KR20230077660A - 제어된 자기장 환경에서 산화철 나노입자를 도입한 근관세포의 정렬 기술 - Google Patents

제어된 자기장 환경에서 산화철 나노입자를 도입한 근관세포의 정렬 기술 Download PDF

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KR20230077660A
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myotube cells
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정재현
조성우
홍석현
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숭실대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 실제 근육을 모사하며 전기신호에 반응하여 수축과 이완 운동을 할 수 있으며, 체외의 2D 또는 3D 환경에서 근아세포 내에 있는 산화철 나노입자가 선택적으로 조절가능한 자기장의 영향을 받아 근관세포를 일정한 방향으로 정렬시킬 수 있으며, 더불어 조절된 자기장 환경에서 대면적으로 정렬된 근관세포가 실제 근육의 역할을 모사할 수 있어서 외부동력 없이 자체적으로 운동 가능한 세포 기반의 바이오 로봇을 비롯한 근육 및 동력이 필요한 다양한 기술분야에서 대체 동력원으로서 활용도를 크게 제고시킬 수 있는 근아세포의 제조 및 근관세포의 정렬기술을 제공한다.

Description

제어된 자기장 환경에서 산화철 나노입자를 도입한 근관세포의 정렬 기술{Sorting technology of myotube cells incorporating iron oxide nanoparticles in a controlled magnetic field environment}
본 발명은 전기신호에 반응하여 수축과 이완 운동을 할 수 있는 근관세포의 정렬기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 조절된 자기장 환경에서 대면적으로 정렬된 근관세포가 실제 근육의 역할을 모사할 수 있어서 외부동력 없이 자체적으로 운동 가능한 세포 기반의 바이오로봇 및 바이오액츄에이터 등의 동력원으로써 사용될 수 있는 근아세포 및 이를 포함하는 근관세포에 대한 것이다.
근육은 뼈와 함께 신체의 전체적인 형태를 잡아주며 움직임을 가능하게 하는 중요 구성요소이다. 이와 같은 근육은 신경의 자극에 따라 수축과 이완을 반복하며 전기신호의 형태를 나타낸다.
특히, 신체 내의 근섬유를 이루는 근관세포(myotube)는 근아세포(myoblast)의 분화와 정렬을 통해 형성되는데, 근아세포를 근관세포로 분화시켜 여러 분야에 응용하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 다만, 체내의 근섬유와는 다르게 체외 환경에서 분화된 근관세포는 무작위로 배열하기 때문에 실제 근육과 동일한 근수축(muscle contraction)을 모사하는데 어려움이 있다. 즉 인체 근육은 근관이 모두 정렬되어 같은 방향으로 수축과 이완을 반복하는 반면 체외 환경에서 분화된 근관세포는 무작위한 방향성을 갖기 때문이다.
한편, 바이오 로봇을 비롯한 생체조직 기반의 바이오 기술에서 근관세포를 통한 대체 동력원에 대한 수요가 늘어나고 있으나, 상기 근관세포의 무작위 배열로 인한 근육의 수축과 이완을 충분히 모사하지 못하는 한계로 인해 바이오 기술에 대한 연구 및 개발이 활발히 진행되지 못하고 있는 실정이다. 또한, 이와 같은 근관세포의 정렬기술을 이용하더라도 표면에 붙어있는 형태의 2차원적인 모사만 가능하여 실질적으로 신체 내부에 3차원적인 근육을 모사하는데 어려움이 있어 이를 활용하는데 한계가 있다.
이에 따라 체외 환경에서의 근아세포의 배양 및 원하는 방향으로 근관세포를 정렬할 수 있는 기술에 대한 연구가 시급하다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 실제 근육을 모사하며 전기신호에 반응하여 수축과 이완 운동을 할 수 있어서 근관세포의 정렬기술을 제공하는 것이다.
체외의 2D는 물론 3D 환경에서도 근아세포 내에 있는 산화철 나노입자 가 선택적으로 조절가능한 자기장의 영향을 받아 근아세포로부터 분화된 근관세포를 일정한 방향으로 정렬시킬 수 있는 근아세포 및 근관세포를 제공하는 것이다.
또한, 조절된 자기장 환경에서 대면적으로 정렬된 근관세포가 실제 근육의 역할을 모사할 수 있어서 외부동력 없이 자체적으로 운동 가능한 세포 기반의 바이오로봇 및 바이오액츄에이터 등의 동력원으로써 활용할 수 있는 근관세포 정렬기술을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위하여 제어된 자기장 환경에서 가해준 자기력선 방향에 따라 근관세포로 분화하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포를 제공한다.
