KR20230088451A - 암 요법을 위한 페롭토시스의 유도 - Google Patents

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크레이그 비. 톰슨
지아준 주
준메이 이
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Abstract

본 발명은 PI3K-AKT-mTORC1 경로 (또는 SREBP 및 SCD1과 같은 이 경로의 하류 구성요소)의 저해제와 페롭토시스 (ferroptosis)를 유도하는 물질을 필요한 개체에 투여함에 의한 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 다양한 관련 조성물 및 관련 방법을 제공한다.

Description

암 요법을 위한 페롭토시스의 유도
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2020년 10월 16일자 미국 가출원 번호 63/093,151의 우선권 혜택을 주장하며, 그 내용은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형태로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다. 2021년 10월 15일자에 생성된 ASCII 복사본은 파일명 MSKCC_051_WO1_SL.txt이고, 크기 4,615 바이트이다.
연방 정부 지원 연구에 대한 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여된 지원 번호 CA201318, CA204232 및 CA008748 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부가 본 발명에 대해 일부 권리를 가진다.
원용에 의한 통합
원용에 의한 통합을 허용하는 사법권에서는 본원에 인용된 참조문헌들 모두 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다. 아울러, 본원에 인용되거나 또는 언급된 임의 제품에 대한 임의의 제조사의 설명서 또는 카탈로그도 원용에 의해 통합된다. 본원에 원용에 의해 통합된 문헌들 또는 이의 임의 교시 내용은 본 발명의 실시에도 이용될 수 있다.
세포 대사의 부산물로서 인지질 퍼옥사이드의 축적은 페롭토시스 (ferroptosis)로 언급되는 철-의존적인 세포 사멸 형태를 유발할 수 있다 (1, 2). 페롭토시스의 생리학적 기능은 아직 명확하지 않지만, 허혈성 장기 손상, 신경퇴행 및 암 등의 다양한 병리학적 병태들에서 이의 관여가 최근 입증되었다 (1, 6-8). 특히, 페롭토시스가 종양 억제에 역할을 할 수 있으며 (9-12), 페롭토시스의 활성화가 면역 체크포인트 차단 (13) 및 방사선요법 (14-16)과 같은 일부 암 치료에 대한 반응에 기여할 수 있음을 보여주는 증거들이 쌓이고 있다. 중요하게도, 중간엽 특성의 암 또는 E 카드헤린-NF2-Hippo 경로 돌연변이를 가진 암은, 페롭토시스와 관련한 대사 공정 및 레독스/철 항상성의 변형으로 인해, 페롭토시스에 의한 세포 사멸에 매우 민감한 것으로 입증되었다 (17-19). 그러나, 대부분의 암에서 페롭토시스가 질환에 역할을 하는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 마찬가지로, 특별한 종양발생 돌연변이 또는 유전자 백그라운드가 페롭토시스에 대한 특정 암의 민감성에 역할을 할 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
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본 발명은 부분적으로 본 특허 명세서의 실시예 부분에서 더욱 상세히 기술된 일련의 중대한 발견 사실을 기반으로 한다. 예를 들어, PI3K-AKT-mTORC1 신호전달 경로의 활성화가 하류 SREBP1-매개 지질생성을 상향 조절함으로써 암 세포가 페롭토시스에 대해 내성이 되게 할 수 있는 것으로, 현재 밝혀져 있다. 아울러, 중요하게도, 포유류 개체에 페롭토시스를 유도하는 물질과 함께 PI3K-AKT-mTORC1 경로 (또는 이 경로의 하류 구성성분, 예를 들어 SREBP 및 SCD1)의 저해제의 투여가 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에서 활성화 돌연변이가 존재하는 종양의 유의한 퇴행을 야기하여, 대규모의 중대한 암 그룹에 대해 새로운 치료학적 접근법을 제공할 수 있는 것으로도 이제 밝혀졌다. 이러한 발견 사실과 본원에 제시된 기타 발견 사실에 기초하여, 본 발명은 다양한 암을 치료하기 위한 다양한 새로운 개선된 방법을 제공한다.
이에, 일부 구현예에서, 본 발명은 (a) PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제 및 (b) 페롭토시스의 유도제를 둘다 유효량으로 개체에 투여하여, 개체에서 종양을 치료하는 것을 포함하는, 필요한 포유류 개체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 필요한 개체에서 종양을 치료하는데 이용하기 위한, (a) PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제, (b) 페롭토시스의 유도제 및 (c) 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 치료학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 필요한 개체에서 종양을 치료하는데 이용하기 위한 (a) PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제와 (b) 페롭토시스의 유도제로 이루어진 조합물을 제공한다.
일부 구현예에서, 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 종양이 존재한다. 일부 구현예에서, 개체에는 PTEN 결손을 가진 종양이 존재한다. 일부 구현예에서, 개체에는 유방 종양이 존재한다. 일부 구현예에서, 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 유방 종양이 존재한다. 일부 구현예에서, 개체에는 전립선 종양이 존재한다. 이러한 일부 구현예에서, 개체에는 PTEN 결손을 가진 전립선 종양이 존재한다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제는 PI3K 저해제, Akt 저해제, MTOR 저해제, MTORC1 저해제, SREBP 저해제 및 SCD1 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제는 PI3K 저해제이다. 일부 구현예에서, PI3K 저해제는 GDC-0941, SAR245409, SAR245408, BYL-719, GDC-0980, 워트만닌 (wortmannin), Ly294002, 데메톡시비리딘 (demethoxyviridin), 페리포신 (perifosine), 델랄리십 (delalisib), 이델라이십 (idelaisib), PX-866, IPI-145, BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR 1202, RP5264, SF1126, INK1117, BKM120, Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477, CUDC-907 및 AEZS-136으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제는 Akt 저해제이다. 일부 구현예에서, Akt 저해제는 MK-2206, MK-2206, 페리포신, GSK690693, 이파타세르팁 (ipatasertib)(GDC-0068), AZD5365, 어푸레세르팁 (afuresertib)(GSK2110183), At13148, PF-04691502, AT7867, 트리시리빈 (triciribine), CCT128930, A-674563, PHT0427, 밀테포신 (miltefosine), 호노키올 (honokiol) 및 TIC10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제는 MTOR 저해제이다. 일부 구현예에서, MTOR 저해제는 SAR245409, GDC-0980, CCI-779, KU-0063794, 라파마이신 (rapamycin), 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG), 카페인, 커쿠민 (curcumin), 레스베라트롤, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스 (everolimus) 및 리다포롤리무스 (ridaforolimus)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제는 MTORC1 저해제이다. 일부 구현예에서, MTORC1 저해제는 템시롤리무스 (CCI-779), 토린 (Torin) 및 RAPTOR의 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTORC1 신호전달 축에 대한 저해제는 SREBP 저해제이다. 일부 구현예에서, SREBP 저해제는 파토스타틴 A (Fatostatin A)이다.
일부 구현예에서, PI3K/Akt/MTORC1 신호전달 축에 대한 저해제는 SCD1 저해제이다. 일부 구현예에서, SCD1 저해제는 CAY10566이다.
일부 구현예에서, 페롭토시스의 유도체는 RSL3, 에라스틴 (erastin), 이미다졸 케톤 에라스틴 (IKE), 설파살라진 (sulfasalazine), 소라페닙 (sorafenib), 알트레타민 (altretamine), 아르테수네이트 (artesunate), ML-162 및 ML-210으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 측면과 기타 측면들이 본 특허 문헌의 아래 상세한 설명, 도면, 실시예 및 청구항 부분에서 추가로 기술된다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 특허 문헌 전체에 기술된 본 발명에 대한 다양한 구현예들이 다양한 여러가지 방식으로 조합될 수 있으며, 이러한 조합이 본 발명의 범위 내임을 알 것이다.
도 1 A -D. PI3K-AKT-mTOR 신호전달 경로의 종양생성 활성화 (oncogenic activation)는 페롭토시스에 대해 내성을 부여한다. (A) 분석한 암 세포주의 유전자 백그라운드 및 RSL3에 대한 이의 민감성. (B) 세포를 96웰 플레이트, 웰 당 세포 2x104개로 접종하여 밤새 인큐베이션 하였다. RSL3를 지정된 농도로 24시간 처리하여 세포 사멸을 유도하였다. 세포 사멸은 방법에 상세히 기술된 바와 같이 Sytox 그린 염색에 의해 측정하였다. (C) PI3K-AKT 경로에서 지정된 단백질 성분을 지정된 세포 타입에서 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. (D) 세포에 PI3K 저해제 GDC-0941 (2 μM), AKT 저해제 MK-2206 (2 μM), RSL3 (1 μM) 또는 페롭토시스 저해제 페로스타틴-1 (Fer-1, 1 μM)을 12시간 (BT474) 또는 24시간 (MDA-MB-453) 동안 지정된 바와 같이 처리하거나 또는 비-처리하였다. 세포 사멸을 측정하였다. P 값에 대한 지표 (다른 도면 전체에서 동일): ****, P ≤ 0.0001; ***, P ≤ 0.001; **, P≤0.01; *, P≤0.05; ns, P>0.05.
도 2 A -E. mTORC2 대신, mTORC1이 페롭토시스를 억제한다. (A) MDA-MB-453 및 BT474에 CCI-779 (0.5 μM), RSL3 (MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM, BT474 세포의 경우 0.5 μM) 및 Fer-1 (1 μM)을 지정된 바와 같이 처리하였다. (B) 세포를 6웰 플레이트에 웰 당 세포 4x105개로 접종하여 밤새 인큐베이션 하였다. MDA-MB-453 및 BT474 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 세포를 5 μM C11-BODIPY로 염색한 다음 8시간 처리 후 유세포 측정을 수행하였다. (C) 3D 스페로이드를 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; RSL3, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 상단 패널, 사멸 세포는 SYTOX Green에 의해 염색하였다 (스케일 바, 100 ㎛). 하단 패널, 세포의 ATP 수준을 측정함으로써 세포 생존성을 분석하였다. (D) RPTOR 또는 RICTOR을 표적화하는 shRNA의 발현 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; RSL3, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. (E) 패널 D에서와 같이 샘플의 지질 과산화를 측정하였다.
