KR20230059115A - An antibodies specifically binding to NT-proBNP and uses thereof - Google Patents
An antibodies specifically binding to NT-proBNP and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230059115A KR20230059115A KR1020220031497A KR20220031497A KR20230059115A KR 20230059115 A KR20230059115 A KR 20230059115A KR 1020220031497 A KR1020220031497 A KR 1020220031497A KR 20220031497 A KR20220031497 A KR 20220031497A KR 20230059115 A KR20230059115 A KR 20230059115A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antibody
- probnp
- amino acid
- seq
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 102400001263 NT-proBNP Human genes 0.000 title claims abstract description 166
- 108010008064 pro-brain natriuretic peptide (1-76) Proteins 0.000 title 1
- 101800001904 NT-proBNP Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 88
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 64
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 16
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 2
- 101100272807 Rattus norvegicus Btg2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 abstract description 54
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 69
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 14
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 7
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 7
- 101000685663 Homo sapiens Sodium/nucleoside cotransporter 1 Proteins 0.000 description 7
- 102100023116 Sodium/nucleoside cotransporter 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 7
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102100036836 Natriuretic peptides B Human genes 0.000 description 6
- 101710187802 Natriuretic peptides B Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010067171 Regurgitation Diseases 0.000 description 4
- 210000004763 bicuspid Anatomy 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 2
- 239000002232 CNT15 Substances 0.000 description 2
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VCBWXASUBZIFLQ-IHRRRGAJSA-N His-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VCBWXASUBZIFLQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 208000035478 Interatrial communication Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 2
- SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 208000001910 Ventricular Heart Septal Defects Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 208000013914 atrial heart septal defect Diseases 0.000 description 2
- 206010003664 atrial septal defect Diseases 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 208000003278 patent ductus arteriosus Diseases 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 208000009138 pulmonary valve stenosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 2
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 201000003130 ventricular septal defect Diseases 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical class O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BFMIRJBURUXDRG-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 BFMIRJBURUXDRG-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- ZCUFMRIQCPNOHZ-NRPADANISA-N Ala-Val-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N ZCUFMRIQCPNOHZ-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N Arg-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NKNILFJYKKHBKE-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 description 1
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 description 1
- 239000002011 CNT10 Substances 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- RZSLYUUFFVHFRQ-FXQIFTODSA-N Gln-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RZSLYUUFFVHFRQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HYPVLWGNBIYTNA-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HYPVLWGNBIYTNA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LPIKVBWNNVFHCQ-GUBZILKMSA-N Gln-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LPIKVBWNNVFHCQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MXOODARRORARSU-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N MXOODARRORARSU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- JPAACTMBBBGAAR-HOTGVXAUSA-N Gly-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 JPAACTMBBBGAAR-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- ZPVJJPAIUZLSNE-DCAQKATOSA-N His-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZPVJJPAIUZLSNE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZZLWLWSUIBSMNP-CIUDSAMLSA-N His-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZZLWLWSUIBSMNP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GIRSNERMXCMDBO-GARJFASQSA-N His-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O GIRSNERMXCMDBO-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000821827 Homo sapiens Sodium/nucleoside cotransporter 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000822028 Homo sapiens Solute carrier family 28 member 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- WSGXUIQTEZDVHJ-GARJFASQSA-N Leu-Ala-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O WSGXUIQTEZDVHJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OGUUKPXUTHOIAV-SDDRHHMPSA-N Leu-Glu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OGUUKPXUTHOIAV-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- TUSOIZOVPJCMFC-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TUSOIZOVPJCMFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 1
- LHALYDBUDCWMDY-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O LHALYDBUDCWMDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N Pro-Leu-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100328521 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cnt6 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021541 Sodium/nucleoside cotransporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100021470 Solute carrier family 28 member 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- UDNVOQMPQBEITB-MEYUZBJRSA-N Thr-His-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O UDNVOQMPQBEITB-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- JAWUQFCGNVEDRN-MEYUZBJRSA-N Thr-Tyr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N)O JAWUQFCGNVEDRN-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- COLXBVRHSKPKIE-NYVOZVTQSA-N Trp-Trp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O COLXBVRHSKPKIE-NYVOZVTQSA-N 0.000 description 1
- NSTPFWRAIDTNGH-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O NSTPFWRAIDTNGH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- XEYUMGGWQCIWAR-XVKPBYJWSA-N Val-Gln-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N XEYUMGGWQCIWAR-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical class [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008828 contractile function Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 1
- 210000004115 mitral valve Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N nesiritide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 210000003540 papillary muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 206010042772 syncope Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000006499 vasodilator function Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an antibody that specifically binds to NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) and uses thereof.
개의 심장질환은 그 원인에 따라 치료방법과 예후가 다르며, 심장기능이 현저히 감소한 심부전의 경우 완치할 수 없는 진행성 질환으로 분류된다. 심장질환에 이환된 개의 경우 기침, 운동불내성, 기절 등의 임상 증상이 나타나며, 만성질환으로 진행될 경우 심장 리모델링 및 심장기능 저하가 초래된다.Heart disease in dogs has different treatment methods and prognoses depending on the cause, and heart failure, in which cardiac function is significantly reduced, is classified as a progressive disease that cannot be cured. In the case of dogs suffering from heart disease, clinical symptoms such as coughing, exercise intolerance, and fainting appear.
여러가지 종류의 바이오마커 중에서 NT pro-BNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide)는 심장질환에서 가장 기본이 되는 바이오마커다 (WO 2014/072500). 심근이 늘어나려는 장력(tension)을 받는 경우, 혈관 이완기능이 있는 BNP라는 호르몬이 방출된다. 즉, 심장병에 의해 심근에 미치는 압력이 증가할 때 심근세포에서 분비되며, 전구체인 NT pro-BNP를 측정하여 심장질환을 간접적으로 확인할 수 있다.Among various types of biomarkers, NT pro-BNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) is the most basic biomarker for heart disease (WO 2014/072500). When the myocardium receives tension to stretch, a hormone called BNP, which has a vasodilator function, is released. That is, it is secreted from cardiomyocytes when the pressure on the myocardium increases due to heart disease, and heart disease can be indirectly confirmed by measuring NT pro-BNP, a precursor.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 NT pro-BNP에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 완성하였으며, 상기 항체를 포함하는 키트 검사를 통하여 바이오마커를 간편하게 검사한다면 이를 토대로 얻은 결과를 임상적으로 유용하게 활용할 수 있을것으로 기대한다.Under this background, the present inventors have completed an antibody and an antigen-binding fragment thereof capable of specifically binding to NT pro-BNP, and if a biomarker is conveniently tested through a kit test containing the antibody, the results obtained based on this It is hoped that it will be useful clinically.
일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.One aspect provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, NT-proBNP 검출용 조성물을 제공한다.Another aspect is NT-proBNP detection, including an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A composition for
또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, NT-proBNP 검출용 키트를 제공한다.Another aspect is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, NT-proBNP A detection kit is provided.
또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 심장 질환 진단용 조성물을 제공한다.Another aspect is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for diagnosing heart disease. composition is provided.
또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, NT-proBNP를 검출하는 방법을 제공한다.In another aspect, an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is isolated from a biological sample contacting with; and detecting a complex formed by binding of the sample and the antibody or antigen-binding fragment thereof to a method for detecting NT-proBNP.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 심장 질환 진단을 위한 정보제공 방법으로서, 상기 NT-proBNP의 발현 수준을 측정하는 단계는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 것인, 방법을 제공한다.Another aspect is an information providing method for diagnosing heart disease, comprising measuring the expression level of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) in a biological sample isolated from a subject, wherein the NT -The step of measuring the expression level of proBNP is an antibody that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an antigen-binding fragment thereof It provides a method, which is to use.
또 다른 양상은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Another aspect is a heavy chain complementarity determining region 1 (HCDR1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and amino acids of SEQ ID NO: 6 a heavy chain variable region comprising a heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) consisting of the sequence; and light chain complementarity determining region 1 (LCDR1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, light chain complementarity determining region 2 (LCDR2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and light chain complementarity determining region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. Provided is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to NT-proBNP, comprising a light chain variable region comprising 3 (LCDR3).
