KR20230074088A - A new aqueous refractive index matching and tissue clearing solution for biological imaging - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 생체 조직 투명화용 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 생체 조직을 투명화시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for clearing living tissue and a method for clearing living tissue using the composition.
x-ray를 통한 의료 진단 기술은 CT나 MRI와 같은 2차원 스캐닝 후 3차원으로 재구성하는 기술에 의하여 입체적으로 관찰, 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 광원이 아니라 초음파 등을 활용하는 경우 역시 3차원적 영상을 구현하는 기술이 진단에 활발하게 이용되고 있다. 그러나 현재 개발된 기술 대부분은 밀리미터 수준의 상대적으로 마크로 해상력을 가진 기술들로, 세포 수준에서의 분석이 가능한 마이크로 수준의 3차원 측정하는 기술은 상대적으로 그 발전이 미흡하여, 현재 대부분의 세포 수준 분석은 전통적인 2차원 기술을 이용하고 있다. 즉, 생검 또는 부검 조직 등 생체조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매한 후 수 마이크로미터 또는 나노미터 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 투과 이미지를 광학 또는 전자현미경을 이용하여 취득하는 기술을 사용하여 미세구조를 분석한다.Medical diagnosis technology through x-ray has been developed into a technology capable of 3D observation and precise diagnosis by 3D reconstruction technology after 2D scanning such as CT or MRI. In the case of using ultrasound instead of a light source, a technology for realizing a three-dimensional image is also actively used for diagnosis. However, most of the currently developed technologies are technologies with relatively macro resolution at the millimeter level, and the micro-level 3D measurement technology that can be analyzed at the cell level is relatively underdeveloped. uses traditional two-dimensional techniques. That is, biological tissue such as biopsy or autopsy tissue is fixed in a fixative, embedded in paraffin or polymer, and then sliced to a thickness of several micrometers or nanometers to allow light or electromagnetic waves to pass through, and the optical or electronic transmission image is then processed. The microstructure is analyzed using techniques obtained using a microscope.
이러한 미세 이미징 기술을 이용하여 3차윈 이미지를 획득하기 위해서는 콘포칼 현미경 등을 이용해야 하며, 이 경우 일반적으로 수십 마이크로미터 수준의 두께 정보를 획득할 수 있다. 대략적으로 이 두께는 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의하여 그 한계가 그어진다. 그러나 대부분의 생체 조직 내 유의미한 구조물들이 수백 마이크로미터 이상의 크기를 가지고 있으므로, 이와 같은 방법으로는 일부의 정보만을 취득할 수 있다. 따라서 보다 두꺼운 조직 내 이미지를 획득하기 위해서는 수십 마이크로 두께의 연속적인 절편을 제작하고, 이를 일일이 현미경으로 통하여 이미징한 후, 다시 재구성하는 일련의 과정을 필요로 한다. 특히 뇌조직의 경우 하나의 뉴런 전체를 이미징한다고 할 때, 경우에 따라서는 하나의 뉴런이 수 ｍ까지도 그 액손(Axon)을 뻗기 때문에, 조직을 자르고 붙이는 일련의 과정을 진행하면서 일어날 수 있는 문제점이 기하급수적으로 발생한다.In order to obtain a three-dimensional image using such a microscopic imaging technique, a confocal microscope or the like must be used, and in this case, thickness information on the order of tens of micrometers can be generally obtained. Roughly, this thickness is limited by the depth at which the light source can penetrate. However, since most of the significant structures in biological tissue have a size of hundreds of micrometers or more, only some information can be acquired by this method. Therefore, in order to acquire images in thicker tissues, a series of processes of fabricating continuous sections with a thickness of several tens of microns, imaging them individually through a microscope, and then reconstructing them are required. In particular, in the case of brain tissue, when imaging an entire neuron, in some cases, a neuron extends its axon up to several meters, so there are problems that may occur while performing a series of processes of cutting and attaching tissue. It happens exponentially.
조직 투명화 기술은 조직의 손상 없이 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있어 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다.Tissue transparency technology can check the internal structure and protein distribution of tissues without damaging the tissue, surpassing the observation limits of existing technologies, observing tissue structures to a deeper level, and accessing integrated structural and molecular information from various organ systems. In recent years, various methods have been developed to make the organization transparent.
종래 조직 투명화 기술로는 크게 4가지로 구분될 수 있다.Conventional tissue clearing techniques can be largely classified into four types.
첫째, 유기용매 (solvent)를 이용한 지질의 제거를 통해 투명화하는 방법으로, 상기 방법의 경우 인체유해 유기용매 사용으로 후드에서 사용하여야 하며 생체조직 구조와 형태의 변화 및 단백질 변성으로 형광 등을 오래보관하지 못하는 단점이 있다. 둘째, 다당류와 특정 성분을 이용하여 생체조직의 빛의 굴절율을 맞춰주는 굴절률 용액(Refractive index(RI) Matching solution)을 이용한 단순 침투방식의 투명화 방법으로, 상기 방법의 경우 투명화 가능한 생체조직의 두께가 얇고 투명화 시간이 길며, 점도가 높아 이미징 시 RI 용액에 의한 이미지 왜곡이 생기는 단점이 있다. 셋째, 조직 탈수화를 통한 투명화 방법으로, 상기 방법을 사용하는 경우 여러 농도의 용액교체를 통해 조직 탈수화를 가져오고, RI 용액에 투명화 될 때까지 장시간이 소요되며 여러 농도의 용액에 따른 조직의 구조와 크기의 변화가 발생하는 문제점이 있다. 넷째, 하드로겔을 이용한 열과 전기영동을 통한 지질의 제거 후 굴절율 맞춤 용액에 담궈 사용하는 방법으로, 이 방법의 경우 하드로겔(아크릴아마이드 등)의 사용으로 하이드로겔 농도에 의한 조직샘플의 크기가 증가하고 지질을 SDS 미셀(micelle)로 제거하기 위한 특별한 전기영동장치가 필요한 단점이 있다.First, it is a method of clearing through the removal of lipids using an organic solvent. In the case of the above method, it must be used in a hood due to the use of organic solvents harmful to the human body, and long-term storage of fluorescence due to changes in biological tissue structure and shape and protein denaturation There are downsides to not being able to. Second, it is a simple penetrating transparent method using a refractive index (RI) Matching solution that uses polysaccharide and specific components to match the refractive index of light in biological tissue. It is thin, has a long clearing time, and has a high viscosity, so there are disadvantages in that image distortion occurs due to the RI solution during imaging. Third, as a clearing method through tissue dehydration, when using the above method, tissue dehydration is brought about by replacing solutions of various concentrations, and it takes a long time until the RI solution becomes clear, and the tissue of the tissue according to the solution of various concentrations There is a problem that changes in structure and size occur. Fourth, a method in which lipids are removed through heat and electrophoresis using a hydrogel and then immersed in a refractive index matching solution. In this method, a hydrogel (acrylamide, etc.) is used and the size of the tissue sample is determined by the hydrogel concentration. There is a disadvantage that increases and requires a special electrophoresis device to remove lipids into SDS micelles.
상기 언급된 여러 투명화 방법에서 최종적으로 투명화된 샘플을 이미징하기 위해서는 샘플과 대물렌즈의 굴절률 동기화를 통하여 고해상도로 나타낼 수 있다. 이를 위해 각각의 투명화 방법마다 제시된 굴절률 동기화 용액이 존재하며 이미 상업화되어 판매되고 있다. In order to image the finally transparent sample in the above-mentioned various transparent methods, it can be displayed in high resolution through synchronization of the refractive index of the sample and the objective lens. To this end, refractive index synchronization solutions presented for each transparency method exist and are already commercialized and sold.
그러나 현재 시판되고 있는 굴절률 동기화 용액의 경우 투명화를 위하여 먼저, 지질제거 방법을 거친 후 이미징을 위해 굴절률 동기화 용액을 사용하는 것이 기본 방법이며, 지질제거 방법을 거치지 않고 굴절률 동기화 용액만을 이용하여 샘플의 투명화를 이끌어낼 수 있는 굴절률 동기화 용액은 없는 실정이다. 또한, 여러 조직 투명화 방법에서 최종적으로 사용되는 종래 굴절률 동기화 용액은 샘플과 렌즈사이의 커버글라스의 굴절률인 1.51에 가깝게 조성되어 있는데(각각의 굴절률 동기화 용액마다 고유의 굴절률을 가지며 RI = 1.45~1.51까지 다양하게 존재함), 상기 범위의 굴절률은 물의 굴절률 RI = 1.33 보다 높아 점도에 의한 기포형성과 조직변형을 가져오는 문제점이 있다.However, in the case of currently commercially available refractive index synchronization solution, the basic method is to use the refractive index synchronization solution for imaging after first going through the lipid removal method for clearing, and the sample is made transparent by using only the refractive index synchronization solution without going through the lipid removal method. There is no refractive index synchronization solution capable of deriving . In addition, the conventional refractive index synchronization solution finally used in various tissue clearing methods is composed close to 1.51, the refractive index of the cover glass between the sample and the lens (each refractive index synchronization solution has a unique refractive index and RI = 1.45 to 1.51 variously exist), and the refractive index in the above range is higher than the refractive index of water RI = 1.33, resulting in bubble formation and tissue deformation due to viscosity.
