KR102378634B1 - Rapid immunodiagnostic method - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신속 면역 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 반응용액을 제1 마이크로튜브 내에 준비하는 단계(S10); 상기 반응용액의 소정 측정영역에서 기준 형광을 측정하는 단계(S20); 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리하는 단계(S30); 및 잔존 형광을 측정하는 단계(S40)를 포함하는 신속 면역 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 신속 면역 진단 방법은 상기 S40단계 이후에, 분리된 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 표적물질이 존재하지 않는 제2 마이크로튜브로 이동시켜 형광을 측정하는 단계(S50)를 더 포함할 수 있다.The present invention relates to a rapid immunodiagnostic method, and more particularly, to a method comprising: preparing a reaction solution in a first microtube (S10); measuring a reference fluorescence in a predetermined measurement area of the reaction solution (S20); separating the target material bound to the magnetic particles by moving it to an area other than the measurement area of the reaction solution (S30); and measuring the residual fluorescence (S40). In addition, the rapid immunodiagnostic method of the present invention further comprises the step (S50) of measuring fluorescence by moving the target material bound to the separated magnetic particles into a second microtube in which the target material is not present after the step S40. can do.
Description
본 발명은 신속 면역 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신속하게 고감도로 표적(타겟) 물질을 면역진단으로 정량분석할 수 있는 신속 면역 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a rapid immunodiagnostic method, and more particularly, to a rapid immunodiagnostic method capable of quantitatively analyzing a target (target) material quickly and with high sensitivity through immunodiagnosis.
면역분석법(immunoassay)이란 시료의 분석과정에서 항체를 이용하는 기술을 의미한다. 초기에는 연구자들이 주로 단백질의 정량적 검출 및 분석을 위하여 면역분석법을 사용하였으나, 최근에는 항체기술의 발전으로 저분자 화합물, 탄수화물, 지질 등의 분석 및 각종 미생물의 분석에도 활용하고 있다. 면역분석법은 그 검출 원리 및 방법에 따라 방사성 동위원소를 사용하여 신호를 검출하는 방사면역분석법(RIA: radioimmunoassay), 효소에 의한 신호 증폭을 사용하는 효소면역측정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay, 혹은 EIA: enzyme immunoassay), 형광을 이용하여 검출하는 형광항체법(FA: fluorescence antibody technique), 화학발광을 사용하는 화학발광면역측정법(CLIA: chemiluminescence immunoassay) 등으로 나눌 수 있으며, 그 밖에도 표지물질의 사용 방법이나 기질의 종류에 따라 다양한 분류가 가능하다.Immunoassay refers to a technique that uses an antibody in the process of analyzing a sample. In the early days, researchers mainly used immunoassays for quantitative detection and analysis of proteins, but recently, with the development of antibody technology, it is also used for analysis of small-molecular compounds, carbohydrates, lipids, etc., and analysis of various microorganisms. Immunoassays are radioimmunoassay (RIA) that detects signals using radioactive isotopes according to the detection principle and method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that uses signal amplification by enzymes, or It can be divided into enzyme immunoassay (EIA), fluorescence antibody technique (FA) that detects using fluorescence, and chemiluminescence immunoassay (CLIA) that uses chemiluminescence. Various classifications are possible depending on the method or the type of substrate.
여러 가지 면역분석법 중 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 효소면역측정법이며, 상기 분석법은 항체의 활용 방법에 따라 직접효소면역측정법(Direct ELISA), 간접효소면역측정법(Indirect ELISA) 및 샌드위치효소면역측정법(Sandwich ELISA)의 3가지로 세분할 수 있다. 직접효소면역측정법은 고체표면에 고정된 항원에 효소와 연결된 항체(Enzyme-linked Antibody)가 결합하면 효소가 기질의 반응을 촉매 함으로써 신호를 생성하게 된다. 간접효소면역측정법은 1차로 주항체(primary antibody)가 항원에 특이적인 결합을 하고, 2차로 효소가 연결된 보조항체(secondary antibody)가 주항체를 인식하여 결합한다. 이 상태에서 보조항체에 연결되어 있는 효소가 기질의 반응을 촉매 하여 신호를 내게 된다. 마지막으로, 가장 널리 사용되는 형태인 샌드위치효소면역측정법은 검출하려는 하나의 항원에 대하여, 인식부위(epitope)가 다른 2종의 항체를 사용하는 것이며, 검출하고자 하는 항원에 대한 높은 선택성을 나타내어 진단용으로도 많이 사용이 되고 있다. 또한, 나노자성입자를 질병진단용 기기에 적용한 선행기술로서, 등록특허 제1145660호에서 나노자성입자 및 나노센서를 포함하는 질병진단용 기기 및 그 검사방법을 개시하고 있다.Among various immunoassays, enzyme immunoassay is currently the most used method, and the assays are direct ELISA, indirect ELISA, and sandwich enzyme immunoassay depending on the method of using the antibody. ELISA) can be subdivided into three types. In direct enzyme immunoassay, when an enzyme-linked antibody binds to an antigen immobilized on a solid surface, the enzyme catalyzes the substrate reaction, thereby generating a signal. In the indirect enzyme immunoassay, the primary antibody specifically binds to the antigen, and the secondary antibody to which the enzyme is linked recognizes and binds the primary antibody. In this state, the enzyme linked to the auxiliary antibody catalyzes the reaction of the substrate and generates a signal. Lastly, sandwich enzyme immunoassay, which is the most widely used type, uses two types of antibodies with different epitopes for one antigen to be detected. is also widely used. In addition, as a prior art in which nano magnetic particles are applied to a device for diagnosing diseases, Korean Patent Registration No. 1145660 discloses a device for diagnosing a disease and a method for diagnosing the same, including magnetic nanoparticles and a nano sensor.
한편, 면역분석이나 ELISA(Enzyme linked immunoassay) 분석을 위해서는 면역반응에 참여한 신호물질과 남아있는 신호물질의 분리가 이루어져야 면역반응 결과를 정량적으로 분석할 수 있다. 이런 이유로 캡처 항체, 타겟 항원, 신호물질을 포함한 이차 항체의 면역반응 단계별로 반드시 세척이 필수적이며 ELISA 분석시 반응과 세척 절차가 필수적으로 수행되어 면역분석 시간이 길어진다. On the other hand, for immunoassay or ELISA (Enzyme Linked Immunoassay) analysis, the signal material participating in the immune reaction and the remaining signal material must be separated to quantitatively analyze the immune reaction result. For this reason, washing is essential for each stage of the immune reaction of the secondary antibody including the capture antibody, target antigen, and signal material.