일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.One aspect is to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 명세서에서의 용어 "NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)"는 proBNP에서 유래되는 단백질이다. 상기 proBNP는 BNP와 NT-proBNP의 전구단백질로서 심장 근육세포에서 생성되며 활성호르몬인 BNP와 비활성조각인 NT-proBNP로 쪼개져서 혈액으로 방출된다. BNP (뇌나트륨이뇨펩티드, B-type natriuretic peptide)는 혈액량을 조절하고 심장이 몸 전체에 혈액을 내보내는 작업을 돕는 것으로 알려져 있으며, 근육세포의 과도한 스트레칭(stretching)이 있을 시, 혈액 내 BNP나 NT-proBNP의 농도가 크게 증가한다. 혈중 BNP 또는 NT-proBNP 농도를 측정하여 심장근의 스트레칭 정도를 평가할 수 있으며, 이는 심장질환의 심각도에 비례한다. 또한, NT-proBNP는 BNP에 비해, 혈중에서 안정하며 반감기가 길어, 심장 바이오마커로서의 장점을 가지고 있다. 따라서, NT-proBNP는 심장 질환 진단을 위한 바이오마커로서 활용할 수 있다.The term "NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide)" in the present specification is a protein derived from proBNP. The proBNP is a precursor protein of BNP and NT-proBNP, which is produced in cardiac muscle cells and is cleaved into BNP, an active hormone, and NT-proBNP, an inactive fragment, and released into the blood. BNP (Brain Natriuretic Peptide, B-type natriuretic peptide) is known to regulate blood volume and help the heart pump blood throughout the body. When there is excessive stretching of muscle cells, BNP or NT in the blood -The concentration of proBNP is greatly increased. The degree of stretching of the myocardium can be evaluated by measuring the concentration of BNP or NT-proBNP in the blood, which is proportional to the severity of the heart disease. In addition, compared to BNP, NT-proBNP is stable in blood and has a long half-life, and thus has advantages as a cardiac biomarker. Therefore, NT-proBNP can be used as a biomarker for diagnosing heart disease.
상기 NT-proBNP는 개과 동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로 개 (canine) 유래 NT-proBNP일 수 있다.The NT-proBNP may be derived from canine animals, and may specifically be canine-derived NT-proBNP.
본 명세서에서의 용어 "에피토프 (epitope)"는 항원 특이성을 결정하는 특정한 입체분자구조 부위를 의미한다. 본 명세서에서 상기 '에피토프'는 '항원결정기(antigenic determinant)'와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 에피토프는 하기의 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.As used herein, the term "epitope" refers to a specific three-dimensional molecular structure region that determines antigen specificity. In the present specification, the 'epitope' may be used interchangeably with 'antigenic determinant'. The epitope may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 below, and may specifically consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
서열번호 2: H-X1-L-G-X2-X3-X4 SEQ ID NO: 2: HX 1 -LGX 2 -X 3 -X 4
상기 서열번호 2의 X1 내지 X4는 각각 임의의 아미노산으로서, 20종의 아미노산 중 선택된 하나일 수 있다. Each of X 1 to X 4 of SEQ ID NO: 2 is an arbitrary amino acid, and may be one selected from 20 amino acids.
구체적으로, X1은 P(프롤린)일 수 있고, X2는 G(글라이신)일 수 있고, X3은 R(아르기닌)일 수 있고, 또는 X4는 S(세린)일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 서열번호 2의 X1=P, X2=G X3=R 및 X4=S일 수 있으며 서열번호 3의 아미노산 서열로 표현될 수 있다.Specifically, X 1 may be P (proline), X 2 may be G (glycine), X 3 may be R (arginine), or X 4 may be S (serine), more specifically As X 1 =P, X 2 =GX 3 =R and X 4 =S of SEQ ID NO: 2, it may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
상기 에피토프는 서열번호 3의 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 에피토프는 서열번호 3의 서열에서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 갖는 에피토프일 수 있다. The epitope comprises an amino acid sequence having at least 60%, for example, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 99%, or at least 100% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 3 it could be In addition, the epitope is a sequence in which at least 1 amino acid, at least 2 amino acids, at least 3 amino acids, at least 4 amino acids, at least 5 amino acids, at least 6 amino acids, or at least 7 amino acid residues differ from the sequence of SEQ ID NO: 3 It may be an epitope with
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof may specifically bind to an epitope of NT-proBNP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, specifically binding to an epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 it could be
본 명세서에서의 용어 "항체 (antibody)"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합을 의미한다. 상기 항체의 형태는 다중클론성 항체, 단일클론성 항체, 또는 재조합 항체, 예를 들어, ScFv 단편, 디아바디, 단쇄 항체 등을 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위 즉 결합 도메인을 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함할 수 있다. As used herein, the term "antibody" refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site. The antibody refers to a polypeptide or a combination of polypeptides specifically binding to an epitope comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The form of the antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, or recombinant antibodies, such as ScFv fragments, diabodies, single-chain antibodies, and the like, and all immunoglobulin antibodies are included. The antibody is a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as a full form having two light chains and two heavy chains. It does not have the structure of an intact antibody, but is directed against an antigenic site. It may also include a functional fragment of an antibody molecule having a specific antigen-binding site, that is, a binding domain, and having an antigen-binding function.
상기 중쇄(heavay chain)는 γ, δ, α, μ, ε 5가지 종류가 있으며 중쇄가 항체의 종류를 결정지을 수 있다. α와 γ는 450개, μ 와 ε는 550개의 아미노산으로 구성되어 있다. 중쇄는 두 영역 즉 가변 영역과 불변 영역이 있다.There are five types of the heavy chain (γ, δ, α, μ, ε), and the heavy chain can determine the type of antibody. α and γ consist of 450 amino acids, and μ and ε consist of 550 amino acids. A heavy chain has two regions, a variable region and a constant region.
상기 경쇄(light chain)는 λ, κ 2가지 종류가 있으며 대략 211 내지 217개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 사람의 항체 각각에는 모두 동일하게 1가지의 쇄만이 존재한다. 경쇄는 불변 영역과 가변 영역이 연속적으로 이루어져 있다.The light chain has two types, λ and κ, and may consist of approximately 211 to 217 amino acids. All human antibodies have only one chain. The light chain consists of a constant region and a variable region consecutively.
본 명세서에서의 용어 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 말한다. 상기 단편은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv (single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있다 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다). 또한 상기 항원 결합 단편은 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a fragment of the entire immunoglobulin structure, and refers to a portion of a polypeptide including a portion capable of binding to an antigen. Such fragments include functional fragments of antibody molecules that are not complete antibodies having two light chains and two heavy chains. For example, an antigen-binding fragment can be a scFv, (scFv) 2 , Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 , or a combination thereof. For example, it may be F(ab')2, Fab', Fab, Fv or scFv. Among the antigen-binding fragments, Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (C H1 ) of heavy chains, and has one antigen-binding site. Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain. An F(ab') 2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'. Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombination technique for generating an Fv fragment is widely known in the art. In two-chain Fv, the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond, and in single-chain Fv, the heavy chain variable region and the short chain variable region are generally shared through a peptide linker. They are linked by bonds or directly linked at the C-terminus, so that they can form a dimer-like structure like double-chain Fv. The antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (eg, Fab can be obtained by restriction digestion of whole antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin). In addition, the antigen-binding fragment can be produced through genetic recombination technology.
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.본 명세서에서의 용어 "상보성 결정부위" (Complementarity determining region, CDR)는 가변 영역의 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 부위이며 가변 영역 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분으로 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다. 중쇄의 상보성 결정부위 3개를 아미노 말단부터 카르복실 말단방향으로 차례로 HCDR1, HCDR2, HCDR3라 하며, 경쇄의 상보성 결정부위 3개를 아미노 말단부터 카르복실 말단방향으로 차례로 LCDR1, LCDR2, LCDR3이라 한다. 하나의 항체에서 상기 여섯 개의 상보성 결정부위가 모여 항원 결합부위를 형성한다. The antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain complementarity determining region 1 (HCDR1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a heavy chain variable region comprising a heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; and light chain complementarity determining region 1 (LCDR1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, light chain complementarity determining region 2 (LCDR2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and light chain complementarity determining region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. It may include a light chain variable region including 3 (LCDR3). As used herein, the term "complementarity determining region" (Complementarity determining region, CDR) is a region present in each of the light chain and the heavy chain of the variable region, and is a variable region. Among the regions, amino acid sequence variability is particularly high, and specific antibodies to various antigens can be found by such high variability. The three complementarity-determining regions of the heavy chain are called HCDR1, HCDR2, and HCDR3 in order from the amino-terminus to the carboxyl-terminus, and the three complementarity-determining regions of the light chain are called LCDR1, LCDR2, and LCDR3 in order from the amino-terminus to the carboxyl-terminus. In one antibody, the six complementarity-determining regions gather to form an antigen-binding region.
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 서열번호 3 내지 9의 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인될 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof has at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% sequence homology with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 9, respectively. The branch may include an amino acid sequence. The "percentage of sequence homology" for the amino acid sequence can be determined by comparing the two optimally aligned sequences with the regions of comparison.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP 의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 단일 클론 항체일 수 있으며, 본 명세서에서는 제 1항체로 명명된다.An antibody that specifically binds to the epitope of NT-proBNP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be a monoclonal antibody, and is referred to herein as the first antibody.