기존에 개발되어 상품화된 굴절률 동기화 용액으로는 EasyIndex, X-CLARITY™ Mounting Solution, Mounting & Storage™ Solution, RapiClear 등을 예시할 수 있는데, 상기와 같은 굴절률 동기화 용액의 경우 고점도의 용액으로 인해 이미징을 위한 샘플 조작 시 기포생성과 샘플조작이 어렵고 샘플 안쪽에 생기는 공기방울을 제거하기 위해서 외부의 물리적 힘에 의해서 샘플에 손상을 입히기 쉬운 문제점이 있으며, 외부 공기에 노출 되었을 시 다당류에 의한 호박화 및 결정화 현상이 빠르게 나타나며 이는 용액의 재사용 및 현미경을 이용한 장시간 이미징을 불가능한 문제점이 있을 뿐 아니라, 느린 투명화 속도와 용액 조성의 특성에 의한 샘플의 팽창 및 수축이 문제로 각각의 단점들을 지니고 있으며 이는 투명화에 의한 단백질 손상 혹은 소실을 야기하는 문제점이 있다.Examples of previously developed and commercialized refractive index synchronization solutions include EasyIndex, X-CLARITY™ Mounting Solution, Mounting & Storage™ Solution, and RapiClear. During sample manipulation, it is difficult to create air bubbles and manipulate the sample, and it is easy to damage the sample by external physical force in order to remove air bubbles generated inside the sample. This appears quickly, which not only has problems of not being able to reuse the solution and imaging for a long time using a microscope, but also has disadvantages such as slow clearing speed and expansion and contraction of the sample due to the characteristics of the solution composition. There is a problem that causes damage or loss.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 투명화와 동시에 생체조직을 현미경 이미징에 맞는 굴절률로 맞출 수 있는 용액을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 특정 화합물을 유기적으로 조합한 조성물의 경우, 조직 지질의 제거를 위한 투명화와 추후 굴절률 동기화 용액(RI Matching solution)을 사용하지 않고 바로 이미징이 가능하며, 투명화된 샘플의 이미지 구현을 위한 현미경 사용시 기존의 투명화 용액들에서 발생하는 기포에 의한 이미지 왜곡과 고점도에 의한 투명화 조직의 조작의 어려움을 극복하기 위해 최대한 물의 점도에 가까울 뿐 아니라, 기존 상품화된 제품에 비해 투명화 조직샘플의 결정화가 현저히 늦게 일어남으로 투명화 샘플의 장기보관 및 형광유지 효과가 뛰어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors have tried to develop a solution capable of adjusting the refractive index suitable for microscopic imaging of biological tissue at the same time as clearing, and as a result, in the case of a composition in which a specific compound is organically combined, clearing for tissue lipid removal and Imaging can be done immediately without using the refractive index matching solution (RI Matching solution) later, and when using a microscope to realize the image of the cleared sample, image distortion due to bubbles generated in existing clearing solutions and manipulation of the clearing tissue due to high viscosity The present invention was completed by confirming that not only is the viscosity as close to water as possible to overcome the difficulties, but also that the crystallization of the clear tissue sample is remarkably late compared to existing commercialized products, so that the effect of long-term storage and fluorescence maintenance of the clear sample is excellent.
따라서 본 발명의 목적은 생체 조직 투명화용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for clearing biological tissues.
본 발명의 다른 목적은 생체 조직의 투명화 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for clearing biological tissues.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 N-메틸-D-글루카민, 2,2’-티오디에탄올 및 이오딕사놀을 유효성분으로 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a composition for clearing biological tissues comprising N-methyl-D-glucamine, 2,2'-thiodiethanol and iodixanol as active ingredients. .
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 N-메틸-D-글루카민, 2,2’-티오디에탄올 및 이오딕사놀은 조성물에 각각 15 ~ 25% (w/v), 25 ~ 35% (w/v) 및 40 ~ 50% (w/v) 농도로 포함될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the N-methyl-D-glucamine, 2,2'-thiodiethanol and iodixanol are respectively 15 to 25% (w / v), 25 to 35% ( w/v) and 40 to 50% (w/v).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 지질 성분을 생체 조직으로부터 제거하는 과정 없이 생체 조직을 투명화시킬 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition can clear biological tissues without removing lipid components from biological tissues.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물을 생체 조직을 90분 이내에 신속하게 투명화시킬 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition can rapidly clear biological tissue within 90 minutes.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 20일 내지 30일 동안 상온에서 노출되는 경우에도 결정화가 일어나지 않으며 액체 상태를 유지할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition can maintain a liquid state without crystallization even when exposed at room temperature for 20 to 30 days.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biological tissue may be selected from the group consisting of brain, lung, heart, liver, kidney, small intestine and spleen.
또한, 본 발명은 생체로부터 분리되고 고정화된 생체 조직을 상기 생체 조직 투명화용 조성물에 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함하는, 생체 조직 투명화 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a biological tissue clearing method comprising the step of contacting a biological tissue separated from a living body and fixed with the biological tissue clearing composition to make it transparent.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계는 15℃ ~ 35℃의 상온에서 진행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the step may be carried out at room temperature of 15 ℃ ~ 35 ℃.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계는 90분 내지 3일 동안 진행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the step may be performed for 90 minutes to 3 days.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biological tissue may be selected from the group consisting of brain, lung, heart, liver, kidney, small intestine and spleen.
본 발명의 생체 조직 투명화용 조성물은 물과 가장 비슷한 점도를 지니고 있어 샘플 내부 공기방울 제거와 샘플조작이 용이하며, 물에 가까운 점도를 유지함으로 용액의 변성(호박화, 결정화)에 따른 샘플의 손상이나 변형을 최소화할 수 있다. 또한, 실제 생체 조직의 현미경을 이용한 이미지에 대한 두께의 한계를 쉽고 빠르게 투명화하여 심부(약 3mm)까지 이미징할 수 있고, 장시간의 이미징과 조직샘플의 보관능력이 우수하여 30일 이후에도 샘플의 형광을 유지함으로 동일 샘플의 여러 번 이미징이 가능하다. 뿐만 아니라, 고가에 판매되고 있는 다양한 굴절률 동기화 용액(RI Matching solution)에 비해 본 발명의 조성물은 주요 구성성분의 재료값이 저가이며, 독성과 유기용매와 같은 악취가 없어 실험실에서 대용량 제작 후 보관하며 사용이 가능하며 상품화시 생산이 용이한 이점을 갖는다.The composition for clarifying biological tissue of the present invention has a viscosity most similar to that of water, so it is easy to remove air bubbles inside the sample and manipulate the sample, and maintains a viscosity close to that of water, thereby damaging the sample due to solution denaturation (amberization, crystallization). or distortion can be minimized. In addition, it is possible to easily and quickly clear the thickness limit for images using a microscope of real biological tissue to image deep parts (about 3 mm), and it is excellent in long-term imaging and storage of tissue samples, so that the fluorescence of the sample can be maintained even after 30 days. This allows multiple imaging of the same sample. In addition, compared to various refractive index matching solutions (RI Matching solutions) sold at high prices, the composition of the present invention has a low cost of main components and does not have odors such as toxicity and organic solvents. It can be used and has the advantage of easy production during commercialization.
도 1은 본 발명의 AICI 용액 및 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액을 이용 1mm 두께의 뇌 조직을 90분간 투명화시킨 결과를 나타낸 것이다. ‘XclarityMS’는 X-CLARITY™ Mounting Solution을 의미하며, ‘MS’는 Mounting & Storage™ Solution을 의미한다.
도 2는 본 발명의 AICI 용액 및 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액에 뇌 조직을 보관하는 경우 시간경과에 따른 조직의 변형을 보여주는 결과이다. 왼쪽은 이미지 사진이며, 오른쪽은 시간경과에 따른 뇌 조직의 변형을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. XclarityMS’는 X-CLARITY™ Mounting Solution을 의미하며, ‘MS’는 Mounting & Storage™ Solution을 의미한다.