LFA(Lateral Flow Assay, 측면유동검사법)의 경우 멤브레인으로 흐르는 측장유동에 의해 면역반응에 참여하는 신호물질은 테스트 라인이나 컨트롤 라인에 면역반응하여 고정되고 반응하지 못하는 신호물질은 흘러가게 되므로 신속하게 정성 혹은 정량분석이 가능한 면역진단 방법이다. 그러나, 세척 없이 측방유동으로 신호물질과 면역반응 결과물이 분리되므로 분석 시간이 10분 내외로 매우 신속한 특성이 있어서 신속진단에 많이 쓰이지만 측정결과의 편차가 크다는 단점이 있었다. In the case of LFA (Lateral Flow Assay, lateral flow assay), signal substances participating in the immune response by the lateral flow flowing through the membrane are immobilized by immunoreaction to the test line or control line, and the signal substances that do not respond are flowed, so Alternatively, it is an immunodiagnostic method capable of quantitative analysis. However, since the signal material and the immune response product are separated by lateral flow without washing, the analysis time is about 10 minutes, which is very fast.
이러한 측정결과의 편차를 제거하여 정량분석 성능이 우수한 현장 면역진단 방법으로 패스패스트(pathfast)의 CLIA(Chemiluminescence immunoassay)가 대표적이나, 자성입자와 자석을 이용하여 면역반응 후 세척을 통해 감도를 향상시켜 우수한 정량분석 검출 성능을 보여주지만 세척 과정이 필요하므로 유체제어가 필요하고 분석 시간이 더 걸리는 단점이 있다. CLIA (Chemiluminescence immunoassay) of pathfast is representative as an on-site immunodiagnostic method with excellent quantitative analysis performance by removing the deviation of these measurement results. Although it shows excellent quantitative analysis detection performance, it requires a cleaning process, so fluid control is required and analysis time is longer.
따라서 본 발명의 목적은 별도의 세척절차가 필요없이 신속하고 정량적인 고감도 검출이 가능한 신속 면역 진단 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a rapid immunodiagnostic method capable of rapid, quantitative and highly sensitive detection without the need for a separate washing procedure.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법은, 표적물질과 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있는 형광물질이 분산되어 있는 반응용액을 제1 마이크로튜브 내에 준비하는 단계(S10); 표적물질을 포함하는 시료, 및 상기 표적물질과 특이적으로 반응하는 캡처 항체가 고정되어 있는 자성입자를 상기 반응용액에 투입하여 상기 반응용액의 소정 측정영역에서 기준 형광을 측정하는 단계(S20); 상기 반응용액에 자력을 인가하여 상기 반응용액 내 포함된 표적물질 중 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리하는 단계(S30); 및 상기 자성 입자와 결합한 표적물질이 분리되어 제거된 상기 반응용액의 측정영역에서 잔존 형광을 측정하는 단계(S40)를 포함한다.In the rapid immunodiagnostic method according to a preferred embodiment of the present invention for achieving the above object, a reaction solution in which a fluorescent material to which a receptor that specifically reacts with a target material is fixed is dispersed is prepared in a first microtube to (S10); measuring a reference fluorescence in a predetermined measurement area of the reaction solution by injecting a sample containing a target material and magnetic particles to which a capture antibody specifically reacting with the target material is immobilized into the reaction solution (S20); separating the target material bound to the magnetic particles from among the target materials contained in the reaction solution by applying a magnetic force to the reaction solution to an area outside the measurement area of the reaction solution (S30); and measuring the residual fluorescence in the measurement region of the reaction solution from which the target material bound to the magnetic particles is separated and removed (S40).
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 S40단계 이후에, 분리된 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 표적물질이 존재하지 않는 제2 마이크로튜브로 이동시켜 형광을 측정하는 단계(S50)를 더 포함할 수 있다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, after the step S40, the step of measuring the fluorescence by moving the target material bound to the separated magnetic particles to a second microtube in which the target material does not exist (S50) may further include.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 S20단계는, 상기 표적물질과 특이적으로 반응하는 캡처 항체 및 상기 캡처 항체와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있는 자성입자를 각각 상기 반응용액에 투입하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the step S20 includes reacting the capture antibody specifically reacting with the target material and magnetic particles to which a receptor specifically reacting with the capture antibody is immobilized, respectively. It is characterized in that it is added to the solution.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 S30단계는, 상기 반응용액을 구비한 제1 마이크로튜브의 외측면에 자석을 근접시켜 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 소정 측정영역에서 이동시켜 분리하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, in step S30, a magnet is brought close to the outer surface of the first microtube provided with the reaction solution, and the target material bound to the magnetic particles is measured by a predetermined measure of the reaction solution. It is characterized in that it is separated by moving it in the area.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 자성 입자는 산화되거나 금속, 작용기, 단백질, 탄수화물, 폴리머 또는 지질에 의해 표면 개질된 것일 수 있다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the magnetic particles may be oxidized or surface-modified with a metal, functional group, protein, carbohydrate, polymer or lipid.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the receptor is at least one selected from the group consisting of an enzyme substrate, a ligand, an antibody, an amino acid, a peptide, a protein, a nucleic acid, a lipid, and a carbohydrate.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 제1 마이크로튜브의 하부에 배치된 광원이 상기 형광물질의 형광을 여기시키고, 상기 제1 마이크로튜브의 하단 측면에 배치된 광측정부가 상기 여기된 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, a light source disposed below the first microtube excites the fluorescence of the fluorescent material, and a photometric unit disposed at the lower side of the first microtube excites the excitation. It is characterized in that the measured fluorescence.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 광측정부는 PMT(Photo Multiplier Tube) 또는 PD(Photo Detector)인 것을 특징으로 한다.Further, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the photo-measuring unit is a PMT (Photo Multiplier Tube) or a PD (Photo Detector).
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 형광 측정은 TRF(시간분할형광측정, Time Resolved Fluorescence) 검출법으로 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the fluorescence measurement is characterized in that it is measured by a TRF (Time Resolved Fluorescence) detection method.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 형광 측정은 복수개의 마이크로튜브를 구비한 마이크로튜브 어레이 블럭에 대하여 수평 이동되는 슬라이더를 포함하는 이송부가 광원과 광측정부를 포함하는 측정모듈을 이동시켜 연속적으로 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the fluorescence measurement is performed by moving a measuring module including a light source and an optical measuring unit by a transfer unit including a slider that horizontally moves with respect to a microtube array block having a plurality of microtubes. to continuously measure fluorescence.
