KR20230057939A - A gravity-driven biochip using magnetic particles and a method to detect analytes using the biochip - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성입자를 이용하여 분석물질을 검출할 수 있는 바이오칩에 관한 것으로, 이 바이오칩은 중력에 의해 세척용액이 흘러가도록 함으로써 기기를 사용하지 않고도 세척 과정을 수행할 수 있는 특징을 가지고 있다.The present invention relates to a biochip capable of detecting an analyte using magnetic particles, and the biochip has a characteristic in that a washing process can be performed without using a device by allowing a washing solution to flow by gravity.
Description
본 발명은 자성입자를 이용하여, 분석물질을 현장에서 간편하게 정량적으로 검사할 수 있는 바이오칩 및 이 바이오칩을 이용한 분석물질 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biochip capable of conveniently and quantitatively examining an analyte on-site using magnetic particles, and a method for detecting an analyte using the biochip.
현장검사(point-of-care testing, POCT)는 시료를 분석 검사실로 가져가지 않고 현장에서 바로 검사하는 것이다. 현장검사를 위해서는 크고 복잡한 기기를 사용하지 않고 동물세포, 박테리아, 바이러스, 핵산, 단백질, 기타 유기물 또는 무기물과 같은 분석물질(analyte)을 검사할 수 있는 간단한 키트가 필요하며 특히 배터리와 같이 저전력을 이용하는 키트(low-powered kit)나 아예 전기를 사용하지 않는 무동력 방식의 키트(non-powered kit)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 현장검사는 숙련된 분석 기술자가 아닌 일반인이 쉽게 사용할 수 있을 정도로 작동이 쉽고 간단해야 하며 경제적이어야 한다. Point-of-care testing (POCT) is testing on-site without taking samples to an analytical laboratory. For on-site inspection, a simple kit that can test analytes such as animal cells, bacteria, viruses, nucleic acids, proteins, and other organic or inorganic substances without using large and complex equipment is required. It is preferable to use a low-powered kit or a non-powered kit that does not use electricity at all. In addition, point-of-care testing must be simple, easy to operate, and economical enough to be easily used by non-trained analytical technicians.
현장검사를 위해 가장 널리 이용되고 있는 것은 임신진단에 사용되는 측면 흐름(lateral flow) 방식의 키트, 또는 혈당량 검사에 사용되는 전기화학 진단 키트 등이 있다. 그러나 이와 같이 작동이 쉽고 간단한 저전력 또는 무동력 키트는 검출 감도가 매우 낮고 대부분 정성적인 검사만 가능하다는 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 형태의 랩온어칩(lab-on-a-chip)들도 개발되고 있지만 구조가 복잡하거나 감도가 낮거나, 또는 신뢰성이 낮은 문제점을 가지고 있다.The most widely used for point-of-care testing is a lateral flow type kit used for pregnancy diagnosis, or an electrochemical diagnosis kit used for blood glucose level testing. However, such a simple and easy-to-operate low-power or non-powered kit has a limitation in that detection sensitivity is very low and only qualitative inspection is possible in most cases. To solve this problem, various types of lab-on-a-chips are also being developed, but have complex structures, low sensitivity, or low reliability.
자성입자(magnetic particle)는 스스로는 자성이 없으나 자기장 가운데 있을 때는 자성을 갖는 입자로, 자석을 이용하여 쉽게 모을 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점 때문에 자성입자는 단백질 또는 핵산의 분리, 면역분석, 바이오센서 등에서 고체상(solid phase)으로 널리 사용되고 있다.Magnetic particles are particles that are not magnetic by themselves but have magnetism when placed in a magnetic field, and have the advantage of being easily collected using a magnet. Because of these advantages, magnetic particles are widely used as a solid phase in separation of proteins or nucleic acids, immunoassays, biosensors, and the like.
자성입자를 고체상으로 사용할 때는, 자석으로 자성입자를 모은 후 자성입자에 결합하지 않은 물질을 제거하는 세척 과정이 필요하다. 지금까지 분리 및 세척을 위해 주로 두 가지 방법이 사용되었다. When the magnetic particles are used in a solid state, a washing process is required to remove substances not bound to the magnetic particles after collecting the magnetic particles with a magnet. So far, mainly two methods have been used for separation and washing.
첫 번째는 시료가 든 튜브 외부에 자기장을 가하여 튜브 내벽에 자성입자를 모으고 피펫으로 튜브 내에 포함된 용매를 제거한다. 다음으로 자석을 제거한 상태에서 피펫으로 세척용액을 취하여 튜브에 넣어주면 자성입자들이 분산된다. 이 두 과정을 반복함으로써 자성입자의 세척이 이루어진다.First, a magnetic field is applied to the outside of the tube containing the sample to collect magnetic particles on the inner wall of the tube, and the solvent contained in the tube is removed with a pipette. Next, when the cleaning solution is taken with a pipette while the magnet is removed and put into the tube, the magnetic particles are dispersed. By repeating these two processes, the magnetic particles are cleaned.
두 번째 방법으로는 플라스틱 플런저(plunger)를 씌운 자석을 시료에 담가 자성입자를 모은다. 다음으로 플런저가 씌워진 자석을 세척용액을 포함하는 다른 튜브로 옮긴 후 플런저로부터 자석을 빼내면 자성입자들이 분산된다. 이 과정을 반복함으로써 자성입자를 세척할 수 있다.In the second method, a magnet covered with a plastic plunger is immersed in the sample to collect magnetic particles. Next, the magnet covered with the plunger is moved to another tube containing a cleaning solution, and the magnetic particles are dispersed when the magnet is removed from the plunger. By repeating this process, the magnetic particles can be washed.
이 두 가지 방법 모두 손으로 수행할 경우에는 번거로울 뿐만 아니라 일정한 결과를 얻기 어렵다. 또한 이 두 가지 방법을 자동화된 장치에 적용할 경우 피펫(pipette)이나 자석을 이동시키는 액추에이터(actuator)들이 필요하기 때문에 장치가 커지고 가격이 비싸지는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 자성입자 세척장치 및 이를 이용한 자성입자 세척방법이 요구되고 있다.Both of these methods are cumbersome and difficult to obtain consistent results when performed by hand. In addition, when these two methods are applied to an automated device, there is a problem in that the device becomes large and expensive because actuators for moving a pipette or magnet are required. Therefore, there is a demand for a magnetic particle cleaning device and a magnetic particle cleaning method using the magnetic particle cleaning device to solve these problems.
이러한 문제점을 해결하기 위해 고체상으로 사용되는 자성입자를 이동함으로써 분석물질을 검출하는 방법이 제시되었었다(등록특허 10-1398764, 10-1608598, 10-1811134). 이 방법에 의하면 액체상을 이동시키는 대신 자성입자를 이동시키기 때문에 기존의 랩온어칩에 비해 구조가 더 단순하고 분석을 수행하는 장치도 간단한 장점이 있었다. 그러나 여전히 자성입자를 일정하게 이동시키기 위해 전기로 작동되는 구동장치를 사용해야 하는 단점이 있었다.In order to solve this problem, a method of detecting an analyte by moving magnetic particles used in a solid phase has been proposed (Patent Nos. 10-1398764, 10-1608598, and 10-1811134). According to this method, magnetic particles are moved instead of liquid phase, so the structure is simpler than the existing lab-on-a-chip, and the device for performing the analysis is simple. However, there is still a disadvantage in that an electrically operated driving device must be used to constantly move the magnetic particles.
