KR20230059108A - 질소 도핑된 그래핀 양자점을 포함하는 유전자 전달용 조성물 - Google Patents
질소 도핑된 그래핀 양자점을 포함하는 유전자 전달용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 질소 도핑된 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 유전자 전달용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 질소 도핑된 그래핀 양자점은 실온에서 뛰어난 안전성과 낮은 세포독성을 나타내고, 표면에 양전하를 띠고 있어 음전하를 띤 유전자들과 정전기적 인력을 통해 결합함으로써 세포 내로 유전자를 전달할 수 있으며, 우수한 유전자 전달 효율 및 형질감염 효율을 나타내므로 유전자 치료를 위한 유전자 전달 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 질소 도핑된 그래핀 양자점을 포함하는 유전자 전달용 조성물 등에 관한 것이다.
유전자 치료 (Gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 최근, 유전자 치료에 의한 바이러스성 질환, 암 등 다양한 질병의 유효한 치료 효과가 다수 보고되고 있다. 최초의 유전자 치료제가 유럽에서 시판되어 상용화됨에 따라, 국내에서도 이에 대한 활발한 연구가 진행되고 있으며, 실제로, 몇몇의 유전자 치료제는 임상 연구에서 우수한 치료 효과를 보여주고 있는바, 국내뿐만 아니라, 전 세계적으로 유전자 치료제 개발에 대한 기대가 높은 상황이다. 그러나, 이러한 주목을 받고 있음에도 불구하고, 유전자 치료제는, 초기 임상 시험에서 뛰어난 효능을 보여주지 못해 실제로 상업화까지 진행되는 경우는 극히 드문 실정으로서, 이의 주요한 요인으로 유전자 치료제의 안전성 및 표적 세포로의 낮은 유전자 전달 효율을 꼽고 있다. 따라서, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현 효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달 플랫폼 (gene delivery platform)을 개발하는 것이 필수적이다.
현재, 높은 전달 효율을 가지고 있는 바이러스성 유전자 전달 플랫폼이 활용되고 있으나, 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 연관 바이러스 (adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 핵산의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기에는 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 유전자 전달 플랫폼이 바이러스성 유전자 전달 플랫폼의 대용으로 각광 받고 있다. 비바이러스성 유전자 전달 플랫폼은 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 안전성 및 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있으며, 이러한 예로는 양이온성 리포좀 (liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄 클로라이드 (N-[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,Ntriethylammonium chloride; DOTMA), 알킬암모늄 (alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체 (cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘 (gramicidin) 등이 있다. 그러나, 이 역시도 열악한 생체적합성 및 비-생분해성으로 인해 현저하게 높은 세포독성을 나타내며, 혈액 안정성이 낮고, 유전자 전달 효율이 낮다는 등의 단점이 있다.
따라서, 이러한 단점을 극복하면서 우수한 전달 효율을 나타내는 유전자 전달 플랫폼의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 안전하면서 우수한 전달 효율을 나타내는 최적화된 유전자 전달 플랫폼을 개발하고자 하였으며, 시트르산과 폴리에틸렌이민을 전구 물질로 합성한 질소 도핑된 그래핀 양자점이 실온에서 뛰어난 안정성과 낮은 세포 독성을 가지면서 기존의 유전자 전달 플랫폼과 비슷하거나 더 우수한 유전자 전달 효율 및 형질감염 효율을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 질소 도핑된 그래핀 양자점(N-Doped Graphene Quantum Dots; NGQDs) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 질소 도핑된 그래핀 양자점을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 질소 도핑된 그래핀 양자점(N-Doped Graphene Quantum Dots; NGQDs) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 0.1 내지 20 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 직경이 1 내지 20 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 유전자는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, DNA-RNA 혼성체 (hybrid), 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점 및 유전자는 1 내지 50:1의 비율로 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점과 유전자는 정전기적 상호작용으로 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 시트르산(citric acid) 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine; PEI) 혼합 용액을 수열 반응(hydrothermal reaction)하는 단계를 포함하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수열 반응은 마이크로웨이브(microwave)를 조사함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 시트르산과 상기 폴리에틸렌이민은 1 내지 10:1의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 질소 도핑된 그래핀 양자점을 제공한다.
또한, 본 발명은 전달하고자 하는 유전자와 결합한 질소 도핑된 그래핀 양자점 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 질소 도핑된 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유전자 전달 용도를 제공한다.
