KR20230071030A - 단일염기다형성(snp)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 관련 위암 예측 또는 진단용 조성물 - Google Patents

단일염기다형성(snp)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 관련 위암 예측 또는 진단용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230071030A
KR20230071030A KR1020220055665A KR20220055665A KR20230071030A KR 20230071030 A KR20230071030 A KR 20230071030A KR 1020220055665 A KR1020220055665 A KR 1020220055665A KR 20220055665 A KR20220055665 A KR 20220055665A KR 20230071030 A KR20230071030 A KR 20230071030A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gastric cancer
pylori
protein
composition
predicting
Prior art date
Application number
KR1020220055665A
Other languages
English (en)
Inventor
김나영
신철민
온정헌
원성호
박경택
Original Assignee
서울대학교병원
렉스소프트 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교병원, 렉스소프트 주식회사 filed Critical 서울대학교병원
Publication of KR20230071030A publication Critical patent/KR20230071030A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 위암 예측 또는 진단용 조성물, 키트 및 정보제공방법에 관한 것으로, 본 발명은 일 측면에서, 정상 대조군에 비하여 위암군에서는 rs2671655 C>T의 SNP를 가지고, 특히 H. pylori과 관련된 위암, 보다 구체적으로 미만형 위암 발생에 상기 SNP가 역할을 함을 확인하였으며, 상기 SNP는 위암에 대한 감수성에 미치는 영향 측면에서 PHB1, SPOP, 및 ZNF652를 조절할 수 있고, H. pylori 감염에 따라 그 효과가 다른바, 본 발명의 일 측면에 따른 rs2671655의 SNP 검출 제제를 포함하는 조성물은 위암을 예측 또는 진단할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 관련 위암 예측 또는 진단용 조성물 {Composition for predicting or diagnosing gastric cancer related to Helicobacter pylori infection comprising single nucleotide polymorphism detection agent}
본 명세서에는 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 위암 예측 또는 진단용 조성물, 키트 및 정보제공방법이 개시된다.
위암(gastric cancer, GC)은 매년 약 100만 건의 발병 사례가 있고; 연간 720,000 명 이상이 사망하는 전 세계적으로 다섯 번째로 많이 진단되는 암이자 세 번째 주요 암 사망 원인이다 [Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015;136(5):E359-86; Karimi P, Islami F, Anandasabapathy S, Freedman ND, Kamangar F. Gastric cancer: descriptive epidemiology, risk factors, screening, and prevention. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014;23(5):700-13]. Helicobacter pylori 감염은 GC 위험과 관련이 있다. 그러나, H. pylori에 감염된 개인의 2-3%만이 GC로 발병한다 [Hooi JKY, Lai WY, Ng WK, Suen MMY, Underwood FE, Tanyingoh D, et al. Global prevalence of Helicobacter pylori Infection: systematic review and meta-analysis. Gastroenterology. 2017;153(2):420-9]. 또한, H. pylori 제균은 GC 위험을 감소시키지만 이를 제거하지는 않는다.
이전 연구에서는 직계(1촌) GC 가족력이 GC 위험을 증가시킨다고 보고하였으며 [Yaghoobi M, McNabb-Baltar J, Bijarchi R, Hunt RH. What is the quantitative risk of gastric cancer in the first-degree relatives of patients? A Meta-analysis World J Gastroenterol. 2017;23(13):2435-42], 대규모 코호트 쌍둥이 연구는 숙주 유전이 GC 위험을 28% 증가시키는 것으로 나타났다 [Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M, et al. Environmental and heritable factors in the causation of cancer-analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med. 2000;343(2):78-85]. 게놈-전체 연관 연구(genome-wide association studies, GWAS)는 rs4072037 (mucin 1 [MUC1]), rs9841504 (ZBTB20), rs13361707 (protein kinase AMP-activated catalytic subunit α1 [PRKAA1]), rs2294008 (prostate stem cell antigen [PSCA]), 및 rs2274223 (PLCE1)과 같은 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNP)가 GC 위험과 관련이 있어 [Lott PC, Carvajal-Carmona LG. Resolving gastric cancer aetiology: an update in genetic predisposition. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2018;3(12):874-83; Sakamoto H, Yoshimura K, Saeki N, Katai H, Shimoda T, Matsuno Y, et al. Genetic variation in PSCA is associated with susceptibility to diffuse-type gastric cancer. Nat Genet. 2008;40(6):730-40; Wang Z, Dai J, Hu N, Miao X, Abnet CC, Yang M, et al. Identification of new susceptibility loci for gastric non-cardia adenocarcinoma: pooled results from two Chinese genome-wide association studies. Gut. 2017;66(4):581-7], H. pylori-연관 GC 위험에 기여할 수 있음을 확인하였다. H. pylori 감염과 GC 가족력 사이의 시너지적 상호 작용이 관찰되었으며 [Brenner H, Arndt V, St
Figure pat00001
rmer T, Stegmaier C, Ziegler H, Dhom G. Individual and joint contribution of family history and Helicobacter pylori infection to the risk of gastric carcinoma. Cancer. 2000;88(2):274-9; Shin CM, Kim N, Yang HJ, Cho SI, Lee HS, Kim JS, et al. Stomach cancer risk in gastric cancer relatives: interaction between Helicobacter pylori infection and family history of gastric cancer for the risk of stomach cancer. J Clin Gastroenterol. 2010;44(2):e34-9], GC 위험에 대한 H. pylori 감염의 영향은 숙주 유전에 따라 다를 수 있다 [Cai M, Dai S, Chen W, Xia C, Lu L, Dai S, et al. Environmental factors, seven GWAS-identified susceptibility loci, and risk of gastric cancer and its precursors in a Chinese population. Cancer Med. 2017;6(3):708-20; Li M, Huang L, Qiu H, Fu Q, Li W, Yu Q, et al. Helicobacter pylori infection synergizes with three inflammation-related genetic variants in the GWASs to increase risk of gastric cancer in a Chinese population. PLoS ONE. 2013;8(9):e74976; Ying HY, Yu BW, Yang Z, Yang SS, Bo LH, Shan XY, et al. Interleukin-1B 31 C>T polymorphism combined with Helicobacter pylori-modified gastric cancer susceptibility: evidence from 37 studies. J Cell Mol Med. 2016;20(3):526-36]. 그러나, 대부분의 유전 연구는 후보 유전자 접근 방식을 사용하여 상호 작용만을 평가하였으며 GWAS는 GC에서 숙주 유전과 H. pylori간의 상호 작용은 고려하지 않았다. 이러한 배경에서, 본 발명자는 H. pylori 감염에 관한 포괄적인 GWAS가 GC에 대한 감수성을 변형하는 일부 유전자를 밝힐 것이라고 가정하고 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
H. pylori 감염이 위암의 발병에 중요한 역할을 하지만, 감염된 개체의 2 내지 3%만이 위암을 발병하므로, 위암 발병에서 숙주 유전학의 가능한 중요성을 제시한다. 더욱이, H. pylori 자체보다는 H. pylori 및 숙주 유전자 요인 사이의 상호작용이 위암의 위험을 더욱 증가시킬 수 있다. 그러나, 지금까지 위암 발생에서 숙주 유전과 H. pylori 간의 상호작용을 고려한 GWAS는 없었다. 이에, 본 발명자들은 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 효과가 H. pylori 감염 여부에 따라 다르다고 가정하고, H. pylori 감염 상태에 따라 계층화된 피험자를 대상으로 GWAS를 수행한 결과, rs2671655가 위암 위험과 관련이 있고 그 효과가 H. pylori에 의해 바뀌는 것을 발견하였다. 이로써, 본 발명자는 rs2671655이 위암을 예측 또는 진단할 수 있는 인자가 될 수 있음을 있음을 확인하였다.
