KR20230059643A - 신규 바실러스 서브틸리스 kb-1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

신규 바실러스 서브틸리스 kb-1 균주 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230059643A
KR20230059643A KR1020210144032A KR20210144032A KR20230059643A KR 20230059643 A KR20230059643 A KR 20230059643A KR 1020210144032 A KR1020210144032 A KR 1020210144032A KR 20210144032 A KR20210144032 A KR 20210144032A KR 20230059643 A KR20230059643 A KR 20230059643A
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이승웅
노문철
박찬선
이소영
이승재
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주에 관한 것이다. 본 발명의 균주를 이용하면 선충의 난낭을 분해하여 선충 방제에 탁월한 효과를 나타낼 수 있으므로, 상기 균주를 미생물제제로 이용하여 선충을 방제할 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 프로테아제 활성이 우수하므로, 토양부숙능을 증대시킬 수 있다.

Description

신규 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주 및 이의 용도{Novel Bacillus subtilis KB-1 Strain and Use Thereof}
본 발명은 신규 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 기생 선충은 흙속에 존재하는 선충강에 속하는 작은 생물체로서, 일반적으로 실 모양의 가느다란 형태 또는 방추형의 형태를 띠며, 매우 작고 몸에 마디가 없으며 체표에 주름을 가지고 있는 특징이 있다. 식물 기생 선충은 자웅이체이나 동정생식을 통해 번식하기도 하며, 암컷은 생존 기간 동안 대략 50개 내지 600개의 알을 낳는 것으로 알려져 있다.
이러한 식물 기생 선충은 두부 입주위에 구침을 가지고 있어, 이를 이용하여 식물의 뿌리 조직에 구침을 꽂아 구멍을 내고 식물 조직의 영양분을 흡수하거나 뿌리 조직 내로 침입하게 된다. 식물 기생 선충은 식물의 종자, 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부분에서 기생하며, 종에 따라 식물체의 외부에서 식물체를 가해하는 외부 기생성, 식물 조직 내부로 침입하여 가해하는 내부 기생성 및 머리 부분만 식물체 내에 삽입하여 영양분을 섭취하는 반 내부 기생성 등 다양한 생활양식을 갖는다. 또한 내부 기생성 선충은 이동하며 가해하는 이동성인 것과 한번 가해하기 시작하면 이동하지 않는 정착성인 것이 있다.
대표적인 식물 기생 선충인 뿌리혹선충은 전국의 시설 재배지에서 작물의 생장저해와 발병에 직간접적인 피해를 일으키며 특히 박과 작물 (참외, 오이, 수박, 멜론), 가지과 작물 (토마토, 가지), 엽채류 (상추, 잎들깨), 화훼 (국화, 금어초), 딸기 등 다양한 작물의 생산에 피해를 주는 방제가 가장 어려운 해충의 하나로 알려져 있다. 국내에는 고구마뿌리혹선충 (Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충 (M. arenaria), 당근뿌리혹선충 (M. hapla), 자바니카뿌리혹선충 (M. javanica) 등이 분포하고 있으며, 감염 시 조기고사 및 수확량 감소의 피해를 입히는 것으로 알려져 있다.
현재 뿌리혹선충에 대한 방제 방법으로는 재배적 방제, 물리적 방제 및 화학적 방제가 이용되고 있는데, 재배적 방제에는 담수, 휴경, 건토, 깊이갈이, 객토, 벼 윤작 재배, 저항성 품종 이용 등이 있으며, 물리적 방제에는 열처리 방법(스팀, 건열, 온탕침법), 태양열 소독 방법 등이 있고, 화학적 방제에는 카보입제, 포스치아제이트(선충탄) 등의 화학 약제를 살포하여 선충을 방제하는 방법 등이 이용되고 있다. 이 중 재배적 방제와 물리적 방제의 경우, 지역 조건 및 재배 작물에 따라 적용이 어렵거나 고비용이 소요되는 단점이 있으며, 저항성 품종은 특이 작물에 제한되어 실용성이 낮은 문제가 있다. 또한 화학적 방제의 경우에는 화학 약제를 사용하여 방제 효과는 높으나 대부분 유기인제 및 카바메이트계로 토양 잔류 시 독성이 높고 환경오염뿐만 아니라 작물의 성장에 유익한 토양 내 유용 미생물에 대한 무분별한 살균작용에 의해 피해가 가중되고 토양을 점차 척박하게 하는 원인이 된다.