본 발명의 질소 도핑된 그래핀 양자점은 실온에서 뛰어난 안전성과 낮은 세포독성을 나타내고, 표면에 양전하를 띠고 있어 음전하를 띠는 유전자들과 정전기적 인력을 통해 결합함으로써 세포 내로 유전자를 전달할 수 있으며, 우수한 유전자 전달 효율 및 형질감염 효율을 나타내므로 유전자 치료를 위한 유전자 전달 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 특성을 분석한 것으로, a)는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 TEM 이미지를 나타낸 도면이고(스케일 바 = 20 nm), b)는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 크기 분포를 나타낸 도면이고, c)는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제타 전위를 나타낸 도면이다.
도 2는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 전구 물질의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 4는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 XPS C1s 스펙트럼 (좌측) 및 XPS N1s 스펙트럼 (우측)을 나타낸 도면이다.
도 5는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 라만 (Raman) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 6은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 형광 및 흡광 특성을 확인한 것으로, a)는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 도면이고, b)는 365 nm 여기 (excitation)에서 질소 도핑된 그래핀 양자점의 광학 및 형광 이미지를 나타낸 도면이고, c)는 365 nm 여기에서 질소 도핑된 그래핀 양자점의 방출(emission) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 7은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 로딩 용량을 나타낸 것으로 a)는 mRNA 로딩 용량, b)는 pDNA 로딩 용량을 나타낸 도면이다.
도 8은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 mRNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 HeLa 세포에 질소 도핑된 그래핀 양자점-mRNA 복합체를 처리한 후 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바 = 200 μm).
도 10은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 mRNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 pDNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 HeLa 세포에 질소 도핑된 그래핀 양자점-pDNA 복합체를 처리한 후 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바 = 200 μm).
도 12는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 pDNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 전구 물질의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 4는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 XPS C1s 스펙트럼 (좌측) 및 XPS N1s 스펙트럼 (우측)을 나타낸 도면이다.
도 5는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 라만 (Raman) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 6은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 형광 및 흡광 특성을 확인한 것으로, a)는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 도면이고, b)는 365 nm 여기 (excitation)에서 질소 도핑된 그래핀 양자점의 광학 및 형광 이미지를 나타낸 도면이고, c)는 365 nm 여기에서 질소 도핑된 그래핀 양자점의 방출(emission) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 7은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 로딩 용량을 나타낸 것으로 a)는 mRNA 로딩 용량, b)는 pDNA 로딩 용량을 나타낸 도면이다.
도 8은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 mRNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 HeLa 세포에 질소 도핑된 그래핀 양자점-mRNA 복합체를 처리한 후 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바 = 200 μm).
도 10은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 mRNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 pDNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 HeLa 세포에 질소 도핑된 그래핀 양자점-pDNA 복합체를 처리한 후 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바 = 200 μm).
