria JEF-544 strain}

본 발명을 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) JEF-232 또는 보베리아 바시아나 JEF-544 균주를 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물에 관한 것이다.

농업 생산에서 흡즙해충은 다양한 농작물에 흡즙에 의해 잎말림, 엽록소 붕괴, 고사등의 다양한 피해를 야기한다. 이러한 흡즙해충에는 진딧물, 점박이응애, 가루이, 응애 등 여러 가지가 있으며, 특히 최근 문제가 많이 되는 종으로는 목화진딧물과 점박이응애가 주목을 받고 있다.

목화진딧물과 점박이응애는 유럽, 아시아, 아프리카, 아메리카 및 호주를 포함한 대부분의 국가에서 발생이 보고된 전 세계적인 주요 해충이다.

목화진딧물과 점박이응애는 구침으로 작물 잎의 엽육세포에 침투하여 식물 체액을 빨아먹으며, 이를 통해 식물의 성장을 억제하고 기형을 유발하는 큰 피해를 발생시킨다.

특히 진딧물은 CMV(오이모자이크바이러스), TuMV(순무모자이크바이러스) 등 180종 이상의 식물바이러스병을 옮기는 것으로 알려져 있어 바이러스매개로 인한 피해가 매우 크다.

또한 점박이응애는 개체수가 증가하면 거미줄을 만들어 이동하므로 점박이응애 피해가 심각한 잎에서는 거미줄이 관찰되고 광합성 기능을 상실하여 생육이 어렵게 된다. 목화진딧물에 의한 피해증상으로는 구침을 잎과 줄기의 조직 속에 찌른 후 식물 체액을 빨아먹어 식물의 성장을 억제하거나 기형을 유발하고, 여러 가지 바이러스를 매개하여 바이러스병으로 인한 피해도 매우 크며 배설물에 의해 그을음병이 발생하면 작물 생육에 장애를 준다. 점박이응애에의한 피해증상은 주로 잎 뒷면에 발생하여 잎 체액을 흡즙함. 따라서 피해받은 잎은 황색, 갈색 및 백색의 반점이 생기고 구멍이 나며 시들고 낙엽이 된다.

현재까지 목화진딧물과 점박이응애를 방제하기 위해 아바멕틴(abamectin), 비펜트린(bifenthrin), 카보설판(carbosulfan), 카바메이트(cabamates), 피레트로이드(pyrethroids), 네오니코티노이드(neonicotinoids)와 같은 화학약제가 주로 사용되어 왔지만, 화학약제의 장기간 사용은 약제저항성을 발달시키고 환경오염을 일으켜 문제가 되므로 친환경적으로 목화진딧물과 점박이응애를 방제하는 새로운 방법에 대한 관심이 높아 지고 있다.