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 마이크로튜브 어레이 블럭은 면역 반응에 최적의 온도를 조절할 수 있는 히팅부와 자성입자나 형광입자의 효과적 분산을 위해 초음파를 발생시키는 초음파 발생부를 구비하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the microtube array block is provided with a heating unit capable of controlling an optimal temperature for an immune response and an ultrasound generator generating ultrasound for effective dispersion of magnetic or fluorescent particles. characterized in that
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 표적물질을 포함하는 시료를 투입 후 면역반응이 진행되는 시간을 제어하고, 면역반응 진행이 제어된 특정 시간에 자석을 배치 후 형광 변화를 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the time during which the immune reaction proceeds after the sample containing the target material is injected is controlled, and the change in fluorescence is measured after placing a magnet at a specific time at which the progress of the immune reaction is controlled. characterized in that
또한, 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 상기 S30단계는, 내부 공간부에 상하 이동 가능한 자석을 구비한 자성입자 이동부를 상기 제1 마이크로튜브 내에서 상하로 위치이동시켜 상기 표적물질과 결합한 자성 입자를 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리하고, 상기 S40단계는, 외측면에 상기 표적물질과 결합한 자성 입자가 고정된 상기 자성입자 이동부를 제1 마이크로튜브에서 제2 마이크로튜브의 버퍼 용액으로 이동시키고, 상기 자성입자 이동부 내의 자석을 제거하여 상기 제2 마이크로튜브 내의 버퍼 용액에 상기 자성 입자와 결합한 표적물질이 분산되도록 한 후 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다.In addition, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, in step S30, a magnetic particle moving unit having a magnet capable of moving up and down in the inner space is moved up and down in the first microtube to combine with the target material. The magnetic particles are separated by moving them to an area outside the measurement area of the reaction solution, and in step S40, the magnetic particle moving part in which the magnetic particles bound to the target material are fixed on the outer surface of the first microtube to the second microtube It is characterized in that the fluorescence is measured after moving to the buffer solution, removing the magnet in the magnetic particle moving part to disperse the target material bound to the magnetic particles in the buffer solution in the second microtube.
본 발명에 따르면, 종래의 경우 자성입자와 자석을 이용하여 면역반응 후 세척을 통해 감도를 향상시켜 우수한 정량분석 검출 성능을 보여주지만 세척 과정이 필요하므로 유체제어가 필요하고 분석 시간이 더 걸리는 문제점이 존재하는 반면, 본 발명은 신호물질의 형광신호를 측정한 후 표적물질과 캡처 항체가 고정된 자성입자를 투입하여 면역반응을 일으키게 하고 자력으로 자성입자를 제거함으로써 측정영역에 면역반응에 참여하지 않은 신호물질만 남겨지는 분리가 진행되므로 별도의 세척절차가 필요없이 LFA와 동일한 소요시간만으로도 면역진단을 신속하게 고감도로 정량적으로 제공할 수 있다.According to the present invention, in the conventional case, the sensitivity is improved through washing after the immune reaction using magnetic particles and magnets to show excellent quantitative analysis detection performance, but since a washing process is required, fluid control is required and analysis time is longer. On the other hand, in the present invention, after measuring the fluorescence signal of the signal material, the target material and the capture antibody immobilized magnetic particles are injected to cause an immune reaction, and the magnetic particles are removed by magnetic force so that the measurement area does not participate in the immune reaction. Since the separation that leaves only the signal material is carried out, it is possible to quickly and quantitatively provide immunodiagnosis with high sensitivity and with the same amount of time as LFA without the need for a separate washing procedure.
또한, 신호물질로 유로퓸 금속입자(EuNPs)를 사용하여 TRF 기법으로 면역반응 결과를 얻으므로 고감도 정량 분석이 가능하며, 기존의 마이크로튜브를 그대로 사용하여 신속 대량 면역 검사에 적합하다. In addition, high-sensitivity quantitative analysis is possible because the TRF technique uses europium metal particles (EuNPs) as a signal material to obtain immune response results, and it is suitable for rapid mass immune testing by using the existing microtube as it is.
또한, 자력으로 자성입자를 제거함으로써 측정영역에 면역반응에 참여하지 않은 신호물질만 남겨지는 분리가 진행되므로 별도의 세척절차가 필요없어 유체 제어가 불필요하고 자성입자와 자석의 사용만으로 면역분석이 가능하므로 소형 면역진단 기기 구성이 가능하다. In addition, by removing the magnetic particles by magnetic force, separation proceeds, leaving only the signal material that does not participate in the immune reaction in the measurement area, so there is no need for a separate washing procedure, so fluid control is unnecessary. Therefore, it is possible to configure a small immunodiagnostic device.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법의 면역분석 과정 및 원리를 설명하는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 8개 마이크로튜브 어레이 블럭을 구비한 신속 면역 진단 측정기기의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 대량 검사 및 신속 자동화 검사를 위한 복수의 마이크로튜브 내 반응용액의 믹싱 및 측정을 설명하는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법 및 대조군의 면역분석 과정을 설명하는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법의 형광신호의 변화를 대조군과 대비하여 설명하는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 측정영역에서의 형광물질 농도에 따른 형광신호 세기를 설명하는 개념도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 제1 마이크로튜브(Tube A, 네거티브 측정 튜브)에서 제2 마이크로튜브(Tube B, 포지티브 측정 튜브)로 면역반응 결과물을 이동시켜, 제1 마이크로튜브에서 감소한 형광량을 측정하고 제2 마이크로튜브에서 증가한 형광량을 측정함으로써 검출 감도를 향상시키는 방법을 설명하는 개념도이다. 1 is a flowchart of a rapid immune diagnosis method according to an embodiment of the present invention.
2 is a schematic diagram illustrating the immunoassay process and principle of the rapid immune diagnosis method according to an embodiment of the present invention.
3 is a schematic diagram of a rapid immunodiagnostic measuring device having an 8 microtube array block according to an embodiment of the present invention.
4 is a schematic diagram illustrating mixing and measurement of a reaction solution in a plurality of microtubes for mass inspection and rapid automated inspection according to an embodiment of the present invention.
5 is a schematic diagram illustrating a rapid immunodiagnostic method and an immunoassay process of a control group according to an embodiment of the present invention.
6 is a schematic diagram illustrating a change in a fluorescence signal in the rapid immunodiagnostic method according to an embodiment of the present invention in comparison with a control.
7 is a conceptual diagram illustrating the intensity of a fluorescence signal according to a concentration of a fluorescence in a measurement region in the rapid immunodiagnostic method according to an embodiment of the present invention.
8 is a diagram illustrating an immune response result by moving an immune response result from a first microtube (Tube A, negative measuring tube) to a second microtube (Tube B, positive measuring tube) in the rapid immunodiagnostic method according to an embodiment of the present invention. , a conceptual diagram explaining a method of improving detection sensitivity by measuring a decreased amount of fluorescence in the first microtube and measuring an increased amount of fluorescence in the second microtube.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 이하, 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. Since the present invention can apply various transformations and can have various embodiments, specific embodiments will be described in detail in the detailed description. Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법의 흐름도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법의 면역분석 과정 및 원리를 설명하는 모식도이다.1 is a flowchart of a rapid immune diagnosis method according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an immunoassay process and principle of the rapid immune diagnosis method according to an embodiment of the present invention.