도 12는 질소 도핑된 그래핀 양자점의 pDNA 형질감염 효율을 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 시트르산 및 폴리에틸렌이민을 전구 물질로 사용하여 제조한 질소 도핑된 그래핀 양자점이 우수한 형질감염 효율을 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실험예에 따르면, 질소 도핑된 그래핀 양자점은 평균 직경이 7.03 nm ± 0.27 nm이며, 그래핀 도메인과 카르복실산 및 아민과 같은 작용기를 가지고 있고, 표면이 양전하 (1.91 ± 1.77 mV)를 띠는 그래핀 양자점인 것을 확인하였다 (실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에 따르면, 질소 도핑된 그래핀 양자점의 로딩 용량이 NGQDs:유전자 = 20:1인 것을 확인하였다 (실험예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에 따르면, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점이 낮은 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다 (실험예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에 따르면, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점이 mRNA 및 pDNA에 대하여 시판되는 유전자 전달 플랫폼과 유사하거나 더 우수한 형질감염 효율을 나타내는 것을 확인하였다 (실험예 5 참조).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 질소 도핑된 그래핀 양자점(N-Doped Graphene Quantum Dots; NGQDs) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유전자 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “그래핀”은 복수개의 탄소 원자들이 서로 공유 결합으로 연결되어 폴리시클릭 방향족 분자를 형성하는 것을 의미하는 것으로서, 상기 공유 결합으로 결합된 탄소 원자들은 기본 반복 단위로서 6 원환을 형성하나, 5 원환 및/또는 7 원환을 더 포함하는 것도 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어 “그래핀 양자점 (Graphene Quantum Dots; GQDs)”은 나노-크기 단편을 가진 그래핀을 의미하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 그래핀 양자점은 질소 도핑된 그래핀 양자점 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
상기 “질소 도핑된 그래핀 양자점 (N-Doped Graphene Quantum Dots; NGQDs)”은 통상적인 그래핀 양자점에 추가로 질소를 포함하는 그래핀 양자점을 의미하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 시트르산(citric acid) 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine; PEI)을 전구 물질로 사용하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 “질소 도핑”이란 그래핀을 이루는 탄소 사이에 질소를 넣어주는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점의 도핑된 질소는 피리딘 유사배열(pyridinic-N), 피롤 유사 배열(pyrrolic-N) 및/또는 그라파이트 유사배열(graphitic-N)로 이루어질 수 있으며, 상기 피리딘 유사 배열은 30~35%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 질소 도핑된 그래핀 양자점은 표면이 양전하를 나타내므로 표면에 생성된 양전하를 이용하여 음전하를 띤 유전자와 결합하여 유전자를 세포 내로 전달할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 0.1 내지 20 mV, 0.5 내지 20 mV, 1 내지 20 mV, 3 내지 20 mV, 5 내지 20 mV, 8 내지 20 mV, 10 내지 20 mV, 10 내지 18 mV, 10 내지 15 mV, 10 내지 13 mV, 0.1 내지 10 mV, 0.3 내지 10 mV, 0.5 내지 10 mV, 0.8 내지 10 mV, 1 내지 10 mV, 3 내지 10 mV, 5 내지 10 mV, 5.5 내지 10 mV, 6 내지 10 mV, 6 내지 9 mV, 6 내지 7 mV, 0.1 내지 6 mV, 0.13 내지 6 mV, 0.14 내지 6 mV, 0.15 내지 6 mV, 0.5 내지 6 mV, 0.8 내지 6 mV, 1 내지 6 mV, 2 내지 6 mV, 3 내지 6 mV, 3.5 내지 6 mV, 4 내지 6 mV, 4.5 내지 6 mV, 5 내지 6 mV, 5.5 내지 6 mV, 0.1 내지 5.5 mV, 0.13 내지 5 mV, 0.14 내지 4.5 mV, 0.14 내지 4 mV, 0.14 내지 3.8 mV, 0.14 내지 3.7 mV, 0.15 내지 3.7 mV, 0.18 내지 3.7 mV, 0.2 내지 3.7 mV, 0.25 내지 3.7 mV, 0.3 내지 3.7 mV, 0.5 내지 3.7 mV, 0.8 내지 3.7 mV, 1 내지 3.7 mV, 1.5 내지 3.7 mV, 2 내지 3.7 mV, 2.5 내지 3.7 mV, 또는 3 내지 3.7 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 0.14 내지 3.68 mV 범위의 제타 전위를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 직경이 1 내지 20 nm, 1 내지 18 nm, 1 내지 16 nm, 1 내지 14 nm, 1 내지 12 nm, 1 내지 10 nm, 1 내지 8 nm, 1 내지 6 nm, 1 내지 4 nm, 1 내지 2 nm, 2 내지 19 nm, 2 내지 17 nm, 2 내지 15 nm, 2 내지 13 nm, 2 내지 11 nm, 2 내지 9 nm, 2 내지 7 nm, 2 내지 5 nm, 2 내지 3 nm, 3 내지 18 nm, 3 내지 16 nm, 3 내지 14 nm, 3 내지 12 nm, 3 내지 11 nm, 3 내지 9 nm, 3 내지 7 nm, 3 내지 5 nm, 3 내지 4 nm, 4 내지 11 nm, 4 내지 9 nm, 4 내지 7 nm, 4 내지 5 nm, 5 내지 10 nm, 5 내지 8 nm, 5 내지 6 nm, 6 내지 10 nm, 6 내지 8 nm, 6 내지 7.8 nm, 6 내지 7.5 nm, 6 내지 7.3 nm, 6.3 내지 7.3 nm, 6.5 내지 7.3 nm, 6.7 내지 7.3 nm, 또는 6.8 내지 7.3 nm일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 6.76 내지 7.30 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드의 중합체인 핵산을 포함하는 물질을 의미하며, gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, DNA-RNA 혼성체 (hybrid), 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, mRNA 및/또는 pDNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자는 유전자 약물일 수 있으며, 여기서 유전자 약물은 하나 이상의 질병 치료 또는 예방을 약효로 나타내는 음전하를 띤 유전자를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 질소 도핑된 그래핀 양자점과 유전자는 1 내지 50:1, 