KR20230093044A - 인간 만능 줄기 세포로부터의 cd4+ 이펙터 및 조절 t 세포의 생성 - Google Patents

인간 만능 줄기 세포로부터의 cd4+ 이펙터 및 조절 t 세포의 생성 Download PDF

Info

Publication number
KR20230093044A
KR20230093044A KR1020237017648A KR20237017648A KR20230093044A KR 20230093044 A KR20230093044 A KR 20230093044A KR 1020237017648 A KR1020237017648 A KR 1020237017648A KR 20237017648 A KR20237017648 A KR 20237017648A KR 20230093044 A KR20230093044 A KR 20230093044A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
population
treg
gene
Prior art date
Application number
KR1020237017648A
Other languages
English (en)
Inventor
헬렌 퐁
앤서니 콘웨이
매튜 씨. 멘델
Original Assignee
상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20230093044A publication Critical patent/KR20230093044A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Gyroscopes (AREA)
  • Permanent Magnet Type Synchronous Machine (AREA)
  • Control Of Eletrric Generators (AREA)

Abstract

CD4-양성 이펙터 T 세포 및 조절 T 세포를 생성하기 위한 개선된 방법 및 조성물, 및 그의 사용 방법이 본원에 제공된다.

Description

인간 만능 줄기 세포로부터의 CD4+ 이펙터 및 조절 T 세포의 생성
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2020년 10월 28일에 출원된 미국 가출원 63/106,591을 우선권 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
건강한 면역계는 균형을 이루는 것이다. 적응 면역에 관여하는 세포는 B 및 T 림프구를 포함한다. 2가지 일반적인 유형의 T 림프구 - 이펙터 T 세포 (Teff) 및 조절 T 세포 (Treg)가 있다. 2가지 일반적인 유형의 이펙터 T 세포 - T 헬퍼 (Th) 세포 및 세포독성 T 세포 (CTL)가 있다. CD4를 발현하는 이펙터 T 세포는 전형적으로 Th 세포로서 기능하는 반면에 (CD4+ 이펙터 T 세포), CD8을 발현하는 이펙터 T 세포는 전형적으로 CTL로서 기능한다 (CD8+ 이펙터 T 세포). Th 세포는 Th1, Th2, 및 Th17 세포를 포함한다. Th 세포 이외에, 비통상적인 T 세포 (예를 들어, NK T 세포, 감마/델타 T 세포, 및 점막-연관 불변 T 세포)가 또한 CD4를 발현할 수 있다. 다른 고유한 유형의 T 림프구 - Treg -는 일반적으로 CD4를 발현하는 것으로 공지되어 있다. Treg 세포는 이펙터 T (Teff) 세포를 조절하고, 과도한 면역 반응 및 자가면역을 방지한다 (예를 들어, 문헌 [Romano et al., Front Imm. (2019) 10:43] 참조). 전통적으로 정의된 Treg는 CD4+이지만, 또한 CD8+ Treg가 기재되어 있다 (문헌 [Yu et al., Oncology Letters (2018) 15:6]).
Teff 세포는 항원 챌린지 후의 세포-매개 면역에서 중추적인 역할을 하고, 나이브, 기억, 줄기 세포 기억, 또는 최종적으로 분화 이펙터 T 세포를 포함할 수 있다. Teff 세포는, 항원을 경험하였고 이펙터 기능 (예를 들어, "헬퍼" 및/또는 세포성 면역 반응을 촉진하는 시토카인 또는 인자를 분비함)을 수행하고 있는 나이브 T 세포로부터 분화한다. 기억 또는 줄기 세포 기억 T 헬퍼 세포가 또한 존재할 수 있으며, 이는 또한 이어서 후속적으로 헬퍼 T 이펙터 세포로 재분화하여 이펙터 기능을 수행할 수 있다.
일부 Treg는 흉선에서 생성되고; 이들은 천연 Treg (nTreg) 또는 흉선 Treg (tTreg)로 공지되어 있다. 다른 Treg는 항원 접촉 후 주변부에서 또는 세포 배양물에서 생성되고, 유도 Treg (iTreg) 또는 적응 Treg로 공지되어 있다. Treg는, 특이적 세포 표면 수용체를 수반하는 세포-대-세포 접촉 및 억제 시토카인, 예컨대 IL-10, TGF-β 및 IL-35의 분비를 통해 관용을 유도하는 것을 포함하여 다른 면역 세포의 증식 및 활성화를 능동적으로 제어한다 (문헌 [Dominguez-Villar and Hafler., Nat Immunol. (2018) 19:665-73]). 관용의 실패는 자가면역 및 만성 염증으로 이어질 수 있다. 관용의 상실은 Treg 기능의 결함 또는 불충분한 Treg 수에 의해, 또는 비반응성 또는 과다활성화된 Teff에 의해 유발될 수 있다 (문헌 [Sadlon et al., Clin Transl Imm. (2018) 7:e1011]).
최근 수년간, 질환을 치료하기 위한 Treg의 사용에 대한 많은 관심이 있었다. 자가면역 질환을 치료하기 위해 Treg 수 및 기능을 부스팅하기 위한 입양 세포 요법을 비롯한 여러 접근법이 연구되었다. Treg 전달 (Treg의 활성화 및 확장된 집단을 전달함)은 자가면역 질환, 예컨대 제I형 당뇨병, 피부 홍반성 루푸스 및 크론병을 갖는 환자에서 및 기관 이식에서 시험되었다 (상기 문헌 [Dominguez-Villar]; 문헌 [Safinia et al., Front Immunol. (2018) 9:354]).
CD4+ Teff 세포는 또한 입양 세포 요법에 대한 관심을 증가시켰다. CD4+ Teff는 특이적 수지상 세포 및 다른 항원-제시 세포 (APC)를 통한 항종양 또는 항병원체 (예를 들어, 항바이러스) 프라이밍 동안 CTL의 반응의 크기 및 품질을 최적화함으로써 CD8+ CTL의 기능을 증진시키는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Borst et al., Nat Rev Immunol. (2018) 18:635-47]). CD4+ Teff는 또한 HIV의 질환 모델에서 치료상 유용한 것으로 밝혀졌다 (문헌[Maldini et al., Mol Ther. (2020) 28(7):1585-99]). T 여포성 헬퍼 세포 (Tfh)는 B 세포 반응을 증진시킴으로써 치료 가능성을 나타낸 CD4+ Teff의 추가의 하위세트이다 (문헌 [Kamphorst et al., Immunotherapy (2013) 5(9):975-98]).
현재, 세포 요법을 위한 CD4+ Teff 및 Treg의 유일한 공급원은 성인 또는 청소년 1차 혈액 (예를 들어, 전혈 또는 분리반출술 생성물) 및 조직 (예를 들어, 흉선)이다. 이들 공급원으로부터의 CD4+ Teff 및 Treg의 단리는 침습적이고 시간-소모적이며, 단지 소수의 세포, 특히 Treg를 생성한다. 추가로, 이들 공급원으로부터 수득된 CD4+ Teff 및 Treg는 사실상 폴리클로날이고, 그의 잠재적 면역억제 반응에서 가변성을 도입할 수 있다. Treg의 수를 단순히 증가시키는 것이 질환을 제어하는 데 충분하지 않을 수 있다는 증거가 또한 존재한다 (문헌 [McGovern et al., Front Immunol. (2017) 8:1517]).
따라서, 대량으로 항원-특이적 CD4+ Teff 및 Treg 세포, 특히 유전자 조작된 것을 효율적으로 수득할 필요가 남아있다.
본 개시내용은 CD4+CD8+ 미성숙 T 세포의 출발 집단을 제공하는 단계, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신 (I)을 포함하는 배지에서 세포의 집단을 배양하고, 그에 의해 CD4 단일 양성 T 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, CD4+ T 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD4 단일 양성 T 세포는 미성숙 CD4+ T 세포이고, 임의로 여기서 T 세포는 ThPOK를 발현한다. 특정 실시양태에서, 미성숙 CD4+ T 세포는 이펙터 T (Teff) 세포이고, 임의로 여기서 Teff 세포는 CD25저이다.
일부 실시양태에서, 배양 배지는 약 0.00625 내지 약 0.1 μg/ml PMA 및 약 0.125 내지 약 2 μg/ml의 이오노마이신을 포함한다. 추가 실시양태에서, 배양 배지는 0.00625 μg/ml PMA 및 0.125 μg/ml의 이오노마이신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지 내의 PMA 대 이오노마이신의 중량비는 약 1:10 내지 1:1000 (예를 들어, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200 1:250, 또는 1:500)이다. 특정 실시양태에서, 비는 1:20이다.
일부 실시양태에서, CD4+CD8+ T 세포의 출발 집단은 배지에서 약 1 내지 5일 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD4+CD8+ T 세포의 출발 집단을 제공하는 단계, 세포의 집단을 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신 (I)을 포함하는 배지에서 배양하고, 그에 의해 CD4 단일 양성 T 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 단계, CD4 단일 양성 T 세포를 IL-2, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체, 및 항-CD28 항체를 포함하는 제2 배지에서 (예를 들어, 약 5-10일 동안) 배양하고, 그에 의해 CD4+ 조절 T (Treg) 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, CD4+ T 세포가 풍부한 세포 (예를 들어, 인간 세포)의 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 제2 배지는 TGF-β 및 올 트랜스-레티노산 (ATRA, all trans-retinoic acid)을 추가로 포함한다. 제2 배지는 또한 IL-2가 첨가된 T 세포-특이적 배지로 구성될 수 있고; 추가 실시양태에서, 제2 배지는 TGF-β, ATRA, IL-2, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체, 및 항-CD28 항체 중 하나 이상이 첨가된 T-세포 특이적 배지로 구성된다.
일부 실시양태에서, CD4 단일 양성 Teff 또는 CD4 단일 양성 및 CD25 양성 Treg 세포는, 예를 들어 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 자기-활성화 세포 분류 (MACS)에 의해 조직 배양물로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4 단일 양성 Teff 또는 CD4+CD25+CD127저 Treg 세포는 FACS에 의해 조직 배양물로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4+CD25고CD127저 및 CD4+CD25저CD127저 Treg 세포는 FACS에 의해 조직 배양으로부터 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, CD4+CD8+ T 세포의 집단은 인간 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 예를 들어 T 세포로부터 재프로그램화된 iPSC로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, iPSC는 게놈 내에 이종 서열을 포함하며, 여기서 이종 서열은 계열 수임 인자 (예를 들어, FOXP3, 헬리오스(Helios), 또는 ThPOK)를 코딩하는 트랜스진을 포함하고, 여기서 계열 수임 인자는 (i) iPSC의 CD4+ Teff 세포로의 분화를 촉진하거나 또는 (ii) iPSC의 CD4+ Treg 세포로의 분화를 촉진하거나 또는 CD4+ Treg 세포의 표현형의 유지를 촉진한다. 추가 실시양태에서, 이종 서열은 T 세포 특이적 유전자좌 (예를 들어, T 세포 수용체 알파 불변 또는 TRAC 유전자좌) 내로 통합되어 트랜스진의 발현이 상기 유전자좌에서 전사-조절 요소의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 이종 서열은 TRAC 유전자좌의 엑손 1, 2 또는 3 내로 통합된다.
추가 실시양태에서, 트랜스진은 추가의 폴리펩티드 (예를 들어, 또 다른 계열 수임 인자, 치료 단백질, 또는 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체)에 대한 코딩 서열을 포함하며, 여기서 계열 수임 인자에 대한 코딩 서열 및 추가의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 자기-절단 펩티드에 대한 인-프레임 코딩 서열에 의해 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 이종 서열은 T 세포 특이적 유전자좌에서 엑손 내로 통합되고, 트랜스진의 바로 상류에 있는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES); 또는 트랜스진의 바로 상류 및 트랜스진과 인-프레임인 자기-절단 펩티드에 대한 제2 코딩 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 이종 서열은 IRES 또는 자기-절단 펩티드에 대한 제2 코딩 서열의 바로 상류에 통합 부위의 하류에 있는 T 세포 특이적 유전자좌의 모든 엑손 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 이에 따라 T 세포 특이적 유전자좌가 무손상 T 세포 특이적 유전자 산물을 발현할 수 있도록 유지된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 FOXP3에 대한 코딩 서열, 헬리오스에 대한 코딩 서열, 및/또는 ThPOK의 코딩 서열을 포함하며, 여기서 이들 코딩 서열은 인-프레임이고, 자기-절단 펩티드에 대한 인-프레임 코딩 서열에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 세포의 출발 집단은 부류 II 주요 조직적합성 복합체 전사활성인자 (CIITA) 유전자, HLA 부류 I 또는 II 유전자, 항원 프로세싱 연관 수송체, 부 조직적합성 항원 유전자, 및 β2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자로부터 선택된 유전자 내의 널(null) 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 출발 집단은 HSV-TK 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 시토크롬 P450 유전자 또는 카스파제-9 유전자로부터 임의로 선택된 자살 유전자를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 본 방법에 의해 수득된 CD4 단일 양성 세포가 풍부한 세포의 집단 또는 CD4+ Teff 세포가 풍부한 세포의 집단을 제공한다. 관련 측면에서, 본 개시내용은, 본원에서 수득된 CD4+ Teff 세포가 풍부한 세포의 집단을 투여하는 것을 포함하는, 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법; 치료 방법에서의 의약의 제조를 위한 본원에서 수득된 CD4+ Teff 세포가 풍부한 세포의 집단의 용도; 및 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에서 수득된 CD4+ Teff 세포가 풍부한 세포의 집단을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 수득된 CD4+ Treg 세포가 풍부한 세포의 집단을 제공한다. 관련 측면에서, 본 개시내용은, 본 방법에 의해 수득된 CD4+ Treg 세포가 풍부한 세포의 집단을 투여하는 것을 포함하는, 면역억제를 필요로 하는 환자의 치료 방법; 면역억제를 필요로 하는 환자의 치료에서의 의약의 제조에서 본 방법에 의해 수득된 CD4+ Treg 세포가 풍부한 세포의 집단의 용도; 및 면역억제를 필요로 하는 환자의 치료에 사용하기 위한 본 방법에 의해 수득된 CD4+ Treg 세포가 풍부한 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 자가면역 질환을 갖거나; 또는 조직 이식을 받았거나 받을 것이다.
본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시양태 및 측면을 나타내지만, 제한이 아니라 단지 예시로서 주어지는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
도 1은 iPSC로부터 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 림프성 전구 세포, 이중 양성 (DP) T 세포, CD4 단일 양성 (CD4sp) T 세포, CD4 Th 세포 및 Treg를 생성하는 데 사용된 과정을 도시한 다이어그램이다. 림프성 전구 세포: CD5+CD7+. 이중 양성: CD4+CD8+. 단일 양성: CD4+ 또는 CD8+.
도 2는 IL-2와 함께 T 세포-특이적 배지 ("T 세포 배지")의 존재 하에 배양된 iPSC로부터 Treg를 생성하는 과정을 도시한 다이어그램이다.
도 3 및 4는 제35일 (도 3) 또는 제42일 (도 4)에 첨가될 때 DP T 세포의 CD4sp 세포로의 분화를 촉진하는 PMA 및 이오노마이신 (PMAI)의 능력을 평가하는 유동 세포측정 플롯의 패널이다. PMAI를 다양한 농도로 첨가하였고, 더 낮은 농도 (0.125X, 0.25X, 0.50X, 1X, 또는 2X)가 더 많은 CD4sp 세포를 생산하였다. 연속 희석된 PMAI의 성분을 표 A에 나타낸다.