또한 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 나노입자는 초자성 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 초자성 나노입자는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 나노입자는 N-Hydroxysuccinimide ester를 포함하는 기능기로 기능화된 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포에 자기장을 인가하여 자기력선 방향에 따라 분화되어 정렬시킨 근관세포를 제공한다.
또한, 하기 수학식 1에 따른 Order parameter(S) 값이 0.9 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00001
이때 상기　θ는 근관세포의 정렬 방향(°)이고,
상기 P(θ)는 전체 근관세포 대비 각도 θ로 정렬된 근관세포의 비율이다.
또한 본 발명은 나노입자를 기능화하는 제1단계, 기능화된 나노입자를 근아세포에 도입하는 제2단계를 포함하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포의 제조방법를 제공한다.
또한, 상기 제1단계는 초자성 나노입자 및 N-Hydroxysuccinimide ester를 포함하는 기능기를 1: 30 내지 100의 개수 비율로 합성하는 단계인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 제2단계는 0.01~1 mg/mL in media의 농도를 가지는 기능화된 나노입자를 (1~10)×104~5개의 근아세포에 도입하는 단계인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 근아세포의 제조방법으로 제조된 근아세포를 근관세포로 분화시킴과 동시에 자기장을 인가하여 근관세포를 3차원으로 정렬시키는 단계를 더 포함하는 정렬된 근관세포의 정렬기술을 제공한다.
또한, 본 발명은 3차원적으로 정렬된 근관세포를 이용하여 근관을 진단하는 기술을 제공한다.
본 발명은 전기신호에 반응하여 수축과 이완 운동을 할 수 있으며, 체외의 2D는 물론 3D 환경에서도 근아세포 내에 있는 산화철 나노입자가 선택적으로 조절가능한 자기장의 영향을 받아 근관세포를 일정한 방향으로 정렬시킬 수 있다. 더불어, 3D 배지에서 본 발명에 따른 산화철 나노입자를 도입한 세포를 봉입 후, 자기장 환경에서 세포를 키울 경우 3차원적으 조절된 자기장 환경에서 대면적으로 정렬된 근관세포가 실제 근육의 역할을 모사할 수 있어서 외부동력 없이 자체적으로 운동 가능한 세포 기반의 바이오 로봇을 비롯한 근육 및 동력이 필요한 다양한 기술분야에서 대체 동력원으로서 활용도를 크게 제고시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 대하여 자기장을 인가하고 근관세포의 정렬된 모습을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 대한 VSM(Vibrating Sample Magnetometer) 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 초자성 나노입자가 근아세포에 성공정으로 도입되었는지 확인하기 위하여, 세포가 배지 바닥에 부착하기 전인 부유 상태에서 자기력을 가한 모습을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 대하여 자기장을 가하여 근관세포를 정렬시킨 모습을 나타내는 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 전자석 장치를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 자기장 환경을 가하여 9 일 동안 근관세포로의 분화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 대하여 자기력선의 방향을 0°로 설정하고, 근관의 형성 방향을 기준으로 자기력선으로부터 틀어진 정도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 대하여 자기력 세기에 따른 근관의 정렬 정도를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
상술한 것과 같이 근관세포는 체내 근육 세포와 다르게 체외에서 무작위 방향으로 배열하는 특징이 있어서, 근관세포를 통한 근육의 수축 및 이완을 연구하는데 큰 제한이 있다.
이에 따라, 본 발명은 제어된 자기장 환경에서 가해준 자기력선 방향에 따라 근관세포로 분화하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
이를 통해, 본 발명은 전기신호에 반응하여 수축과 이완 운동을 할 수 있으며, 체외의 2D 또는 3D 환경에서 근아세포 내에 있는 산화철 나노입자가 선택적으로 조절가능한 자기장의 영향을 받아 근관세포를 일정한 방향으로 정렬시킬 수 있다. 더불어, 조절된 자기장 환경에서 대면적으로 정렬된 근관세포가 실제 근육의 역할을 모사할 수 있어서 외부동력 없이 자체적으로 운동 가능한 세포 기반의 바이오 로봇을 비롯한 근육 및 동력이 필요한 다양한 기술분야에서 대체 동력원으로서 활용도를 크게 제고시킬 수 있다.
이하 도면을 참조하여 본 발명에 따른 근아세포, 정렬된 근관세포 및 근관세포의 정렬 기술에 대하여 설명한다.
