KR20230093606A - 3d 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 이의 제조방법 - Google Patents

3d 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 예는 아민기를 가지는 세포외기질 및 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산를 포함하는 하이브리드 잉크로서, 상기 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에 형성된 화학적 결합에 의해 세포외기질 및 변성 히알루론산은 가교결합 상태에 있는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크를 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 하이브리드 잉크는 구성성분인 세포외기질 및 변성 히알루론산 사이의 화학적 가교결합에 의해 3D 프린팅에 적합한 기계적 물성을 가지며, 화화적 가교결합 밀도 조절을 통해 약물 방출 속도를 제어할 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제작된, 서로 다른 성장인자가 시공간적으로 구획화된 다층 구조의 패치는 서로 다른 성장인자가 순차적으로 서방출되기 때문에 약물전달 시스템, 혈관신생 촉진 또는 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는데에도 사용될 수 있다.

Description

3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 이의 제조방법{Extracellular matrix-based hybrid ink and mufacturing method of the same}
본 발명은 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 내부 구성성분들간의 화학적 결합에 의해 가교결합 밀도가 조절되어, 3D 프린팅에 적합한 기계적 물성을 갖고 약물 방출 속도를 제어할 수 있는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
대뇌 허혈은 뇌로의 불충분한 혈류가 뇌 저산소증 및 뇌 조직의 죽음을 야기할 때 발생한다. 그 심각성 때문에, 대뇌 허혈은 전 세계적으로 가장 빈번한 사망 원인 중 하나로 알려져 있다. 허혈성 뇌 조직 치료를 위해서는 필수적으로 혈관신생 성장인자의 지속적인 공급을 통해, 새로 형성된 혈관의 개통성을 유지하고 기존 혈관에서 모세혈관이 새롭게 뻗어나가며 새로운 혈관을 생성하는 혈관 신생을 유도하는 과정이 필요하다. 혈관신생 과정은 적시에 필수적인 다양한 혈관신생 성장인자를 포함하는 복잡한 다단계 과정으로, 세포 침투 및 대사 유지에 필요한 산소와 영양소를 지속적으로 공급하는 역할을 한다. 혈관신생을 촉진하기 위해 혈관신생 인자를 전달하는 치료 방법은 심각한 허혈성 질환의 치료를 위한 유망한 전략으로 부상하고 있다.
치료적 혈관신생의 초기 단계 및 성숙 단계를 촉진하는 혈관신생 인자는 잘 알려져 있다. 그리고 각 단계에 작용하는 혈관신생 인자들을 함께 투여하는 것도 또한 혈관 재생 촉진에 유익한 방법으로 인식되고 있다. 특히, 혈관내피성장인자(VEGF)는 혈관 생성의 초기 단계를 촉진하는 중요한 인자 중 하나로, 내피세포를 증식시켜 미성숙한 혈관이 생성될 수 있도록 유도한다. 그러나, VEGF의 부작용인, 혈관 투과성 증가와 같은 염증촉진반응으로 인해 VEGF의 임상 사용에 대한 우려가 제기되었다. 간세포성장인자(HGF)는 혈관신생의 성숙 단계를 촉진하는 또다른 중요한 혈관신생 인자 중 하나로, VEGF의 부작용을 감소시키고 혈관내피세포의 생장을 촉진하는 등 VEGF와 함께 적용되었을 때 상승작용을 일으킨다. 따라서, 이 두가지 혈관신생 인자의 순차적인 방출 과정은 더욱 강력한 혈관신생 반응을 유도하며, 혈관 퇴행이나 혈액 누수를 방지한다. 따라서, 혈관신생 과정을 모사하는 이러한 다중 혈관신생 인자의 지속적인 투여는 허혈 부위의 혈관 신생 과정에서 필수적이다.
그러나 정맥 주사와 같은 전통적인 성장인자 투여 방법은 치료 효과를 자극하기 위해 고용량 투여 또는 반복 전달이 필요한 경우가 많으며 그 결과 효능이 감소하고 심각한 부작용이 발생한다. 이를 해결하기 위해서는 이러한 인자들이 생리학적으로 적절한 시간(시간 조절)과 적절한 부위(부위별) 표적 방식으로 투여되어야 한다. 따라서, 혈관신생 인자의 방출 양상을 조절할 수 있고, 연약한 뇌 영역에 국소적으로 적용할 수 있는, 부드럽고 유연한 하이드로겔 패치형 약물 전달 시스템의 개발이 필요하다. 이러한 패치를 제작하기 위해서 3D 프린팅 기술을 사용할 수 있다. 3D 프린팅 기술 및 다양한 유형의 생체 재료 사용을 통해, 제어 가능하고 사용자 정의 가능한 패치 유형 전달 시스템을 자유자재로 제작할 수 있다. 혈관신생 인자의 방출 양상 조절은, 3D 프린팅 변수(예: 시스템의 치수 및 디자인)들을 조절하거나, 재료 특성(예: 합성 및 천연 유래 생체 재료, 가교 밀도 및 농도)의 조절들을 통하여 구현될 수 있다. 생체 재료의 경우 조직의 특성과 인쇄능을 가지는 세포외기질(ECM) 기반 하이드로겔이 실행 가능한 옵션으로 제안되었다.
최근 연구에 따르면 약물전달을 위한 재료로서 혈관 조직 유래 탈세포화된 세포외기질(VdECM)의 사용 가능성이 보고되었으나, VdECM만으로는 인쇄능이 떨어지기 때문에 프린팅 가능한 생체재료 잉크로는 사용이 어렵다는 단점이 있다(G. Gao, J. Y. Park, B. S. Kim, J. Jang, D. W. Cho, Advanced healthcare materials 2018, 7, 1801102.).
3D 프린팅용 세포외기질 기반 바이오잉크와 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-1954953호에는 (a) 세포 배양액, 히알루론산, 젤라틴, 피브리노겐 및 글리세롤이 포함된 온도감응성 하이드로젤(hydrogel)을 제조하는 단계; (b) 체외로 적출된 조직을 탈세포화하고 0.05 내지 100㎛ 입자 크기로 분말화하여 탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix, dECM) 분말을 제조하는 단계; (c) 단계 (a)에서 얻어진 온도감응성 하이드로젤을 30 내지 40℃에서 졸(sol)화 하는 단계; (d) 단계 (c)의 졸(sol) 상태의 온도감응성 하이드로젤에 단계 (b)에서 얻어진 탈세포화된 세포외기질 분말을 교반을 통해 혼합하여 탈세포화된 세포외기질 기반 바이오 잉크를 제조하는 단계; (e) 단계 (d)에서 제조한 탈세포화된 세포외기질 기반 바이오 잉크 및 목적하는 조직 유래 세포를 혼합하여 3D 바이오 프린터용 카트리지(cartridge)에 주입하는 단계; (f) 단계 (e)의 3D 바이오 프린터용 카트리지를 3 내지 6℃에서 8 내지 15분간 유지하여 카트리지 내 세포 및 탈세포화된 세포외기질 기반 바이오 잉크의 온도에 따른 겔(gel)화를 유도하는 단계; (g) 단계 (f)의 겔화가 유도된 세포 및 탈세포화된 세포외기질 기반 바이오 잉크가 포함된 3D 바이오 프린터용 카트리지를 이용하여 목적하는 인공 조직을 3D 바이오 프린팅하는 단계; 및 (h) 단계 (g)에서 3D 바이오 프린팅된 목적하는 인공 조직에 트롬빈 용액(thrombin solution)을 처리하고, 20 내지 25℃에서 25 내지 35분간 유지하여 트롬빈 및 피브리노겐의 효소적 중합반응에 따른 겔화를 유도하는 단계;를 포함하는 인공 조직 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-2302770호에는 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하고, 상기 미세입자화된 인체 조직 유래 성분의 입경은 10 내지 1000 um인 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물이 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 3D 프린팅에 적합한 기계적 물성을 갖고 약물 방출 속도를 제어할 수 있는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 이의 제조방법을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 생체재료 기반 약물전달 패치 및 이의 제조방법을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관신생을 촉진하거나 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는데에 사용될 수 있는 생체재료 기반 패치를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자는 세포외기질의 아민기와 메타크릴레이트화된 히알루론산의 메타크릴레이트기를 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 통해 화학적으로 결합시켜 3D 프린팅에 적합한 기계적 물성을 갖고 약물 방출 속도를 제어할 수 있는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크를 개발하였다. 또한, 본 발명의 발명자는 상기 세포외기질 기반 하이브리드 잉크에 대뇌의 혈관신생을 촉진할 수 있는 혈관신생 성장인자를 첨가한 후 3D 프린팅하여, 혈관신생 성장 인자들이 공간적으로 구획화되고 혈관신생 성장 인자들이 순차적으로 방출되는 하이드로겔 패치를 제작하였다. 본 발명의 발명자는 2종류의 혈관신생 성장인자가 시공간적으로 구획된 패치를 뇌에 이식한 후 광음향 현미경을 통해 모니터링한 결과 혈관신생을 효과적으로 촉진시킨다는 점을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 아민기를 가지는 세포외기질 및 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산를 포함하는 하이브리드 잉크로서, 상기 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에 형성된 화학적 결합에 의해 세포외기질 및 변성 히알루론산은 가교결합 상태에 있는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 pH가 6.5~7.5인 세포외기질 용액을 준비하는 단계; 및 상기 세포외기질 용액에 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산을 첨가하고 균일하게 혼합시킨 후 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 진행시켜 세포외기질 및 변성 히알루론산이 가교결합 상태에 있는 잉크 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 내부 코어층과 상기 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 포함하는 다층 구조의 패치로서, 상기 내부 코어층과 외부층은 세포외기질 기반 하이브리드 잉크로 이루어지고, 상기 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 성장인자를 포함하고, 상기 하이브리드 잉크를 구성하는 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하고, 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크는 서로 다른 화학적 가교결합 밀도를 가지며 서로 다른 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료 기반 약물전달 패치를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 제1 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하는 제1 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 제1 성장인자와 다른 제2 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며 제1 하이브리드 잉크와 화학적 가교결합 밀도가 다른 제2 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 상기 제2 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 형성하는 단계; 및 상기 제1 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 형성하고 다층 구조물을 수득하는 단계를 포함하는 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 내부 코어층과 상기 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 포함하는 다층 구조의 패치로서, 상기 외부층은 세포외기질 기반 제1 하이브리드 잉크로 이루어지고 내부 코어층은 세포외기질 기반 제2 하이브리드 잉크로 이루어지고, 상기 제1 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자를 포함하고, 상기 제2 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자를 포함하고, 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 구성하는 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며, 상기 제2 하이브리드 잉크는 제1 하이브리드 잉크보다 화학적 가교결합 밀도가 큰 것을 특징으로 하는 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하는 제1 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며 제1 하이브리드 잉크보다 화학적 가교결합 밀도가 큰 제2 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 상기 제2 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 형성하는 단계; 및 상기 제1 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 형성하고 다층 구조물을 수득하는 단계를 포함하는 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 제조방법을 제공한다.
상기 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치는 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는데에도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 하이브리드 잉크는 구성성분인 세포외기질 및 변성 히알루론산 사이의 화학적 가교결합에 의해 3D 프린팅에 적합한 기계적 물성을 가지며, 화화적 가교결합 밀도 조절을 통해 약물 방출 속도를 제어할 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제작된, 서로 다른 성장인자가 시공간적으로 구획화된 다층 구조의 패치는 서로 다른 성장인자가 순차적으로 서방출되기 때문에 약물전달 시스템, 혈관신생 촉진 또는 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는데에도 사용될 수 있다.
도 1은 본 연구에서 화학적 가교결합 및 열적 가교결합과 같이 이중 가교결합 메커니즘을 이용하여 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)으로부터 하이드리드 잉크(HAVEM 잉크)를 제조하는 개략적인 과정을 나타낸 것이고, 도 2는 본 연구에서 서로 다른 가교결합 밀도를 가진 하이브리드 잉크 각각에 뇌혈관 신생 유도 성장인자인 VEGF와 HGF를 첨가하고 3D 프린팅 공정을 이용하여 뇌혈관 신생 유도(Spatiotemporal compartmentalized cerebral angiogenesis inducing, SCAI) 패치를 제조하는 개략적인 과정과, SCAI 패치에서 VEGF와 HGF가 순차적으로 방출되는 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 통해 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)으로부터 HAVEM 잉크를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA) 사이의 가교결합 발생을 증명하기 위해 VdECM 잉크(4V0H), HAMA 및 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 핵자기공명(NMR)으로 측정한 스펙트럼이다.
도 5의 위 사진은 화학적 가교결합 밀도의 차이에 따른 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 솔(sol) 상태 이미지이고, 도 5의 아래 그래프는 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 점도를 4℃의 인쇄 조건 및 다양한 전단속도에서 측정한 결과이다.