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 scFv 절편, scFv-Fc 절편, Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라항체, 마우스 항체, 염소 항체, 양 항체, 모르모트 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다.The antibodies or antigen-binding fragments thereof include scFv fragments, scFv-Fc fragments, Fab fragments, Fv fragments, diabodies, chimeric antibodies, mouse antibodies, goat antibodies, sheep antibodies, guinea pig antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, or a humanized antibody.
상기 항체는 실시예에서 기술하고 있는 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다. The antibody may be produced in hybridoma cells described in Examples.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 NT-proBNP 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 유전자 재조합 NT-proBNP 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.The hybridoma cells can be prepared using methods known in the art. Specifically, the hybridoma cells are prepared by immunizing an animal with NT-proBNP protein, fusing antibody-producing B cells derived from the immunized animal with myeloma cells, and then genetically recombination among them. It can be prepared by selecting a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to the NT-proBNP protein. As the animal to be immunized, animals such as goats, sheep, guinea pigs, rats, or rabbits may be used in addition to the mice used in the examples.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트 (Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다. 한편, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있다.As a method of immunizing the immunized animal, a method already known in the art may be used. For example, in the case of immunizing a mouse, 1 to 100 μg of immunogen is emulsified with the same amount of physiological saline and/or an antigen adjuvant such as Freund's adjuvant, subcutaneously in the abdomen of the animal to be immunized. Alternatively, it may be performed by inoculating 2-6 times every 2-5 weeks into the peritoneal cavity. After immunizing the immunized animals, the spleen or lymph nodes are extracted 3-5 days after the final immunization, and B cells contained in their tissues in the presence of a fusion promoter are myeloma according to a cell fusion method already known in the art. to fuse with the cell. As the fusion promoter, materials such as polyethylene glycol (PEG) may be used. The myeloma cells, for example, P3U1, NS-1, P3x63. Mouse-derived cells such as Ag 8.653 and Sp2/0-Ag14, and rat-derived cells such as AG1 and AG2 can be used. In addition, in the cell fusion method known in the art, for example, B cells and myeloma cells are mixed at a ratio of 1: 1-10: 1, and PEG having a molecular weight of 1,000-6,000 is added at a concentration of 10-80% So, it can be performed by a method of incubating at 30-37 ° C. for 1-10 minutes. In addition, hybridomas producing a monoclonal antibody that specifically binds to the porcine epidemic diarrhea virus are cultured in a selective medium such as HAT medium in which only hybridomas can survive, and the hybridoma culture supernatant The antibody activity in the antibody can be measured and selected using a method such as ELISA. Finally, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to NT-proBNP is, for example, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to NT-proBNP, limiting dilution, etc. It can be selected by repeating cloning by the method of. Meanwhile, the monoclonal antibody may be of IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, or IgD type.
다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, NT-proBNP 검출용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.Another aspect is NT-proBNP detection, including an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It is to provide a composition for The same parts as described above also apply to the composition.
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NT-proBNP에 특이적으로 결합함으로서 시료 내 NT-proBNP를 검출하거나 발현 수준을 측정할 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to NT-proBNP, thereby detecting NT-proBNP in a sample or measuring its expression level.
본 명세서에서의 용어 "발현 수준의 측정"은 특정 단백질(펩타이드)의 존재 여부, 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 것으로서, 구체적으로 상기 조성물은 NT-proBNP 단백질의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.The term "measurement of expression level" in the present specification refers to measuring the presence, expression, or expression level of a specific protein (peptide), and specifically, the composition may measure the expression level of the NT-proBNP protein.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 효소면역흡착법 (ELISA), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 방법 (protein chip technology) 또는 바이오센서 (biosensor)일 수 있으며, 구체적으로 상기 NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.Methods for measuring the expression level of the protein include Western blotting, enzyme immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay (radical immunodiffusion), Ouchteroney immunodiffusion method (Ouchterlony immunodiffusion), rocket immunoeletrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography ), FACS analysis (fluorescence activated cell sorter analysis), protein chip method (protein chip technology) or biosensor (biosensor), specifically using an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the NT-proBNP Anything can be used without limitation.
상기 NT-proBNP 검출용 조성물은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 NT-proBNP에 특이적으로 결합하여 형성된 항원(NT-proBNP)-항체 복합체를 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography) 또는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 확인하는 것일 수 있으며, 구체적으로 면역크로마토그래피법을 이용하여 확인하는 것일 수 있다.The composition for detecting NT-proBNP is an antigen (NT-proBNP)-antibody complex formed by specifically binding the antibody or an antigen-binding fragment thereof to NT-proBNP by immunofluorescence or immunochromatography Alternatively, it may be confirmed using an enzyme immunosorbent assay (ELISA), and specifically, it may be confirmed using an immunochromatography method.
본 명세서에서의 용어 "면역크로마토그래피법 (immunochromatography)"은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 분석물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서, 래피드 테스트(rapid test)법으로도 알려져있다. 이러한 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 분석물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석스트립(assay strip) 또는 상기 분석스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다. 통상적인 분석스트립은 액상 검체를 수용하는 검체(샘플) 패드, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드, 검체 중의 분석물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제(항체 또는 항원)를 고정시킨 다공성 멤브레인 패드 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다. 이와 같이, 분석스트립을 이용한 면역 크로마토그래피 분석법에 있어서, 검체 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 다공성 멤브레인 패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 이때, 상기 접합체 패드에 함유되어 있던 접합체도 액상 검체와 함께 이동하여, 검체 중에 분석하고자 하는 물질이 존재하면, 접합체가 분석물질을 매개하여 다공성 멤브레인 패드에 고정된 결합제와 결합하거나(통상, "샌드위치(sandwich) 반응"이라 한다.), 접합체와 분석물질이 경쟁적으로 결합제와 결합함으로서(통상, "경쟁(competition) 반응"이라 한다.), 검체 중 분석물질의 존재 여부를 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역크로마토그래피(immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 수행하여 감지하는 것을 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라 당업계에 알려진 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다. As used herein, the term "immunochromatography" refers to a method for qualitatively and quantitatively analyzing a small amount of an analyte in a short time using an antigen-antibody reaction, and is a rapid test. Also known as law. In such an immunochromatographic analysis, an assay strip containing a reactant capable of reacting with the analyte to be detected and exhibiting a change or an assay device in the form of a device equipped with the assay strip in a plastic case is generally used. . A typical assay strip includes a sample (sample) pad accommodating a liquid specimen, and a conjugate pad containing a conjugate in which a label generating a signal detectable by the naked eye or a sensor is conjugated to a ligand such as an antigen or an antibody. , a porous membrane pad immobilized with a binding agent (antibody or antigen) that specifically binds to the analyte and/or the conjugate in the sample, and a moisture absorption pad that finally accommodates the liquid sample, and these functional pads are in the order listed above. They are connected in some overlapping form and attached to a solid support to be arranged continuously. As described above, in the immunochromatographic analysis method using the assay strip, when a liquid sample is dropped onto the sample pad, the liquid sample moves through the conjugate pad and the porous membrane pad by capillary action, and is finally accommodated in the moisture absorption pad. At this time, the conjugate contained in the conjugate pad also moves along with the liquid sample, and if a substance to be analyzed is present in the sample, the conjugate binds to the binder fixed to the porous membrane pad through the medium of the analyte (usually, a "sandwich"). As the conjugate and analyte competitively bind to the binding agent (usually referred to as "competition reaction"), the presence or absence of the analyte in the sample is determined by enzyme immunoassay (ELISA) , Western blotting, immunofluorescence, immunochromatography, immunohistochemistry staining, flow cytometry, immunocytochemistry, radioimmunoassay (RIA), It may include detecting by performing any one selected from the group consisting of an immunoprecipitation assay, an immunodiffusion assay, a complement fixation assay, and a protein chip, In addition, known techniques known in the art may be applied without limitation.
상기 항체(제 1항체)는 검출 표지와 결합 또는 접합되어 있을 수 있으며, 만일 상기 항체가 검출 표지와 결합되어 있지 않은 경우, 상기 항원 또는 항원-항체 복합체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리함으로써, 형성된 항원-항체 복합체를 확인할 수 있다.The antibody (first antibody) may be bound or conjugated to a detection label, and if the antibody is not bound to a detection label, another antibody capable of capturing the antigen or antigen-antibody complex and having a detection label By treating the antibody, the formed antigen-antibody complex can be identified.
또한, 상기 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method)으로 검출할 수 있다.In addition, the formation of the antigen-antibody complex is performed by a colormetric method, an electrochemical method, a fluorescence method, a luminometry, a particle counting method, and a visual assessment Alternatively, it can be detected by a scintillation counting method.
