KR102666815B1 - Dvice with patterning for culturing muscle cells and the method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법에 관한 것으로서, 마루(ridge)와 골(groove) 또는 점(dot)으로 구성되는 세포 배양 장치로써, 상기 세포 배양장치의 골(groove) 또는 점(dot)은 레이저(laser) 처리 및 플라즈마(laser plasma) 처리 중 적어도 하나 이상의 표면처리 방식으로 형성되는 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치를 제공한다.The present invention relates to a patterned muscle cell culture device and a culture method thereof, which is a cell culture device composed of ridges and grooves or dots, wherein the grooves or dots of the cell culture device Dot provides a muscle cell culture device with a pattern formed by at least one surface treatment method among laser treatment and plasma treatment.
Description
본 발명은 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a patterned muscle cell culture device and a culture method thereof.
세포 집단인 조직을 생체에서 분리시켜 배양액(培養液)이나 배양기(培養基)에서 기르는 것을 조직 배양이라 하 듯이 세포를 단독으로 분리시켜 배양하는 것을 세포 배양이라 한다. 바이오 분야에서 세포 배양에 따른 실험은 그 목적에 따라 매우 다양하게 수행되고 있고, 최근에는 다양한 종류의 암세포를 비롯하여 혈관, 근육, 뇌 등 여러 가지 조직의 미세환경을 모사하여 세포를 배양하는 시도들이 이루어지고 있으며, 부분적으로 성공을 거두고 있다.Just as tissue culture, which is a group of cells, is separated from a living body and grown in a culture medium or incubator, is called tissue culture, so isolating and culturing cells individually is called cell culture. In the bio field, cell culture experiments are carried out in a variety of ways depending on the purpose, and recently, attempts have been made to culture cells by simulating the microenvironment of various tissues such as various types of cancer cells, blood vessels, muscles, and brain. It is losing, and it is partially succeeding.
미세 유체 세포배양 장치는 세포 배양을 위한 유체보관이 가능한 미세구조 또는 미세크기의 세포배양 장치를 일컬으며, 유체를 흘려보내 여러 가지 실험을 한꺼번에 수행할 수 있는 기능을 갖는다. 구체적으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 기판을 이용하여 미세 채널을 만들고, 이러한 채널을 통해 유체(예를 들어, 액체 시료)를 이동시킨 후, 미세 유체 세포배양 장치 내의 복수의 챔버에서 세포와 서로 혼합 및 반응하게 할 수 있다. 뿐만 아니라, 세포의 체내 미세환경과 유사한 생화학적/물리적 환경을 모사하여 제어된 환경에서의 즉각적이고 역동적인 반응을 관측하는 데에 사용되기도 한다. 이와 같이, 종래에 실험실에서 행해지던 실험들을 작은 장치 내에서 수행한다는 점에서, 미세 유체 세포배양 장치는 세포 실험의 더 쉽고 편하게 다양한 방식으로 수행할 수 있도록 만들었다고 볼 수 있다.A microfluidic cell culture device refers to a cell culture device with a microstructure or micro size capable of storing fluid for cell culture, and has the function of performing various experiments at once by flowing fluid. Specifically, microchannels are created using substrates such as plastic, glass, and silicon, fluids (e.g., liquid samples) are moved through these channels, and then cells are interacted with each other in a plurality of chambers within the microfluidic cell culture device. It can be mixed and reacted. In addition, it can be used to observe immediate and dynamic reactions in a controlled environment by simulating a biochemical/physical environment similar to the cellular microenvironment in the body. In this way, in that experiments that were conventionally performed in a laboratory are performed within a small device, the microfluidic cell culture device can be seen as making it easier and more convenient to perform cell experiments in a variety of ways.