도 3은 본 발명의 AICI 용액 및 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액의 점도를 측정한 결과이다. 왼쪽은 모세관 현상을 통한 용개의 점도를 보여주는 사진이고 빨간 점선은 용액의 높이를 의미하며, 오른쪽은 회전형 레오미터를 이용하여 용액의 점도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. XclarityMS’는 X-CLARITY™ Mounting Solution을 의미하며, ‘MS’는 Mounting & Storage™ Solution을 의미한다.
도 4는 본 발명의 AICI 용액 및 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액을 상온에서 장시간 노출 시 액체 상태를 유지하는지 보여주는 사진이다. 빨간 점선은 기동일한 기울기에 따른 용액의 이동상태를 의미한다. XclarityMS’는 X-CLARITY™ Mounting Solution을 의미하며, ‘MS’는 Mounting & Storage™ Solution을 의미한다.
도 5는 본 발명의 AICI 용액 및 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액을 상온에서 장시간 노출에 따른 결정화 정도를 보여주는 사진이다. 빨간 점선은 결정화에 따른 세포의 변화를 확대한 부위을 의미한다. XclarityMS’는 X-CLARITY™ Mounting Solution을 의미하며, ‘MS’는 Mounting & Storage™ Solution을 의미한다.
도 6은 본 발명의 AICI 용액에 뇌 조직을 보관하는 경우 시간경과에 따른 투명화도를 보여주는 사진이다(A: 1mm 두께 샘플을 1.5시간 투명화시킴; B: 2mm 두께 샘플을 1일간 투명화시킴; C: 3mm 두께 샘플을 3일간 투명화시킴).
도 7은 본 발명의 AICI 용액을 이용하여 뇌 조직을 투명화시킨 후 조직 내의 시냅스를 600배 확대 촬영한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 AICI 용액 및 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액을 이용하여 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장 조직을 투명화시킨 이미지이다. ‘MS’는 Mounting & Storage™ Solution을 의미한다.
도 9는 본 발명의 AICI 용액 및 BINAREE社의 굴절률 맞춤용액(Mounting & Storage™ Solution)을 이용한 뇌 조직 투명화 후 시간 경과에 따른 형광 이미지 세기를 확인한 결과이다. 도 9a는 시간 경과에 따른 형광 이미지 세기를 측정하여 그래프로 나타낸 것이며, 도 9b는 이미지 사진이다.Figure 1 shows the results of clearing brain tissue of 1 mm thickness for 90 minutes using the AICI solution of the present invention and the existing commercialized refractive index matching solution. 'XclarityMS' stands for X-CLARITY™ Mounting Solution, and 'MS' stands for Mounting & Storage™ Solution.
Figure 2 is a result showing the deformation of the tissue over time when the brain tissue is stored in the AICI solution of the present invention and the existing commercialized refractive index matching solution. The left side is a picture of the image, and the right side is a graph showing the deformation of brain tissue over time. 'XclarityMS' stands for X-CLARITY™ Mounting Solution, and 'MS' stands for Mounting & Storage™ Solution.
Figure 3 is the result of measuring the viscosity of the AICI solution of the present invention and the existing commercialized refractive index matching solution. The left side is a picture showing the viscosity of the solution through capillary action, the red dotted line means the height of the solution, and the right side is a graph showing the viscosity of the solution measured using a rotational rheometer. 'XclarityMS' stands for X-CLARITY™ Mounting Solution, and 'MS' stands for Mounting & Storage™ Solution.
Figure 4 is a photograph showing whether the AICI solution of the present invention and the existing commercialized refractive index matching solution maintain a liquid state when exposed to room temperature for a long time. The red dotted line means the movement state of the solution according to the gradient of the starting date. 'XclarityMS' stands for X-CLARITY™ Mounting Solution, and 'MS' stands for Mounting & Storage™ Solution.
5 is a photograph showing the crystallization degree of the AICI solution of the present invention and the existing commercialized refractive index matching solution at room temperature for a long time exposure. The red dotted line denotes an enlarged area of cell changes due to crystallization. 'XclarityMS' stands for X-CLARITY™ Mounting Solution, and 'MS' stands for Mounting & Storage™ Solution.
Figure 6 is a photograph showing the degree of transparency over time when brain tissue is stored in the AICI solution of the present invention (A: 1 mm thick sample cleared for 1.5 hours; B: 2 mm thick sample cleared for 1 day; C: 3 mm thick samples were cleared for 3 days).
7 is an image obtained by magnifying 600 times the synapses in the tissue after clearing the brain tissue using the AICI solution of the present invention.
8 is an image obtained by clearing lung, heart, liver, kidney, small intestine and spleen tissues using the AICI solution of the present invention and an existing commercialized refractive index matching solution. 'MS' stands for Mounting & Storage™ Solution.
9 is a result of confirming fluorescence image intensity over time after brain tissue clearing using the AICI solution of the present invention and BINAREE's refractive index matching solution (Mounting & Storage™ Solution). Figure 9a is a graph showing fluorescence image intensity measured over time, and Figure 9b is a picture of the image.
본 발명은 N-메틸-D-글루카민, 2,2’-티오디에탄올 및 이오딕사놀을 유효성분으로 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for clearing living tissue comprising N-methyl-D-glucamine, 2,2'-thiodiethanol and iodixanol as active ingredients.
본 발명에서 ‘N-메틸-D-글루카민(N-methyl-D-glucamine)’은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 메글루민(Meglumine) 또는 1-디옥시-1-(메틸아미노)-D-글루시톨(1-Deoxy-1-(methylamino)-D-glucitol)로도 불린다.In the present invention, 'N-methyl-D-glucamine' is a compound represented by the following formula (1), meglumine or 1-deoxy-1-(methylamino) Also called -D-glucitol (1-Deoxy-1-(methylamino)-D-glucitol).
<화학식 1><
본 발명에서 ‘2,2’-티오디에탄올(2,2’-thiodiethanol)’은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 2,2′-티오비스(에탄올)(2,2′-Thiobis(ethanol)), 비스(2-하이드록시에틸) 설파이드(Bis(2-hydroxyethyl) sulfide), 티오디에틸렌 글리콜(Thiodiethylene glycol), 티오디글리콜(Thiodiglycol)로도 불린다.In the present invention, '2,2'-thiodiethanol (2,2'-thiodiethanol)' is a compound represented by the following formula (2), 2,2'-thiobis (ethanol) (2,2'-Thiobis (ethanol) )), Bis(2-hydroxyethyl) sulfide, Thiodiethylene glycol, also called Thiodiglycol.
<화학식 2><
본 발명에서 ‘이오딕사놀(Iodixanol)’하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로서, 5-[아세틸-[3-[아세틸-[3,5-비스(2,3-디하이드록시프로필카바모일)-2,4,6-트리요오드-페닐]아미노]-2-하이드록시-프로필]아미노]-N,N'-비스(2,3-디하이드록시프로필)-2,4,6-트리요오드-벤젠-1,3-디카르복사미드(5-[acetyl-[3-[acetyl-[3,5-bis(2,3-dihydroxypropylcarbamoyl)-2,4,6-triiodo-phenyl]amino]-2-hydroxy-propyl]amino]-N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo-benzene-1,3-dicarboxamide)로도 불린다.In the present invention, 'Iodixanol' is a compound represented by
<화학식 3><
본 발명은 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3으로 표시되는 화합물의 조합을 통해 기존방식의 고점도 용액으로 인한 기포형성 및 조직크기의 변화 등 여러 가지 문제를 최소화하여 투명화 조직 이미징의 접근성을 높이고 장시간 이미징 및 보관이 가능하게 한다.The present invention minimizes various problems such as bubble formation and change in tissue size due to conventional high-viscosity solutions through a combination of the compounds represented by
본 발명의 생체 조직 투명화용 조성물은 유효성분으로 상기 N-메틸-D-글루카민, 2,2’-티오디에탄올 및 이오딕사놀을 각각 15 ~ 25% (w/v), 25 ~ 35% (w/v) 및 40 ~ 50% (w/v) 농도로 포함할 수 있다.The composition for clearing biological tissues of the present invention contains 15 to 25% (w/v) and 25 to 35% of N-methyl-D-glucamine, 2,2'-thiodiethanol and iodixanol, respectively, as active ingredients. (w/v) and 40 to 50% (w/v) concentration.
본 발명의 하기 실시예에서는, 조성물에 N-메틸-D-글루카민을 20% (w/v), 2,2’-티오디에탄올을 30% (w/v), 이오딕사놀을 45% (w/v) 농도로 포함하였다.In the following examples of the present invention, 20% (w/v) of N-methyl-D-glucamine, 30% (w/v) of 2,2'-thiodiethanol, and 45% of iodixanol were added to the composition. (w/v) concentration.