여기에 도시된 본 발명은 신호물질의 형광신호를 측정한 후 표적물질과 캡처 항체가 고정된 자성입자를 투입하여 면역반응을 일으키게 하고 자력으로 자성입자를 제거함으로써 표적물질의 농도를 신속하게 면역 진단하는 방법에 관한 것이다.In the present invention shown here, after measuring the fluorescence signal of the signal material, the target material and the capture antibody are immobilized magnetic particles to generate an immune reaction, and the concentration of the target material is quickly diagnosed by removing the magnetic particles by magnetic force. It's about how to do it.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법은 반응용액을 제1 마이크로튜브 내에 준비하는 단계(S10); 상기 반응용액의 소정 측정영역에서 기준 형광을 측정하는 단계(S20); 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리하는 단계(S30); 및 잔존 형광을 측정하는 단계(S40)를 포함한다. 또한, 본 발명의 신속 면역 진단 방법은 상기 S40단계 이후에, 분리된 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 표적물질이 존재하지 않는 제2 마이크로튜브로 이동시켜 형광을 측정하는 단계(S50)를 더 포함할 수 있다.1 and 2, the rapid immunodiagnosis method according to an embodiment of the present invention includes the steps of preparing a reaction solution in a first microtube (S10); measuring a reference fluorescence in a predetermined measurement area of the reaction solution (S20); separating the target material bound to the magnetic particles by moving it to an area other than the measurement area of the reaction solution (S30); and measuring the residual fluorescence (S40). In addition, the rapid immunodiagnostic method of the present invention further comprises the step (S50) of measuring fluorescence by moving the target material bound to the separated magnetic particles into a second microtube in which the target material is not present after the step S40. can do.
S10단계는 표적물질과 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있는 형광물질이 분산되어 있는 반응용액을 제1 마이크로튜브 내에 준비하는 단계이다.Step S10 is a step of preparing a reaction solution in which a fluorescent material to which a receptor that specifically reacts with a target material is fixed is dispersed in the first microtube.
본 발명의 형광물질은 면역측정법에서 일반적으로 사용되는 형광체를 의미하는 것으로, 형광물질의 표면은 표적물질과 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있을 수 있다.The fluorescent material of the present invention refers to a fluorescent material generally used in immunoassays, and a receptor that specifically reacts with a target material may be fixed on the surface of the fluorescent material.
리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.The receptor is characterized in that at least one selected from the group consisting of enzyme substrates, ligands, antibodies, amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, lipids and carbohydrates.
여기서, 상기 형광물질은 예컨대, 쿠마린(coumarin) 계열 형광물질(예컨대, 7-hydroxycoumarin, 4-methyl-7-hydroxycoumarin 등); 잔텐(xanthene) 계열 형광물질(예컨대, ROX, TET, Texas Red, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로 다민(tetramethylrhodamine) 등); 시아닌(cyanine) 계열 형광물질 (예컨대, Cy3, Cy5 등); 보디피(Bodipy) 계열 형광물질 (예컨대 Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, Bodipy TMR 등); 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열 형광물질(예컨대, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532등); 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열 형광물질(예컨대, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800등),FITC(fluorescein isothiocyanate, 황녹색형광) 및 발광 나노금속입자(예컨대, 유로퓸(Eu), 세륨(Ce), 프라세오디뮴(Pr), 네오디듐(Nd), 사마륨(Sm), 터븀(Tb), 홀뮴(Ho), 어븀(Er) 및 툴륨(Tm)으로 이루어진 군에서 선택되는 나노금속입자)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Here, the fluorescent material is, for example, a coumarin-based fluorescent material (eg, 7-hydroxycoumarin, 4-methyl-7-hydroxycoumarin, etc.); xanthene-based fluorescent materials (eg, ROX, TET, Texas Red, fluorescein, tetramethylrhodamine, etc.); cyanine-based fluorescent materials (eg, Cy3, Cy5, etc.); Bodipy-based fluorescent materials (eg, Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, Bodipy TMR, etc.); Alexa Fluor-based fluorescent materials (eg, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532, etc.); DyLight Fluor-based fluorescent materials (eg, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800, etc.), FITC (fluorescein isothiocyanate, yellow-green fluorescence) ) and luminescent nanometal particles (eg, europium (Eu), cerium (Ce), praseodymium (Pr), neodymium (Nd), samarium (Sm), terbium (Tb), holmium (Ho), erbium (Er) and It may be one or more selected from the group consisting of (nanometal particles selected from the group consisting of thulium (Tm)), but is not limited thereto.
S10단계에서, 형광물질이 분산되어 있는 반응용액의 소정 측정영역에서 형광을 측정할 수 있다. 이를 통해 다음 단계인 S20단계에서의 시료 투입에 의한 형광 세기 변화를 파악하고 전체 측정의 정확성 및 재현성을 모니터링할 수 있다. 이를 위해 본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법은 먼저 신호물질인 형광물질의 농도를 TRF(시간분할형광측정, Time Resolved Fluorescence) 검출법으로 측정한다. 유로퓸 나노입자(EuNPs)와 같은 형광물질은 광원을 꺼도 형광수명이 길어 시간분할 형광측정이 가능하다. 이때, 상기 반응용액의 소정 측정영역은 마이크로튜브의 측면에 배치된 광측정부가 반응용액의 여기된 형광을 측정하는 영역으로서 마이크로튜브의 하단부가 바람직할 수 있다.In step S10, fluorescence may be measured in a predetermined measurement area of the reaction solution in which the fluorescent material is dispersed. Through this, it is possible to grasp the change in fluorescence intensity due to the sample input in the next step, step S20, and to monitor the accuracy and reproducibility of the entire measurement. To this end, in the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, the concentration of a fluorescent material, which is a signal material, is first measured by a TRF (Time Resolved Fluorescence) detection method. Fluorescent materials such as europium nanoparticles (EuNPs) have a long fluorescence lifetime even when the light source is turned off, enabling time-division fluorescence measurement. In this case, the predetermined measurement area of the reaction solution is an area in which the photometer disposed on the side of the microtube measures the excited fluorescence of the reaction solution, and the lower end of the microtube may be preferable.
S20단계는 표적물질을 포함하는 시료, 및 상기 표적물질과 특이적으로 반응하는 캡처 항체가 고정되어 있는 자성입자를 상기 반응용액에 투입하여 상기 반응용액의 소정 측정영역에서 기준 형광을 측정하는 단계이다.Step S20 is a step of measuring a reference fluorescence in a predetermined measurement area of the reaction solution by injecting a sample containing a target material and magnetic particles to which a capture antibody that specifically reacts with the target material is immobilized into the reaction solution. .