미세 유체 세포배양 장치는 제약, 생물공학, 의학 등의 분야에서 비용과 시간절감의 효과를 창출해 낸 것은 물론 정확도, 효율성 및 신뢰성을 높일 수 있다. 예를 들어, 미세 유체 세포배양 장치를 사용함으로써 단백질과 DNA 분석에 사용되는 값 비싼 시약들의 사용량을 기존의 방법보다 현저히 줄일 수 있어 상당한 비용 절감 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 단백질 샘플이나 세포 샘플도 기존의 방법보다 훨씬 적은 양이 사용되므로 샘플 낭비를 줄일 수 있다.Microfluidic cell culture devices can reduce costs and time in fields such as pharmaceuticals, biotechnology, and medicine, as well as increase accuracy, efficiency, and reliability. For example, by using a microfluidic cell culture device, the amount of expensive reagents used for protein and DNA analysis can be significantly reduced compared to existing methods, resulting in significant cost savings. Additionally, since much smaller amounts of protein samples or cell samples are used than existing methods, sample waste can be reduced.
최근, 마이크로미터 수준의 특정 영역에 선택적으로 세포를 고정화 시키는 세포 패터닝(cell patterning) 기술이 연구 중이고, 이는 세포-조직, 세포-표면, 또는 세포-매트릭스 사이의 상호작용과 같은 세포 생물학을 연구하는데 필요한 모델 시스템을 제공하고, 바이오센서(biosensor) 및 바이오칩(biochip) 개발을 위한 기반 기술로 역할 하고 있다. 시험관내 분석, 진단, 및 신약 개발에 소요되는 비용을 절감하고 높은 효율을 위해 고효율 검색(high throughput screening)의 필요성이 강조되면서, 세포 패터닝 기술을 이용하여 세포의 상호작용을 조절하고 이를 통해 증식 및 분화를 유도함으로써, 세포 어레이화, 기능화 및 조직화 등을 포함하는 세포배양 효율을 향상시키려는 노력이 진행중이다.Recently, cell patterning technology, which selectively immobilizes cells in specific areas at the micrometer level, is being studied, which is used to study cell biology such as interactions between cell-tissue, cell-surface, or cell-matrix. It provides the necessary model systems and serves as a base technology for the development of biosensors and biochips. As the need for high throughput screening is emphasized to reduce costs and achieve high efficiency in in vitro analysis, diagnosis, and new drug development, cell patterning technology is used to control cell interactions and thereby promote proliferation and Efforts are underway to improve cell culture efficiency, including cell arraying, functionalization, and organization, by inducing differentiation.
본 발명은 상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 특정 조건으로 레이저 조사에 의한 패턴을 형성시키고 외부자극을 가하여 세포배양 과정 중 다수의 계대배양(passaged culture) 시에도 세포가 보유하고 있는 원 기능과 특성을 유지 및 향상되도록 함으로써, 세포의 배양 성능을 유지할 수 있는 외부자극이 전달가능한 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.The present invention was developed to solve the above-described technical problem. By forming a pattern by laser irradiation under specific conditions and applying an external stimulus, the cell retains its original form even during multiple passages during the cell culture process. The purpose is to provide a muscle cell culture device and a culture method thereof in which a pattern capable of transmitting external stimuli capable of maintaining cell culture performance is formed by maintaining and improving function and characteristics.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the technical problem mentioned above, and other technical problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
상기의 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 일 실시예는, 마루(ridge)와 골(groove) 또는 점(dot)으로 구성되는 세포 배양 장치로써, 상기 세포 배양장치의 골(groove) 또는 점(dot)은 레이저(laser) 처리되어 형성될 수 있다.In order to achieve the above problem, one embodiment of the muscle cell culture device with a pattern according to the present invention is a cell culture device consisting of a ridge and a groove or a dot, wherein the cell culture The grooves or dots of the device may be formed by laser processing.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 세포 배양장치의 골(groove) 또는 점(dot)은 플라즈마(plasma) 처리되어 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, grooves or dots of the cell culture device may be formed by treatment with plasma.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 배양액은 상기 마루(ridge) 또는 골(groove) 또는 점(dot) 부위에 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the culture medium may be formed in the ridge, groove, or dot area.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 배양된 세포의 형태는 입체형태, 예를 들어 2D 또는 3D 형태로 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the cultured cells may be formed in a three-dimensional shape, for example, 2D or 3D shape.