도 5는 PMAI-유도된 CD4sp T 세포에서의 CD4 분자의 재발현을 입증하는 그래프의 패널이다. 세포를 증가하는 농도의 프로나제 효소 (비처리, 0.02%, 0.04%, 0.08%, 0.1%)로 처리하여 CD4를 스트리핑하고, 각각 4℃ 또는 37℃에서 인큐베이션하여 CD4 재-발현을 막거나 또는 허용하였다. CD4 MFI (평균 형광 강도)를 프로나제 처리 1 또는 2일 후에 측정하였다. 막대 그래프 (좌측)는 4℃에서의 세포에 비해 37℃에서 2일 배양한 후의 CD4 MFI의 증가를 나타내고, 유동 플롯 (우측)은 4℃에서의 세포와 비교하여 0.1% 농도에서의 CD4 재발현을 입증한다.
도 6a 및 6b는 TGF-β1, ATRA, IL-2 및 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자로 처리된 PMAI-유도된 CD4sp T 세포에서의 Treg 마커의 발현을 나타내는 유동 세포측정 히스토그램의 패널이다. 다양한 농도의 PMAI를 제35일 (도 6a) 또는 제42일 (도 6b)에 첨가하여 CD4sp T 세포를 유도하였다. FOXP3, 헬리오스, CTLA-4, GARP 및 LAP의 발현을 검사하였다.
도 7은 활성화된 PMAI-유도된 및 TGF-β1-처리된 CD4sp T 세포 (iPSC-Treg)에서의 Treg 마커의 발현을 나타내는 유동 세포측정 히스토그램의 패널이다. FOXP3, 헬리오스, CTLA-4, GARP 및 LAP의 발현을 검사하였다.
도 8은 반응자 T 세포의 증식에 대한 0.125X PMAI-유도된 및 TGF-β1-처리된 iPSC-Treg의 억제 능력을 나타내는 유동 세포측정 히스토그램의 패널이다. Tresp: 반응자 T 세포.
도 9는 TGF-β, ATRA, IL-2, 및 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자로 처리된 PMAI-유도된 CD4sp T 세포에서의 Treg 마커의 발현을 나타내는 유동 세포측정 플롯 및 히스토그램의 패널이다. CD4sp T 세포를 100% 스템스팬(StemSpan)™ T 세포 성숙 배지 (성숙) 또는 IL-2의 추가의 보충을 갖는 성숙 및 T 세포-특이적 배지의 50% 혼합물에서 분화시켰다. 보충 IL-2 및 CD3/CD28/CD2 활성화인자를 갖지만 TGFB 및 ATRA는 갖지 않는 성숙 및 T 세포-특이적 배지의 50% 혼합물에서 분화된 CD4sp T 세포를 대조군으로서 사용하였다. CD4, CD8, CD25, CD127 및 FOXP3의 발현을 검사하였다. FOXP3의 발현을 CD4spCD127저CD25고 및 CD4spCD127저CD25저 세포에서 검사하였다.
도 10은 CD25 고 및 CD25 저 iPSC-Treg를 분류하는데 사용된 분류 전략을 도시한 유동 세포측정 그래프의 패널이다. CD4, CD8, CD25, 및 CD127의 발현을 결정하여 분류용 게이트를 위치시켰다.
도 11은 비활성화 및 활성화 CD25고 및 CD25저 분류된 iPSC-Treg에서의 Treg 마커의 발현을 나타내는 유동 세포측정 플롯의 패널이다. CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD69 및 GARP의 발현을 검사하였다.
도 12는 비활성화 및 활성화 CD25고 및 CD25저 분류된 iPSC-Treg에서의 Treg 마커의 발현을 나타내는 유동 세포측정 그래프의 패널이다. FOXP3, 헬리오스, CTLA-4, 및 LAP의 발현을 검사하였다.
도 13은 반응자 T 증식에 대한 분류된 iPSC-Treg 또는 iPSC-CD4sp T 세포의 억제 능력을 나타내는 그래프의 패널이다. iPSC-Treg 또는 iPSC-CD4sp T 세포를 반응자 T 세포와 1:1까지 증가하는 농도로 공동배양하였다 (Treg: 반응자 T) (n=3).
도 14는 2개의 상이한 클론으로부터의 iPSC-유래 Treg 내의 FOXP3 Treg-특이적 탈메틸화 영역 (TSDR)에서 탈메틸화된 세포의 백분율을 도시한다. 메틸화를 PMAI 및 TGF-β1로 처리 후 iPSC-Treg에서 (패널 A), 0.125X PMAI 단독으로의 처리 후 CD4sp 세포에서, 및 1차 Treg 및 반응자 T 세포 (Tresp) 대조군에서 (패널 B) 결정하였다. FOXP3의 발현을 또한 PMAI 및 TGF-β1-처리된 세포에서 유동 세포측정법에 의해 검사하였다 (패널 C).
도 15는 표적 세포 (Treg) 및 비-표적 세포 (통과액)에서의 사멸 세포의 제거 전 (피콜 전) 및 후 (피콜 후) 및 Treg 풍부화 후 iPSC-유래 Treg에서의 FOXP3 TSDR에서 탈메틸화된 세포의 백분율을 도시한다 (패널 A). 패널 B는 사멸 세포 제거 및 Treg 풍부화 후 iPSC-Treg에서의 FOXP3의 발현을 입증하는 유동 세포측정 플롯을 도시한다.
도 16은 분류된 iPSC-Treg에서 FOXP3 Treg-특이적 탈메틸화 영역 (TSDR)에서 탈메틸화된 세포의 백분율을 도시한다. 메틸화는 CD25고, CD25저 iPSC-Treg, 및 벌크 비분류 집단에서 결정하였다. 1차 Treg 및 Tresp를 대조군으로서 사용하였다.
도 17a-c는 Treg를 생성하는 다양한 유형의 T 세포 자극의 능력을 도시한 유동 세포측정 플롯의 패널이다. 성숙 CD4+ T 세포 (도 17a), Treg (도 17b), 및 나이브 Treg (도 17c)에 대한 마커를 검사하였다.
도 18은 TGF-β1 및 ATRA 처리 후에 DP T 세포로부터 CD4sp T 세포를 생성한 후 iPSC-Treg를 생성하는 다양한 농도의 PMAI의 능력을 도시한 유동 세포측정 플롯의 패널이다.
도 19는 하나 이상의 Treg 수임 (또는 유도) 인자 ("TF")를 코딩하는 트랜스진을 인간 TRAC 유전자의 엑손 2 내로 통합시키는 게놈 편집 접근법을 도시한 개략적 다이어그램이다. 도입된 mRNA로부터 생성된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)는 엑손 2의 특정 부위 (번개 표시)에서 이중-가닥 파괴를 만든다. 아데노-관련 바이러스 (AAV) 6 벡터에 의해 도입된 공여자 서열은 5'에서 3'으로 상동성 영역 1; 자기-절단 펩티드 T2A에 대한 코딩 서열; 제1 TF, 자기-절단 펩티드 P2A, 제2 TF2, 자기-절단 펩티드 E2A 및 제3 TF3의 융합체에 대한 코딩 서열; 폴리-아데닐화 (폴리A) 신호 서열; 및 상동성 영역 2를 함유한다. 상동성 영역은 ZFN 절단 부위에 플랭킹된 게놈 영역과 상동성이다. 통합 부위의 상류에 있는 TRAC 엑손 2 부분, T2A 코딩 서열, 및 TF 코딩 서열(들)은 서로 인-프레임이다. 이러한 접근법 하에, TRAC 단백질의 발현은 트랜스진 통합의 결과로서 녹아웃된다. 통합된 서열의 발현은 내인성 TCR 알파 쇄 프로모터에 의해 조절된다.
도 20은 도 19에 도시된 것과 유사한 게놈 편집 접근법을 도시한 개략적 다이어그램이지만, 여기서 이종 서열은 통합 부위의 하류에 있는 TRAC 엑손 서열 (즉, 통합 부위에 대해 3'에 있는 엑손 2 서열 및 엑손 3 서열)을 포괄하는 부분 TRAC cDNA를 포함한다. 이러한 부분 TRAC cDNA는 T2A 코딩 서열의 바로 상류에 그와 인-프레임으로 위치하여, 조작된 유전자좌가 내인성 TCR 알파 쇄 프로모터 하에 무손상 TCR 알파 쇄 및 TF(들)를 발현하게 한다.
도 21은 하나 이상의 수임 인자를 코딩하는 트랜스진을 통합하기 위한 또 다른 게놈 편집 접근법을 도시한 개략적 다이어그램이다. 이러한 접근법에서, 트랜스진은 게놈 세이프 하버 내로 통합된다. 이 도면에서, 트랜스진은 인간 AAVS1 유전자좌의 인트론 1 내로 삽입되고, 독시시클린 (Dox) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. SA: 스플라이스 수용자. 2A: 자기-절단 펩티드 2A에 대한 코딩 서열. PuroR: 퓨로마이신-저항성 유전자. TI: 표적화된 통합.
도 22는 도 21에 개략화된 개략도를 사용하여 편집된 세포로부터 생성된 데이터를 나타내는 그래프의 패널이다. 트랜스진은 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩한다. Puro: 퓨로마이신. Dox: 독시시클린. Puro: 퓨로마이신.
도 23은 하나 이상의 수임 인자를 코딩하는 트랜스진이 인간 AAVS1 유전자의 인트론 1 내로 통합되는 게놈 편집 접근법을 도시한 개략적 다이어그램이다. 게놈 내로 통합된 이종 서열은 CAR-코딩 서열을 포함한다. Treg 분화가 달성되면, (2개의 LoxP 부위 사이에 위치하는) 수임 인자를 코딩하는 트랜스진을 절제하여 통합 부위에 CAR 발현 카세트만을 남긴다.
도 24는 하나 이상의 수임 인자를 코딩하는 트랜스진을 인간 TRAC 유전자의 엑손 2 내로 통합시키는 게놈 편집 접근법을 도시한 개략도이다. 이러한 접근법에서, 게놈 내로 통합된 이종 서열은 CAR-코딩 서열을 포함한다. Treg 분화가 달성되면, (2개의 LoxP 부위 사이에 위치하는) 수임 인자를 코딩하는 트랜스진을 절제하여 통합 부위에 CAR 발현 카세트만을 남긴다.
도 25는 단일 재배열된 TCR을 갖는 성숙 Treg를 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)로 재프로그램화하는 과정을 도시한 개략적 다이어그램이다. 확장 후, iPSC는 Treg 표현형으로 다시 재분화된다. 여기서 TCR은 동종-항원이 아닌 항원을 표적화한다.
도 26은 iPSC가 Treg로 분화하는 과정을 도시한 개략적 다이어그램이다. HSC: 조혈 줄기 세포. 단일 양성: CD4+ 또는 CD8+. 이중 양성: CD4+CD8+.
도 27은 IL-7 수용체의 알파 유닛 (IL-7Ra)에 대한 항체를 조직 배양 배지에 도입하면 iPSC-유래 전구 T 세포의 분화가 CD8 단일 양성 세포 형성 (4분면의 좌측 상단)에서 CD4 단일 양성 세포 형성 (4분면의 우측 하단)으로 편향된다는 것을 입증하는 세포 분류 그래프의 패널이다. 항체를 조직 배양 배지에 3가지 농도 (저, 중, 및 고)로 첨가하였다. 이러한 효과는 2개의 별개의 실험 (Expt. #1 및 Expt. #2)에서 나타났다.
도 28은 iPSC를 Treg로 분화시키는 다수의 과정을 도시한 개략적 다이어그램이다. 세포를 림프구 분화 코팅 물질 (피더 비의존성) 상에서, 또는 OP9 기질 세포 또는 OP9-DLL1 기질 세포 (노치(Notch) 리간드, 델타-유사 1을 발현하는 OP9 세포) 기질 세포 (피더 의존성)와 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 도 26에 도시된 바와 같이 추가로 배양하여 Treg로의 분화를 촉진시킨다. 대안적 경로에서, 3차원 배아 중배엽 유사기관 (EMO)은 iPSC를 MSS-DLL1/4 또는 EpCAM-CD56+ 기질 세포와 공동-배양함으로써 형성되고; EMO의 조혈 유도 후, 인공 흉선 유사기관 (ATO)이 형성되고, 이는 흉선으로 선택된 Treg와 보다 유사한 TCR 레퍼토리를 갖는 성숙 Treg를 생성하도록 유도된다.
본 개시내용은 줄기 세포, 예컨대 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 및 조혈 전구 세포의 CD4+ 이펙터 및/또는 조절 T 세포로의 분화를 촉진하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 흉선 내에서 천연 CD4+ Teff 및/또는 Treg 발생을 모방하는 정도로, 예를 들어 증가된 세포내 칼슘 유동을 통해 단백질 키나제 C (PKC) 경로 및/또는 다른 T 세포 신호전달 경로 (예를 들어, TCR 활성화 경로)를 활성화시킴으로써 줄기 및 전구 세포 (예를 들어, iPSC, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 림프성 전구 세포, 또는 미성숙 전구 T 세포)로부터 CD4+ T 세포를 생성하기 위한 조직 배양 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 조직 배양 방법은 의도된 발생 경로를 촉진하기 위해 소분자 및 생물학적 인자를 이용한다. 본 방법은 iPSC로부터 CD4 단일 양성 (CD4sp) T 세포를 생성할 수 있고, 이는 억제 기능을 갖는 CD4sp 이펙터 T 세포 및 FOXP3+ Treg-유사 세포로 추가로 성숙될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 줄기 및 전구 세포의 CD4+ Teff 및 Treg로의 분화를 추가로 촉진하기 위한 유전자 조작 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 방법에서, 모 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포 계열 수임 인자 (예를 들어, 가타(Gata)3 및 ThPOK) 및/또는 Treg 계열 수임 인자 (예를 들어, FOXP3, 헬리오스, 이카로스(Ikaros))를 과다발현하도록 (즉, 정상적으로 세포보다 더 높은 수준으로 발현하도록) 유전자 조작된다. 이들 인자는 조작된 줄기 및/또는 전구 세포의 의도된 세포 유형으로의 분화를 용이하게 한다.
본 방법에 의해 수득된 CD4+ Teff 및 Treg 세포는 자가 또는 동종일 수 있고, 세포-기반 요법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Teff 세포는 증진된 면역을 필요로 하는 환자, 예컨대 암 또는 감염 (예를 들어, 바이러스 감염)을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. Treg 세포는 면역 관용의 유도 또는 면역 항상성의 회복을 필요로 하는 환자, 예컨대 기관 이식 또는 동종 세포 요법을 받는 환자 및 자가면역 질환을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 Teff 및 Treg 세포는 이들이 모노클로날일 수 있기 때문에 개선된 치료 효능을 가질 것이며, 이는 과거 T 세포 요법에서 폴리클로날성에 의해 유발된 가변성을 회피한다. 추가로, Teff 및 Treg 세포는 그의 항원 특이성에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, Teff 및 Treg 세포는, T 세포가 요구되는 생체내 부위에서 항원에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR) 또는 편집된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시켜 TCR 또는 CAR이 T 세포를 상기 부위 (예를 들어, Treg 세포에 대한 염증 부위, 또는 Teff 세포에 대한 종양 부위)로 향하게 하고, 그에 의해 세포의 효력을 증진시키기 위해 선택될 수 있다.