본 발명은 자성입자를 사용하는 분석과정을 기기를 사용하지 않고 간편하게 수행할 수 있는 바이오칩과 이 바이오칩을 이용한 분석물질 검출 방법을 제공한다.The present invention provides a biochip capable of conveniently performing an analysis process using magnetic particles without using a device, and a method for detecting an analyte using the biochip.
상기 과제를 해결하기 위하여,In order to solve the above problem,
본 발명은 세척용액 주입구를 포함하는 세척용액 챔버(washing solution chamber); 외부로 열린 방출구(vent hole) 및 방출 채널(vent channel)을 포함하는 폐기 챔버(waste chamber); 및 시료 및 자성을 띄는 포획입자(capture particle)를 수용하기 위한 시료 챔버(sample chamber)를 포함하고, 상기 시료 챔버는 세척용액 챔버와 폐기 챔버 사이에 위치하며, 상기 포획입자를 포함하는 시료 혼합물의 주입을 위한 시료 주입구, 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(solution inlet), 및 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(solution outlet)를 포함하고, 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버(magnet chamber)를 포함하며, 상기 포획입자는 분석물질(analyte)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 입자인 자성입자 기반 바이오칩을 제공한다.The present invention includes a washing solution chamber including a washing solution inlet (washing solution chamber); a waste chamber including a vent hole and a vent channel that are open to the outside; and a sample chamber for accommodating a sample and magnetic capture particles, wherein the sample chamber is positioned between the washing solution chamber and the waste chamber, and contains the sample mixture containing the capture particles. It includes a sample inlet for injection, a solution inlet connected to the washing solution chamber, and a solution outlet connected to the waste chamber, and a magnet chamber at the bottom or top of the sample chamber. ), wherein the capture particle is a particle in which a receptor that specifically binds to an analyte is immobilized on a magnetic particle.
또한, 본 발명은 상기 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 시료 내 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 시료를 포획입자(capture particle) 및 표지시약(labeling agent)과 혼합하는 단계; 상기 혼합물과 세척용액을 각각 바이오칩의 시료 챔버와 세척용액 챔버에 주입하는 단계; 상기 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세워 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 흘러가도록 하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하는 단계; 및 상기 시료 챔버에 남아있는 표지시약의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to an analyte detection method for detecting an analyte in a sample using the magnetic particle-based biochip, comprising mixing the sample with a capture particle and a labeling agent; injecting the mixture and the washing solution into a sample chamber and a washing solution chamber of the biochip, respectively; standing the biochip so that the washing solution chamber faces above the waste chamber so that the washing solution flows through the sample chamber and into the waste chamber to remove substances not bound to the captured particles; and measuring the activity of a labeling reagent remaining in the sample chamber.
본 발명에 따른 바이오칩은 단순하여 제작이 쉽고 경제적인 장점이 있다. The biochip according to the present invention is simple, easy to manufacture, and economical.
또한, 본 발명에 따른 바이오칩은 기기를 사용하지 않고 자성입자를 세척할 수 있기 때문에 현장검사에 적용이 가능하다.In addition, since the biochip according to the present invention can clean magnetic particles without using a device, it can be applied to on-site inspection.
도 1(a) 및 도 1(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 도시한 도면이다.
도 2(a) 및 도 2(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면이다.
도 3(a) 내지 (c)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이다.
도 4(a) 및 도 4(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면이다.
도 5(a) 및 도 5(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이고, 도 5(c) 및 5(d)는 이에 따라 3D 프린터로 제작된 바이오칩의 사진이다.
도 6(a) 및 도 6(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 자성입자 포집 효율과 세척 효율을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 이용하여 바이러스 모방 입자를 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8(a) 내지 (e)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이다.
도 9(a) 및 도 9(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 설치되고 자석이 포함된 자성입자 기반 바이오칩의 사진이다.
도 10(a) 및 도 10(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 자성입자 포집 효율과 세척 효율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 제작한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 살모넬라균을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.1(a) and 1(b) are diagrams illustrating a magnetic particle-based biochip in which a sample chamber is disposed above a magnet chamber according to the present invention.
2(a) and 2(b) are views illustrating the principle of a detection method using a biochip based on magnetic particles in which a sample chamber is located above a magnet chamber according to the present invention.
3(a) to (c) are diagrams showing the structure of a biochip based on magnetic particles in which a sample chamber is located below a magnet chamber according to the present invention.
4(a) and 4(b) are views illustrating the principle of a detection method using a biochip based on magnetic particles in which a sample chamber is located below a magnet chamber according to the present invention.
5(a) and 5(b) are diagrams showing the structure of a magnetic particle-based biochip in which a sample chamber fabricated in an embodiment of the present invention is located above a magnet chamber, and FIGS. 5(c) and 5( d) is a photograph of the biochip fabricated by the 3D printer accordingly.
6(a) and 6(b) are graphs showing the results of evaluating the magnetic particle collection efficiency and cleaning efficiency of the magnetic particle-based biochip in which the sample chamber fabricated in one embodiment of the present invention is located above the magnet chamber. .
7 is a graph showing the results of detecting virus-mimetic particles using the structure of a magnetic particle-based biochip in which the sample chamber fabricated in one embodiment of the present invention is located above the magnet chamber.
8(a) to (e) are diagrams illustrating the structure of a biochip based on magnetic particles in which a sample chamber fabricated in an embodiment of the present invention is positioned below a magnet chamber.
9(a) and 9(b) are photographs of a magnetic particle-based biochip fabricated in an embodiment of the present invention, in which a sample chamber is installed under a magnet chamber and includes a magnet.
10(a) and 10(b) are graphs showing magnetic particle collection efficiency and cleaning efficiency of a magnetic particle-based biochip fabricated according to an embodiment of the present invention, wherein the sample chamber is located below the magnet chamber.
11 is a graph showing results of detecting Salmonella bacteria using a biochip based on magnetic particles in which a sample chamber is located below a magnet chamber manufactured in an embodiment of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Prior to this, the terms or words used in this specification and claims should not be construed as being limited to the usual or dictionary meaning, and the inventor appropriately uses the concept of the term in order to explain his/her invention in the best way. It should be interpreted as a meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention based on the principle that it can be defined.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.Therefore, since the embodiments described in this specification and the configurations shown in the drawings are only one of the most preferred embodiments of the present invention and do not represent all of the technical ideas of the present invention, various alternatives may be used at the time of this application. It should be understood that there may be equivalents and variations.
본 발명에서, “포함한다” 또는 “가지다” 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.In the present invention, terms such as “comprise” or “having” are intended to designate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification, but one or more other features It should be understood that the presence or addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof is not precluded.