이러한 종래 방제 방법에 대한 대안으로 선충의 천적 미생물, 생화학제 그리고 식물 추출물을 이용한 생물학적 방제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 현재까지 보고된 선충 천적 미생물은 대부분이 선충 포식성 곰팡이로 실제 시설 재배지에서 사용 효과가 극히 미흡하며 농가에 보급할 수 있도록 실용화하기에는 매우 어려운 형편이다. 또한, 천적 세균의 경우 최근까지 뿌리혹선충에 대한 생물학적 방제 효과가 입증된 미생물로서는 국내 토착 토양 세균인 파스테리아 페네트랜스(Pasteuria penetrans), 바실러스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 및 바실러스 페네트랜스(Bacillus penetrans) 등이 알려져 있으나(KR10-0379019, KR10-0668280), 배양상의 어려움과 시설 재배지 실용화를 위한 토양 정착성 문제 등 해결해야 할 문제점이 많아 실용성에 대한 의문이 제기되고 있다.
아울러 점차적으로 국내 유기농 및 친환경 농산물의 수요가 증대됨에 따라 많은 농업인들이 화학 합성 농약을 대신할 수 있는 미생물 농약에 관심을 모으고 있으나, 비교적 적은 비용으로 우수한 효과를 발휘하는 미생물 제제가 미흡하여 이의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
대한민국 공개공보 제10-2021-0124737호(2021.10.15)
일 양상은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주, 이의 포자, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 선충 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주, 이의 포자, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 선충 방제용 미생물 제제를 식물, 이의 종자 또는 이의 생육 환경에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원성 선충의 방제 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주를 제공하는 것이다.
상기 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속 KB-1 균주는 한국생명공학연구원 전북분원 생물자원센터(Korea Collection for Type Culture; KCTC)에 기탁을 완료하였다.
상기 바실러스 속 균주는 간균이라고 불리기도 하며, 간균속에 속하는 막대 모양의 그람 양성균 세균을 총칭한다. 또한, 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성혐기성 간균으로서 탈질, 철환원, 망간산화 등에 관여하며, 환경조건에 따라 균체 내에 구조적 변화가 생겨 포자를 형성할 수 있다. 상기 바실러스 속 균주는 예를 들어, 탄저균(B. anthracis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 세레우스 (B. cereus) 또는 바실러스 투링기엔시스 (B. thuringiensis)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 균주는 젤라틴 분해 효소 활성 및 프로테아제(protease) 활성을 갖는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 균주를 고체화된 젤라틴 배지에 처리할 경우 젤라틴 배지가 액체화되는 것을 확인하였다.
일 구체예에 따르면, 상기 균주는 뿌리혹선충 (Meloidogyne spp.), 시스트선충 (Heterodera spp.), 뿌리썩이선충 (Pratylenchus), 감귤선충 (Tylenchulus semipenetrans), 감귤뿌리선충 (Radopholus), 줄기구근선충 (Ditylenchus), 밀알선충 (Anguina) 및 잎선충 (Aphelenchoides)으로 이루어진 군에서 선택되는 선충에 대하여 항선충 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충 (Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충 (Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충 (Meloidogyne hapla), 자바니카뿌리혹선충 (Meloidogyne javanica) 및 토마토뿌리혹선충 (Meloidogyne incognita)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 뿌리혹선충은 참외, 오이, 멜론, 수박, 고추 등의 과채류와 인삼 등에 생육지연, 미량요소 결핍증상, 수확량 감소, 시들음 증상 등을 일으키는 식물 병원성 선충일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항선충 활성은 선충의 난낭을 분해하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 균주의 균체 및 상등액을 뿌리혹선충 난낭에 처리하였을 때, 난낭의 원형 형태가 깨지면서 내부의 알이 밖으로 쏟아져 나오는 것을 확인하였다.
다른 양상은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속 (Bacillus sp.) KB-1 균주, 이의 포자, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 선충 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
상기 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속 (Bacillus sp.) KB-1 균주에 관한 것은 상기한 내용과 동일하므로, 명세서의 내용의 중복성을 배제하기 위해 설명을 생략한다.