본 발명의 Teff 및 Treg 세포는 자가-재생 속성 및 만능성 (예를 들어, iPSC) 또는 다능성 (예를 들어, HSPC, 림프성 전구 세포, 또는 미성숙 전구 T 세포)을 갖는 세포 집단으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 1차 T 세포와 비교하여, 본 발명의 CD4sp Teff 및 Treg는 1차 CD4sp Teff 및 Treg에 비해 종양학, 감염성 질환, 자가면역 및 염증성 질환, 및 다른 치료 용도에 사용하기 위한 비교적 저비용의 입양 세포 요법을 생성할 잠재력을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "CD4+ 이펙터 T 세포" 및 "CD4+ Teff"는 표현형 CD4+CD25저에 의해 표시된 T 림프구의 하위세트를 지칭한다. 이들은 높은 수준의 CD25를 발현하는 것으로 공지된 Treg를 포함하지 않는 CD4+ T 세포의 하위세트이다.
본원에 사용된 용어 "조절 T 세포", "조절 T 림프구" 및 "Treg"는 면역계를 조정하고, 자기-항원에 대한 관용을 유지하고, 일반적으로 T 이펙터 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 또는 하향조절하는 T 세포의 하위집단을 지칭한다. Treg 표현형은 부분적으로 마스터 전사 인자 포크헤드 박스 P3 (FOXP3)의 발현에 의존하며, 이는 면역 억제 기능에 필수적인 유전자의 네트워크의 발현을 조절한다 (예를 들어, 문헌 [Fontenot et al., Nature Immunology (2003)4(4):330-6] 참조). Treg는 종종 CD4+CD25+CD127loFOXP3+의 표현형으로 표시된다. 일부 실시양태에서, Treg는 또한 CD45RA+, CD62Lhi, 헬리오스+, 및/또는 GITR+이다. 특정한 실시양태에서, Treg는 CD4+CD25+CD127loCD62L+ 또는 CD4+CD45RA+CD25hiCD127lo로 표시된다.
I. 만능 및 다능 세포로부터 CD4+ Teff 및 Treg 세포를 생성하기 위한 조직 배양 방법
CD4+ Teff 및 Treg 세포의 생성을 위한 출발 세포 집단은 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포, 가축 (예를 들어, 소, 돼지 또는 말)으로부터의 세포, 및 애완동물 (예를 들어, 고양이 또는 개)로부터의 세포이다. 세포는 만능 줄기 세포 (PSC)일 수 있다. 만능 줄기 세포 (PSC)는 무한정 확장되어 인체 내에서 임의의 세포 유형을 발생시킬 수 있다. PSC는 치료 용도를 위한 다수의 분화 세포를 생산하기 위한 이상적인 출발 공급원을 나타낸다. PSC는, 예를 들어 배아 줄기 세포 (ESC), 체세포 핵 전달에 의해 유래된 PSC, 및 유도된 PSC (iPSC)를 포함한다. 예를 들어, iPSC를 T 세포로 분화시키기 위해 문헌 [Iriguchi and Kaneko, Cancer Sci. (2019) 110(1):16-22]을 참조한다. 본원에 사용된 용어 "배아 줄기 세포"는 초기 배아로부터 수득된 만능 줄기 세포를 지칭하고; 일부 실시양태에서, 이 용어는 이전에 확립된 배아 줄기 세포주로부터 수득된 ESC를 지칭하고, 인간 배아의 최근 파괴에 의해 수득된 줄기 세포는 배제한다.
다른 실시양태에서, 출발 세포 집단은 다능 세포, 예컨대 중배엽 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 골수 또는 제대혈로부터 단리된 것), 또는 조혈 전구 세포 (예를 들어, 림프성 전구 세포)일 수 있다. 다능 세포는 하나 초과의 세포 유형으로 발달할 수 있지만, 세포 유형 잠재력에 있어 만능 세포보다 제한적이다. 다능 세포는 확립된 세포주로부터 유래되거나 또는 인간 골수 또는 제대로부터 단리될 수 있다. 예로서, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF)-유도된 가동화, 플레릭사포르-유도된 가동화 또는 그의 조합 후에 환자 또는 건강한 공여자로부터 단리될 수 있다. 혈액 또는 골수로부터 HSC를 단리하기 위해, 원치않는 세포에 결합하는 항체, 예컨대 CD4 및 CD8 (T 세포), CD45 (B 세포), GR-1 (과립구), 및 Iad (분화된 항원-제시 세포)에 대한 항체에 의해 혈액 또는 골수 내의 세포를 패닝할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Inaba, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702] 참조). 이어서, HSC는 CD34에 대한 항체에 의해 양성 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 출발 세포 집단은 인간 체세포, 예컨대 섬유모세포 또는 성숙 T 세포, 예컨대 Treg (문헌 [Takahashi et al. (2007) Cell 131(5):861-72]), 예컨대 비-동종 항원을 표적으로 하는 TCR을 발현하는 성숙 Treg로부터 재프로그램화된 인간 iPSC이다. 도 25 및 하기 추가의 논의를 참조한다.
본 개시내용은 PSC, 예컨대 유도된 PSC (iPSC)로부터 CD4+ Teff 및 Treg 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 다능 세포, 예컨대 중배엽 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 림프성 전구 세포로부터 Treg 세포를 생성하는 방법이 본 개시내용에 포함된다. 다능 줄기 세포 및 조직 전구 세포를 포함한 다능 세포는 만능 세포와 비교하여 상이한 세포 유형으로 분화하는 그의 능력에 있어 보다 제한적이다.
본 방법에서, 만능 또는 다능 세포는 PKC 경로 및/또는 다른 T 세포 신호전달 경로 (예를 들어, TCR 활성화 경로)를 활성화시킴으로써 CD4+ T 세포 (Teff 및 Treg 포함)로 분화될 수 있다. 이러한 활성화는 흉선 내에서의 천연 CD4+ Teff 및/또는 Treg 발생을 모방한다. 이들 경로의 활성화는 경로의 효능제로서 작용하는 소분자 및/또는 거대분자의 존재 하에 CD4+CD8+ 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 이러한 효능제의 예는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA; PKC 활성화의 경우); 이오노포어 이오노마이신 (세포내 칼슘 수준의 증진 및 칼시뉴린 및 NFAT 탈인산화의 증가의 경우); Src 키나제 억제제 (Lck 활성의 차단의 경우; 예를 들어 JNJ 10198409, A 419259 트리히드로클로라이드, AZM 475271, 및 알스테르파울론, 예를 들어 토크리스(Tocris)에서 입수가능함); 및 TCR 및 보조-수용체 결속 및 활성화를 촉진하는 항체 또는 다른 단백질 (예를 들어, CD3, CD28, 및 CD2 다량체 항체 또는 효능제 복합체, 예컨대 이뮤노컬트(ImmunoCult)™ 인간 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자, 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)에서 입수가능함)이다. 세포를 MHC 부류 II 발현 세포 (예를 들어, B 세포, 대식세포, 및 수지상 세포)와 공동-배양하는 것 또한 흉선 선택 동안 CD4+ TCR 결속을 모방할 수 있다.
일부 실시양태에서, CD4+CD8+ T 세포 (이중 양성 T 세포)는 PMA 및 이오노마이신의 존재 하에 배양되어 CD4 단일 양성 T 세포로의 세포의 분화를 촉진한다. 특정한 실시양태에서, PMA 대 이오노마이신의 중량비는 약 1:10 내지 약 1:1000 (예를 들어, 1:20, 1:50, 1:100, 1:250, 또는 1:500)이다. 일부 실시양태에서, 이중 양성 세포는 PMA 및 이오노마이신의 존재 하에 약 1 내지 5일, 예를 들어 약 24시간 동안 배양된다.
예로서, 도 1은 - iPSC로부터 - 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC), 림프성 전구 세포, 이중 양성 T 세포, CD4sp Teff 및 Treg를 생성하는 단계적 과정을 예시한다. 이러한 예시적인 과정에서, 먼저 iPSC를 시토카인 및 성장 인자에서 약 5-12일 (예를 들어, 약 8일) 동안 배상체 (EB)로 성장시켜 그의 중배엽 계열로의 분화를 지시한 후, HSPC로의 분화를 지시할 수 있다. 예를 들어, iPSC를 약 5-20 (예를 들어, 10) ng/mL BMP4, 약 5-20 (예를 들어, 10) ng/mL VEGF, 약 10-100 (예를 들어, 50) ng/mL SCF, 약 5-20 (예를 들어, 10) ng/mL bFGF 및 약 5-20 (예를 들어, 10) μM Y-27632 디히드로클로라이드의 존재 하에 스템디프(STEMdiff)™ APEL2™ 배지 (스템셀 테크놀로지스)에서 약 1-5일 (예를 들어, 1일) 동안 배양하여 배상체 (EB) 형성을 촉진할 수 있다. 이어서, EB를 약 10-50 (예를 들어, 20) ng/mL VEGF, 약 50-200 (예를 들어, 100) ng/mL SCF, 약 5-20 (예를 들어, 10) ng/mL bFGF, 약 10-50 (예를 들어, 20) ng/mL Flt-3, 약 10-50 (예를 들어, 20) ng/mL TPO 및 약 10-100 (예를 들어, 40) ng/mL IL-3의 존재 하에 약 1 내지 10일 (예를 들어, 7일) 동안 스템디프™ APEL2™ 중에서 배양한 다음, 약 50-200 (예를 들어, 100) ng/mL SCF, 약 10-50 (예를 들어, 20) ng/mL Flt-3, 약 10-50 (예를 들어, 20) ng/mL TPO 및 약 10-100 (예를 들어, 40) mg/mL IL-3의 존재 하에 약 8 내지 14일 (예를 들어, 6일) 동안 스템프로(StemPro)™-34 (써모 피셔) 중에서 배양하여 HSPC가 풍부한 세포 집단을 생성할 수 있다.
EB로부터의 HSPC는 추가 14일 정도 동안 림프성 전구 세포로 추가로 분화된다. 이어서, 림프성 전구세포를 약 7-14일 동안 CD4+CD8+ (이중 양성) T 세포로 분화시키고 (예를 들어, T 세포 전구세포 성숙 배지에서; 예를 들어, 스템스팬™ SFEM II를 T 세포 전구세포 성숙 보충제 (스템셀 테크놀로지스)와 혼합함으로써 수득가능함), 이 때 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 및 이오노마이신 (PMAI)을 약 1 내지 3일 (예를 들어, 약 1일 또는 약 24시간) 동안 배양 시스템에 첨가하여 CD4 계열로의 수임을 유도한다. PMAI-유도된 세포는 약 5-15일 (예를 들어, 7일) 동안 PMAI의 부재 하에 추가로 배양될 수 있다. 이어서, 생성된 CD4sp T 세포를 약 1-10 ng/mL TGF-β1, 약 1-10 nM 올-트랜스 레티노산 (ATRA), 약 10-1000 U/mL IL-2, 및 CD3/CD28/CD2 인간 T 세포 활성화인자 (이뮤노컬트™; 또는 써모 피셔로부터의 디나비즈(Dynabeads))를 약 5-10일 (예를 들어, 약 7일) 동안 첨가하여 Treg로 추가로 분화시킨다. 일부 실시양태에서, CD4sp T 세포로의 분화는 T 세포-특이적 배지를 포함하는 배지에서 발생하고; 이 배양 배지는 기초 배지, 예컨대 T 세포 전구세포 성숙 배지 및 T 세포-특이적 배지를 (예를 들어, 1:1의 부피비로) 혼합하고, IL-2 (예를 들어, 약 10-1000 U/mL IL-2)로 보충함으로써 제조될 수 있다 (도 2). T 세포-특이적 배지는 T 림프구의 성장 및 확장을 촉진하고 임의로 무혈청인 배양 배지이다. T 세포-특이적 배지의 예는 비제한적으로 옵트마이저(OpTmizer)™ (써모 피셔), 이뮤노컬트™-XF (스템셀 테크놀로지스), 및 엑스-비보(X-VIVO)™ 15 (론자(Lonza))를 포함한다. 이들 방법에서, iPSC로부터 Treg로의 분화 과정은 전적으로 피더 비의존성일 수 있다. 이중 양성 (CD4+CD8+) T 세포 발달 단계에서 배양 시스템에 PMAI를 첨가하는 것은 미성숙 이중 양성 T 세포를 CD4sp T 세포 및 궁극적으로 Teff 및 Treg로 분화시키기 위한 중요한 단계이다. T 세포-특이적 배지에서의 IL-2의 첨가 및 분화는 집단 내의 전체 Treg의 수를 증진시킨다.
일부 실시양태에서, PMA는 0.005 내지 5 (예를 들어, 0.00625 내지 2) ng/μl 이오노마이신과 함께 0.0001 내지 0.2 (예를 들어, 0.0003125 내지 0.1) ng/μl로 이중 양성 T 세포의 조직 배양물에 첨가된다. 특정한 실시양태에서, 1X PMAI는 조직 배양물 중 0.05 ng/μl PMA 및 1 ng/μl 이오노마이신을 지칭하고, 이중 양성 세포는 0.00625X, 0.125X, 0.25X, 0.50X, 1X 또는 2X PMAI의 존재 하에 약 24시간 동안 배양된다. 이중 양성 세포를 또한 0.004X PMA 및 0.2X 이오노마이신에서 약 24시간 동안 배양할 수 있다. 본 배양 방법에 유용한 예시적인 PMAI 농도 (예를 들어, 0.00625X 내지 2X)를 하기 표 A에 나타낸다:
표 A
Figure pct00001
PMAI-유도된 세포를 PMAI의 부재 하에 약 1주 동안 추가로 배양하여 CD4sp T 세포가 풍부한 세포 집단을 수득할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 세포 유형이 "풍부한" 세포 집단은 특정 세포 유형이 전체 세포 집단의 적어도 30% (예를 들어, 적어도 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90%)를 차지한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, PMAI-유도된 세포 집단은 적어도 60-80%의 CD4sp 세포를 함유한다.
CD4sp 세포는 CD4+ Teff 또는 Treg 세포로 추가로 분화될 수 있다. 예를 들어, 도 1 및 2에 도시된 바와 같이, CD4sp-풍부 T 세포 집단을 TGF-β, ATRA, IL-2, 및 CD2, CD3, 및 CD28에 대한 항체, 및 T 세포-특이적 배지의 존재 하에 약 1주 동안 배양하여 Treg 세포를 수득할 수 있다. 또한, 문헌 [Liu et al., Cell Mol Immunol. (2015) 12(5):553-7; Chen and Konkel, Eur J Immunol. (2015) 45(4):958-65]을 참조한다.
대안적으로, CD4sp 세포를 IL-12의 존재 하에 배양하여 Th1-풍부 T 세포 집단을 수득할 수 있거나; IL-4의 존재 하에 배양하여 Th2-풍부 T 세포 집단을 수득할 수 있거나; 또는 IL-6 및 TGF-β의 존재 하에 배양하여 Th17-풍부 T 세포 집단을 수득할 수 있다.
CD4+ Teff 및/또는 Treg는 배양된 세포 집단으로부터 FACS 또는 MACS를 사용하여, 이러한 세포 유형에 특이적인 세포 표면 또는 세포내 마커를 사용하여 정제될 수 있다. 전체 CD4sp 세포에 대해, 다음 마커가 사용될 수 있다: CD3, CD4, CD8, 및 TCRαβ. 전체 Treg에 대해, 다음 마커가 사용될 수 있다: CD4, CD8, CD25, 및 CD127. 나이브 Treg에 대해, 다음 마커가 사용될 수 있다: CD4, CD8, CD25, CD127 및 CD45RA. 정제된 세포는 후속 치료 용도를 위해 동결보존 또는 확장될 수 있다.
또한, iPSC로부터 분화된 T 세포를 수득하는 방법에 대해서는 도 26 및 28을 참조한다.