(001) 대한민국 등록특허 KR 10-1444214

이에 본 발명자는 흡즙성 해충에 대해 병원성을 갖는 곤충병원성 진균을 발굴하기 위하여 연구한 결과, 목화진딧물, 복숭아혹진딧물 및 점박이응애에 대해 우수한 살충효과를 나타내는 균주를 확보하고 이들의 생물농약으로의 적용 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 보베리아 바시아나 균주, 상기 균주의 포자 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 해충, 이의 서식지, 해충으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 토양에 처리하여, 흡즙성 해충을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보베리아 바시아나 균주, 상기 균주의 포자 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 보베리아 바시아나는 보베리아 바시아나 JEF-232(KFCC11888P) 또는 보베리아 바시아나 JEF-544(KFCC11889P)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 흡즙성 해충은 목화진딧물, 복숭아혹진딧물 및 점박이응애로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 해충일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 액상제형, 분말제형 및 입상제형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 보베리아 바시아나 균주는 기장, 백미, 밀기울, 조, 수수 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나의 고체 배양 배지에서 배양된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 해충, 이의 서식지, 해충으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 토양에 처리하여, 목화진딧물 및 점박이응애를 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 보베리아 바시아나 균주는 다양한 흡즙성 해충에 높은 살충효과를 나타낼 뿐만 아니라, 높은 잎 정착성, 빠른 mycosis를 통한 2차 감염 유도가 가능하며, 곡물배양을 통해 열안정성이 높은 포자를 대량생산 할 수 있고, 알, 유충 및 성충 등 모든 령기에서 높은 살충효과를 나타낼 수 있으며, 구체적으로 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주 모두는 목화진딧물 및 점박이응애에 대한 살충효과가 매우 뛰어나므로 흡즙성 해충 방제용 살충제로써 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 분무 처리된 목화진딧물에 대한 살충효과을 나타낸 그래프이다.
도 2는 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주의 배양 특성을 나타낸 사진이다.
도 3은 B. bassiana JEF-232, B. bassiana JEF-544의 ITS 영역의 염기서열을 B. bassiana ARSEF 1564의 ITS 영역의 염기서열과 비교한 것이다.
도 4는 기존 보고된 Beauveria 및 다른 속 균주와의 유연관계 비교를 나타낸 것이다.
도 5는 잎 침지 처리된 목화진딧물에 대한 살충효과 (4반복) 및 mycosis 된 목화진딧물을 나타낸 그래프와 사진이다.
도 6은 잎 침지 처리된 점박이응애에 대한 살충효과 (5반복)를 타나낸 그래프이다.
도 7은 잎 침지 처리된 점박이응애에 대한 살충효과 (5반복) 및 처리 7일차 mycosis 된 점박이응애을 나타낸 그래프와 사진이다.
도 8은 B. bassiana JEF-232와 다른 B. bassiana 균주 (MMD058)의 잎 정착성 비교 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 B. bassiana JEF-232의 잎 정착성 관찰한 것으로, (a) 오이 잎 위에 발생한 B. bassiana JEF-232 균사와 포자, (b) 잎에 발생한 B. bassiana JEF-232 균사로 인해 치사한 목화진딧물을 나타낸 사진이다.
도 10은 B. bassiana JEF-232와 다른 B. bassiana 균주 (MMD058)의 사충 mycosis 형태를 나타낸 사진이다.
도 11은 분무처리된 복숭아혹진딧물에 대한 살충효과 및 mycosis 된 복숭아혹진딧물을 나타낸 사진이다.
도 12는 Millet (기장)을 이용한 B. bassiana JEF-232 포자 생산을 나타낸 사진이다.
도 13은 B. bassiana JEF-232 균주의 포자 생산성 확인한 그래프이다.
도 14는 B. bassiana JEF-544 균주의 점박이응애 성충 및 약충에 대한 살충효과 및 처리 5일차 mycosis 된 점박이응애를 나타낸 그래프와 사진이다.
도 15는 B. bassiana JEF-544 균주의 산란 수 확인 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 점박이응애 알에 대한 B. bassiana JEF-544 균주의 살란 효과를 나타낸 사진이다.
도 17은 B. bassiana JEF-544 균주의 잎 피해율 감소 효과를 나타낸 사진이다.
도 18은 Foxtail millet을 이용한 B. bassiana JEF-544 포자 생산을 나타낸 사진이다.
도 19는 B. bassiana JEF-544 균주의 포자 생산성을 확인한 그래프이다.
도 20은 B. bassiana JEF-544 균주의 열안정성을 확인한 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 최근 경제 작물에 심각한 문제를 야기하고 있는 목화진딧물과 점박이응애를 효과적으로 방제할 수 있으며, 기존 합성 살충제의 저항성 문제와 환경 잔류 문제를 획기적으로 극복하기 위한 B. bassiana JEF-232 및 JEF-544 균주를 선발하여 이에 대한 우수한 효과를 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 B. bassiana JEF-232, JEF-544 균주를 이용하여 동종의 다른 균주에 비해 목화진딧물과 점박이응애를 효과적으로 방제할 수 있다. 6일차의 목화진딧물의 방제 효과는 B. bassiana JEF-232은 84%이고, 동종의 다른 B. bassiana 균주 (MMD058)는 40%이므로 방제 효과가 매우 우수하였다. 5일차의 점박이응애의 방제효과는 B. bassiana JEF-544가 87%로 동종의 다른 B. bassiana 균주 (MJR026)가 15~50%, 식물추출물(고삼추출물)이 48%인 것에 비하여 매우 우수하였다.