도 3 A -E. NRF2는 mTORC1의 페롭토시스-억제 활성의 주 매개인자가 아니다. (A) BT474 세포를 8시간 동안 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; 토린, 1 μM. p-T389 S6, 전체 S6K 및 NRF2를 측정하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. (B) HT1080 세포에서 CRISPR/Cas9 기법에 의해 NRF2를 고갈시켰다. NRF2 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. (C) 대조군 또는 NRF2-고갈 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. 에라스틴, 0.5 μM; RSL3, 25 nM. (D) NRF2 고갈된 또는 고갈되지 않은 HepG2 세포에 지정된 바와 같이 CCI-779 (0.5 μM) 처리 또는 비-처리와 더불어 시스틴 기아 (cystine starvation)를 처리하였다. 세포 사멸을 염색하기 위해 48시간 후 Sytox Green을 첨가하였다 (스케일 바, 100 ㎛). (E) NRF2 고갈된 또는 비-고갈된 PC-3 세포에 지정된 바와 같이 CCI-779 (0.5 μM) 처리 또는 비-처리와 더불어 시스틴 기아를 처리하였다. 세포 사멸을 염색하기 위해 48시간 후 Sytox Green을 첨가하였다 (스케일 바, 100 ㎛).
도 4 A -F. mTORC1 활성화는 SREBP1을 상향 조절함으로써 페롭토시스를 억제한다. (A) BT474 및 MDA-MB-453 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM. BT474 세포 및 MDA-MB-453 세포에 대해 8시간 및 24시간 처리 후, p-T389 S6, 총 S6K, 비-가공된 SREBP1 (SREBP1(p)) 및 가공된 성숙한 SREBP1 (SREBP1(m))을 검출하는 웨스턴 블롯을 수행하기 위해, 각각 세포 용해물을 수집하였다. (B) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, BT474 세포의 경우 0.5 μM 및 MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM; Fer-1, 1 μM. (C) 세포를 패널 B에서와 같이 처리하였다. 지질 과산화를 측정하였다. (D) 대조군 또는 SREBF1 sgRNA를 보유한 BT474 세포 유래 3D 스페로이드를 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; RSL3, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 상단, 세포 사멸을 Sytox Green에 의해 염색하였다 (스케일 바, 100 ㎛). 하단, 세포 생존성. (E) SREBP1m을 BT474 세포에서 과다 발현시켜 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM. 세포 사멸을 측정하였다 (하단 패널). (F) BT474 세포로부터 유래한 3D 스페로이드를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 상단, 세포 사멸을 Sytox Green에 의해 염색하였다 (스케일 바, 100 ㎛). 하단, 세포 생존성.
도 5 A -H. SREBP1은 SCD1 활성을 통해 페롭토시스로부터 세포를 보호한다. (A) SREBP1의 발현, 및 이의 표적 SCD1, FASN 및 ACACA를 대조군 및 SREBF1-sgRNA 세포에서 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. (B) SREPF1의 mRNA 수준 및 이의 표적 유전자 SCD를 RT-PCR에 의해 측정하였다. (C) 세포에 5 μM CAY10566을 밤새 전처리하거나 또는 전처리하지 않은 후, 지정된 처리를 실시하였다. RSL3, BT474 세포의 경우 0.5 μM 및 MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM; CAY10566, 5 μM; Fer-1, 1 μM. (D) 대조군 또는 SCD-sgRNA를 발현하는 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. (E) 대조군 또는 SCD-sgRNA를 보유한 BT474 세포로부터 유래한 3D 스페로이드를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 좌측, 세포 사멸 염색 (스케일 바, 100 ㎛). 우측, 세포 생존성. (F) SCD1을 BT474 세포에서 과다 발현시키고, 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM. (G) 대조군 또는 SCD1을 과다발현하는 BT474 세포로부터 유래한 3D 스페로이드를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 좌측, 세포 사멸 염색 (스케일 바, 100 ㎛). 우측, 세포 생존성. (H) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, BT474의 경우 0.5 μM 및 MDA-MB-453의 경우 1 μM; CCI-779, 0.5 μM; 올레산 (OA), 0.5 mM; 스테아르산 (SA), 0.5 mM.
도 6 A -F. mTORC1 저해와 페롭토시스의 유도의 조합은 생체내 종양 퇴행을 유발한다. (A) 웨스턴 블롯에 의해 모니터링한, BT474 세포에서의 CRISPR/Cas9-매개, Dox-유도된 GPX4 넉아웃 (GPX4-iKO). (B) GPX4-iKO BT474 세포가 이종이식된 마우스로부터 절제한 종양의 사진. 마우스 군들에 CCI-779 및/또는 Dox를 지정된 바와 같이 처리하였다 (n = 6/군). 상세 내용은 방법을 참조한다. (C) 모두 헤마톡실린 (청색)으로 대조염색한, GPX4, Ki67, PTGS2 및 pS235/236 S6의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 면역염색 사진을 이종이식 종양의 단편들에서 나타낸다. 스케일 바, 50 ㎛. (D) 각 군의 BT474 종양의 증식 곡선. 데이터는 실제 종양 크기에 대한 선형 스케일 (상단 패널) 또는 종양의 배수 변화에 대한 log2 스케일 (하단 패널)에 대한 평균 ± s.d., n = 6로 그래프로 작성하였다. (E) 실제 종양 크기에 대한 선형 스케일 (상단 패널) 또는 종양 크기의 배수 변화에 대한 log2 스케일 (하단 패널)에 대한, 각 군 (n = 6)의 PC-3 종양의 증식 곡선. (F) PI3K-AKT-mTORC1 신호전달의 종양생성 활성화가 SREBP1/SCD1-매개 지질생성을 통해 페롭토시스를 억제함을 보여주는 모델.
도 7 A -J. PI3K-AKT-mTOR 신호전달은 페롭토시스에 대한 민감성을 조절한다. (A) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. GDC-0941, 2 μM; MK-2206, 2 μM; RSL3, 1 μM; Fer-1, 1 μM. 지질 과산화를 측정하였다. (B) 세포를 지정된 조건으로 처리하였다. 토린, 1 μM; RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 세포 사멸을 측정하였다. (C) 세포를 지정된 조건으로 처리하였다. RSL3, MCF 세포 및 PC-3 세포의 경우 10 μM, T47D 세포의 경우 5 μM, HepG2 세포의 경우 1 μM; 토린, 1 μM; CCI-779, 0.5 μM. (D) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; 토린, 1 μM; Fer-1, 1 μM. 세포 사멸을 프로피듐 아이오다이드 (PI)(적색) 또는 Sytox Green (녹색)에 의해 염색하였다 (스케일 바, 100 ㎛). (E-F) MDA-MB-453 세포 및 MCF7 세포에 대해 3D 스페로이드를 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 MCF7 세포의 경우 5 μM; Fer-1, 1 μM. 상단 패널, 세포 사멸 염색 (스케일 바, 100 ㎛). 하단 패널, 세포 생존성. (G) MDA-MB-453 세포를 24시간 동안 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 1 μM; CCI-779, 0.5 μM; GDC-0941, 2 μM; MK-2206, 2 μM; 다브라페닙, 2 μM; SCH772984, 2 μM; Fer-1, 1 μM. (H) 웨스턴 블롯을 수행하여, RPTOR 및 RICTOR 넉다운 효율을 검출하였다. (I) HT1080 세포 및 MDA-MB-231 세포 (둘다 야생형 PI3K-AKT-mTOR 경로를 가짐)를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, HT1080의 경우 0.1 μM 및 MDA-MB-231의 경우 0.25 μM; 토린, 1 μM; CCI-779, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 세포 사멸을 측정하였다. (J) PI3K-AKT-mTOR 경로 야생형 세포주 2종 (HT1080 및 MDA-MB-231)과 경로의 활성화 돌연변이를 가진 세포주 2종 (BT474 및 MDA-MB-453)을 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.25 μM; Fer-1, 1 μM. 웨스턴 블롯을 수행하여 pT389 S6K의 수준을 검출하였다.
도 8 A -D. NRF2는 mTORC1의 페롭토시스-억제 활성을 매개하는 주 인자가 아니다. (A) HepG2 세포에서 CRISPR/Cas9 기법에 의해 NRF2를 고갈시켰다. NRF2 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. (B) PC-3 세포에서 CRISPR/Cas9 기법에 의해 NRF2를 고갈시켰다. NRF2 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. (C) MCF7 세포에서 CRISPR/Cas9 기법에 의해 NRF2를 고갈시켰다. (좌측) NRF2 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. (우측) NRF2 고갈된 또는 비-고갈된 MCF7 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 5 μM; CCI-779, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. 세포 사멸을 측정하였다. (D) BT474 세포에서 CRISPR/Cas9 기법에 의해 Keap1을 고갈시켰다. (좌측) NRF2 및 Keap1 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. (우측) Keap1 고갈된 또는 비-고갈된 BT474 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; 토린, 1 μM; Fer-1, 1 μM.
도 9 A -F. SREBP1은 페롭토시스로부터 세포를 보호한다. (A) MCF7 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 5 μM; CCI-779, 0.5 μM. p-T389 S6, 총 S6K, SREBP1(P) 및 SREBP1(m)을 검출하는 웨스턴 블롯을 위해, 처리 후 24시간에 세포 용해물을 수집하였다. (B) 세포를 5 μM 파토스타틴 A로 밤새 전처리한 다음 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, BT474 세포의 경우 0.5 μM, MDA-MB-453의 경우 1 μM 및 MCF7 세포의 경우 5 μM; Fer-1, 1 μM. (C) BT474, MDA-MB-453 및 MCF7 세포에서 SREBF1 넉아웃의 효율을 웨스턴 블롯에 의해 모니터링하였다. (D) MCF7 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 5 μM; Fer-1, 1 μM. (E) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM; 토린, 1 μM; GDC-0941, 2 μM; MK-2206, 2 μM; CCI-779, 0.5 μM. (F) SREBP1m을 MCF7, MDA-MB-453 및 A549 세포에서 과다 발현시키고, 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, MCF7 세포의 경우 5 μM, MDA-MB-453 세포의 경우 0.5 μM, 및 A549 세포의 경우 0.25 μM; CCI-779, 0.5 μM.
