KR20230068659A - Method for increasing the production of extracellular vesicles in Lactobacillus sp. strains using red LED - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 락토바실러스 속에서 세포외 소포체의 생산을 증진시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method capable of enhancing the production of extracellular vesicles in Lactobacillus.
대부분의 동물세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포 내 기원의 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 분비할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 세포외 소포체는 혈액, 소변, 타액 및 세포 배양액을 포함하는 모든 생물학적 유체 (biological fluids)에서 발견된다. Most animal cells have the ability to secrete extracellular vesicles of intracellular origin with various sizes and components. Found in biological fluids.
상기 세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)는 세포 바깥의 소포체로 세포가 세포외부로 방출하는 소낭을 말한다. 세포외 소포체는 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 ㎛의 크기를 갖는 막 구조 소낭체로서, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로입자(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함한다. The extracellular vesicles (EVs) refer to vesicles that cells release to the outside of the cell as vesicles outside the cell. Extracellular vesicles are membrane-structured vesicles ranging in size from about 20 nm in diameter to about 5 μm in diameter, and include exosomes, ectosomes, microvesicles, and microparticles. ), apoptotic bodies, and the like.
세포외 소포체 중에서 엑소좀(Exosome)은 약 50-300nm 정도로 가장 작은 직경을 갖는 소낭성 입자이다. 엑소좀의 경우, 단백질 및 RNA의 교환을 통한 세포 간 의사소통의 수단으로, 세포 내 불필요한 물질의 배출 기능도 담당하고 있으며, 마이크로RNA(microRNA, miRNA)를 포함하고 있어 암 등의 질병 조기진단과 같은 분자 진단에 있어서 유용한 마커로 그 활용이 기대되고 있다. 엑소좀은 세포간 정보의 교환을 위해 물질이동에 기여하는 매개체로서 거의 모든 세포에서 분비되며, 면역조절, 암전이, 신경세포와 신경교세포 사이의 신호 전달 매개체로서 작용한다.Among extracellular vesicles, exosomes are vesicular particles having the smallest diameter of about 50-300 nm. In the case of exosomes, as a means of communication between cells through the exchange of proteins and RNA, they are also responsible for the function of excretion of unnecessary substances in cells, and contain microRNA (microRNA, miRNA), which is useful for early diagnosis of diseases such as cancer and It is expected to be used as a useful marker in molecular diagnosis. Exosomes are secreted from almost all cells as mediators that contribute to the transfer of substances for the exchange of information between cells, and act as immune regulation, cancer metastasis, and signal transmission mediators between neurons and glial cells.
엑소좀 또는 세포외 소포체의 중요성 및 가치가 밝혀지고 있지만 엑소좀 또는 세포외 소포체를 다량 생성하고 이를 분리 및 정제하기는 쉽지 않다. 또한, 엑소좀 또는 세포외 소포체는 세포를 통해서만 생산이 가능하고, 세포의 분비량이 극미량에 불과하다. 따라서, 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법과 생성된 엑소좀 또는 세포외 소포체를 대량 생산하는 방법에 대한 개발이 필요하다. Although the importance and value of exosomes or extracellular vesicles has been revealed, it is not easy to produce exosomes or extracellular vesicles in large quantities and to isolate and purify them. In addition, exosomes or extracellular vesicles can be produced only through cells, and the secretion amount of cells is only very small. Therefore, it is necessary to develop a method for increasing the production of exosomes or extracellular vesicles and a method for mass-producing the exosomes or extracellular vesicles.
이러한 세포외 소포체 또는 엑소좀은 포유 동물 세포, 주로 동물성 줄기세포의 배양액에서 분리되고 있다. 인체에 유익한 대표적인 미생물인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하는 균이다. 유산균은 당으로부터 유기산을 만드는 발효 과정을 거쳐 발효유, 치즈, 버터와 같은 발효 식품을 제조하는 데에 사용되고 있으나, 유산균 유래의 복합 생리 활성 물질인 세포외 소포체에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. These extracellular vesicles or exosomes are isolated from mammalian cell cultures, mainly animal stem cells. Lactic acid bacteria, which are representative microorganisms beneficial to the human body, decompose sugars such as glucose or lactose to produce organic acids such as lactic acid or acetic acid. Lactic acid bacteria are used to produce fermented foods such as fermented milk, cheese, and butter through a fermentation process that produces organic acid from sugar, but there is little research on extracellular vesicles, which are complex physiologically active substances derived from lactic acid bacteria.
이에, 본 발명자들은 유산균에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생산을 증가시키는 방법을 개발하고자 하였다.Thus, the present inventors tried to develop a method for increasing the production of exosomes or extracellular vesicles in lactic acid bacteria.