상기 NT-proBNP 검출용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 제 2항체 또는 이의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 제 2항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NT-proBNP에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 제외한 영역을 에피토프로 하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 제 2항체는 제 1항체와는 겹치지 않은 상이한 에피토프 영역에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.The composition for detecting NT-proBNP may further include a second antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to NT-proBNP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and specifically, the second antibody The antibody or antigen-binding fragment thereof may have as an epitope a region excluding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in NT-proBNP. Preferably, the second antibody may specifically bind to a different epitope region that does not overlap with the first antibody.
상기 제 1항체는 포획 항체 또는 검출 항체일 수 있으며, 상기 제 1항체가 포획 항체일 경우 제 2항체는 검출 항체일 수 있고, 상기 제 1항체가 검출 항체일 경우 제 2항체는 포획 항체일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 NT-proBNP 검출용 조성물에서 상기 제 1항체는 포획 항체이고, 제 2항체는 검출 항체일 수 있다.The first antibody may be a capture antibody or a detection antibody, and when the first antibody is a capture antibody, the second antibody may be a detection antibody, and when the first antibody is a detection antibody, the second antibody may be a capture antibody. there is. According to one embodiment, in the composition for detecting NT-proBNP, the first antibody may be a capture antibody, and the second antibody may be a detection antibody.
상기 검출 표지는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 효소 표지(enzymatic label), 자성 물질 또는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 검출 표지로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트, 크립테이트, FITC, RITC 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 및 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다. 상기 검출 표지는 발색되는 정도를 육안 또는 센서를 이용하여 정량 또는 정성적으로 분석물질의 존재 여부를 확인할 수 있다. 실시예를 따르면, 검출 표지 중 형광물을 항원, 항체 등의 리간드에 접합시켜 접합체를 만들어 접합체가 다공성 멤브레인 패드에 고정된 결합제와 분석물질을 매개로 결합하거나 경쟁적으로 결합한 복합체에 빛을 조사하면 발색되는 정도에 따라 센서를 이용하여 분석물질의 존재 여부를 확인할 수 있다.The detection label may include an enzyme, a fluorescent substance, a ligand, a luminescent substance, a microparticle, an enzymatic label, a magnetic material, or a radioactive isotope. Enzymes used as detection labels include acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, horseradish peroxidase and β-latamase, etc. Fluorescein , Eu 3+ , Eu 3+ chelate, cryptate, FITC, RITC, and the like, including biotin derivatives as ligands, acridinium esters and isoluminol derivatives as light-emitting substances, and microparticles Examples include colloidal gold and colored latex, and radioactive isotopes include 57 Co, 3 H, 125 I and 125 I-Bolton Hunter reagent and the like. The presence or absence of the analyte can be determined quantitatively or qualitatively using the naked eye or a sensor for the degree of color development of the detection label. According to the embodiment, a conjugate is formed by conjugating a fluorescent substance among detection labels to a ligand such as an antigen or an antibody, and the conjugate binds to a binding agent immobilized on a porous membrane pad through the medium of an analyte, or when the competitively bound complex is irradiated with light, color develops. Depending on the degree of detection, the presence or absence of the analyte can be confirmed using a sensor.
또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, NT-proBNP 검출용 키트를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다.Another aspect is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, NT-proBNP It is to provide a kit for detection. The same parts as described above also apply to the kit.
상기 NT-proBNP 검출용 키트는 상기 NT-proBNP 검출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.The kit for detecting NT-proBNP may include the composition for detecting NT-proBNP.
상기 NT-proBNP 검출용 키트는 면역크로마토그래피 키트일 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 포획 항체는 다공성 멤브레인 패드에 고정되고, 검출 항체는 접합체 패드에 고정된 분석스트립을 포함하는 것일 수 있다.The kit for detecting NT-proBNP may be an immunochromatography kit. For example, the kit may include an assay strip in which the capture antibody is immobilized on a porous membrane pad and the detection antibody is immobilized on a conjugate pad.
상기 키트는 NT-proBNP의 면역학적 검출을 위하여, 상기한 기질, 및 검출 표지와 결합된 항체뿐만 아니라, 적당량의 완충용액, 발색 기질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라, 당업계 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다. For immunological detection of NT-proBNP, the kit may further include an appropriate amount of a buffer solution, a chromogenic substrate, and the like, as well as the above-described substrate and an antibody bound to the detection label, as well as those known in the art. The technology of can be applied without limitation.
일 실시예에 따르면, 상기 NT-proBNP 검출용 조성물 또는 이를 포함하는 키트는 생물학적 시료 내 포함된 NT-proBNP와 반응/결합하여 검출 표지가 발광 또는 발색될 수 있으며, 상기 검출 표지의 발광 또는 발색 정도는 추가적인 판독 기기에 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어 상기 판독 기기는 상기 검출 표지의 발광 또는 발색 정도를 통해서 생물학적 시료 내 NT-proBNP를 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.According to one embodiment, the composition for detecting NT-proBNP or a kit including the same may react/bind with NT-proBNP included in a biological sample to emit light or color, and the degree of light emission or color development of the detection label. can be verified by applying an additional reading device. For example, the reading device can qualitatively or quantitatively analyze NT-proBNP in a biological sample through the degree of luminescence or color development of the detection label.
또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 심장 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.Another aspect is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for diagnosing heart disease. to provide a composition. The same parts as described above also apply to the composition.
상기 진단용 조성물은 NT-proBNP 단백질을 검출하거나 발현 수준을 측정함으로서 특정 개체, 구체적으로 개과 동물(Canidae)의 심장 질환을 진단하거나 및/또는 예후를 예측할 수 있다.The diagnostic composition can diagnose and/or predict the prognosis of heart disease in a specific individual, specifically canine ( Canidae ), by detecting the NT-proBNP protein or measuring its expression level.
본 명세서에서의 용어 "심장 질환 (prostate cancer, PCa)" 심장에 발생하는 질환을 의미한다. 구체적으로, 반려견(개과 동물)의 심장질환은 선천적인 심장질환과 나이가 들면서 발생하는 후천적인 심장질환으로 나눌 수 있다. 선천적 심장질환은 동맥관개존증 및 폐동맥판협착증이 가장 많이 발생하며, 이밖에 대동맥하협착증, 심실중격결손증, 심방중격결손증 등이 있다. 또한, 후천적 심장질환은 노화로 인해 판막이 제 기능을 하지 못하게 되는 것이 원인이 될 수 있으며, 가장 많이 발생하는 질병으로는 이첨판폐쇄부전증이 있다.The term "heart disease (prostate cancer, PCa)" in this specification means a disease that occurs in the heart. Specifically, heart disease in companion dogs (canines) can be divided into congenital heart disease and acquired heart disease that occurs with age. The most common congenital heart disease is patent ductus arteriosus and pulmonary valve stenosis, and other congenital heart diseases include subaortic stenosis, ventricular septal defect, and atrial septal defect. In addition, acquired heart disease may be caused by valves not functioning properly due to aging, and bicuspid regurgitation is the most common disease.
상기 심장질환은 선천적 심장질환 또는 후천적 심장질환일 수 있으며, 구체적으로 동맥관개존증, 폐동맥판협착증, 대동맥하협착증, 심실중격결손증, 심방중격결손증 및 이첨판폐쇄부전증로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.The heart disease may be a congenital heart disease or an acquired heart disease, and specifically, may be at least one selected from the group consisting of patent ductus arteriosus, pulmonary valve stenosis, subaortic stenosis, ventricular septal defect, atrial septal defect, and bicuspid valve insufficiency.
본 명세서에서의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단이란 심장 질환의 발병 여부를 판별하는 것을 의미하는 것일 수 있다.As used herein, the term “diagnosis” means confirming the presence or character of a pathological condition. For the purposes of the present invention, diagnosis may mean determining whether or not a heart disease has occurred.
본 명세서에서의 용어 "예후"는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명의 목적상, 예후란 심장 질환의 치료 후 해당 개체에서 치료 성공 여부, 생존, 재발, 전이, 약물반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 즉, 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.As used herein, the term "prognosis" refers to a prediction of disease progression and recovery, and refers to a prospective or preliminary evaluation. For the purpose of the present invention, prognosis means determining whether or not treatment success, survival, recurrence, metastasis, drug response, tolerance, etc. in a subject after treatment of heart disease. That is, it means prediction of medical outcome (eg, long-term viability, disease-free survival rate, etc.), and includes positive prognosis (positive prognosis) or negative prognosis (negative prognosis), wherein the negative prognosis is recurrence, tumor growth, metastasis A positive prognosis includes remission of the disease, such as no disease, and improvement or stabilization of the disease, such as tumor regression.
본 명세서에서의 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적 상 심장 질환으로 진단받은 개체의 병의 경과(병의 진행, 개선, 재발, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미하는 것일 수 있다.The term "prediction" in the present specification means to guess in advance about medical abduction, and for the purpose of the present invention, the course of the disease (progression, improvement, recurrence, drug resistance) of a subject diagnosed with a heart disease in advance It could mean guessing.