도 10 A -B. SREBP1 넉아웃은 SCD1을 하향 조절한다. (A) SREBF1 넉아웃을 가진 지정된 세포주를 수집하였다. (A) SREPF1 및 이의 표적 유전자 (ACACA, FASN, SCD, ACLY)의 mRNA를 RT-PCR에 의해 측정하였다. (B) SREBF1 넉아웃을 가진 MCF7 세포에서 웨스턴 블롯에 의한 FASN, ACC 및 SCD1 확인.
도 11 A -H. SCD1은 세포를 페롭토시스로부터 보호한다. (A) 세포를 5 μM CAY10566으로 밤새 전처리하였다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, MDA-MB-453의 경우 1 μM 및 BT474의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM; CAY10566, 5 μM; Fer-1, 1 μM. (B) BT474, MDA-MB-453 및 MCF7 세포에서 SCD 넉아웃 효율을 측정하는 웨스턴 블롯. (C) MCF 세포 (sgCtrl, sgSCD#1 및 sgSCD#2)를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 5 μM; Fer-1, 1 μM. (D) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM. (E) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; Fer-1, 1 μM; CCI-779, 0.5 μM; GDC-0941, 2 μM; MK-2206, 2 μM. (F) SCD1을 BT474 세포에서 과다 발현시켰다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM. 지질 과산화를 측정하였다. (G) SCD1을 A549 세포에서 과다 발현시키고, 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.25 μM; CCI-779, 0.5 μM. 지질 과산화 및 세포 사멸을 처리 후 6시간 및 24시간에 각각 측정하였다. (H) SCD1을 SREBF1 넉아웃을 가진 BT474 세포에서 과다 발현시켰다. SCD1 및 SREBP1 수준을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM; Fer-1, 1 μM.
도 12 A -C. mTORC1 저해제 의해 촉발된 페롭토시스는 외인성 MUFA에 의해 방지될 수 있다. (A) SREBP1-구인된 전사에 의해 조절되는 지질생성에 대한 개괄. (B) A549 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. 올레산 (18:1, OA), 0.5 mM; 스테아르산 (18:0, SA), 0.5 mM; RSL3, 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM. (C) 세포를 지정된 바와 같이 처리하였다. 팔미트올레산 (16:1, PO), 0.5 mM; 팔미트산 (16:0, PA), 0.5 mM; RSL3, MDA-MB-453 세포의 경우 1 μM 및 BT474 세포의 경우 0.5 μM; CCI-779, 0.5 μM.
도 13 A -E. mTORC1 저해와 페롭토시스 유도의 조합이 종양 퇴행을 유발한다. (A) GPX4-iKO BT474 세포를 30시간 동안 지정된 바와 같이 처리하였다. CCI-779, 0.5 μM; DOX, 100 ng/ml; Trolox, 200 μM. 사멸 세포를 Sytox Green으로 염색하였다 (스케일 바, 100 ㎛). (B) BT474 종양 체적을 각 마우스에서 매일 측정하였다. 각 개별 마우스의 종양 체적의 log2 배수 변화를 도표로 작성하였다. (C) PC-3 세포로 이종이식된 마우스로부터 적출된 종양의 사진. 마우스 군들을 CCI-779 및/또는 IKE로 지정된 바와 같이 처리하였다 (n = 6/군). 상세 내용은 방법을 참조한다. (D) 모두 헤마톡실린 (청색)으로 대조염색한, Ki67, PTGS2 및 pS235/236 S6의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 면역염색 사진을 PC-3 이종이식 종양의 단편들에서 나타낸다. 스케일 바, 50 ㎛. (E) PC-3 종양 체적을 각 마우스에서 매일 측정하였다. 각 개별 마우스의 종양 체적의 log2 배수 변화를 도표로 작성하였다.
본 발명의 주요 구현예들 중 일부는 본 특허 문헌의 발명의 내용, 실시예 및 청구항에서 기술되지만, 본 상세한 설명 섹션에서는 본 발명과 관련한 일부 추가적인 설명을 제공하며, 본 출원의 모든 다른 섹션과 함께 숙독하도록 의도된다.
달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않은 한 복수의 언급을 포괄한다. 용어 "a" (또는 "an") 뿐 아니라 용어 "하나 이상의" 및 "적어도 하나"는 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
아울러, "및/또는"은 명시된 피처 또는 성분 2종이 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 각각을 구체적으로 기술하는 것으로 이해되어야 한다. 즉, "A 및/또는 B"와 같은 어구로 사용되는 용어 "및/또는"은 A와 B, A 또는 B, A (단독) 및 B (단독)를 포괄하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구로 사용되는 용어 "및/또는"은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)를 포괄하는 것으로 의도된다.
단위, 접두어 및 기호는 SI (Systeme International de Unites) 허용되는 형식으로 표시된다. 본원에 제공된 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다.
숫자 용어 앞에 "약" 또는 "대략"이 오는 경우, 이들 용어는 언급된 숫자와 언급된 숫자의 ±10% 값을 포괄한다. 아울러, 숫자 용어 앞에 수식어 "약"이 오는 경우, 수식어 "약"이 없는 정확한 언급된 숫자 값을 가진 대안적인 구현예도 고려하며, 또한 본 발명의 범위에 속한다. 반대로, 본 발명의 구현예가 구체적인 숫자 용어를 언급하는 경우, 수식어 "약"이 있는 대안적인 구현예도 고려하는 것이며, 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
용어 "포함하는", "로 이루어진" 및/또는 "로 필수적으로 구성되는"은 미국 특허법에 따라 허용되는 의미를 가진다. 구현예가 표현 "포함하는"을 사용해 기술된 경우, "로 이루어진" 및/또는 "로 필수적으로 구성되는" 용어로 기술된 유사한 구현예를 포괄한다.
I. 활성 물질 & 조성물
본 발명에 의해 제공되는 방법 및 조성물은 비-제한적으로 하기를 비롯하여, 다양한 여러가지 활성 물질을 수반한다:
PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제, 비-제한적으로, PI3K 저해제, Akt 저해제, MTOR 저해제, MTORC1 저해제, SREBP 저해제 및 SCD1 저해제 등;
PI3K 저해제, 비-제한적으로, GDC-0941, SAR245409, SAR245408, BYL-719, GDC-0980, 워트만닌, Ly294002, 데메톡시비리딘, 페리포신, 델랄리십, 이델라이십, PX-866, IPI-145, BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR 1202, RP5264, SF1126, INK1117, BKM120, Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477, CUDC-907 및 AEZS-136 등;
Akt 저해제, 비-제한적으로, MK-2206, MK-2206, 페리포신, GSK690693, 이파타세르팁 (ipatasertib) (GDC-0068), AZD5365, 어푸레세르팁 (afuresertib)(GSK2110183), At13148, PF-04691502, AT7867, 트리시리빈 (triciribine), CCT128930, A-674563, PHT0427, 밀테포신 (miltefosine), 호노키올 (honokiol) 및 TIC10 등;
MTOR 저해제, 비-제한적으로, SAR245409, GDC-0980, CCI-779, KU-0063794, 라파마이신, 에피갈로카테킨 갈레이트 (epigallocatechin gallate, EGCG), 카페인, 커쿠민, 레스베라트롤, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스 및 리다포롤리무스 등;
MTORC1 저해제, 비-제한적으로, 템시롤리무스 (CCI-779), 토린 및 RAPTOR의 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 저해제 등;
SREBP 저해제, 비-제한적으로, 파토스타틴 A 등;
SCD1 저해제, 비-제한적으로, CAY10566 등; 및
페롭토시스 유도제, 비-제한적으로, RSL3, 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴 (IKE), 설파살라진 (sulfasalazine), 소라페닙 (sorafenib), 알트레타민 (altretamine), 아르테수네이트 (artesunate), ML-162 및 ML-210 등.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 활성 물질 하나 이상과 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. "치료학적으로 허용가능한 담체"는 살아있는 개체 (예, 살아있는 인간 개체)에 투여하기에 적합한 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성인 물질이거나 또는 이를 포함한다. 적합한 "치료학적으로 허용가능한 담체"는 염수 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충화된 염수 용액), 물, 에멀젼 (예, 수중유 또는 유중수 에멀젼), 습윤제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 용해제, 지질 또는 살아있는 개체에 투여하기 적합한 조성물을 제조하는데 이용하기 위한 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 기타 물질일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다.
II. 치료 방법
본 발명은 다양한 치료 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 종양 (예, 특정 타입의 종양)의 하나 이상의 임상적인 적응증 또는 증상을 검출가능한 정도로 개선하는 것 (또는 개선하는 방법)을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 용어는 종양 (또는 종양 세포의) 증식 속도의 감소, 종양 (또는 종양 세포의) 증식 중단, 종양 (또는 종양 세포의) 퇴행 유발, 종양의 크기 감소 (예를 들어 종양 체적 또는 종양 덩어리 측면에서 측정시), 종양 등급의 개선, 종양 (또는 종양 세포의) 소거 등을 포괄하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 주어진 조성물 또는 치료 방법의 효과는 주어진/"검사" 조성물 또는 방법을 "대조군" 조성물 또는 방법과 효과를 비교하는 방법과 같이 당해 기술 분야에 공지된 일반 방법을 이용해 입증 또는 평가할 수 있다. 예를 들어, 주어진 조성물 또는 암 치료 방법의 효과는 종양의 하나 이상의 임상 적응증 또는 증상을 개선하는 능력을, 위약 대조군과 같이 대조군 조성물 또는 대조군 방법과 비교함으로써 입증 또는 평가할 수 있다. 예를 들어, 비교는 서로 다른 개체들 간에 (예를 들어, 검사 개체 군 또는 대조군 개체들 간에) 이루어질 수 있다. 마찬가지로, 주어진 조성물 또는 치료 방법의 효과는 치료하기 전과 치료한 후 개체의 종양을 비교함으로써 단일 개체에서 입증 또는 평가할 수 있다.