먼저 본 발명에 따른 근아세포의 제조방법은 나노입자를 기능화하는 제1단계, 기능화된 나노입자를 근아세포에 도입하는 제2단계를 포함한다.
상기 제1단계에서 근아세포는 제어된 자기장 환경에서 가해준 자기력선 방향에 따라 근관세포로 분화하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포를 의미한다.
일반적으로 근육은 동물의 신체를 구성하는 중요 요소로, 뼈와 함께 신체의 전체적인 형태를 잡아주며 움직임을 가능하게 한다. 또한 근육은 신경의 자극에 따라 수축과 이완을 반복하며, 이때의 신경 자극은 전기신호의 형태를 나타낸다. 특히, 신체 내의 근섬유를 이루는 근관세포(myotube)는 근아세포(myoblast)의 분화와 정렬을 통해 형성되는데 인체 근육과 달리 근관세포는 체외에서 대면적으로 정렬시키는데 어려움이 있다. 즉, 인체 근육은 근관이 모두 정렬되어 같은 방향으로 수축과 이완을 반복하는 반면, 체외 환경에서 분화된 근관세포는 무작위한 방향성을 갖기 때문에 실제 근육의 움직임을 모사하기 어렵다. 따라서 체외 환경 에서의 근아세포의 배양 및 분화와 동시에 원하는 방향으로 근관세포를 정렬할 수 있는 기술이 요구된다.
이에 본 발명은 상기 제1단계에서 나노입자를 초자성 나노입자로 구현하여 근아세포에 도입함으로써 선택적으로 조절가능한 자기장의 영향을 받아 근관세포를 일정한 방향으로 정렬시킬 수 있는 근아세포를 구현할 수 있다.
보다 구체적으로 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 상기 제1단계에서 나노입자를 초자성 나노입자로 구현한 경우 자기장 환경에서의 배양 및 근관 형성을 유도할 수 있어서, 세포 배지에 어떠한 처리 없이 자기력선의 방향으로 근관세포를 정렬시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한, 면역염색을 통해 근관세포의 방향성을 분석한 결과, 본 발명에 따라 상기 나노입자가 초자성 나노입자로 구현된 실시예는 자기력선의 방향으로 형성된 근관의 비율이 초자성 나노입자로 구현되지 않은 비교예에 비해 약 26.5% 증가한 것을 확인할 수 있다.
이를 위해 상기 제1단계의 초자성 나노입자는 입자 주변에 자기장을 가할 경우 각각의 입자들은 자성을 지니는 자기 모멘트(magnetic mement)를 가지는 초자성 나노입자를 사용할 수 있다. 초상자성 나노입자는 주변의 자기장이 사라진 직후, 입자들의 잔류 자성(remanence)은 소멸될 수 있다.
보다 구체적으로 도 2를 참조하면, 본 발명에 따라 상기 나노입자가 초자성 나노입자로 구현된 바람직한 실시예는 VSM(Vibrating Sample Magnetometer) 분석에서 자기 모멘트가 55 emu/g 이상임과 동시에 잔류 자성을 가지지 않으며, 비교예(Control)와는 다르게, 7000 Gauss 세기 이상의 자기장에서 일정한 자기 모멘트를 가짐을 알 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 상기 초자성 나노입자는 55 emu/g 이상의 자기 모멘트를 나타냄과 동시에 잔류 자성을 가지지 않는 초상자성(superparamagnetism)을 지닐 경우 근관세포로의 정렬을 이룰 수 있다.
한편 상기 나노입자는 제1단계를 통해 기능기로 기능화될 수 있다.
즉 본 발명은 초자성 나노입자를 포함한 근아세포를 통해 조절된 자기장 환경에서 근관세포로의 정렬을 유도할 수 있는데, 근아세포에 초자성 나노입자를 도입하여 근관세포로 분화시키기 전에 초자성 나노입자에 기능기로 기능화하여 세포 친화적인 초자성 나노입자를 구현할 수 있다.
이때 초자성 나노입자를 기능화하기 위하여 본 발명의 목적에 부합하는 한 공지의 통상적인 세포 친화적인 물질이 사용될 수 있으며, Iron oxide nanoparticles, gold nanoparticles로 이루어진 군에서 적어도 어느 하나를 사용할 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 상기 초자성 나노입자가 산화철 나노입자로 구현되는 경우 상기 기능기는 N-Hydroxysuccinimide ester를 포함하는 기능기일 수 있다.