II. 만능 및 다능 세포로부터 CD4+ Teff 및 Treg 세포를 생성하기 위한 유전자 조작 방법
전구 세포 또는 줄기 세포, 예컨대 iPSC의 Teff 및 Treg로의 분화를 추가로 촉진하기 위해, 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포 및 궁극적으로 Treg 세포가 되도록 전구 또는 줄기 세포의 계열 수임을 촉진하는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 이들 수임 인자는 Treg 분화 과정의 전체 또는 일부 동안 구성적으로 과다발현될 수 있거나, 또는 Treg 분화 과정의 특정 기간 동안 (예를 들어, 독시시클린-유도된 TetR-매개 유전자 발현을 통해) 유도적으로 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 수임 인자는 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 트랜스포손을 사용함으로써) 줄기 또는 전구 세포의 게놈 내로 무작위로 통합된 트랜스진(들)에 의해 코딩된다.
대안적으로, 수임 인자는 부위-특이적 방식으로 줄기 또는 전구 세포의 게놈 내로 통합된 트랜스진(들)에 의해 코딩된다. 예를 들어, 트랜스진은 게놈 세이프 하버 부위에서, 또는 T 세포 특이적 유전자, 예컨대 T 세포 수용체 알파 쇄 불변 영역 (즉, T 세포 수용체 알파 불변 또는 TRAC) 유전자의 게놈 유전자좌에서 통합된다. 전자의 접근법에서, 트랜스진은 임의로 T 세포 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 전사 제어 하에 놓일 수 있다. 후자의 접근법에서, 트랜스진은 내인성 프로모터 및 T 세포 특이적 유전자에 대한 다른 전사-조절 요소 (예를 들어, TCR 알파 쇄 프로모터)의 제어 하에 발현될 수 있다. 트랜스진을 T 세포 특이적 프로모터의 제어 하에 두는 것의 이점은 트랜스진이 의도한 대로 T 세포에서만 발현되고, 그에 의해 조작된 세포의 임상 안전성을 개선시킬 수 있다는 점이다.
1. CD4+ Teff 및 Treg 수임 인자를 코딩하는 트랜스진
전구 세포 또는 줄기 세포, 예컨대 iPSC의 Teff 및 Treg로의 분화를 추가로 촉진하기 위해, 세포는 CD4+ 헬퍼 T 세포 및 궁극적으로 Treg 세포가 되도록 전구 또는 줄기 세포의 계열 수임을 촉진하는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 본 방법에서, 줄기 세포 또는 전구 세포의 게놈에 도입되어 CD4+ Teff로의 분화를 촉진하는 트랜스진은 비제한적으로 CD4, CTLA-4, 가타3 및 ThPOK이다. CD4+ Treg로의 추가의 분화를 촉진할 수 있는 트랜스진은 비제한적으로 CD4, CD25, FOXP3, CD4RA, CD62L, 헬리오스, GITR, 이카로스, CTLA4, 가타3, 톡스(Tox), ETS1, LEF1, RORA, TNFR2, 및 ThPOK 중 하나 이상을 코딩하는 것일 수 있다. 이들 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 진뱅크 및 다른 널리 공지된 유전자 데이터베이스에서 이용가능하다. 이들 단백질 중 하나 이상의 발현은 분화 동안 줄기 또는 전구 세포를 Treg 운명으로 수임하는 것을 도울 것이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 Treg 계열 수임 인자 FOXP3 및/또는 CD4+ 헬퍼 T 세포 계열 수임 인자 ThPOK를 코딩한다 (문헌 [He et al., Nature (2005) 433(7028):826-33]). 일부 실시양태에서, 트랜스진은 Treg의 하위집단에서 발현되는 헬리오스를 코딩한다 (문헌 [Thornton et al., Eur J Immunol. (2019) 49(3):398-412]).
일부 실시양태에서, 줄기 또는 전구 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC) 다능성을 증진시키는 수임 인자를 과다발현하도록 조작될 수 있다 (문헌 [Sugimura et al., Nature (2017) 545(7655):432-38] 참조). 이들 인자는 비제한적으로 HOXA9, ERG, RORA, SOX4, LCOR, HOXA5, RUNX1 및 MYB를 포함한다.
일부 실시양태에서, 줄기 또는 전구 세포는 조작된 부위-특이적 전사 억제 구축물 (예를 들어, ZFP-KRAB, CRISPRi 등), shRNA, 또는 siRNA를 통해 EZHI를 하향조절하여 HSC 다능성을 증진시키도록 조작될 수 있다 (문헌 [Vo et al., Nature (2018) 553(7689):506-510] 참조).
Treg의 표현형은 불안정한 경향이 있다. 일부 실시양태에서, Treg 표현형을 유지하고/거나 조작된 Treg 세포에서 Treg 계열 수임 인자 및 트랜스진의 발현을 증가시키기 위해, 세포는 라파마이신 및/또는 고농도의 IL-2를 함유하는 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [MacDonald et al., Clin Exp Immunol. (2019) 197:11-13] 참조). 가소성은 거의 모든 유형의 면역 세포에 고유한 특성이다. Treg 세포는 염증성 및 환경 조건 하에 Teff 세포로 전이 ("드리프트")될 수 있는 것으로 보인다 (문헌 [Sadlon et al., Clin Transl Imm. (2018) 7(2):e1011]). 항원-특이적 모이어티, 예컨대 CAR 또는 조작된 TCR을 갖는 조작된 모노클로날 Treg는 자가면역 활성 또는 기관 이식 부위에서 증진된 면역조정 반응을 허용할 수 있다.
2. 수임 인자를 코딩하는 트랜스진의 통합
줄기 세포 또는 전구 세포를 유전자 조작하기 위해, 관심 트랜스진을 보유하는 이종 뉴클레오티드 서열을 세포에 도입한다. 여기서 용어 "이종"은 서열이 이러한 서열이 자연적으로 발생하지 않는 게놈의 부위 내로 삽입되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이종 서열은 Treg 세포에서 특이적으로 활성인 게놈 부위에 도입된다. 이러한 부위의 예는 T 세포 수용체 쇄 (예를 들어, TCR 알파 쇄, 베타 쇄, 감마 쇄 또는 델타 쇄), CD3 쇄 (예를 들어, CD3 제타, 엡실론, 델타 또는 감마 쇄), FOXP3, 헬리오스, CTLA4, 이카로스, TNFR2 또는 CD4를 코딩하는 유전자이다.
예로서, 이종 서열은 게놈 내의 하나 또는 둘 다의 TRAC 대립유전자에 도입된다. TRAC 유전자좌의 게놈 구조는 도 19 및 20에 도시되어 있다. TRAC 유전자는 TCR 알파 쇄 V 및 J 유전자의 하류에 있다. TRAC는 TCR 알파 쇄의 불변 영역으로 전사되는 3개의 엑손을 함유한다. 인간 TRAC 유전자의 유전자 서열 및 엑손/인트론 경계는 진뱅크 ID 28755 또는 6955에서 찾아볼 수 있다. 통합을 위한 표적화된 부위는, 예를 들어 인트론 (예를 들어, 인트론 1 또는 2), TRAC 유전자의 마지막 엑손의 하류 영역, 엑손 (예를 들어, 엑손 1, 2 또는 3), 또는 인트론과 그의 인접한 엑손 사이의 접합부에 있을 수 있다.
도 19 및 20은 유전자 편집을 통한 인간 TRAC 유전자좌의 엑손 2 내로의 이종 서열의 표적화 통합에 대한 2가지 상이한 접근법을 예시한다. 두 접근법 모두에서, 트랜스진은 자기-절단 펩티드 (예를 들어, P2A, E2A, F2A, T2A)에 의해 분리된 하나 이상의 Treg 수임 또는 유도 인자 (예를 들어, FOXP3)를 함유하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, FOXP3 트랜스진은 아세틸화되는 것으로 공지된 리신 잔기를 아르기닌 잔기로 전환시키도록 조작되어 (예를 들어, K31R, K263R, K268R), Treg 억제 활성을 증진시킨다 (문헌 [Kwon et al., J Immunol. (2012) 188(6):2712-21] 참조).
도 19에 도시된 접근법에서, 조작된 세포에서의 TCR 알파 쇄의 발현은 이종 서열의 삽입에 의해 파괴된다. 이러한 접근법에서, 게놈 내로 통합된 이종 서열은 5'에서 3'으로 (i) 자기-절단 펩티드 T2A에 대한 코딩 서열 (또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열), (ii) 수임 인자(들)에 대한 코딩 서열, 및 (iii) 폴리아데닐화 (폴리A) 부위를 함유한다. 통합된 후, 조작된 TRAC 유전자좌는 내인성 프로모터 하에 수임 인자(들)를 발현할 것이며, 여기서 T2A 펩티드는 제1 수임 인자로부터 임의의 TCR 알파 쇄 서열 (즉, 임의의 TCR 가변 도메인 서열, 뿐만 아니라 엑손 1, 및 통합 부위에 대해 5'에 있는 엑손 2의 부분에 의해 코딩되는 임의의 불변 영역 서열)의 제거를 허용한다. TRAC 유전자가 파괴되기 때문에, 기능적 TCR 알파 쇄는 조작된 세포에서 생산될 수 없다. 트랜스진에서의 P2A 코딩 서열의 포함으로 인해, 조작된 유전자좌는 모든 개별 Treg 유도 인자(들)를 개별 폴리펩티드로서 발현할 수 있다. 이러한 접근법 하에, 줄기 또는 전구 세포는 목적하는 항원-인식 수용체 (예를 들어, 관심 항원을 표적화하는 TCR 또는 CAR)를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다.
도 20에 도시된 접근법에서, 이종 서열은 5'에서 3'으로 (i) 통합 부위에 대해 3'에 있는 TRAC 엑손 서열 (즉, 통합 부위의 하류의 나머지 엑손 2 서열, 및 전체 엑손 3 서열), (ii) T2A에 대한 코딩 서열 (또는 IRES 서열), (iii) 하나 이상의 수임 인자에 대한 코딩 서열, 및 (iv) 폴리A 부위를 함유할 수 있다. TRAC 엑손 서열 및 T2A를 이종 서열에 포함시키는 것은 무손상 TCR 알파 쇄의 생산을 허용할 것이다. P2A의 포함은 개별 폴리펩티드로서 수임 인자(들)의 생산을 허용할 것이다. TCR 알파 쇄, 외인적으로 도입된 수임 인자(들)는 모두 내인성 TCR 알파 쇄 프로모터의 제어 하에 발현된다. 이러한 접근법은 그의 TCR 알파 및 베타 쇄 유전자좌가 이미 재배열된 성숙 Treg로부터 재프로그램화된 iPSC를 조작하는 데 특히 적합하다 (도 25 및 하기 논의 참조). 이러한 유전자 조작된 iPSC로부터 분화된 Treg는 조상 Treg 세포의 항원 특이성을 보유할 것이다. 또한, TCR 신호전달이 흉선에서 T 세포 및 Treg 발생에 통합적으로 관여하기 때문에 TCR 알파 쇄 발현의 보유는 증진된 T 세포 및 Treg 분화를 가져올 수 있다.
대안적 실시양태에서, 트랜스진은 TRAC 엑손보다는 TRAC 인트론 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 트랜스진은 엑손 2 또는 엑손 3의 상류 인트론에 통합된다. 이러한 실시양태에서, 트랜스진을 보유하는 이종 서열은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용자 (SA) 서열, 하나 이상의 Treg 수임 인자를 코딩하는 트랜스진, 및 폴리A 부위를 함유할 수 있다. 재배열된 TCR 알파 쇄 유전자의 발현이 요구되는 경우, 이종 서열은 5'에서 3'으로 (i) SA 서열, (ii) 이종 서열 통합 부위의 하류의 임의의 엑손(들), (iii) 자기-절단 펩티드에 대한 코딩 서열 또는 IRES 서열, (iv) 하나 이상의 수임 인자를 코딩하는 트랜스진, 및 (v) 폴리A 부위를 함유할 수 있다. 통합된 후, SA는 무손상 (즉, 전장) TCR 알파 쇄, 자기-절단 펩티드, 및 수임 인자(들)를 코딩하는 RNA 전사체의 발현을 허용할 것이다. 이러한 RNA 전사체의 번역은 2개 (또는 그 초과)의 별개의 폴리펩티드 산물 - 무손상 TCR 알파 쇄 및 하나 이상의 수임 인자를 생성할 것이다. SA 서열의 예는 TRAC 엑손의 것 및 관련 기술분야에 공지된 다른 SA 서열이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 조작된 세포의 게놈 세이프 하버 내로 통합된다. 게놈 세이프 하버 부위는 비제한적으로 AAVS1 유전자좌; ROSA26 유전자좌; CLYBL 유전자좌; 알부민, CCR5, 및 CXCR4에 대한 유전자좌; 및 내인성 유전자가 조작된 세포에서 녹아웃된 유전자좌 (예를 들어, T 세포 수용체 알파 또는 베타 쇄 유전자좌, HLA 유전자좌, CIITA 유전자좌, 또는 β2-마이크로글로불린 유전자좌)를 포함한다. 도 21은 이러한 접근법을 예시한다. 상기 예에서, 이종 서열은, 예를 들어 인트론 1에서 인간 AAVS1 유전자좌 내로 통합된다. 트랜스진을 코딩하는 수임 인자의 발현은 독시시클린-유도성 프로모터에 의해 제어된다. 독시시클린-유도성 프로모터는 Tet-반응성 요소의 5-mer 반복부를 포함할 수 있다. 독시시클린의 조직 배양물에의 도입 시, 테트라시클린-제어된 전사활성화인자 (rtTA)의 구성적으로 발현된 유도성 형태는 Tet-반응성 요소에 결합하고, 수임 인자(들)의 전사를 개시한다. 도입된 mRNA로부터 생산된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)는 인트론 1 내의 특정 부위 (라이트닝 볼트)에서 이중-가닥 파괴를 만든다. 플라스미드 DNA 또는 선형화 이중-가닥 DNA에 의해 도입된 공여자 서열은 5'에서 3'으로 상동성 영역 1, AAVS1 엑손 1로 스플라이싱하기 위한 스플라이스 수용자 (SA), 자기-절단 펩티드 2A에 대한 코딩 서열, 퓨로마이신-저항성 유전자에 대한 코딩 서열, 폴리A 신호 서열, 5' 게놈 인슐레이터 서열, 독시시클린-유도성 수임 인자 카세트, CAGG 프로모터로부터 구동되고 이어서 이어서 폴리A 서열이 후속하는 rtTA 코딩 서열, 3' 게놈 인슐레이터 서열, 및 상동성 영역 2를 함유한다. 게놈 인슐레이터 서열은 그들 내의 트랜스진이 분화 과정에 걸쳐 후성적으로 침묵되지 않는 것을 보장한다. 상동성 영역은 ZFN 절단 부위에 플랭킹된 게놈 영역과 상동성이다. 성공적인 표적화된 통합 (TI)을 갖는 세포는 퓨로마이신을 배양물에 도입함으로써 양성 선택될 수 있다. Treg 유도 인자의 유도성 발현이 유용한데, 이는 특정 인자가 중배엽, 조혈 또는 림프구 발생 동안 독성일 수 있고, 따라서 T 세포 발생 동안에만 인자를 작동을 개시시켜 분화를 Treg 계열로 편향시키는 것이 유리하기 때문이다.