본 발명에서는 기기를 사용하지 않고 간편하게 자성입자를 이용한 분석물질의 검출 과정을 수행하기 위해 중력을 이용하여 완충용액을 이동시키는 바이오칩을 고안하였다.In the present invention, a biochip that moves a buffer solution using gravity was devised in order to conveniently detect an analyte using magnetic particles without using a device.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 기반 바이오칩을 도시한 도면이다. 도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 기반 바이오칩(100)은 세척용액 주입구(111)를 포함하는 세척용액 챔버(washing solution chamber, 110); 외부로 열린 방출구(vent hole, 122) 및 방출 채널(vent channel, 121)을 포함하는 폐기 챔버(waste chamber, 120); 및 시료 및 자성을 띄는 포획입자(capture particle, 미도시)를 수용하기 위한 시료 챔버(sample chamber, 130)를 포함하고, 상기 시료 챔버는 세척용액 챔버와 폐기 챔버 사이에 위치하며, 상기 포획입자를 포함하는 시료 혼합물(미도시)의 주입을 위한 시료 주입구(131), 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(solution inlet, 132), 및 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(solution outlet, 133)를 포함하고, 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버(magnet chamber, 140)를 포함하며, 상기 포획입자는 분석물질(analyte, 미도시)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 입자인 것을 특징으로 한다.1 is a diagram illustrating a biochip based on magnetic particles according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, the magnetic particle-based
본 발명에 따른 자성입자 기반 바이오칩은 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버를 포함하고, 상기 자석 챔버는 자석을 포함할 수 있다.The magnetic particle-based biochip according to the present invention may include a magnet chamber below or above the sample chamber, and the magnet chamber may include a magnet.
또한, 본 발명에 따른 자성입자 기반 바이오칩의 시료 챔버의 일면은 투명한 창(window, 150)을 포함할 수 있다.In addition, one surface of the sample chamber of the magnetic particle-based biochip according to the present invention may include a
도 2는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면으로, 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 세웠을 때, 세척용액이 시료 챔버를 통해 폐기 챔버 측으로 이동하는 것을 특징으로 한다.2 is a view showing the principle of a detection method using a biochip based on magnetic particles in which a sample chamber is located on top of a magnet chamber according to the present invention. It is characterized in that it moves to the waste chamber side through.
이와 같이 세척용액 챔버에 세척용액(washing solution)을 주입하고 세척용액 챔버가 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세우면 중력에 의해 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 이동하면서 시료 챔버에 포집된 포획입자(220)를 세척한다(도 2(b)). 즉 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하게 되는 것이다. 이때 용액 출구의 단면적을 조절함으로써 세척용액의 흐름 속도를 조절할 수 있다. 상기 용액 출구는 단면적 1 mm2 이하의 크기로 설치될 수 있다.In this way, if the washing solution is injected into the washing solution chamber and the biochip is placed so that the washing solution chamber faces upward than the disposal chamber, the washing solution moves through the sample chamber and into the disposal chamber by gravity, and the captured particles are captured in the sample chamber. (220) is washed (FIG. 2(b)). That is, substances not bound to the capture particles are removed. At this time, the flow rate of the washing solution can be controlled by adjusting the cross-sectional area of the solution outlet. The solution outlet may have a cross-sectional area of 1 mm 2 or less.
본 발명에서 고안한 바이오칩에는 세척용액 챔버(110), 시료 챔버(130), 폐기 챔버(120)가 차례로 배열되어 있다(도 1(a)). 시료 챔버 하부에는 자석을 수용할 수 있는 자석 챔버(140)가 있고, 상기 시료 챔버는 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(132)를 포함하고, 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(133)를 포함한다(도 1(b)). In the biochip designed in the present invention, a
본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 기반 바이오칩은 자성입자를 이용하는 분석물질의 검출 방법에서 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체는 자성입자에 고정시킨 포획입자를 고체상으로 사용한다. 따라서 상기 포획입자는 분석물질에 대한 수용체를 자성입자에 고정시킨 입자이고, 상기 수용체는 분석물질과 직접 결합할 수 있다. 즉 포획입자는 분석물질을 포획하여 다른 불순물들로부터 분리하는 역할을 하는 것이다.In the magnetic particle-based biochip according to an embodiment of the present invention, in a method of detecting an analyte using magnetic particles, a receptor capable of specifically binding to an analyte uses capture particles immobilized on magnetic particles as a solid phase. Accordingly, the capture particle is a particle in which a receptor for an analyte is immobilized on a magnetic particle, and the receptor can directly bind to the analyte. That is, the capture particle serves to capture the analyte and separate it from other impurities.
본 발명에서 상기 분석물질(210)은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.In the present invention, the
본 발명에서 상기 자성입자에 고정되는 수용체는 상기 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체일 수 있다. 예를 들어, 상기 분석물질이 단백질, 유기 분자, 바이러스, 박테리아, 식물 세포 또는 동물 세포와 같이 항체가 형성될 수 있는 물질인 경우 각 분석물질에 대한 항체(antibody)를 수용체로 사용할 수 있다. 따라서, 분석물질이 항원일 경우 수용체는 항체가 될 수 있고, 반대로 분석물질이 항체일 경우 수용체는 항원이 될 수 있다. 다른 예로, 상기 분석물질이 렉틴(lectin)인 경우 탄수화물을 수용체로 사용할 수 있으며, 반대로 탄수화물을 포함하는 물질일 경우 상기 렉틴을 수용체로 사용할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 분석물질이 DNA 또는 RNA와 같은 핵산일 경우에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 또는 PNA(peptide nucleic acid)를 수용체로 사용할 수 있다. 그 외에도 핵산으로부터 얻어지는 앱타머(aptamer), 펩티드 문고로부터 얻어지는 펩티드 리간드, affibody 문고로부터 얻어지는 단백질 리간드 등 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 모두 수용체로 사용할 수 있다.In the present invention, the receptor immobilized on the magnetic particle may be a receptor capable of specifically binding to the analyte. For example, when the analyte is a substance capable of forming an antibody, such as a protein, organic molecule, virus, bacteria, plant cell, or animal cell, an antibody against each analyte may be used as a receptor. Accordingly, when the analyte is an antigen, the receptor may be an antibody, and conversely, when the analyte is an antibody, the receptor may be an antigen. As another example, when the analyte is a lectin, carbohydrate may be used as a receptor, and conversely, when the analyte is a substance containing carbohydrate, the lectin may be used as a receptor. As another example, when the analyte is a nucleic acid such as DNA or RNA, DNA or peptide nucleic acid (PNA) having a complementary nucleotide sequence may be used as a receptor. In addition, any substance that can specifically bind to an analyte, such as an aptamer obtained from nucleic acids, a peptide ligand obtained from a peptide library, and a protein ligand obtained from an affibody library, can be used as a receptor.
본 발명에서 상기 시료 혼합물(134)은 분석물질의 검출 시 포획입자 및 분석물질을 혼합하여 반응시키는 물질로서, 표지시약을 추가로 포함할 수 있다(도 4).In the present invention, the
본 발명에서 상기 표지시약(230)은 포획입자에 포획된 분석물질에 결합하여 분석물질의 양에 비례하는 신호를 생성하거나, 분석물질과 경쟁적으로 포획입자에 결합하여 분석물질의 양에 반비례하는 신호를 생성함으로써 분석물질을 정량적으로 검출할 수 있게 해준다(도 2).In the present invention, the
또한, 표지물질을 포함하는 비자성 입자에 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 고정시킨 표지입자(labeling particle, 231)를 표지시약으로 사용할 수도 있다(도 4). 표지입자에는 많은 양의 표지물질이 포함될 수 있어서 더 강한 신호를 생성할 수 있는 장점이 있다.In addition, a
상기 표지입자는 상기 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 입자로서, 박테리아와 같은 세포를 검출할 때 사용할 수 있는 분석시약이다. 상기 표지입자는 박테리아를 포함하는 시료 및 포획입자와 함께 혼합되면 상기 박테리아의 크기가 크기 때문에 한 개의 박테리아에 다수의 포획입자와 표지입자가 동시에 결합하게 될 수 있다.The labeled particle is a particle in which a receptor that specifically binds to the analyte and a labeling material are immobilized on non-magnetic particles, and is an analytical reagent that can be used to detect cells such as bacteria. When the marker particle is mixed with a sample containing bacteria and the capture particle, since the size of the bacteria is large, a plurality of capture particles and marker particles can be simultaneously bound to one bacterium.