보다 구체적으로 3을 참조하면, 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 근아세포에 도입할 초자성 나노입자로 fIONPs(functionalized Iron Oxide Nanoparticles)를 사용할 수 있으며 이와 같은 fIONPs는 1 내지 10 nm 크기의 산화철 나노입자에에 Arg-Gly-Asp(RGD) sequence를 통해 구현할 수 있다.
이때 상기 RGD sequence 입자는 각각 NHS기(N-Hydroxysuccinimide ester)를 하나씩 가지고 있을 수 있기 때문에 도 3과 같이 초자성 나노입자가 가지고 있는 아민기와 NHS기의 합성은 pH 7~9 환경에서 높은 수율로 이루어질 수 있다. 이를 위해 상기 제1단계의 기능기 도입은 초자성 나노입자 및 N-Hydroxysuccinimide ester를 포함하는 기능기를 1: 30 내지 100의 개수 비율로 합성할 수 있다.
다음, 본 발명에 따른 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포의 제조방법 제2단계는 기능화된 나노입자를 근아세포에 도입하는 단계이다.
상술한 제1단계를 거쳐 기능기로 기능화된 초자성 나노입자는 근아세포가 자기장의 영향을 받으면서 분화할 수 있도록, 제2단계에서 충분한 양의 초자성 나노입자가 근아세포에 도입되어야 한다.
이를 위해 상기 제2단계는 0.01~1 mg/mL in media의 농도를 가지는 기능화된 초자성 나노입자를 (1~10)×104~6개의 근아세포에 도입하는 단계일 수 있다. 이때 만일 상기 기능화된 초자성 나노입자의 농도가 0.01 mg/mL in media 미만일 경우 근아세포에 도입된 초자성 나노입자의 양이 부족하여 이후 근관세포로의 정렬이 어려울 수 있다.
도 4를 참조하면, 근아세포에 본 발명의 바람직한 실시예인 fIONPs가 성공적으로 도입되었는지 확인하기 위해, 세포가 배지 바닥에 부착하기 전인 부유 상태에서 자기력을 가한 결과 전자석에 가까운 방향으로 근아세포가 이동함과 동시에, 자기력의 세기가 강해질 수록 세포의 이동속도가 더욱 빨라짐을 알 수 있다(도 5(A)). 또한, 배지 안의 부유 근아세포가 자기장을 걸어준 환경에 노출된 모습을 통해 부유 세포는 N극 전자석에 가까이 위치하였고, 자기력의 영향을 받는 세포들은 왼쪽으로 이동한 것을 알 수 있다(도 5(B)). 또한, 실제 부유 세포의 시간별 이동 경로를 분석하기 위해 자기력을 15, 330, 1000 Gauss로 가했고, 각 자기력 별로 2개의 근아세포를 선정하여 이동경로를 추적한 결과 해당 세포에 15 Gauss의 자기력을 가해 줄 경우 초당 평균 16.86 μm을 이동했고, 330 Gauss의 자기력에선 초당 평균 53.96 μm, 1000 Gauss의 자기력에선 초당 평균 93.61 μm만큼 이동한 것을 알 수 있다. 이를 통해 근아세포에 본 발명의 바람직한 실시예인 기능기가 도입되어 기능화된 초자성 나노입자인 fIONPs가 성공적으로 도입했을 뿐만 아니라, 자기력의 세기가 강해질수록 세포에 더욱 강한 힘이 작용한다는 사실을 알 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 방법으로 기능화된 나노입자가 도입된 근아세포를 근관세포로 분화시킴과 동시에 자기장을 인가해주는 단계를 더 포함하는 근관세포 정렬기술을 제공한다.
보다 구체적으로 상기 제1 및 2단계를 통해 제조된 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포에 자기장을 인가하여 자기력선 방향에 따라 분화시킴으로써 근관세포로 정렬시킬 수 있는데, 이때 근아세포를 분화 및 정렬시키는 방법은 본 발명의 목적에 부합하는 한 공지의 통상적인 방법을 사용할 수 있어서 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 기능화된 나노입자가 도입된 근아세포를 근관세포로 분화시킴과 동시에 자기장을 인가해 줄 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 기능화된 나노입자가 도입된 근아세포를 근관세포로 분화시키는 본 발명의 일 실시예에 따라 근아세포를 분화시킨 후 정렬시킨 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따라 근아세포(myoblast)는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에 10% Fetal Bovine Serum(FBS)과 1% Penicillin and Streptomycin(PS)를 혼합한 성장 배지(growth media)를 통해 근아세포를 배양할 수 있다. 이때 근관세포로 분화하기 위해선 근아세포가 증식하여 단층을 형성하여야 하는데, 배지의 조성을 DMEM에 10% Horse Serum(HS)과 1% PS를 혼합한 분화배지 (differentiation media)를 통해 세포의 분화를 유도할 수 있다.