이에, 일 측면에서, 본 발명의 목적은, 위암을 예측 또는 진단하기 위한 조성물, 키트 및 정보제공방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 위암 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 위암 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는 위암 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 위암 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법으로서, 상기 정보제공방법은 피험자의 샘플로부터 피험자의 샘플로부터 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 단계를 포함하는, 위암 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 정상 대조군에 비하여 위암군에서는 rs2671655 C>T의 SNP를 가지고, 특히 H. pylori과 관련된 위암, 보다 구체적으로 미만형 위암 발생에 상기 SNP가 역할을 함을 확인하였으며, 상기 SNP는 위암에 대한 감수성에 미치는 영향 측면에서 PHB1, SPOP, 및 ZNF652를 조절할 수 있고, H. pylori 감염에 따라 그 효과가 다른바, 본 발명의 일 측면에 따른 rs2671655의 SNP 검출 제제를 포함하는 조성물은 위암을 예측 또는 진단할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 SNUBH 코호트에서 H. pylori-양성 환자(n = 761)의 GWAS 결과를 나타내는 도이다. 도 1A는 맨해튼 플롯(Manhattan plot)으로, 빨간색과 파란색 선은 각각 5Х10-8 및 1Х10-5의 유의 수준을 나타낸다. 도 1B는 분위수-분위수 플롯(quantile-quantile plot)으로, 회색 영역은 95% 포인트별 신뢰 구간을 나타낸다. 도 1C는 영역 플롯(regional plot)으로, 보라색 사각형은 rs2671655을 나타내고 다른 색 원은 각각 변이 및 이의 rs2671655와의 상관관게 정도 (r 2 )를 나타낸다. 도 1에서 약어는 다음과 같다: P, P 값; GIF, 게놈 팽창 인자(genomic inflation factor); Chr, 염색체(chromosome).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 PHB1와 위암과의 관계를 확인하기 위해 수행한 RT-qPCR 분석 결과를 나타내는 도이다. 도 2A 및 2B는 각각 rs2671655의 T 대립유전자 수 (도 2A) 및 표현형(도 2B)에 따른 H. pylori 양성 및 음성 그룹에서의 PHB1 발현을 비교한 결과를 나타낸다. 도 2A 및 2B에서, Y-축은 액틴의 주기 임계값에서 성별, 연령, 흡연 상태 및 상위 4개 PC 점수의 영향을 조정하는 PHB1의 주기 임계값을 뺀 추정값을 나타낸다. 도 2A 및 2B에서, 검은색 선은 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간의 연관성 결과를 나타내고, 유색 선은 각각 동일한 색상의 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간의 연관성 결과를 나타낸다. 도 2에서 약어는 다음과 같다: Ct, 주기 임계값(cycle threshold); β, 그룹 간의 추정된 차이(estimated difference among groups); P, P 값; NS, 유의하지 않음(not significant).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 ZNF652와 위암과의 관계를 확인하기 위해 수행한 RT-qPCR 분석 결과를 나타내는 도이다. 도 3A 및 3B는 각각 rs2671655의 T 대립유전자 수 (도 3A) 및 표현형(도 3B)에 따른 H. pylori 양성 및 음성 그룹에서의 ZNF652 발현을 비교한 결과를 나타낸다. 도 3A 및 3B에서, Y-축은 액틴의 주기 임계값에서 성별, 연령, 흡연 상태 및 상위 4개 PC 점수의 영향을 조정하는 ZNF652의 주기 임계값을 뺀 추정값을 나타낸다. 도 3A 및 3B에서, 검은색 선은 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간의 연관성 결과를 나타내고, 유색 선은 각각 동일한 색상의 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간의 연관성 결과를 나타낸다. 도 3에서 약어는 다음과 같다: Ct, 주기 임계값(cycle threshold); β, 그룹 간의 추정된 차이(estimated difference among groups); P, P 값; NS, 유의하지 않음(not significant).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 SPOP와 위암과의 관계를 확인하기 위해 수행한 RT-qPCR 분석 결과를 나타내는 도이다. 도 4A 및 4B는 각각 rs2671655의 T 대립유전자 수 (도 4A) 및 표현형(도 4B)에 따른 H. pylori 양성 및 음성 그룹에서의 SPOP 발현을 비교한 결과를 나타낸다. 도 4A 및 4B에서, Y-축은 액틴의 주기 임계값에서 성별, 연령, 흡연 상태 및 상위 4개 PC 점수의 영향을 조정하는 SPOP의 주기 임계값을 뺀 추정값을 나타낸다. 도 4A 및 4B에서, 검은색 선은 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간의 연관성 결과를 나타내고, 유색 선은 각각 동일한 색상의 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간의 연관성 결과를 나타낸다. 도 4에서 약어는 다음과 같다: Ct, 주기 임계값(cycle threshold); β, 그룹 간의 추정된 차이(estimated difference among groups); P, P 값; NS, 유의하지 않음(not significant).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 수행한 다유전자 위험 점수(polygenic risk score, PRS) 비교 결과를 나타내는 도이다. PRS 추정값은 rs2671655의 T 대립유전자의 수에 따라 2개 그룹에서 그리고 H. pylori-양성 및 -음성 그룹 간에 각각 비교되었다. 도 5에서 검은색 선은 H. pylori-양성 또는 -음성 서브그룹에서의 연관성 결과를 각각 나타내고, 유색 선은 참가자가 각각 rs2671655의 동일한 수의 위험 대립유전자를 갖는 H. pylori-양성 또는 -음성 그룹 간을 나타낸다. 도 5에서 약어는 다음과 같다: β, 추정된 연관성(-estimated association); P, P 값; NS, 유의하지 않음(not significant).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 가정 경로를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에서, "rs2671655" (chr17:47,468,020;hg19, GH17J049387 인핸서 영역)는 위암에서 수치적 이상을 보이는 가장 흔한 염색체 중 하나인 17번 염색체에 위치하며[Panani AD. Cytogenetic and molecular aspects of gastric cancer: clinical implications. Cancer Lett. 2008;266(2):99-115], 구체적으로, 인핸서 영역, 보다 구체적으로 PHB1, ZNF652, SPOP, 및 리신 아세틸트랜스퍼라제 7 (lysine acetyltransferase 7, KAT7)과 같은 여러 유전자를 표적으로 하는 GH17J049387에 위치한다.
본 발명의 일 측면에서, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.
본 발명의 일 측면에서, "위암 예측"이란 피험자에 대하여 위암이 발병할 가능성이 있는지, 위암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 위암의 원인인자가 무엇인지, 또는 위암이 이미 발병하였는지 여부를 예측 또는 진단하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에서, "위암 진단"이란 피험자에 대하여 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 일 측면에 따른 목적상, 진단은 위암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 임의의 특정 피험자, 구체적으로 동물 피험자에 대한 위암 발병 위험도가 높은 피험자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 위암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 제제를 포함하는 위암 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 rs2671655의 SNP 검출 제제는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머(primer)는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건, 즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에서 주형-지시(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함), 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10내지 약 30 nt, 또는 약 10 내지 약 20 nt일 수 있다.
구체적으로, 상기 프로브(probe)는 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 표지 물질에 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 길이가 약 50 nt 내지 약 400 nt, 약 100 nt 내지 약 350 nt, 약 150 nt 내지 약 300 nt, 또는 약 200 nt 내지 약 250 nt일 수 있다.
상기 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 검출된 SNP가 rs2671655 C>T인 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 위암은 장형 위암, 미만형 위암 또는 이들이 혼합된 형태의 위암일 수 있고, 구체적으로 미만형 위암일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 현재 감염되거나 과거에 감염되었던 피험자에게 적용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, rs2671655 C>T SNP는 위암, 구체적으로 H. pylori-양성인 위암(현재 또는 과거에 감염), 보다 구체적으로 H. pylori-양성인 미만형 위암을 예측 또는 진단할 수 있다 (실험예 1).