상기 비자성 입자는 실리카 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리카보네이트 입자, 덱스트란(dextran) 입자, 유리 입자, 알루미나 입자, 금 입자, 은 입자, 팔라듐 입자, 백금 입자, 티아니아 입자, 지르고늄 입자 및 코어-쉘(core-shell) 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.The non-magnetic particles include silica particles, polystyrene particles, polycarbonate particles, dextran particles, glass particles, alumina particles, gold particles, silver particles, palladium particles, platinum particles, tiania particles, zirgonium particles, and core- It may include one or more materials selected from the group consisting of shell (core-shell) particles.
상기 표지시약은 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 표지입자(labeling particle), 상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체 및 상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나일 수 있다. The labeling reagent includes a labeling particle in which a receptor specifically binding to an analyte and a labeling material are immobilized on non-magnetic particles, a receptor-label complex in which the receptor and a labeling material are linked, and a labeling material and an analyte are linked. It may be a selected one of the analyte-label complexes.
상기 수용체-표지 복합체는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 표지물질과 연결할 수 있다. 포획입자와 표지시약은 동일한 수용체를 사용할 수도 있고 분석물질의 서로 다른 부위에 결합하는 다른 수용체를 사용할 수도 있다. The receptor-label complex may link a receptor capable of specifically binding to an analyte with a label. The capture particle and the labeling reagent may use the same receptor or may use different receptors that bind to different sites on the analyte.
상기 수용체-표지 복합체는 단백질과 같은 고분자의 검출 방법인 샌드위치 면역분석법(sandwich immunoassay)에서 사용할 수 있는 분석시약으로서, 상기 수용체와 표지물질이 연결되어 있는 복합체일 수 있다. 이 방법으로 단백질을 검출하는 경우, 포획입자에는 다른 항체가 고정될 수 있고, 상기 포획입자에 고정되는 항체를 포획항체(capture antibody)라고 하고, 표지물질과 연결되는 항체를 검출항체(detection antibody)라고 부른다. 샌드위치 면역분석법에서는 포획입자에 고정된 포획항체에 분석물질이 결합되고 다시 그 분석물질에 항체-표지 복합체가 결합되어 분석물질을 중심으로 샌드위치를 형성하게 될 수 있다.The receptor-label complex is an analytical reagent that can be used in a sandwich immunoassay, which is a method of detecting a polymer such as a protein, and may be a complex in which the receptor and the label are linked. When proteins are detected by this method, other antibodies may be immobilized on the capture particles, the antibody immobilized on the capture particles is called a capture antibody, and the antibody linked to the labeling material is called a detection antibody. It is called. In the sandwich immunoassay, an analyte is bound to a capture antibody immobilized on a capture particle, and an antibody-label complex is bound to the analyte again to form a sandwich around the analyte.
표지시약의 또 다른 예로는 분석물질을 표지물질(labeling material)과 연결한 분석물질-표지 복합체를 들 수 있다. 상기 분석물질-표지 복합체는 저분자 물질의 검출 방법인 경쟁적 면역분석법(competitive immunoassay)에서 사용할 수 있는 분석시약으로서, 분석물질에 표지물질(labeling material)이 연결되어 있는 복합체일 수 있다. 경쟁적 면역분석법에서는 시료에 있는 분석물질과 분석물질-표지 복합체가 포획입자에 경쟁적으로 결합하게 될 수 있다.Another example of a labeling reagent is an analyte-label complex in which an analyte is linked to a labeling material. The analyte-label complex is an assay reagent that can be used in a competitive immunoassay, which is a method for detecting small molecules, and may be a complex in which a labeling material is linked to an analyte. In a competitive immunoassay, the analyte and the analyte-label complex in the sample may be competitively bound to the capture particle.
상기 표지물질은 흡광 성질, 형광 성질, 발광 성질, 방사성, 촉매 활성 등 측정 가능한 신호를 발생할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질로는 기질에 반응을 일으켜 흡광 성질 또는 형광 성질을 갖는 생성물을 만들어 내거나, 빛을 발생시키거나, 또는 기체를 발생시킬 수 있는 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 또는 포스파타아제(phosphatase)와 같은 효소를 사용할 수 있다. 또한, 상기 표지물질로는 형광을 낼 수 있는 유기 형광 분자나 유로퓸 킬레이트(europium chelate)와 같은 형광 물질을 사용할 수 있다. 그 외에도 측정가능한 신호를 발생할 수 있는 물질은 모두 표지 물질로 사용할 수 있다.The labeling material may include a material capable of generating a measurable signal such as light absorption, fluorescence, light emission, radioactivity, and catalytic activity. For example, the labeling material may be catalase, peroxidase, or catalase capable of reacting with a substrate to produce a product having light absorption or fluorescence properties, generating light, or generating gas. Enzymes such as phosphatase can be used. In addition, as the labeling material, an organic fluorescent molecule capable of emitting fluorescence or a fluorescent material such as europium chelate may be used. In addition, any substance capable of generating a measurable signal can be used as a labeling substance.
본 발명에서 폐기 챔버에는 방출구(vent hole)를 통해 외부로 열린 방출 채널(vent channel)이 설치되어 있어 세척용액이 폐기 챔버로 이동할 때 압력이 걸리지 않고 원활하게 이동하게 해준다(도 1). In the present invention, a vent channel opened to the outside through a vent hole is installed in the waste chamber, so that the cleaning solution moves smoothly without applying pressure when moving into the waste chamber (FIG. 1).
또한, 시료 챔버에 포집된 포획입자에 결합한 표지시약의 신호를 측정하여 분석물질을 검출할 수 있다. 색깔이나 형광과 같은 광학 신호의 측정이 가능하도록 시료 챔버의 상부에는 투명한 창을 포함할 수 있다.In addition, the analyte can be detected by measuring the signal of the labeling reagent bound to the capture particles collected in the sample chamber. A transparent window may be included in an upper portion of the sample chamber to enable measurement of an optical signal such as color or fluorescence.
세척용액 챔버 상부에는 세척용액 주입을 위한 세척용액 주입구(washing solution injection hole)를 포함할 수 있고, 시료 챔버 상부에는 시료 주입을 위한 시료 주입구(sample injection hole)를 포함할 수 있다(도 1). A washing solution injection hole for injecting a washing solution may be included in the upper part of the washing solution chamber, and a sample injection hole for injecting a sample may be included in the upper part of the sample chamber (FIG. 1).
상기 세척용액은 트리톤(Triton) X-100, Tween-20, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(NP-40)와 같은 계면 활성제를 포함시킬 수 있다. The washing solution may include a surfactant such as Triton X-100, Tween-20, or polyoxyethylene nonylphenyl ether (NP-40).