본 발명자들은 락토바실러스 속에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의노력한 결과, 적색 LED를 조사한 경우 락토바실러스 속에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성이 증가되고, 세포외 소포체의 입자 수, 입자 크기 또는 농도가 증가하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors have made diligent efforts to develop a method for increasing the production of exosomes or extracellular vesicles in Lactobacillus. As a result, when irradiated with red LED, the production of exosomes or extracellular vesicles is increased in Lactobacillus, and extracellular vesicles It was found that the number of particles, particle size or concentration of was increased and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 락토바실러스 속 균주에 적색 LED를 조사하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주에서 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for increasing the production of extracellular vesicles in a strain of the genus Lactobacillus, comprising the step of irradiating the strain with a red LED.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주에서 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing extracellular vesicles, comprising the step of isolating extracellular vesicles from a strain of the genus Lactobacillus in which the production of the extracellular vesicles is increased.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a Lactobacillus genus strain with increased production of extracellular vesicles prepared by the above method.
이하 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present specification will be described in more detail.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.A detailed description of this is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may also be applied to other descriptions and embodiments for each. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be seen that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.Expressions such as “comprising” used in this specification are understood as open-ended terms that include the possibility of including other embodiments, unless specifically stated otherwise in a phrase or sentence in which the expression is included. It should be.
본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선을 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.The terms or words used in the description and claims of the present invention should not be construed as being limited to ordinary or dictionary meanings, and the inventors use the concept of terms appropriately in order to explain their invention in the best way. Based on the principle that it can be defined, it should be interpreted as meaning and concept consistent with the technical spirit of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 속 균주에 적색 LED를 조사하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주에서 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법을 제공한다. As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a method for increasing the production of extracellular vesicles in a strain of the genus Lactobacillus, comprising irradiating the strain with a red LED.
본 발명의 용어, "세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)"은 세포바깥의 소포체로 세포가 세포외부로 방출하는 소낭을 말한다. 모든 세포들은 세포외 소포체를 분비하며, 이는 박테리아로부터 인간과 식물에 이르기까지 진화적으로 보존된 현상이다. 세포외 소포체는 단백질, 지질, 유전물질 등 세포 간의 물질 교환을 가능하게 하며, 생리적/병리적으로 신호를 전달하는 매개체로서 작용한다.As used herein, the term "extracellular vesicles (EVs)" refers to vesicles released by cells to the outside of the cell as an extracellular vesicle. All cells secrete extracellular vesicles, an evolutionarily conserved phenomenon from bacteria to humans and plants. Extracellular vesicles enable the exchange of substances such as proteins, lipids, and genetic materials between cells, and act as physiological/pathological signal transmission mediators.
세포외 소포체는 크게 엑소좀(exosomes)과 마이크로베지클(microvesicles)로 분류된다. 엑소좀은 크기가 약 50-300 nm로, 다중 소포 엔도좀(multi-vesicular endosomes)이 성숙하는 과정에서 엔도좀 막이 안쪽으로 들어와 생성된 내강 소낭(intraluminal vesicles)으로, 다중 소포 엔도좀이 세포 표면과 결합할 때 분비된다. 마이크로베지클은 크기가 50-1000 nm로, 원형질막(plasma membrane)이 바깥으로 솟아나와 분리되어 세포 밖으로 분비되는 소낭이다.Extracellular vesicles are largely classified into exosomes and microvesicles. Exosomes are about 50-300 nm in size and are intraluminal vesicles created by the endosome membrane coming in during the maturation process of multi-vesicular endosomes. secreted when combined with Microvesicles are vesicles with a size of 50-1000 nm, and the plasma membrane protrudes to the outside and is separated and secreted out of the cell.
세포들은 생리적 상태에 따라 세포외 소포체를 다르게 생성하고, 특정한 지질/단백질/핵산 조성을 갖는 세포외 소포체를 분비한다. 세포외 소포체의 특정한 조성은 세포외 소포체의 기능과 운명을 결정하게 된다. Cells produce extracellular vesicles differently according to physiological conditions and secrete extracellular vesicles having specific lipid/protein/nucleic acid compositions. The specific composition of the extracellular vesicle determines its function and fate.
본 발명의 용어, "엑소좀(Exosome)"은 세포에서 유래된 지질 이중층으로 구성된 소낭(vesicle)으로 세포외 소포체를 구성한다. 엑소좀은 세포 특유의 단백질, RNA 등을 포함한 상태로 세포 밖으로 분비되어 다른 세포에게 단백질과 RNA 등을 전달한다. 엑소좀에 포함되어 있는 단백질들은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 단백질 분해효소 등에 의해 활성을 쉽게 잃지 않아 가용성 형태의 단순 단백질(soluble protein)보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다. 또한, 지질 이중층의 구조는 세포막과 쉽게 융합되므로 엑소좀 내의 물질들은 세포에 효율적으로 전달될 수 있다. The term of the present invention, "Exosome" is a vesicle composed of a cell-derived lipid bilayer and constitutes an extracellular endoplasmic reticulum. Exosomes, including cell-specific proteins and RNA, are secreted out of the cell and deliver proteins and RNA to other cells. Proteins included in exosomes are protected by phospholipids in the form of cell membranes, so they do not easily lose their activity by proteolytic enzymes, etc., so they can perform more stable functions than soluble proteins. In addition, since the structure of the lipid bilayer is easily fused with the cell membrane, substances in the exosome can be efficiently delivered to the cell.