용어 "종양"은 본원에서 당해 기술 분야에서의 일반적인 용법에 따라 사용되며, 다양한 여러가지 종양 타입들을 망라한다.
본원에 기술된 치료 방법을 수행함에 있어, 임의의 적절한 방법 및 투여 경로를 이용해 본원에 기술된 활성 물질 또는 이의 조합을 전달할 수 있다. 용어 "투여"는 명시된 조성물 또는 물질을 개체에 도입하거나 또는 전달하는 임의 경로를 망라한다. 일부 구현예에서, 활성 물질 또는 이들의 조합은 전신 투여된다. 일부 구현예에서, 활성 물질 또는 이들의 조합은 국소 투여된다. "전신 투여"는 명시된 조성물 또는 물질을 개체 신체의 광범위한 영역 (예를 들어, 신체의 50% 초과)으로 도입 또는 전달하는 경로를 통해, 예를 들어 순환계 또는 림프계로의 유입을 통해 이러한 조성물 또는 물질을 개체에 도입 또는 전달하는 것을 의미한다. 반면, "국소 투여"는 물질을 투여 부위나 투여 지점과 바로 인접한 부위로 도입 또는 전달하지만 치료학적으로 유의한 함량으로 물질을 전신 도입하는 것은 아닌 경로를 통해 명시된 조성물 또는 물질을 개체에 도입 또는 전달하는 것을 의미한다. 예를 들어, 국소 투여된 물질은 투여 지점의 국소 인접 영역에서 쉽게 검출 가능하지만, 개체 신체의 원위 부위에서는 검출 불가하거나 또는 미미한 양으로 검출 가능하다.
일부 구현예에서, 투여는 종양내, 정맥내, 피하, 경구, 국소, 피부를 통해, 진피를 통해, 근육내, 관절내 (intra-joint), 비경구, 세동맥내, 진피내, 심실내, 두개강내, 복막내, 병소내, 비강내, 직장, 질, 흡입에 의해, 이식된 저장체를 통해, 비경구 (예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 관절내 (intra-articular), 활액내, 흉골내, 척수강내, 복막내, 간내, 병소내 및 두개강내 주사 또는 주입 기법) 등을 비롯하여 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 투여는 자가-투여와 타인에 의한 투여를 포함한다. 주어진 투여 경로 또는 수단의 적합성은 의사가 쉽게 결정할 수 있다.
활성 물질 2종 이상을 투여하는 경우, 물질들은 동시에, 순차적으로 또는 시간적으로 중복되게 투여할 수 있다. 마찬가지로, 물질 2종 이상을 투여하는 경우, 물질들은 동일한 조성물로 함께 투여하거나, 또는 서로 다른 조성물로 분리하여 투여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 본원의 "치료" 설명에서 열거된 하나 이상의 성과를 달성하는데 충분하거나 또는 달성하도록 기여하는, 본원에 기술된 활성 물질의 양이다. 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효"량은 용량 증량 실험과 같은 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법을 이용해 결정할 수 있으며, 요망되는 투여 경로 (예, 전신 대 국소), 요망되는 투여 빈도 등과 같은 인자를 고려해 결정할 수 있다. 아울러, "유효량"은 이용할 임의의 공동-투여 맥락에서 결정될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 본 특허 출원의 - 본원에 기술된 물질을 투여 실험을 수행하는 제약 과학에서 일상적으로 사용되는 동물 개체 등의 개체에 투여하는 것을 수반한 - 실시예 섹션에 기술된 바와 같은 분석을 이용하여, 이용할 적절한 용량을 결정하기 위해, (단일 물질 또는 물질들의 조합을 이용한) 이러한 투여 실험을 쉽게 수행할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 활성 물질의 용량은 활성 물질의 효능 및/또는 유효량을 결정하기 위해 수행된 인간 또는 기타 포유류에서의 실험을 기반으로 계산할 수 있다. 용량 함량과 투여 빈도 또는 시기는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 결정할 수 있으며, 활성 물질의 약제학적 형태, 투여 경로, 단독 활성 물질이 사용되는지 또는 복수의 활성 물질들이 사용되는지 유무 (예를 들어, 필요한 제1 활성 물질의 투여량은 이러한 물질이 제2 활성 물질과 조합하여 사용되는 경우 더 낮을 수 있음), 그리고 나이, 체중 또는 약물 대사에 영향을 미치는 임의의 의학적인 상태의 존재 등의 환자 특징과 같은 인자에 따라 결정될 수 있다.
마우스 실험에 기반하여 투여할 물질의 구체적인 용량을 참조하는 본원에 기술된 이러한 구현예에서, 당해 기술 분야의 당업자는, 예를 들어, 본원에 기술된 투여 실험 타입 및 계산을 이용하여, 마우스 용량을 토대로 인간 실험에서 유사한 용량을 쉽게 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다양한 활성 물질의 적절한 용량은 용량 증량 실험과 같은 당해 기술 분야에서 표준적인 타입의 투여 실험을 수행함으로써, 예를 들어, 출발 지점으로서 본 특허 출원의 실시예 섹션에서 마우스에서 유효한 것으로 입증된 투여량을 이용해, 결정할 수 있다.
투여 용법은 또한 당해 기술 분야에서 표준 타입의 실험을 수행함으로써, 예를 들어, 출발 지점으로서 본 특허 출원의 실시예 섹션에서 마우스에서 유효한 것으로 입증된 투여 용량을 이용하여, 적정 및 최적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성 물질은 매일, 주당 2회, 매주, 2주 간격 또는 매달 투여한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 조성물 및 치료 방법은 비-제한적으로 외과적 방법 (예를 들어, 종양 절제), 방사선 요법, 화학치료제를 이용한 치료, 항체를 이용한 치료, 면역치료제를 이용한 치료, 세포 요법을 이용한 치료, 티로신 키나제 저해제를 이용한 치료 등의, 종양 요법에 유용한 것으로 공지된 기타 조성물 및 치료 방법과 함께 사용될 수 있다. 마찬가지로, 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 생검 방법 및 진단 방법 (예를 들어, MRI 방법 또는 기타 촬상 방법)과 같이 질환 상태/진행을 모니터링하기 위해 사용되는 절차와 함께 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및/또는 본원에 기술된 물질 및 조성물은, 예를 들어, 외과적으로 절제하기 전 종양을 줄이기 위해, 종양을 외과적으로 절제하기 전 개체에 적용하거나 또는 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및/또는 본원에 기술된 물질 및 조성물은 종양을 외과적으로 절제하기 전과 절제한 후 개체에 적용하거나 또는 투여할 수 있다.
III. 개체
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개체"는 축산업에서 사용되는 모든 포유류 동물 종뿐 아니라 애완동물로서 그리고 동물원에서 사육되는 동물을 비롯하여, 비-제한적으로, 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 설치류 (예, 랫, 마우스 및 기니아피그), 소, 돼지, 양, 염소, 말 등의 모든 포유류 종을 망라한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 이러한 개체는 전형적으로 치료가 필요한 종양 (또는 종양들)을 앓고 있을 것이다.
***
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예와 여기에 참조된 도면에서 추가로 설명된다.
실시예
페롭토시스는 인지질의 철-의존적인 과산화에 의해 유발되는 제어된 괴사 형태로서, 세포 대사, 레독스 항상성 및 다양한 암 관련 신호전달 경로에 의해 제어된다. 본 실험에서, 본 발명자들은, 인간 암에서 매우 빈번한 현상인 PI3K의 활성화 돌연변이 또는 PTEN 기능 상실이 암 세포에 페롭토시스 내성을 부여하고, PI3K-AKT-mTOR 신호전달 축의 저해가 암 세포를 페롭토시스 유도에 민감하게 만든다는 것을 알게 되었다. 기계론적으로, 이러한 내성에는 mTORC1의 지속적인 활성화와 지질 대사를 조절하는 중추적인 전사 인자인 SREBP1 (sterol regulatory element-binding protein 1)의 mTORC1-의존적인 유도가 필요하다. 아울러, SREBP1의 전사 표적인 SCD1 (stearoyl-CoA desaturase-1)은 단일 불포화 지방산을 생산함으로써 SREBP1의 페롭토시스-억제 활성을 매개한다. SREBP1 또는 SCD1의 유전자 또는 약리학적 제거 (ablation)는 PI3K-AKT-mTOR 경로 돌연변이가 존재하는 암 세포에서 페롭토시스를 감작화한다. 반대로, SREBP1 또는 SCD1의 이소성 발현은 이들 세포에서, 심지어 mTORC1이 저해된 경우에도 페롭토시스를 복구하였다. PI3K-돌연변이형 유방암 및 PTEN-결함성 전립선암에 대한 이종이식 마우스 모델에서, mTORC1 저해는 페롭토시스 유도와 조합하여 거의 완전한 종양 퇴행을 달성하였다. 결론적으로, PI3K-AKT-mTOR 신호전달의 과활성 돌연변이는 암 세포를 산화 스트레스 및 SREBP1/SCD1-매개 지질생성을 통한 페롭토시스로부터 보호하고, mTORC1 저해는 페롭토시스 유도와 조합하여 전임상 모델에서 치료학적 유망성을 나타낸다.
결과
PI3K-AKT-mTOR 신호전달 경로의 종양생성 활성화는 페롭토시스에 대해 내성을 부여한다
페롭토시스와 암에서 빈번하게 돌연변이된 신호전달 경로 간의 기능적 상호작용을 조사하기 위해, 정의된 유전자 돌연변이를 가진 인간 암 세포주 패널을 분석하였다. 페롭토시스를 GPX4의 약리학적 저해제인 RSL3에 의해 촉발하였다. 페롭토시스 유도에 대한 민감성은 검사한 세포주들에 따라 다양하였다. 특히, 본 발명자들은 PIK3CA 활성화 돌연변이 또는 PTEN 결손을 가진 암 세포가 RSL3에 훨씬 더 내성적임을 확인하였다 (도 1, A-C). 이들 돌연변이는 인간 암에서 가장 빈번하게 변이되는 신호전달 경로들 중 하나인 종양생성 PI3K-AKT 신호전달 경로의 활성화를 유발한다 (26-28).