도 3과 같이 시료 챔버를 자석 챔버의 상부에 설치하는 대신 자석 챔버의 하부에 설치할 수도 있다. 이 바이오칩은 구조는 좀 더 복잡하지만, 다음과 같은 두 가지 장점이 있다.As shown in FIG. 3 , instead of installing the sample chamber above the magnet chamber, it may be installed below the magnet chamber. This biochip has a more complex structure, but has two advantages:
첫째, 시료 혼합물을 시료 챔버에 주입할 때 자기장과 중력이 서로 반대 방향으로 작용하기 때문에 자성입자가 포집되는 면에 불순물의 비특이적 흡착을 줄일 수 있다. 즉 물에 용해되지 않은 입자 상태의 불순물은 중력에 의해 밑에 가라앉고 포획입자에 결합한 물질들만 시료 챔버의 위쪽 면, 즉 자석이 설치된 면에 포집되기 때문이다. First, since the magnetic field and gravity act in opposite directions when the sample mixture is injected into the sample chamber, non-specific adsorption of impurities to the surface on which magnetic particles are collected can be reduced. That is, impurities in particulate state that are not dissolved in water sink to the bottom by gravity, and only substances bound to the captured particles are collected on the upper surface of the sample chamber, that is, the surface where the magnet is installed.
둘째, 세척용액 챔버가 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세울 때 세척용액이 흘러가는 경로가 자성입자가 포집되는 면을 세척하는데 더 유리하다(도 4(a)). 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 바이오칩에서는 용액 입구로 들어간 세척용액이 일직선으로 진행하여 시료 챔버 상부를 지나가기 때문에 시료 챔버 바닥 면에 있는 불순물들은 확산에 의해 세척용액으로 이동해야 한다. 그러나 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 바이오칩에서는 세척용액의 방향이 꺾이면서 시료 챔버 전체를 휩쓸고 지나가게 된다(도 4(b)). Second, when the biochip is erected so that the cleaning solution chamber faces upward than the disposal chamber, the path through which the cleaning solution flows is more advantageous for cleaning the surface where the magnetic particles are collected (FIG. 4(a)). In a biochip in which the sample chamber is located above the magnet chamber, since the cleaning solution entering the solution inlet travels in a straight line and passes through the top of the sample chamber, impurities on the bottom surface of the sample chamber must move to the cleaning solution by diffusion. However, in the biochip where the sample chamber is located below the magnet chamber, the direction of the cleaning solution is bent and sweeps through the entire sample chamber (FIG. 4(b)).
시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 있는 바이오칩에서는 시료 챔버의 아랫면에 광학 신호 측정을 위해 투명한 창을 설치할 수 있다(도 3(c)).In a biochip in which the sample chamber is below the magnet chamber, a transparent window may be installed on the lower surface of the sample chamber for optical signal measurement (FIG. 3(c)).
또한, 본 발명은 상기 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 시료 내 분석물질을 검출하는 분석물질의 검출방법에 관한 것으로, 일 실시예에서, 시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계; 상기 혼합물과 세척용액을 각각 바이오칩의 시료 챔버와 세척용액 챔버에 주입하는 단계; 상기 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세워 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 흘러가도록 하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하는 단계; 및 상기 시료 챔버에 남아있는 표지시약의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for detecting an analyte in a sample by using the magnetic particle-based biochip. In one embodiment, mixing the sample with a capture particle and a labeling reagent; injecting the mixture and the washing solution into a sample chamber and a washing solution chamber of the biochip, respectively; standing the biochip so that the washing solution chamber faces above the waste chamber so that the washing solution flows through the sample chamber and into the waste chamber to remove substances not bound to the captured particles; and measuring the activity of a labeling reagent remaining in the sample chamber.
상기 분석물질의 검출방법은, 전술한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 분석물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 후술하는 검출장치 및 검출장치에 사용되는 분석물질, 포획입자, 표지시약 등의 물질들에 대한 구체적인 사항은 자성입자 기반 바이오칩(100)에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.The method for detecting an analyte relates to a method for detecting an analyte using the above-described magnetic particle-based biochip. Accordingly, the details described for the magnetic particle-based
시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계에서 자석 챔버에 자석이 포함된 상태로 제작된 바이오칩에서 수행할 경우, 자석에 의해 포획입자가 포집되어 포획입자와 분석물질의 결합이 방해를 받을 수 있다. 따라서 상기 시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계는 별도의 튜브에서 진행하고, 그 혼합물을 바이오칩에 주입하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거할 수 있다. 이때 포획입자는 시료 챔버 내에서 자석이 설치된 면에 포집된다(도 2(a)).In the step of mixing the sample with the capture particle and the labeling reagent, if the sample is mixed with a magnet in the magnet chamber, the capture particle may be captured by the magnet and the binding between the capture particle and the analyte may be hindered. . Accordingly, the step of mixing the sample with the capture particle and the labeling reagent may be performed in a separate tube, and substances not bound to the capture particle may be removed by injecting the mixture into the biochip. At this time, the captured particles are collected on the surface where the magnet is installed in the sample chamber (FIG. 2(a)).
반면, 자석이 포함되지 않은 상태로 제작된 바이오칩에서는 상기 시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계부터 수행할 수 있다. 즉 분석물질이 포함된 시료, 포획입자 및 표지시약을 시료 챔버에 넣어 결합반응을 수행한 후, 자석 챔버에 자석을 삽입하여 포획입자를 포집할 수 있다.On the other hand, in a biochip manufactured without a magnet, the step of mixing the sample with the capture particle and the labeling reagent may be performed. That is, after putting the sample containing the analyte, the capture particle, and the labeling reagent into the sample chamber to perform a binding reaction, the capture particle may be captured by inserting a magnet into the magnet chamber.
시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 바이오칩에서 포획입자를 포집할 때, 시료 혼합물을 시료 챔버에 주입한 후 바이오칩을 뒤집어 주면, 자기장과 중력이 서로 반대 방향으로 작용하기 때문에 자성입자가 포집되는 면에 불순물의 비특이적 흡착을 줄일 수 있다. 또한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치하고 자석이 상부에 있는 상태에서는 물에 용해되지 않은 입자 상태의 불순물은 중력에 의해 밑에 가라앉고 포획입자에 결합한 물질들만 위쪽 면, 즉 자석이 설치된 면에 포집된다. When the sample chamber collects captured particles from the biochip located on top of the magnet chamber, when the sample mixture is injected into the sample chamber and the biochip is turned over, the magnetic field and gravity act in opposite directions to the surface where the magnetic particles are captured. Non-specific adsorption of impurities can be reduced. In addition, when the sample chamber is located at the bottom of the magnet chamber and the magnet is at the top, impurities in particle state that are not dissolved in water sink to the bottom by gravity, and only substances bound to the captured particles are collected on the upper surface, that is, the surface where the magnet is installed. do.
이와 같이 세척용액 챔버에 세척용액(washing solution)을 주입하고 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세우면 중력에 의해 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 이동하면서 시료 챔버에 포집된 포획입자를 세척한다(도 2(b)). 즉 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하게 되는 것이다. 이때 용액 출구의 단면적을 조절함으로써 세척용액의 흐름 속도를 조절할 수 있다. 상기 용액 출구는 단면적 1 mm2 이하의 크기로 설치될 수 있다.In this way, when the washing solution is injected into the washing solution chamber and the biochip is placed with the washing solution chamber facing upward, the washing solution moves through the sample chamber and into the disposal chamber by gravity, washing the captured particles collected in the sample chamber. (Fig. 2(b)). That is, substances not bound to the capture particles are removed. At this time, the flow rate of the washing solution can be controlled by adjusting the cross-sectional area of the solution outlet. The solution outlet may have a cross-sectional area of 1 mm 2 or less.