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 프로히비틴(prohibitin, PHB1), 반점형 POZ 단백질(speckle-type POZ protein, SPOP) 및 징크 핑거 단백질 652(zinc finger protein 652, ZNF652)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 측정 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv를 모두 포함하는 것일 수 있다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 앱타머는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 일 측면에 따른 앱타머는 상기 단백질에 대하여 사용될 수 있다. 상기 단백질에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 mRNA 발현 수준 측정 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 혼성화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 프라이머 및 프로브에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 혼성화(hybridization)란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 상기 PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 상기 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에서 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 PHB1 단백질의 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 헬리코박터 파일로리에 현재와 과거 모두에서 감염되지 않은 피험자에게 적용되고, 상기 측정된 SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, RT-qPCR 및 IHC 실험 결과로부터 PHB1은 대조군보다 위암군에서 더 많이 발현되고, SPOP 및 ZNF652는 오직 H. pylori-음성 위암군에서만 더 많이 발현됨을 확인하였고(실험예 2), 이로부터 도 6과 같은 가능한 경로를 도출할 수 있었다. 도 6에 따르면, PHB1은 종양 유전자로 작용하는 것으로 보이며, SPOP 및 ZNF652는 종양 억제자로 작용한다. 또한, H. pylori는 PHB1의 기능을 방해할 수 없지만 SPOP 및 ZNF652의 기능을 방해할 수 있다. H. pylori-감염된 개체의 경우, rs2671655의 위험 대립유전자가 증가함에 따라 3가지 유전자가 모두 더 많이 발현되고, PHB1의 기능이 고유하게 활성화될 수 있다. 개체에서만 동일한 패턴을 나타내므로, SPOP 및 ZNF652가 H. pylori 존재 하에서는 제대로 기능하지 않을 수 있음을 예상할 수 있다 (도 2 내지 4).
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 피험자의 샘플에 적용하는 것일 수 있고, 상기 샘플은 본 발명의 일 측면에 따른 rs2671655의 SNP을 검출할 수 있는 개체, 또는 PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미하며, 구체적으로, 상기 샘플은 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 위암 예측 또는 진단용 조성물을 포함하는 위암 예측 또는 진단용 키트를 제공한다. 상기 위암 예측 또는 진단용 조성물에 대한 설명은 상기 키트에 적용될 수 있다. 상기 위암, rs2671655, SNP, SNP 검출 제제, PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준 측정 제제, 위암으로 예측 또는 진단에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있다.
구체적으로, 상기 RT-PCR 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또는, 구체적으로, 상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산이 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 설명서에는 상기 검출된 SNP가 rs2671655 C>T인 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것이 기재될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 설명서에는 상기 PHB1 단백질의 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높으면 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것이 기재될 수 있다. 또는, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 설명서에는 상기 피험자가 헬리코박터 파일로리에 현재와 과거 모두에서 감염되지 않은 피험자이고, 상기 피험자 샘플에서 측정된 SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준 이 정상 대조군에 비하여 높으면 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것이 기재될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 키트는 피험자의 샘플에 적용되는 것일 수 있고, 상기 샘플은 본 발명의 일 측면에 따른 rs2671655의 SNP을 검출할 수 있는 개체, 또는 PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미하며, 구체적으로, 상기 샘플은 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위암 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법으로서, 상기 정보제공방법은 피험자의 샘플로부터 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 단계를 포함하는, 위암 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 위암, rs2671655, SNP, SNP 검출 제제, PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준 측정 제제, 위암으로 예측 또는 진단에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따른 피험자의 샘플로부터 검출된 SNP가 rs2671655 C>T인 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 피험자의 샘플은 피험자의 핵산을 포함할 수 있고,폐암 상기 핵산은 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 위암은 장형 위암, 미만형 위암 또는 이들이 혼합된 형태의 위암일 수 있고, 구체적으로 미만형 위암일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 피험자는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 현재 감염되거나 과거에 감염되었던 피험자일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 정보제공방법은 피험자의 샘플로부터 프로히비틴(prohibitin, PHB1), 반점형 POZ 단백질(speckle-type POZ protein, SPOP) 및 징크 핑거 단백질 652(zinc finger protein 652, ZNF652)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 단백질 수준 측정은 위암의 예측 또는 진단을 위하여 피험자에서 분리된 생물학적 시료에서 상기 PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로써, 웨스턴블롯(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmuno assay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining, IHC 염색), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석 법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준 측정은 위암의 예측 또는 진단을 위하여 피험자에서 분리된 생물학적 시료에서 상기 PHB1, SPOP 및 ZNF652로 이루어진군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로써, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RTPCR), RNase 보호분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 정보제공방법은 상기 측정된 단백질 또는 mRNA 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정상 대조군은 위암에 걸리지 않은 대조군, 구체적으로 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 현재 및 과거에서 감염되지 않았고 위암에 걸리지 않은 대조군, 미만형 위암에 걸리지 않은 대조군, 또는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 현재 및 과거에서 감염되지 않았고 미만형 위암에 걸리지 않은 대조군을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따른 정보제공방법은 상기 측정된 PHB1 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따른 피험자는 헬리코박터 파일로리에 현재와 과거 모두에서 감염되지 않은 피험자이고, 상기 정보제공방법은 상기 측정된 SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예 및 실험예에서, 연속 변수는 평균±표준 편차로 표시하였고, 범주형 변수는 비율에 따른 숫자로 표시하였다. 범주형 변수의 경우, χ2 검정을 사용하여 분석하였다. 그룹 간의 차이는 2개 그룹만 있는 경우에는 Student's t 검정을 사용하고 그룹이 2개 이상인 경우에는 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)을 사용하여 분석하였다. 모든 통계 분석은 R 버전 3.2.3 (The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria; http:// www.r- project. org)을 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 P 값 < 0.05으로 설정되었다.
[실시예 1] 연구 집단 및 GWAS
[실시예 1-1] 분당서울대학교병원(SNUBH) 코호트를 이용한 GWAS
본 연구는 SNUBH에 등록된 1216 명의 피험자 (610명의 위암군 및 606명의 대조군)를 연속적으로 통합하였다. 대부분의 대조군은 전암성 위점막 병변 또는 위암에 대한 선별 프로그램의 일환으로 표준 식도위 십이지장 내시경 검사를 받았다. 식도위 십이지장 내시경 검사 결과에서 GC, 이형성, 점막 관련 림프 조직 림프종, 또는 식도암의 증거가 없을 때 피험자를 대조군으로 등록하였다. 모든 피험자는 수술 또는 내시경 치료 후 조직학적으로 위선암(gastric adenocarcinomas)으로 확인되었다. 26-80 세의 모든 피험자는 사전 동의를 받았고 잘 훈련된 면접관의 감독 하에 설문지를 작성하도록 요청받았다. 설문지는 인구통계학적 데이터 (연령, 성별, 및 현재 및 아동기 거주지), 사회경제적 데이터 (흡연, 월 소득, 교육 수준), 식이 데이터(짠 음식 및 매운 음식 식단), 및 H. pylori 제균 치료 이력에 대한 질문을 포함했다. 연구 프로토콜은 SNUBH의 윤리위원회의 승인을 받았다(IRB No. B-1610-366-303). 또한, 본 연구는 ClinicalTrials.gov (NCT03486574; 연구 시작 날짜: 2016년 12월 7일; 1차 완료 날짜: 2022년 12월 31일 [예상])에 등록되었다.
모든 연구 피험자로부터 혈액 샘플을 얻었고, 제조사의 지침에 따라 QIAamp® DNA 혈액 미니 키트 (Qiagen, CA, USA)를 사용하여 커피 코트 층(buffy coat layer)의 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 순도 및 농도는 Nanodrop 분광광도계 (Thermo scientific, USA)를 사용하여 평가하였다. 추출된 DNA 샘플은 추가 분석을 위해 -20℃에 보관되었다.