따라서 본 발명의 보베리아 바시아나 JEF-232 또는 보베리아 바시아나 JEF-544 균주, 상기 균주의 포자 또는 상기 균주의 배양액를 포함하는 조성물은 목화진딧물 및 점박이응애 방제용 조성물로 효과적이다.

본 발명의 보베리아 바시아나 JEF-232 및 보베리아 바시아나 JEF-544 균주와 기존에 알려진 Beauveria 및 다른 속 균주들 사이의 유연관계를 확인하고자, 미국 국립생물정보센터에 보고된 2종의 Beauveria 속 균주, 1종의 Isaria 속 균주, 2종의 Metarhizium 속 균주와 1종의 Pochonia 속 균주의 ITS sequence를 이용하여 B. bassiana JEF-232, B. bassiana JEF-544와의 유연관계를 비교하였다. 그 결과, 대부분의 B. bassiana 균주들과 유연관계가 비교적 높은 것으로 확인되어, 본 발명의 균주를 보베리아 바시아나로 동정하여, 2021년 6월 16일 한국미생물보존센터(국내)에 B. bassiana JEF-232는 수탁번호 KFCC11888P로, B. bassiana JEF-544는 수탁번호 KFCC11889P로 기탁하였다.

<실시예 1> B. bassiana JEF-232 및 JEF-544 균주의 선발

<1-1> B. bassiana 균주의 목화진딧물에 대한 살충효과 확인(분무처리)

목화진딧물에 대한 본 발명의 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주의 분무처리에 따른 우수한 사충률을 확인하기 위하여, 동종의 B. bassiana 균주와 비교하였다.

구체적으로, MMD058 등 40 종류의 B. bassiana 균주, B. bassiana JEF-232 또는 B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액을 목화진딧물이 존재하는 오이 잎에 각각 분무처리한 다음, 25℃ 조건에서 5일 동안 목화진딧물의 생충수와 사충수를 조사하였다. 사충률(mortality)은 살충제 또는 곤충의 살충 시험에 있어서 공시충에 대한 죽은 곤충의 비율을 뜻하며, 사충률(％)은 (사충수/방충수)×100의 식을 통하여 계산하였다.

그 결과, 처리 후 1일차부터 B. bassiana JEF-544 처리구에서 사충이 확인되었으며, 처리 2일차부터 B. bassiana JEF-232 처리구에서 사충이 확인되었다. 처리 5일차에 음성 대조구(배지 처리구)에서 0%의 사충률이 나타난 반면, B. bassiana JEF-232에서 100%, B. bassiana JEF-544에서 85%의 사충률이 확인되었다. 반면, MMD058 등 40 종류의 다른 B. bassiana 균주에서는 처리 5일차에 0-40%의 낮은 사충률이 확인되었다(도 1).

이와 같은 결과를 통하여, B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주는 동종의 다른 균주 대비 목화진딧물에 대해 높은 사충률을 나타내는 것으로 확인되었다.

<1-2> B. bassiana JEF-232 및 JEF-544 균주의 생육 및 형태

B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주의 생육 및 형태를 확인하기 위하여, Sabraud Dextrose Agar (SDA)에서 7일간 배양 (25℃, dark)한 후 육안 및 광학현미경 (400 배)으로 관찰하였다(도 2).

그 결과, B. bassiana 속의 전형적인 특징인 백색의 균사 및 회백색의 포자(포자형성 방법)가 확인되었다.