또한, 세포를 배양함과 동시에 배지 전체에 자기장 환경을 구현하기 위해한 본 발명의 일 실시예에 따라 도 6과 같은 전자석 장치를 할 수 있다. 즉 세포 배양 chamber를 두 전자석 사이에 위치시켜, chamber 내의 공기조성과 온도를 세포 배양에 최적인 환경(이산화탄소 3~7%, 상온)으로 유지시킴과 동시에 다양한 자기장 환경을 구현할 수 있다. 이때 전자석이 만들어내는 자기력선을 통해 기능화된 기능기를 포함하는 나노입자는 자기력선의 모양대로 배열하며 본 발명에 따른 근아세포 내에 있는 나노입자가 자기장의 영향을 받는다면, 해당 세포가 분화한며 자기력선의 방향으로 근관을 형성할 수 있고 이 때, 인접한 근아세포들의 융합을 통해 근관세포로 분화될 수 있다.
보다 구체적으로 도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따라 기능화된 초자성 나노입자가 도입된 근아세포에 600 Gauss 세기의 3s/57s pulsed 자기장 환경을 가하여 9 일 동안 근관세포로의 분화를 유도한 결과를 알 수 있다. 즉 3일째부터 인접한 근아세포들이 서로를 인식하며 분화하는 것을 알 수 있고, 6일째엔 근관세포의 형태로 분화가 시작되고 9일째에는 근관세포로 분화된 것을 확인할 수 있다.
한편 도 8은 자기력선의 방향을 0°로 설정하고, 근관의 형성 방향을 기준으로 자기력선으로부터 틀어진 정도를 분석한 결과를 나타낸다. 즉 도 8을 통해 기능화된 산화철 나노입자가 도입되지 않은 비교예(Control)의 경우 근관이 모든 방향으로 다양하게 형성되었으나, 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 기능화된 산화철 나노입자가 도입된 실험군(Cells with )은 자기력선의 방향(± 15°)으로 형성된 근관의 비율이 대조군에 비해 약 26.5% 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한, 대조군에 비해 산화철 나노입자가 도입된 실험군은 자기력선의 방향 주변으로 근관이 많이 형성된 것을 알 수 있다.
이때 본 발명은 근관 형성 방향에 대한 보다 정확한 분석을 위해 Order parameter를 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명은 대면적에서 θ각도로 배열된 n번째 근관의 정렬 정도 xn를 다음과 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 2]
Figure pat00002
S(θ)는 order parameter로 정의하고, 자기력선의 방향(θm)을 기준으로 근관의 생성 방향(θ)이 자기력선으로부터 얼마나 떨어져 있는지를 수치로 나타내는 값이며, 다음과 같이 나타낼 수 있다.
[수학식 3]
Figure pat00003
상기 수학식 2 및 3에 따라 자기력의 방향(θm)을 90°로 설정하면 근관의 생성 방향이 90°일 때 order parameter S(θ), 즉 근관의 정렬 정도는 1이며, 근관의 생성 방향이 90°에서 멀어질수록 order parameter S(θ) 값이 점점 감소한다. 최종적으로 근관이 180°방향으로 생성될 경우 order parameter 값은 -0.5가 된다.
또한, 대면적에서 근관의 정렬 정도를 구하기 위해 모든 근관의 정렬 정도를 함께 고려해야할 필요성이 있다. 이를 위하여, 본 발명은 하기 수학식 4와 같은 산술평균 개념을 도입하여 Mean order parameter S(θ)m을 구할 수 있다.
[수학식 4]
Figure pat00004
xa는 a번째 myotube의 정렬 정도, A는 전체 근관의 개수를 의미한다. 1°부터 180°까지 모든 각도에서 생성된 근관의 정렬 정도를 더해주어, 모든 근관의 정렬 정도를 고려하고, 모든 근관의 정렬 정도의 총합을 전체 근관의 개수 A로 나누면 mean order parameter (S)m을 구할 수 있다.
[수학식 5]
Figure pat00005
이 때, a(θ)는 θ 각도로 배열된 근관의 개수를 의미하며, 특정 각도(θ)로 생성된 근관의 개수 a(θ)를 전체 근관의 개수 A로 나누어주면 하기 수학식 6과 같이 θ 방향으로 정렬된 근관의 비율 P(θ)를 알 수 있다.