페롭토시스에 대한 내성이 PI3K-AKT 신호전달 경로의 활성화 결과인지를 확인하기 위해, 이 경로에 대한 약리학적 저해가 암 세포를 페롭토시스 유도에 대해 감작화할 수 있는지를 검사하였다. 실제, PI3K 저해제 (PI3Ki) GDC-0941 및 AKT 저해제 (AKTi) MK-2206 둘다 BT474 및 MDA-MB-453 세포 (둘다 경로의 활성화 돌연변이를 보유함)를 페롭토시스 (도 1D) 및 지질 과산화 (도 7A)에 대해 감작화 하였다. 아울러, PI3K-AKT 경로의 주요 하류 작동인자인 mTOR의, 이의 촉매적 저해제 토립에 의한, 저해, 역시 이들 세포를 RSL3에 의해 유도된 페롭토시스에 대해 감작화 하였다 (도 7B). 따라서, PI3K-AKT-mTOR 경로의 지속적인 활성화가 암 세포를 페롭토시스로부터 보호한다. 특히, 페롭토시스 저해에서 mTORC1의 역할은 심근세포 맥락에서 이전에 발표된 바 있지만 (29), 기저 기전은 미완으로 남아있다.
mTORC2 대신 mTORC1이 페롭토시스를 억제한다
mTOR 신호전달은 2개의 분지, 즉 mTORC1 및 mTORC2에 의해 매개된다 (28). 어느 분지가 관찰된 페롭토시스 조절을 담당하는지 확인하기 위해, 먼저 mTORC2가 아닌 mTORC1의 활성을 저해하는 라파로그 (rapalog) 템시롤리무스 (CCI-779)를 조사하였다. CCI-779는, 토린과 마찬가지로, 암 세포를 페롭토시스 유도 및 지질 과산화에 대해 감작화 할 수 있었다 (도 2, A-B 및 도 7, C-D). 일관적으로, 3차원 (3D) 종양 스페로이드 시스템에서, mTOR 저해는 이들 돌연변이 암 세포에서 페롭토시스 유도에 RSL3와 상승 작용하였다 (도 2C 및 도 7, E-F). 대조적으로, ERK 또는 BRAF의 저해제는 그렇지 못하였다 (도 7G).
라파로그 CCI-779 및 mTOR 촉매성 저해제 토린 둘다 페롭토시스 민감성을 복구할 수 있어, 본 발명자들은 mTORC2가 아닌 mTORC1이 PI3K-AKT 경로 돌연변이를 가진 암 세포의 내성을 담당한다는 가설을 세웠다. 이러한 개념과 일관적으로, (mTORC1의 성분) RAPTOR의 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)-매개 침묵화는 MDA-MB-453 및 BT474 세포를 RSL3에 대해 감작화 하였지만, (mTORC2의 성분) RICTOR은 그렇지 않았다 (도 2, D-E 및 도 7H).
다음으로, 본 발명자들은 야생형 PI3K-AKT-mTOR 경로를 발현하고 페롭토시스 유도에 민감한 암 세포를 조사하였다. 이들 야생형 세포에서, 경로의 기저 활성이 페롭토시스의 유도를 허용하는 방식, 그리고 경로의 약리학적 저해가 페롭토시스를 추가로 강화할 수 있는지를 조사하였다. 야생형 PI3K-AKT-mTOR 경로를 가진 세포주 2종, 즉 HT1080 및 MDA-MB-231을 이용하였다. RSL3 단독은 저 농도에서 이들 세포에서 페롭토시스를 유도하기에 충분하였음에도 불구하고, mTOR 저해제의 첨가시 페롭토시스가 추가로 강화되었다 (도 7I). 특히, S6K 인산화에 의해 측정한 바와 같이, 이들 야생형 세포에서 mTORC1 활성이 RSL3에 의해 경시적으로 저해되었다 (도 7J). 이와는 대조적으로, 경로 돌연변이를 가진 세포는 동일한 시간 동안 RSL3 처리시 활성 mTORC1을 유지하였다 (도 7J). 흥미롭게도, 지질 과산화물-포획제 페로스타틴-1 (Fer-1)의 처리가 야생형 세포에서 RSL3-촉발된 mTORC1 활성의 불활화를 방지하였으며 (도 7J), 이는 지질 과산화가 RSL3에 반응한 mTORC1의 불활화에 역할을 하고, 이를 선행함을 시사한다. 그러나, PI3K-AKT-mTOR 경로 돌연변이를 가진 암 세포에서, RSL3-유도된 지질 과산화는 경로가 저해되었을 경우에만 명확해졌으며 (도 7A 및 도 2), 이는 mTOR 저해가 이들 돌연변이 세포에서 지질 과산화물의 상당한 축적에 기여함을 의미한다. 이들 결과에 따르면, mTORC1 활성은 지질 과산화물의 독성 효과를 방지하도록 작용하는 반면, 세포에서 ROS 및 지질 과산화물의 축적은 mTORC1 활성을 약화시킨다. 이런 방식으로 페롭토시스 유도시, 야생형 세포에서 더 낮은 기저 mTORC1 활성은 지질 과산화물 축적을 허용하고, 그래서 mTORC1 활성의 저해 및 가속화된 지질 과산화로 이어지지만, 돌연변이 암 세포에서는 더 강하고 지속적인 mTORC1 활성이 지질 과산화물 축적을 방지하여 페롭토시스에 대해 내성을 유발한다.
NRF2는 mTORC1의 페롭토시스-억제 활성의 주요 매개제가 아니다.
페롭토시스의 특징인 세포성 ROS의 높은 수준 (1)은 Keap1-매개 NRF2 전사 인자의 프로테아좀 분해를 억제함으로써 항산화 경로를 촉발할 것이다 (30). mTORC1은 p62를 인산화함으로써 p62의 Keap1과의 결합을 촉진하여, Keap1 분해로 이어지고 그래서 NRF2가 축적되는 것으로 발표된 바 있다 (31). 이러한 p62-Keap1-NRF2 축은 간 세포암 세포를 페롭토시스로부터 보호하는 것으로 발표되었다 (32). 아울러, NRF2 신호전달은 페롭토시스 저해에 대한 mTOR의 효과를 매개하는 것으로 제안된 바 있다 (33). 그러나, 본 발명자들은 RSL3-유도된 NRF2 축적이 토린 처리에 의해 제거되었음을 확인하였지만 (도 3A), HT1080 세포에서 NRF2-넉아웃은 에라스틴 (시스템 xc- 시스틴/글루타메이트 안티포터의 화학적 저해제)에 의해 유도된 페롭토시스를 단지 약간 강화하였으며, RSL3-유도된 페롭토시스에는 측정가능한 효과가 없었으며 (도 3, B 및 C); PI3K 경로 돌연변이를 가진 복수의 세포주들에서는, 페롭토시스 유도는 NRF2 넉아웃 이후에도 mTOR 저해제에 의해 여전히 강하게 감작화될 수 있었다 (도 3, D-E 및 도 8, A-C). 나아가, BT474 세포에서 Keap1 넉아웃과, 그 결과로 NRF2 축적은 mTORC1 저해에 의해 촉발된 페롭토시스 감작화를 단지 약간 감소시켰다 (도 8D). 이들 결과에 따르면, mTORC1 저해에 의한 페롭토시스의 감작화는 주로 NRF2-비의존적인 기전을 통해 이루어진다.
mTORC1 활성화는 SREBP1을 상향 조절함으로써 페롭토시스를 억제한다.
페롭토시스에는 인지질 과산화가 요구된다. mTORC1이 세포의 지질 대사를 조절함으로써 페롭토시스를 조절하는지를 조사하기 위해, 최근 mTORC1 활성의 하류 표적인 것으로 입증된 (22, 25, 34, 35) 지질 합성의 중추적인 조절제인 SREBP1을 조사하였다 (20, 21), 실제, 복수의 타입의 RSL3-내성 암 세포에서, mTORC1 저해제 CCI-779는 핵으로 전좌하여 이의 하류 전사 표적들을 제어하는 SREBP1의 성숙한 형태 (SREBP1m)의 수준을 낮추었다 (도 4A, 도 9A). 기능적으로, 파토스타틴 A에 의한 SREBP 활성의 약리학적 저해 (36) 또는 CRISPR/cas9에 의한 SREBF1 유전자의 결손은 이들 세포에서 페롭토시스 및 지질 과산화에 대해 감작화 하였다 (도 4, B-D 및 도 9, B-D). 아울러, 이들 SREBF1-넉아웃 세포에서, mTOR 저해제 (토린 및 CCI-779), PI3K 저해제 (GDC-0941) 및 AKT 저해제 (MK-2206)들은 모두 RSL3-유도된 페롭토시스를 추가로 강화하진 못하였다 (도 9E). 반대로, 2D 세포 배양 및 3D 종양 스페로이드 실험에서 검사한 같이, SREBP1의 구성적으로 활성인 핵 형태 (SREPB1m)의 이소적인 발현은 (1) RSL3-감수성 A549 세포 내성으로 만들고, (2) 복수의 RSL3-내성 세포주가 CCI-779와 RSL3의 조합에 더 이상 반응성이지 않게 만든다 (도 4, E-F 및 도 9F). 결론적으로, mTORC1은 SREBP1 기능의 상향 조절을 통해 페롭토시스 유도에 대한 암 세포 내성을 촉진한다.
SREBP1은 SCD1 활성을 통해 세포를 페롭토시스로부터 보호한다.