1 내지 45:1, 1 내지 40:1, 1 내지 35:1, 1 내지 30:1, 1 내지 25:1, 1 내지 20:1, 1 내지 15:1, 1 내지 10:1, 1 내지 8:1, 1 내지 5:1, 5 내지 40:1, 5 내지 35:1, 5 내지 30:1, 5 내지 28:1, 5 내지 25:1, 5 내지 23:1, 5 내지 20:1, 5 내지 18:1, 5 내지 15:1, 5 내지 13:1, 5 내지 10:1, 8 내지 30:1, 8 내지 28:1, 8 내지 25:1, 8 내지 23:1, 8 내지 20:1, 8 내지 18:1, 8 내지 15:1, 8 내지 13:1, 8 내지 10:1, 10 내지 30:1, 10 내지 28:1, 10 내지 25:1, 10 내지 23:1, 10 내지 20:1, 10 내지 18:1, 10 내지 15:1, 또는 10 내지 13:1 비율로 결합될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 질소 도핑된 그래핀 양자점과 유전자는 20:1 또는 10:1 비율로 정전기적 상호작용으로 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 “정전기적 상호작용”은 서로 반대되는 전하가 만나 정전기적 인력에 의해 작용하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “유전자 전달 (gene delivery)”은 DNA 또는 RNA에 암호화되어 있는 목적 유전자를 세포 안으로 전달하는 것을 의미하는 것으로, 상기 유전자는 음전하를 띠고 있어 표면에 양전하를 띠고 있는 질소 도핑된 그래핀 양자점과 정전기적 인력 (상호작용)을 통해 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “유전자 전달 플랫폼 (gene delivery platform) 또는 유전자 전달체 (gene carrier)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미한다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 유전자를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 유전자가 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절하게 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제, 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 유전자의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자 전달용 조성물은 유전자가 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병용하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 시트르산(citric acid) 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine; PEI) 혼합 용액을 수열 반응(hydrothermal reaction)하는 단계를 포함하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제조방법을 제공한다. 여기서, 상기 시트르산 및 폴리에틸레이민은 질소 도핑된 그래핀 양자점의 전구 물질로서 사용된다.
상기 폴리에틸렌이민은 선형 폴리에틸렌이민(Linear PEI) 또는 가지형 폴리에틸렌이민(Branched PEI)일 수 있으며, 바람직하게는 가지형 폴리에틸렌이민일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 전구 물질로 선형 폴리에틸렌이민을 사용할 경우, 선형 폴리에틸렌이민의 분자량은 2.5 내지 250 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 전구 물질로 가지형 폴리에틸렌이민을 사용할 경우, 사용한 가지형 폴리에틸렌이민의 분자량은 0.6 내지 750 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 “수열 반응(hydrothermal reaction)”은 고온의 물, 특히 고온, 고압의 물 존재하에서 이루어지는 물질의 합성 혹은 변성반응을 의미하는 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수열 반응은 마이크로웨이브-보조 수열 반응 (microwave-assisted hydrothermal reaction)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “마이크로웨이브-보조 수열 반응”은 마이크로웨이브를 조사함으로써 수행되는 것을 의미하며, 상기 마이크로웨이브는 300 내지 1000 W, 300 내지 900 W, 300 내지 800 W, 300 내지 700 W, 400 내지 900 W, 400 내지 800 W, 400 내지 700 W, 500 내지 800 W, 600 내지 800 W, 700 내지 800 W, 750 내지 800 W의 세기로 조사할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예 따르면, 800 W의 세기로 조사될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 시트르산과 상기 폴리에틸렌이민은 1 내지 15:1, 1 내지 13:1, 1 내지 10:1, 1 내지 8:1, 1 내지 5:1, 1 내지 4:1, 1 내지 3:1, 1 내지 2:1, 2 내지 4:1, 2 내지 3:1, 3 내지 4:1, 3.5 내지 4:1, 또는 4:1의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 잔류 반응물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 잔류 반응물을 제거하는 단계는 투석에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 질소 도핑된 그래핀 양자점을 제공한다.
전구물질로 사용된 폴리에틸렌이민은 단독으로 세포에 전달될 경우 세포 독성이 있어 유전자 전달 플랫폼으로 사용하기에 적절하지 않으나, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 질소 도핑된 그래핀 양자점은 표면에 양전하를 띠며 실온에서 안정적이고, 낮은 세포 독성을 나타내므로 유전자를 세포 내로 전달하는 유전자 전달 플랫폼으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 질소 도핑된 그래핀 양자점은 전구물질인 폴리에틸렌이민이 높은 제타 전위 값을 가짐에도 불구하고 낮은 제타 전위 값을 가지므로, pDNA(mRNA에 비해 길이가 길어 제타 전위 값이 높을 경우 강하게 결합되어 탈착에 어려움이 있음)의 전달 플랫폼으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다 (도 1 및 도 12 참조).