상기와 같은 조성비로 이루어진 본 발명의 조성물은 생체 조직 투명화를 위한 전처리 과정으로서 지질 성분을 생체 조직으로부터 제거하는 과정 없이도 생체 조직을 투명화시킬 수 있는 특징을 가진다.The composition of the present invention composed of the composition ratio as described above has the characteristic of being able to clear biological tissue without removing the lipid component from the biological tissue as a pretreatment process for biological tissue clearing.
종래 사용되고 있는 투명화 방법 중 유기용매 (solvent)를 이용한 지질의 제거를 통해 투명화하는 방법은 인체유해 유기용매사용으로 후드에서 사용하여야하며 생체조직 구조와 형태의 변화 및 단백질 변성으로 형광 등을 오래보관하지 못하는 문제점이 있었다.Among the conventional clearing methods, the method of clearing by removing lipids using an organic solvent must be used in a hood because it uses an organic solvent harmful to the human body, and does not keep the fluorescence light for a long time due to changes in the structure and form of living tissue and protein denaturation. There was a problem I couldn't.
본 발명의 조성물을 이용하는 경우 지질 성분을 생체 조직으로부터 제거하는 과정 없이도 생체 조직을 투명화시킬 수 있는바, 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있다.When using the composition of the present invention, biological tissues can be made transparent without removing lipid components from biological tissues, and thus, the problems of the prior art described above can be solved.
본 발명의 조성물은 생체 조직을 90분 이내에 신속하게 투명화시킬 수 있으며, 최대 3mm 두께까지 투명화시킬 수 있다. 하기 실시예에서는, 본 발명의 조성물에 1mm의 생체 조직을 적용한 경우 90분 내에 투명화가 이루어졌으며, 3mm의 생체 조직을 적용한 경우 3일 이내에 이루어지는 것을 확인하였다.The composition of the present invention can rapidly clear biological tissues within 90 minutes, and can clear up to a maximum thickness of 3 mm. In the following examples, it was confirmed that clearing was achieved within 90 minutes when 1 mm of biological tissue was applied to the composition of the present invention, and within 3 days when 3 mm of biological tissue was applied.
종래 사용되고 있는 투명화 방법은 투명화 가능한 생체조직의 두께가 얇고 투명화 시간이 길다는 문제점이 있다.Conventionally used vitrification methods have a problem in that the thickness of vitrifiable biological tissues is thin and the vitrification time is long.
본 발명의 조성물을 이용하는 경우 1mm 두께의 생체 조직을 90분 이내에 투명화시킬 수 있으며, 3mm 두께의 생체 조직까지 투명화시킬 수 있는바, 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있다.In the case of using the composition of the present invention, biological tissues having a thickness of 1 mm can be made transparent within 90 minutes, and biological tissues having a thickness of 3 mm can be made transparent, thus solving the problems of the prior art.
*본 발명의 조성물은 생체 조직을 상온에서 장시간 보관하는 경우에도 조직 샘플의 수축과 팽창과 같은 변화가 거의 발생하지 않으며, 조성물을 장시간 외부에 노출시킨 경우에도 결정화(또는 호박화)가 일어나지 않고 여전히 액체 상태를 유지할 수 있다. 하기 실시예에서는, 본 발명의 조성물에 생체 조직을 3일 동안 보관한 경우에도 조직의 변형이 거의 나타나지 않았으며, 신경세포의 변형 없이 미세 구조를 그대로 유지하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 하기 실시예에서는, 본 발명의 조성물을 최대 30일간 외부에 노출시킨 경우 결정화가 일어나지 않으며 여전히 액체 상태를 유지하는 것을 확인하였다.* In the composition of the present invention, even when biological tissue is stored at room temperature for a long time, changes such as shrinkage and expansion of the tissue sample hardly occur, and even when the composition is exposed to the outside for a long time, crystallization (or amberization) does not occur and still It can remain in a liquid state. In the following examples, it was confirmed that even when living tissues were stored in the composition of the present invention for 3 days, almost no deformation of the tissue was observed, and the microstructure was maintained without deformation of nerve cells. In addition, in the following examples, when the composition of the present invention was exposed to the outside for up to 30 days, it was confirmed that crystallization did not occur and the liquid state was still maintained.
종래 사용되고 있는 투명화 방법은 여러 농도의 용액에 따른 조직의 구조와 크기의 변화가 발생하며, 굴절률 동기화용액의 점도가 높아 기포형성과 조직변형을 가지고 오는 문제점이 있다. The conventionally used clearing method has problems in that the structure and size of tissue change according to solutions of various concentrations, and the viscosity of the refractive index synchronization solution is high, resulting in bubble formation and tissue deformation.
본 발명의 조성물을 이용하는 경우 생체 조직을 상온에서 장시간 보관하는 경우에도 조직의 변형 없이 구조와 크기를 그대로 유지할 수 있으며, 조성물을 외부에 장시간 노출시킨 경우에도 결정화 없이 액상 상태를 유지할 수 있는바, 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있다.When the composition of the present invention is used, the structure and size of the biological tissue can be maintained without deformation even when stored at room temperature for a long time, and the composition can be maintained in a liquid state without crystallization even when exposed to the outside for a long time. It is possible to solve the problems of the prior art, such as.
본 발명의 조성물은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장(spleen)과 같은 다양한 생체 조직을 효과적으로 투명화시킬 수 있다. 하기 실시예에서는, 본 발명의 조성물 상기와 같은 다양한 조직을 적용하여 상온에서 투명화를 진행한 결과 2일 이내에 모두 투명화가 진행된 것을 확인하였으며, 특히, 혈액을 많이 함유하고 있는 비장의 경우 타사의 제품화 용액에 비해 투명화가 월등히 우수한 것을 확인하였다.The composition of the present invention can effectively clear various biological tissues such as brain, lung, heart, liver, kidney, small intestine and spleen. In the following examples, as a result of applying the composition of the present invention to various tissues as described above and proceeding with clearing at room temperature, it was confirmed that all clearing progressed within 2 days. It was confirmed that the transparency was far superior to that of
조직 중 비장(spleen)의 경우 피가 많이 모여 있는 기관인데, 종래 투명화 방법을 이용하는 경우 이러한 기관의 이미지화가 어려 문제점이 있다. Among tissues, the spleen is an organ in which a lot of blood is collected, and it is difficult to image such an organ when using a conventional transparent method.
본 발명의 조성물을 이용하는 경우 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장뿐 아니라 혈액을 많이 함유하고 있는 비장(spleen) 조직의 투명화가 우수함에 따라, 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있다.When using the composition of the present invention, it is possible to solve the problems of the prior art as described above because the transparency of the spleen tissue containing a lot of blood as well as the brain, lung, heart, liver, kidney, and small intestine is excellent.
일반적으로 ‘상온’이라 함은 연중 평균적인 온도로서 바깥 대기 중의 평균적인 온도를 의미하며, 따라서 본 명세서에서 ‘상온’이라 함은 15℃ 내지 35℃ 온도로 정의될 수 있다.In general, 'room temperature' means the average temperature of the outside air as an average temperature throughout the year, and therefore, 'room temperature' in the present specification may be defined as a temperature of 15 ° C to 35 ° C.
또한, 본 발명은 생체로부터 분리되고 고정화된 생체 조직을 상기 조성물에 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함하는, 생체 조직 투명화 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a biological tissue clearing method comprising the step of contacting a biological tissue separated from a living body and fixed with the composition to make it transparent.
구체적으로, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 고정화된 생체 조직을 N-메틸-D-글루카민, 2,2’-티오디에탄올 및 이오딕사놀을 유효성분으로 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물과 접촉시킴으로써, 생체 조직의 물리화학적 특성을 변형하여 투명하게 함으로써 보다 깊이 빛이 침투할 수 있도록 만들어 투명하게 하는 것이다.Specifically, the method for clearing biological tissue according to the present invention is a composition for clearing biological tissue comprising N-methyl-D-glucamine, 2,2'-thiodiethanol and iodixanol as active ingredients in a fixed biological tissue. By contacting with, it is made transparent by modifying the physicochemical properties of living tissue so that light can penetrate more deeply.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 상기 생체 조직 투명화용 조성물을 사용함으로써 기포 형성과 조직변형이 없어 생체 조직의 투명성을 향상시킬 수 있는바, 원하는 조직 내 정보가 손실 또는 왜곡되지 않아, 특히 GFP단백질 등 다양한 형광원(Fluorophore)을 조직 내 정보 검출 유용하게 사용될 수 있다.The method for clearing biological tissue according to the present invention can improve the transparency of biological tissue without bubble formation and tissue deformation by using the composition for biological tissue clearing, so that information in the desired tissue is not lost or distorted, especially GFP Various fluorescent sources (Fluorophores) such as proteins can be usefully used to detect information in tissues.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 생체 조직은 투명화 하기 전에 통상적으로 항원성의 손실을 유발하지 않으면서 생체 조직을 고정화하는 방법이라면 특별한 제한 없이 적용하여 고정화할 수 있나, PFA(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 폴리아크릴아마이드 등을 사용하여 통상적인 방법으로 고정화될 수 있다.In the method for clearing biological tissue according to the present invention, if the biological tissue is immobilized without causing loss of antigenicity before clearing, the biological tissue can be immobilized without particular limitation, PFA (paraformaldehyde), Ethylene glycol diglycidyl ether, dipropylene glycol diglycidyl ether, 1,4-butanediol diglycidyl ether, It can be immobilized by a conventional method using glycerol polyglycidyl ether, glutaraldehyde, polyacrylamide, or the like.