일부 실시양태에서, 이종 서열은 항원-결합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)에 대한 발현 카세트를 함유한다. 도 23 및 24는 이러한 실시양태의 예를 예시한다. 도 23에서, 이종 서열은 플라스미드 DNA 또는 선형화 이중-가닥 DNA에 의해 도입되고, 5'에서 3'으로 상동성 영역 1, 그 자체 프로모터로부터 구동되고 폴리A 부위를 함유하는 CAR 발현 카세트 (공여자에 대해 안티센스 배향임), 5' LoxP 부위, AAVS1 엑손 1로 스플라이싱하기 위한 스플라이스 수용자, 자기-절단 펩티드 2A에 대한 코딩 서열, 퓨로마이신-저항성 유전자에 대한 코딩 서열, 자살 유전자 HSV-TK에 대한 코딩 서열, 폴리A 부위, 5' 게놈 인슐레이터 서열, 독시시클린-유도성 수임 인자 발현 카세트, CAGG 프로모터로부터 구동되는 rtTA 코딩 서열, 2A 펩티드를 통해 rtTA 서열에 연결되고 이어서 폴리A 서열이 후속하는 Cre 레콤비나제의 4-히드록시-타목시펜 (4-OHT)-유도성 형태에 대한 코딩 서열, 3' 게놈 인슐레이터 서열, 3' LoxP 부위, 및 상동성 영역 2를 함유한다. 게놈 인슐레이터 서열은 그들 내의 트랜스진이 분화 과정에 걸쳐 후성적으로 침묵되지 않는 것을 보장한다. 상동성 영역은 ZFN 절단 부위에 플랭킹된 게놈 영역과 상동성이다. 성공적인 표적화된 통합을 갖는 세포는 퓨로마이신을 조직 배양물에 도입함으로써 양성 선택될 수 있다. 구성적으로 발현된 4-OHT-유도성 Cre는 배양물에 4-OHT의 첨가 후 LoxP 부위들 사이의 전체 카세트의 절제를 가능케 한다. 레콤비나제-매개 절제를 겪지 않은 세포는 여전히 HSV-TK를 발현할 것이고, 따라서 간시클로비르 (GCV)를 조직 배양물에 첨가함으로써 음성 선택 (제거)될 수 있다. GCV는 HSV-TK를 발현하는 임의의 세포의 세포 사멸을 초래할 것이다. 이 시스템은 CAR 카세트를 통합된 상태로 두면서 Treg 유도 카세트를 완전히 흔적 없이 제거하여, 조작된 Treg에서의 표적화된 면역억제를 허용한다.
도 24는 조작된 TRAC 유전자로부터의 CAR의 발현을 예시한다. 상기 예에서, 플라스미드 DNA 또는 선형화된 dsDNA에 의해 도입된 이종 서열은 5'에서 3'으로 상동성 영역 1, CAR 코딩 서열에 직접 융합되고 이어서 폴리A 부위가 후속하는 2A-코딩 서열, 5' LoxP 부위, 5' 게놈 인슐레이터 서열, AAVS1 엑손 1에 스플라이싱하기 위한 스플라이스 수용자, 2A 코딩 서열, 둘 다 그 자체 프로모터로부터 구동되고 이어서 폴리A 신호 서열이 후속하는, 자살 유전자 HSV-TK에 대한 2A 펩티드-연결된 코딩 서열을 갖는 퓨로마이신-저항성 유전자에 대한 코딩 서열, 독시시클린-유도성 Treg 유도 인자 발현 카세트, CAGG 프로모터로부터 구동되는 rtTA 코딩 서열, 2A 펩티드를 통해 rtTA 서열에 연결되고 이어서 폴리A 서열이 후속하는 Cre 레콤비나제의 4-OHT-유도성 형태에 대한 코딩 서열, 3' 게놈 인슐레이터 서열, 3' LoxP 부위, 및 상동성 영역 2를 함유한다. 게놈 인슐레이터 서열은 그들 내의 트랜스진이 분화 과정에 걸쳐 후성적으로 침묵되지 않는 것을 보장한다. 상동성 영역은 ZFN 절단 부위에 플랭킹된 게놈 영역과 상동성이다. 성공적인 표적화된 통합을 갖는 세포는 퓨로마이신을 조직 배양액에 도입함으로써 양성 선택될 수 있다 (임의로 비통합된 공여자 에피솜이 희석되도록 1주 이상 기다림). 구성적으로 발현된 4-OHT-유도성 Cre는 배양물에 4-OHT의 첨가 후 LoxP 부위들 사이의 전체 카세트의 절제를 가능케 한다. 레콤비나제-매개 절제를 겪지 않은 세포는 여전히 HSV-TK를 발현할 것이고, 따라서 GCV를 조직 배양물에 첨가함으로써 제거될 수 있다. 이러한 시스템은 CAR 카세트가 통합된 내인성 TRAC 프로모터로부터 구동되게 하면서 Treg 유도 카세트를 완전히 흔적 없이 제거하여, 조작된 Treg에서의 표적화된 면역억제를 허용한다.
상기 기술된 도면은 단지 본 발명의 일부 실시양태를 예시하는 것이다. 예를 들어, 다른 자기-절단 펩티드가 도면에 예시된 T2A 및 P2A 펩티드 대신에 사용될 수 있다. 자기-절단 펩티드는 전형적인 길이가 18-22개 아미노산인 바이러스 유래 펩티드이다. 자기-절단 2A 펩티드는 T2A, P2A, E2A 및 F2A를 포함한다. 더욱이, 2A 펩티드의 코돈 다양화된 버전을 사용하여 하나의 대규모 통합 트랜스진 카세트 상에서 다중 Treg 유도 유전자를 조합할 수 있다. 일부 실시양태에서, IRES는 자기-절단 펩티드 코딩 서열 대신에 사용된다. 인트론 및 엑손 둘 다 표적화될 수 있다. 추가의 요소가 이종 서열에 포함될 수 있다. 예를 들어, 이종 서열은 RNA-안정화 요소, 예컨대 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함할 수 있다.
3. 유전자 편집 방법
특이적 게놈 부위 내로의 이종 서열의 표적화된 통합을 위한 임의의 유전자 편집 방법이 사용될 수 있다. 트랜스진의 부위-특이적 통합의 정밀도를 증진시키기 위해, 이종 서열을 보유하는 구축물은 그의 말단 중 하나 또는 둘 다에 표적화된 게놈 부위에 상동인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 서열은 T 세포 특이적 유전자좌 또는 게놈 세이프 하버 유전자좌에서 표적 게놈 부위에 상동성인 서열을 5' 및 3' 말단 영역 둘 다에 보유한다. 이종 서열 상의 상동성 영역의 길이는, 예를 들어 50-1,000개 염기 쌍 길이일 수 있다. 이종 서열 내 상동성 영역은 표적화된 게놈 서열과 동일할 수 있지만, 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 이종 서열 내 상동성 영역은 표적화된 게놈 서열 (예를 들어, 이종 서열 내 상동성 영역에 의해 대체될 서열)에 대해 80% 이상 (예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상) 상동성이거나 또는 동일할 수 있다. 추가 실시양태에서, 구축물은 선형화될 때 한쪽 말단 상에 상동성 영역 1, 및 그의 다른쪽 말단 상에 상동성 영역 2를 포함하고, 여기서 상동성 영역 1 및 2는 각각 게놈 내의 통합 부위에 플랭킹된 게놈 영역 1 및 게놈 영역 2에 상동성이다.
이종 서열을 보유하는 구축물은 임의의 공지된 기술, 예컨대 화학적 방법 (예를 들어, 인산칼슘 형질감염 및 리포펙션), 비-화학적 방법 (예를 들어, 전기천공 및 세포 압착), 입자-기반 방법 (예를 들어, 마그네토펙션), 및 바이러스 형질도입 (예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 백시니아 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 하이브리드 바이러스 벡터 사용)에 의해 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구축물은 AAV 바이러스 벡터이며, 생산 시스템, 예컨대 곤충 세포/바큘로바이러스 생산 시스템 또는 포유동물 세포 생산 시스템에서 AAV 비리온의 생산을 가능하게 하기 위해 양쪽 말단 상에 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 갖는 것을 포함하여 그의 게놈이 구축물을 포함하는 재조합 AAV 비리온에 의해 표적 인간 세포에 도입된다. AAV는 임의의 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8.2, AAV9, 또는 AAVrh10, 유사형, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5, 또는 AAV2/6의 것일 수 있다.
이종 서열은 임의의 부위-특이적 유전자 녹-인 기술에 의해 TRAC 게놈 유전자좌에 통합될 수 있다. 이러한 기술은 비제한적으로 상동 재조합, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 닉카제 (본원에서 집합적으로 "ZFN"), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 또는 닉카제 (본원에서 집합적으로 "TALEN"), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 시스템 (CRISPR, 예컨대 Cas9 또는 cpf1을 사용하는 것), 메가뉴클레아제, 인테그라제, 레콤비나제 및 트랜스포즈에 기반한 유전자 편집 기술을 포함한다. 하기 작업 실시예에 예시된 바와 같이, 부위-특이적 유전자 편집을 위해, 편집 뉴클레아제는 전형적으로 표적화된 게놈 서열에서 DNA 파괴 (예를 들어, 단일- 또는 이중-가닥 DNA 파괴)를 생성하여, 표적화된 게놈 서열에 상동성을 갖는 공여자 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 구축물)가 DNA 파괴의 복구를 위한 주형으로서 사용되어 게놈 부위에 공여자 폴리뉴클레오티드가 도입되게 한다.
유전자 편집 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, CRISPR 유전자 편집 기술의 경우, 미국 특허 8,697,359, 8,771,945, 8,795,965, 8,865,406, 8,871,445, 8,889,356, 8,895,308, 8,906,616, 8,932,814, 8,945,839, 8,993,233, 8,999,641, 9,790,490, 10,000,772, 10,113,167 및 10,113,167을 참조한다. 예를 들어, ZFN 기술 및 T 세포 및 줄기 세포의 편집에서의 그의 적용의 경우, 미국 특허 8,735,153, 8,771,985, 8,772,008, 8,772,453, 8,921,112, 8,936,936, 8,945,868, 8,956,828, 9,234,187, 9,234,188, 9,238,803, 9,394,545, 9,428,756, 9,567,609, 9,597,357, 9,616,090, 9,717,759, 9,757,420, 9,765,360, 9,834,787, 9,957,526, 10,072,062, 10,081,661, 10,117,899, 10,155,011 및 10,260,062를 참조한다. 상기 언급된 특허의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
유전자 편집 기술에서, 유전자 편집 복합체는 복합체의 DNA 결합 특이성을 변경함으로써 특정 게놈 부위를 표적화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 기술에서, 가이드 RNA 서열은 특정 게놈 영역에 결합하도록 설계될 수 있고; ZFN 기술에서, ZFN의 아연 핑거 단백질 도메인은 ZFN의 뉴클레아제 또는 닉카제 도메인이 게놈 DNA를 부위-특이적 방식으로 절단할 수 있도록 특정 게놈 영역에 특이적인 아연 핑거를 갖도록 설계될 수 있다. 목적하는 게놈 표적 부위에 따라, 유전자 편집 복합체가 그에 따라 설계될 수 있다.
유전자 편집 복합체의 성분은 널리 공지된 방법, 예컨대 전기천공, 리포펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 지질 나노입자, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA 또는 mRNA, 및 인공 비리온에 의해 트랜스진 구축물과 공동으로 또는 순차적으로 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 소니트론(Sonitron) 2000 시스템 (리치-마르(Rich-Mar))을 사용하는 초음파천공이 또한 핵산의 전달에 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 뉴클레아제 또는 닉카제를 포함한 유전자 편집 복합체의 하나 이상의 성분은 mRNA로서 편집될 세포 내로 전달된다.
4. Treg의 항원-특이성
일부 실시양태에서, 줄기 세포 또는 전구 세포는 항원-인식 수용체, 예컨대 TCR 또는 CAR을 코딩하는 트랜스진을 포함하도록 (예를 들어, 본원에 기재된 유전자 편집 방법을 사용하여) 추가로 조작될 수 있다. 대안적으로, 줄기 세포 또는 전구 세포는 이미 재배열된 그의 TCR 알파/베타 (또는 델타/감마) 유전자좌를 갖는 성숙 Treg로부터 재프로그램화된 세포이고, 이러한 줄기 또는 전구 세포로부터 재분화된 Treg는 그의 조상 Treg의 항원 특이성을 보유할 것이다. 어떤 경우에도, Treg는 특정한 치료 목표에 대한 관심 항원에 대한 그의 특이성에 대해 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 항원은 다형성 동종 MHC 분자, 예컨대 실질 기관 이식에서의 세포에 의해 또는 세포-기반 요법 (예를 들어, 골수 이식, 암 CAR T 요법, 또는 세포-기반 재생 요법)에서 세포에 의해 발현되는 것이다. 이렇게 표적화된 MHC 분자는 비제한적으로 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C; HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 또는 HLA-DR을 포함한다. 예로서, 관심 항원은 부류 I 분자 HLA-A2이다. HLA-A2는 이식에서 통상적으로 미스매칭된 조직적합성 항원이다. HLA-A 미스매칭은 이식 후 불량한 결과와 연관된다. MHC 부류 I 분자에 대해 특이적인 CAR을 발현하는 조작된 Treg가 유리한데, 이는 MHC 부류 I 분자가 모든 조직 상에서 광범위하게 발현되어 Treg가 이식의 조직 유형과 관계 없이 기관 이식에 사용될 수 있기 때문이다. HLA-A2에 대한 Treg는 HLA-A2가 상당한 비율의 인간 집단에 의해 발현되고, 따라서 많은 공여자 기관 상에서 발현된다는 추가의 이점을 제공한다. Treg 세포에서의 HLA-A2 CAR의 발현이 이식 거부를 방지하는 데 있어서 Treg 세포의 효력을 증진시킬 수 있다는 것을 나타내는 증거가 존재한다 (예를 들어, 상기 문헌 [Boardman]; 문헌 [MacDonald et al., J Clin Invest. (2016) 126(4):1413-24]; 및 상기 문헌 [Dawson] 참조).
일부 실시양태에서, 관심 항원은 자가항원, 즉 신체의 특정 조직 내 자가면역 염증 부위에서 우세하게 또는 독특하게 발현되는 내인성 항원이다. 이러한 항원에 특이적인 Treg는 염증발생 조직으로 귀소하여 국부 면역억제를 유발함으로써 조직-특이적 활성을 발휘할 수 있다. 자가항원의 예는 아쿠아포린 물 채널 (예를 들어, 아쿠아포린-4 물 채널), 부신생물성 항원 Ma2, 암피피신, 전압-게이팅 칼륨 채널, N-메틸-d-아스파르테이트 수용체 (NMDAR), a-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 수용체 (AMPAR), 갑상선 퍼옥시다제, 티로글로불린, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NR1 서브유닛), Rh 혈액형 항원, 데스모글레인 1 또는 3 (Dsgl/3), BP180, BP230, 아세틸콜린 니코틴성 시냅스후 수용체, 티로트로핀 수용체, 혈소판 인테그린, 당단백질 IIb/IIIa, 칼파스타틴, 시트룰린화 단백질, 알파-베타-크리스탈린, 위벽 세포의 내인성 인자, 포스포리파제 A2 수용체 1 (PLA2R1), 및 트롬보스폰딘 유형 1 도메인-함유 7A (THSD7A)이다. 자가항원의 추가의 예는 다발성 경화증-연관 항원 (예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 연관 당단백질 (MAG), 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG), 단백질지질 단백질 (PLP), 핍지교세포 미엘린 올리고단백질 (OMGP), 미엘린 연관 핍지교세포 염기성 단백질 (MOBP), 핍지교세포 특이적 단백질 (OSP/클라우딘 11), 핍지교세포 특이적 단백질 (OSP), 미엘린-연관 신경돌기 생장 억제제 NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22), 2'3'-시클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 (CNPase), 및 그의 단편); 관절-연관 항원 (예를 들어, 시트룰린-치환된 시클릭 및 선형 필라그린 펩티드, 유형 II 콜라겐 펩티드, 인간 연골 당단백질 39 펩티드, 케라틴, 비멘틴, 피브리노겐, 및 유형 I, III, IV, 및 V 콜라겐 펩티드); 및 눈-연관 항원 (예를 들어, 망막 아레스틴, S-아레스틴, 광수용체간 레티노이드-결합 단백질, 베타-결정질 Bl, 망막 단백질, 맥락막 단백질, 및 그의 단편)이다. 일부 실시양태에서, Treg 세포에 의해 표적화된 자가항원은 IL23-R (예를 들어, 크론병, 염증성 장 질환 또는 류마티스 관절염 치료용), MOG (다발성 경화증 치료용) 또는 MBP (다발성 경화증 치료용)이다. 일부 실시양태에서, Treg는 다른 관심 항원 (예를 들어, B 세포 마커 CD19 및 CD20)을 표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동종-항원보다 외래 펩티드 (예를 들어, CMV, EBV, 및 HSV)를 인식하는 Treg는 TCR 발현의 녹아웃을 필요로 하지 않으면서 동종-항원을 인식함으로써 지속적으로 활성화되는 위험 없이 동종 입양 세포 전달 환경에서 사용될 수 있다.