즉, S20단계는 시료에 포함된 표적물질이 형광물질과 결합되면, 이를 캡처 항체가 고정되어 있는 자성입자를 이용하여 제거하기 위해 캡처 항체가 고정되어 있는 자성입자를 상기 반응용액에 투입하는 것이다.That is, in step S20, when the target material included in the sample is combined with the fluorescent material, magnetic particles to which the capture antibody is fixed are added to the reaction solution in order to remove it using the magnetic particles to which the capture antibody is fixed.
표적물질과 형광물질의 결합은 형광물질의 리셉터가 표적물질과 특이적으로 반응함으로써 결합된다. 이때, 리셉터는 항체(이차 항체)인 것이 바람직하다.The binding between the target material and the fluorescent material is achieved by a receptor of the fluorescent material reacting specifically with the target material. In this case, the receptor is preferably an antibody (secondary antibody).
이때, S20단계는 캡처 항체가 고정되어 있는 자성입자를 투입하는 대신, 표적물질과 특이적으로 반응하는 캡처 항체 및 상기 캡처 항체와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있는 자성입자를 각각 상기 반응용액에 투입할 수도 있다. 이로 인해 상기 형광물질와 결합되어 있는 표적물질에 상기 캡처 항체가 결합되고 상기 자성입자의 리셉터가 상기 캡처 항체와 특이적으로 반응하여 결합된다.At this time, in step S20, instead of injecting the magnetic particles to which the capture antibody is fixed, a capture antibody specifically reacting with the target material and magnetic particles having a receptor specifically reacting with the capture antibody fixed therein are added to the reaction solution, respectively. can also be put into As a result, the capture antibody is bound to the target material bound to the fluorescent material, and the receptor of the magnetic particle reacts specifically with the capture antibody to bind.
자성 입자는 산화되거나 금속, 작용기, 단백질, 탄수화물, 폴리머 또는 지질에 의해 표면 개질된 것이다.Magnetic particles are those that have been oxidized or surface-modified with metals, functional groups, proteins, carbohydrates, polymers or lipids.
S30단계는 상기 반응용액에 자력을 인가하여 상기 반응용액 내 포함된 표적물질 중 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리하는 단계이다.Step S30 is a step of separating by applying a magnetic force to the reaction solution to move the target material bound to the magnetic particles among the target materials included in the reaction solution to an area outside the measurement area of the reaction solution.
상기 반응용액을 구비한 마이크로튜브의 외측면에 자석을 근접시켜 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 소정 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리한다.A magnet is brought close to the outer surface of the microtube having the reaction solution, and the target material bound to the magnetic particles is moved to an area outside the predetermined measurement area of the reaction solution to separate it.
S40단계는 상기 자성 입자와 결합한 표적물질이 분리되어 제거된 상기 반응용액의 측정영역에서 잔존 형광을 측정하는 단계이다.Step S40 is a step of measuring the residual fluorescence in the measurement region of the reaction solution from which the target material bound to the magnetic particles is separated and removed.
본 발명에 있어서, 형광 측정은 제1 마이크로튜브의 하부에 배치된 광원이 상기 형광물질의 형광을 여기시키고 제1 마이크로튜브의 하단 측면에 배치된 광측정부가 여기된 형광을 측정한다. 이때, 반응용액의 소정 측정영역은 제1 마이크로튜브의 하단부로서 광측정부와 측면으로 대응되어 측정되는 영역이다.In the present invention, in the fluorescence measurement, a light source disposed below the first microtube excites the fluorescence of the fluorescent material, and a photometer disposed at the lower side of the first microtube measures the excited fluorescence. In this case, the predetermined measurement area of the reaction solution is the lower end of the first microtube and is the area measured in correspondence with the optical measurement unit laterally.
측정영역을 마이크로튜브 상단에 두고 자성입자를 마이크로튜브 상단으로 옮겨와 면역반응에 참여한 형광 라벨의 증가하는 형광량을 측정하는 방식도 가능하지만, 자성입자의 뭉침에 의해 형광이나 여기광이 방해받아 오차가 크고 자성입자를 측정영역에 정확하게 이동시켜 측정하기도 어렵다는 단점이 있다. It is also possible to measure the increasing fluorescence amount of the fluorescent label participating in the immune reaction by placing the measuring area on the top of the microtube and moving the magnetic particles to the top of the microtube, but the fluorescence or excitation light is disturbed by the aggregation of magnetic particles, resulting in an error. It has a disadvantage in that it is difficult to measure by accurately moving magnetic particles to the measurement area.
반면, 본 발명의 반응용액의 소정 측정영역은 마이크로튜브의 하단부로서 광측정부와 측면으로 대응되어 측정되는 영역으로서, 이러한 본 발명의 측정 방식은 형광입자가 상기 마이크로튜브의 하단부의 측정영역에 가라앉아 일정한 조건을 유지할 수 있으므로 형광입자가 존재하다가 제거되어 없어지는 형광물질의 양적 변화를 측정하기 용이하며, 용매의 혼탁함이 형광측정에 크게 영향을 주지 않는 장점이 있다.On the other hand, the predetermined measurement area of the reaction solution of the present invention is the lower end of the microtube, and is the area to be measured in correspondence with the optical measuring unit. Since it can sit and maintain a constant condition, it is easy to measure the quantitative change of the fluorescent material that is removed and disappears after the fluorescent particles are present, and there is an advantage that the turbidity of the solvent does not significantly affect the fluorescence measurement.
형광 측정은 TRF(시간분할형광측정, Time Resolved Fluorescence) 검출법으로 측정할 수 있다. 즉, TRF 검출법은 마이크로튜브의 하부에서 광원이 형광물질을 여기시키고 마이크로튜브의 측면에서 형광을 읽는 광측정부 구성으로 가능하다. 이때, 광측정부는 PMT(Photo Multiplier Tube) 또는 PD(Photo Detector)인 것이 바람직하고, 광센서 앞단에는 형광 필터를 사용하는 것이 외부 빛의 노이즈를 제거하는데 도움이 된다. Fluorescence may be measured by a TRF (Time Resolved Fluorescence) detection method. That is, the TRF detection method is possible with the configuration of an optical measuring unit in which a light source excites a fluorescent material at the bottom of the microtube and reads the fluorescence from the side of the microtube. In this case, it is preferable that the photo-measuring unit is a PMT (Photo Multiplier Tube) or PD (Photo Detector), and using a fluorescent filter in front of the photosensor helps to remove noise from external light.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 8개 마이크로튜브 어레이 블럭을 구비한 신속 면역 진단 측정기기의 모식도이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 대량 검사 및 신속 자동화 검사를 위한 복수의 마이크로튜브 내 반응용액의 믹싱 및 측정을 설명하는 모식도이다.3 is a schematic diagram of a rapid immunodiagnostic measuring device having 8 microtube array blocks according to an embodiment of the present invention, and FIG. 4 is a plurality of mass tests and rapid automated tests according to an embodiment of the present invention. It is a schematic diagram explaining the mixing and measurement of the reaction solution in the microtube.