도 6은 4℃의 온도에서 37℃까지의 온도 변화에 따른 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 탄성률 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 37℃의 온도에서 진동수 변화에 따른 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 저장 탄성률과 손실 탄성률을 나타낸 것이다.
도 8은 HAVEM 잉크(4V0.5H) 및 HAVEM 잉크(4V1H)에 캡슐화된 HGF의 방출 프로파일을 7일 동안 측정한 결과이다.
도 9는 본 연구에서 3D 프린팅 기술을 이용하여 SCAI 패치를 제작하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10은 튜브 형성 어세이(Tube formation assay)에 의해 다양한 혈관신생 인자의 혈관신생 효과를 측정한 결과이다.
도 11은 본 연구에서 제작한 SCAI 패치의 단면 구조와 각 단면을 공초첨 현미경으로 촬영한 이미지이다(scale bars : 200㎛).
도 12는 HAVEM 잉크의 다양한 조합으로 제작한 SCAI 패치들의 설계구조 및 각 패치들의 인쇄, 겔화 및 유리화 단계에서의 이미지이다.
도 13은 본 연구에서 제작한 유리화 과정을 거친 SCAI 패치의 인장강도 측정 결과 및 팽창비(Swelling ratio)를 나타낸 것이다.
도 14는 본 연구에서 제작한 다양한 유리화 된 패치의 SEM 촬영 이미지이다(scale bars : 1㎛). 도 14에서 "4VOH"는 VdECM 잉크(4VOH)로 이루어진 유리화 된 패치를 나타내고, "4V0.5H"는 HAVEM 잉크(4V0.5H)로 이루어진 유리화 된 패치를 나타내고, "4V1H"는 HAVEM 잉크(4V1H)로 이루어진 유리화 된 패치를 나타낸다.
도 15는 VEGF 및 HGF의 순차적인 약물 서방출을 위해 본 연구에서 설계된 다층 SCAI 패치의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 16은 VEGF 및 HGF의 순차적인 약물 서방출을 위해 본 연구에서 설계된 2종의 다층 SCAI 패치 각각에 대해 VEGF 및 HGF의 누적 방출 프로파일을 1개월 동안 평가한 결과이다.
도 17은 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치를 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 적용하여 배양하였을 때의 In vitro 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치를 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 적용하여 배양하였을 때의 세포 생존능을 live/dead 분석 키트로 분석한 결과이다(scale bars: 50㎛).
도 19는 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치를 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 적용하여 배양하였을 때의 혈관신생 관련 유전자 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 20은 본 연구에서 제작된 VEGF 및 HGF가 시공간적으로 구획화된 SCAI 패치를 SD 쥐의 대뇌 피질에 이식한 후 OR-PAM 시스템을 사용하여 이식된 부위를 모니터링하는 과정으로 이루어진 In vivo 실험을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 21은 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 시간 경과에 따른 SCAI 패치의 변화를 추적하기 위해 패치가 이식된 부위의 횡단면을 광음향(PA) B-모드로 촬영한 이미지이다(scale bars: 200㎛).
도 22는 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 SCAI 패치 처리 여부에 따른 SD 쥐의 뇌 혈관 구조 변화를 광음향(PA) 최대 진폭 투영(MAP) 이미지로 나타낸 것이고, 도 23은 도 22에서 SCAI 패치가 적용된 쥐의 이미지에서 흰색 점선으로 표시된 영역 C1 및 C2에 대한 단면 PA B-모드 이미지이다(scale bars: 400㎛). 도 23의 확대된 이미지(scale bars: 1㎜)에서 큰 혈관은 노란색 점선으로 강조 표시되었다.
도 24는 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 광학 해상도 광음향 현미경(OR-PAM) 이미지를 이용하여 SCAI 패치 처리 여부에 따른 SD 쥐의 혈관 밀도를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 25는 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 SCAI 패치 이식 14일 후에 패치 미처리 그룹과 SCAI 패치 이식 그룹에 대한 조직학적 분석 결과를 H&E 염색 이미지와 면역조직화학(IHC) 이미지(CD 31)로 나타낸 것이다(scale bars: 50㎛).
도 26은 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 SCAI 패치 이식 14일 후에 면역조직화학(IHC) 이미지를 이용하여 패치 미처리 그룹과 SCAI 패치 이식 그룹의 단위 면적당 혈관 수를 정량적으로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '바이오잉크(bioink)'는 3-D 프린팅이 가능한 세포 적합성(cell compatible) 재료로 정의된다. 바이오잉크는 0 내지 37℃에서 바늘을 통해 압출될 수 있고, 그 후에는 겔화되거나 고화될(solidified) 수 있다. 바이오잉크는 잉크젯, 레이저 보조(laser-assisted), 또는 마이크로밸브 3-D 프린팅 장비에 적합하도록 제제(formulate)될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '세포외기질(Extracellular matrix, ECM)'은 동물세포에 구조적인 지지를 통상 제공함과 동시에, 다른 다양한 중요한 기능을 수행하는 동물 조직의 세포외 부분이다. 세포외기질은 동물에 있어서 결합 조직을 규정하는 특징으로서, 콜라겐(Collagen), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 등을 포함하는 다양한 형태의 단백질로 이루어져 있다. 이러한 세포외기질은 돼지, 소와 같은 동물의 조직일 수 있고 다양한 기관으로부터 추출이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '생체고분자'는 생물의 몸 안에서 합성되어 생기는 고분자 화합물의 총칭으로서, 단백질, 핵산, 다당류 등이 대표적인 예이고, 구체적인 물질로는 히알루론산, 콜라겐 등이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '가교결합 밀도(Crosslinking density)'는 가교결합 고분자에서 전체 구조 단위의 수 중 가교하고 있는 구조 단위(가교점)의 수의 비율로 정의된다. 가교결합 밀도에 의해 가교결합 고분자 겔의 물성, 예를 들면 팽윤도, 탄성 등이 뚜렷하게 바뀌게 된다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '성장인자(Growth factor)'는 세포 또는 생물의 성장과 분화 조절에 관여하는 단백질로서, 세포 표면에 존재하는 특이적 수용체에 결합하여 세포 내부로 신호를 전달하는 신호전달 물질로서 작용을 하며, 세포의 분화, 재생, 치유 등의 다양한 세포 생리 현상을 조절한다. 성장인자의 구체적인 예로는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 상피성장인자(epithermal growth factor, EGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin, EPO), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 뇌유래신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF) 인터루킨(interleukin, IL), 콜로니형성자극인자(colony-stimulating factor, CSF), 안지오포이에틴(angiopoietin, ANG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 태반성장인자(placental growth factor, PGF), 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α, TGF-α), 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 뼈형성단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP) 등이 있다.
본 발명의 일 측면은 3D 프린팅에 적합한 기계적 물성을 갖고 약물 방출 속도를 제어할 수 있는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 하이브리드 잉크는 세포 적합성(cell compatible) 재료인 생체재료를 기반으로 하기 때문에 바이오잉크 또는 생체재료 잉크로 분류될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 하이브리드 잉크는 구성성분이 균일하게 혼합되어 있는 조성물 형태이고, 3D 프린팅에 필요한 적절한 유동성을 갖기 위해 졸(sol) 상태 또는 졸(sol)과 하이드로겔(hydrogel)의 중간 상태로 존재한다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질 및 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산를 포함한다.
상기 세포외기질은 바람직하게는 하이브리드 잉크의 사용 목적에 따라 다양한 기관 조직으로부터 유래할 수 있으며, 후술하는 혈관신생 촉진용 패치 등의 제조 목적을 고려할 때 바람직하게는 혈관 조직에서 유래한다. 또한, 상기 세포외기질은 생체 이식 용도 등을 고려할 때 탈세포화 세포외기질인 것이 바람직하다. 탈세포화 과정에 의해 면역반응을 유도하는 항원으로서 작용할 수 있는 세포를 제거함으로써 동종이식 (allograft) 또는 이종이식 (xenograft)시 면역반응을 최소화화는 효과가 있다. 조직에 따라 세포의 종류와 수, 조직 자체의 물리적 특성이 다르기 때문에 산, 염기, 저장액, 고장액, 세제 등 다양한 화학물질을 이용하여 탈세포화가 이루어진다. 또한, 상기 세포화기질은 탈세포화 과정만을 거쳐 조직 자체의 구조를 유지한 채로 사용하기도 하지만, 동결건조와 분쇄과정을 거쳐 산성 용액에 녹이거나, 이를 다시 중화과정을 거쳐 졸(sol) 상태의 용액으로 만들어 사용하기도 한다.
상기 변성 히알루론산에 도입된 에틸렌성 불포화 결합 관능기는 세포외기질에 존재하는 아민기와 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 비닐기, 알릴기, 아크릴기, 메타크릴기 등에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크에서 상기 변성 히알루론산은 생체 적합성, 아민기와의 반응성 등을 고려할 때 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid) 또는 아크릴레이트화된 히알루론산(Acrylated hyaluronic acid)에서 선택될 수 있다. 상기 메타클릴에이트화된 히알루론산은 하기의 화학식 1로 표시되는 화학 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크에서 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에는 화학적 결합이 형성되고, 이로 인해 하이드리드 잉크의 구성성분인 세포외기질 및 변성 히알루론산은 가교결합 상태에 있게 된다. 상기 세포외기질에 존재하는 아민기와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이의 화학적 결합은 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)에 의해 형성된다. 상기 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)은 N-친핵체(N-nucleophiles)와 활성화된 알켄 등과 같은 친전자체(electrophiles)를 포함하는 친핵성 접합체 첨가 반응으로서, 본 발명에서는 세포외기질에 존재하는 아민기가 N-친핵체(N-nucleophiles)로 작용하고, 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 친전자체(electrophiles)로 작용한다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 세포외기질 대 변성 히알루론산의 중량비는 하이브리드 잉크의 기계적 물성, 인쇄성 또는 약물 방출 제어와 관련된 인자인 화화적 가교결합 밀도를 고려할 때 1:0.01 내지 1:0.8인 것이 바람직하고, 1:0.05 내지 1:0.5인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 하이브리드 잉크 내의 세포외기질 농도는 하이브리드 잉크의 기계적 물성, 인쇄성 또는 약물 방출 제어 등을 고려할 때 1~10%(w/v)인 것이 바람직하고 2~8%(w/v)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 하이브리드 잉크 내의 변성 히알루론산 농도는 하이브리드 잉크의 기계적 물성, 인쇄성 또는 약물 방출 제어 등을 고려할 때 0.01~8%(w/v)인 것이 바람직하고 0.1~4 %(w/v)인 것이 더 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크는 후술하는 약물전달 패치, 혈관신생 촉진용 패치 등의 제조를 위해 바람직하게는 성장인자(Growth factor)를 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자(Growth factor)는 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제조한 약물전달 패치 등의 구체적인 용도에 따라 공지의 다양한 성장인자에서 선택될 수 있고, 예를 들어 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 상피성장인자(epithermal growth factor, EGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin, EPO), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 뇌유래신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF) 인터루킨(interleukin, IL), 콜로니형성자극인자(colony-stimulating factor, CSF), 안지오포이에틴(angiopoietin, ANG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 태반성장인자(placental growth factor, PGF), 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α, TGF-α), 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 및 뼈형성단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성될 수 있다. 상기 하이브리드 잉크 내의 성장인자 농도는 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제조한 약물전달 패치 등의 구체적인 용도에 따라 다양한 범위에서 선택될 수 있고, 예를 들어 0.001~1 g/ℓ일 수 있고, 약물 전달 효과 등을 고려할 때 0.01~0.5 g/ℓ인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법은 pH가 6.5~7.5인 세포외기질 용액을 준비하는 단계; 및 상기 세포외기질 용액에 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산을 첨가하고 균일하게 혼합시킨 후 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 진행시켜 세포외기질 및 변성 히알루론산이 가교결합 상태에 있는 잉크를 수득하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법은 잉크에 의해 성형된 패치를 약물전달 시스템이나 질환 치료제 용도로 사용하기 위해 바람직하게는 상기 잉크에 성장인자(Growth factor)를 첨가하고 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법에서 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산, 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction), 성장인자(Growth factor) 등의 기술적 특징은 전술한 내용을 참조하며, 구체적인 설명을 생략한다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법에서, pH가 6.5~7.5인 세포외기질 용액을 준비하는 단계는 아민기를 가지는 세포외기질을 물(water) 에 분산시킨 후 pH를 조절하는 것으로 구성되거나 아민기를 가지는 세포외기질을 산 용액에 용해시고 염기로 중화시키는 것으로 구성된다. 상기 세포외기질을 용해시키기 위해 사용되는 산 용액은 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 생체 이식 용도 등을 고려할 때 약산 용액인 것이 바람직하다. 상기 약산은 아세트산, 구연산, 뷰티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 사과산, 호박산 등에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 세포외기질 용액의 pH는 잉크를 구성하는 성분들에 대한 부정적 영향을 최소화하고 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 원활히 유도하는 관점에서 중성에 가까운 것이 바람직하고 예를 들어 6.8~7.4에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법에서 세포외기질 및 변성 히알루론산은 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)이 진행된 후 가교결합 상태로 존재하게 되는데, 이는 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)에 의해 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에 화학적 결합이 형성되기 때문이다. 상기 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)은 세포외기질 및 변성 히알루론산에 대한 부정적 영향을 최소화하고 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 원활히 유도하는 관점에서 1~10℃, 바람직하게는 2~8℃의 온도 조건에서 2~24 hr, 바람직하게는 6~18 hr 동안 진행된다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법에서 세포외기질 용액에 첨가되는 변성 히알루론산의 첨가량은 크게 제한되지 않으나, 하이브리드 잉크의 기계적 물성, 인쇄성 또는 약물 방출 제어 등을 고려할 때 세포외기질 100 중량부 대비 1~80 중량부의 양인 것이 바람직하고 세포외기질 100 중량부 대비 5~50 중량부의 양인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 세포외기질 용액 내의 세포외기질 농도는 하이브리드 잉크의 기계적 물성, 인쇄성 또는 약물 방출 제어 등을 고려할 때 1~10%(w/v)인 것이 바람직하고 2~8%(w/v)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 변성 히알루론산은 세포외기질 용액에 0.01~8%(w/v)의 농도가 되게 첨가되는 것이 바람직하고, 0.1~4%(w/v)의 농도가 되게 첨가되는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법에서 상기 잉크에 첨가되는 성장인자의 첨가량은 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제조한 약물전달 패치 등의 구체적인 용도에 따라 다양한 범위에서 선택될 수 있고, 예를 들어 성장인자는 잉크에 0.001~1 g/ℓ의 농도가 되게 첨가될 수 있고, 약물 전달 효과 등을 고려할 때 0.01~0.5 g/ℓ의 농도가 되게 첨가될 수도 있다.