5. 추가의 게놈 편집
본 발명의 조작된 세포는 세포를 보다 효과적이고/거나, 보다 큰 환자 집단에 대해 보다 유용하고/거나, 보다 안전하게 만들기 위해 상기 기재된 게놈 편집 전 또는 후에 추가로 유전자 조작될 수 있다. 유전자 조작은, 예를 들어 관심 이종 서열의 무작위 삽입 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 트랜스포손을 사용함) 또는 표적화된 게놈 통합 (예를 들어, ZFN, TALEN, CRISPR, 부위-특이적 조작된 레콤비나제, 또는 메가뉴클레아제에 의해 매개되는 게놈 편집을 사용함)에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 세포는 CAR 또는 TCR 트랜스진의 세포의 게놈 내로의 부위-특이적 통합을 통해 하나 이상의 외인성 CAR 또는 TCR을 발현하도록 조작될 수 있다. 외인성 CAR 또는 TCR은 상기 기재된 바와 같이 관심 항원을 표적화할 수 있다.
세포는 또한 Treg의 면역억제 활성을 촉진하는 하나 이상의 치료제를 코딩하도록 편집될 수 있다. 치료제의 예는 시토카인 (예를 들어, IL-10), 케모카인 (예를 들어, CCR7), 성장 인자 (예를 들어, 다발성 경화증의 치료를 위한 재수초화 인자), 및 신호전달 인자 (예를 들어, 암피레귤린)를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 세포는 세포 요법의 중증 부작용 및/또는 독성, 예컨대 시토카인 방출 증후군 (CRS) 및/또는 신경독성 (예를 들어, 항-IL-6 scFv 또는 분비가능한 IL-12)을 감소시키는 인자를 발현하도록 추가로 조작된다 (예를 들어, 문헌 [Chmielewski et al., Immunol Rev. (2014) 257(1):83-90] 참조).
일부 실시양태에서, EZH1 신호전달은 조작된 세포에서 파괴되어 그의 림프성 수임을 증진시킨다 (예를 들어, 문헌 [Vo et al., Nature (2018) 553(7689):506-10] 참조).
일부 실시양태에서, 편집된 세포는 환자에 대해 동종 세포일 수 있다. 이러한 경우, 세포는 이들 세포에 대한 숙주 거부 (이식편 거부) 및/또는 숙주에 대한 이들 세포의 잠재적 공격 (이식편-대-숙주 질환)을 감소시키도록 추가로 조작될 수 있다. 추가로 조작된 동종 세포가 특히 유용한데, 이는 이들이 상용성 문제 없이 다수의 환자에게 사용될 수 있기 때문이다. 따라서, 동종 세포는 "범용"으로 불릴 수 있고, "기성품"으로 사용될 수 있다. "범용" 세포의 사용은 효율을 크게 개선시키고, 채택된 세포 요법의 비용을 감소시킨다.
"범용" 동종 세포를 생성하기 위해, 세포는, 예를 들어 다음 중 하나 이상에 대해 널 유전자형을 갖도록 조작될 수 있다: (i) T 세포 수용체 (TCR 알파 쇄 또는 베타 쇄); (ii) 다형성 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 또는 II 분자 (예를 들어, HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C; HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 또는 HLA-DR; 또는 β2-마이크로글로불린 (B2M)); (iii) 항원 프로세싱 연관 수송체 (예를 들어, TAP-1 또는 TAP-2); (iv) 부류 II MHC 전사활성화인자 (CIITA); (v) 부 조직적합성 항원 (MiHA; 예를 들어, HA-1/A2, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1H, 또는 HB-1Y); (vi) 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1 및 CTLA-4; (vii) VIM; 및 (vi) 그의 임의의 조합.
동종 조작된 세포는 또한 숙주의 자연 킬러 세포 및 항-이식편 거부에 관여하는 다른 면역 세포에 대한 조작된 세포 (특히 HLA 부류 I 녹아웃 또는 녹다운을 갖는 것)의 저항성을 증가시키기 위해 불변 HLA 또는 CD47을 발현할 수 있다. 예를 들어, 수임 인자 트랜스진을 보유하는 이종 서열은 불변 HLA (예를 들어, HLA-G, HLA-E, 및 HLA-F) 또는 CD47에 대한 코딩 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 불변 HLA 또는 CD47 코딩 서열은 자기-절단 펩티드에 대한 코딩 서열 또는 IRES 서열을 통해 이종 서열 내의 1차 트랜스진에 연결될 수 있다.
6. 조작된 세포에서의 안전성 스위치
세포 요법에서, 환자에서 세포의 존재가 더 이상 요구되지 않을 때 세포의 증식이 중단될 수 있도록 이식된 세포가 그의 게놈에 "안전성 스위치"를 함유하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hartmann et al., EMBO Mol Med. (2017) 9:1183-97] 참조). 안전성 스위치는, 예를 들어 환자에게 제약 화합물의 투여 시 세포가 아폽토시스에 진입하도록 활성화 또는 불활성화될 자살 유전자일 수 있다. 자살 유전자는, 인간 세포에서 무해 물질을 독성 대사물로 전환시키는 인간에서 발견되지 않는 효소 (예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 효소)를 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 자살 유전자는 단순 포진 바이러스 (HSV)로부터의 티미딘 키나제 (TK) 유전자일 수 있다. TK는 간시클로비르, 발간시클로비르, 팜시클로비르 또는 또 다른 유사한 항바이러스 약물을, DNA 복제를 방해하고 세포 아폽토시스를 유발하는 독성 화합물로 대사시킬 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서 HSV-TK 유전자는 환자에게 이러한 항바이러스 약물 중 하나의 투여에 의해 세포를 사멸시키는 작동을 개시할 수 있다.
다른 실시양태에서, 자살 유전자는, 예를 들어 또 다른 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제 (또는 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제; 항진균 약물 5-플루오로시토신을 5-플루오로우라실로 변환시킴), 니트로리덕타제 (CB1954 ([5-(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤즈아미드]인 경우)를 독성 화합물로 변환시킴), 4-히드록실아민, 및 시토크롬 P450 (이포스파미드를 아크롤레인 (질소 머스타드)으로 변환시킴) (문헌 [Rouanet et al., Int J Mol Sci. (2017) 18(6):E1231]), 또는 유도성 카스파제-9 (문헌 [Jones et al., Front Pharmacol. (2014) 5:254])를 코딩한다. 추가의 실시양태에서, 자살 유전자는 세포내 항체, 텔로머라제, 또 다른 카스파제, 또는 DNAase를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zarogoulidis et al., J Genet Syndr Gene Ther. (2013) doi:10.4172/2157-7412.1000139]을 참조한다.
안전성 스위치는 또한 "켜짐" 또는 "가속기" 스위치, 세포 생존에 중요한 세포성 단백질의 발현을 간섭하는 작은 간섭 RNA, shRNA, 또는 안티센스를 코딩하는 유전자일 수 있다.
안전성 스위치는 임의의 적합한 포유동물 및 다른 필요한 전사 조절 서열을 이용할 수 있다. 안전성 스위치는 본원에 기재된 유전자 편집 기술 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 기술을 사용하여 무작위 통합 또는 부위-특이적 통합을 통해 세포에 도입될 수 있다. 조작된 세포의 유전적 안정성 및 임상적 안전성이 유지되도록 안전성 스위치를 게놈 세이프 하버에 통합시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 개시내용에 사용된 세이프 하버의 예는 AAVS1 유전자좌; ROSA26 유전자좌; CLYBL 유전자좌; 알부민, CCR5, 및 CXCR4에 대한 유전자좌; 및 내인성 유전자가 조작된 세포에서 녹아웃된 유전자좌 (예를 들어, T 세포 수용체 알파 또는 베타 쇄 유전자좌, HLA 유전자좌, CIITA 유전자좌, 또는 β2-마이크로글로불린 유전자좌)이다.
III. Teff 및 Treg 세포의 사용
본 개시내용의 Teff 및 Treg 세포는 면역 관용의 유도 또는 면역 항상성의 회복을 필요로 하는 환자 (예를 들어, 인간 환자)를 치료하기 위한 세포 요법에서 사용될 수 있다. 용어 "치료하는" 및 "치료"는 치료된 상태의 1종 이상의 증상의 완화 또는 제거, 증상의 발생 또는 재발의 예방, 조직 손상의 역전 또는 치유, 및/또는 질환 진행의 둔화를 지칭한다.
본원에서 환자는 바람직하지 않은 염증성 상태, 예컨대 자가면역 질환을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 환자일 수 있다. 자가면역 질환의 예는 애디슨병, AIDS, 강직성 척추염, 항-사구체 기저막 질환, 자가면역 간염, 피부염, 굿패스쳐 증후군, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반증 (HSP), 소아 관절염, 소아 근염, 가와사키병, 염증성 장 질환 (예컨대, 크론병 및 궤양성 결장염), 다발근염, 폐포 단백증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 시신경척수염, PANDAS, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 전신 경피증, 전신 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 혈소판감소성 자반증 (TTP), 제I형 당뇨병, 포도막염, 혈관염, 백반증, 및 보그트-코야나기-하라다 질환이다.
일부 실시양태에서, Treg는 자가면역 질환과 연관된 자가항원, 예컨대 미엘린 핍지교세포 당단백질 (다발성 경화증), 미엘린 단백질 제로 (자가면역 말초 신경병증), HIV env 또는 gag 단백질 (AIDS), 미엘린 염기성 단백질 (다발성 경화증), CD37 (전신 홍반성 루푸스), CD20 (B-세포 매개 자가면역 질환), 및 IL-23R (염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 결장염)을 표적화하는 항원-결합 수용체 (예를 들어, TCR 또는 CAR)를 발현한다.
본원에서 환자는 동종 이식, 예컨대 동종 조직 또는 실질 기관 이식 또는 동종 세포 요법을 필요로 하는 환자일 수 있다. 본 개시내용의 Treg, 예컨대 하나 이상의 동종 MHC 부류 I 또는 II 분자를 표적화하는 CAR을 발현하는 것이 환자에게 도입될 수 있고, 여기서 Treg는 이식으로 귀소하여 숙주 면역계에 의해 도출되는 동종이식편 거부 및/또는 이식편-대-숙주 거부를 억제할 것이다. 조직 또는 기관 이식 또는 동종 세포 요법을 필요로 하는 환자는, 예를 들어 신장 이식, 심장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 장 이식, 정맥 이식, 골수 이식 및 피부 이식편을 필요로 하는 환자; 재생 세포 요법을 필요로 하는 환자; 유전자 요법 (AAV-기반 유전자 요법)을 필요로 하는 환자; 및 암 CAR T 요법을 필요로 하는 환자를 포함한다.
원하는 경우, 본원에서 조작된 Treg를 받는 환자 (생체내에서 Treg로 분화될 조작된 만능 또는 다능 세포를 받는 환자 포함)는 세포 이식편의 도입 전에 경도 림프구고갈 절차로 또는 격렬한 골수절제 컨디셔닝 요법으로 치료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 Teff는 항원 수용체, 예컨대 변형 또는 비변형된 TCR, 또는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된다. 항원 수용체는 관심 항원을 표적화한다. Teff는 염증 반응을 증가시키고, 유해 세포를 사멸시키기 위한 다른 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 CTL)의 활성을 촉진할 수 있다. 유해 세포는, 예를 들어 종양학 환경에서 종양 세포; 감염성 질환 환경에서 바이러스 또는 다른 병원체에 의해 감염된 세포; 자가면역 또는 염증성 환경에서 자가항체-생산 B 세포 또는 자기-반응성 세포; 및 알레르기 환경에서 병원성 알레르겐-반응성 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, Teff 세포는 결함이 있는 CD4+ 구획 (예를 들어, AIDS)을 갖는 환자에서 세포 대체 요법으로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 세포는 세포 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물로 제공될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 멸균수, 생리 염수 또는 중성 완충 염수 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 염, 항생제, 등장화제, 및 다른 부형제 (예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트란, 만니톨; 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민); 아미노산 (예를 들어, 글리신 및 아르기닌); 항산화제 (예를 들어, 글루타티온); 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA); 및 보존제를 포함한다. 제약 조성물은 Treg 표현형 및 성장을 지지하는 인자 (예를 들어, IL-2 및 라파마이신 또는 그의 유도체), 항염증성 시토카인 (예를 들어, IL-10, TGF-β, 및 IL-35), 및 세포 요법을 위한 다른 세포 (예를 들어, 암 요법을 위한 CAR T 이펙터 세포 또는 재생 요법을 위한 세포)를 추가적으로 포함할 수 있다. 저장 및 수송을 위해, 세포는 임의로 동결보존될 수 있다. 사용 전에, 세포를 해동시키고 제약상 허용되는 담체에서 희석시킬 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 전신 투여 (예를 들어, 정맥내 주사 또는 주입) 또는 관심 조직에의 국부 주사 또는 주입 (예를 들어, 간 동맥을 통한 주입, 및 뇌, 심장 또는 근육에 대한 주사)을 통해 치료 유효량으로 환자에게 투여된다. 용어 "치료 유효량"은 환자에게 투여될 때 치료를 실시하기에 충분한 제약 조성물의 양 또는 세포의 수를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물의 단일 투여 단위는 104개 초과의 세포 (예를 들어, 약 105 내지 약 106개 세포, 약 106 내지 약 1010, 약 106 내지 107, 약 106 내지 108, 약 107 내지 108, 약 107 내지 109, 또는 약 108 내지 109개 세포)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물의 단일 투여 단위는 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 또는 약 1010개 또는 그 초과의 세포를 포함한다. 환자에게 제약 조성물을 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월 1회, 또는 필요한 경우 또 다른 빈도로 투여하여 환자에서 조작된 Treg 세포의 충분한 집단을 확립할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 아연 핑거 뉴클레아제 또는 다른 뉴클레아제 및 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재되지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 면역학, 의약, 의약 및 제약 화학, 및 세포 생물학과 관련하여 사용된 명명법, 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 실시양태 전반에 걸쳐, 단어 "갖는다" 및 "포함한다", 또는 변형어, 예컨대 "갖다", "갖는", "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하는 것은 아님을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 다수의 문헌들이 본원에 인용되지만, 이러한 인용은 이들 문헌 중 어느 것도 관련 기술분야의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다. 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우에 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본 용어는 달리 언급되거나 또는 문맥으로부터 달리 명백해지지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예를 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
<실시예>
실시예 1: TiPSC 세포주의 무-피더 유래
본 실시예는 iPSC 세포주가 재프로그램화 인자를 사용함으로써 T 세포 (TiPSC 세포주)로부터 유래된 과정을 기재한다. 상기 과정에서, iPSC는 건강한 인간 공여자로부터의 백혈구분리반출술 팩 (올셀즈(AllCells), 미국)으로부터 이전에 단리된 냉동보존된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합 집단으로부터 유래되었다. 세포를 해동시키고, 100 U/mL IL-2로 보충된 RPMI + 10% 인간 AB 혈청 (huABS)에서 배양하였다. 세포를 CD3/CD28 디나비즈로 1:1 (세포:비드)의 비로 활성화시켰다. 활성화된 세포를 106개 세포/mL의 밀도로 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다.