상기 진단용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 제 2항체 또는 이의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는, 상기 제 2항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NT-proBNP에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 제외한 영역을 에피토프로 하는 것일 수 있다.The diagnostic composition may further include a second antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to NT-proBNP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and preferably, the second antibody or its antigen-binding fragment. The antigen-binding fragment may have as an epitope a region excluding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in NT-proBNP.
상기 진단용 조성물은 상기 NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하여 개과 동물의 심장질환 바이오마커인 NT-proBNP을 검출함으로서 해당 개체의 심장 질환 발병 여부 등을 진단할 수 있다.The diagnostic composition detects NT-proBNP, which is a heart disease biomarker in canine animals, using an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the NT-proBNP, thereby diagnosing whether or not the individual has a heart disease. there is.
또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체(제 1항체) 또는 이의 항원-결합 단편을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, NT-proBNP를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.Another aspect is an antibody that specifically binds to an epitope of N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (first antibody) or an antigen-binding fragment thereof to an individual contacting with the biological sample separated from; and detecting a complex formed by binding the sample and the antibody or antigen-binding fragment thereof to provide a method for detecting NT-proBNP. The same parts as described above are also applied to the method.
본 명세서에서의 용어 "개체"는 심장 질환이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적으로, 심장 질환 발병에 의해 proBNP, NT-proBNP 및/또는 BNP의 발현 수준이 변화하는 생물체를 의미한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스, 래트, 원숭이, 소, 돼지, 미니돼지, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 포함할 수 있으며, 구체적으로 개과 동물일 수 있다.As used herein, the term "subject" refers to all organisms that have or are likely to develop heart disease, and specifically, organisms whose expression levels of proBNP, NT-proBNP, and/or BNP change due to heart disease. it means. For example, it may include mammals including dogs, cats, mice, rats, monkeys, cows, pigs, mini pigs, livestock, humans, farmed fish, and the like, and may specifically be canines.
상기 개과 동물은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다. 본 발명에서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.The canines can be largely divided into the canine family (Tribe Canini) and the fox family (Tribe Vulpini), and may include dogs, wolves, jackals, foxes, jackals, raccoons, coyotes, and the like. Preferably dogs or wolves are included. It is known that the dog is domesticated from a wild wolf, and accordingly, the wolf and the dog have the same number of chromosomes and show similar patterns in gestation period and sex hormone changes. In the present invention, the term 'canine' is sometimes simply shortened to 'dog' and used interchangeably.
본 명세서에서의 용어 "생물학적 시료"는 상기 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 세포, 기관, 세포 용해물, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 세포 외액, 체액, 소변, 분변, 조직, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 시료로부터 유전자 및/또는 단백질 시료를 얻을 수 있으며, 유전자 시료는 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA 등을 포함할 수 있으며, 이로부터 특정 유전자/단백질의 발현 수준을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.The term "biological sample" as used herein refers to a material derived from the subject, specifically cells, organs, cell lysates, whole blood, blood, serum, plasma, lymph, extracellular fluid, body fluid, urine, feces, tissue , bone marrow, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or a combination thereof, It may preferably be blood, but is not limited thereto. In addition, gene and/or protein samples may be obtained from these samples, and the genetic samples may include nucleic acids, for example, DNA, mRNA, or cDNA synthesized from mRNA, from which expression of specific genes/proteins may be obtained. As long as the level can be confirmed, the type is not limited thereto.
상기 접촉시키는 단계는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 제 2항체 또는 이의 항원-결합 단편을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 제 2항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NT-proBNP에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 제외한 영역을 에피토프로 하는 것일 수 있다.The contacting may further include contacting a second antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to NT-proBNP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a biological sample isolated from the subject. And, specifically, the second antibody or antigen-binding fragment thereof may have as an epitope a region excluding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in NT-proBNP.
상기 제 1항체 및 제 2항체는 분리된 생물학적 시료와 개별적, 순차적 또는 동시적으로 접촉시킬 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The first antibody and the second antibody may be individually, sequentially or simultaneously contacted with the separated biological sample, but is not limited thereto.
상기 접촉시키는 단계는 상기 NT-proBNP 검출용 조성물을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.The contacting may include contacting the composition for detecting NT-proBNP with a biological sample isolated from the subject.
상기 방법에 있어서, 상기 검출하는 단계는 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 효소면역흡착법 (ELISA), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 방법 (protein chip technology) 및 바이오센서 (biosensor)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 선택하여 수행하는 것일 수 있으며, 구체적으로 면역크로마토그래피법을 이용하여 수행하는 것일 수 있다.In the above method, the detecting step is Western blotting, enzyme immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay (radical immunodiffusion), Ouchteroni immunodiffusion method (Ouchterlony immunodiffusion), rocket immunoeletrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography ), FACS analysis (fluorescenceactivated cell sorter analysis), protein chip technology, and biosensor. may be performing
상기 NT-proBNP를 검출하는 방법은 생물학적 시료 내 NT-proBNP를 정량적 또는 정성적으로 분석할 수 있다.The method for detecting NT-proBNP may quantitatively or qualitatively analyze NT-proBNP in a biological sample.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 심장 질환 진단을 위한 정보제공 방법으로서, 상기 NT-proBNP의 발현 수준을 측정하는 단계는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP (N-terminal pro-B- type natriuretic peptide)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 것인, 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.Another aspect is an information providing method for diagnosing heart disease, comprising measuring the expression level of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) in a biological sample isolated from a subject, wherein the NT -The step of measuring the expression level of proBNP is an antibody that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an antigen-binding fragment thereof To use, to provide a method. The same parts as described above are also applied to the method.
상기 방법은 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료로부터, NT-proBNP의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 개체 및 상기 대조군의 발현 수준을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.The method comprises the steps of measuring the expression level of NT-proBNP in a biological sample isolated from a control group; And it may be to further include the step of comparing the expression level of the individual and the control group.
본 명세서에서의 용어 "대조군"은 심장 질환이 발병되지 않은 일반 개체, 비-심장질환 환자군, 비환자군 등을 의미하는 것일 수 있다.As used herein, the term "control group" may mean a general subject without heart disease, a non-cardiac disease patient group, a non-patient group, and the like.
상기 방법은 상기 개체의 발현 수준이 상기 대조군보다 높은 경우, 상기 개체를 심장 질환이 발병한 것으로 판별하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.The method may further include determining that the subject has a heart disease or predicting a high risk of developing the subject when the expression level of the subject is higher than that of the control group.
상기 방법은 개체로부터 수득한 생물학적 시료 내 포함된 NT-proBNP를 정량적 또는 정성적으로 분석할 수 있다.The method can quantitatively or qualitatively analyze NT-proBNP contained in a biological sample obtained from an individual.
일 실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료 내 NT-proBNP의 농도가 900 pmol/L 미만일 경우에는 상기 개체를 정상으로 판정하는 것일 수 있고, 농도가 900 pmol/L 이상 1,800 pmol/L이하인 경우에는 상기 개체를 심장 질환의 발병이 의심되는 것으로 판정하는 것일 수 있으며, 농도가 1,800 pmol/L 초과인 경우에는 상기 개체를 심장 질환이 발병한 것으로 판정하는 것을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment, when the concentration of NT-proBNP in the biological sample is less than 900 pmol/L, the subject may be determined to be normal, and when the concentration is greater than or equal to 900 pmol/L and less than or equal to 1,800 pmol/L, the subject may be determined to be normal. It may be to determine that the onset of heart disease is suspected, and if the concentration exceeds 1,800 pmol / L, it may include determining that the subject has a heart disease.
또 다른 양상은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역1(Heavy chain complementarity determining region1: HCDR1), 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역2(HCDR2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1(Light chain complementarity determining region1: LCDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역2(LCDR2), 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성 결정 영역3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에도 공히 적용된다.Another aspect is a heavy chain complementarity determining region 1 (HCDR1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a heavy chain complementarity determining region 2 (HCDR2) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and amino acids of SEQ ID NO: 6 a heavy chain variable region comprising a heavy chain complementarity determining region 3 (HCDR3) consisting of the sequence; and light chain complementarity determining region 1 (LCDR1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, light chain complementarity determining region 2 (LCDR2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and light chain complementarity determining region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. 3 (LCDR3) to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to NT-proBNP, including a light chain variable region. The same parts as described above also apply to the antibody or antigen-binding fragment thereof.
일 양상에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 NT-proBNP의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 심장질환 바이오마커인 NT-proBNP을 검출할 수 있으며, 이를 이용하여 심장 질환 또한 효과적으로 진단할 수 있다.An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to one aspect can detect the heart disease biomarker NT-proBNP, and by using the antibody Diseases can also be effectively diagnosed.