폐기 챔버에는 방출구(vent hole)를 통해 외부로 열린 방출 채널(vent channel)이 설치되어 있어 세척용액이 폐기 챔버로 이동할 때 압력이 걸리지 않고 원활하게 이동하게 해준다(도 1). A vent channel is installed in the waste chamber, which is opened to the outside through a vent hole, so that the cleaning solution moves smoothly without applying pressure when moving into the waste chamber (FIG. 1).
마지막으로 시료 챔버에 포집된 포획입자에 결합한 표지시약의 신호를 측정하는 단계를 수행함으로써 분석물질을 검출할 수 있다. 색깔이나 형광과 같은 광학 신호의 측정이 가능하도록 시료 챔버의 상부에는 투명한 창을 설치할 수 있다.Finally, the analyte can be detected by performing a step of measuring the signal of the labeling reagent bound to the capture particles collected in the sample chamber. A transparent window may be installed at the top of the sample chamber to allow measurement of optical signals such as color or fluorescence.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples and the like according to the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the examples presented below.
<실시예><Example>
실시예 1. 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 있는 바이오칩을 사용하여 바이러스 모방 입자 검출Example 1. Detection of virus mimetic particles using a biochip in which the sample chamber is on top of the magnet chamber
본 실시예에서는 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 있는 바이오칩을 제작하여 바이러스 모방 입자를 검출하였다. In this example, a biochip with a sample chamber on top of a magnet chamber was fabricated to detect virus-mimetic particles.
바이오칩의 본체는 Fusion360(Autodesk) 프로그램을 이용하여 설계한 후 3D 프린터로 제작했다. 도 5(a) 및 도 5(b)는 설계한 바이오칩을 바르게 눕혔을 때와 뒤집었을 때의 도면이고, 도 5(c)와 도 5(d)는 3D 프린터로 제작한 바이오칩을 바르게 눕혔을 때와 뒤집었을 때의 사진이다. 바이오칩의 윗면은 투명한 실리콘 테이프를 붙여 밀폐시켰다.The main body of the biochip was designed using the Fusion360 (Autodesk) program and then produced with a 3D printer. 5(a) and 5(b) are drawings of the designed biochip when it is laid correctly and when it is turned over, and FIGS. 5(c) and 5(d) are views when the biochip manufactured by the 3D printer is laid down This is a picture of when and when it was turned over. The upper surface of the biochip was sealed with transparent silicon tape.
바이오칩의 포집 성능을 확인하기 위해 자성입자에 유로퓸(europium)으로 표지된 자성입자(Eu-MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)를 사용하였다. 튜브에서 PBS-TB(0.1% Tween-20, 0.25% BSA in PBS) 195 μL와 2 mg/mL Eu-MP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광을 측정하였다(excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm). 측정이 끝난 후 세척용액 챔버에 PBS-T(0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써 자성입자 포집 효율을 평가하였다. 그 결과 도 6(a)와 같이 세척 이후에 약 82%의 자성입자가 포집되어 있는 것을 확인할 수 있었다.To confirm the collection performance of the biochip, magnetic particles labeled with europium (Eu-MP, diameter 300 nm, Amo Lifescience, Korea) were used as magnetic particles. After mixing 195 μL of PBS-TB (0.1% Tween-20, 0.25% BSA in PBS) and 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL Eu-MP in a tube, inject it into the sample chamber of the biochip equipped with a magnet for 5 minutes. captured. The fluorescence of the captured Eu-MP was measured using a microplate reader (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm). After the measurement, 4.5 mL of PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) was injected into the washing solution chamber, and the biochip was erected so that the washing solution chamber faced upward so that PBS-T flowed into the waste chamber. After washing, the fluorescence remaining in the sample chamber was measured and compared with the fluorescence value before washing to evaluate the magnetic particle collection efficiency. As a result, as shown in FIG. 6 (a), it was confirmed that about 82% of the magnetic particles were collected after washing.
다음으로 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)와 자성이 없는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 바이오칩의 세척 효율을 평가하였다.Next, magnetic particles (MP, diameter 300 nm, Amo Lifescience, Korea) and non-magnetic Europium fluorescent particles (Eu-FP, diameter 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were used to form biochips. Washing efficiency was evaluated.
튜브에서 PBS-TB 190 μL, 2 mg/mL MP 5 μL(10 μg), 2 mg/mL Eu-FP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광(excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm)을 측정한 후, 세척용액 챔버에 PBS-T(0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써, MP에 결합하지 않은 Eu-FP가 제거되는 효율을 평가하였다. 그 결과 도 6(b)와 같이 세척 이후에 97.7%의 Eu-FP가 제거된 것을 확인할 수 있었다.After mixing 190 μL of PBS-TB, 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL MP, and 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL Eu-FP in a tube, it was injected into the sample chamber of the biochip equipped with a magnet and collected for 5 minutes. did After measuring the fluorescence (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm) of the captured Eu-MP using a microplate reader, 4.5 mL of PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) was injected into the washing solution chamber. , the biochip was placed with the wash chamber facing up, allowing PBS-T to flow into the waste chamber. The fluorescence remaining in the sample chamber after washing was measured and compared with the fluorescence value before washing to evaluate the removal efficiency of Eu-FP not bound to MP. As a result, it was confirmed that 97.7% of Eu-FP was removed after washing, as shown in FIG. 6(b).
바이러스 모방입자(virus-mimicking particle, VMP)는 카복실기로 기능화되어있는 실리카 나노입자(SNP, 직경 100 nm, Microspheres-Nanospheres, New York, NY, USA)에 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)를 이용해 토끼의 면역글로불린 G(IgG)를 고정시켜 제조하였다. Virus-mimicking particle (VMP) is 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) in silica nanoparticles (SNP,
바이러스 모방입자를 포획할 수 있는 포획입자(VMP-CP)는 카복실기로 기능화되어있는 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)에 EDC를 이용해 염소에서 생성된 이차항체(anti-rabbit immunoglobulin G antibody)를 고정시켜 제조하였다. The capture particle (VMP-CP) capable of capturing the virus mimic particle is a secondary antibody (anti-rabbit immunoglobulin G antibody) was prepared by immobilization.
바이러스 모방입자 검출에 사용할 표지입자(VMP-LP)는 카복실기로 기능화되어있는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 EDC를 이용해 염소에서 생성된 이차항체(anti-rabbit immunoglobulin G antibody)를 고정시켜 제조하였다. The marker particle (VMP-LP) to be used for detecting virus mimic particles is a carboxyl group-functionalized Europium fluorescent particle (Eu-FP, diameter 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) in goats using EDC. It was prepared by immobilizing the generated secondary antibody (anti-rabbit immunoglobulin G antibody).
위와 같이 제조한 세 종류 입자를 이용하여 바이오칩의 검출 효율을 평가하였다. VMP를 8.7×103∼107 개/mL의 농도로 묽혀주었다. 튜브에서 PBS-TB 90 μL, 2 mg/mL VMP-CP 5 μL(10 μg), VMP-LP 5 μL(10 μg), 서로 다른 농도로 묽힌 VMP 100 μL를 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 음성 대조군은 VMP 대신 PBS-TB 100 μL를 주입하여 반응시켰다. 반응물을 바이오칩의 시료 챔버에 넣고 시료 주입구를 테이프로 막은 후. 바이오칩을 뒤집은 상태에서 2분간 포획입자를 포집하였다. The detection efficiency of the biochip was evaluated using the three types of particles prepared as above. VMP was diluted to a concentration of 8.7×10 3 to 10 7 /mL. In a tube, 90 μL of PBS-TB, 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL VMP-CP, 5 μL (10 μg) of VMP-LP, and 100 μL of VMP diluted in different concentrations were mixed and reacted at room temperature for 10 minutes. Negative control was reacted by injecting 100 μL of PBS-TB instead of VMP. After putting the reactants into the sample chamber of the biochip and covering the sample inlet with tape. The captured particles were collected for 2 minutes while the biochip was turned over.