[수학식 6]
Figure pat00006
따라서, 대면적에서 모든 근관의 정렬 정도를 다음과 같은 식으로 계산할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00007
근관이 자기력의 방향으로 정렬이 잘 될수록 (S)m 값이 1에 가까워지며, 최종적으로 근관의 정렬 정도를 수치화할 수 있다.
P(θ)가 모든 각도 θ에서 일정한 경우 근관이 무작위로 배열되었다고 할 수 있다. 각도 θ는 1°부터 180°까지 고려하므로, 근관이 무작위로 배열될 경우 P(θ)는 1을 180으로 나눈 0.0056이며, Mean order parameter at non-directional phase (S)m, nd는 0.4496이다. 다음과 같은 수학식 7의 Alignmentinde (AI)를 통해 무작위로 배열된 근관 대비 얼마나 정렬이 잘 되었는지 계산할 수 있다.
[수학식 7]
Figure pat00008
도 10 및 하기 표 2를 참조하면, 0 gauss (control) 및 15 gauss의 자기력 세기에서 근관의 AI는 0.85% 및 0.93%로 무작위로 정렬됨을 알 수 있고, 300 gauss의 자기력 세기에서 근관의 AI는 47.52%를 나타낸다. 600 gauss 및 1500 gauss에서 근관의 AI는 각 64,12%, 57,65%로 자기력의 방향으로의 정렬 정도가 약 60% 개선됨을 알 수 있다. 형광염색을 통해 근관세포를 관찰한 결과, 자기력이 가해진 실험군은 자기력선의 방향으로 근관을 형성하는 모습을 확인할 수 있다.
최종적으로, 기능화된 산화철 나노입자를 도입한 근관세포를 일정한 방향의 자기장 환경에서 배양할 경우, 근관 형성을 자기력의 방향으로 유도할 수 있다. 또한, 자기력의 방향으로 유도된 근관은 57% 이상의 정렬 정도를 나타내며 대면적으로의 정렬이 개선됨을 알 수 있다.
이와 같이 본 발명은 실제 근육을 모사하며 전기신호에 반응하여 수축과 이완 운동을 할 수 있으며, 체외의 2D 또는 3D 환경에서 근아세포 내에 있는 산화철 나노입자가 선택적으로 조절가능한 자기장의 영향을 받아 근관세포를 일정한 방향으로 정렬시킬 수 있다. 더불어, 조절된 자기장 환경에서 대면적으로 정렬된 근관세포가 실제 근육의 역할을 모사할 수 있어서 외부동력 없이 자체적으로 운동 가능한 세포 기반의 바이오 로봇을 비롯한 근육 및 동력이 필요한 다양한 기술분야에서 대체 동력원으로서 활용도를 크게 제고시킬 수 있다.
즉, 3D 배지에서 산화철 나노입자를 도입한 세포를 봉입 후, 자기장 환경에서 세포를 키울 경우 3차원적으로 근관세포의 정렬을 기대할 수 있어서 이 경우, 종래 바닥에 붙어있는 형태의 2차원 형태의 근관세포 정렬 기술 대비 3차원 형태인 신체의 근관을 보다 더 높은 수준으로 모사할 수 있음으로 인해 더 좋은 효율의 바이오로봇 동력원으로 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
준비예 - fIONPs(functionalized Iron Oxide Nanoparticles) 제조
5nm 크기의 산화철 나노입자에 Arg-Gly-Asp(RGD) sequence를 합성하였다. Arg-Gly-Asp(RGD)는 NHS기(N-Hydroxysuccinimide ester)를 하나씩 가지고 있기 때문에 산화철 나노입자의 아민기와 NHS기의 합성은 pH 8 환경에서 진행하였다.
이때, 산화철 나노입자와 RGD sequence의 개수 비율을 1:60으로 하여 합성을 진행하여 fIONPs(functionalized Iron Oxide Nanoparticles)를 제조하였다.
실시예
이후 상기 준비예에서 제조한 fIONPs를 근아세포(C2C12, ATCC)에 도입하기 위하여 근아세포 개수 (1~10)×105에 fIONPs를 0.1mg Fe/mL in media의 농도로 12시간 배양시키며 근아세포의 나노입자 도입을 유도하였다. 이후, Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 떼어내어 새로운 배지에 배양하였다. 이는 fIONPs가 충분이 도입된 근아세포를 사용하고, 세포 외부 또는 배지에 남아있는 나노입자를 제 거하기 위함이다. 새로운 배지에서 근아세포를 근관세포로 분화시킴과 동시에 도 6과 같은 전기장 장치에서 배지 전체에 자기장을 걸어주었다. 이는 근아세포 내의 나노입자가 자기장의 영향을 받을 수 있도록 하기 위함이다.