도 1은 NT-proBNP 포획 항체 및 검출 항체의 제작방법 및 이를 이용한 NT-proBNP 검출 방법을 대략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 NT-proBNP 포획 항체의 1차 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 NT-proBNP 포획 항체의 2차 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 NT-proBNP 포획 항체의 4차 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 도면이다.1 is a diagram schematically showing a method for preparing an NT-proBNP capture antibody and a detection antibody and a method for detecting NT-proBNP using the same.
2 is a diagram showing the results of primary epitope mapping of the NT-proBNP capture antibody.
3 is a diagram showing the results of secondary epitope mapping of the NT-proBNP capture antibody.
4 is a diagram showing the results of the 4th epitope mapping of the NT-proBNP capture antibody.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.It will be described in more detail through the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: NT-proBNP 항체 제작 - 포획 항체 (Capture antibody) 및 검출항체 (Detector antibody) 제작Example 1: Production of NT-proBNP Antibody - Production of Capture Antibody and Detector Antibody
개로부터 유래된 NT-proBNP를 검출하기 위한 포획 항체 (Capture antibody) 및 검출 항체 (Detector antibody)를 제작하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.To prepare a capture antibody and a detector antibody for detecting NT-proBNP derived from dogs, the following experiment was performed.
구체적으로, 면역원인 NT-proBNP와 항원 보강제를 혼합하여 자성의 6주령 마우스에 면역하였으며 상기 동물의 비장을 적출하여 세포를 분리하고 항체 생산세포인 비장세포를 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음 그 중에서 NT-proBNP에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있으며 단일클론항체 또는 다클론항체를 사용할 수 있다.Specifically, a 6-week-old mouse was immunized with a mixture of immunogen NT-proBNP and an adjuvant, and the spleen was removed from the animal, cells were separated, and antibody-producing cells, spleen cells, were fused with myeloma cells to prepare a hybridoma. Then, hybridomas producing monoclonal antibodies specifically binding to NT-proBNP can be selected from among them. The immunized animals may be animals such as goats, sheep, guinea pigs, rats or rabbits in addition to the mice used in the examples, and monoclonal antibodies or polyclonal antibodies may be used.
실시예 2: NT-proBNP 포획 항체의 에피토프 맵핑(epitope mapping)Example 2: Epitope mapping of NT-proBNP capture antibody
상기 실시예 1에서 제작한 NT-proBNP 포획 항체의 NT-proBNP 에피토프 영역을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to confirm the NT-proBNP epitope region of the NT-proBNP capture antibody prepared in Example 1, the following experiment was performed.
2.1: 1차 에피토프 맵핑2.1: Primary Epitope Mapping
상기 포획 항체의 1차 에피토프 맵핑을 위해, NT-proBNP의 전체 서열을 총 15 개의 영역으로 분할하여 1차 재조합 항원을 제작하였으며(CNT1 내지 CNT15로 명명), 상기 포획 항체와 상기 재조합 항원의 결합 여부를 확인하기 위해 스트립 스팟 테스트(Strip spot test)를 수행하였다 (표 1). For the primary epitope mapping of the capture antibody, the entire sequence of NT-proBNP was divided into a total of 15 regions to prepare primary recombinant antigens (named CNT1 to CNT15), and whether the capture antibody binds to the recombinant antigen A strip spot test was performed to confirm (Table 1).
상기 스트립 스팟 테스트는 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane)에 상기 재조합 항원을 부착(spotting)한 뒤, 이를 금 나노입자(Gold nanoparticle)가 접합된 포획 항체를 버퍼와 혼합하여 반응시키고, 발생으로 결합여부를 확인할 수 있다.The strip spot test is performed by spotting the recombinant antigen on a nitrocellulose membrane, reacting it by mixing the gold nanoparticle-conjugated capture antibody with a buffer, and determining whether the antigen is bound by generation. You can check.
분석 결과, CNT1 재조합 항원에 대해서만 약한 반응성을 보이는 것을 확인하였는 바, CNT1에 에피토프 영역이 존재하는 것을 알 수 있다 (도 2).As a result of the analysis, it was confirmed that only the CNT1 recombinant antigen showed weak reactivity, indicating that the epitope region exists in CNT1 (FIG. 2).
2.2: 2차 에피토프 맵핑2.2: Secondary Epitope Mapping
상기 포획 항체의 2차 에피토프 맵핑을 위해, 상기 실시예 2.1에서 반응성을 확인한 CNT1 재조합 항원의 C-말단의 아미노산을 절단하여 2차 재조합 항원을 제작하였으며(CNT1-1 내지 CNT1-5로 명명), 상기 포획 항체와 상기 재조합 항원의 결합 여부를 확인하기 위해 스트립 스팟 테스트(Strip spot test)를 수행하였다 (표 2). For secondary epitope mapping of the capture antibody, secondary recombinant antigens were prepared by cleaving the C-terminal amino acid of the CNT1 recombinant antigen whose reactivity was confirmed in Example 2.1 (named CNT1-1 to CNT1-5), A strip spot test was performed to confirm the binding between the capture antibody and the recombinant antigen (Table 2).
분석 결과, CNT1-1 내지 CNT1-4 재조합 항원에 대해서는 반응성을 보이나, CNT1-5 재조합 항원에 대해서는 반응성을 보이지 않는 것을 확인하였다. 이를 토대로, CNT1-4의 아미노산 서열이 NT-proBNP 포획 항체의 에피토프 영역인 것을 알 수 있다 (도 3).As a result of the analysis, it was confirmed that the cells showed reactivity to CNT1-1 to CNT1-4 recombinant antigens, but no reactivity to CNT1-5 recombinant antigens. Based on this, it can be seen that the amino acid sequence of CNT1-4 is an epitope region of the NT-proBNP capture antibody (FIG. 3).
2.3: 3차 에피토프 맵핑2.3: Tertiary Epitope Mapping
상기 2차 에피토프 맵핑에서 확인한 CNT1-4의 아미노산 서열이 NT-proBNP 포획 항체 에피토프의 최소 단위인지 확인하기 위해, CNT1-4 재조합 항원의 C-말단의 아미노산이 추가적으로 절단된 재조합 항원을 추가로 제작하였으며(CNT1-6 및 CNT1-7로 명명), 상기 포획 항체와 상기 재조합 항원의 결합 여부를 확인하기 위해 스트립 스팟 테스트(Strip spot test)를 수행하였다 (표 3).In order to confirm that the amino acid sequence of CNT1-4 identified in the secondary epitope mapping is the minimum unit of the epitope of the NT-proBNP capture antibody, the C-terminal amino acid of the CNT1-4 recombinant antigen was additionally truncated. A recombinant antigen was additionally prepared. (named CNT1-6 and CNT1-7), a strip spot test was performed to confirm the binding of the capture antibody and the recombinant antigen (Table 3).
분석 결과, CNT1-4 재조합 항원에 대해서는 반응성을 보이나, C-말단의 아미노산이 추가적으로 절단된 재조합 항원에 대해서는 반응성을 보이지 않는 것을 확인하였다. 이를 토대로, CNT1-4의 아미노산 서열이 NT-proBNP 포획 항체의 최소 반응 에피토프 영역인 것을 알 수 있다.As a result of the analysis, it was confirmed that the CNT1-4 showed reactivity against the recombinant antigen, but showed no reactivity against the recombinant antigen in which the C-terminal amino acid was additionally truncated. Based on this, it can be seen that the amino acid sequence of CNT1-4 is the least reactive epitope region of the NT-proBNP capture antibody.
2.4: 4차 에피토프 맵핑2.4: 4th Epitope Mapping
상기 3차 에피토프 맵핑에서 확인한 NT-proBNP 포획 항체의 최소 단위 에피토프 영역에서, 핵심적인 역할을 하는 중요 아미노산 부분을 확인하기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발(Alanine Scanning Mutagenesis) 테스트를 통해 추가적인 에피토피 맵핑을 수행하였다.In the minimum unit epitope region of the NT-proBNP capture antibody identified in the tertiary epitope mapping, additional epitope mapping was performed through an alanine scanning mutagenesis test to identify an important amino acid portion that plays a key role. .
먼저, Canine NT-proBNP 전장 단백질을 E. coli 발현 시스템으로 발현하되, 1 내지 8번째 아미노산을 각각 알라닌 발현 코돈(GCT) 으로 치환하고 클로닝하여 NT-proBNP 재조합 항원을 제작하였다 (표 4).First, Canine NT-proBNP full-length protein was expressed in an E. coli expression system,
Origin. seq.Origin. seq.
