KR20230056438A - Dvice with patterning for culturing muscle cells and the method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a patterned muscle cell culture device and a method for culturing the same.
세포 집단인 조직을 생체에서 분리시켜 배양액(培養液)이나 배양기(培養基)에서 기르는 것을 조직 배양이라 하 듯이 세포를 단독으로 분리시켜 배양하는 것을 세포 배양이라 한다. 바이오 분야에서 세포 배양에 따른 실험은 그 목적에 따라 매우 다양하게 수행되고 있고, 최근에는 다양한 종류의 암세포를 비롯하여 혈관, 근육, 뇌 등 여러 가지 조직의 미세환경을 모사하여 세포를 배양하는 시도들이 이루어지고 있으며, 부분적으로 성공을 거두고 있다.Tissue culture, which is a group of cells, is isolated from living organisms and grown in a culture medium or incubator, and is called tissue culture. Experiments with cell culture in the bio field are being carried out in a variety of ways depending on the purpose, and recently, attempts have been made to culture cells by simulating the microenvironment of various types of cancer cells, blood vessels, muscles, and brain. and are partially successful.
미세 유체 세포배양 장치는 세포 배양을 위한 유체보관이 가능한 미세구조 또는 미세크기의 세포배양 장치를 일컬으며, 유체를 흘려보내 여러 가지 실험을 한꺼번에 수행할 수 있는 기능을 갖는다. 구체적으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 기판을 이용하여 미세 채널을 만들고, 이러한 채널을 통해 유체(예를 들어, 액체 시료)를 이동시킨 후, 미세 유체 세포배양 장치 내의 복수의 챔버에서 세포와 서로 혼합 및 반응하게 할 수 있다. 뿐만 아니라, 세포의 체내 미세환경과 유사한 생화학적/물리적 환경을 모사하여 제어된 환경에서의 즉각적이고 역동적인 반응을 관측하는 데에 사용되기도 한다. 이와 같이, 종래에 실험실에서 행해지던 실험들을 작은 장치 내에서 수행한다는 점에서, 미세 유체 세포배양 장치는 세포 실험의 더 쉽고 편하게 다양한 방식으로 수행할 수 있도록 만들었다고 볼 수 있다.A microfluidic cell culture device refers to a microstructure or a micro-sized cell culture device capable of storing fluid for cell culture, and has a function of performing various experiments at once by flowing fluid. Specifically, microchannels are made using substrates such as plastic, glass, and silicon, fluid (eg, liquid samples) is moved through these channels, and cells and cells interact with each other in a plurality of chambers in a microfluidic cell culture device. Mix and react. In addition, it is also used to observe immediate and dynamic reactions in a controlled environment by simulating a biochemical/physical environment similar to the cell's internal microenvironment. In this way, in that experiments conventionally performed in laboratories are performed in a small device, it can be seen that the microfluidic cell culture device has made cell experiments easier and more convenient to perform in various ways.
미세 유체 세포배양 장치는 제약, 생물공학, 의학 등의 분야에서 비용과 시간절감의 효과를 창출해 낸 것은 물론 정확도, 효율성 및 신뢰성을 높일 수 있다. 예를 들어, 미세 유체 세포배양 장치를 사용함으로써 단백질과 DNA 분석에 사용되는 값 비싼 시약들의 사용량을 기존의 방법보다 현저히 줄일 수 있어 상당한 비용 절감 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 단백질 샘플이나 세포 샘플도 기존의 방법보다 훨씬 적은 양이 사용되므로 샘플 낭비를 줄일 수 있다.Microfluidic cell culture devices can increase accuracy, efficiency, and reliability as well as create effects of cost and time reduction in fields such as pharmaceuticals, biotechnology, and medicine. For example, by using a microfluidic cell culture device, the amount of expensive reagents used for protein and DNA analysis can be significantly reduced compared to conventional methods, resulting in significant cost savings. In addition, protein samples or cell samples are also used in much smaller amounts than conventional methods, so sample waste can be reduced.