도 3 및 도 4를 참조하면, 본 발명에 따른 형광 측정은 복수개의 마이크로튜브를 구비한 마이크로튜브 어레이 블럭에 수평 이동되는 슬라이더를 포함하는 이송부가 광원과 광측정부를 포함하는 측정모듈을 이동시켜 연속적으로 형광을 측정할 수 있다.3 and 4, the fluorescence measurement according to the present invention is performed continuously by moving a measuring module including a light source and an optical measuring unit by a transfer unit including a horizontally moving slider on a microtube array block having a plurality of microtubes. fluorescence can be measured.
예컨대, 8개의 어레이로 이루어진 마이크로튜브 고정 구조물인 마이크로튜브 어레이 블럭에 대하여 1번 튜브에서 8번 튜브까지 측정모듈을 이동해가며 연속적으로 형광 신호를 측정할 수 있다. 표적물질을 포함하는 시료(타겟 시료) 주입 후 형광을 측정하고 자석을 위치시켜 분리 동작이 이루어진 후 다시 형광을 측정하여 감소한 형광신호를 분석할 수 있다. 표적물질을 포함하는 시료 주입 후 면역반응이 진행되는 시간을 조절 할 수 있으며 시간 경과에 따라 자석을 배치하고 형광변화를 측정하는 것도 가능하다. 이런 방법으로 본 발명은 하나의 장비로 LFA보다 대량 분석에 적합하다. 이때, 마이크로튜브는 일회용으로 사용하고 폐기할 수 있다.For example, with respect to the microtube array block, which is a microtube fixed structure composed of eight arrays, the fluorescence signal can be continuously measured while moving the measurement module from the first tube to the eighth tube. After injection of a sample containing a target material (target sample), the fluorescence is measured, and the separation operation is performed by positioning a magnet, and then the fluorescence is measured again to analyze the reduced fluorescence signal. It is possible to control the time during which the immune response proceeds after injection of a sample containing a target substance, and it is also possible to place a magnet and measure the change in fluorescence over time. In this way, the present invention is more suitable for mass analysis than LFA with one instrument. In this case, the microtube can be used for single use and discarded.
마이크로튜브 고정 및 측정을 위한 지지부인 마이크로튜브 어레이 블럭은 상기 이송부에 결합된 자석 승하강부가 상기 자석을 상하방향으로 승강 및 하강시켜 자석을 이동시키거나 고정된 형태의 자석을 배치할 수 있다. 또한, 상기 마이크로튜브 어레이 블럭은 항원-항체 반응 등의 면역 반응에 최적의 온도를 조절할 수 있는 히팅부와 자성입자나 형광입자의 효과적 분산을 위해 초음파를 발생시키는 초음파 발생부를 구비할 수 있다.In the microtube array block, which is a support for fixing and measuring microtubes, the magnet elevating unit coupled to the transfer unit elevates and lowers the magnet in the vertical direction to move the magnet or to arrange a fixed magnet. In addition, the microtube array block may include a heating unit capable of controlling an optimal temperature for an immune reaction such as an antigen-antibody reaction and an ultrasonic wave generating unit generating ultrasonic waves for effective dispersion of magnetic or fluorescent particles.
본 발명에 따른 신속 면역 진단 방법은 자석의 배치만으로 측정영역에 면역반응에 참여하지않은 신호물질만 남겨지는 분리가 진행되므로 별도의 세척절차가 필요없이 LFA와 동일한 소요시간만으로도 면역진단을 신속하게 정량적으로 제공할 수 있다. 즉, 먼저 신호물질의 농도를 TRF 기법으로 측정한 후, 여기에 항원 등의 타겟 시료를 넣게 되면 시료의 혼탁도 증가여부나 형광물질의 희석정도에 따라서 약간의 신호감소가 일어날 수 있다. 여기에 다시 캡처 항체가 고정된 자성입자를 넣게 되면 자성입자의 산란이나 희석 배수에 따라서 TRF 신호는 약간의 감소가 나타날 수 있다. 면역반응 결과를 확인하기 위해 마이크로튜브의 상부 혹은 측정부를 벗어난 마이크로튜브 옆 벽면부에 자석을 위치시키면 자성입자는 모두 측정영역에서 제거된다. 이때, 항원의 농도에 비례하여 자유롭게 존재하던 신호물질은 측정영역에서 그 만큼 감소하게 되므로 TRF측정에 의해 감소한 신호정도는 항원의 농도와 상관관계를 갖게 된다. 즉, 초기 신호 혹은 대조신호 레벨에 비해 줄어든 신호크기가 항원 농도에 좌우된다. 따라서, 기준 형광 세기에서 잔존 형광 세기의 차를 계산함으로써 면역분석이 가능하다. In the rapid immunodiagnostic method according to the present invention, only the signal material that does not participate in the immune response is separated in the measurement area only by placing the magnet, so there is no need for a separate washing procedure and it takes the same amount of time as LFA to quickly and quantitatively immunodiagnose. can be provided as That is, if the concentration of the signal material is first measured by the TRF technique and then a target sample such as an antigen is added thereto, a slight signal decrease may occur depending on whether the turbidity of the sample increases or the degree of dilution of the fluorescent material. Here again, if magnetic particles to which the capture antibody is immobilized are added, the TRF signal may be slightly decreased depending on the scattering or dilution factor of the magnetic particles. If a magnet is placed on the top of the microtube or on the wall next to the microtube outside the measuring section to check the immune response result, all magnetic particles are removed from the measuring area. At this time, the signal material that was freely present in proportion to the antigen concentration is reduced by that amount in the measurement region, so the reduced signal level by the TRF measurement has a correlation with the antigen concentration. That is, the reduced signal level compared to the initial signal or control signal level depends on the antigen concentration. Therefore, immunoassay is possible by calculating the difference between the residual fluorescence intensity from the reference fluorescence intensity.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법 및 대조군의 면역분석 과정을 설명하는 모식도이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법의 형광신호의 변화를 대조군과 대비하여 설명하는 모식도이다.5 is a schematic diagram illustrating the immunoassay process of the rapid immunodiagnostic method and the control group according to an embodiment of the present invention, and FIG. 6 is a diagram illustrating the change in fluorescence signal of the rapid immunodiagnostic method according to the embodiment of the present invention with the control group. It is a schematic diagram explaining the comparison.