본 발명의 일 측면은 서로 다른 약물을 순차적으로 서방출하기 위해 약물이 시공간적으로 구획화된 다층 구조의 생체재료료 기반 약물전달 패치 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 다른 생체재료료 기반 약물전달 패치 및 이의 제조방법에서, 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산, 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction), 성장인자(Growth factor) 등의 기술적 특징은 전술한 내용을 참조하며, 구체적인 설명을 생략한다.
본 발명의 일 예에 따른 생체개료 기반 약물전달 패치는 전술한 세포외기질 기반 하이브리드 잉크를 소정의 설계 구조에 맞게 3D 프린팅하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치는 내부 코어층과 상기 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 포함하는 다층 구조의 패치로서, 상기 내부 코어층과 외부층은 세포외기질 기반 하이브리드 잉크로 이루어진다. 또한, 상기 생체재료 기반 약물전달 패치는 하이드로겔 상태 또는 유리화(vitrification)된 겔 상태에 해당하는 유변학적 특성을 보인다.
본 발명의 일 예에 따른 생체개료 기반 약물전달 패치에서 상기 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 성장인자를 포함한다. 상기 변성 생체고분자는 바람직하게는 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 콜라겐 등에서 선택될 수 있다. 상기 변성 생체고분자에 도입된 에틸렌성 불포화 결합 관능기는 세포외기질에 존재하는 아민기와 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 비닐기, 알릴기, 아크릴기, 메타크릴기 등에서 선택될 수 있다. 상기 변성 히알루론산은 생체 적합성, 아민기와의 반응성 등을 고려할 때 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid) 또는 아크릴레이트화된 히알루론산(Acrylated hyaluronic acid)에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 변성 콜라겐은 생체 적합성, 아민기와의 반응성 등을 고려할 때 메타크릴레이트화된 콜라겐(Methacrylated collagen) 또는 아크릴레이트화된 콜라겐(Acrylated collagen)에서 선택될 수 있다. 상기 메타크릴레이트화된 콜라겐(Methacrylated collagen)은 콜라겐에 존재하는 아민기에 메타크릴기가 펩티드 결합을 통해 연결된 변성 콜라겐이고, 아크릴레이트화된 콜라겐(Acrylated collagen)은 콜라겐에 존재하는 아민기에 아크릴기가 펩티드 결합을 통해 연결된 변성 콜라겐이다. 상기 메타크릴레이트화된 콜라겐(Methacrylated collagen) 또는 아크릴레이트화된 콜라겐(Acrylated collagen)의 구조 및 제조방법은 공지된 다양한 문헌(예를 들어 미국등록특허공보 제8658711호; He Liang et al., Journal of Materials Chemistry B, 2018, 6, 3703-3715 등)에 개시되어 있다. 상기 하이브리드 잉크를 구성하는 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재한다. 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자의 화화적 가교결합은 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)에 의해 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에 형성된 화학적 결합에서 비롯된다.
또한, 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크는 서로 다른 화학적 가교결합 밀도를 가지며, 약물의 순차적 서방출을 고려할 때 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도가 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도보다 큰 것이 바람직하다. 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크와 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크의 구성성분인 아민기를 가지는 세포외기질과 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자의 중량비에 의해 조절될 수 있다. 세포외기질 기반 하이브리드 잉크의 주요 성분은 세포외기질인데, 하이브리드 잉크 내에서 상기 세포외기질 대비 변성 생체고분자의 양이 커질수록 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)에 의해 화학적 결합이 더 많이 형성되어 화학적 결합 밀도가 증가하게 된다. 예를 들어, 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 세포외기질 대 변성 생체고분자의 중량비는 1:0.2 내지 1:0.5인 것이 바람직하다. 또한, 상기 외부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 세포외기질 대 변성 생체고분자의 중량비는 1:0.05 내지 1:0.15인 것이 바람직하다. 또한, 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 세포외기질 농도는 2~8%(w/v)인 것이 바람직하다. 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 변성 생체고분자 농도는 0.4~4%(w/v)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 변성 생체고분자 농도는 0.1~1.2%(w/v)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크는 서로 다른 성장인자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 생체개료 기반 약물전달 패치에서 상기 내부 코어층과 외부층은 서로 다른 성장인자를 함유하게 된다. 상기 성장인자는 약물전달 패치의 구체적인 용도에 따라 공지의 다양한 성장인자에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성장인자는 혈관신생을 유도하는 성장인자인 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 상피성장인자(epithermal growth factor, EGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 안지오포이에틴(angiopoietin, ANG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 태반성장인자(placental growth factor, PGF), 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α, TGF-α), 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 뼈형성단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP) 등에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 생체개료 기반 약물전달 패치에서, 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크가 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크보다 화학적 가교결합 밀도가 높은 경우, 내부 코어층에 함유된 성장인자는 외부층에 함유된 성장인자와 위치 관계에 의해 공간적으로 구획화될 뿐 아니라 세포외기질 기반 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도에 의해 시간적으로도 구획화되어, 생체 내에서 내부 코어층에 함유된 성장인자는 외부층에 함유된 성장인자에 비해 더 늦은 순서로 서서히 방출된다. 상기 내부 코어층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 및 외부층을 구성하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 내에서 성장인자의 농도는 다층 구조 패치의 약물 전달 효과 등을 고려할 때 0.01~0.5 g/ℓ인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치는 제1층, 제2층 및 제3층이 순차적으로 적층된 다층 구조의 패치로서, 제2층은 내측에 위치하는 제2 내부층 및 양쪽의 외측에 위치하는 2개의 제2 외부층으로 구성되며, 상기 제1층, 2개의 제2 외부층 및 제3층은 제1 하이브리드 잉크로 이루어지고, 제2 내부층은 제2 하이브리드 잉크로 이루어진다. 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 성장인자를 포함한다. 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 구성하는 세포외기질 및 변성 히알루론산은 화학적으로 가교결합된 상태로 존재한다. 또한, 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크는 서로 다른 화학적 가교결합 밀도를 가지며, 약물의 순차적 서방출을 고려할 때 제2 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도가 제1 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도보다 큰 것이 바람직하다. 또한, 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 구성하는 성장인자는 서로 다른 성장인자에서 선택된다.
본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법은 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 제1 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하는 제1 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 제1 성장인자와 다른 제2 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며 제1 하이브리드 잉크와 화학적 가교결합 밀도가 다른 제2 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 상기 제2 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 형성하는 단계; 및 상기 제1 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 형성하고 다층 구조물을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법에서 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층과 상기 내부 코어층을 둘러싸는 외부층으로 구성된 다층 구조물은 졸(sol)과 하이드로겔(hydrogel)의 중간 상태로 존재한다. 본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법은 상기 다층 구조물을 하이드로겔 상태로 전환시키기 위해 다층 구조물을 25~45℃, 바람직하게는 30~40℃에서 0.5~3 hr, 바람직하게는 0.6~1.5 hr 동안 열처리하여 하이드로겔 상태의 다층 구조물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법은 하이드로겔 상태의 다층 구조물을 통풍이 되는 조건에서 6~24 hr, 바람직하게는 8~18 hr 동안 건조하여 유리화 된 다층 구조물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법에서 상기 제2 하이브리드 잉크는 제1 하이브리드 잉크보다 가교결합 밀도가 큰 것이 바람직하다. 본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법에서 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크는 세포외기질을 주성분으로 하는 세포외기질 기반 하이브리드 잉크이다. 상기 제1 하이브리드 잉크 내의 세포외기질 대 변성 생체고분자의 중량비는 1:0.05 내지 1:0.15인 것이 바람직하다. 또한, 상기 제1 하이브리드 잉크 내에서 세포외기질 농도는 2~8%(w/v)인 것이 바람직하고 변성 생체고분자 농도는 0.1~1.2%(w/v)인 것이 바람직하다. 상기 제2 하이브리드 잉크 내의 세포외기질 대 변성 생체고분자의 중량비는 1:0.2 내지 1:0.5인 것이 바람직하다. 또한, 상기 제2 하이브리드 잉크 내에서 세포외기질 농도는 2~8%(w/v)인 것이 바람직하고 변성 생체고분자 농도는 0.4~4%(w/v)인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법은 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 제1 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 히알루론산은 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하는 제1 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 제1 성장인자와 다른 제2 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 히알루론산은 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며 제1 하이브리드 잉크와 화학적 가교결합 밀도가 다른 제2 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 상기 제1 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제1층을 형성하는 단계; 상기 제2 하이브리드 잉크를 제1층 표면의 내측에 3D 프린팅하고 제1 하이브리드 잉크를 제1층 표면의 양쪽 외측에 3D 프린팅하여 제2 내부층 및 2개의 제2 외부층으로 구성된 제2층을 형성하는 단계; 및 상기 제1 하이브리드 잉크를 제2층의 표면에 3D 프린팅하여 제3층을 형성하고 다층 구조물을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법은 상기 제1층, 제2층 및 제3층을 포함하는 다층 구조물을 25~45℃, 바람직하게는 30~40℃에서 0.5~3 hr, 바람직하게는 0.6~1.5 hr 동안 열처리하여 하이드로겔 상태의 다층 구조물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 약물전달 패치 제조방법은 하이드로겔 상태의 다층 구조물을 통풍이 되는 조건에서 6~24 hr, 바람직하게는 8~18 hr 동안 건조하여 유리화 된 다층 구조물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크는 서로 다른 화학적 가교결합 밀도를 가지며, 약물의 순차적 서방출을 고려할 때 제2 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도가 제1 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도보다 큰 것이 바람직하다. 또한, 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 구성하는 제1 성장인자 및 제2 성장인자는 서로 다른 성장인자에서 선택된다.
본 발명의 일 측면은 서로 다른 혈관신생 촉진 인자를 순차적으로 서방출하기 위해 약물이 시공간적으로 구획화된 다층 구조의 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 및 이의 제조방법은 전술한 생체재료 기반 약물전달 패치 및 이의 제조방법과 비교할 때 각 층들에 함유되는 성장인자들이 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 성장인자 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 성장인자로 구체화된 것을 제외하고 나머지 기술적 특징은 동일하다.
