KR20230047329A

KR20230047329A - 졸중을 치료하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20230047329A
Application number: KR1020227044205A
Authority: KR
Inventors: 용팅 왕; 마크 펠더 앨런; 앤서니 산드라사그라; 마니샤 신하
Original assignee: 엘레비안, 인크.
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-04-07
Also published as: US20230263860A1; CA3179133A1; JP2023526507A; EP4154001A4; AU2021273813A1; EP4154001A1; WO2021236824A1

Abstract

포유동물 대상체에서 졸중을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 조성물 및 방법은 일반적으로 졸중 사건 후 짧은 시간 창 이내에 개시되는, 유효량의 성장 및 분화 인자 11 (GDF11) 분자의 대상체에 대한 투여를 수반하며, 여기서 GDF11 분자가 대상체의 체중에 비해 고용량으로 투여되고 이러한 투여 요법은 1일 내지 약 14일 범위의 짧은 기간에 걸쳐 수행된다.

Description

졸중을 치료하기 위한 방법 및 조성물

우선권

이 특허 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2020년 5월 19일에 출원된 "졸중을 치료하기 위한 방법 및 조성물"이라는 제목의 미국 특허 출원 일련 번호 63/026,809를 우선권 주장하며, 이 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 일반적으로 성장 분화 인자 11 분자 (GDF11)를 대상체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 상기 대상체에서 졸중을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

도입

다수의 연구는 특정 혈액-매개(borne) 인자가 조직 항상성 및 재생을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈다 (예를 들어, 문헌 [Conboy et al. (2005) Nature 433(7027): 760-764; Ruckh et al. (2012) Cell Stem Cell 10(1): 96-103; Loffredo et al. (2013) Cell 153(4): 828-839; Katsimpardi et al. (2014) Science 344(6184): 630-634]; 및 [Sinha et al. (2014) Science 344(6184): 649-652] 참조). 하나의 이러한 순환 혈액 인자는 성장 분화 인자 (GDF11)이며, 이는 피부 및 근육, 심혈관, 및 신경계를 포함한 다수의 상이한 조직계에서 재생 능력을 광범위하고 지속적으로 자극하는 것으로 입증되었다 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호: WO 2013/142114; WO 2014/168973; WO 2014/201143; 및 WO 2015/070076 참조). 상기-언급된 간행물에 후속적으로, GDF11의 하기 보편적인 치료 및 재생 효과가 인식되어 보고되었다: 신장 허혈-재관류 손상 후 개선된 세뇨관 재생 (Zhang et al (2016) Scientific Reports 6(1): 34624); 내피 손상에 대한 보호 (Mei et al. (2016) Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy 24(11): 1926-1938); 심장 허혈-재관류 손상 후 증강된 심근 재생 (Du et al. (2017) Basic Research in Cardiology 112(1): 7); 2형 당뇨병에서 개선된 인슐린 분비 및 글루코스 내성 (Li et al. (2017) Diabetes 66(7): db170086-1927); 폐기종 (COPD)에서 개선된 폐 기능 (Onodera et al. (2017) Thorax April); 삼중-음성 유방암에서의 종양-억제 (Bajikar et al. (2017) Developmental Cell 43(4): 418-435); 심장 비대의 역전 (Harper et al. (2018) Circulation Research 7 Sep 2018); 당뇨병성 사지 허혈에서 신생혈관형성 및 혈류의 촉진 (Zhang et al. (2018) Diabetes); 대뇌 허혈-재관류 손상에서 개선된 신경거동 회복 및 혈관신생 (Ma et al. (2018) Brain Research Bulletin 139(February): 38-47); 알츠하이머병에서 구조된 인지 기능 및 개선된 뇌혈관 기능 (Zhang et al. (2018) Journal of Alzheimer's Disease 62(2)); 졸중 후 대뇌 신생혈관형성, 신경발생 및 기능 회복의 촉진 (Lu et al. (2018) Front Cell Neurosci 12: 205); 궤양성 대장염 동안에 장 염증소체 활성화의 예방 (Wang et al. (2018) Am J Physiology Gastrointest Liver Physiology); 건선에서 약화된 피부 염증 (Wang et al. (2018) Inflammation).