연구 대상자는 796,769개의 변이에 대해 Affymetrix Axiom Korean Chip (v1.1)을 사용하여 유전자형을 지정했다[Moon S, Kim YJ, Han S, Hwang MY, Shin DM, Park MY, et al. The Korea biobank array: design and identification of coding variants associated with blood biochemical traits. Sci Rep. 2019;9(1):1382]. 유전자형은 K-medoids를 사용하여 클러스터링되었고 [Seo S, Park K, Lee JJ, Choi KY, Lee KH, Won S. SNP genotype calling and quality control for multi-batch-based studies. Genes Genom. 2019;41(8):927-39], Anderson et al.[Anderson CA, Pettersson FH, Clarke GM, Cardon LR, Morris AP, Zondervan KT. Data quality control in genetic case-control association studies. Nat Protoc. 2010;5(9):1564-73]이 제안한 품질 관리 (QC) 단계에 따라 데이터를 다듬었다. 참가자는 다음의 경우에 분석에서 제외되었다: (1) 추정된 유전자형과 생물학적 성별이 일치하지 않는 경우, (2) 유전자형의 결측률이 0.03보다 큰 경우, (3) 이형접합률이 전체 참가자의 평균에서 3 표준편차 이상인 경우, (4) 쌍별 동일성 추정치(pairwise identity-by-descent estimate)가 상대보다 큰 결측 유전자형 비율로 0.185보다 큰 경우. 변이는 다음의 경우에 제외되었다: (1) 성염색체에 위치한 경우, (2) 위암군과 대조군 사이의 결측률이 유의하게 다르고 (p < 1Х10-5) 0.03보다 큰 경우, (3) 소수 대립유전자 빈도(minor allele frequency, MAF)가 0.005보다 작은 경우, (4) Hardy-Weinberg 평형 (HWE) 검정의 P-값이 < 0.001인 경우.
QC 후, Michigan Imputation Server (v.1.1)를 사용하여 나머지 1,038 참가자 및 606,270개의 변이에 대한 데이터를 얻었다 [Das S, Forer L, Schφnherr S, Sidore C, Locke AE, Kwong A, et al. Next-generation genotype imputation service and methods. Nat Genet. 2016;48(10):1284-7]. 비유럽 및 혼합 인구, Eagle (v.2.4), Minimac4, 및 아시안이 포함된 Haplotype Reference Consortium r1.1 2016은 설정된 파이프라인에서 각각 참조 패널, 단계적 프로그램, 대치 프로그램 및 QC 집단으로 지정되었다.
대치(imputation) 후, 다음에 해당되는 변이는 제외되었다: (1) MAF가 0.05 미만인 경우, (2) 결측률이 0.03보다 큰 경우, (3) HWE 검정의 p-값이 < 0.001인 경우, (4) 대치 품질 점수(imputation quality score, INFO)가 0.3보다 작은 경우. 본 발명자들은 대조군의 3명의 피험자가 중간 GC 상태를 가지고 있고, 51명은 다른 암의 이전 병력이 있음을 발견하였다; 따라서 본 발명자는 본 연구 분석에서 그들을 제외하였다. 성별, 연령, 흡연 상태, 상위 4개 주요 구성요소 (PC) 점수를 조정하여 변이별 로지스틱 회귀를 수행하였다. -indep-pairwise 50 5 0.2 in plink (v1.90b3.44) 옵션을 사용하여 추출된 가지치기된 변이를 사용하여 PC 점수를 계산하였다 [Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MA, Bender D, et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 2007;81(3):559-75]. 참가자 중 15명은 흡연 여부에 대한 정보가 없었고, 1명은 GC 상태가 알려지지 않았다. 최종적으로, 968명의 참가자 (527명의 GC 피험자 및 441명의 비암 대조군) 및 4,962,361개의 변이가 분석되었다. H. pylori-양성 참가자 761명 (454명의 위암군 및 307명의 대조군) 및 H. pylori-음성 참가자 207명 (73명의 위암군 및 134명의 대조군). 527명의 위암군 중, 323명은 장형 암 (271명의 H. pylori-양성 및 52명의 H. pylori-음성), 197명은 미만형 암 (176명의 H. pylori-양성 및 21명의 H. pylori-음성)이었다. 게놈 데이터 분석은, plink (v1.90b3.44), ONETOOL(v1.0) [Song YE, Lee S, Park K, Elston RC, Yang HJ, Won S. ONETOOL for the analysis of family-based big data. Bioinformatics. 2018;34(16):2851-3], 및 R (v3.6.3)을 사용하였다.
하기 표 1은 968명의 피험자 (527명의 GC 피험자 및 441명의 대조군)을 포함하는 SNUBH 코호트의 기준선 특성을 나타낸다. GC 피험자는 나이가 많고 주로 남성이었으며, 대조군에 비해 H. pylori 양성, 흡연, 음주, 고염분 섭취의 비율이 더 높았다 (P < 0.001). 교육 수준은 위암군과 대조군 사이에 유의한 차이를 보였다 (P < 0.001).
[표 1] 전체 SNUBH 코호트에서 연구 피험자의 특성 (N = 968)
Figure pat00002
[실시예 1-2] H-PEACE 코호트 및 US Biobank (UKBB) 데이터를 사용한 유의한 변이 검증
H-PEACE 코호트는 2003년부터 2017년까지 서울대학교병원 강남센터에 등록한 참가자들로 구성되었다 [Lee C, Choe EK, Choi JM, Hwang Y, Lee Y, Park B, et al. Health and Prevention Enhancement (H-PEACE): a retrospective, population-based cohort study conducted at the Seoul National University Hospital Gangnam Center, Korea. BMJ Open. 2018;8(4):e019327]. 그 중 8000명의 참가자 및 2349명의 참가자가 각각 다른 시간에 Affymetrix Axiom Korean Chip (v1.0)로 유전자형을 분석하였다. 두 유전자형 데이터를 결합한 후, 본 발명자는 상기 상태와 동일한 QC 및 대치 단계를 따랐고, H. pylori 감염에 대항 정보가 없거나 GC를 가진 65세 이상의 참가자를 추가로 제외하였다. QC 후, 7812명의 참가자 (21명의 GC 피험자 및 7791명의 대조군)이 남았다. 그 중, 3975명이 H. pylori-양성이었다 (13명의 GC 피험자 및 3,962명의 대조군). SNUBH 코호트에서 유의한 변이에 대한 로지스틱 분석은 흡연 상태를 제외하고 SNUBH 코호트의 GWAS와 동일한 공변량으로 수행되었다.
UKBB 데이터는 50만명의 참가자의 유전자형 및 표현형 데이터 쌍의 잘 알려진 수집이다 (https:// www. ukbio bank. ac. uk/). 본 발명자는 데이터 수집에서 자가-보고된 암 상태 (필드 id: 20001; f.20001), 연령 (f.21022), 흡연 상태 (f.20116), 및 유전자형 데이터를 추출하였다. 철회를 요청하고 GC 외 다른 암을 가진 참가자는 제외되었다. 그 후, 182명의 GC 참가자 및 487,097명의 비암 참가자를 사용하여 GWAS와 동일한 로지스틱 모델을 사용하여 SNUBH의 GWAS에서 중요한 변이와 GC 위험 간의 연관성을 검증했다.
[실시예 2] H. pylori 감염 여부 확인 실험
상기 실시예 1의 피험자들의 H. pylori 감염에 따른 결과를 확인하기 위해, 하기와 같은 방법으로 H. pylori 감염 여부를 확인하고, 실시예 및 실험예에서 H. pylori-양성 및 -음성을 정의하였다.