도 5 및 도 6을 참조하면, 본 발명의 경우 항원을 포함하는 검사 시료가 주입되고 타겟 항원에 의해 형광물질이 제거되는 만큼 형광신호가 낮아진 반면, 대조군의 경우 항원이 포함되지 않는 버퍼 용액이 주입되고 타겟 시료가 없어서 형광신호 변화가 거의 없게 된다.5 and 6, in the case of the present invention, a test sample containing an antigen is injected and the fluorescence signal is lowered as much as the fluorescent material is removed by the target antigen, whereas in the case of the control, a buffer solution containing no antigen is injected and there is almost no change in the fluorescence signal because there is no target sample.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 측정영역에서의 형광물질 농도에 따른 형광신호 세기를 설명하는 개념도이다. 7 is a conceptual diagram illustrating the intensity of a fluorescence signal according to a concentration of a fluorescence in a measurement region in the rapid immunodiagnostic method according to an embodiment of the present invention.
도 7을 참조하면, 측정영역에서 형광물질 농도에 따른 형광신호 세기를 나타내고 있다. 항원 농도 증가에 의해 형광세기가 감소한다. 이를 고려하여 적절한 형광물질 농도를 선정할 수 있다. 또한, 자성입자의 분산 정도 및 버퍼 용액에 따른 형광 신호 수준을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 7 , the intensity of the fluorescence signal according to the concentration of the fluorescence in the measurement area is shown. The fluorescence intensity decreases as the antigen concentration increases. In consideration of this, an appropriate fluorescent material concentration may be selected. In addition, the degree of dispersion of the magnetic particles and the fluorescence signal level according to the buffer solution can be checked.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 신속 면역 진단 방법에 있어서, 제1 마이크로튜브(Tube A, 네거티브 측정 튜브)에서 제2 마이크로튜브(Tube B, 포지티브 측정 튜브)로 면역반응 결과물을 이동시켜, 제1 마이크로튜브에서 감소한 형광량을 측정하고 제2 마이크로튜브에서 증가한 형광량을 측정함으로써 검출 감도를 향상시키는 방법을 설명하는 개념도이다. 8 is a rapid immunodiagnostic method according to an embodiment of the present invention, by moving the immune response result from the first microtube (Tube A, negative measuring tube) to the second microtube (Tube B, positive measuring tube) , a conceptual diagram explaining a method of improving detection sensitivity by measuring a decreased amount of fluorescence in the first microtube and measuring an increased amount of fluorescence in the second microtube.
도 8을 참조하면, 본 발명의 신속 면역 진단 방법은 검출 감도 향상을 위하여 S40단계 이후에, 분리된 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 표적물질이 존재하지 않는 제2 마이크로튜브로 이동시켜 추가로 형광을 측정한다(S50단계). Referring to FIG. 8 , in the rapid immunodiagnostic method of the present invention, after step S40 to improve detection sensitivity, the target material bound to the separated magnetic particles is moved to a second microtube in which the target material is not present, thereby further fluorescence is measured (step S50).
즉, 제1 마이크로튜브에서 감소한 형광량을 측정하고, 제2 마이크로튜브에서 표적물질의 존재량에 비례해 증가하는 형광량을 측정하여 이를 동시 분석함으로써 검사시료의 혼탁도에 의한 영향을 배제할 수 있고 검출 감도의 편차를 줄일 수 있게 된다.That is, the effect of turbidity of the test sample can be excluded by measuring the amount of fluorescence decreased in the first microtube and the amount of fluorescence increasing in proportion to the amount of the target material in the second microtube and analyzing it simultaneously. and the deviation of detection sensitivity can be reduced.
또한, 넓은 검출 영역을 갖는 면역진단이 가능하다. 즉, 제1 마이크로튜브는 높은 농도의 항원 검출이 가능하고 제2 마이크로튜브는 매우 희박한 항원의 존재에도 형광 검출이 가능하므로 면역진단의 검출영역을 매우 크게 할 수 있는 장점이 있다. 통상의 효소를 이용하는 96 웰플레이트(well plate) ELISA는 흡광도 변화를 측정하는 원리상 넓은 검출 영역을 커버할 수 없어서 시료를 희석해야 하는 조건을 잡아야 하는 번거로움이 있다. In addition, immunodiagnosis with a wide detection area is possible. That is, since the first microtube can detect a high concentration of antigen and the second microtube can detect fluorescence even in the presence of a very rare antigen, there is an advantage in that the detection area for immunodiagnosis can be very large. 96-well plate ELISA using a conventional enzyme cannot cover a wide detection area in principle of measuring the change in absorbance, so it is inconvenient to set conditions for diluting the sample.
제1 마이크로튜브에서 분리된 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 표적물질이 존재하지 않는 제2 마이크로튜브로 용이하게 이동시키기 위하여, S30단계에서 자성입자 이동부를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. In order to easily move the target material bound to the magnetic particles separated from the first microtube to the second microtube in which the target material does not exist, it may be preferable to use a magnetic particle moving unit in step S30.
즉, S30단계에서, 내부 공간부에 상하 이동 가능한 자석을 구비한 자성입자 이동부를 상기 제1 마이크로튜브 내에서 상하로 위치이동시켜 상기 표적물질과 결합한 자성 입자를 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리한다. That is, in step S30, the magnetic particle moving part having a magnet capable of moving up and down in the inner space is moved up and down in the first microtube to move the magnetic particles bound to the target material to an area outside the measurement area of the reaction solution. move and separate
이후, S40단계에서 외측면에 상기 표적물질과 결합한 자성 입자가 고정된 상기 자성입자 이동부를 제1 마이크로튜브에서 제2 마이크로튜브의 버퍼 용액으로 이동시키고, 상기 자성입자 이동부 내의 자석을 상방으로 이동시켜 제거함으로써 상기 제2 마이크로튜브 내의 버퍼 용액에 상기 자성 입자와 결합한 표적물질이 분산되도록 한 후 형광을 측정한다.Thereafter, in step S40, the magnetic particle moving part having the magnetic particles bound to the target material fixed on the outer surface is moved from the first microtube to the buffer solution of the second microtube, and the magnet in the magnetic particle moving part is moved upward. and then the target material bound to the magnetic particles is dispersed in the buffer solution in the second microtube, and then the fluorescence is measured.