SREBP1은 다른 대사 유전자들 중에서도 ACLY, ACACA, FASN 및 SCD 등의 복수의 지질 합성-관련 유전자를 제어하는 전사 인자이다 (도 12A)(20). PI3K-AKT-mTOR 경로 돌연변이를 가진 검사 세포주에서, SREBF1 넉아웃은 SCD1의 발현 (mRNA 수준과 단백질 수준)을 다른 표적보다 더 현저하게 낮추었다 (도 5, A-B 및 도 10). 이러한 결과와 최근 발표된 SCD1의 항-페롭토시스 기능 (37)은 SCD1이 페롭토시스 유도에 대해 내성을 매개하는 SREBP1의 주요 하류 표적인지를 조사하도록 촉구하였다. 약리학적으로, SCD1 저해제 CAY10566은 페롭토시스의 유도 (도 5C) 및 지질 과산화 (도 11A)에 대한 RSL3의 효과를 감작화하였다. 유전자 측면에서는, CRISPR/Cas9-매개 SCD 넉아웃 역시 페롭토시스 유도 및 지질 과산화에 대해 세포를 감작화하였다 (도 5, D-E 및 도 11, B-D). 나아가, SCD 넉아웃시, mTORC1, PI3K 또는 AKT의 저해는 암 세포를 페롭토시스에 대해 추가로 감작화하지 못하였다 (도 11E). 역으로, SCD1 과다 발현은 암 세포를 RSL3과 mTOR 저해 또는 SREBF1 넉아웃의 조합에 의해 유도되는 페롭토시스로부터 보호하였다 (도 5, F-G 및 도 11, F-H).
SCD1은 포화 지방산을 단일 불포화 지방산 (MUFA)으로 변환하는 효소이다 (도 12A). MUFA가 페롭토시스를 저해하는 것으로 발표되었으며 (38), 이는 본 발명의 관찰 결과에 대한 기계론적 설명을 제공해준다. 실제, 포화 지방산 팔미트산 (16:0, PA) 또는 스테아르산 (18:0, SA)이 아닌 MUFA 팔미트올레산 (16:1, PO) 또는 올리에이트 산 (18:1, OA)의 추가가 CCI-779 + RSL3 처리시 페롭토시스 내성을 유발하였다 (도 5H 및 도 12, B-C). 종합적으로, 이들 결과에 따르면, SREBP1은 SCD1을 상향 조절함으로써 암 세포를 페롭토시스로부터 보호한다. 특히, SCD1은 본래 산화 반응인 지방산 탈포화 (desaturation)를 촉매하는 철-의존적인 효소로서, 본원에서는 이 철-의존적인, 산화 효소 반응이 세포 사멸의 철-의존적인 산화 형태인 페롭토시스를 완화할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
mTORC1 저해와 페롭토시스 유도의 조합은 생체내에서 종양 퇴행을 유발한다
mTORC1 저해와 페롭토시스 유도의 조합의 암 치료학적 잠재성을 조사하기 위해, 인간 암에 대한 2종의 마우스 이종이식 모델을 분석하였다. 첫번째 모델로, PI3K-돌연변이된 BT474 유방암 세포에서 독시사이클린 (Dox)-유도가능한 방식으로 CRISPR/Cas9-매개 GPX4 넉아웃을 구축하였다 (도 6A). 이 세포에서, GPX4 넉아웃과 mTORC1 저해의 조합만 페롭토시스를 유도하였으며, 각각의 단독에서는 그렇지 못하였다 (도 13A). 이들 세포가 이종이식된 마우스에서, 종양의 평균 체적 ~400 mm3에 도달한 후 CCI-779 투여에 의한 mTORC1 저해를 개시하였다 (Dox 투여는 2일 일찍 개시). CCI-779 투여는 종양 증식을 감속시켰지만, 놀랍게도 Dox 처리 + CCI-779 조합이 종양에 대해 거의 완전한 퇴행을 유발하였다 (도 6B, 6D 및 도 13B). 산화 스트레스 및 페롭토시스의 마커인 (3) PTGS2에 대한 면역조직화학적 분석은, 종양에서 생체내 페롭토시스를 유도하는데 있어 GPX4 + mTORC1 저해 조합의 이러한 상승적인 효과를 뒷받침하였다 (도 6C). 기타 마우스 모델에서, 종양 세포에 페롭토시스를 유도하기 위해, GPX4의 유전자 결손 대신, 생체내 이용이 검증된 에라스틴의 강력하고 대사적으로 안정적인 유사체인 이미다졸 케톤 에라스틴 (IKE)을 이용하였다. PTEN-결함성 PC-3 전립선암 세포를 이용해, 마우스에서 이종이식 종양을 구축하였다 (PTEN 결핍은 전립선암에서 예후 불량을 예측한다 (40)). BT474 이종이식 실험에서 관찰된 바와 마찬가지로, IKE 단독은 종양 증식에는 효과가 없었지만, CCI-779와의 조합시 극적인 종양 퇴행이 달성되었다 (도 6E 및 도 13, C-E). 종합적으로, 이러한 생체내 실험 2가지는, mTORC1 저해 + 페롭토시스 유도의 조합이 PI3K-AKT-mTORC1 경로의 활성화 돌연변이를 가진 암을 치료하는데 유망한 치료학적 접근법임을, 입증해준다.
고찰
결론적으로, 본 작업으로 PI3K-AKT-mTORC1 경로의 종양생성 활성화가 암 세포에서 하류 SREBP1/SCD1-매개 지질생성을 통해 페롭토시스를 억제한다는 점에서 새로운 페롭토시스-제어 기전을 발견하게 되었다 (도 6F). 이전에, 글루타민 분해 및 미토콘드리아 TCA 사이클과 같은 다양한 대사 공정들이 (11, 41) 페롭토시스에 기여하는 것으로 발표되었다. 이 연구는 페롭토시스 제어에서 SREBP-매개 지질 대사의 기능을 해명하였다. 즉, 아미노산, 탄수화물 및 지질 등의 세포 대사는 모두 페롭토시스를 제어할 수 있다. 암 세포는 통상적으로 대사적 및 증식성 부담 증가로 인해 증가한 산화 스트레스를 견딘다 (42, 43). 결론적으로, 산화 스트레스에 맞서는 경로, 특히 NRF2 신호전달 (30)이 흔히 암 세포에서 활성화된다. 이 연구에서는 mTORC1이 세포의 레독스 항상성의 중대한 조절자이고, NRF2-매개 신호전달과 SREBP1/SCD1-매개 MUFA 합성을 통해 이루어지는 것으로 밝혀졌다. 후자 기전은 아마도 더 파괴적인 타입의 산화 스트레스, 페롭토시스-유도성 지질 과산화를 억제하는데 중요하다. MUFA의 페롭토시스-저해 활성은 이전에 입증된 바 있으며 (38) 페롭토시스를 억제하는데 종양생성 PI3K-AKT-mTORC1 경로가 역할을 함에도 불구하고, 페롭토시스-저해 활성의 기저가 되는 정확한 기전은 규명되지 않았음에 유념하여야 한다.
암과 관련하여, 본 연구에서는, 인간 암에서 대부분 돌연변이된 경로들 중 하나인 (26-28) PI3K-AKT-mTOR 신호전달에서 종양생성 변형이 암 세포를 페롭토시스 유도에 더 내성으로 만드는 것으로, 확인되었다. 흥미롭게도, 최근 인간 암에서 또한 빈번하게 돌연변이되는 신호전달 경로인 E cadherin-NF2-Hippo-YAP 경로에서 종양생성 돌연변이가 오히려 암 세포를 페롭토시스에 대해 감작화하는 것으로 발표되었다 (18). 따라서, 특이적인 암-구인성 돌연변이가 암 세포에서 페롭토시스를 강화 또는 억제하는지 여부와 방법은 유전자 산물이 대사와 레독스 및 철 항상성과 같이 페롭토시스와 관련한 세포성 과정을 제어하는 방식에 따라 결정된다. 양자의 경우에, 이들 기계적인 발견 사실은 향후 페롭토시스-유도성 암 요법에 대해 매우 유익한 통찰력을 제공해준다: E cadherin-NF2-Hippo-YAP 경로에서 악성 돌연변이는 단일요법으로서 페롭토시스 유도에 대한 암 세포 반응성을 예측하는 바이오마커로서 이용할 수 있으며; PI3K-AKT-mTOR 경로에 종양생성 돌연변이를 가진 환자는 mTORC1의 저해제 또는 다수가 임상적으로 이용가능한, 경로의 다른 성분의 저해제를 페롭토시스 유도와 조합한 요법에 의해 효과적으로 치료할 수 있다. 이들 2가지 경로는 다양한 악성 타입들에서 상당히 돌연변이되므로, 페롭토시스 유도는 암 치료에 상당한 잠재성을 가진다.
재료 및 방법
사용 시약
RSL3 (1219810-16-8, Cayman), 토린 (10997, Cayman), 템시롤리무스 (CCI-779, NSC 683864, Selleck), 페로스타틴-1 (17729, Caymen), MK-2206 (S1078, Selleck Chemicals), GDC-0941 (S1065, Selleck Chemicals), CAY10566(10012562, Cayman Chemicals), 파토스타틴 A (4444, Tocris), SYTOX Green (S7020, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), 프로피듐 아이오다이드 (556463, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), BODIPY 581/591 C11 (Thermo Fisher, Cat #D3861), 올레산 (O1383, Sigma-Aldrich), 스테아르산 (S4751, Sigma), 팔미트산 (P0500, Sigma-Aldrich), 팔미트올레산 (P9417, Sigma), 이미다졸 케톤 에라스틴 (IKE, HY-114481, MCE).
세포 배양
Kelly는 Sigma-Adlrich 사에서 입수하였다. MEF, HT1080, MDA-MB-231, MDA-MB-453, BT474, MCF7, T47D, U87MG, HepG2, PC-3, DU145, A549, NCI-H1299, LN229 및 SK-MEL-2는 ATCC (American Tissue Culture Collection)에서 입수하였으며, 5% CO2 함유 가습 분위기 하에 37℃에서 ATCC에서 권고한 배지 조건에서 배양하였다. 배지는 MSKCC Media Preparation Core Facility 사에서 준비하였다. 세포주들 모두 ATCC 또는 MSKCC IGO Core Facility를 통해 STR 인증 받았다.