본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치는 내부 코어층과 상기 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 포함하는 다층 구조의 패치로서, 상기 외부층은 세포외기질 기반 제1 하이브리드 잉크로 이루어지고 내부 코어층은 세포외기질 기반 제2 하이브리드 잉크로 이루어진다. 상기 제1 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자를 포함하고, 상기 제2 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자를 포함한다. 또한, 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 구성하는 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며, 상기 제2 하이브리드 잉크는 제1 하이브리드 잉크보다 화학적 가교결합 밀도가 크다. 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치에서 상기 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자는 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산이다. 또한, 본 발명에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치에서 상기 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 안지오포이에틴(angiopoietin, ANG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 태반성장인자(placental growth factor, PGF), 상피성장인자(epithermal growth factor, EGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α, TGF-α) , 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β) 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한, 상기 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자는 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 뼈형성단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP) 및 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치는 제1층, 제2층 및 제3층이 순차적으로 적층된 다층 구조의 패치로서, 제2층은 내측에 위치하는 제2 내부층 및 양쪽의 외측에 위치하는 2개의 제2 외부층으로 구성되며, 상기 제1층, 2개의 제2 외부층 및 제3층은 제1 하이브리드 잉크로 이루어지고, 제2 내부층은 제2 하이브리드 잉크로 이루어진다. 상기 제1 하이브리드 잉크는 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자를 포한한다. 또한, 제2 하이브리드 잉크는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자를 포함한다. 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크를 구성하는 세포외기질 및 변성 히알루론산은 화학적으로 가교결합된 상태로 존재한다. 또한, 상기 제1 하이브리드 잉크 및 제2 하이브리드 잉크는 서로 다른 화학적 가교결합 밀도를 가지며, 약물의 순차적 서방출을 고려할 때 제2 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도가 제1 하이브리드 잉크의 화학적 가교결합 밀도보다 큰 것이 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 제조방법은 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하는 제1 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 생체고분자 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 생체고분자는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며 제1 하이브리드 잉크보다 화학적 가교결합 밀도가 큰 제2 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 상기 제2 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 형성하는 단계; 및 상기 제1 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 형성하고 다층 구조물을 수득하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 제조방법은 내부 코어층과 외부층을 포함하는 다층 구조물을 하이드로겔 상태로 전환시키기 위해 다층 구조물을 25~45℃, 바람직하게는 30~40℃에서 0.5~3 hr, 바람직하게는 0.6~1.5 hr 동안 열처리하여 하이드로겔 상태의 다층 구조물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 제조방법은 하이드로겔 상태의 다층 구조물을 통풍이 되는 조건에서 6~24 hr, 바람직하게는 8~18 hr 동안 건조하여 유리화 된 다층 구조물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치 제조방법은 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 혈관신생 초기 단계를 촉진하는 제1 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 히알루론산은 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하는 제1 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 아민기를 가지는 세포외기질, 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산 및 혈관신생 성숙 단계를 촉진하는 제2 성장인자를 포함하는 혼합물로 이루어지고 상기 세포외기질 및 변성 히알루론산은 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하며 제1 하이브리드 잉크보다 화학적 가교결합 밀도가 큰 제2 하이브리드 잉크를 준비하는 단계; 상기 제1 하이브리드 잉크를 3D 프린팅하여 제1층을 형성하는 단계; 상기 제2 하이브리드 잉크를 제1층 표면의 내측에 3D 프린팅하고 제1 하이브리드 잉크를 제1층 표면의 양쪽 외측에 3D 프린팅하여 제2 내부층 및 2개의 제2 외부층으로 구성된 제2층을 형성하는 단계; 및 상기 제1 하이브리드 잉크를 제2층의 표면에 3D 프린팅하여 제3층을 형성하고 다층 구조물을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 생체재료 기반 혈관신생 촉진용 패치는 혈관신생 의존성 질환을 예방하거나 치료하는데에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 생체재료 기반 혈관신생 의존성 질환 예방 또는 치료용 패치를 제공한다.
상기 '혈관신생 의존성 질환'은 혈액 공급이 원활하게 이루어지지 않거나 혈관신생이 제대로 이루어지지 않는 증상을 수반하는 질환이다. 본 발명에서 혈관신생 의존성 질환은 혈관신생 촉진에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 허혈성 질환, 상처, 화상, 건선, 만성궤양, 심근경색, 협심증, 욕창, 탈모, 당뇨망막증, 미숙아 망막증, 연령관련 황반변성증, 녹내장, 당뇨성 족부궤양, 폐고혈압 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, 상기 허혈성 질환은 뇌허혈, 심장허혈, 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전, 심근비대증, 망막허혈, 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중, 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 실험방법
(1) 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM) 및 이를 포함하는 잉크의 제조
가까운 도축장에서 구입한 신선한 돼지 대동맥을 약 2㎜ 길이의 입방체로 잘게 썰고 탈이온수로 6 hr 동안 세척하여 남아있는 혈액을 제거하였다. 이후, 슬라이스한 대동맥 조직을 0.3%(w/w) 도데실황산나트륨(Sodium dodecyl sulfate) 용액에 넣고 24 hr 동안 교반시키고, 다음에 3%(w/w) Triton X-100 용액에 넣고 24 hr 동안 교반하였다. 이후, 대동맥 조직을 PBS(Phosphate buffered saline) 용액으로 24 hr 동안 헹구어 화학 세제를 씻어낸 후, 대동맥 조직을 PBS 용액 내에 75 U/㎖ DNase와 50 mM 염화마그네슘(MgCl2)이 포함된 뉴클레이스 용액으로 37℃에서 24 hr 동안 처리하여 탈세포화시켰다. 이후, 탈세포화된 조직을 4% 에탄올에 녹인 0.1% 과산화아세트산(Peracetic acid) 용액으로 약 4 hr 동안 처리하여 멸균하고, 탈이온수와 PBS 용액으로 여러번 헹구어 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)을 수득하였다. 이후, 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)을 -80℃에서 급속 동결하고 약 48 hr 동안 동결건조하여 분말 형태의 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)을 수득하였다.
동결건조된 VdECM 100㎎을 15㎎의 펩신과 함께 7.5㎖의 0.5M 아세트산 용액에서 약 120 rpm으로 교반하여 용해시키고 40㎛ 기공 크기의 메쉬 필터로 여과하여 용해되지 않은 입자를 제거한 VdECM 용액을 수득하였다. 이후, VdECM 용액에 10N 수산화나트륨 용액을 첨가하고 교반하여 pH를 7.4로 중화하고 졸(Sol) 상태의 VdECM 잉크를 제조하였다.
(2) 하이브리드 잉크의 제조
VdECM과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)을 중성 상태(pH 7)의 용액 내에서 혼합한 후, 4℃에서 약 10~12 hr 동안 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 진행시켜 졸(Sol) 상태의 하이브리드 바이오잉크를 새롭게 합성하였고, 'HAVEM 잉크'라 명명하였다. 상기 HAMA의 아크릴레이트 작용기는 마이클 어셉터(Michael acceptor)로 작용하고, VdECM의 구성성분에 존재하는 아민 작용기는 마이클 도너(Michael donor)로 작용하여 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)이 진행된다. 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)은 N-친핵체(N-nucleophiles)와 활성화된 알켄 등과 같은 친전자체(electrophiles)를 포함하는 친핵성 접합체 첨가 반응이다. 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)은 별도의 촉매를 필요로 하지 않으며 아민을 α,β-불포화 카보닐 화합물에 결합시키는 가장 단순하고 효율적인 방법으로 알려져 있다. 상기 HAVEM 잉크는 중성 상태 용액 내에 VdECM과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)의 양을 각각 달리 첨가하여 HAVEM 잉크(4V0.5H) 및 HAVEM 잉크(4V1H)와 같이 2가지 종류로 제조하였고, 2가지 종류의 HAVEM 잉크에 포함된 성분들의 조성을 하기 표 1에 요약하였다. 또한, 대조군으로 VdECM만을 중성 상태(pH 7)의 용액에 4%(w/v)의 농도로 첨가하여 VdECM 잉크(4VOH)를 제조하였다.
HAVEM 잉크 구분 HAVEM 잉크 구성성분 및 조성
VdECM(%, w/v) HAMA(%, w/v)
HAVEM 잉크(4V0.5H) 4 0.5
HAVEM 잉크(4V1H) 4 1
또한, 시공간 구획화된 뇌혈관 신생 유도(Spatiotemporal compartmentalized cerebral angiogenesis inducing, SCAI) 패치 제작을 위해 HAVEM 잉크(4V0.5H) 또는 HAVEM 잉크(4V1H)에 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 간세포성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)를 각각 0.05 ㎍/㎕의 농도로 혼합하여 총 4종류의 바이오잉크를 제조하였다.
(3) SCAI 패치의 제작
시공간적으로 분리된.이중 성장인자 방출 플랫폼을 개발하기 위해 3층 구조의 원형패치를 3D 프린팅 시스템을 사용하여 제작하였다. 첫번째 층, 두번째 외부층 및 세번째 층은 VEGF(재조합 인간 VEGF 165; PeproTech, USA)와 혼합된 HAVEM 잉크를 사용하여 인쇄하였다. 두번째 내부층은 HGF(재조합 인간 HGF; PeproTech, USA)와 혼합된 HAVEM 잉크를 사용하여 인쇄하였다. 2가지 유형의 HAVEM 잉크를 각각 24G 플라스틱 노즐이 장착된 3㎖ 주사기(Musashi Engineering Company, 일본)에 로드한 다음, 멀티헤드 3D 프린팅시스템(T&R Biofab, 한국)에 로드하였다. 3개의 레이어 모두 4℃로 제어된 온도에서 프로그래밍된 g-코드에 따라 나선형으로 인쇄하였다. 각 층을 인쇄한 후, 적층된 층 사이의 혼합을 방지하기 위해 20초의 정지 시간을 주었다. 인쇄된 3층 원형 SCAI 패치의 겔화를 위해 배양기에 넣고 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 1 hr 동안 처리하였다. 이후, SCAI 하이드로겔 패치를 통풍이 잘되는 곳에서 약 10~12 hr 동안 건조하여 유리화(vitrification)시켰다. 이후, 유리화 된 SCAI 패치를 이후의 세포실험과 동물실험에 사용하였다.
(4) 3D 프린팅용 잉크 및 SCAI 패치의 물리화학적 특성 검증
위에서 제조한 3D 프린팅용 생체재료 잉크의 유변학적 분석은 20㎜ 콘 플레이트 모양의 Discovery Hybrid Rheometer-2(TA Instruments, USA) 시스템을 사용하여 수행되었다. 분석한 3D 프린팅용 잉크는 3종류의 중성화된 잉크(pH 7)로서, 4% VdECM 잉크(4V0H); 0.5% HAMA를 포함하는 4% VdECM 잉크[HAVEM 잉크(4V0.5H)]; 및 1% HAMA를 포함하는 4% VdECM 잉크[HAVEM 잉크(4V1H)]이었다. 전단점도 값은 각 생체재료 잉크의 흐름 거동을 평가하기 위해, 4℃의 온도 조건 및 0.01s-1에서 1000s-1로 증가하는 전단속도 조건에서 결정하였다. 각 잉크의 겔화 역학은 5 ℃/min의 가열속도 조건 및 4℃에서 37℃까지의 전단 온도 변화 모드에서 측정되었다. 생체재료 잉크의 진동수에 따른 저장 탄성률(Storage modulus)과 손실 탄성률(loss modulus)를 확인하기 위해, 37℃에서 겔화시킨 잉크에 대해 2% 변형률 조건 및 0.1~100 rad/s의 범위에서 동적 진동수 변화 시험을 진행하였다. 또한, 잉크의 구성성분인 VdECM과 HAMA가 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction) 메커니즘을 통해 화학적으로 가교되었음을 확인하기 위해서, 동결건조된 잉크를 D2O에 용해시키고 1H NMR(400MHz) 스펙트럼을 Bruker Advance III HD 400MHz NMR 분광계를 통해 얻었다. 이후, 해당 잉크를 통해 제작한 패치를 유리화시킨 뒤, 유리화 된 패치의 인장 특성을 MTS 신율계(AVX54, MTS)를 이용하여 확인하였다. 인장 특성 시험시 유리화 된 패치의 미끄러짐을 방지하기 위해 직사각형 모양의 유리화 패치 샘플(25㎜×8㎜×400㎛)을 준비하고 MTS 신장계에 장착된 나사그립을 사용하여 고정하였다.
(5) 성장인자 방출 시험
재조합 인간 VEGF 165(100-20; PeproTech, USA) 및 재조합 인간 HGF(100-39H; PeproTech, USA)를 최종 농도가 0.05 ㎍/㎕가 되게 각각의 잉크에 혼합한 후, 3D 프린팅을 통해 다중층으로 이루어진 패치를 적층가공하고 열처리 및 건조를 통해 유리화 된 SCAI 패치를 제작하였다. 상기 유리화 된 SCAI 패치는 화학적 가교 및 열적 가교와 같이 이중가교를 거친 것이다. 유리화 된 원형 디스크 모양(직경 8㎜, 높이 150㎛) SCAI 패치를 37℃ 온도의 PBS 용액 1.1㎖에 넣었다. 이후, 원하는 시간 포인트마다 용액 1㎖를 취하여 -80℃에 보관하고, PBS 용액을 취한 양만큼 다시 넣어주었다. 이후, ELISA 키트를 사용하여 각 패치에서 방출되는 성장인자인 VEGF(DY293B; R&D Systems, USA)와 HGF(DY294; R&D Systems, USA)의 양을 정량화하였다.