2013년에, 대략 690만명이 허혈성 졸중에 걸렸고, 340만명이 출혈성 졸중에 걸렸다 (Global Burden of Disease Study 2013 Collaborators (August 2015) The Lancet 386(9995): 743-800). 2015년에, 졸중은 관상 동맥 질환에 이어서 두 번째로 가장 빈번한 사망 원인이었으며, 전체의 11%를 차지하였다 (GBD 2015 Mortality and Causes of Death Collaborators (October 2016) The Lancet 388(10053): 1459-1544). 출혈성 졸중이 허혈성 사건에 의해 개시되었는지를 확인하기 어렵기 때문에 방대한 대부분의 졸중이 허혈성인 것으로 일반적으로 인정된다. 현재의 의약 개입 및 졸중 치료는 유난히 매우 시급하게 다루어야 한다. 급성 허혈성 졸중에서, 예컨대 재조합 조직 플라스미노겐 활성인자 (rtPA)로의, 혈전용해의 최적 표준(gold standard)은, 증상 시작 3시간 이내에 투여할 때, 불구(disability) 없이 살아가는 것과 관련하여 약 10%의 전반적인 이점을 제공하나 생존 기회를 개선시키지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Wardlaw et al. (July 2014) The Cochrane Database of Systemic Reviews 7(7): CD000213] 및 [Emberson et al. (2014) The Lancet 384(9958): 1929-1935] 참조). 증상 시작 3시간과 4시간 30분 내지 5시간 사이에 혈전용해제의 투여의 바람직함은 상기 투여가 치료적 이점을 제공하는지 또는 잠재적 추가 손상을 유발하는지에 대해 논쟁의 대상이다. 카테터가 동맥을 통해 뇌로 전달되고 의약이 혈전증 부위에 주사되는 동맥내 섬유소용해술은 급성 허혈성 졸중의 결과를 개선시키는데 이점을 나타냈다 (예를 들어, 문헌 [Lee et al. (2010) Stroke 41(5): 932-937] 참조). 허혈성 졸중을 유발하는 혈전의 기계적 제거 (기계적 혈전절제술)는 큰 동맥, 예를 들어, 중대뇌 동맥)의 폐색에 대한 또 다른 잠재적 치료를 나타내며, 공개된 검토는 증상 시작 최대 24시간 이내에 수행할 경우 장애를 감소시키는데 이러한 절차의 안전성 및 효능을 보고하였으나, 다시 생존 기회를 개선시키지는 않았다 (예를 들어, 문헌 [Sardar et al. (2015) European Heart Journal 36(35): 2373-2380; Saver et al. (2016) JAMA 316(12): 1279-1288; Goyal et al. (2016) The Lancet 387(10029): 1723-1731; Mistry et al. (2017) Stroke 48(9): 2450-2456]; 및 [Powers et al. (2018) Stroke 49(3): e46-e110] 참조).

졸중 사건 후 신속하게 투여되는 의약 개입의 낮은 치료적 이점을 고려해 볼 때, 졸중의 치료는 전통적인 3-갈래의 접근법으로 진화하였으며, 여기서 첫 번째 갈래는 예방으로 이루어진다. 예를 들어, 심근 경색 또는 다른 높은 심혈관 위험을 갖고 있는 집단에서, 매일 아스피린은 특정 예방 효과를 가질 수 있다. 이전에 졸중에 걸렸던 집단의 경우, 아스피린, 클로피도그렐 및 디피리다몰 치료는 이점을 제공할 수 있다. 고혈압, 심방 세동, 고콜레스테롤 수준, 진성 당뇨병 등과 같은 변형가능한 위험 인자는 의약 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 마찬가지로 치료될 수 있다. 치료의 두 번째 갈래는 졸중 사건이 발생한 직후 발생하는 시간-창에 적용되는 상기에 상세히 설명한 의약 및 기계적 접근법을 수반한다. 세 번째 갈래는 재활, 예를 들어 물리 요법, 작업 요법 및 언어 병리학을 수반한다. 이와 관련하여, 졸중 생존자는 전형적으로 처음 몇 개월 이내에 어느 정도의 기능 회복을 나타내긴 하지만, 이들은 종종 운동, 감각, 및 인지 장애를 포함한 유의한 신경학적 결함이 남아 있다. 졸중으로 인해 영구적으로 상실된 신경 세포와 회로를 대체하기 위해 할 수 있는 일이 거의 없다는 일반적으로 여겨지는 믿음이 있긴 하지만, 졸중 치료제의 최근 생겨난 네 번째 갈래, 즉 졸중에 의해 손상된 신경 조직 및 신경계의 가능한 약효가 있는 복구 또는 원기회복을 달성하기 위해 추구되는 다수의 접근법이 검토되었다 (예를 들어, 문헌 [Iaci et al. (2013) Stroke 44: 1942-1950] (달팜프리딘) 및 [Iaci et al. (2016) Journal of Neuroscience Research 94: 253-265] (뉴레귤린 1β3, 신경아교세포 성장 인자) 참조). 그러나, 현재까지, 졸중 사건으로 손상된 신경 조직 및/또는 신경계의 복구 또는 원기회복을 위해 승인된 어떠한 의약품도 없다.