상기 세포외 소포체 또는 엑소좀은 락토바실러스 속 균주를 배양한 후 수득된 배양액에서 수득할 수 있다. 세포외 소포체 또는 엑소좀은 해당 세포외 소포체 또는 엑소좀이 유래된 세포 타입을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사물질들을 함유한다. 세포외 소포체 또는 엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포의 다양한 분자 구성성분들(예, 단백질들 및 RNA)을 함유한다.The extracellular vesicles or exosomes can be obtained from a culture solution obtained after culturing a strain of the genus Lactobacillus. Extracellular vesicles or exosomes contain RNA, proteins, lipids and metabolites that reflect the cell type from which the extracellular vesicles or exosomes are derived. Extracellular vesicles or exosomes contain various molecular components (eg, proteins and RNA) of the cell from which they are derived.
현재, 세포외 소포체 또는 엑소좀은 포유 동물 세포, 특히 동물성 줄기세포에서 분리되고 있다. 동물세포에서 분비되는 엑소좀보다 유산균의 대사산물로 세포외 소포체(extracellular vesicles, EV)를 분리한다면, 경제성, 수월성, 안전성 면에서 탁월하다. 또한, 세포외 세포체의 대량생산 과정에 적색 LED를 조사하여 유산균을 배양한다면, 세포외 소포체의 대량 생산이 가능하다. 또한, 프로바이오틱스 제제의 무분별한 섭취로 항생제 내성을 갖는 유산균주의 위험성이 보고되어, 생균 그대로 투입되는 경우 면역력이 약한 노인 및 중환자들에게 패혈증 발병 위험이 있을 수 있는데, 유산균 자체가 아니라 유산균의 대표 균주인 락코바실러스 속 균주에서 세포외 소포체 또는 엑소좀을 분리하여 의약품, 건강기능식품 등의 식품, 또는 화장품 원료로 사용하는 경우, 프로바이오틱스 제제의 문제점을 보완하는 대체 신소재로 이용 가능하다.Currently, extracellular vesicles or exosomes are isolated from mammalian cells, especially animal stem cells. If extracellular vesicles (EV) are separated as a metabolite of lactic acid bacteria rather than exosomes secreted from animal cells, it is excellent in terms of economy, efficiency, and safety. In addition, mass production of extracellular endoplasmic reticulum is possible if lactic acid bacteria are cultured by irradiating red LEDs during mass production of extracellular cell bodies. In addition, the risk of antibiotic-resistant lactobacillus strains has been reported due to indiscriminate intake of probiotics preparations, and when live bacteria are introduced as they are, there may be a risk of sepsis in the elderly and critically ill patients with weak immunity. When extracellular vesicles or exosomes are isolated from Bacillus sp. strains and used as raw materials for foods such as pharmaceuticals, health functional foods, or cosmetics, it can be used as an alternative new material to supplement the problems of probiotics preparations.
본 발명의 방법은 락토바실러스 속 균주에 적색 LED를 조사하는 단계를 포함한다.The method of the present invention includes irradiating a strain of the genus Lactobacillus with a red LED.
본 발명의 용어 "조사"는 표면 상에 빛을 비추는 것으로, 인공광원의 빛을 락토바실러스 속 균주에 노출시키는 것을 의미한다.The term "irradiation" as used herein refers to shining light on a surface and exposing the Lactobacillus strain to light from an artificial light source.
본 발명의 용어 "LED(Light-Emitting Diode)"는 화합물 반도체의 특성을 이용하여 전기적인 신호를 적외선 또는 빛으로 변화하여 신호를 보내고 받는데 사용되는 반도체 소자로써 다른 발광체에 비하여 수명이 길며, 낮은 전압을 사용하는 동시에 소비전력이 적은 장점이 있다. The term "LED (Light-Emitting Diode)" of the present invention is a semiconductor device used to send and receive signals by converting electrical signals into infrared rays or light using the characteristics of compound semiconductors, and has a longer lifespan and lower voltage than other light emitting bodies. At the same time, it has the advantage of low power consumption.