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 마루(ridge)의 폭(w) 또는 점(dot)의 직경(d)은 1 내지 100 마이크로미터 범위로 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 마루(ridge)의 폭(w) 또는 점(dot)의 직경(d)은 25 내지 80 마이크로미터 범위로 형성될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the width (w) of the ridge or the diameter (d) of the dot may be formed in the range of 1 to 100 micrometers. Preferably, the width (w) of the ridge or the diameter (d) of the dot may be formed in the range of 25 to 80 micrometers.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 0.1 내지 500mV/mm 범위의 전기장이 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, an electric field in the range of 0.1 to 500 mV/mm may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 1 내지 100 kPa 범위의 강도(Stiffness)가 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, a stiffness in the range of 1 to 100 kPa may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스(Acoustic pulse)가 인가될 수 있다. In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, acoustic pulses in the range of 0.01 to 0.1 mJ/mm 2 may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 1 내지 100 mT 범위의 자기장이 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, a magnetic field in the range of 1 to 100 mT may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 근육세포 배양 장치는 0 내지 30 % 범위의 산소가 인가될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, oxygen in the range of 0 to 30% may be applied to the muscle cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 세포는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 심장근육세포 및 식도상피세포를 포함하는 진핵세포로부터 선택된 1종을 포함될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the cells include myoblasts, fibroblasts, vascular endothelial cells, chondrocytes, hepatocytes, osteoblasts, kidney cells, adipocytes, corneal epithelial cells, stem cells, and nerve cells. , may include one type selected from eukaryotic cells including keratinocytes, cardiac muscle cells, and esophageal epithelial cells.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 세포 배양장치는 TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 플라스틱, 유리, 금속, 세라믹 및 고분자와 같은 생체재료로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함될 수 있다.In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the cell culture device is a biological material such as TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)), polydimethylsiloxane (PDMS), plastic, glass, metal, ceramic and polymer. It may contain one type selected from the group consisting of materials.
한편, 본 발명은 상기 세포 배양장치를 이용하는 세포 배양방법을 제공하는 바,Meanwhile, the present invention provides a cell culture method using the cell culture device,
세포 배양장치 상부에 세포 배양액을 도포하는 단계;Applying a cell culture medium to the top of the cell culture device;
레이저 처리하여 상기 세포 배양장치 상에 마루(ridge)와 골(groove)을 형성시키는 표면처리 단계; A surface treatment step of forming ridges and grooves on the cell culture device by laser treatment;
상기 마루(ridge)와 골(groove) 및 점(dot) 상에 근육세포를 이식하여 배양시키는 단계; 및transplanting and culturing muscle cells on the ridges, grooves, and dots; and
상기 세포 배양장치에 전기장을 인가하여 전기자극을 제공하는 단계;를 포함할 수 있다. It may include providing electrical stimulation by applying an electric field to the cell culture device.
본 발명에 따른 근육세포 배양장치의 일 실시예는, 상기 전기자극 과정은 0.1 내지 500mV/mm 범위의 전기장이 인가되어 수행될 수 있다. In one embodiment of the muscle cell culture device according to the present invention, the electrical stimulation process can be performed by applying an electric field in the range of 0.1 to 500 mV/mm.
본 발명에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치 및 이의 배양 방법은 특정 조건으로 레이저 조사에 의한 패턴을 형성시키고 세포배양 과정 중 다수의 계대배양(passaged culture) 시에도 세포 기능을 유지 및 향상되도록 함으로써, 원하는 세포의 특성 및 기능을 유지할 수 있는 효과를 가진다.The patterned muscle cell culture device and its culture method according to the present invention forms a pattern by laser irradiation under specific conditions and maintains and improves cell function even during multiple passages during the cell culture process. It has the effect of maintaining desired cell characteristics and functions.