최근, 마이크로미터 수준의 특정 영역에 선택적으로 세포를 고정화 시키는 세포 패터닝(cell patterning) 기술이 연구 중이고, 이는 세포-조직, 세포-표면, 또는 세포-매트릭스 사이의 상호작용과 같은 세포 생물학을 연구하는데 필요한 모델 시스템을 제공하고, 바이오센서(biosensor) 및 바이오칩(biochip) 개발을 위한 기반 기술로 역할 하고 있다. 시험관내 분석, 진단, 및 신약 개발에 소요되는 비용을 절감하고 높은 효율을 위해 고효율 검색(high throughput screening)의 필요성이 강조되면서, 세포 패터닝 기술을 이용하여 세포의 상호작용을 조절하고 이를 통해 증식 및 분화를 유도함으로써, 세포 어레이화, 기능화 및 조직화 등을 포함하는 세포배양 효율을 향상시키려는 노력이 진행중이다.Recently, a cell patterning technology that selectively immobilizes cells in a specific area at the micrometer level is being researched, which is used to study cell biology such as cell-tissue, cell-surface, or cell-matrix interactions. It provides necessary model systems and serves as a base technology for the development of biosensors and biochips. As the need for high throughput screening for high efficiency and cost reduction for in vitro analysis, diagnosis, and new drug development is emphasized, cell patterning technology is used to control cell interactions and thereby proliferate and Efforts are underway to improve cell culture efficiency, including cell arraying, functionalization and organization, by inducing differentiation.
본 발명은 상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 특정 조건으로 레이저 조사에 의한 패턴을 형성시키고 외부자극을 가하여 세포배양 과정 중 다수의 계대배양(passaged culture) 시에도 세포가 보유하고 있는 원 기능과 특성을 유지 및 향상되도록 함으로써, 세포의 배양 성능을 유지할 수 있는 외부자극이 전달가능한 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.The present invention was made to solve the above technical problems, and by forming patterns by laser irradiation under specific conditions and applying external stimuli, even during a number of passaged cultures during the cell culture process, the original cells retained An object of the present invention is to provide a muscle cell culture device having a pattern capable of transmitting external stimuli capable of maintaining cell culture performance by maintaining and improving functions and characteristics, and a method for culturing the same.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned technical problem, and other technical problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
상기의 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 일 실시예는, 마루(ridge)와 골(groove) 또는 점(dot)으로 구성되는 세포 배양 장치로써, 상기 세포 배양장치의 골(groove) 또는 점(dot)은 레이저(laser) 처리되어 형성될 수 있다.In order to achieve the above object, one embodiment of the patterned muscle cell culture device according to the present invention is a cell culture device composed of ridges and grooves or dots, the cell culture Grooves or dots of the device may be formed by laser processing.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 세포 배양장치의 골(groove) 또는 점(dot)은 플라즈마(plasma) 처리되어 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the groove or dot of the cell culture device may be formed by plasma treatment.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 배양액은 상기 마루(ridge) 또는 골(groove) 또는 점(dot) 부위에 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the culture medium may be formed on the ridge or groove or dot portion.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 배양된 세포의 형태는 입체형태, 예를 들어 2D 또는 3D 형태로 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the cultured cells may be formed in a three-dimensional shape, for example, a 2D or 3D shape.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 마루(ridge)의 폭(w) 또는 점(dot)의 직경(d)은 1 내지 100 마이크로미터 범위로 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 마루(ridge)의 폭(w) 또는 점(dot)의 직경(d)은 25 내지 80 마이크로미터 범위로 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the width (w) of the ridge or the diameter (d) of the dot may be formed in the range of 1 to 100 micrometers. Preferably, the width (w) of the ridge or the diameter (d) of the dot may be formed in the range of 25 to 80 micrometers.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 0.1 내지 500mV/mm 범위의 전기장이 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, an electric field in the range of 0.1 to 500 mV/mm may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 1 내지 100 kPa 범위의 강도(Stiffness)가 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, a stiffness in the range of 1 to 100 kPa may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스(Acoustic pulse)가 인가될 수 있다. In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, an acoustic pulse in the range of 0.01 to 0.1 mJ/mm 2 may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 1 내지 100 mT 범위의 자기장이 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, a magnetic field in the range of 1 to 100 mT may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 0 내지 30 % 범위의 산소가 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, oxygen in the range of 0 to 30% may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 세포는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 심장근육세포 및 식도상피세포를 포함하는 진핵세포로부터 선택된 1종을 포함될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the cells are myoblasts, fibroblasts, vascular endothelial cells, chondrocytes, hepatocytes, osteoblasts, kidney cells, adipocytes, corneal epithelial cells, stem cells, and nerve cells. , keratinocytes, cardiomyocytes, and eukaryotic cells including esophageal epithelial cells.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 세포 배양장치는 TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 플라스틱, 유리, 금속, 세라믹 및 고분자와 같은 생체재료로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the cell culture device is a biological material such as TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)), polydimethylsiloxane (PDMS), plastic, glass, metal, ceramic, and polymer. It may include one selected from the group consisting of materials.