(6) 세포 배양
인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMECs; Innoprot, Korea)를 5%(v/v) 태아 소 혈청, 1%(v/v) 내피 세포 성장 보충제 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 첨가되어 보충된 내피 세포 배지(ECM; Innoprot, Korea)에 접종하고 배지를 2~3일마다 교체하면서 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 콘플루언스(Confluence)가 90%에 도달하였을 때 세포를 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 세척한 뒤, 0.25% Trypsin-EDTA(Gibco, USA) 용액으로 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 4분 동안 처리한 후 세포를 분리하여 사용하였다.
(7) rt-PCR
12웰-플레이트를 사용하여 HBMEC 세포를 1.5㎖의 배지에서 웰당 1.5×104 밀도로 배양하였다. 이때, 패치의 영향을 보기 위한 실험군에서는 웰에 삽입된 트랜스웰 위에 SCAI 패치를 두고 패치에서 방출되는 성장인자가 HBMEC의 성장에 미치은 영향을 확인하였다. 배양 3, 7, 14일째에 RNAiso plus(Takara Bio, Japan)를 사용하여 웰 내 세포의 mRNA를 추출하였다. 추출한 RNA 농도 및 순도는 Nanodrop Lite 분광도계(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였다. 이후, SuperScript IV First-Strand Synthesis System(Invitrogen Life Technologies, USA)을 이용하여 추출한 mRNA에 대해 역전사를 수행하였다. Real-time PCR은 SYBR-green I 시약(Takara, Japan)과 함께 StepOne Plus Real-Time Cycler(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 StepOne 소프트웨어.v2.3을 사용하여 분석되었고, GAPDH 발현에 대해 정규화된 각 유전자의 발현 수준은 2-ΔΔCT 방법에 따라 계산되었다. Real-time PCR에 사용한 프라이머 서열은 NCBI 및 PubMed에 게시된 유전자 서열을 기반으로 설계되었고, 하기 표 2에 Real-time PCR에 사용한 프라이머 서열을 정리하였다.
타겟 유전자 프라이머 설명 프라이머 염기 서열(5'→3')
hu-GAPDH Forward 프라이머 5'-CAATGACCCCTTCATTGACC-3'
Reverse 프라이머 5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'
hu-FLT1 Forward 프라이머 5'-CACCCAGCACATCATGCAA-3'
Reverse 프라이머 5'-TTCCCCCCTGCATTGGA-3'
hu-FLK1 Forward 프라이머 5'-ATTCCTCCCCCGCATCA-3'
Reverse 프라이머 5'-GCTCGTTGGCGCACTCTT-3'
hu-ANGPT1 Forward 프라이머 5'-GCGGGACAAAACCATGGA-3'
Reverse 프라이머 5'-AACTGGGCCCTTTGAAGTAGTG-3'
hu-PECAM Forward 프라이머 5'-TATGATGCCCAGTTTGAGGT-3'
Reverse 프라이머 5'-GAATACCGCAGGATCATTTG-3'
(8) SCAI 패치가 세포실험에 미치는 영향 평가
시험관내 세포독성을 평가하기 위해 유리화 된 SCAI 패치를 각 웰에 삽입된 트랜스웰 위에 두고, 각 웰 바닥에 HBMEC를 2×104 cells/㎖ 밀도로 추가하였다. 이후, 세포를 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건에서 7일 동안 배양한 후 live/dead 분석 키트(LIVE/DEAD Cell Viability Assay, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 염색하였다 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 녹색 형광물질과 빨간색 형광물질로 표지한 후 형광현미경(Nikon Instruments, Japan)으로 관찰하였다. 세포 증식은 Cell Counting Kit-8 Assay Kit(Dojindo Molecular Technologies, Japan)를 사용하여 정량화되었다. 패치가 있는 실험군과 패치가 없는 대조군 각각에 대해 특정 시간까지 세포를 배양한 후, 새로운 배지에서 1:10으로 희석된 CCK-8 용액과 함께 37℃에서 3 hr 동안 배양하였다. 이후, 처리된 용액을 투명한 96-웰 플레이트에 옮기고 MultiskanTM GO Microplate Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(9) SCAI 패치가 동물실험에 미치는 영향 평가
모든 동물 연구는 local Institutional Animal Care and Use Committee (POSTECH-2021-0022)의 승인을 받은 후 국가 규정의 지침에 따라 수행되었다. 200~300g 무게의 8주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 생체 내 실험에 사용하였다. 쥐의 마취는 처음에는 4.0% isoflurane을 포함하는 마취 유도 챔버를 사용하여 수행한 다음, 수술 중에는 1.5% isoflurane 농도로 유지하였다. 머리는 스테레오택시 프레임에 이어바로 고정하고, 체온은 히팅패드로 유지하였다. 머리를 면도한 후 반구의 피부를 절개하였다. 남아 있는 표피와 잔해물은 식염수로 제거하였다. 그런 다음 치과용 드릴을 사용하여 개두술을 조심스럽게 수행하였다. 노출된 뇌 조직을 6㎜×11㎜의 크기 및 150~180㎛ 두께의 PDMS(Polydimethylsiloxane) 멤브레인으로 완전히 덮고 멸균한 후 식염수에 담그었다. PDMS 멤브레인의 경계는 시아노아크릴레이트 접착제(Loctite, USA)를 사용하여 두개골과 접착시켰다. 이후, PDMS 멤브레인의 가장자리를 따라 치과용 레진(OA2; Denkist Inc., Korea)을 도포하고 15초 동안 자외선을 조사하여 두개골에 반영구적으로 접착시켰다. 마지막으로 쥐에게 피하주사를 통해 Baytril(5 ㎎/㎏; Bayer, Germany)을 투여하고 우리로 돌려보냈다. 그런 다음, Tylenol(0.5 ㎎/㎖; Janssen, Korea)과 Marboxyl(0.06 ㎎/㎖; Vetoquinol, Korea)을 음용수를 통해 지속적으로 공급하며 염증을 완화시켰다. 수술 2주 후, 뇌 조직을 채취하고, 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색 및 면역조직화학(IHC)을 사용하여 뇌 조직을 분석한 후, 그 결과를 토대로 SCAI 패치의 기능적 혈관신생 효능을 평가하였다.
(10) SCAI 패치에 의해 유도된 대뇌 혈관신생 양상의 광음향 모니터링
대뇌 혈관신생을 모니터링하기 위해 광학 해상도 광음향 현미경(OR-PAM) 시스템(OptchoM, Optcho, Korea)을 사용하였다. OR-PAM은 체적 미세혈관의 비침습적 탐사를 위한 생체 이미징 도구로, 532nm 파장의 나노펄스 레이저 시스템(VPFL-G-10, Spectra-Physics, USA)을 사용하여 혈관에 초음파를 발생시킨다. 시스템에서 생성된 초음파는 중심 주파수 20MHz, 대역폭 60%에서 맞춤형 초음파 변환기에 의해 측정된다. 분할된 이미지를 결합하여 넓은 시야(FOV) 이미지를 재구성할 수 있다. 분할 이미지는 검류계 스캐너(GVS001; Thorlabs, USA)와 2개의 선형 전동 스테이지(L-509.10SD00; Physik Instrumente, Germany)를 사용하여 획득하였다. 검류계 스캐너는 스캔 범위 길이가 1.6㎜(400픽셀)이고 스캔 속도가 50Hz인 레이저 펄스를 조정하게 된다. 최대 스캔 범위가 26㎜인 선형 전동 스테이지(스텝 크기는 5㎛)는 OR-PAM 시스템의 스캔 부분을 검류계 스캐너의 스캔 방향에 수직인 방향으로 이동시킨다. 스테이지의 스캔 범위는 ROI의 크기에 따라 조정된다. 다른 선형 스테이지는 검류계 스캐너와 동일한 스캔 방향으로 스캔 부분을 이동시켜 다른 영역에서 분할된 이미지를 제공하게 된다. 획득한 분할 영상은 피라미드 블렌딩을 이용한 SSIM(structural similarity) 기반 체적 영상 등록 알고리즘에 의해 광각 FOV 영상으로 재구성되었다. 직경 50㎛ 미만의 새롭게 생성된 혈관의 밀도를 계산하기 위해, 먼저 ROI 외부 영역을 제거하는 마스크를 만든 다음 쥐 뇌의 PA 최대 진폭 투영(MAP) 이미지에서 직경이 약 150㎛보다 큰 혈관을 제거하였다. ROI의 면적은 마스크의 면적으로 계산되었다. 이후, Hessian 기반 혈관 필터를 적용하고, 필터링된 영상에서 직경 50㎛ 이상의 혈관을 추출하고 추출된 혈관을 기반으로 큰 혈관 지도를 생성하였다. 마지막으로 혈관 필터링 영상에서 큰 혈관 지도를 빼고 직경 50㎛ 미만의 작은 혈관으로 작은 혈관 지도를 재구성하고 작은 혈관 지도를 기반으로 작은 혈관의 면적을 계산하였다.
(11) 조직학적 분석
뇌를 적출하고, 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드 용액에 고정시키고 패치가 부착된 수술 부위을 절개하였다. 이후, 조직 샘플을 파라핀에 굳히고 H&E 염색 실험을 위해 파라핀이 포함된 조직 샘플을 5㎛ 미만의 두께로 횡방향으로 절단하였다. 염색된 이미지를 현미경 시스템(Leica DM750; Leica)을 사용하여 이미징하였다.
(12) 면역조직화학
4% 파라포름알데히드 용액에 고정된 조직 샘플을 파라핀에 굳히고 면역형광염색을 위해 4㎛ 두께로 절편을 만들었다. 이후 완출액을 사용하여 탈파라핀화 및 재수화 단계를 수행하였다. 이후, 절편을 10% 과산화수소 용액에 넣고 실온에서 10분 동안 배양한 후 CD31에 대한 1차 항체(1:1000; abcam, UK)로 염색하였다. 염색된 부위를 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 2차 항체(Envision+ Rabbit;DAKO, USA)를 30분 동안 더 배양한 후 Mayer' Hematoxylin을 적용하여 대조 염색을 하였다. 얻어진 슬라이드를 현미경 시스템(Leica DM750; Leica)을 사용하여 이미징하였다.
(13) 통계 분석
모든 통계 분석은 GraphPad Prism 8.2.1 프로그램(GraphPad Software, USA)을 사용하여 수행되었다. 데이터간 차이의 유의성은 양방향 ANOVA 또는 t-검정을 통해 평가되었다. 통계적 유의성의 표현은 다음과 같다 : *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p <0.0001.
2. 실험 결과
도 1은 본 연구에서 화학적 가교결합 및 열적 가교결합과 같이 이중 가교결합 메커니즘을 이용하여 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)으로부터 하이드리드 잉크(HAVEM 잉크)를 제조하는 개략적인 과정을 나타낸 것이고, 도 2는 본 연구에서 서로 다른 가교결합 밀도를 가진 하이브리드 잉크 각각에 뇌혈관 신생 유도 성장인자인 VEGF와 HGF를 첨가하고 3D 프린팅 공정을 이용하여 뇌혈관 신생 유도(Spatiotemporal compartmentalized cerebral angiogenesis inducing, SCAI) 패치를 제조하는 개략적인 과정과, SCAI 패치에서 VEGF와 HGF가 순차적으로 방출되는 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 1 및 도 2에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 발명자는 2개의 혈관 신생 성장인자가 구획화되어 순차적으로 지연 방출될 수 있도록 하는 정교한 SCAI 하이드로겔 패치를 세포외기질(ECM) 기반의 하이브리드 잉크 및 3D 프린팅 기술을 활용하여 제작하였다. 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)을 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)이라는 화학적 가교방식으로 결합시켜 하이브리드 잉크를 형성하였다. 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)은 외인성 촉매가 필요하지 않고, 간단하게 화학 결합 밀도만을 변경시켜 혈관신생인자들의 방출 양상이나 인쇄능을 조절할 수 있기 때문에, SCAI 패치를 제작하기에 매우 이상적인 메커니즘이다. 본 발명의 발명자는 패치를 이식한 후 성장인자들이 순차적으로 방출되도록 하기 위해, SCAI 배치 내부와 외부에 각기 다른 성장인자들을 배치하여 공간적으로 분리시켰고, 다른 성장인자들을 탑재하기 위해 각각 다른 화학적 가교 밀도를 가진 2종류의 하이드리드 잉크(HAVEM 잉크)를 사용하였다. 다른 성장인자들이 탑재된 2종류의 하이드리드 잉크(HAVEM 잉크)를 3D 프린팅하여 SCAI 패치를 제조한 후, SCAI 패치에 유리화 공정을 적용하여 부드럽고 유연하며 조작하기 쉬운 뇌 이식용 패치를 만들었다. 이렇게 제작된 패치가 혈관신생을 촉진하는 치료적 효과가 있다는 점이 생체 외 및 생체 내에서 입증되었다. 특히, 본 발명의 발명자는 비표지방식을 적용한 광음향 현미경을 이용하여 패치 이식 후 14일 동안의 대뇌 미세혈관의 시간에 따른 혈관신생 양상을 관찰하였다. 정량화된 결과에 의할 때 SCAI 패치는 뇌 영역에서 상당한 혈관신생 성능을 보여주었다.