바이오칩을 다시 뒤집어 PBS-T 4.5 mL를 세척용액 챔버에 넣고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척이 끝난 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 시료 챔버에 남아있는 VMP-LP의 형광을 측정하였다. 그 결과 도 7과 같이 8.7×103∼107 개/mL 구간에서 VMP 수에 비례하여 형광이 증가하였고 최저 검출 한계(LOD)는 11개였다.The biochip was turned over again and 4.5 mL of PBS-T was put into the washing solution chamber, and the biochip was erected so that the washing solution chamber was facing up so that the PBS-T flowed into the waste chamber. After washing, the fluorescence of VMP-LP remaining in the sample chamber was measured using a microplate reader. As a result, as shown in FIG. 7, fluorescence increased in proportion to the number of VMPs in the range of 8.7×10 3 to 10 7 /mL, and the lowest limit of detection (LOD) was 11.
실시예 2. 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 있는 바이오칩을 사용하여 살모넬라균 검출Example 2. Detection of Salmonella using a biochip in which the sample chamber is at the bottom of the magnet chamber
본 실시예에서는 시료 챔버가 자석챔버의 하부에 있는 바이오칩을 제작하여 살모넬라균을 검출하였다. In this embodiment, Salmonella was detected by fabricating a biochip in which the sample chamber is located below the magnet chamber.
바이오칩의 본체는 Fusion360(Autodesk) 프로그램을 이용하여 설계한 후 3D 프린터로 제작했다. 도 8(a) 및 도 8(b)는 설계한 바이오칩 본체에 자석 챔버 모듈을 삽입하기 전과 삽입한 후의 도면이고, 도 8(c)는 바이오 칩 윗면에 투명한 실리콘 테이프를 붙여 밀폐시킨 도면이며, 도 8(d)는 바이오칩을 뒤집었을 때의 도면, 도 8(e)는 뒤집어진 바이오칩에 창을 설치한 도면이다. 도 9(a) 및 도 9(b)는 3D 프린터로 제작하여 자석을 삽입한 바이오칩을 바르게 눕혔을 때와 뒤집었을 때의 사진이다. The main body of the biochip was designed using the Fusion360 (Autodesk) program and then produced with a 3D printer. 8(a) and 8(b) are views before and after inserting the magnet chamber module into the designed biochip main body, and FIG. 8(c) is a view showing the upper surface of the biochip sealed with transparent silicon tape, FIG. 8(d) is a view when the biochip is turned over, and FIG. 8(e) is a view where a window is installed on the turned over biochip. 9(a) and 9(b) are photographs of a biochip fabricated by a 3D printer and inserting a magnet, when the biochip is laid upright and turned over.
바이오칩의 포집 성능을 확인하기 위해 자성입자에 유로퓸(europium)으로 표지된 자성입자(Eu-MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)를 사용하였다. 튜브에서 PBS-TB 195 μL와 2 mg/mL Eu-MP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광(excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm)을 측정한 후, 세척용액 챔버에 PBS-T(0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써 자성입자 포집 효율을 평가하였다. 그 결과 도 10(a)와 같이 세척 이후에 100%의 자성입자가 포집되어 있는 것을 확인할 수 있었다.To confirm the collection performance of the biochip, magnetic particles labeled with europium (Eu-MP, diameter 300 nm, Amo Lifescience, Korea) were used as magnetic particles. In a tube, 195 μL of PBS-TB and 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL Eu-MP were mixed, injected into the sample chamber of the biochip equipped with a magnet, and collected for 5 minutes. After measuring the fluorescence (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm) of the captured Eu-MP using a microplate reader, PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 After injecting mL, PBS-T was allowed to flow into the waste chamber by standing the biochip with the wash chamber facing up. After washing, the fluorescence remaining in the sample chamber was measured and compared with the fluorescence value before washing to evaluate the magnetic particle collection efficiency. As a result, as shown in FIG. 10 (a), it was confirmed that 100% of the magnetic particles were collected after washing.
다음으로 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)와 자성이 없는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 바이오칩의 세척 효율을 평가하였다.Next, magnetic particles (MP, diameter 300 nm, Amo Lifescience, Korea) and non-magnetic Europium fluorescent particles (Eu-FP, diameter 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were used to form biochips. Washing efficiency was evaluated.
튜브에서 PBS-TB 190 μL, 2 mg/mL MP 5 μL(10 μg), 2 mg/mL Eu-FP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광을 측정한 후, 세척용액 챔버에 PBS-T 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써, MP에 결합하지 않은 Eu-FP가 제거되는 효율을 평가하였다. 그 결과 도 10(b)와 같이 세척 이후에 99% 이상의 Eu-FP가 제거된 것을 확인할 수 있었다.After mixing 190 μL of PBS-TB, 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL MP, and 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL Eu-FP in a tube, it was injected into the sample chamber of the biochip equipped with a magnet and collected for 5 minutes. did After measuring the fluorescence of the collected Eu-MP using a microplate reader, 4.5 mL of PBS-T was injected into the washing solution chamber, and the biochip was erected with the washing solution chamber facing upward so that PBS-T It was allowed to flow into the waste chamber. The fluorescence remaining in the sample chamber after washing was measured and compared with the fluorescence value before washing to evaluate the removal efficiency of Eu-FP not bound to MP. As a result, as shown in FIG. 10 (b), it was confirmed that more than 99% of Eu-FP was removed after washing.
살모넬라균을 포획할 수 있는 포획입자(ST-CP)는 카복실기로 기능화 되어있는 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)에 EDC를 이용해 토끼에서 생성된 살모넬라균 항체(anti-S. typhimurium antibody)를 고정시켜 제조하였다. The capture particle (ST-CP) capable of capturing Salmonella is a Salmonella antibody (anti- S. typhimurium antibody) was fixed.
살모넬라균 검출에 사용할 표지입자(ST-LP)는 카복실기로 기능화 되어있는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 EDC를 이용해 토끼에서 생성된 살모넬라균 항체(anti-S. typhimurium antibody)를 고정시켜 제조하였다. The labeling particles (ST-LP) to be used for detection of Salmonella are produced in rabbits using EDC on Europium fluorescent particles (Eu-FP, diameter 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) functionalized with a carboxyl group. It was prepared by immobilizing an anti- S. typhimurium antibody.
위와 같이 제조한 입자들을 이용하여 바이오칩에서 살모넬라균 검출 효율을 평가하였다. 살모넬라균은 102∼107 CFU/mL의 농도로 묽혀주었다. 튜브에서 PBS-TB 90 μL, 2 mg/mL ST-CP 5 μL(10 μg), ST-LP 5 μL(10 μg), 서로 다른 농도로 묽힌 살모넬라균 100 μL를 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 음성 대조군은 살모넬라균 대신 PBS-TB 100 μL를 주입하여 반응시켰다. 반응물을 바이오칩의 시료 챔버에 넣고 2분간 포획입자를 포집하였다. 세척용액 챔버에 PBS-T 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. The efficiency of Salmonella detection in the biochip was evaluated using the particles prepared as above. Salmonella was diluted to a concentration of 10 2 to 10 7 CFU/mL. In a tube, 90 μL of PBS-TB, 5 μL (10 μg) of 2 mg/mL ST-CP, 5 μL (10 μg) of ST-LP, and 100 μL of Salmonella at different concentrations were mixed and reacted at room temperature for 10 minutes. . As a negative control group, 100 μL of PBS-TB was injected instead of Salmonella. The reactants were placed in the sample chamber of the biochip and the captured particles were collected for 2 minutes. 4.5 mL of PBS-T was injected into the washing solution chamber, and the biochip was erected so that the washing solution chamber faced upward so that the PBS-T flowed into the waste chamber.