본 발명의 상기 투명화시키는 단계는 15℃ ~ 35℃ 상온 조건에서 90분 내지 3일 동안 진행될 수 있다.The clearing step of the present invention may be carried out for 90 minutes to 3 days at room temperature conditions of 15 ° C to 35 ° C.
본 발명의 일실시예에서, 상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장(spleen) 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the biological tissue may include brain, lung, heart, liver, kidney, small intestine, and spleen, but the type is not particularly limited.
나아가, 본 발명은 상기 투명화된 생체 조직 내 중요 정보, 즉, DNA, RNA, 단백질, 형광신호 등의 검출 방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for detecting important information, ie, DNA, RNA, protein, fluorescence signal, etc., in the cleared biological tissue.
본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP 형광, 면역 염색을 통하여 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있다. 단백질의 경우 고정 과정동안 아미노산에 존재하는 아미노기끼리의 공유결합을 이루면서 서로 네트워크를 이루기 때문에, 매우 안정적인 반면, RNA나 DNA와 같은 핵산의 경우 아미노기가 존재하지 않기 때문에, 고정된 조직에서도 상대적으로 불안정하다. 특히, 전기영동 과정이 포함되는 경우, 핵산이 가진 전기적 성질에 의해 조직 내 위치가 바뀔 우려가 있다. 반면, 본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP(Green Fluorescent Protein) 세포 및 도파민 활성 뉴런 마커 항체인 티로신하이드록시아제(Tyrosine Hydroxylase) 등에 대한 형광 염색이 우수하게 수행된다.Protein or mRNA can be detected in the cleared biological tissue according to the present invention through GFP fluorescence and immunostaining. Proteins are very stable because amino groups present in amino acids form a covalent bond and form a network during the fixation process, whereas nucleic acids such as RNA or DNA do not have amino groups, so they are relatively unstable even in fixed tissues. . In particular, when an electrophoresis process is included, there is a concern that the position in the tissue may change due to the electrical properties of nucleic acids. On the other hand, the cleared biological tissue according to the present invention performs excellently in fluorescence staining for Green Fluorescent Protein (GFP) cells and tyrosine hydroxylase, which is a dopaminergic neuron marker antibody.
본 발명에 따른 생체 조직 투명화 방법은 손상되지 않은 생체 조직의 세포와 분자의 3차원 분포를 이미지화하여 관찰할 수 있으므로, 복잡한 구조를 가지는 다양한 생체 조직에 대하여 하나의 완전한 구조로 수백 마이크로미터 이상의 크기로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로 조직 내의 유용한 정보를 취득하여 뇌질환 등의 다양한 질환의 원인을 규명하는데 효과적으로 사용할 수 있다.Since the biological tissue clearing method according to the present invention can image and observe the three-dimensional distribution of cells and molecules of undamaged biological tissues, various biological tissues having complex structures can be formed with a size of hundreds of micrometers or more as one complete structure. Observational research can be performed, so it can be effectively used to identify the causes of various diseases such as brain diseases by acquiring useful information within tissues.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
<실시예><Example>
1. 재료 및 방법1. Materials and Methods
<1-1> 마우스 준비<1-1> Mouse preparation
유전자 변형된 Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J 마우스 라인은 Jackson Laboratories (JAX stock #007788)에서 구입하여 사내에서 사육한 것을 KBRI의 Dr. Rah의 실험실로부터 제공받았다. Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J 마우스는 JAX 프로토콜에 따른 프라이머 세트를 이용하여 유전형을 분석하였다. 실험에서 사용된 프라이머 세트 서열은 다음과 같다: Thy1 transgene 포워드 프라이머 5’-ACAGACACACACCCAGGACA-3’, EYFP transgene 리버스 프라이머 5’-CGGTGGTGCAGATGAACTT-3’ 및 내부 양성대조군 포워드 프라이머 5’-CTAGGCCAC AGAATTGAAAGATCT-3’, 내부 양성대조군 리버스 프라이머 5’-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC-3’. 샘플링을 위해 6-8 주령의 수컷과 암컷 마우스를 Avertin [2.5 %, Tribromoethanol, intraperitoneal (ip)] in 1x PBS를 이용하여 깊게 마취시키고, 차가운 PBS로 경심관류(transcardial perfusion)시킨 다음, 4% PFA(paraformaldehyde)가 포함된 PBS로 관류 고정하였다. 관류 고정된 뇌를 4% PFA가 포함된 PBS로 4℃에서 하룻밤동안 관류후고정(post-fixation)시켰다. 이후, 고정된 뇌를 PBS로 세척하고 관상 뇌 절단틀(coronal brain matrix)을 사용하여 뇌 절편(brain slices)을 준비하였다. 마우스는 20-22℃의 주위 온도 및 일정한 공기 흐름을 통한 습도(약 55 %)에서, 07:00에 "점등"하여 12/12 명암 주기로 표준 사료와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 사육하였으며, 케이지 당 2-5 마리의 동물을 그룹에 수용하였다. 동물의 사육 과정을 정기적으로 모니터링하였다. 모든 실험 설계는 KBRI (IACUC-18-00018, IACUC-20-00051)의 기관 동물 관리 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었다.The genetically modified Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J mouse line was purchased from Jackson Laboratories (JAX stock #007788) and bred in-house by Dr. KBRI. It was provided by Rah's lab. Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J mice were genotyped using primer sets according to the JAX protocol. The primer set sequences used in the experiment were as follows: Thy1 transgene forward primer 5'-ACAGACACACACCCAGGACA-3', EYFP transgene reverse primer 5'-CGGTGGTGCAGATGAACTT-3' and internal positive control forward primer 5'-CTAGGCAC AGAATTGAAAGATCT-3', Internal positive control reverse primer 5'-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC-3'. For sampling, male and female mice aged 6-8 weeks were deeply anesthetized with Avertin [2.5%, Tribromoethanol, intraperitoneal (ip)] in 1x PBS, transcardial perfused with cold PBS, followed by 4% PFA. Perfusion fixation was performed with PBS containing (paraformaldehyde). Perfusion-fixed brains were post-fixed overnight at 4°C in PBS containing 4% PFA. Thereafter, the fixed brain was washed with PBS and brain slices were prepared using a coronal brain matrix. Mice were housed at an ambient temperature of 20-22 °C and humidity (approximately 55%) with constant air flow, with free access to standard chow and water on a 12/12 light/dark cycle with "lights on" at 07:00, cages. 2-5 animals per group were housed. The feeding process of the animals was regularly monitored. All experimental designs were reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of KBRI (IACUC-18-00018, IACUC-20-00051).
<1-2> 본 발명의 생체조직 투명화 및 굴절률 동기화 용액 제조<1-2> Preparation of biotissue clearing and refractive index synchronization solution of the present invention
본 발명의 생체조직 투명화 및 굴절률 동기화 용액은 하기 표 1에서 나타낸 구성성분 및 함량으로 제조되었으며, 본 명세서에서 ‘AICI(Aqueous Immersion Solution for tissue Clearing and Imaging)’로 명명하였다. The biological tissue clearing and refractive index synchronization solution of the present invention was prepared with the components and contents shown in Table 1 below, and was named 'AICI (Aqueous Immersion Solution for tissue Clearing and Imaging)' in the present specification.