또한, 본 발명은 전달하고자 하는 유전자와 결합한 질소 도핑된 그래핀 양자점 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 질소 도핑된 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유전자 전달 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 질소 도핑된 그래핀 양자점 (N-Doped Graphene Quantum Dots; NGQDs)의 합성
200 mg의 시트르산 (citric acid)(미국, 세인트 루이스, Sigma Aldrich, St) 및 50 mg의 PEI (Polyethylenimine)(미국, 워링턴, Polyscience, Mw 1800, branched)를 15 mL의 증류수에 첨가하였다. 30분 동안 초음파 처리한 후, 투명한 용액을 microwave (중국, 베이지아오, Midea, 800W, MWO-2027)의 중앙에 배치하였다. 반응 용액이 노란색으로 변할 때까지 마이크로웨이브-보조 수열 반응 (microwave-assisted hydrothermal reaction)을 30초씩 약 10회 반복하였다. 생성물 용액을 200 nm 및 20 nm disc filter (미국, 시카고, GE Healthcare Life Sciences, AnodiscTM)로 여과하고 3.5 kDa dialysis tube (미국, 월섬, Thermo Fisher Scientific, SnakeskinTM)로 5일 동안 투석하여 잔여 반응물들을 제거하였다. 완성된 용액은 2일 동안 동결건조하였다.
실시예 2. NGQDs의 특성화
NGQDs의 형태 및 크기 분포는 Cs-TEM (Cs-corrected transmission electron microscope)(일본, 도쿄, JEOL Ltd., JEM-ARM200F)으로 분석하였다. 제타 전위는 zeta potential analyzer (영국, 몰번, Malvern Instruments, Zetasizer NanoS)로 측정하였다. NGQDs의 작용기는 FT-IR (Fourier transform infrared)(미국, 빌레리카, BRUKER, Vertex-80V) 및 XPS (X-ray photoelectron spectroscopy)(영국, 맨체스터, Kratos Analytical Ltd., AXIS-His)로 특성화하였다. Raman spectrometer (영국, 워턴 언더 엣지, Renishaw, Via Raman microscope)를 사용하여 NGQDs에서 그래핀의 D 및 G 밴드를 확인하였다. NGQDs의 흡광도는 ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrophotometer (대한민국, 서울, Scinco, S-3100)로 분석하였다. 다양한 여기 파장 (excitation wavelength)에서 방출 스펙트럼은 spectrofluorometer (일본, 도쿄, Jasco Inc., FP-8300)를 사용하여 획득하였다.
실시예 3. 로딩 용량 (Loading Capacity)
NGQDs에 대한 유전자의 비율을 분석하기 위해, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP)을 인코딩하는 100 ng의 mRNA (미국, 샌디에고, TriLink Biotechnologies, CleanCap® EGFP mRNA) 및 pDNA (미국, 워터타운, Addgene, pcDNA3-EGFP)를 20 μL의 1×PBS (phosphate buffer saline) 용액에 있는 다양한 양(0, 0.5, 1, 2, 및 4 μg)의 NGQDs에 첨가하였다. 로딩 과정은 1 mL 튜브에서 실시하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 일련의 복합체를 4 μL의 LoadingSTARTM (대한민국, 성남, Dyne Bio Inc.)과 혼합하고 혼합물을 1% 아가로스 겔 (agarose gel)에 로딩하였다. NGQDs의 로딩 용량은 30분 동안 100V에서 agarose-gel electrophoresis (일본, 도쿄, ADVANCE, Mupid-2plus)한 후, 나머지 유전자들로부터 파생된 밴드의 강도를 측정하여 결정하였다.
실시예 4. 세포 생존율 (Cell Viability) 분석
형질감염 전에 24시간 동안 HeLa 세포를 5×103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 씨딩 (seeding)한 후, 24시간 동안 완전 배지 (complete media)에서 다양한 농도의 NGQDs을 HeLa 세포에 처리하였다. 배지를 제거한 후, 세포를 1×PBS 용액으로 세척하고 10 μL의 cell counting kit-8 (CCK-8)(미국, 록빌, Dojindo Molecular Technologies Inc.) 용액과 함께 90 μL의 무혈청 배지에서 인큐베이션하였다. 처리한 세포의 세포 생존율을 평가하기 위해, microplate absorbance reader (미국, 위누스키, BioTek, Synergy Mx)를 사용하여 450 nm에서 포르마잔 염 (formazan salt)의 광학 밀도를 측정하고, 배지의 배경 흡광도를 뺐다. 실험은 3회 반복 실시하였다.