(1) 하이드리드 잉크(HAVEM 잉크)의 물리화학적 특성
패치에서 혈관신생 인자들을 원하는 양과 속도로 탑재하고 방출하기 위해서 HAMA와 VdECM으로부터 생체재료 기반의 새로운 이중가교 하이브리드 잉크를 제조하였고, 이를 'HAVEM 잉크'라 명명하였다. 도 3은 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 통해 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)으로부터 HAVEM 잉크를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 먼저, HAVEM 잉크의 화학적 가교 과정에서는 aza-Michael 첨가반응을 통해 HAMA의 메타크릴레이트기와 VdECM의 아민기가 결합하게 된다. 각 VdECM과 HAMA의 비율을 조절함으로써 화학 가교 밀도를 조절할 수 있었다.
이때, aza-Michael 첨가반응을 통해 형성된 화학결합은 NMR 분광법을 통해 확인하였다. 도 4는 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA) 사이의 가교결합 발생을 증명하기 위해 VdECM 잉크(4V0H), HAMA 및 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 핵자기공명(NMR)으로 측정한 스펙트럼이다. 메타크릴레이트 작용기와 관련된 NMR 특성 피크들은 1.9, 5.7 및 6.1 ppm에서 강조 표시되어 있다.
HAMA의 NMR 스펙트럼 결과에서는, HAMA에 포함된 메타크릴레이트기의 NMR 특성 피크인 1.9, 5.7, 6.1 ppm에서의 피크가 관찰되었지만, VdECM만 포함된 잉크(4V0H)의 스펙트럼에서는 이러한 피크가 동일한 위치에서 관찰되지 않았고 이는 메타크릴레이트기가 없음을 나타낸다. 또한, HAVEM 잉크 그룹(4V0.5H 및 4V1H)에서도 메타크릴레이트기에 해당하는 NMR 특성 피크들을 관찰할 수 없었다. 이는 HAMA의 모든 메타크릴레이트기가 VdECM의 아민기와 성공적으로 반응하여 화학적 가교를 형성하였음을 의미한다.
이후, HAVEM 잉크에서 HAMA의 비율에 따른 인쇄능 변화를 확인하였다. 도 5의 위 사진은 화학적 가교결합 밀도의 차이에 따른 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 솔(sol) 상태 이미지이고, 도 5의 아래 그래프는 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 점도를 4℃의 인쇄 조건 및 다양한 전단속도에서 측정한 결과이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 화학적 가교 밀도가 다른 HAVEM 잉크(4V0.5H 및 4V1H)는 모두 VdECM만 포함하는 잉크(4V0H)보다 점도가 약간 더 높고 유변학적으로 전단박화 특성을 나타내었다. 보다 구체적으로, 화학적 가교 밀도가 증가할수록 잉크의 유동성은 감소하고 점도는 증가하였다. 한편, 각 HAVEM 잉크의 점도는 시간의 변화에 따라서는 거의 영향을 받지 않았다.
제어된 가교 밀도가 HAVEM 잉크의 기계적 물성에 미치는 영향을 확인하기 위해 HAVEM 잉크의 온도를 4℃에서 37℃로 올리면서 준비된 잉크의 복소 탄성률 변화를 모티터링 하였다. 도 6은 4℃의 온도에서 37℃까지의 온도 변화에 따른 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 탄성률 변화를 나타낸 것이다. 도 6의 탄성률 변화에 의해 잉크의 겔화 동태를 파악할 수 있다. 도 6에서 보이는 바와 같이 더 높은 HAMA 농도를 포함하는 HAVEM 잉크(4V1H)는 더 낮은 HAMA 농도를 포함하는 HAVEM 잉크(4V0.5H) 및 VdECM 단독을 포함하는 VdECM 잉크(4VOH)와 비교할 때 열적 가교가 진행됨에 따라 복소탄성률이 더욱 크게 증가하는 추세를 보여주었다. 그리고, 평형에 도달하는데 필요한 시간은 다른 잉크(4V0.5H, 4V0H)보다 화학적 가교 밀도가 더 높은 HAVEM 잉크(4V1H)에서 상대적으로 더 긴 것으로 관찰되었고, 그 이유는 잉크에서 HAMA의 비율이 증가함에 따라 더 많은 화학적 가교가 발생하여 복소탄성률이 더 커졌기 때문인 것으로 추론된다. 평형 상태에서 HAVEM 잉크(4V1H)의 복소탄성률은 HAVEM 잉크(4V0.5H) 및 VdECM 잉크(4VOH)보다 1.91배 및 3,045배 더 큰 것으로 관찰되었다.
다음으로, 화학적 가교 및 열적 가교가 완료된 겔 상태의 잉크들의 복소탄성률을 확인하였을 때 HAVEM(4V1H) 잉크는 VdECM(4V0H) 잉크 및 HAVEM(4V0.5H) 잉크보다 더 큰 복소탄성률 값을 나타내었다. 도 7은 37℃의 온도에서 진동수 변화에 따른 VdECM 잉크(4V0H), HAVEM 잉크(4V0.5H), HAVEM 잉크(4V1H)의 저장 탄성률과 손실 탄성률을 나타낸 것이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 하이브리드 잉크는 인쇄 과정에서 가교 비율이 높을수록 더욱 높은 구조적 충실도를 가짐을 확인할 수 있었다. HAVEM 잉크의 화학적 가교 밀도를 변경하여 적절한 기계적 특성을 갖도록 유도할 수 있었고 이는 혈관신생 인자의 방출 양상을 조절하는데에 직접적인 영향을 미쳤다. 도 8은 HAVEM 잉크(4V0.5H) 및 HAVEM 잉크(4V1H)에 캡슐화된 HGF의 방출 프로파일을 7일 동안 측정한 결과이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 HGF를 포함하는 HAVEM 잉크(4V1H)의 HGF 방출은 HGF를 포함하는 HAVEM 잉크(4V0.5H)에서의 HGF 방출보다 훨씬 느림을 확인할 수 있었다.
(2) 3D 프린팅 기술을 이용한 SCAI 패치의 설계 및 제작
SCAI 패치를 만들기 위해 HAVEM 잉크(4V0.5H) 및 HAVEM 잉크(4V1H)와 같이 2가지 유형의 HAVEM 잉크를 사용하였다. 도 9는 본 연구에서 3D 프린팅 기술을 이용하여 SCAI 패치를 제작하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 9에서 보이는 바와 같이 패치 구조는 외부층과 내부층이 구분되는 총 3개의 층을 가지는 원형 모양으로 설계되었고, 3D 프린팅되었다. 외부층에는 VEGF(혈관신생 초기단계에 관여하는 혈관신생 인자)를 탑재하여 초기에 방출될 수 있도록 하였고, 내부층에는 HGF(후기 혈관신생과정에 관여하는 혈관신생 인자)를 적용하여 지연방출 되도록 설계하였다. 도 10은 튜브 형성 어세이(Tube formation assay)에 의해 다양한 혈관신생 인자의 혈관신생 효과를 측정한 결과이다. 도 10의 A는 튜브 형성 어세이(Tube formation assay)의 개략도이고, B는 무처리군(Control), VEGF, HGF 및 VEGF와 HGF 조합 처리 샘플별로 48 hr 경과 후에 측정한 총 튜브 길이를 나타낸 것이다. 도 10에서 보이는 바와 같이 성장인자의 조합은 인간 뇌 미세혈관 내피세포(HBMEC)에서 신속하고 연장된 관 형성을 효과적으로 유도하고 48 hr 경과후 한 종류의 성장인자만 처리한 군들과 비교했을때 가장 높은 총 관 길이를 형성하였다. 이러한 결과를 바탕으로 VEGF가 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H; 잉크 A)와 HGF가 포함된 HAVEM 잉크(4V1H; 잉크 B)를 사용하여 직경 8㎜의 원형 SCAI 패치를 제작하였다. 먼저, 잉크 A를 직경 8㎜의 나선형 궤적을 따라 프린팅하여 첫번째 층을 형성하였다. 외부로부터 HGF를 물리적으로 차단하기 위해 첫번째 층의 내부 위치에 잉크 B를 직경 6㎜의 나선형 궤적을 따라 프린팅하여 두번째 내부층을 형성하였고, 이후 동일한 인쇄 조건에서 잉크 A를 사용하여 두번째 외부층 및 세번째 층을 프린팅하였다. 각 층을 프린팅한 후에는 20초 동안 일시 정지하였고, Z축을 200㎛ 상승시킨 뒤 다음 층을 프린팅하였다. 결과적으로 HGF는 프린팅 과정을 통해 공간적으로 구획화되었을 뿐만 아니라, HGF를 포함하고 있는 잉크로 HAVEM 잉크(4V1H)를 사용하여 시간적으로도 구획화될 수 있었고, 이를 통해 혈관신생의 초기단계에서 패치에서 HGF가 방출되는것을 방지할 수 있었다. 본 연구에서는 내부의 코어층이 HGF가 포함된 가교밀도가 높은 HAVEM 잉크(4V1H; 잉크 B)로 인쇄되었고, 코어층을 완전히 둘러싸는 외부층이 VEGF가 포함된 가교밀도가 낮은 HAVEM 잉크(4V0.5H; 잉크 A)로 인쇄되었다. 한편, 패치의 첫번째 층, 두번째 외부층 및 세번째 층이 모두 VEGF가 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H; 잉크 A)로 이루어져 있기 때문에 패치가 이식된 직후에 VEGF가 방출되어 초기 혈관신생 과정에 영향을 증폭시킬 수 있다.
도 11은 본 연구에서 제작한 SCAI 패치의 단면 구조와 각 단면을 공초첨 현미경으로 촬영한 이미지이다(scale bars : 200㎛). 도 12는 HAVEM 잉크의 다양한 조합으로 제작한 SCAI 패치들의 설계구조 및 각 패치들의 인쇄, 겔화 및 유리화 단계에서의 이미지이다. 도 12에서 설계구조 1의 패치(맨 위의 행)는 VdECM 잉크(4VOH)를 사용하여 원형 형태로 프린팅하여 제작한 것이고, 설계구조 2의 패치(중간 행)는 내부의 코어층을 HAVEM 잉크(4V1H)로 프린팅하고 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 HAVEM 잉크(4V0.5H)로 프린팅하여 제작한 것이고, 설계구조 3의 패치(맨 아래의 행)는 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 사용하여 격자(Lattice) 형태로 프린팅하여 제작한 것이다(scale bars : 10㎜). 도 11 및 도 12에서 보이는 바와 같이 패치의 구획화된 구조는 패치가 프린팅된 후 열 가교 공정을 거친 뒤에도 잘 유지되었다. 이는 HAVEM 잉크가 우수한 인쇄능을 가져 다중 재료 기반 인쇄 프로세스를 사용하여도 원하는 구조를 쉽게 프린팅 할 수 있다는 점을 입증한다. 실제로, VdECM 잉크(4V0H)는 HAVEM 잉크(4V0.5H)보다 프린팅을 진행하였을 때, 상대적으로 정확한 모양의 구현이 어렵기 때문에, 목적한 SCAI 패치 모양대로 프린팅을 하는것이 용이하지 않았다. 이에 반해, HAVEM 잉크(4V0.5H)는 구획화된 SCAI 패치 구조뿐만 아니라, 이중층의 미세 기공 구조를 가지는 격자 모양의 하이드로겔 구조를 프린팅하는 것도 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 연구에서 제작한 HAVEM 잉크를 사용하는 경우 다양한 구조의 패치 제작이 가능하다.