비교예(Control)
상기 실시예와 동일한 근아세포에 기능기가 도입된 초자성 나노입자(준비예 1)를 도입하지 않은 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
실험예 1
상기 실시예 및 비교예에 대하여 자기장을 인가하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 상기 제1단계에서 나노입자를 초자성 나노입자로 구현한 경우 자기장 환경에서의 배양 및 근관 형성을 유도할 수 있어서, 세포 배지에 어떠한 처리 없이 자기력선의 방향으로 근관세포를 정렬시킬 수 있음을 알 수 있다. 즉 면역염색을 통해 근관세포의 방향성을 분석한 결과, 본 발명에 따라 상기 나노입자가 초자성 나노입자로 구현된 실시예는 자기력선의 방향으로 형성된 근관의 비율이 초자성 나노입자로 구현되지 않은 비교예에 비해 약 26.5% 증가한 것을 확인하였다.
실험예 2
상기 실시예 및 비교예에 대하여 VSM(Vibrating Sample Magnetometer) 분석을 수행하고 이를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 본 발명에 따라 상기 나노입자가 초자성 나노입자로 구현된 실시예는 VSM(Vibrating Sample Magnetometer) 분석에서 자기 모멘트가 55 emu/g 이상임을 알 수 있으며 자성이 없는 비교예(Control)와는 다르게, 7000 Gauss 세기 이상의 자기장에서 일정한 자기 모멘트를 가짐을 알 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 상기 초자성 나노입자는 자기 모멘트가 5000 Gauss 이상의 자기장에서 55 emu/g 이상의 자기 모멘트를 나타냄과 동시에 잔류 자성을 가지지 않는 초상자성(superparamagnetism)을 지닐 경우 근관세포로의 정렬을 이룰 수 있음을 나타낸다.
실험예 3
상기 실시예에 fIONPs가 성공적으로 도입되었는지 확인하기 위해 세포가 배지 바닥에 부착하기 전인 부유 상태에서 자기력을 가하고 그 결과를 도 4 및 하기 표 1에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 근아세포에 본 발명의 바람직한 실시예인 fIONPs가 성공적으로 도입되었는지 확인하기 위해, 세포가 배지 바닥에 부착하기 전인 부유 상태에서 자기력을 가한 결과를 알 수 있다. 자기력을 가한 결과 전자석에 가까운 방향으로 근아세포가 이동함과 동시에, 자기력의 세기가 강해질 수록 세포의 이동속도가 더욱 빨라짐을 알 수 있다(도 5(A)). 또한, 배지 안의 부유 근아세포가 자기장을 걸어준 환경에 노출된 모습을 통해 부유 세포는 N극 전자석에 가까이 위치하였고, 자기력의 영향을 받는 세포들은 왼쪽으로 이동한 것을 알 수 있다(도 5(B)). 또한, 실제 부유 세포의 시간별 이동 경로를 분석하기 위해 자기력을 15, 330, 1000 Gauss로 가했고, 각 자기력 별로 2개의 근아세포를 선정하여 이동경로를 추적한 결과 해당 세포에 15 Gauss의 자기력을 가해 줄 경우 초당 평균 16.86 μm을 이동했고, 330 Gauss의 자기력에선 초당 평균 53.96 μm, 1000 Gauss의 자기력에선 초당 평균 93.61 μm만큼 이동한 것을 알 수 있다. 이를 통해 근아세포에 본 발명의 바람직한 실시예인 기능기가 도입되어 기능화된 초자성 나노입자인 fIONPs가 성공적으로 도입했을 뿐만 아니라, 자기력의 세기가 강해질수록 세포에 더욱 강한 힘이 작용한다는 사실을 알 수 있다.
[표 1]
Figure pat00009
실험예 4
상기 실시예에 대하여 자기장 환경을 가하여 9 일 동안 근관세포로의 분화를 유도한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따라 기능화된 초자성 나노입자가 도입된 근아세포에 600 Gauss 세기의 3s/57s pulsed 자기장 환경을 가하여 9 일 동안 근관세포로의 분화를 유도한 결과를 알 수 있다. 즉 3일째부터 인접한 근아세포들이 서로를 인식하며 분화하는 것을 알 수 있고, 6일째엔 근관세포의 형태로 분화가 시작되고 9일째에는 근관세포로 분화된 것을 확인할 수 있다. 또한 대조군(Control)과는 다르게, 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 산화철 나노입자가 도입된 근관세포의 경우 자기장의 방향으로 정렬된 것을 확인할 수 있다.