상기 적색 LED의 파장은 600 내지 700 nm 일수 있으며, 보다 구체적으로 640 내지 670 nm 일 수 있다. 또한, 상기 적색 LED의 전류는 40 내지 80 mA, 전압은 1.5 V 내지 2.5 V일 수 있으며, 보다 구체적으로 전류는 50 내지 70 mA, 전압은 1.7 V 내지 2.1 V 일 수 있다. 상기 적색 LED는 0 내지 10℃에서 2시간 이상 조사할 수 있으며, 보다 구체적으로 4 내지 6℃에서 2.5 내지 3.5 시간 조사할 수 있다. The wavelength of the red LED may be 600 to 700 nm, and more specifically, 640 to 670 nm. In addition, the current of the red LED may be 40 to 80 mA, the voltage may be 1.5 V to 2.5 V, more specifically, the current may be 50 to 70 mA, the voltage may be 1.7 V to 2.1 V. The red LED may be irradiated at 0 to 10°C for 2 hours or more, and more specifically, at 4 to 6°C for 2.5 to 3.5 hours.
본 발명에서, 상기 락토바실러스 속(Lactobaillus sp.) 균주는 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus), 락토바실러스 액시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(L. amylovorus), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 델브루에키(L. delbrueckii), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 갈리나룸(L. gallinarum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 알리멘타리우스(L. alimentarius), 락토바실러스 쿠르바투스(L. curvatus), 락토바실러스 사케이(L. sakei), 및 토바실러스 부크네리(L. buchneri)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 락토바실러스 사케이(L. sakei)일 수 있다. In the present invention, the strains of the genus Lactobaillus ( Lactobaillus sp.) are Lactobacillus paracasei ( L. paracasei ), Lactobacillus plantarum ( L. plantarum ), Lactobacillus rhamnosus ( L. rhamnosus ), Lactobacillus acido Pilus ( L. acidophilus ), Lactobacillus amylovorus ( L. amylovorus ), Lactobacillus casei ( L. casei ), Lactobacillus brevis ( L. brevis ), Lactobacillus crispatus ( L. crispatus ), Lactobacillus Delbruecki ( L. delbrueckii ), Lactobacillus bulgaricus ( L. bulgaricus ), Lactobacillus fermentum ( L. fermentum ), Lactobacillus helveticus ( L. helveticus ), Lactobacillus gallina room ( L. gallinarum ), Lactobacillus gasseri ( L. gasseri ), Lactobacillus johnsonii ( L. johnsonii ), Lactobacillus reuteri ( L. reuteri ), Lactobacillus salivarius ( L. salivarius ), Lactobacillus alimentarius ( L. alimentarius ), Lactobacillus curvatus ( L. curvatus ), Lactobacillus sake ( L. sakei ), and Tobacilus buchneri ( L. buchneri ) It may be selected from the group consisting of, more specifically, Lactobacillus sake ( L. sakei ).
또한, 상기 적색 LED 조사에 의해, 락토바실러스 사케이에서 생성되는 세포외 소포체(EV)의 입자 수, 입자 크기 또는 농도가 증가되는 특징이 있다. In addition, the number, particle size or concentration of extracellular vesicles (EVs) produced in Lactobacillus sake are increased by the red LED irradiation.
본 발명의 일실시예에서는 암소 조건(Dark condition) 또는 블루 LED에 비해 적색 LED를 조사한 경우 락토바실러스 사케이에서 생성되는 세포외 소포체(EV)의 평균 크기, 농도 및 입자수가 증가하는 것을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the average size, concentration and number of particles of extracellular vesicles (EVs) produced in Lactobacillus sake increased when irradiated with red LED compared to dark condition or blue LED.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주에서 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소포체의 제조방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing extracellular vesicles, comprising the step of isolating extracellular vesicles from a strain of the genus Lactobacillus in which the production of the extracellular vesicles is increased.
상기 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주에서 세포외 소포체를 분리하여 세포외 소포체를 제조할 수 있다. Extracellular vesicles may be prepared by isolating the extracellular vesicles from the strain of the genus Lactobacillus in which the production of the extracellular vesicles is increased.
본 방법은 락토바실러스 속 균주에 적색 LED 조사하여 배양한 후, 이의 배양액을 회수하고 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계이다.This method is a step of culturing a strain of the genus Lactobacillus by irradiation with a red LED, recovering the culture medium, and isolating and purifying exosomes or extracellular vesicles.
상기 용어 "배양액"은 분리된 락토바실러스 속 균주를 시험관 내에서 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 액체 배지 또는 고체 배지에 일정기간 배양하여 수득한 배양물 또는 상기 배양물로부터 락토바실러스 속 균주를 제거한 배양 상등액 등을 의미한다. The term "culture medium" refers to a culture obtained by culturing an isolated strain of the genus Lactobacillus in a liquid medium or a solid medium capable of supporting growth and survival in vitro for a period of time, or a culture obtained by removing a strain of the genus Lactobacillus from the culture. Culture supernatant and the like.