본 발명의 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problem of the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 패턴 형상 과정을 나타내는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 전기자극 예시도이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법을 나타내는 흐름도이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 근육 전구 세포를 추출하는 과정을 나타내는 개념도이고,
도 5 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 근육 전구 세포생성 결과를 나타내는 그래프와 SEM 사진이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴 생성속도에 따른 세포형성 모양을 나타내는 SEM 사진이고,
도 9 및 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 패턴 간격에 따른 거칠기를 나타내는 그래프이고,
도 11 내지 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 레이저 패턴 처리된 배양장치의 전기자극 유무에 따른 세포 생성 효과를 나타내는 SEM 사진들이다.1 is a schematic diagram showing the pattern formation process of a muscle cell culture device in which a pattern is formed according to an embodiment of the present invention;
Figure 2 is an illustration of electrical stimulation of a patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention;
Figure 3 is a flowchart showing a method of culturing muscle cells with a patterned pattern according to an embodiment of the present invention;
Figure 4 is a conceptual diagram showing the process of extracting human muscle progenitor cells according to an embodiment of the present invention;
Figures 5 to 7 are graphs and SEM photographs showing the results of producing human muscle progenitor cells according to an embodiment of the present invention;
Figure 8 is an SEM photograph showing the shape of cell formation according to the pattern generation speed according to an embodiment of the present invention;
Figures 9 and 10 are graphs showing the roughness according to the pattern spacing of the patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention;
Figures 11 to 13 are SEM photographs showing the effect of cell generation according to the presence or absence of electrical stimulation in a culture device treated with a laser pattern according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명의 일 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 도는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings. When adding reference numerals to components in each drawing, it should be noted that identical components are given the same reference numerals as much as possible even if they are shown in different drawings. Additionally, when describing embodiments of the present invention, if detailed descriptions of related known configurations or functions are judged to impede understanding of the embodiments of the present invention, the detailed descriptions will be omitted.
본 발명의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.In describing the components of the embodiment of the present invention, terms such as first, second, A, B, (a), and (b) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, sequence, or order of the component is not limited by the term. Additionally, unless otherwise defined, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as generally understood by those skilled in the art to which the present invention pertains. Terms defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related technology, and should not be interpreted in an ideal or excessively formal sense unless explicitly defined in the present application. No.
본 발명에 있어서, '마루(ridge)'는 양각으로 가장 크게 변위가 일어난 부분을 지칭하고, '골(groove)'은 음각으로 가장 크게 변위가 일어난 홈 부분을 지칭한다. 또, '점(dot)은 양각 또는 음각으로 가장 크게 변위가 일어난 부분을 지칭한다. 본 발명에 있어서, 상기 '마루와 골로 구성된 구조'는 평면에 일정 간격으로 마루와 골이 형성된 패턴을 가지는 구조물을 지칭한다.In the present invention, 'ridge' refers to a positive portion where the greatest displacement occurred, and 'groove' refers to a negative groove portion where the greatest displacement occurred. Also, the 'dot' refers to the part where the greatest displacement occurred, either positive or negative. In the present invention, the 'structure composed of ridges and valleys' refers to a structure having a pattern in which ridges and valleys are formed at regular intervals on a plane.
본 발명에 있어서, '줄기세포'는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭하는 것으로, 단계별로 크게는 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 또한, 줄기세포는 그 유래에 따라 다양하게 분류할 수 있는데, 본 발명의 줄기세포는 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 위장관, 양막, 태반 또는 탯줄로부터 유래된 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, '전구세포(precursor cell)'는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로 위탁 줄기세포라고도 한다. 본 발명에 있어서, 전구세포(precursor cell)는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로 위탁줄기 세포라고도 한다. 이에, 조골세포 분화를 통한 뼈를 재생하고자 하는 본 발명은 조골세포의 전구세포를 이용하는 것이 바람직하다.In the present invention, 'stem cell' refers to a cell that has the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells, and is broadly categorized by stage into totipotent stem cell, totipotent stem cell ( It can be classified into pluripotent stem cells and multipotent stem cells. In addition, stem cells can be classified in various ways depending on their origin. The stem cells of the present invention are derived from bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, dental tissue, blood, umbilical cord blood, liver, gastrointestinal tract, amniotic membrane, placenta, or umbilical cord. It is characterized by being used, but is not limited to this. In the present invention, a 'precursor cell' is a cell at a stage before acquiring the form and function of a specific cell and is also called a committed stem cell. In the present invention, a precursor cell is a cell at a stage before acquiring the form and function of a specific cell and is also called a committed stem cell. Accordingly, the present invention, which seeks to regenerate bone through osteoblast differentiation, preferably uses osteoblast progenitor cells.