다음으로, 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체의 상기 재조합 항원에 대한 반응성을 확인하기 위해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 구체적으로, 상기 재조합 항원 (3 ug)을 SDS-PAGE 전기영동하고 멤브레인에 블랏팅한 후, HRP가 접합된 상기 NT-proBNP 포획 항체 (10ug/ml)를 반응시킨 후, 기질 (CN/DAB) 반응성 여부를 확인하였다. 그 결과, 1, 3 및 4번째 아미노산 부위를 A로 치환한 경우 웨스턴 블랏팅에서의 밴드가 사라지거나 약해지는 것을 확인하였다 (SDS-PAGE에서 밴드가 명확히 확인된 부위임) (도 4A).Next, Western blotting was performed to confirm the reactivity of the NT-proBNP capture antibody of the present invention to the recombinant antigen. Specifically, the recombinant antigen (3 ug) was subjected to SDS-PAGE electrophoresis and membrane blotting, followed by reaction with the HRP-conjugated NT-proBNP capture antibody (10 ug/ml), and substrate (CN/DAB) Reactivity was confirmed. As a result, when the 1st, 3rd and 4th amino acid sites were substituted with A, it was confirmed that the bands in Western blotting disappeared or weakened (the bands were clearly identified in SDS-PAGE) (FIG. 4A).
다음으로, 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체의 상기 재조합 항원에 대한 반응성을 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 플레이트에 상기 재조합 항원(6 ug/ml)을 코팅하고, HRP가 접합된 상기 NT-proBNP 포획 항체를 농도별로 처리한 후, 기질 (TMB)을 첨가하여 반응시키고 흡광도를 측정하여 반응성을 확인하였다. 그 결과, 상기 웨스턴블랏팅 결과와 마찬가지로 1, 3 및 4번째 아미노산 부위를 A로 치환한 경우 반응성이 사라지는 것을 확인하였다 (도 4B).Next, ELISA was performed to confirm the reactivity of the NT-proBNP capture antibody of the present invention against the recombinant antigen. Specifically, after coating the recombinant antigen (6 ug / ml) on a plate, treating the HRP-conjugated NT-proBNP capture antibody by concentration, adding a substrate (TMB) to react and measuring absorbance to determine reactivity Confirmed. As a result, it was confirmed that the reactivity disappeared when the 1st, 3rd and 4th amino acid sites were substituted with A, similar to the results of the western blotting (FIG. 4B).
상기 내용을 종합해보면, 상기 3차 에피토프 맵핑에서 확인한 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체의 최소 단위 에피토프 영역인 CNT1-4의 아미노산 서열 중 1번째, 3번째 및 4번째 아미노산이 핵심 에피토프(key epitope)임을 알 수 있다.Summarizing the above, the first, third and fourth amino acids of the amino acid sequence of CNT1-4, which is the smallest unit epitope region of the NT-proBNP capture antibody of the present invention identified in the tertiary epitope mapping, are key epitopes It can be seen that
실시예 3: NT-proBNP 포획 항체의 CDR 서열 분석Example 3: CDR sequence analysis of NT-proBNP capture antibody
상기 실시예 2에서 에피토프를 확인한 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체의 CDR 서열을 분석하였으며, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 내 CDR 영역의 서열 정보를 하기 표 5에 표시하였다.The CDR sequences of the NT-proBNP capture antibody of the present invention whose epitope was confirmed in Example 2 were analyzed, and sequence information of the CDR regions in the light chain variable region and heavy chain variable region is shown in Table 5 below.
실시예 4: NT-proBNP 포획 항체를 포함하는 진단 키트의 임상적 성능 평가Example 4: Evaluation of clinical performance of diagnostic kits containing NT-proBNP capture antibodies
상기 실시예 2에서 에피토프를 확인하고 실시예 3에서 서열을 분석한 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체를 포함하는 개과 동물 심장질환 진단 키트의 진단 효과를 평가하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to evaluate the diagnostic effect of the canine heart disease diagnosis kit containing the NT-proBNP capture antibody of the present invention, the epitope of which was confirmed in Example 2 and sequence analyzed in Example 3, the following experiment was performed.
4.1: 임상 평가 대상 선정 및 시료 수집4.1: Selection of subjects for clinical evaluation and collection of samples
2020년 7월 1일부터 2020년 12월 31일까지 2차급 이상의 동물병원에 내원한 개 중에서 임상평가의 대상을 선정하였다. 정상개는 심장질환과 관련된 증상이 없는 건강한 개체를 대상으로 하였다. 심장질환에 이환된 개는 심장초음파평가를 통하여 심장질환으로 진단된 개체를 대상으로 선정하였다 (단, 심장질환에 이환된 개 그룹에 속하는 개체는 NT pro-BNP(250-10,000pmol/L)의 측정가능 범위를 넘지 않도록 하였다). 심장질환에는 이첨판 폐쇄 부전증을 포함하였다.From July 1, 2020 to December 31, 2020, subjects for clinical evaluation were selected among dogs who visited veterinary hospitals of the second or higher level. Normal dogs were healthy individuals without symptoms related to heart disease. Dogs with heart disease were selected as subjects diagnosed with heart disease through echocardiography (provided, that individuals belonging to the dog group with heart disease were NT pro-BNP (250-10,000 pmol/L)). not exceed the measurable range). Heart disease included bicuspid regurgitation.
임상평가 대상이 되는 개체로부터 채취한 혈액 검체는 혈청분리하여 즉시검사를 수행하였다. 즉시 검사가 어려운 경우에는 검사전까지 -80 ℃에서 보관하였다.Blood samples collected from individuals subject to clinical evaluation were separated from serum and tested immediately. If immediate inspection is difficult, the samples were stored at -80 °C until inspection.
4.2: 임상 평가 대상 개체의 특징 분석4.2: Analysis of the characteristics of objects subject to clinical evaluation
본 발명의 NT-proBNP 포획 항체를 포함하는 개과 동물 심장질환 진단 키트를 이용하여 NT pro-BNP 테스트를 수행한 임상평가 대상 개체(n = 100)의 정보는 다음과 같다. Information on subjects (n = 100) subject to clinical evaluation who performed the NT pro-BNP test using the canine heart disease diagnostic kit containing the NT-proBNP capture antibody of the present invention is as follows.
먼저, 심질환군은 50두로 모두 이첨판 폐쇄 부전증에 해당하였으며, 정상군은 50두로 모두 심장질환과 관련된 증상이 없는 건강한 개체였다(표 6).First, the heart disease group consisted of 50 heads, all corresponding to bicuspid regurgitation, and the normal group consisted of 50 heads, all of which were healthy individuals without heart disease-related symptoms (Table 6).
Right parasternal short-axis papillary muscle view에서 M-mode 상심근 벽 두께와 수축기능을 평가하는 심장초음파 검사 결과, FS (Fractional shortening) 값과 EF (Ejection fraction) 값은 심질환군에서 각각 52.90 ± 9.02%, 84.48 ± 7.73%을 나타냈고, 정상군에서 각각 46.01 ± 9.06%, 78.43 ± 9.57%를 보였으며 (표 7), 두 항목 모두 심질환군에서 정상군에 비해 유의적으로 더 높은 수치를 나타내었다 (p < 0.001).As a result of echocardiography to evaluate M-mode supracardial wall thickness and contractile function in the right parasternal short-axis papillary muscle view, the FS (Fractional shortening) and EF (Ejection fraction) values were 52.90 ± 9.02%, respectively, in the heart disease group. 84.48 ± 7.73%, and 46.01 ± 9.06% and 78.43 ± 9.57% in the normal group, respectively (Table 7), and both items showed significantly higher values in the heart disease group than in the normal group (p < 0.001).
4.3: 임상 평가 대상 개체의 NT pro-BNP 테스트 실시 결과 분석4.3: Analysis of NT pro-BNP test results of objects subject to clinical evaluation
본 발명의 NT-proBNP 포획 항체를 포함하는 개과 동물 심장질환 진단 키트를 이용하여 상기 임상 평가 대상 개체에 대해 NT pro-BNP 테스트를 수행한 결과, 심질환군에서 1815.14 ± 1680.63pmol/L을 나타냈고, 정상군에서 479.64 ± 48.00pmol/L를 나타냈는 바, 심질환군에서 정상군에 비해 유의적으로 높게 나타내는 것을 확인하였다 (표 8).As a result of performing the NT pro-BNP test on the subject subject to clinical evaluation using the canine heart disease diagnostic kit containing the NT-proBNP capture antibody of the present invention, the heart disease group showed 1815.14 ± 1680.63 pmol / L, As the normal group showed 479.64 ± 48.00 pmol/L, it was confirmed that the heart disease group was significantly higher than the normal group (Table 8).