내부의 코어층을 HAVEM 잉크(4V1H)로 프린팅하고 내부 코어층을 둘러싸는 외부층을 HAVEM 잉크(4V0.5H)로 프린팅하여 SCAI 패치로 성형한 후 소정의 열처리를 통해 열적 가교를 진행하였고, 이후 수술 중 이식, 취급 및 보관이 용이할 수 있도록 유리화(vitrification) 과정을 진행하였다. 유리화 과정을 거친 SCAI 패치의 기계적 특성을 평가하기 위해 인장응력-변형률 특성을 조사하였다. 도 13은 본 연구에서 제작한 유리화 과정을 거친 SCAI 패치의 인장강도 측정 결과 및 팽창비(Swelling ratio)를 나타낸 것이다. 도 13에서 "Control"은 유리화 과정을 거치지 않은 SCAI 패치를 나타내고, "SCAI patch"는 유리화 과정을 거친 SCAI 패치를 나타낸다. 도 13에서 보이는 바와 같이 유리화 된 SCAI 패치는 18.62 MPa의 인장강도를 보였고, 이는 유리화 과정을 거치지 않은 대조군 샘플보다 12.46배 더 높은 값이다. 또한, 유리화 된 패치는 식염수에 담그면 빠르게 수분을 재흡수하여 최대 151%까지 팽창하였다. 유리화 된 SCAI 패치의 미세구조는 전자현미경(SEM)을 사용하여 이미징하였고, 가교 밀도에 따라서 변화되는 상호 연결된 구조와 다공 구조를 확인할 수 있었다. 도 14는 본 연구에서 제작한 다양한 유리화 된 패치의 SEM 촬영 이미지이다(scale bars : 1㎛). 도 14에서 "4VOH"는 VdECM 잉크(4VOH)로 이루어진 유리화 된 패치를 나타내고, "4V0.5H"는 HAVEM 잉크(4V0.5H)로 이루어진 유리화 된 패치를 나타내고, "4V1H"는 HAVEM 잉크(4V1H)로 이루어진 유리화 된 패치를 나타낸다. 도 14에서 보이는 바와 같이 가교 밀도가 증가함에 따라 섬유 형태의 밀도도 증가하게 되는데, 각 구조에서 4V0H, 4V0.5H 및 4V1H 순서로 가교 밀도가 증가함에 따라, SEM 이미지 상의 섬유 형태의 밀도도 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
(3) SCAI 패치의 지속적이고 및 순차적인 방출 프로파일 및 세포 거동을 평가하기 위한 In vitro 실험
본 발명의 발명자는 SCAI 패치의 특성을 정립한 뒤, 제작된 패치에서 성장인자(Growth factor)들의 방출 양상을 확인했다. VEGF와 HGF가 순서대로 서방출 될 수 있도록 하기 위하여, 두개의 전략을 활용하였다. 각 성장인자를 포함하는 HAVEM 잉크의 화학적 가교 밀도를 조절하고, 3D 프린팅 기술을 활용하여 두개의 혈관신생인자가 시공간적으로 구획화 될 수 있도록 하는 하이드로겔 패치를 제작하였다.
화학적 가교 밀도가 낮은 하이드로겔은 수분을 더 많이 함유하고 있어서, 화학적 가교 밀도가 높은 하이드로겔보다 더 빠르게 분해된다. 이러한 원리로 하이드로겔의 화학적 가교의 밀도가 높을수록 하이드로겔에 캡슐화된 성장인자의 방출 속도가 낮아진다. 본 발명의 SCAI 패치는 화학적으로 가교된 친수성 매트릭스이기 때문에, 화학 결합의 밀도를 조절하는 것을 통하여 분해 속도를 조절할 수 있고, 이는 결과적으로 해당 하이드로겔에 탑재되어 있는 성장인자들의 방출 양상을 조절할 수 있다.
VEGF 및 HGF의 순차적인 약물 서방출을 위해 설계된 상기 전략을 검증하기 위해 2종류의 다층 SCAI 패치를 제작하고 2개의 실험 그룹에 대해 성장인자의 방출 양상을 확인하였다. 도 15는 VEGF 및 HGF의 순차적인 약물 서방출을 위해 본 연구에서 설계된 다층 SCAI 패치의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 15에서 보이는 바와 같이 본 연구에서 설계된 다층 SCAI 패치는 HGF가 포함된 하이브리드 잉크(잉크 B)로 이루어진 내부의 코어층 및 VEGF가 포함된 하이브리드 잉크(잉크 A)로 이루어지고 내부 코어층을 둘러싸는 외부층으로 구성되어 있다. 도 16은 VEGF 및 HGF의 순차적인 약물 서방출을 위해 본 연구에서 설계된 2종의 다층 SCAI 패치 각각에 대해 VEGF 및 HGF의 누적 방출 프로파일을 1개월 동안 평가한 결과이다. 도 16의 왼쪽 실험 그룹은 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성되어 있어서 잉크 조건이 동일하고 약물이 공간적으로만 구획화된 다층 SCAI 패치에 대해 약물 서방출과 순차 방출 양상을 관찰한 결과이다. 도 16의 오른쪽 실험 그룹은 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성되어 있어서 약물이 시공간적으로 구획화된 다층 SCAI 패치에 대해 약물 서방출과 순차 방출 양상을 관찰한 결과이다. 도 16에서 보이는 바와 같이 SCAI 패치의 외부층에 탑재된 VEGF는 두 그룹에서 별 차이 없이, 모두 50.07% ± 10.63%가 하루(24시간) 이내에 방출되는 것을 확인하였다. 한편, SCAI 패치의 내부 코어층에 탑재된 HGF의 경우, 두 그룹에서 모두 공간적으로 물에 의한 침식으로부터 비교적 보호될 수 있는 내부층에 위치했기 때문에, VEGF에 비해서는 서방출되는 양상을 보였다. 나아가, 오른쪽 실험 그룹에서 보이는 바와 같이 HAVEM 잉크의 화학 가교 밀도를 조절하여, 재료적인 부분에서도 외부와 내부의 조건에 차이를 두게 되었을 때는 공간적인 구분만 구현했을 때보다 서방출 및 순차적 방출 양상이 더 뚜렷하게 나타남을 확인하였다. 외부층와 내부층의 화학 가교 밀도를 조절하여 HGF를 외부층과 다른 HAVEM 잉크(4V1H)에 탑재한 오른쪽 실험 그룹의 경우 HGF 초기 로딩의 약 50%를 방출하는 데에 30일이 소요된 반면, 외부층과 내부층을 화학 가교 밀도를 조절하지 않고 HGF를 외부층과 동일한 HAVEM 잉크(4V0.5H)에 탑재한 왼쪽 실험 그룹의 경우 HGF가 오른쪽 실험 그룹과 비슷한 양으로 HGF를 방출하는데에 4일 정도가 소요되었다.
SCAI 패치의 혈관 신생 촉진에 의한 치료 가능성을 평가하기 위해 생체 적합성과 생체에서의 기능을 In vitro 실험을 통해 검증하였다. 도 17은 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치를 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 적용하여 배양하였을 때의 In vitro 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 17의 In vitro 실험에서 HBMEC 세포는 트랜스웰 위에 위치한 SCAI 패치와 함께 배양되었다. 도 17에서 보이는 바와 같이 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 SCAI 패치를 적용하여 7일 동안 배양했을 때, 세포 생존율에 어떠한 유해한 영향도 나타내지 않았고, 미처리군과 비교하여 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)의 증식 속도를 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 도 18은 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치를 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 적용하여 배양하였을 때의 세포 생존능을 live/dead 분석 키트로 분석한 결과이다(scale bars: 50㎛). 도 18의 live/dead 염색 분석 결과를 통해 도 17에서의 생포 증식 결과가 교차 검증되었다. 도 19는 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치를 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)에 적용하여 배양하였을 때의 혈관신생 관련 유전자 발현 수준을 분석한 결과이다. 도 19에서 보이는 바와 같이 혈관신생 초기 단계에서는 SCAI 패치가 적용된 그룹에서 미처리 그룹에 비해 혈관신생 관련 유전자가 더 많이 발현되었으나, 유의한 차이를 보이지는 않았다. 한편, FLT1, FLK1, ANGPT1 및 PECAM을 포함한 모든 혈관신생 관련 유전자 마커의 발현은 SCAI 패치를 적용한 후 14일이 경과하였을 때 급격히 증가하였다. 이러한 결과는 SCAI 패치가 혈관 신생을 촉진하는데 강력히 영향을 미친다는 것을 의미한다. SCAI 패치가 방출하는 VEGF와 HGF가 HBMEC 세포에 영향을 주게 되는데, 이때 HGF의 지연방출은 VEGF와 시너지 효과를 내어 효과적으로 혈관이 생성될 수 있도록 한다.
(4) SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험
본 연구에서 제작된 VEGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V0.5H)를 잉크 A로 사용하여 형성한 외부층 및 HGF가 0.05 ㎍/㎕의 함량으로 포함된 HAVEM 잉크(4V1H)를 잉크 B로 사용하여 형성한 내부 코어층으로 구성된 SCAI 패치의 생체 내 치료 가능성을 평가하기 위해, OR-PAM 시스템을 사용하여 SCAI 패치에 의해 유도된 대뇌 혈관의 혈관신생 거동을 시간에 따라 시각화하였다. 도 20은 본 연구에서 제작된 VEGF 및 HGF가 시공간적으로 구획화된 SCAI 패치를 SD 쥐의 대뇌 피질에 이식한 후 OR-PAM 시스템을 사용하여 이식된 부위를 모니터링하는 과정으로 이루어진 In vivo 실험을 개략적으로 나타낸 것이다. 본 발명의 발명자는 쥐를 마취하여 개두술을 진행하였고, 두개골을 제거한 후 대뇌 부분에 SCAI 패치를 이식하였다. 이후, 이식 부위에 얇은 PDMS 막을 덮어 모니터링을 위한 레이저와 광음향(PA) 초음파가 침투할 수 있도록 하였다. 이후 쥐의 뇌에서의 혈액 순환과 피질 미세혈관 구조 변화를 모니터링하기 위해 14일 동안 쥐의 관심 부위에 대해 광음향 영상을 촬영하였다.
도 21은 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 시간 경과에 따른 SCAI 패치의 변화를 추적하기 위해 패치가 이식된 부위의 횡단면을 광음향(PA) B-모드로 촬영한 이미지이다(scale bars: 200㎛). 도 21에서 반투명한 SCAI 패치 내부에서는 레이저 빔의 낮은 흡수로 인해 PA 신호가 약하기 때문에, 이를 바탕으로 패치의 경계를 결정하고 노란색 점선으로 강조 표시하였다. 도 21에서 보이는 바와 같이 이식 0일 차의 패치 두께는 유리화 된 SCAI 패치의 두께와 유사하게 140㎛로 표시되었다. 이식 1일 후에는 패치가 뇌척수액에 의해 팽창되어, 패치 두께가 240㎛까지 증가하였다. 이후, 패치가 분해됨에 따라 이식 7일 차에는 약 70㎛까지 감소하여 PA B-모드 이미지에서 거의 구별할 수 없게 되었다. 또한, 이식 14일 후에는 패치가 모두 분해되어 PA B-모드 이미지에서 패치가 관찰되지 않았다(결과 이미지 미도시함).
도 22는 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 SCAI 패치 처리 여부에 따른 SD 쥐의 뇌 혈관 구조 변화를 광음향(PA) 최대 진폭 투영(MAP) 이미지로 나타낸 것이고, 도 23은 도 22에서 SCAI 패치가 적용된 쥐의 이미지에서 흰색 점선으로 표시된 영역 C1 및 C2에 대한 단면 PA B-모드 이미지이다(scale bars: 400㎛). 도 23의 확대된 이미지(scale bars: 1㎜)에서 큰 혈관은 노란색 점선으로 강조 표시되었다. 도 22 및 도 23에서 보이는 바와 같이 이식된 SCAI 패치는 혈관신생을 유도하였고, 시간에 지남에 따라 뇌 미세혈관 구조가 변화함을 관찰할 수 있었다. 이식 14일 후, SCAI 패치 이식 부위에서 많은 미세혈관 구조가 새롭게 뻗어나가는 것을 확인할 수 있었고, 방출된 VEGF와 HGF의 시너지 효과로 인해 직경 50㎛ 이하의 새로 형성된 혈관이 많이 관찰되었다. 반면, SCAI 패치 미처리 그룹에서는 미세혈관 구조의 유의미한 변화를 관찰할 수 없었다. 도 22에서 새로 생성된 혈관에 의해 부분적으로 덮인 원래 혈관은 확대 이미지를 통해 확인할 수 있다. 숨겨진 원래 혈관은 도 22의 MAP 이미지에서 흰색 점선으로 강조 표시되어 있고, 도 22에 표시된 C1 및 C2 영역의 PA B-모드 이미지인 도 23에서 명확하게 볼 수 있었다. 도 23에서 원래 혈관과 새로 생성된 혈관의 윤곽을 각각 노란색과 흰색 곡선으로 표시하였다.
새로 형성된 혈관의 밀도에 대한 정량적 분석도 진행되었다. 도 24는 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 광학 해상도 광음향 현미경(OR-PAM) 이미지를 이용하여 SCAI 패치 처리 여부에 따른 SD 쥐의 혈관 밀도를 정량적으로 분석한 결과이다. 혈관의 밀도는 직경 50㎛ 미만의 혈관 면적과 이식된 표면적의 비율로 결정하였다. 도 24에서 보이는 바와 같이 SCAI 패치 이식 전과 이식 14일 후에 얻은 밀도를 비교했을 때, 패치 이식후 혈관 밀도는 이식 14일째에 0.0609±0.0052 ㎟/㎟에서 0.1999±0.0239 ㎟/㎟으로 약 3.3배 증가한 것으로 나타났고, 이러한 결과는 본 연구에서 제작된 SCAI 패치의 대뇌혈관신생 촉진 치료 효능을 시사한다.