본 발명에 있어서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상으로, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 지칭한다. 아울러, '골분화'는 동물의 발달과정에서 나타나는 전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화 되어 골을 형성하는 일련의 생리적인 반응인 골형성 과정 중에서도 골기질을 형성하는 과정, 또는 자연적 혹은 인위적으로 동물의 줄기세포의 분화를 유도하여 골기질을 형성하는 과정을 모두 포함하는 개념이다.In the present invention, 'differentiation' is a phenomenon in which cells specialize in structure or function while they divide and grow, and the cells, tissues, etc. of living organisms change their form or function to perform a given task. refers to In addition, 'osteodifferentiation' refers to the process of forming bone matrix, which is a series of physiological reactions in which progenitor cells that appear during the development of animals differentiate to form bone matrix, and the formed bone matrix is calcified to form bone. It is a concept that includes the process of forming bone matrix by naturally or artificially inducing differentiation of animal stem cells.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 패턴 형상 과정을 나타내는 모식도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치의 동작 예시도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the pattern formation process of the patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention, and Figure 2 is an exemplary operation diagram of the patterned muscle cell culture device according to an embodiment of the present invention. .
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 근육세포 배양 장치는 배양액이 도포된 기판상에 본 발명에 따른 레이저 처리(laser treatment)에 의하여 마루(ridge)와 골(groove)이 형성될 수 있다. 이와 같이 상기 마루와 골이 형성된 배양 장치에 소정의 전류에 의한 전기자극을 가하여 근육세포 배양 장치를 제조할 수 있다.Referring to Figures 1 and 2, in the muscle cell culture device according to the present invention, ridges and grooves can be formed on a substrate coated with a culture medium by laser treatment according to the present invention. there is. In this way, a muscle cell culture device can be manufactured by applying electrical stimulation by a predetermined electric current to the culture device in which the ridges and valleys are formed.
하나의 예에서, 본 발명의 배양기판은 주형으로서 상업적으로 구매가 가능한 TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene))을 포함할 수 있다. 이때 TCP는 기본 주형으로 세포배양에 최적화된 플라스틱 형태의 몰드이다.In one example, the culture substrate of the present invention may include commercially available TCP (Tissue Culture Plastic (Polystyrene)) as a template. At this time, TCP is the basic mold and is a plastic mold optimized for cell culture.
경우에 따라서, 상기 기판으로 온도감응성 또는 비온도감응성 특성을 갖는 알지네이트 하이드로젤(alginate hydrogel)을 배양기판으로 포함할 수 있다.In some cases, the substrate may include alginate hydrogel having temperature-sensitive or non-temperature-sensitive characteristics as a culture substrate.
이하, 본 발명의 패턴화된 세포 배양기판을 이용한 패턴을 갖는 세포배양 방법에 대해 설명한다.Hereinafter, a method for cultivating cells with a pattern using the patterned cell culture substrate of the present invention will be described.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법을 나타내는 흐름도이다.Figure 3 is a flowchart showing a method for cultivating patterned muscle cells according to an embodiment of the present invention.