실시예 5. 유전자 형질감염 효율(Gene Transfections Efficiency)
HeLa 세포를 3×104 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 씨딩하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 0.5 mL의 무혈청 배지에서 1×PBS(Ctrl), mRNA, Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific), NGQDs, Lipofectamine® 2000과 결합한 mRNA, 및 NGQDs와 결합한 mRNA로 처리하였다. 복합체-포함 유전자 및 NGQDs의 제조를 위해, 3 μL의 mRNA 용액 (10 μg/mL)과 6 μL의 NGQDs 용액 (0.1 mg/mL)을 혼합하고 2 μL의 10 PBS 용액을 9 μL의 탈이온수 (deionized water)와 함께 첨가하였다. 24시간 동안 복합체와 함께 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 1 PBS 용액으로 세척하였다. 명시야 (Bright-field) 및 형광 이미지 (fluorescence image) (λEx/λEm = 488 nm/507 nm)는 Meta-morph image analysis software (미국, 새너제이, Molecular Devices)를 사용하여 fluorescence microscopy (일본, 도쿄, Nikon Co.)로 획득하였다. 형질감염의 정량적 분석을 위해, 세포를 트립신 처리하고 수확한 다음, 0.5 mL의 1×PBS 용액에 세포를 현탁시켰다. 샘플의 형광 강도는 유세포 분석 (flow cytometry)(미국, BD Biosciences, BD FACSLyric)으로 분석하였다.
[실험예]
실험예 1. NGQDs의 특성 분석
mRNA 및 pDNA와 같은 유전자를 세포로 전달하기 위해, 유전자와 정전기 상호작용을 통해 상호작용할 수 있는 양전하를 갖는 GQDs를 합성하였다. PEI와 시트르산을 전구 물질 (precursor)로 사용하여 마이크로웨이브-보조 수열 반응 (microwave-assisted hydrothermal reaction)에 의해 GQDs를 합성하였으며, 합성된 GQDs를 질소 도핑된 그래핀 양자점 (NGQDs)로 명명하였다.
1-1. NGQDs의 형태, 크기, 및 표면 전하
제조한 NGQDs의 형태와 크기를 분석하기 위해 TEM 관찰을 수행하였다. 그 결과, 도 1의 a) 및 b)에 나타낸 바와 같이, NGQDs의 전반적인 직경 분포는 3 내지 11 nm이고, 평균 직경은 7.03 nm ± 0.27 nm인 나노 입자로 확인되었다. 또한, 도 1의 c)에 나타낸 바와 같이, 제타 전위 측정은 탈이온수에서 1.91 ± 1.77 mV의 양전하로 대전된 표면 환경을 갖는 NGQDs의 표면 전하 정보를 추가로 제공하였다. 이 양전하를 통해 NGQDs는 음전하를 띤 인산 골격을 가진 유전자와 정전기적으로 상호작용할 수 있다.
1-2. NGQDs의 광학적 특성
NGQDs의 작용기 분석을 위해 FT-IR 및 XPS를 수행하였다. FT-IR 분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 1720 및 1650 cm-1에서 NGQDs의 대표적인 피크가 관찰되었으며, 이는 각각, 카르복실산 및 방향족 그룹에서 C=O 신축(stretching) 및 C=C 신축 진동(stretching vibration)으로 해석되었다. 또한, 1550 및 1000-1250 cm-1에서도 피크가 명확하게 관찰되었으며, 이는 1차 및 2차 아민 그룹의 N-H 굽힘 (bending) 뿐만 아니라 아민 그룹의 C-N 결합과 상관관계가 있으며, 전구 물질의 FT-IR 스펙트럼인 도 3에 나타내었다.
XPS 분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, C1s 및 N1s 스펙트럼에서 NGQDs에 방향족 sp2 C=C, sp2 C-N, sp3 C-N, 및 카르복실기가 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 284.5, 285.7, 287.5, 및 288.6 eV의 피크에 해당한다.
나아가, 도 5에 나타낸 바와 같이, 라만 스펙트럼에서 그래핀의 특징적인 피크로 각각 1350 cm-1 및 1580 cm-1에서 D 밴드와 G 밴드를 관찰하였다. 상기 결과로부터, NGQDs가 방향족 sp2 도메인과 카르복실산, 아민기 등과 같은 다양한 작용기로 구성되어 있음을 알 수 있다.
NGQDs는 도 6의 a)에 나타낸 바와 같이, 방향족 sp2 C=C의 π-π*전이 및 카르보닐 C=O의 n-π* 전이에 각각 해당하는 250 및 350 nm에서 UV-Vis 흡수 피크를 나타내며, 이는 NGQDs가 방향족 sp2 C=C 도메인과 카보닐 그룹으로 구성된 것을 의미한다.
또한, 도 6의 b) 및 c)에 나타낸 바와 같이, NGQDs는 365 nm 여기(excitation)에서 청색 형광(Em, max = 432 nm)을 방출하였다.