<1-3> B. bassiana JEF-232 및 JEF-544 균주 genomic DNA sequencing

B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주의 동정을 위하여 PCR 진행 후 sequencing을 수행하였다.

구체적으로, PCR은 94℃에서 5분 이후, 변성 94℃ 60초, 어닐링 62℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 1cycle로 하여 30cycle 반복한 다음, 최종적으로 72℃에서 3분간 post maturation 시켰다. 그 후, ITS 1-F: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(서열번호 1) 및 ITS 4-R: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(서열번호 2)의 ITS primer를 이용하여 sequencing을 수행하였다. PCR 산물의 전기영동은 0.8% agarose gel을 사용하여 140 V로 25분 진행하였으며, 최종적으로 얻어진 산물을 마크로젠 (http://dna.macrogen.com/kor/)에 sequencing 의뢰하여 각 균주의 genomic DNA를 확인한 결과, 본 발명의 균주는 B. bassiana로 동정되었다(도 3).

추가적으로, 목화진딧물 병원성 확인에 사용한 균주들과 기존에 알려진 Beauveria 및 다른 속 균주들의 유연관계를 확인하고자, 미국 국립생물정보센터에 보고된 2종의 Beauveria 속 균주, 1종의 Isaria 속 균주, 2종의 Metarhizium 속 균주와 1종의 Pochonia 속 균주의 ITS sequence를 이용하여 B. bassiana JEF-232 및 JEF-544의 유연관계를 비교하였다(도 4).

그 결과 대부분의 B. bassiana 균주들과의 유연관계가 비교적 높은 것으로 확인되었으며 Isaria, Metarhizium와 Pochonia 균주들과의 유연관계는 비교적 낮은 것으로 확인되었다.

<실시예 2> B. bassiana JEF-232 및 JEF-544 균주의 목화진딧물에 대한 살충효과 확인 (침지처리-I)

본 발명의 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주로 침지처리된 먹이원에 의하여 목화진딧물에 살충효과가 나타나는지 확인하였다.

구체적으로, 오이 잎에 B. bassiana JEF-232 또는 B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액을 각각 침지처리한 다음, 목화진딧물의 먹이원으로 제공하여 각 균주에 노출시켰으며, 25℃ 조건에서 5일 동안 목화진딧물의 생충수 및 사충수를 조사하였다.

그 결과, 처리 후 2일차부터 B. bassiana JEF-232와 JEF-544 처리구에서 사충이 확인되었다. 처리 6일차에 음성 대조구(배지 처리구)에서 11%의 사충률이 나타난 반면, B. bassiana JEF-232에서 83%의 사충률이, B. bassiana JEF-544에서 60%의 사충률이 확인되었다(도 5a). 또한, B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 처리 후 6일차에 목화진딧물의 mycosis가 관찰되었다(도 5b).

이와 같은 결과를 통하여, 두 균주 모두 먹이원에 침지될 경우 목화진딧물에 대해 살충효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인되었다.

<실시예 3> B. bassiana JEF-232 및 JEF-544 균의 점박이응애에 대한 살충효과 확인 (침지처리-II)

본 발명의 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 균주로 침지처리된 먹이원에 의하여 점박이응애에 살충효과가 나타나는지 확인하였다.

구체적으로, 콩 잎에 B. bassiana JEF-232 또는 B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액을 각각 침지처리한 다음, 점박이응애 성충을 잎으로 옮겨 포자에 노출시켰으며, 25℃ 조건에서 5일 동안 점박이응애의 생충수 및 사충수를 조사하였다. 대조약제 처리구로는 고삼추출물(PROUD 3, BioHumaNetics INC. USA, 고삼추출물 70%)을 1,000배 희석하여 10초간 침지처리하였다.

그 결과, 처리 후 1일차부터 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544 처리구에서 사충이 확인되었다. 또한, 처리 5일차에 B. bassiana JEF-544에서 90%, B. bassiana JEF-232에서 54%의 사충률이 확인되었고, 대조약제 처리구에서는 49%의 사충률이 확인되었다(도 6).