상기 포자는 세균, 방선균 등의 번식 세포를 의미하며, 상기 배양액은 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함한 것, 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양액일 수 있다. 본 발명에서 배양액은 배양액 자체, 배양액을 농축한 농축액 또는 배양액을 건조시킨 건조물 형태일 수 있다.
상기 식물은 예를 들어, 참외, 오이, 멜론, 수박, 고추, 인삼 등이 포함될 수 있다. 또한, 곡물(밀, 보리, 호밀, 귀리, 쌀, 사탕수수 및 관련 작물 등), 사탕무(사탕무 및 사료 사탕무 등), 오이 식물(오이, 서양호박, 멜론 등), 채소(시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추, 브라시카, 당근, 양파, 토마토, 감자 등), 감귤류 과일(오렌지, 레몬, 자몽, 중국종 귤 등), 과일(사과, 배, 자두, 복숭아, 아몬드, 체리, 딸기, 라즈베리, 블랙베리 등), 콩과 식물(알팔파, 강낭콩, 렌즈콩, 완두콩, 대두 등), 유성식물(평지씨, 겨자씨, 양귀비, 올리브, 해바라기씨, 코코넛, 카스터 오일식물, 코코아씨, 땅콩 등), 섬유 식물(면화, 아마, 대마, 황마 등), 라우라세(아보카도, 계피, 캄퍼 등), 낙엽성 나무와 침엽수(주목나무, 밤나무, 오리나무, 포플라, 자작나무, 전나무, 낙엽송, 소나무 등), 기타 작물이나 식물(옥수수, 잔디식물, 담배, 견과, 커피, 사탕수수, 차나무, 포도나무, 홉, 바나나, 천연 고무나무 등) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 병원성 선충은 뿌리혹선충 (Meloidogyne spp.), 시스트선충 (Heterodera spp.), 뿌리썩이선충 (Pratylenchus), 감귤선충 (Tylenchulus semipenetrans), 감귤뿌리선충(Radopholus), 줄기구근선충 (Ditylenchus), 밀알선충 (Anguina) 및 잎선충 (Aphelenchoides)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 방제는 농작물을 병충해로부터 예방하는 것을 의미하는 것으로, 선충의 생장을 억제하거나 죽이는 행위를 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 미생물 제제는 토양 부숙 증대 효능을 갖는 것일 수 있다.
상기 미생물 제제는 식물 병원성 선충 방제용으로 사용되는 것 이외에, 토양의 부숙능을 증대시키는 등 토질을 개선시키기 위한 토양 개량제로도 사용될 수 있다.
본 발명의 미생물 제제로 사용되는 상기 균주는 생균제 형태로 사용될 수 있으며, 액상 생균제 또는 생균 분말의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 이외에 부형제, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테비아 추출물, 광물유, 기타 천연소재 추출물 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주, 이의 포자, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 선충 방제용 미생물 제제를 식물, 이의 종자 또는 이의 생육 환경에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원성 선충의 방제 방법을 제공하는 것이다.
상기 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주, 포자, 배양액, 식물, 병원성 선충, 방제 및 미생물제제에 관한 내용은 상기 기재되어 있는 내용과 동일하므로, 설명을 생략한다.
본 발명의 미생물 제제는 물에 희석하여 사용할 수 있으며, 예를 들면 약 500배 내지 1,000배로 희석하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 미생물 제제를 처리하는 식물의 부위, 처리 시기, 처리 방식 등 처리 방법은 특별히 제한되지 않으며 통상적으로 식물 병원성 선충의 감염을 예방, 개선 또는 치료하기 위해 미생물 제제를 포함한 기타 약제가 처리될 수 있는 여러 공지된 방법들에 의해 처리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물 제제는 대상 식물의 각 부위, 이의 종자, 이의 생육환경(토양, 공기 등) 등 대상 식물에 미생물 제제가 직접 또는 간접적으로 접촉될 수 있는 부분에 처리될 수 있으며, 식물의 선충 감염에 대한 예방, 개선 또는 치료가 필요한 경우, 또는 선충 제거를 통한 토양의 정화가 필요한 경우에 처리할 수 있고, 식물의 옆면 살포 또는 뿌리에 관주하는 방식으로 처리할 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 보다 우수한 효과를 발휘하기 위하여 식물을 정식하기 전 토양을 개간할 때 처리하거나, 정식한 후 약 5일 후부터 또는 장마철이나 선충 발병 직전 시기에 처리할 수 있으며, 식물체의 지상부에 경엽처리하거나 뿌리 부분에 관주하는 방식으로 살포할 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 단독으로 사용될 수 있으며, 다른 미생물 제제나 화학 합성 제제 등과 혼합사용 또는 병용될 수 있다.