상기의 전체적인 NGQDs의 특성화 데이터들로부터 NGQDs가 GQDs의 특징적인 특성 (다양한 작용기를 가진 흑연 코어 및 유전자와 상호작용하는데 필요한 양전하)을 가지고 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. NGQDs의 로딩 용량
NGQDs의 유전자 로딩 용량을 평가하기 위해, 1×PBS 용액에서 두가지 형태의 유전자와 NGQDs를 혼합한 후 실온에서 인큐베이션하였다. 도 7의 a) 및 b)에 나타낸 바와 같이, agarose-gel electrophoresis 결과에 따르면, agarose gel의 0.1 μg mRNA 및 0.1 μg pDNA에 대한 1 μg 및 0.5 μg NGQDs의 컬럼 (column)은 불완전한 밴드 이동을 나타냈다. 따라서, 완벽한 로딩을 위한 NGQDs의 등가량 (equivalent amount)은 각각 0.1 μg mRNA의 경우 1 내지 2 μg 및 0.1 μg pDNA의 경우 0.5 내지 1 μg으로 가정할 수 있었다.
단일 가닥이면서 선형 구조인 mRNA는 기본 골격구조인 당 부분이 ribose로 2번 탄소에 OH기를 가지고 있는 반면, plasmid DNA(pDNA)는 이중 가닥이며 고리 모양 DNA이고, 2번 탄소에 H기를 가지고 있다. 이러한 구조적인 차이로 인해 pDNA는 같은 질량에도 불구하고 mRNA에 비해 분자 개수가 적으며, 2번 탄소에 OH기 대신 H기가 있어 상대적으로 전하량이 낮을 것으로 예측되고, 이로 인해 mRNA와 pDNA의 NGQDs 등가량 차이가 발생되는 것으로 판단하였다.
양전하로 대전된 NGQDs는 정전기력을 통해 유전자와 상호작용할 수 있으므로, 실온에서 간단한 혼합에 의해 유전자와 복합체를 형성할 수 있다.
실험예 3. NGQDs의 세포독성
in vitro에서 NGQDs로 유전자 형질감염 전, CCK-8 assay kit를 사용하여 NGQDs의 세포독성을 확인하였다. 구체적으로, 1 μg/mL에서 1000 μg/mL까지 다양한 농도의 NGQDs를 완전 배지에서 HeLa 세포에 1일 동안 처리하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, NGQDs는 용량 의존적으로 독성을 나타냈으며, 63 μg/mL의 농도에서 세포 생존율 (cell viability)의 감소를 확인할 수 있었다.
실험예 4. NGQDs의 형질감염 효율
4-1. mRNA
NGQDs의 형질감염 효율을 평가하기 위하여, NGQDs가 있는 HeLa 세포로 mRNA를 전달하였다. 도 7의 a)에 나타낸 바와 같이, NGQDs는 20:1 비율 (wt/wt)로 mRNA와 복합체를 형성할 수 있으므로, GFP를 인코딩하는 30 ng의 mRNA는 형질감염 전에 600 ng의 NGQDs와 복합체를 형성하였다. 양성 대조군으로 다양한 유전자와 리포좀(liposome)을 형성하는 대표적인 형질감염제인 Lipofectamine 2000을 사용하였다. 실온에서 한시간 동안 인큐베이션한 후, NGQDs-mRNA 복합체 처리군, 1×PBS (대조군), mRNA 단독 처리군, Lipofectamine 단독 처리군, NGQDs 단독 처리군, 및 Lipofectamine-mRNA 복합체 처리군으로 실험군을 분류하여 24시간 동안 HeLa 세포에 처리하였다. 각 처리군의 형질감염을 육안으로 확인하기 위해, 형광현미경 (fluorescence microscopy)을 사용하여 녹색 형광을 관찰하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, NGQDs-mRNA 복합체 처리군에서 GFP를 발현하는 세포의 수는 형질감염제로 Lipofectamine을 사용한 처리군과 유사하게 나타났으며, 이로부터 유전자와 복합체를 형성한 NGQDs가 성공적으로 세포 내로 진입했음을 알 수 있었다. 또한, NGQDs가 그들의 양의 10 내지 20 배에 달하는 mRNA 및 pDNA와 복합체를 형성하였으며, 이는 여러 NGQDs가 mRNA 또는 DNA 분자를 감싸서 그것을 주변 세포막으로 전달한 다음 세포 흡수 (cellular uptake)를 수반하는 것을 의미한다. 나아가, 이전에 양전하로 대전된 NGQDs와 세포막의 선호되는 상호 작용이 일부 보고되었을지라도, NGQDs와 유전자 사이의 중화된 전하 복합체가 세포 흡수를 가능케 함을 가정할 수 있었다. 한편, NGQDs가 GFP 방출과 유사한 파장인 360 nm에서 여기 (excitation) 하에 약 500 nm 형광 방출을 가졌음에도 불구하고, NGQDs의 여기 범위는 GFP 여기 파장 (~488 nm)이 아니라 280 내지 430 nm이므로, 도 9의 d)에 나타낸 바와 같이, NGQDs의 형광은 형광현미경 이미지에서 시각화될 수 없다. 따라서, 도 9의 f)에 나타난 형광은 NGQDs 형광으로 인한 것이 아니다. 상기 결과로부터, NGQDs가 성공적으로 세포로 mRNA를 전달하고 그것을 번역(translation)을 위해서 방출함을 알 수 있다.