먼저, 기판의 상에 기판 상에 레이저를 이용하여 소정의 간격을 갖는 패턴을 형성시킨다. 이 때, 상기 패턴은 대략 1 내지 80 마이크로미터의 폭(ridge)을 갖는 상기 마루가 소정의 간격으로 형성될 수 있다(S200). 실질적으로 상기 마루 부위에서 세포가 부착되어 증식하게 된다. 여기서, 상기 패턴은 대략 25 내지 80 마이크로미터의 폭으로 형성되는 것이 바람직하다.First, a pattern with a predetermined spacing is formed on a substrate using a laser. At this time, the pattern may be formed with ridges having a width (ridge) of approximately 1 to 80 micrometers at predetermined intervals (S200). Substantially, cells attach and proliferate at the ridge area. Here, the pattern is preferably formed to have a width of approximately 25 to 80 micrometers.
다음으로, 상기와 같은 패턴이 형성된 배양기판 상에서 근육세포를 배양한다(S300). 여기서, 상기 세포는, 하나의 예로써, 도 4에 도시된 바와 같은 방법으로 준비할 수 있다. 즉, 인체의 후두 부위에 조직을 절개하여 분리한 후에 비이커에 투입한다. 상기 비이커에 소화효소(enzyme)를 투입하되 대략 37도에서 1시간 동안 용해시킨다. 이 때, 상기 소화효소로 콜라겐 분해효소인 콜라게나제(collagenase) 및 단백질 분해효소인 디스파제(dispase)를 사용할 수 있다. 그 다음으로 상기 용해된 용액을 대략 5분동안 원심분리하여 침전시키고 근육 전구세포와 섬유 세포 등을 재부유(resuspension) 과정이 수행됨으로써, 근육 전구세포를 준비할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이와 같이 준비된 근육 전구세포는, 도 5 내지 도 7에 도시된 바와 같이, 유세포 측정결과에서 줄기세포 마커(marker), 근육줄기 마커 및 위성세포 마커가 확인되었으며 면역염색을 통하여 정상적으로 확인할 수 있다.Next, muscle cells are cultured on a culture substrate patterned as above (S300). Here, as an example, the cells can be prepared by the method shown in FIG. 4. That is, the tissue is cut and separated from the larynx area of the human body and then placed in a beaker. Add digestive enzymes to the beaker and dissolve them at approximately 37 degrees for 1 hour. At this time, collagenase, a collagen decomposing enzyme, and dispase, a proteolytic enzyme, can be used as the digestive enzyme. Next, the dissolved solution is centrifuged for approximately 5 minutes to precipitate, and a resuspension process is performed to prepare muscle progenitor cells and fiber cells. According to the present invention, the muscle progenitor cells prepared in this way were confirmed to have stem cell markers, muscle stem markers, and satellite cell markers in flow cytometry results, as shown in Figures 5 to 7, and were normal through immunostaining. You can check it.
이와 같이 배양되는 세포는 본 발명에서는 근육세포로 설명하고 있으나, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 귀, 피부, 쓸개조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등으로부터 분리되거나 활성화할 수 있는 세포를 사용할 수도 있다. 배양조건은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있고, 이러한 내용은 이미 이 분야에서 널리 알려진 공지의 기술이므로 자세한 설명은 생략한다.The cells cultured in this way are described as muscle cells in the present invention, but are not particularly limited and include, for example, liver, kidney, spleen, bone, bone marrow, thymus, heart, muscle, lung, brain, testis, ovary, and islet. Cells that can be isolated or activated from (islet), intestines, ears, skin, gallbladder tissue, prostate, bladder, embryo, immune system, and hematopoietic system can also be used. Culture conditions may vary depending on the type of cell, and since this is a well-known technology already widely known in this field, detailed description will be omitted.
다음으로, 상기 근육 전구세포가 배양되는 상기 기판에 대략 0.1 내지 500 mV/mm 범위의 전기장이 인가되는 과정이 수행된다(S400). 이러한 전기자극 과정을 통하여 세포의 증식력과 분화력 및 방향성을 최적화하여 세포의 특성을 보다 용이하게 확보할 수 있게 된다. 바람직하게는, 상기 인가되는 전압은 0.1 내지 100mV/mm 범위의 전기장이 인가될 수 있다.Next, a process is performed in which an electric field in the range of approximately 0.1 to 500 mV/mm is applied to the substrate on which the muscle progenitor cells are cultured (S400). Through this electrical stimulation process, it is possible to more easily secure the characteristics of cells by optimizing the proliferation, differentiation, and direction of cells. Preferably, the applied voltage may be an electric field in the range of 0.1 to 100 mV/mm.