본 발명의 균주는 선충의 난낭을 분해하여 선충 방제에 탁월한 효과를 나타낼 수 있으므로, 상기 균주를 이용하면 선충을 방제할 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 프로테아제 활성이 우수하므로 이를 처리할 경우, 토양 부숙능을 증대시킬 수 있다.
도 1은 바실러스 속 KB-1 균주 및 다른 바실러스 속 균주의 젤라틴 분해능을 확인한 데이터이다.
도 2는 바실러스 속 KB-1 균주 및 다른 바실러스 속 균주의 균체(cell)와 상등액(sup.)을 통하여 뿌리혹선충 난낭 분해활성을 확인한 데이터이다.
도 3은 뿌리혹선충을 접종한 고추 모종에 바실러스 속 KB-1 균주 및 다른 바실러스 속 균주를 처리한 후, 지상부와 뿌리의 생육을 본 데이터이다.
도 4는 바실러스 속 KB-1 균주의 프로테아제(protease) 활성을 확인한 데이터이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 젤라틴 분해능이 우수한 세균의 분리
항선충능, 특히, 선충의 난낭 분해 활성의 지표가 되는 젤라틴 분해능이 우수한 세균을 분리하기 위하여, 강원도 평창군 가리왕산에서 토양 시료를 수거하여 분석하였다. 시료 채취는 표토층의 15cm 전후의 깊이를 선정해 채취하고 잡초, 낙엽 등의 이물질을 제거한 다음, 지퍼백에 담아 밀봉한 후, 0℃내지 4℃의 상태로 실험실까지 운반하였다.
실시예 1-1. 세균의 분리
상기 채취한 시료로부터 세균을 분리하기 위하여, 상기 채취한 시료 1 g을 토양 희석 한천평판법으로 105 배까지 희석한 다음, 상기 희석액 0.1 ㎖를 LB 배지에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 후, 37℃ 배양기에서 2일간 배양하였다. 그 다음, 생성된 콜로니를 순수 분리하고 하기 표 1의 성분으로 구성된 LB 고체 배지에 옮겨 -80℃에서 보관하면서 사용하였다.
LB　배지 성분 농도(g/L)
효모 추출물 5.0
트립톤 10.0
NaCl 10.0
한천 15.0
실시예 1-2. 젤라틴 분해능 평가
상기에서 분리한 세균들을 LB 배지를 사용해 2일간 배양한 후, 배양액과 균체를 분리하기 위하여 10,000 rpm에서 15 분간 원심 분리하고, 상등액을 0.25 μm 필터로 여과하여 젤라틴 분해능을 평가하였다.
젤라틴 분해능은 하기 표 2의 성분으로 구성된 젤라틴 배지를 사용하여 굳어 있는 젤라틴이 분해되는 정도로 확인하였으며, 실험결과 젤라틴 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하였다.
젤라틴 배지 성분 농도(g/L)
쇠고기 추출물 3.0
젤라틴 120.0
펩톤 5.0
실시예 2: 분리한 균주의 동정
상기 실시예 1에서 선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 16S rRNA의 염기서열을 분석하였다. 상기 선별한 균주를 변형된 콜로니 PCR법을 사용하여 PCR 증폭하였다. 16S rRNA 증폭에는 하기 표 3에 개시된 프라이머를 사용하여 증폭하였으며, PCR product purification kit(Qiagen)를 사용하여 증폭산물을 정제하고, DNA sequencer 3730xl(Applied biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 16S rDNA 염기서열은 서열번호 3과 같았다.