본 발명에 따르면, 종래의 경우 자성입자와 자석을 이용하여 면역반응 후 세척을 통해 감도를 향상시켜 우수한 정량분석 검출 성능을 보여주지만 세척 과정이 필요하므로 유체제어가 필요하고 분석 시간이 더 걸리는 문제점이 존재하는 반면, 본 발명은 별도의 세척절차가 필요없이 LFA와 동일한 소요시간만으로도 면역진단을 신속하게 고감도로 정량적으로 제공할 수 있고, 유체 제어가 불필요하고 자성입자와 자석의 사용만으로 면역분석이 가능하므로 소형 면역진단 기기 구성이 가능하다. According to the present invention, in the conventional case, the sensitivity is improved through washing after the immune reaction using magnetic particles and magnets to show excellent quantitative analysis detection performance, but since a washing process is required, fluid control is required and analysis time is longer. On the other hand, in the present invention, immunodiagnosis can be quickly and quantitatively provided with high sensitivity and without the need for a separate washing procedure, only with the same time required as LFA, and it is possible to perform immunoassay only by using magnetic particles and magnets without fluid control. Therefore, it is possible to configure a small immunodiagnostic device.
한편, 이상의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.On the other hand, the above detailed description should not be construed as restrictive in all aspects, but should be considered as exemplary. The scope of the present invention should be determined by a reasonable interpretation of the appended claims, and all modifications within the equivalent scope of the present invention are included in the scope of the present invention.
Claims (12)
표적물질을 포함하는 시료, 및 상기 표적물질과 특이적으로 반응하는 캡처 항체가 고정되어 있는 자성입자를 상기 반응용액에 투입하여 상기 제1 마이크로튜브 내 반응용액의 소정 측정영역에서 기준 형광을 측정하는 단계(S20);
상기 반응용액에 자력을 인가하여 상기 반응용액 내 포함된 표적물질 중 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 측정영역 외의 영역으로 이동시켜 분리하는 단계(S30);
상기 자성 입자와 결합한 표적물질이 분리되어 제거된 상기 반응용액의 측정영역에서 잔존 형광을 측정하는 단계(S40); 및
분리된 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 표적물질이 존재하지 않는 제2 마이크로튜브로 이동시켜 상기 자성 입자와 결합한 표적물질의 형광을 측정하는 단계(S50);를 포함하고,
상기 제1 마이크로튜브의 하부에 배치된 광원이 상기 형광물질의 형광을 여기시키고, 상기 제1 마이크로튜브의 하단 측면에 배치된 광측정부가 상기 여기된 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
preparing a reaction solution in which a fluorescent material to which a receptor reacting specifically with a target material is fixed is dispersed in the first microtube (S10);
A sample containing a target material and magnetic particles to which a capture antibody that specifically reacts with the target material are immobilized are added to the reaction solution to measure reference fluorescence in a predetermined measurement area of the reaction solution in the first microtube step (S20);
separating the target material bound to the magnetic particles from among the target materials included in the reaction solution by applying a magnetic force to the reaction solution to an area other than the measurement area of the reaction solution (S30);
measuring the remaining fluorescence in the measurement region of the reaction solution from which the target material bound to the magnetic particles is separated and removed (S40); and
Measuring the fluorescence of the target material bound to the magnetic particles by moving the separated target material bound to the magnetic particles to a second microtube in which the target material is not present (S50);
A rapid immunodiagnostic method, characterized in that a light source disposed under the first microtube excites the fluorescence of the fluorescent material, and a photometer disposed on the lower side of the first microtube measures the excited fluorescence .
상기 S20단계는,
상기 표적물질과 특이적으로 반응하는 캡처 항체 및 상기 캡처 항체와 특이적으로 반응하는 리셉터가 고정되어 있는 자성입자를 각각 상기 반응용액에 투입하는 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
The step S20 is,
A rapid immunodiagnostic method, characterized in that each of a capture antibody reacting specifically with the target material and magnetic particles on which a receptor specifically reacting with the capture antibody is immobilized is added to the reaction solution.
상기 S30단계는,
상기 반응용액을 구비한 제1 마이크로튜브의 외측면에 자석을 근접시켜 상기 자성 입자와 결합한 표적물질을 상기 반응용액의 소정 측정영역에서 이동시켜 분리하는 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
The step S30 is,
A rapid immunodiagnostic method, characterized in that the target material bound to the magnetic particles is separated by moving a target material bound to the magnetic particles in a predetermined measurement area of the reaction solution by bringing a magnet close to the outer surface of the first microtube having the reaction solution.
상기 자성 입자는 산화되거나 금속, 작용기, 단백질, 탄수화물, 폴리머 또는 지질에 의해 표면 개질된 것이고,
상기 리셉터는 효소기질, 리간드, 항체, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산, 지질 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
The magnetic particles are oxidized or surface-modified with metals, functional groups, proteins, carbohydrates, polymers or lipids,
The receptor is a rapid immunodiagnostic method, characterized in that at least one selected from the group consisting of enzyme substrates, ligands, antibodies, amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, lipids and carbohydrates.
상기 광측정부는 PMT(Photo Multiplier Tube) 또는 PD(Photo Detector)인 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
The photo-measuring unit is a PMT (Photo Multiplier Tube) or PD (Photo Detector) rapid immunodiagnosis method, characterized in that.
상기 형광 측정은 TRF(시간분할형광측정, Time Resolved Fluorescence) 검출법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
The fluorescence measurement is a rapid immunodiagnostic method, characterized in that it is measured by a TRF (Time Resolved Fluorescence) detection method.
상기 형광 측정은 복수개의 마이크로튜브를 구비한 마이크로튜브 어레이 블럭에 대하여 수평 이동되는 슬라이더를 포함하는 이송부가 광원과 광측정부를 포함하는 측정모듈을 이동시켜 연속적으로 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
The fluorescence measurement is rapid immunity, characterized in that a transfer unit including a slider that horizontally moves with respect to a microtube array block having a plurality of microtubes moves a measurement module including a light source and an optical measurement unit to continuously measure fluorescence diagnostic method.
상기 마이크로튜브 어레이 블럭은 면역 반응에 최적의 온도를 조절할 수 있는 히팅부와 자성입자나 형광입자의 효과적 분산을 위해 초음파를 발생시키는 초음파 발생부를 구비하는 것을 특징으로 하는 신속 면역진단방법.
10. The method of claim 9,
The microtube array block is a rapid immunodiagnostic method, characterized in that it comprises a heating unit capable of controlling the optimum temperature for immune response, and an ultrasonic wave generating unit that generates ultrasonic waves for effective dispersion of magnetic or fluorescent particles.
상기 표적물질을 포함하는 시료를 투입 후 면역반응이 진행되는 시간을 제어하고, 면역반응 진행이 제어된 특정 시간에 자석을 배치 후 형광 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 신속 면역 진단 방법.
According to claim 1,
A rapid immunodiagnostic method, characterized in that after inputting the sample containing the target material, the time for which the immune reaction proceeds is controlled, and the fluorescence change is measured after placing a magnet at a specific time at which the progress of the immune reaction is controlled.
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