세척이 끝난 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 시료 챔버에 남아있는 ST-LP의 형광을 측정하였다. 그 결과 도 11과 같이 102∼107 CFU/mL 구간에서 살모넬라 수에 비례하여 형광이 증가하였고 최저 검출 한계(LOD)는 2.6 CFU였다.After washing, the fluorescence of ST-LP remaining in the sample chamber was measured using a microplate reader. As a result, as shown in FIG. 11 , fluorescence increased in proportion to the number of Salmonella in the range of 10 2 to 10 7 CFU/mL, and the lowest limit of detection (LOD) was 2.6 CFU.
100: 자성입자 기반 바이오칩
110: 세척용액 챔버
111: 세척용액 주입구
112: 세척 용액
120: 폐기 챔버
121: 방출 채널
122: 방출구
130: 시료 챔버
131: 시료 주입구
132: 용액 입구
133: 용액 출구
134: 시료 혼합물
140: 자석 챔버
141: 자석
150: 창
160: 커버
210: 분석물질
220: 포획입자
230: 표지시약
231: 표지입자100: magnetic particle-based biochip 110: cleaning solution chamber
111: washing solution inlet 112: washing solution
120
122: outlet 130: sample chamber
131: sample inlet 132: solution inlet
133: solution outlet 134: sample mixture
140: magnet chamber 141: magnet
150: window 160: cover
210: analyte 220: capture particle
230: labeling reagent 231: labeling particle
Claims (13)
외부로 열린 방출구(vent hole) 및 방출 채널(vent channel)을 포함하는 폐기 챔버(waste chamber); 및
시료 및 자성을 띄는 포획입자(capture particle)를 수용하기 위한 시료 챔버(sample chamber)를 포함하고,
상기 시료 챔버는 세척용액 챔버와 폐기 챔버 사이에 위치하며, 상기 포획입자를 포함하는 시료 혼합물의 주입을 위한 시료 주입구, 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(solution inlet), 및 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(solution outlet)를 포함하고, 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버(magnet chamber)를 포함하며,
상기 포획입자는 분석물질(analyte)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 입자인, 자성입자 기반 바이오칩.
a washing solution chamber including a washing solution inlet;
a waste chamber including a vent hole and a vent channel that are open to the outside; and
A sample chamber for accommodating a sample and magnetic capture particles;
The sample chamber is located between the cleaning solution chamber and the disposal chamber, and includes a sample inlet for injecting the sample mixture including the captured particles, a solution inlet connected to the cleaning solution chamber, and connected to the disposal chamber. A solution outlet is included, and a magnet chamber is included at the bottom or top of the sample chamber,
The capture particle is a magnetic particle-based biochip in which a receptor that specifically binds to an analyte is immobilized on a magnetic particle.
세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 세웠을 때, 세척용액이 시료 챔버를 통해 폐기챔버 측으로 이동하는 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
A biochip based on magnetic particles in which the cleaning solution moves toward the waste chamber side through the sample chamber when the washing solution chamber is placed facing upward from the waste chamber.
상기 용액 출구는 단면적 1 mm2 이하의 크기인, 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
The solution outlet has a cross-sectional area of 1 mm 2 or less, the magnetic particle-based biochip.
상기 자석 챔버에 자석이 설치되어 있는 것을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
A magnetic particle-based biochip comprising a magnet installed in the magnet chamber.
상기 분석물질은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
The magnetic particle-based biochip comprising at least one analyte selected from the group consisting of cells, viruses, bacteria, proteins, nucleic acids, carbohydrates, organic molecules, and metal ions.
상기 포획입자는 분석물질에 대한 수용체(receptor)를 자성입자에 고정시킨 입자이고,
상기 수용체는 분석물질과 직접 결합할 수 있는 것인, 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
The capture particle is a particle in which a receptor for an analyte is immobilized on a magnetic particle,
The receptor is capable of directly binding to an analyte, a magnetic particle-based biochip.
상기 시료 혼합물은 표지시약을 추가로 포함하는 것인, 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
The sample mixture further comprises a labeling reagent, the magnetic particle-based biochip.
상기 표지시약은 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 표지입자,
상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체, 및
상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나이고,
상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사성 물질을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 7,
The labeling reagent includes a receptor that specifically binds to the analyte and label particles in which the label is immobilized on non-magnetic particles;
A receptor-labeled complex in which the receptor and the labeling substance are linked, and
one selected from analyte-label complexes in which the label and the analyte are linked;
The labeling material is a magnetic particle-based biochip containing an enzyme, a fluorescent material or a radioactive material.
상기 시료 챔버의 일면은 투명한 창(window)을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
According to claim 1,
One surface of the sample chamber is a magnetic particle-based biochip including a transparent window.
시료를 포획입자(capture particle) 및 표지시약(labeling agent)과 혼합하는 단계;
상기 혼합물과 세척용액을 각각 바이오칩의 시료 챔버와 세척용액 챔버에 주입하는 단계;
상기 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세워 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 흘러가도록 하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하는 단계; 및
상기 시료 챔버에 남아있는 표지시약의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법.
It relates to a method for detecting an analyte in a sample using the magnetic particle-based biochip according to claim 1,
mixing the sample with a capture particle and a labeling agent;
injecting the mixture and the washing solution into a sample chamber and a washing solution chamber of the biochip, respectively;
standing the biochip so that the washing solution chamber faces above the waste chamber so that the washing solution flows through the sample chamber and into the waste chamber to remove substances not bound to the captured particles; and
A method of detecting an analyte in a sample comprising measuring the activity of a labeling reagent remaining in the sample chamber.
상기 분석물질은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자, 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법.
According to claim 10,
The method of detecting an analyte in a sample comprising at least one selected from the group consisting of cells, viruses, bacteria, proteins, nucleic acids, carbohydrates, organic molecules, and metal ions.
상기 포획입자는 분석물질에 대한 수용체를 자성입자에 고정시킨 입자이고,
상기 수용체는 분석물질과 직접 결합할 수 있는 것인 시료 내 분석물질의 검출방법.
According to claim 10,
The capture particle is a particle in which a receptor for an analyte is immobilized on a magnetic particle,
The method of detecting an analyte in a sample, wherein the receptor can directly bind to the analyte.
상기 표지시약은 표지물질(labeling material)과 분석물질에 대한 수용체를 비자성 입자에 고정시킨 표지입자,
상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체, 및
상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나이고,
상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사성 물질을 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법.
According to claim 10,
The labeling reagent includes labeled particles in which a labeling material and a receptor for an analyte are immobilized on non-magnetic particles;
A receptor-labeled complex in which the receptor and the labeling substance are linked, and
one selected from analyte-label complexes in which the label and the analyte are linked;
The method of detecting an analyte in a sample containing an enzyme, a fluorescent material or a radioactive material.
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