한편, 본 발명은 상기 세포 배양장치를 이용하는 세포 배양방법을 제공하는 바,On the other hand, the present invention provides a cell culture method using the cell culture device,
세포 배양장치 상부에 세포 배양액을 도포하는 단계;Applying a cell culture solution on top of the cell culture device;
레이저 처리하여 상기 세포 배양장치 상에 마루(ridge)와 골(groove)을 형성시키는 표면처리 단계; A surface treatment step of forming ridges and grooves on the cell culture device by laser treatment;
상기 마루(ridge)와 골(groove) 및 점(dot) 상에 근육세포를 이식하여 배양시키는 단계; 및transplanting and culturing muscle cells on the ridge, groove, and dot; and
상기 세포 배양장치에 전기장을 인가하여 전기자극을 제공하는 단계;를 포함할 수 있다. It may include; providing electrical stimulation by applying an electric field to the cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 전기자극 과정은 0.1 내지 500mV/mm 범위의 전기장이 인가되어 수행될 수 있다. In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the electric stimulation process may be performed by applying an electric field in the range of 0.1 to 500 mV/mm.
본 발명에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법은 특정 조건으로 레이저 조사에 의한 패턴을 형성시키고 세포배양 과정 중 다수의 계대배양(passaged culture) 시에도 세포 기능을 유지 및 향상되도록 함으로써, 원하는 세포의 특성 및 기능을 유지할 수 있는 효과를 가진다.The patterned muscle cell culture device and method for culturing the same according to the present invention form a pattern by laser irradiation under specific conditions and maintain and improve cell function even during a number of passaged cultures during the cell culture process, It has the effect of maintaining desired cell characteristics and functions.
본 발명의 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The objects of the present invention are not limited to the tasks mentioned above, and other tasks not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 패턴 형상 과정을 나타내는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 전기자극 예시도이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법을 나타내는 흐름도이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 근육 전구 세포를 추출하는 과정을 나타내는 개념도이고,
도 5 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 근육 전구 세포생성 결과를 나타내는 그래프와 SEM 사진이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴 생성속도에 따른 세포형성 모양을 나타내는 SEM 사진이고,
도 9 및 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 패턴 간격에 따른 거칠기를 나타내는 그래프이고,
도 11 내지 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 레이저 패턴 처리된 배양장치의 전기자극 유무에 따른 세포 생성 효과를 나타내는 SEM 사진들이다.1 is a schematic diagram showing a pattern shaping process of a patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention;
2 is a diagram illustrating electrical stimulation of a patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention;
3 is a flow chart showing a method for culturing patterned muscle cells according to an embodiment of the present invention;
4 is a conceptual diagram showing a process of extracting human muscle progenitor cells according to an embodiment of the present invention;
5 to 7 are graphs and SEM pictures showing the results of human muscle progenitor cell generation according to an embodiment of the present invention,
8 is a SEM photograph showing the shape of cell formation according to the pattern generation rate according to an embodiment of the present invention;
9 and 10 are graphs showing roughness according to pattern intervals of a patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention;
11 to 13 are SEM pictures showing the cell generation effect according to the presence or absence of electrical stimulation of the laser pattern-treated culture device according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명의 일 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 도는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In adding reference numerals to components of each drawing, it should be noted that the same components have the same numerals as much as possible even if they are displayed on different drawings. In addition, in describing an embodiment of the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known configuration or function hinders understanding of the embodiment of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
본 발명의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.In describing the components of the embodiment of the present invention, terms such as first, second, A, B, (a), and (b) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, order, or order of the corresponding component is not limited by the term. In addition, unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by a person of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and unless explicitly defined in the present application, they should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning. don't
본 발명에 있어서, '마루(ridge)'는 양각으로 가장 크게 변위가 일어난 부분을 지칭하고, '골(groove)'은 음각으로 가장 크게 변위가 일어난 홈 부분을 지칭한다. 또, '점(dot)은 양각 또는 음각으로 가장 크게 변위가 일어난 부분을 지칭한다. 본 발명에 있어서, 상기 '마루와 골로 구성된 구조'는 평면에 일정 간격으로 마루와 골이 형성된 패턴을 가지는 구조물을 지칭한다.In the present invention, 'ridge' refers to a portion where the largest displacement occurs in an embossed shape, and 'groove' refers to a groove portion where the largest displacement occurs in a negative shape. In addition, 'dot' refers to the part where the largest displacement occurs in embossed or intaglio. In the present invention, the 'structure composed of peaks and valleys' refers to a structure having a pattern in which peaks and valleys are formed at regular intervals on a plane.