또한, 위와 동일한 방법으로 2차 실험을 진행한 결과, 처리 6일차에 B. bassiana JEF-544에서는 89%의 사충률이, B. bassiana JEF-232에서는 74%의 사충률이 나타난 반면, 대조약제 처리구에서는 43%의 사충률이 확인되었다(도 7a). B. bassiana JEF-544 및 B. bassiana JEF-232 처리 7일차에 mycosis가 나타난 것으로 확인되었으며, 음성 대조구(배지 처리구)에서는 대부분의 개체가 치사하지 않은 것으로 확인되었다(도 7b).

이와 같은 결과를 통하여, 점박이응애에 대한 B. bassiana JEF-232 및 B. bassiana JEF-544의 살충 효과가 우수하며, 이와 같은 효과는 고삼추출물보다도 높을 뿐만 아니라. 점박이응애에 대해 살충효과가 안정적으로 나타남이 확인되었다.

<실시예 4> 목화진딧물에 살충효과가 높은 B. bassiana JEF-232 균주의 특성

<4-1> B. bassiana JEF-232 균주의 잎 정착성

B. bassiana JEF-232 균주의 특성을 확인하기 위하여 B. bassiana JEF-232의 잎 정착성을 확인하였다.

구체적으로, B. bassiana JEF-232와 동종의 다른 균주인 B. bassiana 균주(MJR026)의 포자현탁액을 오이, 토마토, 콩 잎의 앞, 뒷면에 0.02 ml 씩 drop 처리하여 균주가 잎에 정착하는지 확인한 결과, 처리 6일차에 동종의 B. bassiana 균주(MJR026)에 비하여 B. bassiana JEF-232에서 균사 생육이 더욱 많이 진행된 것으로 확인되었다(도 8).

이와 같은 특징은 B. bassiana JEF-232 포자현탁액에 잎을 침지처리한 경우에도 동일하게 관찰되었다. 즉, B. bassiana JEF-232 균주는 침지처리 후 24시간 내에 오이 잎에 정착하여 균사와 포자를 생성하였으며(도 9a), 잎 위에 발생한 B. bassiana JEF-232 균주의 균사와 포자는 목화진딧물의 이동을 어렵게 하고 치사를 유도한 것으로 확인되었다(도 9b). 또한, 잎에 상처나 흡즙흔이 있는 곳에서는 정착이 더욱 많이 발생하는 것으로 확인되었다(도 9c).

목화진딧물은 매우 빠른 속도로 개체수가 늘어나고 이동성이 크다는 점을 고려하면, 목화진딧물의 방제에 잎 정착성이 높은 B. bassiana JEF-232 균주가 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 예상되며, 목화진딧물의 피해가 큰 작물에 처리할 경우, 높은 잎 정착에 따른 효과적인 목화진딧물에 대한 살충 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상된다.

<4-2> B. bassiana JEF-232 균주처리 목화진딧물의 mycosis로 인한 지속적 감염 유도

목화진딧물 감염 시, B. bassiana JEF-232 균주의 mycosis 양상을 다른 동종의 균주와 비교하였다.

구체적으로, B. bassiana JEF-232 균주와 다른 B. bassiana 균주 (MMD058)의 포자현탁액을 오이 잎에 침지처리한 후 목화진딧물에게 노출시켰다.

그 결과, B. bassiana JEF-232 균주가 감염된 목화진딧물에서 mycosis 되는 형태가 다른 동종의 균주보다 빠르게 일어나는 것으로 확인하였다. 처리 7일 후, 다른 B. bassiana 균주 (MMD058)와는 달리(도 10a), B. bassiana JEF-232 균주가 처리된 사충에서는 균사가 충체 전체를 뒤덮는 mycosis가 나타난 것으로 확인되었다(도 10b). 또한 B. bassiana JEF-232 균주 처리 시, 초기에 치사하지 않은 목화진딧물이 이동 과정에서 mycosis된 사충에 접촉하여 추가적인 감염이 발생하는 것으로 확인되었다(도 10c).