경우에 따라서, 상기 근육 전구세포가 배양되는 상기 기판은 대략 1 내지 100 kPa 범위의 강도, 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스, 1 내지 100 mT 범위의 자기장 및 0 내지 30 % 범위의 산소가 인가될 수 있다.In some cases, the substrate on which the muscle progenitor cells are cultured may have an intensity ranging from approximately 1 to 100 kPa, an acoustic pulse ranging from 0.01 to 0.1 mJ/mm 2 , a magnetic field ranging from 1 to 100 mT, and oxygen ranging from 0 to 30%. may be approved.
이와 같이 패턴 및 전기자극 과정이 수행되어 제조된 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치에서 소정의 시간동안 배양된 세포의 방향성을 확인하여 도 8에 나타냈다. 도 8에 도시된 바와 같이, 레이저를 이용하여 대략 1 내지 2000 mm/s 속도로 변화를 주며 상기 패턴을 형성시키되, 상기 패턴의 마루(ridge)의 폭을 30 내지 100 마이크로미터 크기로 형성시킨 후 세포의 방향성(orientation degree)을 가시적으로 확인하였다. 이를 통하여 상기 패턴의 마루(ridge)의 폭이 30 내지 50 마이크로미터 크기로 형성되는 경우에 세포의 증식력이 적절히 유지되면서도 방향성이 형성되는 것을 확인하였다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 상기 패턴의 마루(ridge)의 폭이 40 마이크로미터 크기일 경우에 가장 우수한 세포 증식력과 방향성을 유지할 수 있다. 이러한 세포의 방향성은 구체적인 수치로 평가될 수 있으며, 예를 들어, 상기 패턴의 마루를 따라 증식되는 세포 군집의 길이가 상기 마루를 따라 형성되는 세포 증식의 폭과 대비하여 대략 100 내지 500% 범위를 유지하는 경우에 우수한 방향성을 만족하는 것으로 판단할 수 있으며, 우수한 방향성은 세포의 특성을 변화 및 유지시키는데 도움을 줄 수 있다.In this way, the pattern and electrical stimulation process was performed to confirm the directionality of the cells cultured for a predetermined time in the muscle cell culture device in which the pattern was formed, which is shown in FIG. 8. As shown in Figure 8, the pattern is formed using a laser at a speed of approximately 1 to 2000 mm/s, and the width of the ridge of the pattern is formed to be 30 to 100 micrometers. The orientation degree of the cells was visually confirmed. Through this, it was confirmed that when the width of the ridge of the pattern was formed to be 30 to 50 micrometers, the proliferative power of the cells was appropriately maintained and directionality was formed. According to the present invention, the best cell proliferation and directionality can be maintained when the width of the ridge of the pattern is 40 micrometers. The directionality of these cells can be evaluated with specific values, for example, the length of the cell population proliferating along the crest of the pattern ranges from approximately 100 to 500% compared to the width of cell proliferation formed along the crest. If maintained, it can be judged that excellent directionality is satisfied, and excellent directionality can help change and maintain the characteristics of cells.