3차원 스페로이드 구축
스페로이드는, 종양 세포를 U자형 바닥의 Ultra Low Adherence (ULA) 96웰 플레이트 (Corning, Tewksbury, MA, USA)에 103/웰로 접종하여, 구축하였다. 이를 600 g에서 5분간 원심분리한 다음 2.5% Matrigel (Corning)을 첨가하여, 최적의 3차원 구조를 구축하였다. 플레이트는 단일한 세포 스페로이드를 형성시키기 위해 37℃, 5% CO2, 95% 가습 하에 72시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, Matrigel가 함유된 신선한 배지 중에 RSL3를 지정된 시간 동안 스페로이드에 처리하였다.
세포 사멸 정량 및 세포 생존성 측정
세포를 적당한 세포 밀도로 플레이트에 접종하고, 5% CO2 함유 분위기 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션한 다음 개별 실험에 기술된 바와 같이 처리를 실시하였다. 세포를 hoechst 33342 (0.1 ㎍/ml)로 염색하여 전체 세포 수를 모니터링하고, Sytox Green (5 nM)으로 염색해 세포 사멸을 모니터링하였다. 지정된 시점에 배양 플레이트를 Cytation 5에 의해 판독하였다. 세포 사멸의 %를 전체 세포 수에 대한 Sytox Green-양성 세포 수로 계산하였다. 3D 스페로이드의 경우, 상업적으로 입수가능한 세포 생존성 분석 (Promega, Madison, WI, USA)을 제조사의 지침에 따라 사용해 세포 생존성을 결정하였다. 생존성은 음성 대조군 (처리 없이 보통의 완전 배지 중의 스페로이드)에서의 ATP 수준에 대해 샘플의 ATP 수준을 정규화하여 계산하였다.
지질 과산화 측정
지질 과산화는 유세포 측정으로 분석하였다. 세포를 6웰 플레이트에 적당한 밀도로 접종하고, 밤새 DMEM에서 배양하였다. 세포는 지정된 처리 후 30분 동안 5 μM BODIPY C11 (Thermo Fisher, Cat# D3861)으로 염색하였다. 표지된 세포를 트립신 처리하고, PBS + 2% FBS에 재현탁한 다음 유세포 측정 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯
세포 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 분리시켜 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 막은 5% 탈지유에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후 차단 완충제에 희석한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음과 같은 1차 항체를 이용하였다: PTEN (9559L, CST), 포스포-Akt Ser473 (4060, CST), Akt (2920, CST), β-액틴 (Sigma-Aldrich, A1978), GAPDH (SC-47724, Santa Cruz), Raptor (2280, CST), Rictor (9476, CST), 총 S6K (2708, CST), 포스포-p70 S6 키나제 Thr389 (9205, CST), ATG5 (A0731, Sigma), LC3 I/II (L7543, Sigma), SREBP1(SC-13551, Santa Cruz), SCD1 (ab39969, Abcam), FASN (3180, CST), ACACA (3662, CST), NRF2 (16396-1-AP, Proteintech Group, Inc.), Keap1 (8047S, CST), GPX4 (ab125066, Abcam) 및 Cas9 (14697S, CST). 3회 세척한 후, 막을 염소 항-마우스 HRP-접합 항체 또는 당나귀 항-토끼 HRP-접합 항체 (Invitrogen)와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, Clarity™ Western ECL Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용해 화학발광을 수행하였다. Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA)을 최종 검출에 이용하였다.
RT- PCR
총 RNA는 트리졸 시약 (Invitrogen)을 사용해 준비하였다. 각 샘플에 20% 클로로포름을 첨가하였다. 샘플을 15초간 왕성하게 교반한 다음 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 샘플을 12,000 g에서 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 수상을 새로운 시험관으로 옮기고, 이소프로판올을 동일 부피로 첨가하였다. 샘플을 실온에서 10분간 인큐베이션한 다음 12,000 g에서 10분간 4℃에서 원심분리하였다. mRNA 펠릿을 75% 에탄올에서 헹군 다음 건조하여 뉴클레아제-프리 물에 재현탁하였다. mRNA를 cDNA로 역전사하였다. cDNA는 실시간 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 프로그램은 다음과 같다: 95℃, 30초; 사이클 40회 (각 사이클: 95℃, 15초; 55℃, 40초). 프라이머는 다음과 같다:
표 1 - 프라이머 서열
유전자 정방향 프라이머 5'-3' 역방향 프라이머 5'-3'
β-액틴 CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT 서열번호 1 AGCACTGTGTTGGCGTACAG 서열번호 2
SREBF1 GCTGCTGACCGACATCGAA 서열번호 3 GGGTGGGTCAAATAGGCCAG 서열번호 4
FASN AACTCCAAGGACACAGTCACCAT 서열번호 5 CAGCTGCTCCACGAACTCAA 서열번호 6
ACACA GGATGGGCGGAATGGTCTCTTT 서열번호 7 GCCAGCCTGTCGTCCTCAATGTC 서열번호 8
ACLY AACGCCAGCGGGAGCACATC 서열번호 9 TTGCAGGCGCCACCTCATCG 서열번호 10
SCD CCGGACACGGTCACCCGTTG 서열번호 11 CGCCTTGCACGCTAGCTGGT 서열번호 12
렌티바이러스 -매개 shRNA 간섭
RPTOR 및 RICTOR을 표적화하는 렌티바이러스 shRNA 클론을 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. delta-VPR 외막을 가진 렌티바이러스 벡터와 CMV VSV-G 패키징 플라스미드를 293T 세포에 PEI를 이용해 공동-형질감염시켜, 렌티바이러스를 제조하였다. 형질감염 후 8시간 경과시 배지를 교체하였다. 형질감염 후 48시간에 상층액을 수집하여 0.45 ㎛ 필터를 통과시켰다. 세포를 4 ㎍/ml 폴리브렌 (Sigma-Aldrich)의 존재 하에 감염성 입자와 함께 밤새 인큐베이션하고, 세포에 신선한 완전 배지를 제공하였다. 48시간 후, 세포를 적절한 항생제 선별 하에 두었다.
레트로바이러스-매개 유전자 과다 발현
SREBP1 및 SCD1을 유도 발현하기 위해, cDNA를 수득하여 레트로바이러스 벡터의 변형된 버전으로 서브클로닝하였다. gag/pol을 가진 레트로바이러스 벡터와 VSV-G를 293T 세포에 공동-형질감염시켜 레트로바이러스를 생성하였다. 바이러스를 수집하여 0.45 ㎛ 필터를 통과시켰다. 감염된 세포를 히그로마이신 함유 배지에서 선별하였다. 배양 배지에 100 ng/ml 독시사이클린을 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다.
유도성 CRISPR / Cas9 매개 GPX4 넉아웃
렌티바이러스 독시사이클린 (DOX)-유도성 pCW-Cas9 벡터와 pLX-sgRNA를 유도성 유전자 넉아웃 (iKO)에 이용하였다. 인간 GPX4를 표적화하는 sgRNA 서열은 CACGCCCGATACGCTGAGTG (서열번호 19)이다. 렌티바이러스를 293T 세포에서 패키징하였다. 형질감염 후 8시간 경과시 배지를 교체하고, 바이러스-함유 상층액을 수집해 형질감염 후 48시간에 여과하였다. 6웰 조직 배양 플레이트에서 BT474 세포에 4 ㎍/mL 폴리브렌을 함유한 pCW-Cas9 바이러스 상층액을 감염시켰다. 감염 후 48시간에 2 ㎍/ml 푸로마이신으로 세포를 선별하였다. 단일 클론을 DOX-유도성 Cas9 발현에 대해 스크리닝하였다. Cas9를 발현하는 단일 클론에 GPX4 sgRNA 바이러스-함유 상층액을 4 ㎍/ml 폴리브렌을 이용해 감염시켰다. 감염 후 48시간에 10 ㎍/ml 블라스티시딘을 이용해 세포를 선별하였다. DOX-유도성 Cas9 발현 및 GPX4 넉아웃을 가진 단일 클론을 증폭시켜 이용하였다.
구성적인 CRISPR / Cas9 매개 넉아웃 구축
CRISPR/Cas9-매개 넉아웃 시스템으로 Keap1, NRF2 및 SREBP1 고갈 세포를 구축하였다. sgRNA 서열을 LentiCRISPRV2에 클로닝하였다. SCD1 고갈 세포는 CRISPR/Cas9 매개 넉아웃 시스템을 이용해 안정적인 Cas9 발현 세포 및 sanger CRISPR 클론을 사용해 구축하였다. psPAX2 (Addgene)를 가진 렌티바이러스 벡터와 VSV-G (Addgene)를 293T 세포에 PEI를 이용해 공동-형질감염하여, 렌티바이러스를 생성하였다. 실험을 진행하기 전 푸로마이신-함유 배지에서 감염 세포를 선별하였다. 본 실험에서 사용한 sgRNA 서열을 아래 열거한다:
표 2 - sgRNA 서열
유전자 sgRNA 서열
KEAP1 AGCCGCCCGCGGTGTAGATC 서열번호 13
NFE2L2 GCGACGGAAAGAGTATGAGC 서열번호 14
SREBF1 #1: GAGACCTGCCGCCTTCACAG 서열번호 15
#2: GGATCTGGTGGTGGGCACTG 서열번호 16
SCD #1: GAGACGATGCCCCTCTACTTGG 서열번호 17
#2: TACTATTTTGTCAGTGCCCTGG 서열번호 18
생체내 이종이식 마우스 모델
17-β-에스트라디올 60일 방출 펠릿을 종양 접종하기 7일 전에 좌측 옆구리에 피하 이식하였다. 6-8주령의 암컷 무흉선 nu/nu 마우스의 우측 옆구리에 세포 5x106개를 피하 주사하여 GPX4 iKO BT474 세포를 접종하였다. 종양 증식을 외부 캘리퍼 측정을 통해 정기적으로 모니터링하였다. 종양이 지정된 크기에 도달하면, 마우스를 4개의 군으로 무작위 분할하였다: (1) 비히클 군 (매일 i.p. 비히클 및 정상 식이), (2) CCI-779 군 (매일 i.p. 2 mg/kg CCI-779 및 정상 식이), (3) Dox 군 (매일 i.p. 비히클 및 Dox 식이), (4) Dox + CCI-779 군 (매일 i.p. 2 mg/kg CCI-779 및 DOX 식이). 마우스에 CCI-779 처리하기 전 우측에 2일간 0.9% 멸균 식염수 또는 Dox (매일 100 mg/체중 kg, i.p.)를 복막내 주사하였다. 그런 후, 마우스에 Dox 군 및 Dox+CCI-779 군의 경우, 지정된 바와 같이, CCI-779 처리와 함께 또는 처리 없이, 매일 Dox 식이를 제공하였다. CCI-779를 에탄올에 용해하고, 멸균수 중의 5% Tween 80 및 5% PEG400 용액으로 희석하여 i.p. 주사에 의해 투여하였다. 종양의 최장 폭 (X)과 길이 (Y)를 매일 측정하고, 식: V = (X2Y)/2으로 체적 (V)을 계산하였다. 종양 증식을 경시적으로 모니터링하였다. 모든 실험에서, 마우스는 미리 정해진 엔드포인트에서 희생시켰다. 임의의 종양이 체적 2000 mm3, 직경 1.5 cm 또는 체중의 10%를 초과하면, 마우스를 즉시 안락사시켰다. 실험 종료 시점에, 마우스는 CO2로 안락사시키고, 종양을 무게 측정하기 위해 취하여 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 결과는 평균 종양 체적 ± SD로 나타낸다.