본 발명에서는 세포외 소포체 또는 엑소좀을 분리 및 정제하기 위하여, 원심분리를 진행할 수 있다. 원심분리 방법은 기존의 동물세포에서 세포외 소포체를 분리하는 방법을 변형하여 사용할 수 있다. In the present invention, centrifugation may be performed to isolate and purify extracellular vesicles or exosomes. The centrifugation method can be used by modifying the existing method of separating extracellular vesicles from animal cells.
먼저, 1) 회수한 배양액으로부터 락토바실러스 속 균주를 제거하기 위하여, 2000 내지 4000×g, 4℃에서 10 내지 20분 동안 원심분리하여 세포와 파편(debris)을 제거하고 상등액을 수득하는 단계, 2) 총 엑소좀 분리 시약과 상기 상등액을 혼합하고 균질화하는 단계, 3) 상기 균질화된 혼합물을 실온에서 0.5 내지 2시간 보관하는 단계, 4) 9,000 내지 12,000×g, 4℃에서 30분 내지 1시간 30분 동안 원심분리를 한 후 상등액을 제거하고 하층에 남아 있는 펠렛을 수득하는 단계, 5) 상기 펠렛에 완충용액을 혼합하고 현탁시키는 단계에 의해 세포외 소포체 또는 엑소좀을 분리 및 정제할 수 있다.First, 1) in order to remove the Lactobacillus genus strain from the recovered culture medium, centrifugation at 2000 to 4000 × g at 4 ° C. for 10 to 20 minutes to remove cells and debris and obtain a supernatant; 2 ) mixing and homogenizing the total exosome isolation reagent and the supernatant, 3) storing the homogenized mixture at room temperature for 0.5 to 2 hours, 4) 9,000 to 12,000 × g, 30 minutes to 1 hour and 30 minutes at 4 ℃ The extracellular vesicles or exosomes can be separated and purified by centrifuging for 10 minutes, removing the supernatant and obtaining a pellet remaining in the lower layer, and 5) mixing and suspending the pellet with a buffer solution.
또한, 상기 펠렛에 완충용액을 혼합하기 전에 9,000 내지 12,000×g에서 3 내지 8분 동안 원심분리하여 잔류 시약이나 상등액을 제거하는 단계를 추가할 수 있다. In addition, a step of centrifuging at 9,000 to 12,000 × g for 3 to 8 minutes to remove residual reagents or supernatant before mixing the buffer solution with the pellet may be added.
본 발명의 일실시예에서는 회수한 락토바실러스 속 배양액으로부터 균주 및 파편(debris)를 제거하기 위하여, 3,000g, 4℃ 조건에서 15분 동안 원심분리를 하여 상등액을 취하였고, 상기 회수된 상등액에 총 엑소좀 분리 시약을 혼합하고 균질화 시킨 후 실온에서 1시간 보관하였다. 이 후, 10,000g에서 60분 동안 원심분리하여 2차 상등액을 버리고 1차 펠렛을 회수하였으며, 상기 1차 펠렛을 10,000g에서 5분 동안 원심분리하여 잔류 시약이나 상등액을 제거하고 하층에 남아있는 2차 펠렛을 취하였다. 상기 2차 펠렛에 완충용액을 혼합하고 현탁하시키는 단계에 의해 락토바실러스 속의 배양액으로부터 세포외 소포체 또는 엑소좀을 분리 및 정제하였다.In one embodiment of the present invention, in order to remove strains and debris from the recovered Lactobacillus genus culture, the supernatant was taken by centrifugation at 3,000 g and 4 ° C for 15 minutes, and the total The exosome isolation reagent was mixed and homogenized, and stored at room temperature for 1 hour. Thereafter, the secondary supernatant was discarded and the primary pellet was recovered by centrifugation at 10,000g for 60 minutes, and the primary pellet was centrifuged at 10,000g for 5 minutes to remove residual reagents or supernatant, and the remaining 2 Tea pellets were taken. Extracellular vesicles or exosomes were isolated and purified from the culture medium of the genus Lactobacillus by mixing and suspending the buffer solution in the secondary pellet.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 속 균주에서 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법에 의해 제조된 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a Lactobacillus genus strain with increased production of extracellular vesicles prepared by a method for increasing the production of extracellular vesicles in the Lactobacillus genus strain.
또한, 본 발명은 상기와 같은 적색 LED를 조사하는 방법에 의해 제조된 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주를 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a strain of the genus Lactobacillus with increased production of extracellular vesicles prepared by the method of irradiating red LEDs as described above.
락토바실러스 속 균주에 적색 LED를 조사하는 경우, 세포외 소포체 생성이 증가되는 것을 확인하여, 락토바실러스 속에서 생산된 세포외 소포체를 분리하여 화장품, 식품, 의약품에 이용이 가능하다.When a strain of the genus Lactobacillus is irradiated with red LED, it is confirmed that the production of extracellular vesicles is increased, and the extracellular vesicles produced in Lactobacillus can be separated and used for cosmetics, food, and pharmaceuticals.