밤새 배양한 후, 세포를 염색하고, 총 CD4+ T 세포, 총 CD8+ T 세포, 및 나이브 Treg (CD4+CD25고CD127저CD45RA+)에 대해 분류하였다. 분류 후, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 RPMI + 10% huABS + 100 U/mL IL-2에서 회수하였고, 나이브 Treg를 RPMI + 10% huABS + 1000 U/mL IL-2에서 밤새 회수하였다.
다음 날 사이토튠-iPS 2.0 센다이 리프로그래밍 키트(Cytotune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit) (써모 피셔, 미국)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 분류된 T 세포를 재프로그램화하였다. 각각의 분류된 집단으로부터의 대략 0.5x106개 세포를 재프로그램화 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc)를 보유하는 센다이 바이러스 (SeV)로의 스핀 감염에 의해 형질도입하고, 바이러스의 제거 없이 이들의 각각의 배양 배지 내로 플레이팅하였다.
감염 1일 후에, 세포를 수거하고, ReproTeSR (스템셀 테크놀로지스, 캐나다) 내의 매트리겔 상에 플레이팅하였다. ReproTeSR을 제7일까지 배지 제거 없이 1-2일마다 웰에 첨가하였다. 제7일 후에, 일일 배지 교환을 수행하였다. 재프로그램화 대략 2-3주 후에, iPSC 콜로니를 형태에 기초하여 수동으로 골라내었다. 형태가 안정화될 때까지 콜로니를 수동으로 계대배양한 다음, mTeSR 배지 (스템셀 테크놀로지스)에서 추가의 수주 동안 증식시켰다.
실시예 2: 조혈 줄기 및 전구 세포로의 iPSC의 분화
본 실시예는 iPSC가 조직 배양에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)로 분화되는 과정을 기재한다. 과정은 도 1에 도시되어 있다.
이 과정에서, 출발 iPSC를 제0일에 10 ng/mL의 BMP4, 10 ng/mL VEGF, 50 ng/mL SCF, 10 ng/mL bFGF, 및 10 μM ROCK 억제제 (Y-27632 디히드로클로라이드)의 존재 하에 APEL2 배지 (스템셀 테크놀로지스)에 플레이팅하였다. 세포를 간략하게 원심분리하여 EB 형성을 증진시켰다.
EB 형성 후 제1일 또는 제2일에, 모든 웰로부터의 배지를 20 ng/mL VEGF, 10 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 20 ng/mL Flt-3, 20 ng/mL TPO 및 40 ng/mL IL-3을 함유하는 APEL2 배지로 대체함으로써 완전 배지 교체를 수행하였다. 배지를 제8일까지 2 내지 3일마다 교체하였다.
제8일에, 배지를, 비필수 아미노산, 글루타맥스(GlutaMAX)™ 및 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올로 보충되고 100 ng/mL SCF, 20 ng/mL Flt-3, 20 ng/mL TPO 및 40 ng/mL IL-3을 함유하는 완전 스템프로-34 배지 (써모 피셔, 미국)로 대체함으로써 완전 배지 교환을 수행하였다. 배지를 추가의 6 내지 7일 동안 2 내지 3일마다 교체하였다.
총 분화 제14일 또는 제15일에, HSPC를 수집하고, 세포 스트레이너를 통해 스트레이닝하여 압출된 HSPC로부터 EB를 분리하였다.
실시예 3: iPSC-HSPC의 CD4sp T 세포 및 Treg로의 분화
본 실시예는 iPSC-유래 HSPC (iPSC-HSPC)가 CD4sp T 세포 및 Treg로 분화되는 과정을 기재하였다. 이 과정은 도 1 및 도 2에 도시되어 있다.
이 과정에서, iPSC-HSPC를 1x104 - 5x104개 세포/mL의 밀도로 스템스팬™ 림프성 전구세포 확장 배지 (스템셀 테크놀로지스) 중 림프성 분화 코팅 물질로 사전-코팅된 조직 배양-처리된 플레이트 상에 플레이팅하였다 (제14일). 세포를 제28일까지 제조업체의 지침서에 따라 제17일 또는 제18일, 제21일, 및 제24일 또는 제25일에 공급하여 림프성 전구세포 (T 세포 전구체)를 생성하였다.
제28일에, 림프성 전구세포를 수거하고, 스템스팬™ T 세포 전구세포 성숙 배지 중 림프성 분화 코팅 물질로 코팅된 새로운 플레이트 상에 0.2x106개 세포/mL의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 제35일 또는 제42일까지 3 또는 4일마다 공급하였다.
CD4sp T 세포를 생성하기 위해, 제35일 또는 제42일에 세포를 0.00625 내지 0.1 ng/μL 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 0.125 내지 2 ng/μL 이오노마이신 (I) (0.125X - 2X PMAI)으로 처리하여 CD4sp T 세포를 생성하였다. 처리 24시간 후, 스템스팬™ T 세포 전구세포 성숙 배지를 사용한 전체 배지 교환을 통하여 배양물로부터 PMAI를 제거하였다. 처리된 세포를 추가의 7일 동안 3-4일마다 공급하였다. PMAI-처리된 iPSC-유래 CD4sp T 세포를 또한 프로나제 처리에 적용하여 CD4 계열로의 수임을 결정하였다. 세포를 0.1%까지 증가하는 백분율의 배양 배지 중 프로나제로 처리하고, CD4 재발현을 방지하기 위해 4℃에서 인큐베이션하거나 또는 재발현을 허용하기 위해 37℃에서 인큐베이션하였다. CD4 및 CD8 발현의 평균 형광 강도 (MFI)를 처리 1일 및 2일 후에 유동 세포측정법에 의해 검사하였다. 데이터는 CD4sp T 세포가 프로나제 처리 후에 CD4 및 CD8을 재발현할 수 있었음을 나타내며, 이는 프로나제 처리 전의 이들 세포가 계열로 수임되었음을 입증한다 (도 5).
iPSC-유래 Treg를 생성하기 위해, CD4sp T 세포를 제조업체의 지침서에 따라 제43일 또는 제50일에 인간 재조합 TGF-β1, 올-트랜스 레티노산 (ATRA), 및 IL-2를 함유하는 이뮤노컬트™ 인간 Treg 분화 보충물 (스템셀 테크놀로지스) (49 mL의 배지당 1 mL의 보충물)로 처리하였다. 세포를 또한 TGF-β1 및 ATRA 처리일에 인간 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자 (스템셀 테크놀로지스) (12.5 μL/mL)로 활성화시켰다. 세포를 다음 7일 동안 3-4일마다 공급하였다.
또한, CD4sp T 세포를 이뮤노컬트™ 인간 Treg 분화 보충물 (스템셀 테크놀로지스) (49 mL의 배지당 1 mL의 보충물)로 처리하고, 인간 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자 (스템셀 테크놀로지스) (12.5 μL/mL)로 활성화시키고, 스템스팬™ T 세포 전구세포 성숙 배지 및 T 세포-특이적 배지 (옵트마이저™, 이뮤노컬트™, 또는 엑스-비보™ 15)의 50% 혼합물 중 IL-2로 보충함으로써 iPSC로부터 유래된 Treg를 생성하였다. 세포를 다음 7일 동안 3-4일마다 공급하였다.
제1 TGF-β1 및 ATRA 처리 7일 후에, 세포를 10-1000 U/mL IL-2로 보충된 12.5 - 50 μL/mL의 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자로 자극하고, 하류 기능적 또는 특징화 검정에 사용하였다.
유동 세포측정법 분석은 그의 발생 동안 2개의 시점에서 이중 양성 T 세포를 CD4sp 세포로 분화시키는 PMAI의 능력을 입증한다: PMAI를 제35일 (도 3) 또는 제42일 (도 4)에 첨가하였다. PMAI를 다양한 농도로 첨가하였고, 더 낮은 농도 (0.125X 내지 0.25X)는 더 높은 농도의 PMAI와 비교하여 더 높은 백분율의 CD4sp 세포를 생산하였다. PMAI-처리된 CD4+CD8- 세포 (모든 플롯에서 Q7)는 ThPOK를 발현하였지만, FOXP3 (모든 플롯에서 Q9)은 발현하지 않았다. 세포는 또한 CD3 및 TCR αβ를 발현하였다. PMAI로 처리되지 않은 이중 양성 세포는 주로 이중 양성으로 유지되었고, CD4+CD8- 세포는 ThPOK를 발현하지 않았다.
CD4sp T 세포의 동일성 및 기능을 추가로 분석하였다. 유동 세포측정법 분석은 TGF-β1, ATRA, IL-2 및 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화인자로 처리된 PMAI-유도된 CD4sp T 세포 (제35일 또는 제42일에 첨가된 PMAI)에서 활성화된 Treg 마커의 발현을 나타냈다. FOXP3은 분화 제35일에 이중 양성 세포에 첨가된 보다 낮은 농도의 PMAI (0.125X 및 0.25X)에서 관찰될 수 있었지만 (도 6a), 분화 제42일에 첨가된 모든 농도의 PMAI에서 고도로 발현되었다 (도 6b). 세포는 또한 헬리오스 및 CTLA-4를 발현하였지만, LAP 또는 GARP는 발현하지 않았다. PMAI로 처리되지 않은 세포는 TGF-β1 및 ATRA 처리에도 불구하고 FOXP3, CTLA-4, GARP 및 LAP를 거의 내지 전혀 발현하지 않았다. 헬리오스를 또한 이들 세포 상에서 발현시켰다.
PMAI-유도된 및 TGF-β1-처리된 iPSC-Treg의 추가의 특징화는 또한 CD4sp 집단에서 CD25의 발현을 나타내고 CD127의 발현을 거의 내지 전혀 나타내지 않았다. CD25+ 집단 내에서, 대부분의 세포 (75%)는 FOXP3+이었다. CD25+ 집단 내에서의 추가의 서브-게이팅은 CD25를 고도로 발현하는 세포 (CD25고)가 90% 초과의 FOXP3+인 반면에, 낮은/중간 수준의 CD25를 발현하는 세포 (CD25저)는 FOXP3+ 및 FOXP3- 세포의 혼합물을 함유하였음을 나타낸다 (도 9).
유동 세포측정법 분석은 활성화된 PMAI-유도된 및 TGF-β1-처리된 CD4sp T 세포 (iPSC-Treg)에서의 Treg 마커의 발현을 추가로 나타냈다. 데이터는 FOXP3 및 CTLA-4가 이들 세포 상에서 고도로 발현된 반면에, 헬리오스 및 LAP는 각각 중간 수준 및 낮은 수준으로 발현되었음을 나타낸다 (도 7). GARP+ 세포의 중간 정도이지만 뚜렷한 집단은 0.125X, 0.25X, 및 0.5X PMAI 농도에서만 관찰되었다. PMAI로 처리되지 않은 세포는 이들 마커를 고도로 발현하지 않았다.
유동 세포측정법 분석은 또한 반응자 T 세포의 증식에 대한 0.125X PMAI- 및 TGF-β1-처리된 iPSC-Treg의 억제 능력을 나타냈다. 반응자 T 세포의 수가 증가할수록, iPSC-Treg는 그의 증식을 15-21% 억제할 수 있었다 (도 8). PMAI로 처리되지 않았지만 TGF-β1 및 ATRA로 처리된 세포는 T 반응자 증식을 억제하지 않았고, 표적 세포 증식을 자극하는 것으로 보였다.
PMAI- 및 TGF-β1-처리된 iPSC-Treg는 불순한 세포의 집단을 함유하였다. 따라서, 세포를 분류하여 원치않는 집단 (CD8 단일 양성, CD4 및 CD8 이중 양성, 및 CD4 및 CD8 이중 음성 세포)을 제거하여 우세하게 CD4 단일 양성, CD25 양성, CD127 음성/낮음, 및 FOXP3 양성인 세포의 집단을 수득하였다. CD25고 분류된 세포는 90% 초과의 FOXP3+ 세포를 함유하였고, CD25저 분류된 세포는 FOXP3 양성 및 음성 둘 다인 세포의 혼합물을 함유하였다. 이들 데이터는 CD25의 형광 강도에 대한 게이팅이 FOXP3+ 세포의 목적하는 집단을 생성할 수 있음을 나타낸다 (도 9 및 10).
이들 분류된 세포를 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같이 활성화된 Treg의 마커를 발현하도록 활성화시켰다. CD25고 자극된 세포는 비활성화된 세포와 비교하여 활성화 후에 CTLA-4의 상승된 수준 뿐만 아니라 헬리오스 및 LAP의 중간 정도의 증가를 나타냈다. FOXP3 발현 수준은 활성화 전후에 유사하게 유지되었다. CD25고 자극된 세포는 또한 CD69 및 GARP 발현의 증가 및 Treg 마커 (CD4+CD25+FOXP3+)의 보유를 나타냈다. CD25저 자극된 세포는 또한 증가된 CTLA-4 발현 뿐만 아니라 활성화 후에 헬리오스 및 LAP 발현의 중간 정도의 증가를 나타냈지만; FOXP3 수준은 활성화에도 불구하고 CD25고 세포보다 훨씬 더 낮게 유지되었다 (<18%). CD25저 자극된 세포는 또한 활성화 시 CD69 및 GARP를 발현하였다 (도 11 및 12).
분류된 세포는 또한 T 세포 증식을 억제하는 능력을 나타냈다. iPSC-Treg에 대한 반응자 T 세포의 동일한 비에서, CD25고 및 CD25저 iPSC-Treg 둘 다는 활성화 시 반응자 T 세포의 증식을 각각 66-49% 및 54-38% 억제할 수 있었다. 그러나, PMAI-유도된 CD4sp 세포는 반응자 T 증식에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다 (도 13).
FOXP3 Treg-특이적 탈메틸화 영역 (TSDR) 탈메틸화의 분석을 PMAI-유도된 및 자극 TGF-β1 및 ATRA-처리 iPSC-Treg로부터의 게놈 DNA 상에서 수행하였다. 이들 세포는 보다 낮은 농도의 PMAI에서 탈메틸화의 증가를 나타냈다. PMAI-유도되지 않았지만 TGF-β1 및 ATRA 단독으로 자극 및 처리된 세포는 FOXP3 TSDR에서 탈메틸화를 거의 내지 전혀 나타내지 않았다 (도 14, 패널 A). 1차 Treg로부터의 게놈 DNA는 80% 초과의 탈메틸화를 나타낸 반면에, 1차 Tresp 및 0.125X PMAI-유도된 T 세포는 TSDR에서 고도로 메틸화되지 않았다 (도 14, 패널 B). 유동 세포측정법에 의한 FOXP3 발현의 분석은 더 높은 수준의 FOXP3이 더 높은 백분율의 FOXP3 TSDR 탈메틸화와 상관관계가 있음을 시사한다. 또한, 더 낮은 수준의 PMAI로 처리된 세포는 자극 및 TGF-β1 및 ATRA 처리 후에 더 많은 FOXP3+ 세포를 생성하였다 (도 14, 패널 C).