서열번호 서열명칭 염기서열 (5' > 3') 크기
(bp)
서열번호 1 27F primer AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 20
서열번호 2 1492R primer GGTTACCTTGTTACGACTT 19
서열번호 3 16S rDNA ggcctgggggctatctgcagtcgagcggacgatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGaggtaaccTTTtaggagccagccgcCGAAGgtgGgacagatgATtGgGgtgaatcgtacaaagggatacccgtaa 1481
최종 선별한 균주의 16S rDNA를 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal database project Ⅱ의 데이터베이스에서 상동성을 분석한 결과, 상기 선별된 세균은 바실러스 속(Bacillus sp.)과 높은 상동성을 나타내었다. 이에, 각각 바실러스 속 KB-1으로 명명하였다.
실시예 3: 젤라틴 분해능 및 뿌리혹선충의 난낭 분해능 측정
상기 실시예 2에서 동정한 바실러스 속 균주 및 기존 바실러스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주의 젤라틴 분해능 및 뿌리혹선충의 난낭 분해능을 측정하기 위하여, 상기 균주들을 각각 LB 배지를 사용해 2일간 배양한 후, 배양액과 균체를 분리하기 위하여 10,000rpm에서 15분간 원심 분리하고, 상등액을 0.25μm 필터로 여과하여 젤라틴 분해능 및 뿌리혹선충의 난낭 분해활성을 측정하였다.
젤라틴 분해능은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 뿌리혹선충 난낭 분해활성은 고추뿌리에서 3개월 생육시킨 뿌리혹선충의 난낭을 분리해 배양액과 균체를 각각 넣어 분해능을 확인하고, 뿌리혹선충 난낭의 원형 형태가 깨져서 난낭 속에 들어있는 알이 밖으로 쏟아지는지를 활성의 유무로 판단하였다. 이때 실험에 사용된 바실러스의 배양액 및 균체 실험은 모두 3회 반복으로 진행하였다.
그 결과, 도 1에서 보이는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 KB-1 및 바실러스 서린지네시스 KCTC1108 중 바실러스 서브틸리스 KB-1의 젤라틴 분해능이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 도 2에서 보이는 바와 같이, 뿌리혹선충 난낭 분해활성을 측정한 결과, 난낭의 원형 형태가 깨어져 난낭 속의 상당수의 알이 밖으로 쏟아져 나온 정도가 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주의 균체 및 상등액 모두에서 가장 우수하여, 뿌리혹선충의 난낭의 분해 활성이 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주에서 가장 우수한 것으로 확인되었다.
이에, 상기 바실러스 서브틸리스 KB-1를 전라북도 정읍시 입신길 181 (신정동)에 위치한 한국생명공학연구원 전북분원 생물자원센터(Korea Collection for Type Culture; KCTC)에 2020년 12월 08일자로 기탁 완료하여, 수탁번호 KCTC14399BP를 부여받았다.
실시예 4: 포트 실험을 통한 바실러스 서브틸리스 KB-1의 항선충 효능 측정
뿌리혹선충의 난낭 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주의 뿌리혹선충에 대한 항선충 활성을 측정하기 위하여 고추 모종을 이용한 포트 실험을 실시하였다.
구체적으로, 1개월 단위로 포트에서 고추 모종을 꺼내 뿌리에 붙은 선충의 난낭 개수를 측정하여 부화 및 재침투와 선충의 활성을 측정하였다. 포트 실험에 사용된 뿌리혹선충은 상기 실시예 3에서 준비한 고추 뿌리에 기생하는 뿌리혹선충의 난낭을 증류수를 이용해 부화시킨 후 사용하였고, 시료는 LB 배지에서 배양한 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주를 5%로 희석 및 혼합하여 최종 미생물농도 10%를 투여하여 사용하였다.
포트에는 멸균된 상토 60 g을 넣고, 미리 2개월간 키운 고추(부강)를 정식한 후, 뿌리 활착을 위해 2주간 생육시켰다. 그 다음, 포트 묘의 뿌리 부분에 부화시킨 뿌리혹선충(약 100마리)을 접종한 후, 각각 5%로 희석혼합하여 최종 미생물농도 10%를 맞춘 배양액을 초기 1개월 동안 1주일에 한 번씩 80 ㎖씩 분주하고, 그 후 3개월 동안 2주에 한 번씩 분주하였다. 3~4일 마다 배양액 없이 물만 분주하였으며, 대조군은 배양액을 넣지 않고 물만 공급하였다. 그 후, 고추 포트의 뿌리혹선충의 난낭 개수를 조사하여 상기 균주들의 항선충능을 측정하였다.