본 발명에 있어서, '줄기세포'는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭하는 것으로, 단계별로 크게는 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 또한, 줄기세포는 그 유래에 따라 다양하게 분류할 수 있는데, 본 발명의 줄기세포는 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 위장관, 양막, 태반 또는 탯줄로부터 유래된 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, '전구세포(precursor cell)'는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로 위탁 줄기세포라고도 한다. 본 발명에 있어서, 전구세포(precursor cell)는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로 위탁줄기 세포라고도 한다. 이에, 조골세포 분화를 통한 뼈를 재생하고자 하는 본 발명은 조골세포의 전구세포를 이용하는 것이 바람직하다.In the present invention, 'stem cell' refers to a cell having the ability to differentiate into two or more cells while having self-renewal ability, and in each step, totipotent stem cell, pluripotent stem cell ( pluripotent stem cells) and multipotent stem cells. In addition, stem cells can be classified in various ways according to their origin. The stem cells of the present invention are derived from bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, dental tissue, blood, cord blood, liver, gastrointestinal tract, amnion, placenta or umbilical cord. It is characterized by being, but is not limited thereto. In the present invention, a 'precursor cell' is a cell at a stage before having the shape and function of a specific cell, and is also referred to as a consignment stem cell. In the present invention, precursor cells (precursor cells) are cells at a stage before having the shape and function of a specific cell, and are also referred to as consignment stem cells. Therefore, in the present invention to regenerate bone through osteoblast differentiation, it is preferable to use osteoblast precursor cells.
본 발명에 있어서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상으로, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 지칭한다. 아울러, '골분화'는 동물의 발달과정에서 나타나는 전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화 되어 골을 형성하는 일련의 생리적인 반응인 골형성 과정 중에서도 골기질을 형성하는 과정, 또는 자연적 혹은 인위적으로 동물의 줄기세포의 분화를 유도하여 골기질을 형성하는 과정을 모두 포함하는 개념이다.In the present invention, 'differentiation' is a phenomenon in which structures and functions are specialized from each other while cells divide and proliferate and grow. refers to In addition, 'bone differentiation' is a process of forming a bone matrix among the bone formation process, which is a series of physiological reactions in which precursor cells appearing during the development process of animals are differentiated to form a bone matrix, and the formed bone matrix is calcified to form a bone, or It is a concept that includes all processes of naturally or artificially inducing the differentiation of animal stem cells to form a bone matrix.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 패턴 형상 과정을 나타내는 모식도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 동작 예시도이다.1 is a schematic view showing a pattern shaping process of a patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is an exemplary operation diagram of a patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention. .
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 근육세포 배양 장치는 배양액이 도포된 기판상에 본 발명에 따른 레이저 처리(laser treatment)에 의하여 마루(ridge)와 골(groove)이 형성될 수 있다. 이와 같이 상기 마루와 골이 형성된 배양 장치에 소정의 전류에 의한 전기자극을 가하여 근육세포 배양 장치를 제조할 수 있다.1 and 2, in the muscle cell culture device according to the present invention, ridges and grooves can be formed by laser treatment according to the present invention on a substrate coated with a culture medium. there is. In this way, a muscle cell culture device can be manufactured by applying electrical stimulation with a predetermined current to the culture device in which the peaks and valleys are formed.