이와 같은 결과를 통하여, B. bassiana JEF-232 균주에 의한 목화진딧물 사충의 빠른 mycosis 유도 및 추가적인 감염 유도에 따른 목화진딧물의 지속적인 방제 효과가 확인되었다.

<4-3> B. bassiana JEF-232 균주의 복숭아혹진딧물 살충효과

복숭아혹진딧물에 대한 B. bassiana JEF-232 균주의 우수한 살충효과를 확인하였다.

구체적으로, 복숭아혹진딧물이 있는 배추 잎에 B. bassiana JEF-232 균주의 포자현탁액을 분무처리하고 먹이원으로 제공하였으며, 25℃ 조건에서 5일 동안 복숭아혹진딧물의 생충수와 사충수를 조사하였다.

그 결과, 처리 후 1일차부터 B. bassiana JEF-232 처리구에서 사충이 확인되었다. 또한, 처리 5일차에 B. bassiana JEF-232에서 80% 이상의 사충률이 확인된 반면, UDH017 등 2 종류의 B. bassiana 균주에서는 0-60%의 사충률이 확인되었다(도 11a). 한편, 처리 5일 후, 각 처리구에서 mycosis를 확인한 결과, 동종의 다른 B. bassiana 균주 (UDH017)에 비해 B. bassiana JEF-232에서 mycosis가 빨리 나타난 것으로 확인되었다(도 11b).

이와 같은 결과를 통하여 B. bassiana JEF-232가 목화진딧물 뿐만 아니라 복숭아혹진딧물에도 방제효과가 있으며, 다양한 진딧물류의 방제에 적용될 수 있음이 확인되었다.

<4-4> B. bassiana JEF-232 균주의 포자생산성

본 발명에서는 B. bassiana JEF-232 균주의 대량생산에 중요한 곡물배양과 이를 통한 포자생산성을 확인하였다.

구체적으로, 배양용 polyvinyl bag에 기장 (millet)을 200 g씩 넣은 후, 50% citric acid 0.16 ㎖을 추가로 처리한 다음, Microwave를 이용하여 3분 동안 열처리하여 수분이 충분히 millet에 흡수되도록 하고, Millet이 담긴 polyvinyl bag을 121℃ 조건에서 15 min 간 멸균하였다. 상온에서 냉각 후 Petri-dish (60×15 mm)에 5 g 씩 옮겨담고, B. bassiana JEF-232 포자현탁액 (1×10⁷ conidia/ml)을 0.5 ml 씩 Petri-dish에 접종한 다음, 25℃ 조건에서 14일간 배양하여 B. bassiana JEF-232 입제를 최종 생산하였다(도 12).

포자생산성 확인을 위해 Millet에 14일간 배양된 B. bassiana JEF-232 입제 0.1 g을 1.5 ml tube에 넣었다. 포자 수확을 위해 계면활성제 (0.03% silwet) 1 ml을 넣어준 후 1분간 voltexing 하였다. 최종적으로 수확된 포자를 hemocytometer로 계수하여 확인하였다.

그 결과, 약 4×10⁸ conidia/g의 포자가 생산된 것으로 확인되어, B. bassiana JEF-232 균주는 다른 B. bassiana 균주 (UDH017)에 비해 비교적 높은 포자생산성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 13).

<실시예 5> 점박이응애에 살충효과가 높은 B. bassiana JEF-544 균주의 특성

<5-1> B. bassiana JEF-544 균주의 점박이응애 전체 령기에 대한 살충효과

B. bassiana JEF-544 균주가 점박이응애의 성충 뿐 아니라 알, 약충 등 다른 령기에도 살충효과를 나타내는지 확인하였다.

구체적으로, B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액과 대조약제 처리구(Spiromesifen 액상수화제(Spiromesifen 20% SC, 팜한농), 2,000배 희석), 음성 대조구(배지 처리구)을 잎에 침지처리한 후 점박이응애의 알, 성충을 잎으로 옮겨 포자에 노출하였으며, 25℃ 조건에서 매일 부화한 알의 수, 성충 및 약충의 사충수를 확인하였다.