[실시예 2-1] H. pylori 검사 및 조직학
모든 피험자에서, 조직학적 분석을 위한 내시경 검사, 및 Campylobacter-유사 유기체 검사 (CLOtest)를 통해 10개의 생검 표본을 획득하고, 현재 H. pylori 감염 여부를 확인하기 위해 배양을 수행하였다. 이 방법론은 이전에 제시되었다 [Shin CM, Kim N, Lee HS, Park JH, Ahn S, Kang GH, et al. Changes in aberrant DNA methylation after Helicobacter pylori eradication: a long-term follow-up study. Int J Cancer. 2013;133(9):2034-42]. 간단히, 전정부의 더 큰 곡률 쪽에서 얻은 2개의 생검 표본과 위체에서 얻은 2개의 생검을 포르말린에 고정하여 변형된 김자 염색을 통해 H. pylori의 존재와, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통해 염증 세포 침윤, 위축 및 장상피화생의 정도를 평가하였다. 이러한 위점막의 조직학적 특징은 업데이트된 Sydney 점수 시스템 ("0," 없음; "1," 경증; "2," 중증도; 및 "3," 두드러짐(marked))을 사용하여 기록되었다 [Dixon MF, Genta RM, Yardley JH, Correa P. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney system. International workshop on the histopathology of gastritis. Houston Am J Surg Pathol. 1996;20(10):1161-81]. 전정부의 더 작은 곡률 및 위체에서 얻은 각각 다른 표본은 신속 요소분해 효소 테스트 (CLOtest, Delta West, Bentley, Australia)에 사용되었고, 4개의 표본 (전정부로부터 2개, 위체로부터 2개)은 배양에 사용되었다. 존재하는 유기체는 그람 염색; 콜로니 형태; 및 양성 산화효소, 카탈라제, 및 요소분해효소 반응에 의해 H. pylori로 확인되었다 [Lee JW, Kim N, Nam RH, Jang JY, Choi Y, Lee DH. Favorable outcomes of rescue second- or third-line culture-based Helicobacter pylori eradication treatment in areas of high antimicrobial resistance. Helicobacter. 2021;26(5):e12844]. 전정부 및 위체로부터의 비암성 조직 및 위암 조직의 남아있는 생검 표본은 -70℃에서 즉시 동결되었다.
[실시예 2-2] H. pylori 혈청학 및 혈청 펩시노겐 검사에 의한 위 위축의 평가
기준선에서 연구 참가자로부터 공복 혈청 샘플을 수득하였다. H. pylori 혈청 검사를 위해, H. pylori에 특이적인 면역글로불린 G를 각 피험자의 혈청에서 효소 결합 면역흡착 분석법으로 확인하였고 (Genedia H. pylori ELISA; Green Cross Medical Science Corp., Eumsung, Korea); 이 H. pylori 항체 검사에서 한국 균주를 항원으로 사용하였다 [Kim HJ, Hwang SW, Kim N, Yoon H, Shin CM, Park YS, et al. Helicobacter pylori and molecular markers as prognostic indicators for gastric cancer in Korea. J Cancer Prev. 2014;19(1):56-67]. 또한, 펩시노겐 (PG) I 및 II의 혈청 농도를 라텍스-강화 탁도 면역측정법 (Shima Laboratories, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다. 본 연구에서, 이전 보고에서보다 더 엄격한 컷오프 값을 적용하여 PG I > 70 및 PG I/II 비율 > 4.0를 위축이 없는 것으로 정의하였고, PG I/II 비율 < 2.5를 명확한 위축으로 정의하였다 [Kim HJ, Hwang SW, Kim N, Yoon H, Shin CM, Park YS, et al. Helicobacter pylori and molecular markers as prognostic indicators for gastric cancer in Korea. J Cancer Prev. 2014;19(1):56-67].
[실시예 2-3] H. pylori 감염의 정의
H. pylori-양성 그룹은 현재 (또는 활성) 감염 및 과거 감염을 모두 포함한다. 본 연구에서, H. pylori 감염 여부를 확인하기 위해, H. pylori의 혈청학적 검사, 과거의 H. pylori 제균 이력, CLOtest 및 조직검사를 종합적으로 확인하였다. 현재 H. pylori 감염의 증거가 없는 H. pylori 제균 이력이 있는 피험자는 H. pylori에 노출된 것으로 간주되었다.
[실시예 3] SNP의 조절 유전자와 위암과의 관계 확인
상기 실시예 1을 통해 GWAS를 수행하여 위암과 관련된 마커로 특정 SNP를 발굴하였는바, 이와 위암과의 관계를 확인하기 위해 상기 발굴된 SNP의 조절 유전자의 mRNA 발현 수준을 하기의 방법으로 측정하였다.
[실시예 3-1] RNA 분리 및 실시간 중합효소연쇄반응 (PCR) 분석
Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 위 점막의 신체 표본에서 총 RNA를 추출하였다. RNA 샘플을 RNase-없는 물에서 0.5 mg/mL의 최종 농도로 희석하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 제조사의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 총 RNA (1000 ng)를 cDNA로 역전사시켰다. 2 Х SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Japan)를 포함하는 20-μL 반응 혼합물에서 2 μL의 상보적 DNA를 사용하여 96-웰 반응 플레이트에서 정량적 PCR (qPCR)을 수행하였다. StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하여 샘플을 증폭시켰다. 열 프로파일은 95℃에서 3분동안 초기 변성 후 95℃에서 5초 및 60℃에서 30초 동안 40 주기로 구성된다. 표적 유전자의 사이클 역치(cycle threshold, Ct) 값을 하우스키핑 유전자의 값으로 정규화하여 델타 Ct를 얻었다. 표적 유전자의 mRNA 발현 수준을 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 내인성 대조군 β-액틴의 mRNA 발현 수준과 비교하였다. 실시간 qPCR은 다음과 같은 맞춤형 프라이머를 사용하여 수행되었다: β-actin, 전방향 5'-TTC GAG CAA GAG ATG GCC AC-3' (서열번호 1) 및 역방향 5'-CGG ATG TCC ACG TCA CAC TT-3' (서열번호 2); 프로히비틴(prohibitin, PHB1), 전방향 5'-CGG AGA GGA CTA TGA TGA G-3' (서열번호 3) 및 역방향 5'-GGT CAG ATG TGT CAA GGA-3' (서열번호 4); 징크 핑거 단백질 652(zinc finger protein 652, ZNF652), 전방향 5'-GTT TCA GTA CAA GTA CCA GC-3' (서열번호 5) 및 역방향 5'-AGA TAA AGG GTT TCT CTC CAG-3' (서열번호 6); 및 반점형 POZ 단백질(speckle-type POZ protein, SPOP), 전방향 5'-TGA CCA CCA GGT AGA CAG CG-3' (서열번호 7) 및 역방향 5'-CCC GTT TCC CCC AAG TTA-3' (서열번호 8) [Xu J, Wang F, Wang X, He Z, Zhu X. miRNA-543 promotes cell migration and invasion by targeting SPOP in gastric cancer. Onco Targets Ther. 2018;11:5075-82].
추정된 유전자 발현 수준과 변이 또는 GC의 위험간의 연관성은 GWAS 분석에 사용된 변수의 효과에 대한 조정과 함께 선형 회귀를 사용하여 추정되었다.
[실시예 3-2] 면역조직화학 염색
16명의 대조군 (10명의 H. pylori 감염이 없는 대조군 및 6명의 활성 H. pylori 감염이 있는 대조군) 및 17명의 위암군 (9명의 H. pylori 감염이 없는 위암 피험자 및 8명의 H. pylori 감염이 있는 위암 피험자)의 파라핀 절편에 프로히비틴 및 ZNF652에 대한 면역조직화학염색(immunohistochemical(IHC) 염색)을 수행하였다. 종양 조직 절편 (3 또는 4 mm 두께)을 크실렌에서 탈파라핀화하고 등급화된 에탄올 시리즈에서 재수화하였다. 압력솥을 이용하여 습한 열에서 시트레이트 완충액 (pH 6.0)에서 에피토프 복구(epitope retrieval)를 수행하였다. 그 후, 조직 절편을 프로히비틴에 대한 1차 마우스 단일클론 항체 (MA5-12,855, Thermo Fisher Scientific, 3747 N. Meridian Road, Rocfold, IL 61,105, USA) 및 ZNF652에 대한 1차 마우스 단일 클론 항체 (ZNF652 antibody, NBP1-97,753, Novus Biologicals, 10,730 E. Briarwood Avenue, Centennial, CO 80,112, USA)와 함께 배양하였다. SuperPicture Polymer Detection Kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 면역 반응성 부위를 시각화하였다. 슬라이드는 디지털 Nikon DSM1200F 카메라 (Nikon, USA)가 장착된 Nikon Eclipse E600 현미경 (Nikon, USA)을 사용하여 광학현미경으로 관찰하였다. IHC 결과는 면역반응의 강도에 따라 부재 (0), 경증 (1), 중증도 (2), 및 두드러짐 (3)으로 분류되었다.