따라서 졸중 사건에 의해 손상된 신경 조직 및/또는 신경계의 복구 또는 원기회복에 적합한 신규한 방법 및 조성물을 개발하고 이용하기 위한 긴급하고 오랫동안 느껴온 필요성이 관련 기술분야에 존재한다. 이러한 긴급하고 오랫동안 느껴온 필요성에 대한 응답으로, 본 발명자들은 놀랍게도 대상체에서 졸중 사건 후 약 12시간 내지 약 3일 이내에, 제한된 투여 기간에 걸쳐, 고용량의 성장 분화 인자 11 (GDF11) 분자를 상기 대상체에게 투여하는 것이 부수적인 유해 효과 없이 오래가며 지속적인 치료 (졸중 사건에 의해 손상된 신경 조직 및/또는 신경계의 복구 또는 원기회복)를 가져온다는 것을 밝혀냈다.

다수의 연구는 설치류 졸중, 당뇨병 관련 말초 동맥 질환, 및 AD 모델에서 rGDF11의 매일 투여 직후 내피 세포의 신생혈관형성 및 증식을 보고하였다 (예를 들어, 문헌 [Ma et al. (2018) Brain Research Bulletin 139(February): 38-47; Lu et al. (2018) Front Cell Neurosci 12: 205]; 및 [Zhang et al. (2018) Journal of Alzheimer's Disease 62(2)] 참조). 특히, 알츠하이머병 (AD) 마우스 모델에서, 0.1 mg/kg으로 28일 동안 매일 rGDF11의 정맥내 투여는 뇌혈관 구조, 기능, 혈류를 개선시키고 인지 기능을 또한 구조하는 것으로 나타났다 (상기에 언급한 것과 같은 문헌 [Zhang et al. (2018)]). 어린 성체 래트 대뇌 허혈/재관류 (I/R) 모델에서의 연구는 0.1 mg/kg으로 I/R 후 7일 또는 14일 동안 매일 rGDF11의 정맥내 투약은 신경기능 회복을 개선시키고, 경색-주변 피질의 기능성 미세혈관 수를 증가시키며 뇌 내피 세포의 증식 및 신경 재생을 촉진시킨다는 것을 입증하였다 (상기에 언급한 것과 같은 문헌 [Ma et al. (2018)]). 마찬가지로, 어린 성체 마우스에서 0.1 mg/kg으로 I/R 후 7일 동안 매일 rGDF11의 복강내 투여는 14일에 시작되어 신경기능 회복, 신경발생, 및 신경 재생의 증강을 발생시켰다 (상기에 언급한 것과 같은 문헌 [Lu et al. 2018)]). 더욱이, 고령의 마우스를 사용한 졸중 모델에서, 허혈성 졸중 후 5일차에 시작되어 5일 동안 매일 0.1 mg/kg으로 rGDF11의 주사는 유의하게 개선된 사망률을 발생시키는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Chauhan et al. (2018) Stroke 49] 참조)). 이 고령의 뮤린 졸중 모델에서 rGDF11 처리의 다른 이점은 졸중 후 14일 및 30일차에 신경교증 감소, 혈관신생 증가, 백질 무결성 회복, 및 시냅스 가소성을, 뇌 조직 상실 감소 및 병리학적 측뇌실 확대, NeuN+ 뉴런 수 증가 및 운동 기능 개선에 더하여 포함한다 (상기에 언급한 것과 같은 문헌 [Chauhan et al. (2018)]).

보다 최근에는, 실험적 뇌내 출혈 (ICH) 전 28일 동안 rGDF11의 매일 주사는 24-개월령 래트의 뇌 주위혈액 조직에서 신경학적 결손을 감소시키고 ICH-유도 부종, 염증, 아폽토시스, 산화 스트레스, 및 미토콘드리아 손상을 완화시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Anqi et al. (2019) J Clin Neurosci 63: 182-188] 참조). GDF11 유전자를 보유하는 렌티바이러스를 사용한 전처리는 래트 모델에서 대뇌 I/R에 대해 보호적인 것으로 나타났다 (문헌 [Zhao et al. (2020) Brain Res. 1 737: 146802] 참조). GDF11-렌티바이러스 전처리는 뇌경색 부피 및 아폽토시스 세포를 감소시켰고 거동 회복을 촉진시켰을 뿐만 아니라 뇌실하 구역 (SVZ)에서 신경발생 및 혈관신생을 촉진시켰다. 또한, 재관류 후 24시간에 측뇌실로에 1.25 ng의 rGDF11의 단일회 주사는 일과성 허혈성 졸중 후 5일에 뇌경색 부피를 감소시키고, 경색-주변 대뇌 피질의 아폽토시스 세포 수를 감소시키고 거동 회복을 촉진시키는 것으로 보고되었다 (상기에 언급한 것과 같은 문헌 [Zhao et al. (2020)]).