다음으로, 심장질환에 이환된 개 그룹에서 심장 초음파 평가를 통해 이첨판 폐쇄 부전증의 경우 ACVIM 단계를 이용하여 심장질환의 심각도에 따라 분류하였으며, ACVIM 단계에 따라 NT pro-BNP 수치를 비교해 본 결과, ACVIM Cc단계에서 2175.92 ± 1733.52pmol/L로 가장 높은 수치를 보였으나, 그 다음으로는 D단계 (2035.23 ± 1547.24pmol/L), B2단계(899.93 ± 1341.01pmol/L), B1단계 (556.87 ± 531.51pmol/L), 정상 (479.64 ± 48.00pmol/L)의 순서를 보여, 정상군에서 가장 낮은 수치를 보였다 (표 9).Next, in the case of bicuspid regurgitation through echocardiographic evaluation in a group of dogs suffering from heart disease, they were classified according to the severity of heart disease using the ACVIM level, and as a result of comparing NT pro-BNP levels according to the ACVIM level, The Cc stage showed the highest value at 2175.92 ± 1733.52 pmol/L, followed by D stage (2035.23 ± 1547.24 pmol/L), B2 stage (899.93 ± 1341.01 pmol/L), and B1 stage (556.87 ± 531.51 pmol/L). /L) and normal (479.64 ± 48.00 pmol/L), showing the lowest value in the normal group (Table 9).
다음으로, 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체를 포함하는 개과 동물 심장질환 진단 키트의 양성예측도와 음성예측도 및 정확도를 분석한 결과 양성예측도 82%, 음성예측도 67%, 정확도 72%의 수치를 나타냈는 바, 심장 질환 발병 여부를 정확히 진단할 수 있음을 확인하였다 (표 10).Next, as a result of analyzing the positive predictive value, negative predictive value and accuracy of the canine heart disease diagnostic kit containing the NT-proBNP capture antibody of the present invention, the positive predictive value was 82%, the negative predictive value was 67%, and the accuracy was 72%. , it was confirmed that the onset of heart disease could be accurately diagnosed (Table 10).
상기 결과를 토대로, 본 발명의 NT-proBNP 포획 항체를 개과 동물 심장질환 진단 키트는 심장질환을 가진 반려견에서 NT-proBNP을 효과적으로 검출할 수 있으며, 상기 검출 결과를 토대로 심장질환을 정확하게 진단할 수 있음을 알 수 있다.Based on the above results, the canine heart disease diagnosis kit using the NT-proBNP capture antibody of the present invention can effectively detect NT-proBNP in dogs with heart disease, and can accurately diagnose heart disease based on the detection results. can know
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not limiting.
<110> BIONOTE, INC. <120> An antibodies specifically binding to NT-proBNP and uses thereof <130> PN143464KR <150> KR 10-2021-0143038 <151> 2021-10-25 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP full sequence <400> 1 His Pro Leu Gly Gly Arg Ser Pro Ala Ser Glu Ala Ser Glu Ala Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ser Gly Leu Trp Ala Val Gln Glu Leu Leu Gly Arg Leu Lys 20 25 30 Asp Ala Val Ser Glu Leu Gln Ala Glu Gln Leu Ala Leu Glu Pro Leu 35 40 45 His Arg Ser His Ser Pro Ala Glu Ala Pro Glu Ala Gly Gly Thr Pro 50 55 60 Arg Gly Val Leu Ala Pro His Asp Ser Val Leu Gln Ala Leu Arg Arg 65 70 75 80 Leu Arg Ser Pro Lys 85 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab epitope 1 <400> 2 His Xaa Leu Gly Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ab epitope 2 <400> 3 His Pro Leu Gly Gly Arg Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP Ab HCDR1 <400> 4 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Val 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP Ab HCDR2 <400> 5 Trp Trp Asp Asp Asp 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP Ab HCDR3 <400> 6 Met Asp Asp Tyr Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP Ab LCDR1 <400> 7 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP Ab LCDR2 <400> 8 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP Ab LCDR3 <400> 9 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr 1 5 <110> BIONOTE, INC. <120> An antibody specifically binds to NT-proBNP and uses its <130> PN143464KR <150> KR 10-2021-0143038 <151> 2021-10-25 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 85 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP full sequence <400> 1 His Pro Leu Gly Gly Arg Ser Pro Ala Ser Glu Ala Ser Glu Ala Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ser Gly Leu Trp Ala Val Gln Glu Leu Leu Gly Arg Leu Lys 20 25 30 Asp Ala Val Ser Glu Leu Gln Ala Glu Gln Leu Ala Leu Glu Pro Leu 35 40 45 His Arg Ser His Ser Pro Ala Glu Ala Pro Glu Ala Gly Gly Thr Pro 50 55 60 Arg Gly Val Leu Ala Pro His Asp Ser Val Leu Gln Ala Leu Arg Arg 65 70 75 80 Leu Arg Ser Pro Lys 85 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Ab epitope 1 <400> 2 His Xaa Leu Gly Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Ab epitope 2 <400> 3 His Pro Leu Gly Gly Arg Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP Ab HCDR1 <400> 4 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Val 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP Ab HCDR2 <400> 5 Trp Trp Asp Asp Asp 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP Ab HCDR3 <400> 6 Met Asp Asp Tyr Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP Ab LCDR1 <400> 7 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP Ab LCDR2 <400> 8 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NT-proBNP Ab LCDR3 <400> 9 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr 1 5
Claims (11)
상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계
를 포함하는, NT-proBNP를 검출하는 방법.Contacting an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to an epitope of NT-proBNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with a biological sample isolated from the subject ; and
Detecting a complex formed by binding of the sample and the antibody or antigen-binding fragment thereof.
Including, a method for detecting NT-proBNP.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP22198462.8A EP4169946A1 (en) | 2021-10-25 | 2022-09-28 | Antibodies binding specifically to nt-probnp and use thereof |
| US17/955,111 US20230288436A1 (en) | 2021-10-25 | 2022-09-28 | Antibodies binding specifically to nt-probnp and use thereof |
| CN202211200814.0A CN116023489A (en) | 2021-10-25 | 2022-09-29 | Antibodies that specifically bind to NT-proBNP and uses thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210143038 | 2021-10-25 | ||
| KR20210143038 | 2021-10-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230059115A true KR20230059115A (en) | 2023-05-03 |
Family
ID=86381077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220031497A KR20230059115A (en) | 2021-10-25 | 2022-03-14 | An antibodies specifically binding to NT-proBNP and uses thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230059115A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117285624A (en) * | 2023-09-28 | 2023-12-26 | 北京达成生物科技有限公司 | Anti-canine NT-proBNP bispecific antibody and kit |
-
2022
- 2022-03-14 KR KR1020220031497A patent/KR20230059115A/en unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117285624A (en) * | 2023-09-28 | 2023-12-26 | 北京达成生物科技有限公司 | Anti-canine NT-proBNP bispecific antibody and kit |
| CN117285624B (en) * | 2023-09-28 | 2024-04-26 | 北京达成生物科技有限公司 | Anti-canine NT-proBNP bispecific antibody and kit |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5616851B2 (en) | Determination of proBNP in dogs | |
| EP3029069B1 (en) | Anti-human cd26 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof | |
| JP2008513536A (en) | Monoclonal antibody against progastrin | |
| JP6812521B2 (en) | Immunoassays and antibodies to detect chromogranin A | |
| US20230288436A1 (en) | Antibodies binding specifically to nt-probnp and use thereof | |
| KR20230059115A (en) | An antibodies specifically binding to NT-proBNP and uses thereof | |
| US20210061924A1 (en) | Novel anti-thymidine kinase antibodies | |
| JP2014210761A (en) | Anti-canine n-terminal pro-atrial natriuretic peptide antibody and immunological measurement method using the same, and kit for immunological measurement | |
| JP7205691B2 (en) | Anti-canine procalcitonin antibody and test kit using the same | |
| US9040018B2 (en) | Monoclonal antibodies against alpha-actinin-4 antigens, and uses therefor | |
| TW201643191A (en) | Novel IGF-1R antibody and its use for the diagnosis of cancer | |
| US20240118284A1 (en) | Compositions and methods for detecting plxdc1 and plxcd2 in human tissues | |
| JP6961172B2 (en) | Heart failure detection method, heart failure detection device, sandwich immunological measurement method, and antibody combination | |
| JP4164804B2 (en) | Monoclonal antibody specific for tartrate-resistant acid phosphatase 5b and use thereof | |
| WO2023061388A1 (en) | Immunoassay of galectin-3 | |
| US20230242636A1 (en) | Monoclonal antibodies targeted to human taxilin alpha and methods for use of same | |
| JP2011526689A (en) | Use of IRAP proteins for carrying out diagnostic and prognostic methods | |
| TW201643192A (en) | Novel IGF-1R antibody and its use for the diagnosis of cancer | |
| US20210388108A1 (en) | Antibodies specific for glycosylated apoj and uses thereof | |
| EP2887068B1 (en) | Method for improving the diagnosis of invasive Candida infections by FBA1 protein detection |