하나의 예에서, 본 발명의 배양기판은 주형으로서 상업적으로 구매가 가능한 TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene))을 포함할 수 있다. 이때 TCP는 기본 주형으로 세포배양에 최적화된 플라스틱 형태의 몰드이다.In one example, the culture substrate of the present invention may include commercially available Tissue Culture Plastic (Polystyrene) (TCP) as a template. At this time, TCP is a plastic mold optimized for cell culture as a basic template.
경우에 따라서, 상기 기판으로 온도감응성 또는 비온도감응성 특성을 갖는 알지네이트 하이드로젤(alginate hydrogel)을 배양기판으로 포함할 수 있다.In some cases, the substrate may include an alginate hydrogel having a temperature-sensitive or non-temperature-sensitive property as a culture substrate.
이하, 본 발명의 패턴화된 세포 배양기판을 이용한 패턴을 갖는 세포배양 방법에 대해 설명한다.Hereinafter, a cell culture method having a pattern using the patterned cell culture substrate of the present invention will be described.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법을 나타내는 흐름도이다.3 is a flow chart showing a method for culturing patterned muscle cells according to an embodiment of the present invention.
먼저, 기판의 상에 기판 상에 레이저를 이용하여 소정의 간격을 갖는 패턴을 형성시킨다. 이 때, 상기 패턴은 대략 1 내지 80 마이크로미터의 폭(ridge)을 갖는 상기 마루가 소정의 간격으로 형성될 수 있다(S200). 실질적으로 상기 마루 부위에서 세포가 부착되어 증식하게 된다. 여기서, 상기 패턴은 대략 25 내지 80 마이크로미터의 폭으로 형성되는 것이 바람직하다.First, a pattern having a predetermined interval is formed on a substrate by using a laser on the substrate. At this time, in the pattern, the peaks having a ridge of about 1 to 80 micrometers may be formed at predetermined intervals (S200). Substantially, cells adhere to and proliferate at the ridge. Here, the pattern is preferably formed with a width of approximately 25 to 80 micrometers.
다음으로, 상기와 같은 패턴이 형성된 배양기판 상에서 근육세포를 배양한다(S300). 여기서, 상기 세포는, 하나의 예로써, 도 4에 도시된 바와 같은 방법으로 준비할 수 있다. 즉, 인체의 후두 부위에 조직을 절개하여 분리한 후에 비이커에 투입한다. 상기 비이커에 소화효소(enzyme)를 투입하되 대략 37도에서 1시간 동안 용해시킨다. 이 때, 상기 소화효소로 콜라겐 분해효소인 콜라게나제(collagenase) 및 단백질 분해효소인 디스파제(dispase)를 사용할 수 있다. 그 다음으로 상기 용해된 용액을 대략 5분동안 원심분리하여 침전시키고 근육 전구세포와 섬유 세포 등을 재부유(resuspension) 과정이 수행됨으로써, 근육 전구세포를 준비할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이와 같이 준비된 근육 전구세포는, 도 5 내지 도 7에 도시된 바와 같이, 유세포 측정결과에서 줄기세포 마커(marker), 근육줄기 마커 및 위성세포 마커가 확인되었으며 면역염색을 통하여 정상적으로 확인할 수 있다.Next, the muscle cells are cultured on the culture substrate on which the above pattern is formed (S300). Here, the cells may be prepared by a method as shown in FIG. 4, as an example. That is, after incising and separating tissue from the larynx of the human body, it is put into a beaker. An enzyme is added to the beaker and dissolved at about 37 degrees for 1 hour. At this time, as the digestive enzyme, collagenase, which is a collagen degrading enzyme, and dispase, which is a proteolytic enzyme, may be used. Then, the dissolved solution is centrifuged for about 5 minutes to precipitate, and muscle progenitor cells and fiber cells are resuspended, thereby preparing muscle progenitor cells. According to the present invention, as shown in FIGS. 5 to 7, in the muscle progenitor cells prepared as described above, stem cell markers, muscle stem markers, and satellite cell markers were confirmed in the flow cytometry results, and normal through immunostaining. You can check.