이에 따라, 본 발명의 세포외 소포체의 생성이 증가된 락토바실러스 속 균주를 이용하여 세포외 소포체 또는 엑소좀을 대량으로 생산할 수 있다.Accordingly, extracellular vesicles or exosomes can be mass-produced using the strain of the genus Lactobacillus in which the production of extracellular vesicles is increased according to the present invention.
도 1은 본 발명의 LED 조사 장비의 모식도를 나타낸다.
도 2는 락토바실러스 속에서 세포외 소포체를 분리하는 과정을 나타낸다.
도 3은 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis)로 세포외 소포체의 입자 크기와 농도를 확인한 결과이다. 1 shows a schematic diagram of the LED irradiation equipment of the present invention.
Figure 2 shows the process of isolating extracellular vesicles in Lactobacillus.
3 is a result of confirming the particle size and concentration of extracellular vesicles by using a nanoparticle tracking analysis.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
실험예 1. 락토바실러스 사케이(Experimental Example 1. Lactobacillus sake ( LactobacillusLactobacillus sakeisakei )) 균주에 LED 조사LED irradiation of strains
균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)(ATCC 15521)을 분양 받아 사용하였다. 실험 전, 유산균의 선택 배지로서 MRS (de Man, Rogosa, and Sharpe) agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)와 MRS broth (Difco)를 이용하였고, 2-3회 계대 후에 사용하였다. As the strain, Lactobacillus sakei (ATCC 15521) was received and used. Before the experiment, MRS (de Man, Rogosa, and Sharpe) agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) and MRS broth (Difco) were used as selection media for lactic acid bacteria, and were used after 2-3 passages.
도 1은 본 발명의 LED 조사 장비의 모식도를 나타낸다. LED 조사를 위한 장치(ESLEDs co., Ltd., Seoul, Korea)는 Lab-scale 장비로 만들어졌으며, Red (60 mA, 1.90 V)와 Blue (60 mA, 2.86 V)로 각각 660±5 nm와 450±5 nm 파장의 광원을 이용하였다. 광도는 Multi-LED light meter (TM-209M, Tenmars electronics CO., Ltd., Taipei, Taiwan)를 사용하여 측정하였다. 1 shows a schematic diagram of the LED irradiation equipment of the present invention. The device for LED irradiation (ESLEDs co., Ltd., Seoul, Korea) was made with Lab-scale equipment, and the red (60 mA, 1.90 V) and blue (60 mA, 2.86 V) 660±5 nm and A light source with a wavelength of 450±5 nm was used. Luminous intensity was measured using a Multi-LED light meter (TM-209M, Tenmars electronics CO., Ltd., Taipei, Taiwan).
시료 균주의 주입 용기로 petri dish (35 mm 직경)를 사용하였고, 시료로부터 LED 광원의 조사 높이는 10 cm를 유지하였다. 시료 균주는 4배 희석한 MRS broth에 1%로 접종 후, 생육 특성을 확인하였다. 모든 시료는 뚜껑을 덮어 보관하였으며, 랩을 이용하여 옆면을 두른 후 LED를 조사하였다. 4℃ 냉장 조건에서 72시간 동안 조사하면서 배양하였고, 대조군은 암소 조건(dark condition)을 사용하였다.A petri dish (35 mm diameter) was used as an injection container for the sample strain, and the irradiation height of the LED light source from the sample was maintained at 10 cm. After the sample strain was inoculated at 1% in 4-fold diluted MRS broth, growth characteristics were confirmed. All samples were stored with lids covered, and the sides were wrapped using a wrap and then LED was irradiated. It was cultured while irradiating for 72 hours in 4 ° C. refrigerated conditions, and dark conditions were used as a control group.
실험예 2. 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 분리Experimental Example 2. Isolation of extracellular vesicles
세포외 소포체 분리는 도 2의 모식도에 따라 진행하였다. 도 2는 락토바실러스 속에서 세포외 소포체를 분리하는 과정을 나타낸다. 먼저, 실험예 1에서 LED를 조사하여 배양한 락토바실러스 사케이 균주 배양액은 원심분리(3,000g, 15 min, 4℃)하여 그 상등액을 시료로 취하였고, 세포 외로 분비된 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 추출을 위해 총 엑소좀 분리 시약(total exosome isolation reagent)(Invitrogen)를 사용하였다. 즉, 상기 엑소좀 분리 시약과 시료 균주의 상등액을 동량 주입 후, vortex mixer를 이용하여 균질화시켰다. 실온에서 1시간 보관 후, 4℃에서 1시간 동안 원심분리(10,000g)하여 상등액을 버리고 가라앉은 pellet을 회수하였다. 상기 1차 펠렛을 10,000g에서 5분 동안 원심분리하여 잔류 시약이나 상등액을 제거하고 하층에 남아있는 2차 펠렛을 취하였다. 분석 전 1×PBS 용액으로 부유시킨 후 세포외 소포체(extracellular vesicle) 시료로 사용하였다. Separation of extracellular vesicles was performed according to the schematic diagram of FIG. 2 . Figure 2 shows the process of isolating extracellular vesicles in Lactobacillus. first, In Experimental Example 1, the culture medium of Lactobacillus Sakei strain cultured by irradiating LED was centrifuged (3,000g, 15 min, 4℃), and the supernatant was taken as a sample. For extraction, total exosome isolation reagent (Invitrogen) was used. That is, after injecting the same amount of the exosome separation reagent and the supernatant of the sample strain, they were homogenized using a vortex mixer. After storage for 1 hour at room temperature, centrifugation (10,000 g ) for 1 hour at 4 ° C., the supernatant was discarded and the sedimented pellet was recovered. The first pellet was centrifuged at 10,000 g for 5 minutes to remove residual reagents or supernatant, and the second pellet remaining in the lower layer was taken. After being suspended in 1×PBS solution before analysis, it was used as an extracellular vesicle sample.