[실시예 3-3] 전사체 프로파일링 분석
본 발명자는 공개적으로 이용 가능한 전사체 데이터 세트, 즉 GSE79973을 사용하여, GC와 관련된 유전자를 표적화하였다 [Jin Y, He J, Du J, Zhang RX, Yao HB, Shao QS. Overexpression of HS6ST2 is associated with poor prognosis in patients with gastric cancer. Oncol Lett. 2017;14(5):6191-7]. 이것은 10명의 다른 인간 환자로부터 추출된 GC 조직 및 인접 비종양 조직 쌍의 mRNA 발현 마이크로어레이 데이터이다. limma (v3.42.2) R 패키지는 샘플 상관 관계를 조정하기 위해 duplicateCorrelation 함수로 데이터를 분석하는데 사용되었다 [Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, et al. Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucl Acids Res. 2015;43(7):e47; Smyth GK, Michaud J, Scott HS. Use of within-array replicate spots for assessing differential expression in microarray experiments. Bioinformatics. 2005;21(9):2067-75]. GH17J049387 인핸서에 의해 조절되는 유전자 중, 유의한 변이가 있는 HSALNG0117178, ENSG00000248714, ENSG00000207127, ENSG00000250948, 및 ENSG00000262039는 데이터 분석에 포함되지 않았다. 하나의 유전자 ID에 해당하는 2 개 이상의 프로브 ID가 있는 경우, 가장 유의한 프로브 ID가 선택되었다.
[실험예 1] GWAS 분석을 통한 GC 위험과 연관된 rs2671655 발굴
[실험예 1-1] SNUBH 코호트
상기 실시예 1-1의 SNUBH 코호트를 사용하여, GC 위험과 관련된 게놈 유전자좌를 설명하기 위해 GWAS를 수행하였다. 모든 참가자가 있는 GWAS의 경우, p < 5Х10-8의 유의 수준에서 유의미한 변이가 없었다. 가장 유의한 변이는 rs2484529 (chr10:13,338,730; hg19)이고, p 값은 2.00Х10-7였다.
본 발명자는 코호트를 H. pylori 감염 상태에 따라 2 그룹으로 나누고, 2 데이터 세트에 대해 별도로 GWAS를 수행하였다. H. pylori-양성 그룹은 454명의 GC 피험자 및 307명의 대조군으로 구성되었다. H. pylori-양성 참가자가 있는 GWAS는 rs2671655가 가장 낮은 p-값을 갖는 유의한 유전자좌임을 확인하였다 (P = 4.08Х10-8, OR = 2.03, 95% CI = 1.57-2.61, 도 1A). 제1종 오류는 이 분석에서 잘 통제되어 (게놈 팽창 계수(genomic inflation factor) = 1.015), p-값은 신뢰할 수 있었다 (도 1B). 상기 변이는 염색체 17q21.33에 있으며 (chr17:47,468,020; hg19) (도 1C), 이의 위험 대립유전자는 T이고, 보호 대립유전자는 C이다. 상기 변이의 위험 대립유전자 빈도는 위암군과 대조군에서 각각 0.708 및 0.599였으며, 대조군의 위험 대립유전자 빈도는 한국인의 것과 유사하였다 (0.601; 표 2). 상기 변이는 H. pylori-음성 그룹 (P = 0.929, OR = 1.02, 95% CI = 0.64-1.64, 표 2) 또는 전체 코호트 (P = 1.96Х10-6, OR = 1.70, 95% CI = 1.37-2.11; 표 2)에서 GC 위험과 유의하게 연관되지 않았다. H. pylori-음성 그룹은 73명의 GC 피험자 및 134명의 대조군으로 구성되었으며, 이들 참가자를 대상으로 GWAS를 수행하였다. H. pylori-음성 그룹의 GWAS에는 유의한 변이가 없었다 (n = 207). 가장 낮은 P-값을 가진 변이는 rs169356이고 (chr9:34,782,550; hg19), 이의 P-값은 5.35Х10-6 였다.
[표 2] SNUBH 코호트에서 H. pylori 감염 상태에 따른 rs2671655의 GWAS 결과
Figure pat00003
그런 다음, Lauren 분류 및 H. pylori 감염을 고려하여 GWAS를 수행하였다. 장형 위암의 경우, 유의한 변이가 없었다 (P < 5Х10-8). 그러나, H. pylori-양성 그룹에서 미만형 위암 환자를 대조군과 비교하였을 때, rs2671655의 유의한 연관성이 확인되었다 (P = 4.09Х10-8, OR = 2.53, 95% CI = 1.82-3.52) (176명의 위암군 및 307명의 대조군).
[실험예 1-2] H-PEACE 및 UKBB 코호트
상기 실시예 1-2를 통해, rs2671655와 GC 위험 간의 연관성은 H-PEACE 및 UKBB라는 두 개의 독립적 코호트에서도 확인되었다. QC 후 H-PEACE 코호트에서, H. pylori에 감염된 참가자는 3,975명이었고, 이 중 13명이 GC 환자였다. 비록 위암 피험자의 수가 너무 적지만, 위암 피험자의 변이의 위험 대립유전자 빈도 (0.731)는 대조군에 비하여 컸다 (0.651, 단측(one-tail) P = 0.150, OR = 1.59, 95% CI = 0.66-3.83). UKBB 코호트는 전체 피험자의 약 1%에 대해서만 H. pylori 감염 정보를 가지고 있었다. 따라서, 본 발명자는 H. pylori 감염 여부와 관계 없이 GC 피험자 (n = 182) 및 비위암 피험자 (n = 444,614)를 비교하였다. 로지스틱 분석은 0.05의 명목상 p-값에서 rs2671655와 GC 위험 사이의 상당한 연관성을 보여주었고 (단측 P = 0.041, OR = 1.61, 95% CI = 0.94-2.74) 변이의 대립유전자 빈도는 위암 피험자와 대조군에서 각각 0.961 및 0.940였다.
요약하면, 위암과 관련된 마커로 rs2671655를 발굴하였고, 그 효과가 H. pylori 감염 여부에 의해 바뀌는 것을 확인하였다.
[실험예 2] PHB1, ZNF652 및 SPOP 유전자와 위암과의 관계 확인
상기 실험예 1의 GWAS를 수행하여 위암과 관련된 SNP로 rs2671655를 발굴하였다. PHB1, ZNF652, SPOP, 및 리신 아세틸트랜스퍼라제 7 (lysine acetyltransferase 7, KAT7)과 같은 여러 유전자를 표적으로 하는 GH17J049387 인핸서에 위치한다. rs2671655와 위암과의 관계를 확인하기 위해 상기 실시예 3-1 내지 3-3을 통해, rs2671655의 조절 유전자인, PHB1, ZNF652 및 SPOP와 위암과의 관계를 확인하였다.
[실험예 2-1] PHB1 유전자와 위암과의 관계
PHB1는 물리적으로 rs2671655에 가장 가깝고, 역전사 qPCR (RT-qPCR)이 있는 비암성 위 점막을 사용하여 PHB1의 발현 수준을 측정하기 위해 SNUBH 코호트에서 256명의 위암 피험자 및 159명의 대조군을 무작위로 선택했다. rs2671655에 대한 위험 대립유전자의 수가 증가할수록, PHB1은 H. pylori-양성 그룹 (β = 0.530; P = 1.34Х10-3) 및 H. pylori-음성 그룹 (β = 0.804, P = 1.35Х10-3) 모두에서 유의하게 더 많이 발현되었다 (도 2A). 도 2B는 PHB1이 H. pylori 감염여부와 관계없이 GC가 없는 참가자보다 GC가 있는 참가자에서 훨씬 더 많이 발현되었음을 보여준다 (H. pylori-양성 그룹: β = 0.604, P = 1.82Х10-2; H. pylori-음성 그룹: β = 0.530, P = 3.78Х10-2).
이를 통해, PHB1은 위암이 아닌 피험자보다 위암 환자에서 더 많이 발현됨을 알 수 있었다.