이와 같이 배양되는 세포는 본 발명에서는 근육세포로 설명하고 있으나, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 귀, 피부, 쓸개조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등으로부터 분리되거나 활성화할 수 있는 세포를 사용할 수도 있다. 배양조건은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있고, 이러한 내용은 이미 이 분야에서 널리 알려진 공지의 기술이므로 자세한 설명은 생략한다.The cells cultured in this way are described as muscle cells in the present invention, but are not particularly limited. For example, liver, kidney, spleen, bone, bone marrow, thymus, heart, muscle, lung, brain, testis, ovary, islet Cells that can be isolated or activated from the islet, intestine, ear, skin, gallbladder tissue, prostate, bladder, embryo, immune system and hematopoietic system can also be used. Culture conditions may vary depending on the type of cell, and since these are well-known techniques in this field, detailed descriptions will be omitted.
다음으로, 상기 근육 전구세포가 배양되는 상기 기판에 대략 0.1 내지 500 mV/mm 범위의 전기장이 인가되는 과정이 수행된다(S400). 이러한 전기자극 과정을 통하여 세포의 증식력과 분화력 및 방향성을 최적화하여 세포의 특성을 보다 용이하게 확보할 수 있게 된다. 바람직하게는, 상기 인가되는 전압은 0.1 내지 100mV/mm 범위의 전기장이 인가될 수 있다.Next, a process of applying an electric field in the range of about 0.1 to 500 mV/mm to the substrate on which the muscle progenitor cells are cultured is performed (S400). Through this electrical stimulation process, it is possible to more easily secure the characteristics of the cells by optimizing the proliferative power, differentiation power, and directionality of the cells. Preferably, the applied voltage may be applied with an electric field in the range of 0.1 to 100 mV/mm.
경우에 따라서, 상기 근육 전구세포가 배양되는 상기 기판은 대략 1 내지 100 kPa 범위의 강도, 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스, 1 내지 100 mT 범위의 자기장 및 0 내지 30 % 범위의 산소가 인가될 수 있다.In some cases, the substrate on which the muscle progenitor cells are cultured has an intensity ranging from about 1 to 100 kPa, an acoustic pulse ranging from 0.01 to 0.1 mJ/mm 2 , a magnetic field ranging from 1 to 100 mT, and oxygen ranging from 0 to 30%. may be authorized.
이와 같이 패턴 및 전기자극 과정이 수행되어 제조된 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치에서 소정의 시간동안 배양된 세포의 방향성을 확인하여 도 8에 나타냈다. 도 8에 도시된 바와 같이, 레이저를 이용하여 대략 1 내지 2000 mm/s 속도로 변화를 주며 상기 패턴을 형성시키되, 상기 패턴의 마루(ridge)의 폭을 30 내지 100 마이크로미터 크기로 형성시킨 후 세포의 방향성(orientation degree)을 가시적으로 확인하였다. 이를 통하여 상기 패턴의 마루(ridge)의 폭이 30 내지 50 마이크로미터 크기로 형성되는 경우에 세포의 증식력이 적절히 유지되면서도 방향성이 형성되는 것을 확인하였다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 상기 패턴의 마루(ridge)의 폭이 40 마이크로미터 크기일 경우에 가장 우수한 세포 증식력과 방향성을 유지할 수 있다. 이러한 세포의 방향성은 구체적인 수치로 평가될 수 있으며, 예를 들어, 상기 패턴의 마루를 따라 증식되는 세포 군집의 길이가 상기 마루를 따라 형성되는 세포 증식의 폭과 대비하여 대략 100 내지 500% 범위를 유지하는 경우에 우수한 방향성을 만족하는 것으로 판단할 수 있으며, 우수한 방향성은 세포의 특성을 변화 및 유지시키는데 도움을 줄 수 있다.In this way, the orientation of the cells cultured for a predetermined time in the patterned muscle cell culture device manufactured by performing the pattern and electrical stimulation process was confirmed and shown in FIG. 8 . As shown in FIG. 8, the pattern is formed by using a laser at a speed of about 1 to 2000 mm/s, and the width of the ridge of the pattern is 30 to 100 micrometers After forming The orientation degree of the cells was visually confirmed. Through this, when the width of the ridge of the pattern is formed to a size of 30 to 50 micrometers, it was confirmed that the directionality was formed while the proliferative power of the cells was properly maintained. According to the present invention, preferably, when the width of the ridge of the pattern is 40 micrometers, the best cell proliferation ability and directionality can be maintained. The directionality of these cells can be evaluated with a specific numerical value. For example, the length of the cell population proliferating along the crest of the pattern is approximately 100 to 500% in comparison to the width of cell proliferation formed along the crest. When maintained, it can be determined that excellent directionality is satisfied, and excellent directionality can help change and maintain cell characteristics.