그 결과, 도 3 및 하기 표 4에서 보이는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주 배양액을 처리한 실험군의 경우, 균주 무처리군 및 다른 바실러스 처리군과 비교하여 난낭 개수 감소 및 고추 모종의 지상부와 뿌리의 생육이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
균주 토양내 선충 수 뿌리 난낭 개수
30일 60일 30일 60일
H2O _ _
LB 배지 1306±82.95 1830±69.28 78.8±6.53 140.8±10.06
KB-1 582±107.33 1108±98.59 53.2±7.85 73.8±6.98
실시예 5: 효소 활성 측정
바실러스 서브틸리스 KB-1 균주의 효소활성을 측정하였다.
구체적으로, 각 균주의 프로테아제 활성은 LB 배지에 1% 탈지유를 첨가하고 투명환의 크기를 측정하는 방식으로 수행하였으며, 셀룰라아제 활성은 LB 배지에 CMC를 0.5%를 첨가하여 24시간 배양 후, 0.2% 콩고-레드(Congo-red)로 15분간 염색하고 1M NaCl로 탈색(destaining)하는 과정을 거쳐 노란 환의 크기를 측정하는 방식으로 수행하였다. α-아밀라아제 활성은 1% 가용성 녹말을 넣은 배지에 24시간 배양 후 루골 용액(Lugol's solution)을 떨어뜨려 주위에 생성되는 노란 환의 크기를 측정하는 방식으로 수행하였다.
그 결과, 하기 표 5 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주는 프로테아제 활성이 우수한 것으로 확인되었다.
상기 결과를 통하여, 바실러스 서브틸리스 KB-1 균주를 토양에 처리하여, 선충 방제뿐만 아니라 토양 부숙능을 증대시킬 수 있음을 확인하였다.
균주 효소활성(환의 크기) (mm)
프로테아제 셀룰라아제 α-아밀라아제
바실러스 서브틸리스 KB-1 18 - -
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Novel Bacillus subtilis KB-1 strain and use thereof <130> BPN211038 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1481 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus sp. KB-1 16S rDNA <400> 3 ggcctggggg ctatctgcag tcgagcggac gatgggagct tgctccctga tgttagcggc 60 ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120 gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa cataaaaggt ggcttcggct 180 accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240 caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300 gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360 acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 420 taccgttcga atagggcggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480 tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540 ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 600 ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 660 atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg 720 ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780 acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 840 cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900 acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960 catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020 atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080 ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140 aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200 acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt 1260 ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320 gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380 agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg 1440 gacagatgat tggggtgaat cgtacaaagg gatacccgta a 1481

Claims (8)

  1. 수탁번호 KCTC14399BP의 바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 젤라틴 분해 효소 활성 및 프로테아제(protease) 활성을 갖는 것인,
    바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 뿌리혹선충 (Meloidogyne spp.), 시스트선충 (Heterodera spp.), 뿌리썩이선충 (Pratylenchus), 감귤선충 (Tylenchulus semipenetrans), 감귤뿌리선충 (Radopholus), 줄기구근선충 (Ditylenchus), 밀알선충 (Anguina) 및 잎선충 (Aphelenchoides)으로 이루어진 군에서 선택되는 선 충에 대하여 항선충 활성을 갖는 것인,
    바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주.

  4. 제3항에 있어서,
    상기 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충 (Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충 (Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충 (Meloidogyne hapla), 자바니카뿌리혹선충 (Meloidogyne javanica) 및 토마토뿌리혹선충 (Meloidogyne incognita)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 항선충 활성은 선충의 난낭을 분해하는 활성인 것인,
    바실러스 속(Bacillus sp.) KB-1 균주.
  6. 제1항의 균주, 이의 포자, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 선충 방제용 미생물 제제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 미생물 제제는 토양 부숙 증대 효능을 갖는 것인,
    미생물 제제.
  8. 제6항의 미생물 제제를 식물, 이의 종자 또는 이의 생육 환경에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원성 선충의 방제 방법.
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