자세하게는, 본 발명의 AICI 시약은 20% (w/v) N-methyl-D-glucamine(# M2004, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 30% (w/v) TDE(# 166782, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 45% (w/v) Iodixanol(# D1556, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.2% (w/v) Triton X-100 (20 %)(# T8787, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.5% (w/v) α-thioglycerol(# 88640, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.1% (w/v) Triethanolamine(# 90278, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 순수 증류수(# 10977-015, Invitrogen,, CA, USA)에 녹여 제조하였다. 25℃에서 2시간 동안 자기 교반기에서 혼합 용액을 교반한 후, bottle-top vacuum system을 통해 갈색병으로 여과시켰다. 제조된 시약을 25℃에서 유지하면서 몇 달 동안 실험에 사용하였다. 본 발명의 AICI 시약의 굴절률(RI) 1.465이다.Specifically, the AICI reagent of the present invention is 20% (w / v) N-methyl-D-glucamine (# M2004, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 30% (w / v) TDE (# 166782, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 45% (w/v) Iodixanol (# D1556, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.2% (w/v) Triton X- 100 (20%) (# T8787, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.5% (w/v) α-thioglycerol (# 88640, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.1 It was prepared by dissolving % (w/v) Triethanolamine (# 90278, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in pure distilled water (# 10977-015, Invitrogen, CA, USA). After stirring the mixed solution in a magnetic stirrer at 25° C. for 2 hours, it was filtered into a brown bottle through a bottle-top vacuum system. The prepared reagent was used in experiments for several months while maintaining at 25 °C. The refractive index (RI) of the AICI reagent of the present invention is 1.465.
(M2004; Sigma-Aldrich )N-methyl-D-glucamine
(M2004; Sigma-Aldrich)
(166782, Sigma-Aldrich)2,2'-thiodiethanol
(166782, Sigma-Aldrich)
(D1556, Sigma-Aldrich)Iodixanol
(D1556, Sigma-Aldrich)
(60.48 g)18.334ml
(60.48 g)
(T8787, Sigma-Aldrich)20% Triton X-100
(T8787, Sigma-Aldrich)
(88640, Sigma-Aldrich)α-thioglycerol
(88640, Sigma-Aldrich)
(Triethanolamine)
(90278, Sigma-Aldrich)2,2′,2′′-Nitrilotriethanol
(Triethanolamine)
(90278, Sigma-Aldrich)
상기 표 1에서‘up to 40ml’는 각 구성성분에 물을 첨가하여 최종 조성물이 40ml가 된다는 의미이며, 'Weight/Vol (%)'는 최종 40ml 조성물을 기준으로 해당 성분의 무게를 의미한다.In Table 1, 'up to 40ml' means that the final composition is 40ml by adding water to each component, and 'Weight / Vol (%)' means the weight of the component based on the final 40ml composition.
<1-3> 뇌 조직 절편 투명화 및 선팽창<1-3> Brain tissue slice clearing and linear expansion
고정된 Thy-1-GFP 마우스 뇌를 관상 뇌 절단틀(coronal brain matrix)에서 1mm 두께의 뇌 절편으로 잘랐다. Easyindex (LifeCanvas Technologies, Cambridge, MA, USA), XclarityMS (Logos biosystems, 경기도 안양), MS (Binaree. Inc, 대한민국 대구) 등 상용화된 굴절률 동기화 용액(RI matching solution) 및 본 발명의 AICI 용액을 웰 플레이트의 별도 웰(well)에 준비하고 뇌 조각을 각 웰(well)에 각각 배치하였다. 그 후, 웰 플레이트를 오븐에서 25℃와 35℃에서 두 경로로 회전시켰다. 각 용액으로 처리된 뇌 조각을 특정 간격으로 캡처하여 투명도와 확장을 서로 비교하였다. 촬영한 이미지로 상대적인 면적을 ImageJ로 측정하였다. 초기 상태와 최종 왜곡 (36h)의 정규화된 확장 비율을 정량화 데이터로 적용하였다.Fixed Thy-1-GFP mouse brains were cut into 1 mm thick brain slices in a coronal brain matrix. Commercially available refractive index matching solutions (RI matching solutions) such as Easyindex (LifeCanvas Technologies, Cambridge, MA, USA), XclarityMS (Logos biosystems, Anyang, Gyeonggi-do), MS (Binaree. Inc, Daegu, Korea) and the AICI solution of the present invention were added to well plates. were prepared in separate wells, and brain slices were placed in each well. Then, the well plate was rotated in an oven at 25 °C and 35 °C in two passes. Brain slices treated with each solution were captured at specific intervals to compare transparency and expansion. The relative area was measured with ImageJ. The normalized expansion ratio of the initial state and the final distortion (36 h) was applied as quantification data.
<1-4> 경화 및 점도 측정<1-4> Curing and viscosity measurement
투명화를 위한 시약을 실온 25℃에서 36시간 동안 노출시키고 각 시약의 모세관 현상을 비교하였다. 30일까지 시약의 경화 과정을 관찰하기 위해 웰 플레이트를 기울였다. 모든 시약의 점도는 25℃ 바닥판(bottom plate)에 35mm Rotor가 설정된 Haake Mars rheometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정했다. 점도는 0.01 ~ 10 s-1 범위의 전단 속도로 측정하였다. 실험은 Haake RheoWin Job manager (ver 4.70, ThermoFisher Scientific)에 의해 제어되었다.Reagents for clearing were exposed at room temperature of 25° C. for 36 hours, and capillary action of each reagent was compared. The well plate was tilted to observe the curing process of the reagents up to 30 days. Viscosity of all reagents was measured with a Haake Mars rheometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) with a 35 mm rotor set on a bottom plate at 25 °C. Viscosity was measured at a shear rate in the range of 0.01 to 10 s -1 . Experiments were controlled by Haake RheoWin Job manager (ver 4.70, ThermoFisher Scientific).
<1-5> 이미징 및 형광 보존용 시약의 내구성<1-5> Durability of reagents for imaging and fluorescence preservation
HEK293T 세포는 64 웰 플레이트에서 배양되었다. 바닥 세포의 비 시약 처리 이미지를 획득한 다음, 모든 시약을 각 웰(well)에 처리하고 25℃에서 하룻밤동안 5분마다 동일한 영역을 캡처하였다.HEK293T cells were cultured in 64 well plates. Non-reagent treatment images of basal cells were acquired, then all reagents were applied to each well and the same area was captured every 5 minutes overnight at 25°C.
<1-6> AICI로 처리한 뇌 슬라이스의 3D 이미징<1-6> 3D imaging of brain slices treated with AICI
3 차원 이미징을 위해 해마의 주변을 1-3mm 두께의 조각으로 관상 절개하였다. 슬라이스를 두께에 따라 길이를 다르게 처리한 후, 2% 아가로스에 매립하고 다듬어 AICI 시약에 다시 넣고, 25℃에서 1-2 시간 동안 쉐이커에 놓았다. GFP 검출을 위한 여기 원(Excitation Source, 勵起源)으로는 λ = 488 nm 레이저를 사용하였다. 뇌 절편의 3D 이미지는 Light sheet microscopy (LSM, Lightsheet Z.1, Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다. 조명 렌즈(illumination lens)는 대기(air)에서 5x, 0.1NA였고, 방출 부분의 대물렌즈는 Zeiss의 5x, 0.16 NA, EC Plan-Neofluar였다. 연결된 3D 이미지는 2.47x2.47 mm (1920 x 1920 픽셀)의 시야를 가진 3x3 타일이고, z 단계 크기는 5μm이었다. 모든 인수는 ZEN (Carl Zeiss) 소프트웨어에 의해 제어되었다. 미세 신경 구조 보존을 위한 실험은 NIS(Nikon) 소프트웨어 버전 5.0의 제어 하에 Confocal microscopy (A1Rsi, Nikon, Japan)로 구현되었다. 대물렌즈는 Nikon의 60x Plan Apochromat이었다. 이미지의 시야는 0.2μm z 단계에서 다양한 초점 깊이를 갖는 212 x 212 μm (1024 x 1024 픽셀)이었다.For three-dimensional imaging, the periphery of the hippocampus was coronally cut into 1–3 mm thick slices. After processing the length differently depending on the thickness of the slice, it was embedded in 2% agarose, trimmed, put back into the AICI reagent, and placed in a shaker at 25 ° C. for 1-2 hours. A λ = 488 nm laser was used as an excitation source for GFP detection. 3D images of brain slices were taken with light sheet microscopy (LSM, Lightsheet Z.1, Carl Zeiss, Germany). The illumination lens was 5x, 0.1 NA in air, and the objective lens of the emission part was Zeiss' 5x, 0.16 NA, EC Plan-Neofluar. The concatenated 3D image was a 3x3 tile with a field of view of 2.47x2.47 mm (1920 x 1920 pixels) and a z-step size of 5 μm. All acquisitions were controlled by ZEN (Carl Zeiss) software. Experiments for microscopic neural structure preservation were implemented with confocal microscopy (A1Rsi, Nikon, Japan) under the control of NIS (Nikon) software version 5.0. The objective lens was Nikon's 60x Plan Apochromat. The field of view of the image was 212 × 212 μm (1024 × 1024 pixels) with various depths of focus in 0.2 μm z steps.