한편, 전술한 패턴 및 전기자극 과정이 수행되어 제조된 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치에서 소정의 시간동안 배양된 세포의 생성 결과를 확인하여 도 11 내지 도 13에 나타냈다. 이들 도면에 도시된 바와 같이, 전술한 소정의 폭을 갖는 마루(ridge)를 레이저를 이용하여 형성시킨 후, 세포를 배양시키고 대략 0.1 내지 100mV/mm 범위의 전기장이 인가하는 경우에 보다 높은 방향성을 유지하면서 세포의 배양이 가능한 것을 확인할 수 있다. 이와 비교하여, 전류 인가에 따른 전기자극을 가하지 않거나 250mV/mm 이상의 전기장을 인가하는 경우에 오히려 세포가 사멸하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직하게는 전기장이 대략 0.1 내지 100mV/mm 범위일 수 있다.On the other hand, the production results of cells cultured for a predetermined time in the patterned muscle cell culture device manufactured by performing the above-described pattern and electrical stimulation process were confirmed and shown in FIGS. 11 to 13. As shown in these figures, after forming a ridge having a predetermined width using a laser, culturing the cells and applying a higher directivity when an electric field in the range of about 0.1 to 100 mV / mm is applied It can be confirmed that the cells can be cultured while maintaining. In comparison, it can be confirmed that the cells rather die when electrical stimulation according to the application of current is not applied or when an electric field of 250 mV/mm or more is applied. Thus, according to the present invention, the electric field may preferably range from approximately 0.1 to 100 mV/mm.
이상, 본 발명의 일 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하였다. 그러나, 본 발명의 실시예가 반드시 상술한 일 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의한 다양한 변형 및 균등한 범위에서의 실시가 가능함은 당연하다고 할 것이다. 그러므로, 본 발명의 진정한 권리범위는 후술하는 청구범위에 의하여 정해진다고 할 것이다.In the above, an embodiment of the present invention has been described in detail with reference to the accompanying drawings. However, it should be taken for granted that the embodiments of the present invention are not necessarily limited by the above-described embodiment, and various modifications and implementation within the equivalent range are possible by those skilled in the art to which the present invention belongs. will be. Therefore, it will be said that the true scope of the present invention is determined by the claims described later.
Claims (14)
상기 세포 배양장치의 골(groove)은 또는 점(dot)은 레이저(laser) 및 플라즈마(plasma) 처리 중 적어도 하나 이상의 표면처리 방식으로 형성되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
As a cell culture device composed of ridges and grooves or dots,
A patterned muscle cell culture device in which the groove or dot of the cell culture device is formed by at least one surface treatment method of laser and plasma treatment.
배양액은 상기 마루(ridge) 또는 골(groove) 또는 점(dot) 부위에 형성되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The culture medium is a muscle cell culture device having a pattern formed on the ridge or groove or dot portion.
상기 배양된 세포의 형태는 2D 또는 3D 형태로 형성되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The shape of the cultured cells is a patterned muscle cell culture device formed in a 2D or 3D shape.
상기 근육세포 배양 장치는 상기 근육세포 배양 장치는 0.1 내지 500mV/mm 범위의 전기장이 인가되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The muscle cell culture device is a muscle cell culture device having a pattern to which an electric field in the range of 0.1 to 500 mV / mm is applied.
상기 근육세포 배양 장치는 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스(Acoustic pulse)가 인가되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The muscle cell culture device is a muscle cell culture device having a pattern to which an acoustic pulse in the range of 0.01 to 0.1 mJ / mm 2 is applied.
상기 근육세포 배양 장치는 1 내지 100 kPa 범위의 강도(Stiffness)가 인가되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The muscle cell culture device is a patterned muscle cell culture device to which a stiffness in the range of 1 to 100 kPa is applied.