PC-3 종양 모델의 경우, 5-6주령의 수컷 무흉선　nu/nu　마우스의 우측 옆구리에 PC-3 세포 5x106개를 주사하였다. 종양을 매일 캘리퍼를 사용해 측정하였다. 종양이 평균 체적 200 mm3에 도달하면, 마우스를 무작위로 4개의 군으로 나누었다: (1) 비히클 군 (매일 i.p. 65% D5W (5% 덱스트로스/물), 5% Tween-80, 30% PEG-400); (2) IKE 군 (매일 i.p. 65% D5W (5% 덱스트로스 수용액), 5% Tween-80, 30% PEG-400에 용해한, 50 mg/kg IKE); (3) CCI-779 군 (매일 i.p. 에탄올에 용해하고 5% Tween 80 및 5% PEG400 멸균 수용액으로 희석한, 2 mg/kg CCI-779); (4) IKE + CCI-779 군 (매일 i.p. 50 mg/kg IKE 및 2 mg/kg CCI-779). 실험 종료시, 마우스를 CO2로 안락사시키고, 종양을 무게 측정하기 위해 취하였다.
면역조직화학법
포르말린-고정된, 파라핀-포매된 시료를 수집하고, 일상적인 H&E 슬라이드를 먼저 평가하였다. 상업적으로 구입가능한 항원 복구 시스템을 이용해 항원 복구를 수행하였다. 5 ㎛ 두께의 파라핀-함침된 단면에 대해 토끼 항-GPX4, 마우스 항-Ki-67, 토끼 항-PTGS2 및 토끼 항 pS235/236 S6 항체를 표준 아비딘-바이오틴 HRP 검출 시스템을 이용해 면역조직화학 염색을 수행하였다. 조직을 헤마톡실린으로 대조염색하고, 탈수 처리한 다음 마운팅하였다.
통계학적 분석
모든 데이터는 적용가능한 경우 3개 이상의 독립적인 실험의 평균 +/- SD로 나타내었다. 군 차이는 양측 t-검정 또는 이원식 ANOVA를 이용해 수행하였다. P < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER <120> INDUCTION OF FERROPTOSIS FOR CANCER THERAPY <130> MSKCC.051.WO1 <150> 63/093,151 <151> 2020-10-16 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ctcttccagc cttccttcct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 agcactgtgt tggcgtacag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 gctgctgacc gacatcgaa 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gggtgggtca aataggccag 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 aactccaagg acacagtcac cat 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 cagctgctcc acgaactcaa 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ggatgggcgg aatggtctct tt 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gccagcctgt cgtcctcaat gtc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 aacgccagcg ggagcacatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 ttgcaggcgc cacctcatcg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 ccggacacgg tcacccgttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 cgccttgcac gctagctggt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 agccgcccgc ggtgtagatc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 gcgacggaaa gagtatgagc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gagacctgcc gccttcacag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 ggatctggtg gtgggcactg 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 gagacgatgc ccctctactt gg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 tactattttg tcagtgccct gg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 cacgcccgat acgctgagtg 20

Claims (45)

  1. (a) PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제; 및 (b) 페롭토시스 (ferroptosis)의 유도제를 둘다 유효량으로 개체에 투여하여, 개체에서 종양의 증식을 감소시키거나 및/또는 종양의 퇴행을 유발하는 것을 포함하는, 필요한 포유류 개체에서 종양을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 종양 또는 PTEN 결손을 가진 종양이 존재하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 종양이 존재하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 개체에는 PTEN 결손을 가진 종양이 존재하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에는 유방 종양이 존재하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 유방 종양이 존재하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에는 전립선 종양이 존재하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 개체에는 PTEN 결손을 가진 전립선 종양이 존재하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 PI3K 저해제, Akt 저해제, MTOR 저해제, MTORC1 저해제, SREBP 저해제 및 SCD1 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 PI3K 저해제인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PI3K 저해제가 GDC-0941, SAR245409, SAR245408, BYL-719, GDC-0980, 워트만닌 (wortmannin), Ly294002, 데메톡시비리딘, 페리포신 (perifosine), 델랄리십 (delalisib), 이델라이십 (idelaisib), PX-866, IPI-145, BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR 1202, RP5264, SF1126, INK1117, BKM120, Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477, CUDC-907 및 AEZS-136으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 Akt 저해제인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 Akt 저해제가 MK-2206, MK-2206, 페리포신 (perifosine), GSK690693, 이파타세르팁 (ipatasertib) (GDC-0068), AZD5365, 어푸레세르팁 (afuresertib)(GSK2110183), At13148, PF-04691502, AT7867, 트리시리빈 (triciribine), CCT128930, A-674563, PHT0427, 밀테포신 (miltefosine), 호노키올 (honokiol) 및 TIC10으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 MTOR 저해제인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 MTOR 저해제가 SAR245409, GDC-0980, CCI-779, KU-0063794, 라파마이신 (rapamycin), 에피갈로카테킨 갈레이트 (epigallocatechin gallate, EGCG), 카페인, 커쿠민 (curcumin), 레스베라트롤 (resveratrol), 시롤리무스 (sirolimus), 템시롤리무스 (temsirolimus), 에베롤리무스 (everolimus) 및 리다포롤리무스 (ridaforolimus)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 MTORC1 저해제인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 MTORC1 저해제가 템시롤리무스 (CCI-779), 토린 (Torin) 및 RAPTOR의 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTORC1 신호전달 축에 대한 저해제가 SREBP 저해제인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 SREBP 저해제가 파토스타틴 A (Fatostatin A)인, 방법.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTORC1 신호전달 축에 대한 저해제가 SCD1 저해제인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 SCD1 저해제가 CAY10566인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페롭토시스의 유도제가 RSL3, 에라스틴 (erastin), 이미다졸 케톤 에라스틴 (IKE), 설파살라진 (sulfasalazine), 소라페닙 (sorafenib), 알트레타민 (altretamine), 아르테수네이트 (artesunate), ML-162 및 ML-210으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 필요한 개체에서 종양을 치료하는데 이용하기 위한, (a) PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제, (b) 페롭토시스 (ferroptosis)의 유도제, 및 (c) 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 치료학적 조성물.
  24. 필요한 개체에서 종양을 치료하는데 이용하기 위한 (a) PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제와 (b) 페롭토시스의 유도제의 조합물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 종양 또는 PTEN 결손을 가진 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  27. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 PTEN 결손을 가진 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  28. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 유방 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  29. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 PI3K-PTEN-AKT-mTOR 경로에 활성화 돌연변이를 가진 유방 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  30. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 전립선 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  31. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 개체에는 PTEN 결손을 가진 전립선 종양이 존재하는, 조성물 또는 조합물.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 PI3K 저해제, Akt 저해제, MTOR 저해제, MTORC1 저해제, SREBP 저해제 및 SCD1 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 조합물.
  33. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 PI3K 저해제인, 조성물 또는 조합물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 PI3K 저해제가 GDC-0941, SAR245409, SAR245408, BYL-719, GDC-0980, 워트만닌, Ly294002, 데메톡시비리딘, 페리포신, 델랄리십, 이델라이십, PX-866, IPI-145, BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR 1202, RP5264, SF1126, INK1117, BKM120, Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477, CUDC-907 및 AEZS-136으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 조합물.
  35. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 Akt 저해제인, 조성물 또는 조합물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 Akt 저해제가 MK-2206, MK-2206, 페리포신, GSK690693, 이파타세르팁 (GDC-0068), AZD5365, 어푸레세르팁 (GSK2110183), At13148, PF-04691502, AT7867, 트리시리빈, CCT128930, A-674563, PHT0427, 밀테포신, 호노키올 및 TIC10으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 조합물.
  37. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 MTOR 저해제인, 조성물 또는 조합물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 MTOR 저해제가 SAR245409, GDC-0980, CCI-779, KU-0063794, 라파마이신, 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG), 카페인, 커쿠민, 레스베라트롤, 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스 및 리다포롤리무스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 조합물.
  39. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTOR 신호전달 축에 대한 저해제가 MTORC1 저해제인, 조성물 또는 조합물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 MTORC1 저해제가 템시롤리무스 (CCI-779), 토린 및 RAPTOR의 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 조합물.
  41. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTORC1 신호전달 축에 대한 저해제가 SREBP 저해제인, 조성물 또는 조합물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 SREBP 저해제가 파토스타틴 A인, 조성물 또는 조합물.
  43. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K/Akt/MTORC1 신호전달 축에 대한 저해제가 SCD1 저해제인, 조성물 또는 조합물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 SCD1 저해제가 CAY10566인, 조성물 또는 조합물.
  45. 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페롭토시스의 유도제가 RSL3, 에라스틴, 이미다졸 케톤 에라스틴 (IKE), 설파살라진, 소라페닙, 알트레타민, 아르테수네이트, ML-162 및 ML-210으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 조합물.
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