그 결과, 처리 5일차 음성 대조구에서 18% 사충률 및 대조약제 처리구에서 75%의 사충률이 나타난 반면, B. bassiana JEF-544에서 87%의 사충률이 나타난 것으로 확인되었다(도 14a). 또한 처리 5일차 사충 확인 결과, 대조약제 처리구과는 달리 B. bassiana JEF-544 처리구에서는 mycosis 생성에 따른 2차 감염 가능성이 확인되었다(도 14b).

이와 같은 결과를 통하여, B. bassiana JEF-544는 성충 뿐만 아니라 약충에게도 살충효과를 나타낼 수 있어, 점박이응애 전체 령기에 작용할 수 있음이 확인되었다.

<5-2> B. bassiana JEF-544 균주의 점박이응애 산란 억제

B. bassiana JEF-544 균주의 산란 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액과 대조약제 처리구(Spiromesifen 액상수화제), 음성 대조구(배지 처리구)을 잎에 침지처리한 후 점박이응애 성충을 잎으로 옮겨 포자에 노출하였으며, 25℃ 조건에서 매일 성충의 산란 수를 확인하였다.

그 결과, 처리 9일차 JEF-544 처리구에서 1.2개의 알 수가 확인된 반면, 대조약제 처리구에서 3-9개, 음성 대조구에서 16-38개의 알 수가 확인되어(도 15), B. bassiana JEF-544의 점박이응애 산란 수 감소 효과가 확인되었다.

<5-3> B. bassiana JEF-544 균주의 점박이응애 알에 대한 살충효과

점박이응애 알에 대한 B. bassiana JEF-544 균주의 살충효과를 확인하였다.

구체적으로, B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액과 대조약제 처리구(Spiromesifen 액상수화제), 음성 대조구(배지 처리구)을 잎에 침지처리한 후, 점박이응애 알과 성충을 잎으로 옮겨 포자에 노출하였으며, 25℃ 조건에서 매일 알을 확인하였다.

그 결과, 처리 5일차, 음성 대조구에서는 아무런 변화도 나타나지 않은 반면(도 16a), 대조약제인 Spiromesifen 액상수화제 처리구에서는 알 색이 짙게 변화된 것으로 확인되었다(도 16b). 한편, B. bassiana JEF-544 처리구에서는 알의 표면에 mycosis가 나타났으며(도 16c), 처리 7일차에는 알이 찌그러져 모양이 변형된 것으로 확인되었다(도 16d).

이와 같은 결과를 통하여, B. bassiana JEF-544 균주는 점박이응애의 알에 대해서도 살충효과가 있으며, B. bassiana JEF-544가 감염된 알의 mycosis로 인해 추가적인 감염이 발생할 수 있음이 확인되었다.

<5-4> B. bassiana JEF-544 균주의 잎 피해율 감소효과

B. bassiana JEF-544 균주를 처리한 잎에서 점박이응애의 흡즙으로 인한 피해 감소효과를 확인하였다.

구체적으로, B. bassiana JEF-544 균주의 포자현탁액과 대조약제 처리구(Spiromesifen 액상수화제), 음성 대조구(배지 처리구)을 잎에 침지처리한 후 점박이응애 성충을 잎으로 옮겨 포자에 노출하였으며, 25℃ 조건에서 매일 잎의 피해율을 확인하였다.

그 결과, 음성 대조구(무처리군, 도 17a), 대조약제 처리구(Spiromesifen 액상수화제 처리군, 도 17b) 대비 B. bassiana JEF-544 처리한 잎(도 17c)에서 점박이응애 피해면적이 적은 것으로 확인되었다.