상기 근육세포 배양 장치는 1 내지 100 mT 범위의 자기장이 인가되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The muscle cell culture device is a muscle cell culture device having a pattern to which a magnetic field in the range of 1 to 100 mT is applied.
상기 근육세포 배양 장치는 0 내지 30 % 범위의 산소가 인가되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The muscle cell culture device is a muscle cell culture device having a pattern in which oxygen in the range of 0 to 30% is applied.
상기 마루(ridge)의 폭(w)은 1 내지 100 마이크로미터 범위로 형성되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The width (w) of the ridge (ridge) is a muscle cell culture device with a pattern formed in the range of 1 to 100 micrometers.
상기 마루(ridge)의 폭(w)은 25 내지 80 마이크로미터 범위로 형성되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 9,
The width (w) of the ridge (ridge) is a pattern formed muscle cell culture device formed in the range of 25 to 80 micrometers.
상기 세포는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 심장근육세포 및 식도상피세포를 포함하는 진핵세포로부터 선택된 1종을 포함하는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The cells include myoblasts, fibroblasts, vascular endothelial cells, chondrocytes, hepatocytes, osteoblasts, kidney cells, adipocytes, corneal epithelial cells, stem cells, nerve cells, keratinocytes, cardiac muscle cells and esophageal epithelial cells. A muscle cell culture device having a pattern containing one selected from eukaryotic cells.
상기 세포 배양장치는 TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 플라스틱, 유리, 금속, 세라믹 및 고분자 생체적합재료로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함하는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치.
According to claim 1,
The cell culture device is a patterned muscle including one selected from the group consisting of TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)), polydimethylsiloxane (PDMS), plastic, glass, metal, ceramic, and polymer biomaterials. cell culture device.
레이저(laser) 및 플라즈마(plasma) 중 적어도 하나의 방식으로 상기 세포 배양장치 상에 마루(ridge)와 골(groove) 및 점(dot)을 형성시키는 표면처리 단계;
상기 마루(ridge)와 골(groove) 및 점(dot) 상에 근육세포를 이식하여 배양시키는 단계; 및
상기 세포 배양장치에 전압을 인가하여 전기자극을 제공하는 단계;를 포함하는 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법.
Applying a cell culture solution on top of the cell culture device;
A surface treatment step of forming ridges, grooves, and dots on the cell culture device using at least one of laser and plasma;
transplanting and culturing muscle cells on the ridge, groove, and dot; and
A method for culturing patterned muscle cells comprising the steps of applying a voltage to the cell culture device to provide electrical stimulation.
상기 전기자극 과정은 0.1 내지 100mV/mm 범위의 전기장, 1 내지 100 kPa 범위의 강도(Stiffness), 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스(Acoustic pulse), 1 내지 100 mT 범위의 자기장 및 0 내지 30 % 범위의 산소 중 적어도 하나 이상이 인가되어 수행되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법.
According to claim 13,
The electrical stimulation process includes an electric field in the range of 0.1 to 100 mV/mm, a stiffness in the range of 1 to 100 kPa, an acoustic pulse in the range of 0.01 to 0.1 mJ/mm 2 , a magnetic field in the range of 1 to 100 mT, and 0 A patterned muscle cell culture method performed by applying at least one of oxygen in the range of 30% to 30%.
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|---|---|---|---|
| KR1020210140460A KR102666815B1 (en) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | Dvice with patterning for culturing muscle cells and the method thereof |
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| Publication Number | Publication Date |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| KR101506811B1 (en) | 2013-10-04 | 2015-03-30 | 중앙대학교 산학협력단 | Cell culture device |
| KR20170029237A (en) * | 2015-09-07 | 2017-03-15 | 한양대학교 산학협력단 | Substrate with biopolymer pattern for culturing micro-sized cell sheet and method for delivering the same |
| KR20170106149A (en) * | 2016-03-11 | 2017-09-20 | 가톨릭관동대학교기술지주 주식회사 | Physical stimulation-mediated permeation of Environmental transition guided cellular reprogramming |
| KR20180006321A (en) * | 2016-07-08 | 2018-01-17 | 서울대학교산학협력단 | Culture scaffold for enhancing differentiation of osteoblast using pattern |
-
2021
- 2021-10-20 KR KR1020210140460A patent/KR102666815B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102666815B1 (en) | 2024-05-16 |
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