<1-7> 스택 이미지의 스티칭(stitching) 및 3D 렌더링<1-7> Stitching and 3D rendering of stack images
ZEISS 공초점 레이저 스캐닝 현미경인 LSM를 사용하여 여러 영역의 이미지를 Imaris Stitcher software (Ver 9.2.1, Bitplane)로 수동으로 스티칭하였다. 공초점 현미경의 LSM 이미지와 미세 구조 스택 이미지를 모두 Imaris software (ver 9.2.1, Bitplane)를 사용하여 렌더링하였다.Using a ZEISS confocal laser scanning microscope, LSM, images of several areas were manually stitched with Imaris Stitcher software (Ver 9.2.1, Bitplane). Both LSM images and microstructure stack images of the confocal microscope were rendered using Imaris software (ver 9.2.1, Bitplane).
2. 결과2. Results
<2-1> AICI 용액을 이용한 뇌조직의 시간경과별 투명화도 평가<2-1> Evaluation of transparency over time of brain tissue using AICI solution
본 실험에서는 투명화와 이미징화의 동시효과를 확인하기 위하여 본 발명의 AICI 용액을 신경형광 발현 뇌조직에 적용하였으며, 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조)을 대조군으로 사용하였다.In this experiment, in order to confirm the simultaneous effect of clearing and imaging, the AICI solution of the present invention was applied to neurofluorescence-expressing brain tissue, and an existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above) was used as a control.
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이 25℃ 온도 조건 보다 35℃의 온도 조건에서 투명화가 더욱 잘 진행되는 것을 확인하였다. 또한, 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액에 비해 본 발명의 AICI 용액이 35℃에서 90분이면 1mm 두께의 뇌 조직을 빠르게 투명시킬 수 있는 것으로 나타났다.As a result, as shown in Figure 1, it was confirmed that the transparency proceeds better under the temperature condition of 35 ℃ than the temperature condition of 25 ℃. In addition, it was found that the AICI solution of the present invention can rapidly make 1 mm thick brain tissue transparent in 90 minutes at 35 ° C. compared to conventional commercialized refractive index matching solutions.
<2-2> AICI 용액을 이용한 뇌조직의 투명화 과정 후 조직 변형<2-2> Tissue transformation after clearing brain tissue using AICI solution
본 실험에서는 AICI 용액을 신경형광 발현 뇌조직에 적용하여 투명화 과정을 거친 후(36시간 경과) 뇌의 수축 및 팽창과 같은 변형을 측정하였다. 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조)을 대조군으로 사용하였다.In this experiment, the AICI solution was applied to the neurofluorescence-expressing brain tissue, subjected to a clearing process (36 hours), and then deformations such as shrinkage and expansion of the brain were measured. An existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above) was used as a control.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AICI 용액을 이용한 경우 투명화 과정 후 기존 상품화되어 판매되고 있는 굴절률 맞춤용액에 비해 뇌조직의 수축 및 팽창과 같은 변형이 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다. 특히, BINAREE社의 MS 용액(Mounting & Storage™ Solution)으로 뇌 조직을 투명화시킨 경우, 본 발명의 AICI 용액을 처리한 경우와 비슷한 속도로 뇌 조직을 투명화시키는 것으로 나타났으나, 투명화 과정 후 뇌의 팽창이 두드러지게 증대되는 것으로 나타나, 장기간 조직을 보관하는데 적합하지 않은 것으로 나타났다. 또한, EasyIndex 및 X-clarityMS(X-CLARITY™ Mounting Solution)의 경우 투명화 과정 후 뇌의 수축이 일어나, 조직 변형이 일어나는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 2, when using the AICI solution of the present invention, it was confirmed that almost no deformation such as contraction and expansion of brain tissue appeared after the transparent process compared to the existing commercialized and sold refractive index matching solution. In particular, when the brain tissue was made clear with BINAREE's MS solution (Mounting & Storage™ Solution), it was found that the brain tissue was made clear at a similar speed to the case where the AICI solution of the present invention was treated. The swelling was markedly increased, making it unsuitable for long-term tissue storage. In addition, in the case of EasyIndex and X-clarityMS (X-CLARITY™ Mounting Solution), it was confirmed that tissue deformation occurred due to brain contraction after the clearing process.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 AICI 용액이 종래 시판제품에 비해 조직을 용액에 장시간 보관 시, 변형을 최소화할 수 있는바 생체조직 투명화용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.Through the above results, it was confirmed that the AICI solution of the present invention can be usefully used as a composition for clearing biological tissues, as compared to conventional commercially available products, when the tissue is stored in the solution for a long time, deformation can be minimized.
<2-3> AICI 용액의 점도 측정<2-3> Viscosity measurement of AICI solution
현미경을 이용한 샘플 이미징시 기포의 형성과 샘플 조작의 편리성을 위해서는 굴절률 맞춤용액의 점도가 낮을수록 유용하다(이미지 깊게 하려면 레이져 투여시 기포가 없어야 함). 따라서 본 실험에서는 회전형 레오미터를 이용하여 본 발명의 AICI 용액의 점도를 측정하였다. 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조)을 대조군으로 사용하였다. For the formation of air bubbles and the convenience of sample handling during sample imaging using a microscope, the lower the viscosity of the refractive index matching solution, the more useful it is (no air bubbles should be present during laser administration to deepen the image). Therefore, in this experiment, the viscosity of the AICI solution of the present invention was measured using a rotational rheometer. An existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above) was used as a control.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AICI 용액이 종래 시판제품에 비해 월등히 물에 가까운 점도를 유지하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the AICI solution of the present invention maintained a viscosity much closer to that of water compared to conventional commercially available products.
참고로, 본 발명의 AICI 용액은 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조) 대비 물성이 물에 가까워 모세관, 점도 등 물과 가장 유사하였으며, 물에 가깝게 투명하고 장기 유지 시에도 액상이 유지되는 것으로 나타났다.For reference, the AICI solution of the present invention was most similar to water in properties such as capillary and viscosity, compared to the existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above), close to water, transparent and close to water, maintaining a liquid phase even during long-term maintenance appeared to be
<2-4> AICI 용액의 상온에서 장시간 외부 노출에 따른 결정화<2-4> Crystallization of AICI solution by prolonged external exposure at room temperature
현미경을 이용한 샘플 이미징시 굴절률 맞춤용액이 상온에서 장시간 외부 노출되며, 이때, 용액의 변성(호박화 또는 결정화)에 따른 샘플의 손상이나 변형이 일어날 수 있다. 즉, 샘플을 이미징하는 경우 장시간 외부 노출됨으로써 굴절률 맞춤용액이 딱딱하게 굳어버리며 결정이 생기고, 결정이 생기면 샘플이 망가지게 된다. 따라서 본 실험에서는 AICI 용액의 상온에서 장시간 외부 노출시킨 후 결정화가 일어나는지 여부를 측정하였다. 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조)을 대조군으로 사용하였다.When imaging a sample using a microscope, the refractive index matching solution is exposed to the outside at room temperature for a long time, and at this time, damage or deformation of the sample may occur due to denaturation (amberization or crystallization) of the solution. That is, in the case of imaging the sample, the refractive index matching solution is hardened and crystals are formed due to exposure to the outside for a long time, and the sample is damaged when the crystals are formed. Therefore, in this experiment, it was measured whether crystallization occurred after exposing the AICI solution to the outside at room temperature for a long time. An existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above) was used as a control.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액은 최대 30일간 외부 노출 시 결정화가 된 반면, 본 발명의 AICI 용액의 경우 30일간 외부 노출 시에도 여전히 액체 상태를 유지하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 4, it was confirmed that the existing commercialized refractive index matching solution was crystallized when exposed to the outside for up to 30 days, whereas the AICI solution of the present invention still maintained a liquid state even when exposed to the outside for 30 days. .