한편, 전술한 패턴 및 전기자극 과정이 수행되어 제조된 패턴이 형성된 근육세포 배양 장치에서 소정의 시간동안 배양된 세포의 생성 결과를 확인하여 도 11 내지 도 13에 나타냈다. 이들 도면에 도시된 바와 같이, 전술한 소정의 폭을 갖는 마루(ridge)를 레이저를 이용하여 형성시킨 후, 세포를 배양시키고 대략 0.1 내지 100mV/mm 범위의 전기장이 인가하는 경우에 보다 높은 방향성을 유지하면서 세포의 배양이 가능한 것을 확인할 수 있다. 이와 비교하여, 전류 인가에 따른 전기자극을 가하지 않거나 250mV/mm 이상의 전기장을 인가하는 경우에 오히려 세포가 사멸하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직하게는 전기장이 대략 0.1 내지 100mV/mm 범위일 수 있다.Meanwhile, the results of producing cells cultured for a predetermined time in the muscle cell culture device in which the pattern prepared by performing the above-described pattern and electrical stimulation process were confirmed were shown in Figures 11 to 13. As shown in these figures, after forming a ridge having the above-described predetermined width using a laser, cells are cultured and an electric field in the range of approximately 0.1 to 100 mV/mm is applied, resulting in higher directivity. It can be confirmed that cell culture is possible while maintaining the condition. In comparison, it can be seen that cells die when electrical stimulation according to current application is not applied or when an electric field of 250 mV/mm or more is applied. Therefore, according to the present invention, preferably the electric field may range from approximately 0.1 to 100 mV/mm.
이상, 본 발명의 일 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하였다. 그러나, 본 발명의 실시예가 반드시 상술한 일 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의한 다양한 변형 및 균등한 범위에서의 실시가 가능함은 당연하다고 할 것이다. 그러므로, 본 발명의 진정한 권리범위는 후술하는 청구범위에 의하여 정해진다고 할 것이다.Above, an embodiment of the present invention has been described in detail with reference to the attached drawings. However, the embodiments of the present invention are not necessarily limited to the above-described embodiment, and it is natural that various modifications and equivalent implementations can be made by those skilled in the art. will be. Therefore, the true scope of rights of the present invention will be determined by the claims described later.
Claims (14)
상기 세포 배양장치에 0.1 내지 100mV/mm 범위의 전기장이 인가되는 전기장이 인가되는 전기자극 단계;를 포함하여 세포의 증식력과 방향성을 확보하고,
상기 전기자극 단계는,
1 내지 100 kPa 범위의 강도(Stiffness), 0.01 내지 0.1 mJ/mm2 범위의 음향펄스(Acoustic pulse), 1 내지 100 mT 범위의 자기장, 및 0 내지 30%범위의 산소 중 하나 이상이 인가되는, 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법.
Applying a cell culture medium and creating a pattern including at least one of ridges, grooves, and dots in the range of 30 to 50 micrometers using at least one of laser and plasma. A culture step of transplanting and culturing muscle cells into the formed cell culture device; and
Including an electrical stimulation step in which an electric field in the range of 0.1 to 100 mV/mm is applied to the cell culture device to ensure the proliferative power and direction of the cells,
The electrical stimulation step is,
A pattern in which one or more of a stiffness in the range of 1 to 100 kPa, an acoustic pulse in the range of 0.01 to 0.1 mJ/mm2, a magnetic field in the range of 1 to 100 mT, and oxygen in the range of 0 to 30% are applied. This method of culturing the formed muscle cells.
상기 세포는,
근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 심장근 육세포 및 식도상피세포를 포함하는 진핵세포로부터 선택된 1종을 포함하는, 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법.
According to claim 1,
The cells are,
From eukaryotic cells, including myoblasts, fibroblasts, vascular endothelial cells, chondrocytes, hepatocytes, osteoblasts, kidney cells, adipocytes, corneal epithelial cells, stem cells, neurons, keratinocytes, cardiomyocytes, and esophageal epithelial cells. A method of culturing patterned muscle cells comprising one selected species.
배양된 상기 세포의 형태는 2D 또는 3D 형태로 형성되는, 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법.
According to claim 1,
A patterned muscle cell culture method, wherein the cultured cells are formed in a 2D or 3D shape.
상기 세포 배양장치는 TCP (Tissue Culture Plastic), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 플라스틱, 유리, 금속, 세라믹 및 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함하는, 패턴이 형성된 근육세포 배양 방법.
According to claim 1,
The cell culture device is a patterned muscle cell culture method comprising one selected from the group consisting of TCP (Tissue Culture Plastic), polydimethylsiloxane (PDMS), plastic, glass, metal, ceramic, and polymer.
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|---|---|---|---|
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