본 발명의 발명자는 SCAI 패치의 혈관신생 효능을 검증하기 위해 조직학적 평가도 수행했으며, 이는 PAM 영상으로 확인한 내용과 유사한 결과를 보였다. 도 25는 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 SCAI 패치 이식 14일 후에 패치 미처리 그룹과 SCAI 패치 이식 그룹에 대한 조직학적 분석 결과를 H&E 염색 이미지와 면역조직화학(IHC) 이미지(CD 31)로 나타낸 것이다(scale bars: 50㎛). 도 25에서 확대된 이미지의 scale bars는 20㎛이다. 도 25에서 보이는 바와 같이 SCAI 패치가 이식된 그룹에서는 패치 이식 14일 후 패치 이식 부위의 주변 조직에 혈액을 공급할 수 있는 큰 혈관이 남아 있었고, 다양한 직경과 길이의 수많은 모세혈관들 역시 관찰되었다(검은색 화살표로 표시됨). 혈관 중 일부는 원래의 큰 혈관에서 뻗어나오는 양상을 보였는데, 이는 혈관신생의 명백한 증거이다(파란색 화살표로 표시). 한편, SCAI 패치 미처리 그룹에서는 큰 혈관에서 뻗어나오는 혈관의 양상을 관찰할 수 없었다. 또한, 본 발명의 발명자는 쥐 특이적 혈관 항체에 대한 면역조직화학(IHC)을 사용하여 이식된 패치의 혈관신생 효과를 교차 검증했으며 H&E 염색 결과(검은색 화살표로 표시)와 유사한 경향을 관찰했다. 또한 본 발명의 발명자는 단위 면적(1 ㎟)당 혈관 수를 세어 혈관신생 정도를 정량화하였다. 도 26은 본 연구에서 수행한 SCAI 패치 이식 후 뇌 혈관신생 거동을 평가하기 위한 In vivo 실험에서 SCAI 패치 이식 14일 후에 면역조직화학(IHC) 이미지를 이용하여 패치 미처리 그룹과 SCAI 패치 이식 그룹의 단위 면적당 혈관 수를 정량적으로 분석한 결과이다. 도 26에서 보이는 바와 같이 SCAI 패치 이식 그룹에서의 혈관 수는 167±13개이고 미처리 그룹에서의 혈관 수는 29±5개로, SCAI 패치 이식 그룹에서 1㎟당 약 5.76배 더 많은 수의 혈관이 신생되었다. 종합하면, SCAI 패치는 혈관형성 및 혈관신생을 촉진하여 생체 내에서 적어도 14일까지 치료 효능을 유지한다고 결론지을 수 있다.
3. 논의 및 결론
본 발명의 발명자는 뇌 영역에서 대뇌 혈관신생을 촉진하기 위해 두가지 혈관신생 인자를 혈관신생 단계에 따라 방출될 수 있도록 하는 유연한 패치형 약물전달 시스템을 제작하였다. 제작된 SCAI 패치의 주요 특징은 다음과 같다
(1) 패치를 성형하는데에 사용된 HAVEM 잉크는 메타크릴레이트 작용기와 아민 작용기간의 결합 밀도에 의해 방출 양상을 다양하게 조절할 수 있다.
(2) 3D 프린팅 기술을 사용하여 혈관신생 성장인자들을 시공간적으로 구획화하여 순차적적으로 서방출할 수 있다.
기존의 바이오 가공기술 전략(예: 주형 주조, 가스 발포 및 동결 건조)은 생체재료 기반 약물전달 시스템을 생산하는 데 널리 적용되었다. 그러나 이러한 방법은 필연적으로 여러 복잡한 과정을 수반할 수 밖에 없다. 본 발명의 발명자는 이를 개선하기 위해서, 3D 프린팅 기술을 적용해 물리적으로 여러 번의 공정을 거치지 않고, 단 한 번의 공정으로 공간적으로 내층과 외층이 분리된 구조의 패치를 제작하였다. 이렇게 공정 단계를 줄이게 되면, 전체적인 제작 소요 시간을 줄이게 되어 성장인자의 더 높은 생물학적 활성을 유지하는데 도움이 된다. 또한, 전통적인 접근 방식은 일반적으로 독성 용액을 처리하거나 가혹한 환경 요인(예: pH, 온도) 하에서 추가적인 프로세스가 진행되는 경우가 많다. 그 프로세스 또한 단백질 기반 약물의 안정성을 감소시킨다. 그러나 본 발명의 발명자가 제조한 HAVEM 잉크는 합성하는 과정에서는 라디칼을 비롯한 다른 화학적 활성물질을 중간 물질로 형성하지 않고, 촉매도 필요로 하지 않는 온화한 가교 조건을 가지고 있기 때문에, 이 또한 성장인자의 생체 활성 유지에 기여할 수 있다.
시공간적으로 구획화된 이중 혈관신생 인자가 있는 패치는 뇌의 혈관신생을 유도하는데 상당한 영향을 미친다. 본 발명의 발명자는 14일 동안 쥐 대뇌 피질 미세혈관의 시간 의존적 변화를 모니터링하기 위해 OR-PAM 시스템을 사용하여 생체 내 치료의 효능을 조사하였다. 이 영상화 방법은 혈관계 내에 존재하는 적혈구에 의해 생성된 PA파를 측정하여 혈관 영상을 얻기 때문에, 표지 물질을 사용할 필요가 없는 혈관 영상화 방법이다. OR-PAM 시스템을 사용하는 경우 기존의 혈관 영상 기술에 비해 더 효과적이고 비침습적인 방식으로 기능적이고 통합된 새로 형성된 혈관을 식별할 수 있다.
본 발명의 발명자가 제작한 SCAI 패치는 대뇌 허혈성 영역에서 신생혈관 가능성에 대한 추가 조사를 위한 신뢰할 수 있는 가이드 역할을 할 수 있다. 또한, 본 발명의 발명자가 제작한 서방성 혈관신생 성장인자 방출 패치 시스템은 모야모야병과 같은 난치성 만성 뇌 허혈성 질환을 표적으로 하는 치료 등에도 적용이 가능하다. 모야모야병은 내경동맥과 그 가지의 폐쇄를 특징으로 하는 진행성 폐쇄성 동맥병증이다. 모야모야병 환자의 치료는 주로 외과적 수술(직접 문합법, 간접 문합법)로 진행된다. 그러나 소아 환자들은 중대뇌동맥에 직접 문합하기 위한 표면 측두엽 동맥(STA)이 너무 얇기 때문에 직접 문합법을 시행할 수 없고, 반드시 간접적인 혈관 재생 전략, 즉 뇌경막동맥간접문합술(EDAS) 등이 소아 모야모야병의 치료 전략으로 널리 받아들여지고 있다. 이 수술법은 일반적으로 뇌척수액의 성장인자 수치와 혈관신생 능력 정도에 따라 효과가 달라지는 것으로 알려져있다. 본 발명의 발명자가 제작한 SCAI 패치는 단순히 부위 근처에 배치시키는것 만으로도 간접 수술 후 표면 측두엽 동맥(STA)와 경막 혈관 사이의 혈관신생을 촉진하는 유익한 효과를 나타낼 수 있다.
본 연구 결과는 HAVEM 잉크를 사용하여 제작된 시공간적으로 구획화된 대뇌 혈관신생 유도 패치의 뛰어난 잠재력을 강조한다. 상기 HAVEM 잉크는 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 통해 가교 밀도가 조절된 3D 프린팅용 잉크이다. 본 연구에서는 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 통해 가교 밀도가 조절된 탈세포화 세포외기질(dECM) 기반 하이브리드 잉크를 합성하였고, 하이브리드 잉크의 개선된 인쇄능을 바탕으로 3D 프린팅 기술을 사용하여 복잡한 패치 형태의 구조체를 제작하였다. 더 높은 가교 밀도를 가진 하이브리드 잉크는 더 촘촘하게 결합이 형성되어 있어서 더 작은 기공 크기를 가지며, 성장인자의 방출 속도를 효과적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 3D 프린팅 기술을 사용하면 하이브리드 잉크 내에 탑재된 성장인자의 방출을 제어할 수 있는, 물리적으로 구획화된 구조체를 제작할 수 있다. 따라서, 본 연구에서 제작된 SCAI 패치는 효과적으로 두 종류의 혈관신생 성장인자들을 지속적으로 서방출하여 허혈성 질환의 치료에 필요한 혈관생성을 유도할 수 있다. 본 연구에서 제작된 SCAI 패치 형태의 약물전달 플랫폼은 종래의 장기적 약물전달 접근법에서 발생하는 문제점들을 극복하였다. 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질(VdECM)과 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid, HAMA)을 포함하는 HAVEM 잉크로부터 형성된 패치는 실제 해당하는 조직 유래의 소재로 부드럽고 유연한 특성을 가지며 제작의 다양성을 가지고 있다. 본 연구에서 제작된 SCAI 패치는 다양한 급성 또는 만성 뇌 허혈성 질환 환자에 적용되는 경우 혈관신생을 효과적으로 유도할 수 있기 때문에 유망한 대체 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 시공간적으로 구획화된 패치에 다양한 다른 종류의 약물을 적용하거나 추가적인 약물을 탑재할 수 있는 층들을 더 형성하는 경우, 시공간적으로 구획화된 패치는 용량을 조절하여 국소적으로 약물을 전달해야하는 약물전달 플랫폼으로 효과적으로 기능할 수 있고, 허혈성 심장 질환, 당뇨병 등의 치료 및 코로나 바이러스 백신 등과 같은 다양한 용도로 사용될 수 있다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 아민기를 가지는 세포외기질 및 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산를 포함하는 하이브리드 잉크로서,
    상기 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에 형성된 화학적 결합에 의해 세포외기질 및 변성 히알루론산은 가교결합 상태에 있는 것을 특징으로 하는,
    3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외기질은 탈세포화 세포외기질인 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  3. 제2항에 있어서, 상기 탈세포화 세포외기질은 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질인 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  4. 제1항에 있어서, 상기 에틸렌성 불포화 결합 관능기는 비닐기, 아크릴기 또는 메타크릴기에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변성 히알루론산은 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid) 또는 아크릴레이트화된 히알루론산(Acrylated hyaluronic acid)에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포외기질에 존재하는 아민기와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이의 화학적 결합은 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)에 의해 형성된 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포외기질 대 변성 히알루론산의 중량비는 1:0.01 내지 1:0.8인 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 잉크 내의 세포외기질 농도는 1~10%(w/v)이고, 변성 히알루론산 농도는 0.01~8%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 성장인자(Growth factor)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  10. 제9항에 있어서, 상기 성장인자(Growth factor)는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 상피성장인자(epithermal growth factor, EGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin, EPO), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 뇌유래신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF) 인터루킨(interleukin, IL), 콜로니형성자극인자(colony-stimulating factor, CSF), 안지오포이에틴(angiopoietin, ANG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 태반성장인자(placental growth factor, PGF), 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α, TGF-α), 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 및 뼈형성단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  11. 제9항에 있어서, 상기 하이브리드 잉크 내의 성장인자 농도는 0.001~1 g/ℓ인 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크.
  12. pH가 6.5~7.5인 세포외기질 용액을 준비하는 단계; 및
    상기 세포외기질 용액에 에틸렌성 불포화 결합 관능기가 도입된 변성 히알루론산을 첨가하고 균일하게 혼합시킨 후 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)을 진행시켜 세포외기질 및 변성 히알루론산이 가교결합 상태에 있는 잉크를 수득하는 단계;를 포함하는,
    3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포외기질은 혈관 조직 유래 탈세포화 세포외기질인 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 에틸렌성 불포화 결합 관능기는 비닐기, 아크릴기 또는 메타크릴기에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 변성 히알루론산은 메타크릴레이트화된 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid) 또는 아크릴레이트화된 히알루론산(Acrylated hyaluronic acid)에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)에 의해 세포외기질에 존재하는 아민기 중 적어도 일부와 변성 히알루론산에 존재하는 에틸렌성 불포화 결합 관능기 사이에 화학적 결합이 형성된 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 변성 히알루론산은 세포외기질 100 중량부 대비 1~80 중량부의 양으로 세포외기질 용액에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 세포외기질 용액 내의 세포외기질 농도는 1~10%(w/v)이고, 변성 히알루론산은 세포외기질 용액에 0.01~8%(w/v)의 농도가 되게 첨가되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 아자-마이클 첨가 반응(aza-Michael addition reaction)은 1~10℃의 온도 조건에서 2~24 hr 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 잉크에 성장인자(Growth factor)를 첨가하고 혼합하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 성장인자(Growth factor)는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 상피성장인자(epithermal growth factor, EGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin, EPO), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 뇌유래신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF) 인터루킨(interleukin, IL), 콜로니형성자극인자(colony-stimulating factor, CSF), 안지오포이에틴(angiopoietin, ANG), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 태반성장인자(placental growth factor, PGF), 형질전환성장인자-α(transforming growth factor-α, TGF-α), 형질전환성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 및 뼈형성단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 성장인자는 잉크에 0.001~1 g/ℓ의 농도가 되게 첨가되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 세포외기질 기반 하이브리드 잉크 제조방법.
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