[실험예 2-2] ZNF652 및 SPOP 유전자와 위암과의 관계
위암과 정상 조직 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자를 표적으로 하기 위해 공개된 발현 마이크로어레이 데이터세트인 GSE79973을 분석하였다. 그 결과는 GH17J049387에 의해 조절되는 유전자 중 ZNF652, SPOP 및 KAT7이 FDR 0.1 수준에서 위암와 유의하게 연관되었음을 보여주었다.
RT-qPCR 실험은 PHB1 발현 수준을 위해 준비된 동일한 피험자의 비암성 위 점막을 사용하여 KAT7, ZNF652, 및 SPOP의 발현 수준을 측정하기 위해 수행되었다. KAT7의 발현 수준은 RT-qPCR에 의해 추정되지 않았다. ZNF652는 H. pylori-양성 그룹에서 rs2671655의 위험 대립유전자의 수가 증가할수록 유의하게 더 많이 발현되었지만 (β = 0.300, P = 4.08Х10-2), 이의 발현 수준은 H. pylori-음성 그룹에서 위험 대립유전자의 수에 의존하지 않았다 (β = 0.027, P = 0.888; 도 3A). H. pylori-양성 그룹에서는 위암군과 대조군 사이에 ZNF652 발현 수준에 차이가 없었으나 (β = 0.206, P = 0.357), H. pylori-음성 그룹에서 유의한 수준이 관찰되었다 (β = 0.773, P = 6.56Х10-3; 도 3B).
또한 SPOP 발현 수준 및 rs2671655 사이의 연관성을 평가하였다. 위험 대립유전자의 수가 증가할수록, SPOP는 H. pylori-양성 그룹 (β = 0.649, P = 2.07Х10-2)과 H. pylori-음성 그룹 (β = 0.729, P = 6.04Х10-5) 모두에서 더 많이 발현되었다 (도 4A). 또한, 위암에서 SPOP의 증가는 H. pylori-음성 그룹에서만 관찰되었다 (β = 1.348, P = 1.46Х10-3; 도 4B).
이를 통해, ZNF652 및 SPOP의 발현 수준은 H. pylori-음성 그룹에서만 위암 피험자 및 대조군에 따라 다름을 확인하였다.
[실험예 2-3] 주요 성분 분석(principle component analysis, PCA) 결과
PHB1, ZNF652 및 SPOP의 발현 수준은 H. pylori-양성 그룹과 H. pylori-음성 그룹 모두에서 상관관계가 있었다 (P < 0.05). PCA는 이들의 상관관계를 고려하여 수행하였다. PHB1, ZNF652, 및 SPOP의 발현 수준을 사용하여, H. pylori-양성 그룹과 H. pylori-음성 그룹의 PC 점수를 추정하였다. 그 후, rs2671655의 효과와 GWAS에서 사용된 변수를 조정한 후 GC 위험과 상위 3개 PC 점수 간의 연관성을 테스트하였다. H. pylori-양성 그룹에서 GC 위험은 2번째 상위 PC (PC2) 점수가 증가함에 유의하게 증가하였다 (β = 0.236, P = 3.42Х10-2). PC2는 PHB1이 더 많이 발현되고, 다른 두 유전자는 덜 발현됨에 따라 증가하였다. 그러나, H. pylori-음성 그룹에서, GC 위험은 오직 1번째 상위 PC (PC1) 점수와만 유의하게 연관되었으며 (β = 0.349, P = 1.55Х10-3) 3가지 유전자의 발현이 증가함에 따라 PC1이 증가하였다.
이를 통해, 주요 성분 분석(principle component analysis, PCA)은 GC 위험이 H. pylori-양성 그룹에서 PHB1 발현, 및 H. pylori-음성 그룹에서 PHB1, ZNF652, 및 SPOP 발현과 양의 관련이 있음을 보여주었다
[실험예 2-4] 비암성 위 점막에서 PHB1 및 ZNF652 면역조직화학 염색 결과
면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)은 대조군 (n = 16) 및 GC 피험자 (n = 17)의 비암성 위 점막에서 PHB1 및 ZNF652에 대해 수행되었다. PHB1은 H. pylori-감염에 관계없이 대조군보다 위암군의 위 점막에서 더 많이 발현되었다 (P < 0.05). ZNF652 발현 점수는 H. pylori-양성 그룹에서 대조군과 위암군 사이에 차이가 없었으나, ZNF652 발현은 H. pylori-음성 그룹에서 대조군에 비해 위암군에서 유의하게 증가하였다 (P < 0.05). 이러한 결과는 RT-qPCR 결과와 유사하였다. 그러나, 샘플 수가 적기 때문에, H. pylori 감염 상태에 관계 없이 PHB1 및 ZNF652에서 IHC 점수와 rs2671655의 T 대립유전자 수 사이의 유의한 연관성을 관찰할 수 없었다.
[실험예 3] SNP와 GC 위험 사이의 유전자 매개 분석(Mediation analysis)
상기 실시예 1에서 도출된 rs2671655가 GC에 미치는 영향이 유전자 발현에 의해 매개되는지 여부를 조사하기 위해 부트스트랩과 함께 Sobel 테스트를 사용하여 매개 분석을 수행하였다 [Sobel ME. Asymptotic confidence intervals for indirect effects in structural equation models. Sociol Methodol. 1982;13:290-312]. 효과를 계산하기 위해, 다음과 같은 2 가지 회귀 모델을 조사하였다: 유전자 발현 수준과 변이 간의 연관성 모델; 및 공변량으로 변이가 있는 유전자의 발현 수준과 GC 위험의 모델. 모든 샘플을 사용할 때, H. pylori 감염 상태가 두 회귀 모델에 공변량으로 추가되었다. 매개 효과의 표준 오차는 100,000 번 교체하여 재표본하여 추정하였다.
그 결과, 모든 샘플을 사용할 때, PHB1과 SPOP의 유의한 매개 효과가 발견되었다 (PHB1의 경우 매개 효과(mediation effect) [m] = 2.261 및 P = 2.38Х10-2, SPOP의 경우 m = 2.135 및 P = 3.28Х10-2). ZNF652는 유의한 매개 효과를 나타내지 않았다 (m =1.110, P = 0.267). H. pylori 감염 상태에 따라 계층화한 서브그룹 분석에 따르면, 유사한 매개 효과가 PHB1에서만 발견되었고 (H. pylori-양성 그룹에서는 1.529, H. pylori-음성 그룹에서는 1.774), SPOP 및 ZNF652에서는 발견되지 않았다 (SPOP의 경우 각각 0.581 및 1.834, ZNF652의 경우 각각 0.208 및 -0.176).
즉, rs2671655는 PHB1 및 SPOP를 통해 GC 위험에 영향을 주지만 ZNF652를 통해서 영향을 주지 않음을 확인하였다.
[실험예 4] 다유전자 위험 점수 (polygenic risk score, PRS) 계산
게놈-전체의 복합 형질 분석 (v1.92.0; GCTA)을 사용하여 968명의 참가자의 PRS를 계산하였다 [Yang J, Lee SH, Goddard ME, Visscher PM. GCTA: a tool for genome-wide complex trait analysis. Am J Hum Genet. 2011;88(1):76-82]. 본 발명자는 1 MB 영역 내에서 rs2671655, 및 이와 상관관계가 높은 변이 (r 2 > 0.2)를 제외하였다. 그 후, 0.1 MAF보다 큰 가지치기된 변이만을 사용하여 게놈 관계 매트릭스 (genomic relationship matrix, GRM)를 추정하였다. plink에서 -indep-pairwise 50 10 0.2 명령을 사용하여 가지치기된 변이를 추출하였다. GRM을 사용하여, rs2671655 및 이와 높은 상관관계가 있는 변이 없이 PRS가 계산되었다. 확인 편향을 보정하기 위해, 유병율 값으로 0.00298을 사용하고 [Jung K-W, Won Y-J, Kong H-J, Lee ES. Cancer statistics in Korea: incidence, mortality, survival, and prevalence in 2016. Cancer Res Treat. 2019;51(2):417], 성별, 연령, 흡연 여부 및 상위 4개 PC 점수를 공변량으로 사용하였다.