실험예 3. 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis)를 이용한 세포외 소포체 크기 및 농도 분석 Experimental Example 3. Analysis of Extracellular Vesicle Size and Concentration Using Nanoparticle Tracking Analysis
세포외 소포체의 크기와 수는 Nanosight NS300 system (Nanosight NS300; Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK)을 이용하여 분석하였다. 세포외 소포체는DPBS에 10배 희석하여 적용하였고, flow rate은 50(~13.3 μL/min)으로, 측정시간과 측정횟수는 각각 90 s, 3회로 하였다.The size and number of extracellular vesicles were analyzed using the Nanosight NS300 system (Nanosight NS300; Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK). Extracellular vesicles were applied after being diluted 10-fold in DPBS, the flow rate was 50 (~13.3 μL/min), and the measurement time and number of measurements were 90 s and 3 times, respectively.
도 3은 암소 조건(dark condition), blue LED 조사, Red LED를 조사하여 배양한 락토바실러스 사케이에서 분리된 세포외 소포체의 크기, 농도, 입자 수를 나노입자추적분석기로 분석한 결과이다. 3 is a result of analyzing the size, concentration, and number of particles of extracellular vesicles isolated from Lactobacillus sake cultured under dark conditions, blue LED irradiation, and red LED irradiation with a nanoparticle tracking analyzer.
그 결과, Red LED를 조사한 경우 세포외 소포체(EV)의 크기 분포가 암소 조건과 Blue LED를 조사한 경우에 비해 큰 양상을 나타내었으며, 생성된 농도도 높았다. 또한, 락토바실러스 사케이에서 분리된 세포외 소포체(EV)를 구체적인 수치로 비교 분석하였다. 분석 결과는 표 1에 나타내었다. As a result, when irradiated with Red LED, the size distribution of extracellular vesicles (EV) showed a larger aspect than when irradiated with dark conditions and Blue LED, and the generated concentration was also high. In addition, extracellular vesicles (EVs) isolated from Lactobacillus sake were comparatively analyzed in specific numerical values. The analysis results are shown in Table 1.
표 1에 나타난 바와 같이, 세포외 소포체(EV) 입자 크기 최빈값 (Mode)은 74.1~141.3 nm, 평균값 (Mean)은 108.6~156.6 nm, 크기 분포의 폭(표준편차, SD)은 40.5~44.2 nm 범위에서 관찰되었다. 시료 중 세포외 소포체(EV) 입자의 수 농도 (number concentration)는 1.35 X 109~2.47 X 109 particles/mL 범위에서 측정되었고, 시료들 중 가장 작은 크기 및 가장 낮은 수 및 농도로 관찰된 시료는 대조군인 시료 D(Dark)이며, 가장 큰 크기 및 가장 높은 농도로 관찰된 시료는 시료 R(Red)였다.As shown in Table 1, the extracellular vesicle (EV) particle size mode was 74.1 to 141.3 nm, mean was 108.6 to 156.6 nm, and size distribution width (standard deviation, SD) was 40.5 to 44.2 nm. observed in the range. The number concentration of extracellular vesicles (EV) particles in the sample was measured in the range of 1.35 X 10 9 to 2.47 X 10 9 particles/mL, and the sample observed with the smallest size and lowest number and concentration among the samples is sample D (Dark) as a control, and the sample observed with the largest size and highest concentration was sample R (Red).