<5-5> B. bassiana JEF-544 균주의 포자생산성 및 열안정성

B. bassiana JEF-544 균주의 포자를 대량 생산하기 위한 곡물 배지의 사용시 및 곡물 배지를 사용하여 제작된 입제의 현장 적용시 중요한 포자생산성과 열안정성을 확인하였다.

구체적으로, 배양용 polyvinyl bag에 조 (foxtail millet)를 200 g씩 넣은 후, 50% citric acid 0.16 ㎖을 추가로 처리하고, Microwave를 이용하여 3분 동안 열처리하여 수분이 충분히 foxtail millet에 흡수되도록한 다음, Millet이 담긴 polyvinyl bag을 121℃ 조건에서 15 min 간 멸균하였다. 그 후, 상온에서 냉각 후 Petri-dish (60×15 mm)에 5 g씩 옮겨담고, bassiana JEF-544 포자현탁액 (1×10⁷ conidia/ml)을 0.5 ml 씩 Petri-dish에 접종한 다음, 25℃ 조건에서 14일간 배양하여 B. bassiana JEF-544 포자를 최종 생산하였다(도 18).

Foxtail millet을 이용하여 제작한 입제의 포자생산성을 확인하기 위하여, 14일간 배양된 JEF-544 입제 0.1 g을 1.5 ml tube에 넣고, 포자 수확을 위해 계면활성제 (0.03% silwet) 1 ml을 넣어준 후 1분간 voltexing한 다음, 수확된 포자를 hemocytometer로 계수하여 확인하였다.

그 결과, 약 3×10⁸ conidia/g의 포자가 생산된 것으로 확인되어, 다른 B. bassiana 균주 (MJR026) 대비 높은 포자생산성이 확인되었다(도 19).

한편, 열 안정성 확인을 위해, 14일간 배양된 JEF-544 입제 0.1 g을 1.5 ml tube에 넣고, 포자 수확을 위해 계면활성제 (0.03% silwet) 1 ml을 넣어준 후 1분간 voltexing 하여 포자현탁액을 확보하였다. 포자현탁액을 45℃ incubator에서 열처리 0, 30, 60, 90, 120분 진행하고, 열처리된 포자현탁액을 5 ㎕씩 1/4 SDA배지에서 drop 후, 25℃ 배양기에 배양한 다음, 18시간 후 포자의 발아율을 조사하였다.

그 결과, 45℃에서 60분 열처리 조건에서 JEF-544 균주의 발아율이 86±3%로 확인되어, 다른 균주와의 열안정성 대비 높은 열안정성이 확인되었다(도 20).

B. bassiana JEF-232

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국내)

수탁번호 : KFCC11888P

수탁일자 : 2021616

B. bassiana JEF-544

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국내)

수탁번호 : KFCC11889P

수탁일자 : 2021616

<110> Chonbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation FarmHannong <120> Composition for controlling sucking pests comprising Beauveria JEF-232 or Beauveria JEF-544 strain <130> DHP21-537 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 1-Forward primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 4-Reverse primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

보베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주, 상기 균주의 포자 또는 상기 균주의 배양액를 포함하는 흡즙성 해충 방제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 보베리아 바시아나는 보베리아 바시아나 JEF-232(KFCC11888P) 또는 보베리아 바시아나 JEF-544(KFCC11889P)인 것인 흡즙성 해충 방제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 흡즙성 해충은 목화진딧물, 복숭아혹진딧물 및 점박이응애로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 해충인 것인 흡즙성 해충 방제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 액상제형, 분말제형 및 입상제형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것인 흡즙성 해충 방제용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 보베리아 바시아나 균주는 기장, 백미, 밀기울, 조, 수수 및 이들의 조합으로부터 선택된 어느 하나의 고체 배양 배지에서 배양된 것인 흡즙성 해충 방제용 조성물.
제 1항의 조성물을 해충, 이의 서식지, 해충으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 토양에 처리하여, 흡즙성 해충을 방제하는 방법.