그 결과, H. pylori-양성 GC 피험자의 PRS는 rs2671655의 위험 대립유전자의 수가 증가할수록 증가했지만 (β = 2.35Х10-9, P = 1.12Х10-2), H. pylori-음성 GC 피험자의 PRS는 수에 따른 차이가 없었다 (β = -1.59Х10-9, P = 0.392) (도 5). 참가자가 rs2671655의 2개의 위험 대립유전자를 경우, H. pylori-양성 GC 피험자의 PRS는 H. pylori-음성 GC 피험자의 PRS보다 유의하게 더 컸다 (β = 5.39Х10-9, P = 5.44Х10-3; 도 5). 그러나, 위험 대립유전자의 수가 1 또는 0일 때, H. pylori-양성 및 H. pylori-음성 그룹 사이에는 유의한 차이가 없었다.
이를 통해, rs2671655의 위험 대립유전자의 수가 증가함에 따라, H. pylori-양성 그룹에서만 PRS가 증가함을 알 수 있었다.
[실험예 5] 보고된 유전자의 유전자 세트 분석
추가적으로, SNUBH 코호트의 GWAS 결과를 기반으로, 이전에 확인된 9개의 유전자 (MUC1, ZBTB20, PRKAA1, LINC02161, UNC5CL, LRFN2, PSCA, PLCE1, 및 ATM)에 대해 유전자 세트 분석을 수행하였고 [Lott PC, Carvajal-Carmona LG. Resolving gastric cancer aetiology: an update in genetic predisposition. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2018;3(12):874-83], 최적 서열 커널 연관 케스트를 수행하였다 [Lee S, Wu MC, Lin X. Optimal tests for rare variant effects in sequencing association studies. Biostatistics. 2012;13(4):762-75]. GWAS에 사용된 변수의 효과를 조정하고 모든 샘플을 사용할 때 H. pylori 감염 상태를 공변량으로 포함하였다. 각 유전자의 게놈 위치와 0.2 Mb 측면 영역 내에 위치한 변이가 선택되었다. 또한, GWAS의 각 유전자에 대한 해당 영역에서 가장 낮은 p-값을 갖는 변이를 요약하고, Holm-Bonferroni-조정된 p 값을 계산하였다 [Holm S. A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand J Stat. 1979;6(2):65-70].
그 결과, 모든 참가자에 대해, MUC1 및 PRKAA1의 연관성이 확인되었다. H. pylori-양성 그룹에서 MUC1만이 GC 위험과 유의하게 연관되었다. 한편, PRKAA1 및 PSCA는 H. pylori-음성 그룹에서 유의하였다. FWER 0.05의 유의 수준에서 유전자의 게놈 위치에서 GC와 관련된 유의한 변이는 없었다.
이를 통해, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함함으로써 위암을 예측 또는 진단할 수 있는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL RexSoft Co., Ltd. <120> Composition for predicting or diagnosing gastric cancer related to Helicobacter pylori infection comprising single nucleotide polymorphism detection agent <130> 21p450ind <150> KR 10-2021-0156628 <151> 2021-11-15 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin forward <400> 1 ttcgagcaag agatggccac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin reverse <400> 2 cggatgtcca cgtcacactt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHB1 forward <400> 3 cggagaggac tatgatgag 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHB1 reverse <400> 4 ggtcagatgt gtcaagga 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF652 forward <400> 5 gtttcagtac aagtaccagc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZNF652 reverse <400> 6 agataaaggg tttctctcca g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPOP forward <400> 7 tgaccaccag gtagacagcg 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPOP reverse <400> 8 cccgtttccc ccaagtta 18

Claims (17)

  1. rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는제제를 포함하는 위암 예측 또는 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검출 제제는 프라이머 또는 프로브인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 검출된 SNP가 rs2671655 C>T인 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 위암은 미만형 위암인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 현재 감염되거나 과거에 감염되었던 피험자에게 적용하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 프로히비틴(prohibitin, PHB1), 반점형 POZ 단백질(speckle-type POZ protein, SPOP) 및 징크 핑거 단백질 652(zinc finger protein 652, ZNF652)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 PHB1 단백질의 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는, 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 헬리코박터 파일로리에 현재와 과거 모두에서 감염되지 않은 피험자에게 적용하는 것이고,
    상기 측정된 SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 위암 예측 또는 진단용 키트.
  10. 위암 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법으로서,
    상기 정보제공방법은 피험자의 샘플로부터 rs2671655의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 단계를 포함하는, 위암 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 검출된 SNP가 rs2671655 C>T인 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는, 정보제공방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 위암은 미만형 위암인, 정보제공방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 피험자는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 현재 감염되거나 과거에 감염되었던 피험자인, 정보제공방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 피험자의 샘플로부터 프로히비틴(prohibitin, PHB1), 반점형 POZ 단백질(speckle-type POZ protein, SPOP) 및 징크 핑거 단백질 652(zinc finger protein 652, ZNF652)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 상기 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 상기 측정된 PHB1 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 피험자는 헬리코박터 파일로리에 현재와 과거 모두에서 감염되지 않은 피험자이고,
    상기 정보제공방법은 상기 측정된 SPOP 및 ZNF652로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높은 경우 위암인 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
KR1020220055665A 2021-11-15 2022-05-04 단일염기다형성(snp)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 관련 위암 예측 또는 진단용 조성물 KR20230071030A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20210156628 2021-11-15
KR1020210156628 2021-11-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230071030A true KR20230071030A (ko) 2023-05-23

Family

ID=86544255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220055665A KR20230071030A (ko) 2021-11-15 2022-05-04 단일염기다형성(snp)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 관련 위암 예측 또는 진단용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230071030A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6219824B2 (ja) びまん性大細胞型ｂ細胞性リンパ腫（ｄｌｂｃｌ）患者における抗−ｃｄ２０療法に対する応答の予測
US20110269143A1 (en) Genetic Variants as Markers for Use in Urinary Bladder Cancer Risk Assessment, Diagnosis, Prognosis and Treatment
US20070166738A1 (en) Markers for breast cancer
KR101141829B1 (ko) 초기 폐암 환자의 생존예측을 위한 유전마커와 이를 이용한 생존예측 방법
KR101751806B1 (ko) 암 환자의 예후 및 항암제 감수성 예측용 마커 조성물
JP2009539960A (ja) 加齢黄斑変性に対する保護および処置
EP3375887A1 (en) Methods for determining resistance to anticancer therapy and composition used therefor
US20130345077A1 (en) Diagnosis of lymph node involvement in rectal cancer
KR101359851B1 (ko) 간세포암종의 예후 진단용 단일 염기 다형성
KR102195591B1 (ko) Glut3의 다형성을 이용한 비소세포폐암의 예후 진단 방법
WO2018160880A1 (en) Compositions and methods for detecting sessile serrated adenomas/polyps
US20150315649A1 (en) Method for diagnosing and assessing risk of pancreatitis using genetic variants
US11279980B2 (en) Methods and compositions for predicting a colon cancer subtype
KR20230071030A (ko) 단일염기다형성(snp)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 감염 관련 위암 예측 또는 진단용 조성물
KR102384992B1 (ko) 대장암 환자의 연령 특이적 바이오마커 및 이의 용도
KR20210133200A (ko) 성별에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트
KR101793775B1 (ko) 비흡연자 폐암 발병 위험성 예측용 마커 및 그에 의한 폐암 발병 위험성을 예측하는 방법
WO2011104731A1 (en) Genetic variants as markers for use in urinary bladder cancer risk assessment, diagnosis, prognosis and treatment
KR101979990B1 (ko) Eno1의 다형성을 이용한 비소세포폐암의 예후 진단 방법
US20120289416A1 (en) Methods and kits used in assessing cancer risk
US20110269636A1 (en) Materials and methods for identifying patients at heighten risk for developing her2+ related brain tumors
US20090186772A1 (en) Markers and Methods for Assessing and Treating Ulcerative Colitis and Related Disorders Using a 19 Gene Panel
KR20210125456A (ko) 전이 여부에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트
WO2024138106A1 (en) Compositions and methods for identification of hypomorphic p53 variants
KR20210128370A (ko) 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트