구체적으로, 암소 조건(dark condition)에서 배양한 락토바실러스 사케이에서 분리된 세포외 소포체(EV)의 평균 크기는 108.6 nm이었으며, 농도도 1.35x109 particles/mL, 세포외 소포체(EV) 입자 수는 1,510.0로 가장 낮은 값을 나타냈다. Blue LED를 조사한 경우 세포외 소포체(EV)의 평균 크기는 118.3 nm이었으며, 농도도 1.47x109 particles/mL이고, 평균 입자 크기는 1512.3으로 암소 조건(dark condition)과 크게 다르지 않았다. Specifically, the average size of extracellular vesicles (EV) isolated from Lactobacillus sake cultured in dark conditions was 108.6 nm, the concentration was 1.35x10 9 particles/mL, and the number of extracellular vesicles (EV) particles showed the lowest value at 1,510.0. When Blue LED was irradiated, the average size of extracellular vesicles (EV) was 118.3 nm, the concentration was 1.47x10 9 particles/mL, and the average particle size was 1512.3, which was not significantly different from the dark condition.
그러나, Red LED를 조사한 경우, 세포외 소포체(EV)의 평균 크기는 156.6 nm이었으며, 농도도 2.47x109 particles/mL로 대조군 대비 약 83% 증가하였으며, 세포외 소포체(EV) 입자 수는 1,863.3으로 약 24% 증가하였다.However, when the Red LED was irradiated, the average size of extracellular vesicles (EV) was 156.6 nm, the concentration was 2.47x10 9 particles/mL, an increase of about 83% compared to the control group, and the number of extracellular vesicles (EV) particles was 1,863.3 increased by about 24%.
따라서, Red LED를 조사하여 락토바실러스 사케이에서 생성되는 세포외 소포체(EV) 크기, 농도, 입자 수를 증진시킬 수 있음을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the size, concentration, and number of particles of extracellular vesicles (EVs) produced from Lactobacillus sake could be increased by irradiating the Red LED.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.Although the preferred embodiments of the present invention have been described in detail above, the scope of the present invention is not limited thereto, and various modifications and improvements of those skilled in the art using the basic concept of the present invention defined in the following claims are also made according to the present invention. falls within the scope of the rights of
Claims (10)
상기 적색 LED의 파장은 600 내지 700 nm인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The wavelength of the red LED is 600 to 700 nm, a method for increasing the production of extracellular vesicles.
상기 적색 LED의 전류는 40 내지 60 mA, 전압은 1.5 V 내지 2.5 V인 것인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The current of the red LED is 40 to 60 mA, the voltage is 1.5 V to 2.5 V, a method for increasing the production of extracellular vesicles.
상기 적색 LED는 0 내지 10℃에서 2시간 이상 조사하는 것인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The red LED is a method of increasing the production of extracellular vesicles, which is irradiated for 2 hours or more at 0 to 10 ° C.
상기 적색 LED는 4 내지 6℃에서 2.5 내지 3.5 시간 조사하는 것인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The red LED is to irradiate for 2.5 to 3.5 hours at 4 to 6 ℃, a method for increasing the production of extracellular vesicles.
상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus), 락토바실러스 액시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(L. amylovorus), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 델브루에키(L. delbrueckii), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 갈리나룸(L. gallinarum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 알리멘타리우스(L. alimentarius), 락토바실러스 쿠르바투스(L. curvatus), 락토바실러스 사케이(L. sakei), 및 락토바실러스 부크네리(L. buchneri)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The strains of the genus Lactobacillus are Lactobacillus paracasei ( L. paracasei ), Lactobacillus plantarum ( L. plantarum ), Lactobacillus rhamnosus ( L. rhamnosus ), Lactobacillus acidophilus ( L. acidophilus ), lactobacillus Bacillus amylovorus ( L. amylovorus ), Lactobacillus casei ( L. casei ), Lactobacillus brevis ( L. brevis ), Lactobacillus crispatus ( L. crispatus ), Lactobacillus delbruecki ( L. delbrueckii ), Lactobacillus bulgaricus ( L. bulgaricus ), Lactobacillus fermentum ( L. fermentum ), Lactobacillus helveticus ( L. helveticus ), Lactobacillus gallina room ( L. gallinarum ), Lactobacillus gasseri ( L. gasseri ) , Lactobacillus johnsonii ( L. johnsonii ), Lactobacillus reuteri ( L. reuteri ), Lactobacillus salivarius ( L. salivarius ), Lactobacillus alimentarius ( L. alimentarius ), Lactobacillus curvatus ( L. curvatus ), Lactobacillus sakei ( L. sakei ), and Lactobacillus buchneri ( L. buchneri ) A method for increasing the production of extracellular vesicles selected from the group consisting of.
상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 사케이(L. sakei)인 것인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The strain of the genus Lactobacillus is Lactobacillus sakei ( L. sakei ) A method for increasing the production of extracellular vesicles.
상기 적색 LED는 세포외 소포체의 입자 수, 입자 크기 또는 농도를 증가시키는 것인, 세포외 소포체의 생성을 증가시키는 방법.According to claim 1,
The red LED is to increase the number of particles, particle size or concentration of extracellular vesicles, a method for increasing the production of extracellular vesicles.
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