각 처리군의 형질감염 효율을 정량화하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 형광현미경 결과와 유사하게 대조군, mRNA 단독 처리군, Lipofectamine 단독 처리군, NGQDs 단독 처리군에서는 GFP-발현 세포가 검출되지 않았으며, 특히, 약 500 nm에서 NGQDs의 형광은 유세포 분석에서 영향을 미치지 않았다. NGQDs-mRNA 복합체 처리군과 Lipofectamine-mRNA 복합체 처리군은 유사한 형광 이미지를 가지고 있었지만, NGQDs-mRNA 복합체 처리군은 정량 분석에서 양성 대조군인 Lipofectamine-mRNA 복합체 처리군과 비교하여 최대 50%의 향상된 형질감염을 나타내었다. 상기 결과로부터, NGQDs는 백신 접종 또는 유전자 치료를 위한 mRNA 전달 플랫폼 (platform)으로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 알 수 있다.
4-2. pDNA
mRNA 외에도 NGQDs를 사용하여 pDNA 형질감염을 수행하였다. mRNA와 동일하게, GFP를 인코딩(encoding)하고 NGQDs와 복합체를 형성한 pDNA를 실온에서 혼합하여 제조하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 각 그룹을 24시간 동안 HeLa 세포에 처리하였다. 처리 후, 형광현미경 이미지는 NGQDs가 pDNA 전달 플랫폼으로서 최고의 성능을 가지고 있음을 보여준다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 형광현미경 이미지에서 NGQDs-pDNA 복합체 처리군은 Lipofectamine-pDNA 복합체 처리군과 비슷한 강한 녹색 형광을 나타내었다.
각 처리군의 형질감염 효율을 정량화하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, NGQDs-pDNA 처리군의 형질감염 효율 (~42.5%)은 Lipofectamine-pDNA 처리군 (~49.3%)과 유사하게 나타났다. 도 12의 유세포 분석 결과와 도 11의 형광현미경 이미지 간의 불일치는 형질감염된 세포의 형광 강도의 차이로 인한 것으로 추측되었다. NGQDs-pDNA로 처리된 세포는 유세포 분석 결과에서 강한 형광을 나타내는 경향이 있어 도 11의 e) 및 f)에 나타낸 바와 같이, 형광 이미지가 더 밝게 나타났다.
상기에서 확인한 바와 같이, mRNA와 pDNA가 작용하는 세포 내 위치가 서로 다름에도 불구하고, NGQDs는 mRNA와 pDNA 모두를 세포에 전달하였으며, 전달된 mRNA와 pDNA는 성공적으로 기능하였다. 상기 결과로부터, NGQDs는 그들이 작용하는 세포 내 구획에 관계없이 다양한 종류의 유전자를 형질감염시킬 수 있는 적합한 전달 플랫폼임을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (12)
- 질소 도핑된 그래핀 양자점(N-Doped Graphene Quantum Dots; NGQDs) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 유전자 전달용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 0.1 내지 20 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 직경이 1 내지 20 nm인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 질소 도핑된 그래핀 양자점 및 유전자는 1 내지 50:1의 비율로 결합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 질소 도핑된 그래핀 양자점과 유전자는 정전기적 상호작용으로 결합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 유전자는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA, miRNA, DNA-RNA 혼성체 (hybrid), 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달용 조성물.
- 시트르산(citric acid) 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine; PEI) 혼합 용액을 수열 반응(hydrothermal reaction)하는 단계를 포함하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 수열 반응은 마이크로웨이브(microwave)를 조사함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 시트르산과 상기 폴리에틸렌이민은 1 내지 10:1의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점의 제조방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 질소 도핑된 그래핀 양자점.
- 제10항에 있어서,
상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 0.1 내지 20 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 것을 특징으로 하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점.
- 제10항에 있어서,
상기 질소 도핑된 그래핀 양자점은 직경이 1 내지 20 nm인 것을 특징으로 하는, 질소 도핑된 그래핀 양자점.
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