실험예 5
상기 실시예 및 비교예에 대하여 자기력선의 방향을 0°로 설정하고, 근관의 형성 방향을 기준으로 자기력선으로부터 틀어진 정도를 분석하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, 기능화된 산화철 나노입자가 도입되지 않은 비교예(Control)의 경우 근관이 모든 방향으로 다양하게 형성되었으나, 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 기능화된 산화철 나노입자가 도입된 실험군(Cells with )은 자기력선의 방향(± 20°)으로 형성된 근관의 비율이 대조군에 비해 약 26.5% 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한, 대조군에 비해 산화철 나노입자가 도입된 실험군은 자기력선의 방향 주변으로 근관이 많이 형성된 것을 알 수 있다.
실험예 6
상기 실시예 및 비교예에 대하여 근관 형성 방향에 대한 보다 정확한 분석을 위해 Order parameter를 사용하고 이를 도 9 및 하기 표 2에 나타내었다.
도 9 및 하기 표 2를 참조하면, 상술한 수학식 2 내지 7 및 이를 통해 유도된 수학식 1에 의해 본 발명의 따른 실시예의 경우 (S)값은 경우 비교예에 비해 0.106 만큼 증가함을 확인할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00010
보다 구체적으로 도 9 및 하기 표 2를 참조하면, 0 gauss (control) 및 15 gauss의 자기력 세기에서 근관의 AI는 0.85%, 0.93%로 무작위로 정렬됨을 알 수 있고, 300 gauss의 자기력 세기에서 근관의 AI는 47.52%를 나타낸다. 600 gauss 및 1500 gauss에서 근관의 AI는 각 64,12%, 57,65%로 자기력의 방향으로의 정렬 정도가 약 57% 이상 개선됨을 알 수 있다. 형광염색을 통해 근관세포를 관찰한 결과, 자기력이 가해진 실험군은 자기력선의 방향으로 근관을 형성하는 모습을 확인할 수 있다.
최종적으로, 기능화된 산화철 나노입자를 도입한 근관세포를 일정한 방향의 자기장 환경에서 배양할 경우, 근관 형성을 자기력의 방향으로 유도할 수 있다. 또한, 자기력의 방향으로 유도된 근관은 약 57% 이상의 정렬 정도를 나타내며 대면적으로의 정렬이 개선됨을 알 수 있다.
[표 2]
Figure pat00011

Claims (11)

  1. 제어된 자기장 환경에서 가해준 자기력선 방향에 따라 근관세포로 분화하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 초자성 나노입자인 것을 특징으로 하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포.
  3. 제2항에 있어서,
    초자성 나노입자는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 N-Hydroxysuccinimide ester를 포함하는 기능기로 기능화된 것을 특징으로 하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포에 자기장을 인가하여 자기력선 방향에 따라 분화되어 정렬시킨 근관세포.
  6. 제5항에 있어서,
    하기 수학식 1에 따른 Order parameter(S) 값이 0.9 이상인 것을 특징으로 하는 정렬된 근관세포.
    [수학식 1]
    Figure pat00012

    이때 상기　θ는 근관세포의 정렬 방향(°)이고,
    상기 P(θ)는 전체 근관세포 대비 각도 θ로 정렬된 근관세포의 비율이다.
  7. 나노입자를 기능화하는 제1단계;
    기능화된 나노입자를 근아세포에 도입하는 제2단계; 를 포함하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1단계는 초자성 나노입자 및 N-Hydroxysuccinimide ester를 포함하는 기능기를 1: 30 내지 100의 개수 비율로 합성하는 단계인 것을 특징으로 하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제2단계는 0.01~1 mg/mL in media의 농도를 가지는 기능화된 나노입자를 (1~10)×104~6개의 근아세포에 도입하는 단계인 것을 특징으로 하는 기능화된 나노입자를 포함하는 근아세포의 제조방법.
  10. 제7항에 따라 제조된 근아세포를 근관세포로 분화시킴과 동시에 자기장을 인가하여 근관세포를 3차원으로 정렬시키는 단계; 를 더 포함하는 정렬된 근관세포의 정렬기술.
  11. 제10항에 따라 3차원적으로 정렬된 근관세포를 이용하여 근관을 진단하는 기술.


KR1020220153336A 2021-11-25 2022-11-16 제어된 자기장 환경에서 산화철 나노입자를 도입한 근관세포의 정렬 기술 KR20230077660A (ko)

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