FOXP3 TSDR 탈메틸화는 사멸 세포 제거 후에 증가하였고 (피콜-전 벌크 대 피콜-후 벌크), Treg 풍부화 후에 CD25+CD4+CD127저 세포를 표적화하는 면역자기 분리에 의해 추가로 증진되었다. 통과액 또는 비-표적 집단은 또한 TSDR 탈메틸화된 세포를 함유하였고, 이는 효율적으로 단리되지 않았을 가능성이 있거나 CD8 Treg의 존재를 나타낼 수 있다. 1차 Treg는 고도로 TSDR 탈메틸화되었고, Tresp 세포는 고도로 메틸화되었다 (도 15, 패널 A). 유동 세포측정법에 의한 FOXP3 발현의 분석은 더 높은 수준의 FOXP3이 더 높은 백분율의 FOXP3 TSDR 탈메틸화와 상관관계가 있음을 시사한다 (도 15, 패널 B).
iPSC-Treg의 CD25고 및 CD25저 집단으로의 분류는 2개의 집단 사이의 차이를 추가로 밝혀냈다. CD25고 분류된 iPSC-Treg는 CD25저 분류된 iPSC-Treg (~14%)와 비교하여 FOXP3 TSDR에서 고도로 탈메틸화되었다 (>90%). FOXP3 TSDR에서 1차 Treg 또한 고도로 탈메틸화된 반면애, 1차 T 반응자 세포는 고도로 메틸화되었다 (도 16).
통상적으로 사용되는 T 세포 자극 시약을 iPSC-유래 DP T 세포로부터 CD4sp T 세포를 생성하는 그의 능력에 대해 평가하였다. CD3 및 CD28 또는 CD3, CD28, 및 CD2에 결합하는 가용성 사량체 항체 복합체 (스템셀 테크놀로지스)를 항-CD3 및 항-CD28 항체에 커플링된 자기 비드인 CD3/CD28 디나비즈 (써모 피셔)와 함께 시험하였다. PMAI 처리되지 않거나 0.125X PMAI로 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 다양한 시약으로의 자극 8일 후에, 단지 0.125X PMAI-처리된 세포만이 또한 ThPOK+인 CD4sp 세포의 별개의 집단을 생성할 수 있었다 (도 17a). 이어서, 자극된 세포를 TGF-β1 및 ATRA로 처리하였다. PMAI-자극된 세포만이 ThPOK 및 FOXP3을 또한 발현하는 CD4sp 세포를 생성하였다 (도 17b). 또한, PMAI-자극된 세포만이 CD25고CD127저CD45RA+FOXP3+인 나이브 Treg를 생성하였다 (도 17c).
0.004X PMA 및 0.2X 이오노마이신의 조합을 또한 CD4sp T 세포의 생성을 촉진하는 그의 능력에 대해 평가하였다 (도 18). 이러한 농도의 PMAI는 0.125X PMAI로부터 생성된 대략 74% CD4sp T 세포와 비교하여 대략 33% CD4sp T 세포를 생성하였다. 0.125X PMAI-유도된 CD4sp T 세포는 0.004X PMA 및 0.2X 이오노마이신-유도된 CD4sp T 세포와 비교하여 거의 모두 ThPOK+이었으며, 이는 단지 대략 77% 양성이었다. TGF-β1 및 ATRA를 0.004X PMA 및 0.2X 이오노마이신-유도된 세포에 첨가하여 세포를 CD8+ 및 DP T 세포로 전환시켰다. 0.125X-유도된 PMAI에의 TGF-β1 및 ATRA의 첨가는 80% ThPOK+FOXP3+인 CD4sp T 세포의 집단을 보유하였다.
실시예 4: 트랜스진을 iPSC의 AAVS1 유전자좌 내로 통합시킴
본 실시예는 도 21에 도시된 바와 같이 녹색 형광 단백질 발현 카세트를 AAVS1 유전자좌 내로 통합시킨 실험을 기재한다. AAVS1 ZFN mRNA 및 공여자 플라스미드를 제-7일에 전기천공을 통해 iPSC 내로 전달하였다. 1주 후 (제0일), 퓨로마이신을 조직 배양물에 첨가하여 (0.3 μg/mL) 표적화된 통합을 겪은 세포에 대한 양성 선택을 시작하였다. 독시시클린을 제15일에 첨가하고, 배양물 중에서 3가지 상이한 용량 (0.3, 1, 및 3 μg/mL)으로 유지하여 dox-유도성 GFP 발현 카세트의 발현을 유도하였다. 대조군 세포는 배양물 중에 독시시클린을 첨가하지 않았다. 세포를 독시시클린의 존재 하에 13일 동안 유지하였다. 이 기간 동안, 3 μg/mL 용량의 독시시클린은 최고 수준의 유도성 GFP 트랜스진 발현을 생성하였다 (94%; 도 22). 상기 높은 수준의 발현은 독시시클린이 배양물에 존재하는 동안 지속되었다. 제15일에서 제28일까지 세포를 퓨로마이신 및 또한 독시시클린 중에 유지하고, 추가로 양성 선택하였다 (표적화된 통합을 갖는 대립유전자의 ~50%에서 ~70%로의 증가).
실시예 5: iPSC의 분화를 CD4+ Treg 계열로 편향시킴
iPSC의 분화를 CD4+ T 세포 및 궁극적으로 Treg 세포로 편향시키기 위해, IL-7 수용체의 알파 유닛을 표적화하는 항체 (IL-7Ra)를 사용하여 줄기 세포에 IL-7 수용체를 통한 신호전달의 차단을 수행하였다. T 세포 발생의 후기 단계 동안 항-IL-7Ra 항체를 증가하는 농도로 세포 배양 배지에 첨가하였다. 2회의 이중 실험 (Expt. 1 및 Expt. 2)은 둘 다, 항-IL-7Ra 항체의 첨가가 CD4+ 단일 양성 세포의 백분율을 증가시켜 (우측 하단 4분면), 비처리된 세포의 경우 2.81% 또는 4.78%인 것에 비해 6.9% (Expt. 1) 또는 7.7% (Expt. #2)에 도달한 반면에, CD8+ 단일 양성 세포의 백분율은 감소시켰음 (좌측 상단 4분면)을 나타낸다 (도 27).

Claims (40)

  1. CD4 단일 양성 T 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 방법으로서,
    CD4+CD8+ T 세포의 출발 집단을 제공하는 단계,
    세포의 출발 집단을 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신을 포함하는 배지에서 배양하고, 그에 의해 CD4 단일 양성 T 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배양 배지가 0.00625 내지 0.1 μg/ml PMA 및 0.125 내지 2 μg/ml의 이오노마이신을 함유하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PMA 대 이오노마이신의 중량비가 1:10 내지 1:1000, 임의로 1:20인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 배양 배지가 0.00625 μg/ml PMA 및 0.125 μg/ml의 이오노마이신을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 배지에서 약 1 내지 5일 동안 배양되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CD4 단일 양성 T 세포가 미성숙 CD4+ T 세포이고, 임의로 여기서 T 세포가 ThPOK를 발현하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 미성숙 CD4+ T 세포가 이펙터 T (Teff) 세포이고, 임의로 여기서 Teff 세포가 CD25저인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD4 단일 양성 T 세포를 TGF-β 및 올 트랜스-레티노산 (ATRA, all trans-retinoic acid)을 포함하는 제2 배지에서 배양하고, 그에 의해 CD4+ 조절 T (Treg) 세포가 풍부한 세포의 집단을 수득하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제2 배지가 IL-2, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 제2 배지가 T 세포-특이적 배지, 및 TGF-β, ATRA, IL-2, 항-CD2 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD4 단일 양성 T 세포가 제2 배지에서 약 5-10일 동안 배양되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CD4 단일 양성 Teff 또는 Treg 세포를 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 자기-활성화 세포 분류 (MACS)에 의해 조직 배양물로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CD4 단일 양성 Teff 또는 CD4+CD25+CD127저 Treg 세포를 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 조직 배양물로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+CD25고CD127저 및 CD4+CD25저CD127저 Treg 세포를 FACS에 의해 조직 배양물로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+CD8+ T 세포의 출발 집단이 인간 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, iPSC가 T 세포로부터 재프로그램화된 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, iPSC가 게놈 내에 이종 서열을 포함하고,
    여기서 이종 서열은 계열 수임 인자를 코딩하는 트랜스진을 포함하고,
    여기서, 계열 수임 인자는
    (i) iPSC의 CD4+ Teff 세포로의 분화를 촉진하거나, 또는
    (ii) iPSC의 CD4+ Treg 세포로의 분화를 촉진하고/거나 CD4+ Treg 세포의 표현형의 유지를 촉진하는 것인
    방법.
  18. 제17항에 있어서, 이종 서열이 T 세포 특이적 유전자좌 내로 통합되어 트랜스진의 발현이 상기 유전자좌에서 전사-조절 요소의 제어 하에 있는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 트랜스진이 추가의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하고, 여기서 계열 수임 인자에 대한 코딩 서열 및 추가의 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 자기-절단 펩티드에 대한 인-프레임 코딩 서열에 의해 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 분리되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 추가의 폴리펩티드가 또 다른 계열 수임 인자, 치료 단백질 또는 키메라 항원 수용체인 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 서열이 T 세포 특이적 유전자좌에서의 엑손 내로 통합되고,
    트랜스진의 바로 상류에 내부 리보솜 진입 부위 (IRES); 또는
    트랜스진의 바로 상류에 그와 인-프레임으로 자기-절단 펩티드에 대한 제2 코딩 서열
    을 포함하는 것인
    방법.
  22. 제21항에 있어서, 이종 서열이 IRES 또는 자기-절단 펩티드에 대한 제2 코딩 서열의 바로 상류에, 통합 부위의 하류에 있는 T 세포 특이적 유전자좌의 모든 엑손 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 이에 따라 T 세포 특이적 유전자좌가 무손상 T 세포 특이적 유전자 산물을 발현할 수 있도록 유지되는 것인 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 특이적 유전자좌가 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 유전자좌인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 이종 서열이 TRAC 유전자좌의 엑손 1, 2 또는 3 내로 통합되는 것인 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 FOXP3, 헬리오스, 또는 ThPOK를 코딩하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 트랜스진이 FOXP3에 대한 코딩 서열 및 ThPOK의 코딩 서열을 포함하고, 여기서 이들 2개의 코딩 서열은 인-프레임이고, 자기-절단 펩티드에 대한 인-프레임 코딩 서열에 의해 분리되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 출발 집단이 인간 세포인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세포의 출발 집단이 하기로부터 선택된 유전자 내의 널(null) 돌연변이를 포함하는 것인 방법:
    부류 II 주요 조직적합성 복합체 전사활성인자 (CIITA) 유전자,
    HLA 부류 I 또는 II 유전자,
    항원 프로세싱 연관 수송체,
    부 조직적합성 항원 유전자, 및
    β2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 출발 집단이 HSV-TK 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 시토크롬 P450 유전자 또는 카스파제-9 유전자로부터 임의로 선택된 자살 유전자를 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 CD4 단일 양성 세포가 풍부한 세포의 집단.
  31. 제1항 내지 제7항 및 제12항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 CD4+ Teff 세포가 풍부한 세포의 집단.
  32. 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 제31항의 세포의 집단을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법.
  33. 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제31항의 세포의 집단의 용도.
  34. 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 암, 감염성 질환, 알레르기, 천식, 또는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 제31항의 세포의 집단.
  35. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 CD4+ Treg 세포가 풍부한 세포의 집단.
  36. 면역억제를 필요로 하는 환자에게 제35항의 세포의 집단을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법.
  37. 면역억제를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제35항의 세포의 집단의 용도.
  38. 면역억제를 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 제35항의 세포의 집단.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 자가면역 질환을 갖거나, 또는 조직 이식을 받았거나 받을 것인 방법, 용도, 또는 세포의 집단.
  40. 제30항, 제31항 및 제35항 중 어느 한 항의 세포의 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
KR1020237017648A 2020-10-28 2021-10-28 인간 만능 줄기 세포로부터의 cd4+ 이펙터 및 조절 t 세포의 생성 KR20230093044A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063106591P 2020-10-28 2020-10-28
US63/106,591 2020-10-28
PCT/US2021/057152 WO2022094154A1 (en) 2020-10-28 2021-10-28 Generation of cd4+ effector and regulatory t cells from human pluripotent stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230093044A true KR20230093044A (ko) 2023-06-26

Family

ID=78695853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237017648A KR20230093044A (ko) 2020-10-28 2021-10-28 인간 만능 줄기 세포로부터의 cd4+ 이펙터 및 조절 t 세포의 생성

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230392118A1 (ko)
EP (1) EP4237542A1 (ko)
JP (1) JP2023548115A (ko)
KR (1) KR20230093044A (ko)
CN (1) CN116323921A (ko)
AU (1) AU2021368649A1 (ko)
CA (1) CA3195223A1 (ko)
IL (1) IL302291A (ko)
WO (1) WO2022094154A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202345878A (zh) * 2022-03-23 2023-12-01 國立大學法人京都大學 控制性ｔ細胞之製造方法
WO2024071010A1 (ja) * 2022-09-26 2024-04-04 国立大学法人京都大学 Ｔ細胞の製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112041431A (zh) * 2018-02-14 2020-12-04 桑尼布鲁克研究所 产生t细胞谱系细胞的方法
CN114710958A (zh) * 2019-11-08 2022-07-05 桑格摩生物治疗股份有限公司 工程化的调节t细胞的产生

Also Published As

Publication number Publication date
IL302291A (en) 2023-06-01
CA3195223A1 (en) 2022-05-05
EP4237542A1 (en) 2023-09-06
CN116323921A (zh) 2023-06-23
JP2023548115A (ja) 2023-11-15
WO2022094154A1 (en) 2022-05-05
US20230392118A1 (en) 2023-12-07
AU2021368649A1 (en) 2023-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107075484B (zh) 从多能性干细胞诱导细胞免疫治疗用t细胞的方法
US20220380727A1 (en) Generation of engineered regulatory t cells
CN110023491B (zh) 多能干细胞定向分化为hla纯合免疫细胞的方法
JP2020058398A (ja) 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用
EP4083063A2 (en) Antigen-specific immune effector cells
Kooreman et al. Alloimmune responses of humanized mice to human pluripotent stem cell therapeutics
US20200368279A1 (en) Controlled Transgene Expression in Regulatory T Cells
US20230392118A1 (en) Generation of cd4+ effector and regulatory t cells from human pluripotent stem cells
EP4159846A1 (en) Hypoimmunogenic cells
EP3170896B1 (en) Production method for pluripotent stem cells having antigen-specific t cell receptor gene
Chimienti et al. Engineering of immune checkpoints B7-H3 and CD155 enhances immune compatibility of MHC-I−/− iPSCs for β cell replacement
Opstelten et al. Separating the wheat from the chaff: Making sense of Treg heterogeneity for better adoptive cellular therapy
US20190010467A1 (en) Method for preparing cultured cells or tissues for transplantation
WO2018117090A1 (ja) 制御性ｔ細胞の誘導方法
Liang Development of Genome Engineering Strategies for Cell Therapy Safety
EA046022B1 (ru) Антигенспецифические иммунные эффекторные клетки
Miller et al. Towards eliminating HLA class I expression to generate universal cells