<2-5> AICI 용액의 장시간 이미징시 내구성 측정<2-5> Durability measurement during long-term imaging of AICI solution
본 실험에서는 AICI 용액의 장시간 이미징시 결정화에 의한 세포의 변형이 있는지, 그리고 현미경 이미징에 방해를 주는지를 조사하였다. 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조)을 대조군으로 사용하였다. 바닥 세포의 비 시약 처리 이미지를 획득한 다음, 모든 시약을 각 웰(well)에 처리하고 25℃에서 하룻밤동안 5분마다 동일한 영역을 캡처하였다.In this experiment, we investigated whether there is cell deformation due to crystallization during long-term imaging of AICI solution and whether it interferes with microscopic imaging. An existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above) was used as a control. Non-reagent treatment images of basal cells were acquired, then all reagents were applied to each well and the same area was captured every 5 minutes overnight at 25°C.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액은 시간경과에 따라 결정화로 인해 현미경 상에서 장시간 이미징이 불가능한 반면, 본 발명의 AICI 용액의 경우 현미경 상에서 장시간의 이미징에도 용액의 결정화가 없어 현미경 이미징에 대해 물리적으로 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5, the existing commercialized refractive index matching solution cannot be imaged for a long time on a microscope due to crystallization over time, whereas the AICI solution of the present invention does not crystallize the solution even after long-time imaging on a microscope, It was confirmed that there was no physical effect on imaging.
<2-6> AICI 용액의 투명화 깊이<2-6> Clearing depth of AICI solution
본 실험에서는 AICI 용액의 투명화 한계를 알아보기 위해 뇌 조직 절편의 전반적인 신경형광을 관찰하였다. In this experiment, overall neurofluorescence of brain tissue slices was observed to determine the clearing limit of the AICI solution.
그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AICI 용액에 뇌 조직을 35℃ 온도 조건에서 3일간 보관하는 경우 최대 2~3mm 깊이에서도 형광 단백질 정보를 잘 얻을 수 있어서 투명화의 한계는 3mm임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 6, when the brain tissue is stored in the AICI solution of the present invention at 35 ° C. for 3 days, fluorescent protein information can be obtained even at a depth of up to 2-3 mm, confirming that the limit of transparency is 3 mm. there was.
<2-7> AICI 용액의 사용 시 조직의 미세구조 유지<2-7> Maintenance of tissue microstructure when AICI solution is used
본 실험에서는 AICI 용액을 통하여 신경세포의 변형 없이 미세 구조를 잘 유지할 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명의 AICI 용액을 이용하여 35℃ 온도 조건에서 뇌 조직을 투명화시킨 후 조직 내의 시냅스를 600배 확대 촬영하였다.In this experiment, in order to confirm whether the fine structure can be maintained well without deformation of nerve cells through the AICI solution, the brain tissue was cleared at a temperature of 35 ° C using the AICI solution of the present invention, and then the synapses in the tissue were magnified 600 times. filmed
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AICI 용액을 사용하여 뇌 조직을 투명화시킨 경우 투명화 전과 비교 했을 때, 깊은 뇌조직에서도 미세 구조를 잘 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 7, when the brain tissue was cleared using the AICI solution of the present invention, it was confirmed that the microstructure was well maintained even in the deep brain tissue, compared to before clearing.
<2-8> AICI 용액의 다양한 장기 조직에 적용 가능성<2-8> Applicability of AICI solution to various organ tissues
본 실험에서는 AICI 용액을 뇌 조직뿐만 아니라 허파, 심장, 간, 신장, 소장, 비장(spleen) 등 여러 장기 조직에도 적용이 가능한지 여부를 확인하였다. 참고로, 조직 중 비장의 경우 피가 많이 모여 있는 기관인데 이러한 기관의 이미지화가 어려운 문제점이 있다. 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액(상기 표 2 참조)을 대조군으로 사용하였다.In this experiment, it was confirmed whether the AICI solution could be applied not only to brain tissue but also to various organ tissues such as lung, heart, liver, kidney, small intestine, and spleen. For reference, among tissues, the spleen is an organ in which a lot of blood is collected, and imaging of such an organ is difficult. An existing commercialized refractive index matching solution (see Table 2 above) was used as a control.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AICI 용액을 35℃ 온도 조건에서 48시간 적용하는 경우 허파, 심장, 간, 신장, 소장, 비장(spleen) 조직 모두에서 투명화가 잘 이루어지는 것을 확인하였으며, 특히, 혈액을 많이 함유하고 있는 비장의 경우 본 발명의 AICI 용액을 이용하여 투명화시킨 경우 기존 상품화된 굴절률 맞춤용액에 비해 월등히 우수한 효과를 나타내었다.As a result, as shown in FIG. 8, when the AICI solution of the present invention was applied at 35 ° C. for 48 hours, it was confirmed that all of the tissues of the lung, heart, liver, kidney, small intestine, and spleen were well cleared, In particular, in the case of the spleen containing a lot of blood, when the AICI solution of the present invention was used to make the spleen transparent, the effect was far superior to that of the existing commercialized refractive index matching solution.
<2-9> AICI 용액과 BINAREE社의 굴절률 맞춤용액을 이용한 뇌 조직 투명화 후 형광 이미지 세기 확인<2-9> Confirmation of fluorescence image intensity after clearing brain tissue using AICI solution and BINAREE's refractive index matching solution
본 실험에서는 AICI 용액과 기존 상품화 용액인 BINAREE社의 MS 용액(Mounting & Storage™ Solution)의 투명화 효과를 비교하기 위하여, 1 mm의 뇌 조직에 상기 각각의 용액을 35℃ 온도 조건에서 적용한 후 30min, 1.5h, 40h, 136h 의 시간경과에 따른 형광 이미지 세기를 10x Plan Apochromat 대물렌즈와 488nm 레이저를 통한 Nikon 공초점 현미경(A1Rsi)으로 측정하였다. 형광의 세기는 투명화 된 대뇌피질 (cortex) 영역에서 동일한 FOV (Field of veiw)안에 형광이 강하고 세포크기가 비슷한 신경세포 몸체 (cell body)를 동일 ROI(Region of interest)를 적용하여 측정하였다. In this experiment, in order to compare the clearing effect of the AICI solution and BINAREE's MS solution (Mounting & Storage™ Solution), which is a commercially available solution, each solution was applied to 1 mm brain tissue at a temperature of 35 ° C for 30 min, Fluorescence image intensities over time of 1.5h, 40h, and 136h were measured with a Nikon confocal microscope (A1Rsi) through a 10x Plan Apochromat objective lens and a 488nm laser. The intensity of fluorescence was measured by applying the same region of interest (ROI) to a cell body with strong fluorescence and a similar cell size in the same field of view (FOV) in the cleared cortex region.
그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AICI용액을 처리한 경우 30분부터 형광 세기가 매우 강하게 나타나 투명화 속도가 빠르게 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, BINAREE社의 MS 용액을 처리한 경우 약 2시간 이후부터 투명화가 효과적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 투명화가 완성된 형광세기의 피크점(40 h)을 지나 형광의 보존적인 면에서도, 본 발명의 AICI용액이 BINAREE社의 MS 용액에 비해 형광이 잘 보존되는 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 9, when the AICI solution of the present invention was treated, the fluorescence intensity was very strong from 30 minutes, and it was confirmed that the clearing speed occurred quickly. On the other hand, in the case of treatment with BINAREE's MS solution, it was confirmed that the clearing was effectively achieved after about 2 hours. In addition, in terms of preservation of fluorescence past the peak point (40 h) of fluorescence intensity at which the clearing was completed, the AICI solution of the present invention was found to preserve fluorescence well compared to the MS solution of BINAREE.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to its preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope will be construed as being included in the present invention.
Claims (8)
상기 조성물은 전처리 과정 없이 1~3 mm 두께의 생체 조직을 90분 내지 3일 이내에 신속하게 투명화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화용 조성물.According to claim 1,
The composition is a composition for clearing biological tissues, characterized in that it can rapidly clear biological tissues having a thickness of 1 to 3 mm within 90 minutes to 3 days without a pretreatment process.
상기 조성물은 20일 내지 30일 동안 상온에서 노출되는 경우에도 결정화가 일어나지 않으며 액체 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화용 조성물.According to claim 1,
The composition is characterized in that it does not crystallize and maintains a liquid state even when exposed at room temperature for 20 to 30 days.
상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화용 조성물.According to any one of claims 1 to 3,
The biological tissue is characterized in that selected from the group consisting of brain, lung, heart, liver, kidney, small intestine and spleen, biological tissue clearing composition.
상기 단계는 15℃ ~ 35℃의 상온에서 진행되는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화 방법. According to claim 5,
Characterized in that the step proceeds at room temperature of 15 ℃ ~ 35 ℃, biological tissue clearing method.
상기 단계는 90분 내지 3일 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화 방법. According to claim 5,
Characterized in that the step proceeds for 90 minutes to 3 days, biological tissue clearing method.
상기 생체 조직은 뇌, 허파, 심장, 간, 신장, 소장 및 비장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화 방법.According to any one of claims 5 to 7,
The biological tissue is characterized in that selected from the group consisting of brain, lung, heart, liver, kidney, small intestine and spleen, biological tissue clearing method.
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