상기-언급한 연구 모두가 GDF11의 저용량 또는 소위 "중간 정도의" 용량 투여 (설치류 대상체에서 1.25 ng의 GDF11의 단일회 투여, 또는 0.1 mg/kg으로 GDF11의 매일 투약)를 표적으로 했다는 점이 주목할 만하다. 본 발명자들은 이것이 두 가지 고려사항으로 인한 것이라고 여긴다. 첫째, 포유동물의 기준선 GDF11 수준은 약 3-5 ng/mL (공개되지 않음)이며, 따라서 과거 투약 패러다임은 GDF11 혈장 수준을 실질적으로라기보다는 증분적으로 증가시키도록 구조화된 것으로 여겨진다. 둘째, 그리고 아마도 보다 유의하게, 다수의 연구는 초생리학적 또는 소위 "과도한" 용량의 GDF11이 악액질, 근육 위축, 식욕부진 및 신장 섬유증을 포함한, 유의한 유해 효과를 일으키는 것으로 보고하였다 (예를 들어, 문헌 [Hammers et al. (2017) EMBO Molecular Medicine 9(4): 531-544; Pons et al. (2018) Surgery (May)]; 및 [Jones et al. (2018) Cell Reports 22(6): 1522-1530] 참조). 게다가, 증가된 GDF11 수준이 결장직장암에서 밝혀졌다 (Gu et al. (2018) Cell Mol Biology Noisy-le-grand France 64: 80-84). 노화 해마에서의 단일 연구가 최대 1 mg/kg까지의 용량으로 GDF11의 매일 투여 (Ozek et al. (2018) Sci Rep 8: 17293)를 유의한 유해 효과의 관찰 없이 보고하였긴 하지만, 임의의 고려되는 치료에서 고용량 GDF11의 사용을 표적으로 하는 것에 대한 관련 기술분야에서 강한 편향이 확실히 존재한다.

따라서, 대상체에서 졸중을 치료하는 방법을 제공하는 것이 본 개시내용의 주요 측면이다. 상기 방법은 대상체에서 졸중 사건 후 약 12시간 내지 72시간의 시간 프레임 이내에 치료 유효량의 GDF11 분자를 대상체에게 투여함으로써 투약 요법을 시작하는 것을 수반한다. GFD11 분자는 대상체의 체중에 비해 적어도 약 최소한의 고용량의 GDF11의 양으로 투여되며 2일 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 수행된다. 본 개시내용의 한 측면에서, GDF11 분자는 2일 내지 약 7일의 기간에 걸쳐 투여된다. 본 개시내용의 한 특정한 측면에서, 방법은 졸중 사건 후 약 12시간 내지 24시간 이내에 투약 요법의 개시를 수반한다. 또 다른 특정한 측면에서, GDF11 분자의 투여는 2일 내지 4일의 기간에 걸쳐 수행된다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, GDF11 분자는 설치류 대상체에서 1일 약 1 내지 2 mg/kg의 양으로 또는 대형 포유동물 대상체에서 상응하는 용량으로 대상체에게 투여된다. 본 개시내용의 방법의 실시에서, 즉, 투약 요법의 신속한 개시 (졸중 사건으로부터 약 12시간 내지 약 3일 이내에), GDF11 분자의 고용량 투여, 및 제한된 치료 지속기간 (2일 내지 약 14일)은 수반되는 유해 효과 없이 졸중 대상체에서 오래가며 지속적인 치료를 제공하는데 효과적이다.

본 방법의 실시에 사용되는 GDF11 분자는 투약 요법 과정에 걸쳐 이용되는 조성물에서 동일하거나 상이할 수 있는 GDF11 분자의 임의의 치료 활성 형태이다. 이와 관련하여, 인간의 천연 GDF11 단백질은 GDF11 유전자에 의해 코딩되며 인간, 마우스 및 래트에서 동일한 분자 구조를 갖는다. 따라서 GDF11의 서열은 여러 포유동물 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며, GDF11은 골격근, 췌장, 신장, 신경계 및 망막을 포함한 많은 조직에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. 인간 GDF11의 경우, 프로-펩티드에 더하여 신호 서열 (예를 들어, 전구체 폴리펩티드)은 길이가 407개 아미노산이다. 24개 아미노산 신호 펩티드의 절단은 383개 아미노산의 프로-펩티드를 생성하고 프로-펩티드의 절단은 프로-펩티드의 C-말단 109개 아미노산에 상응하는 109개 아미노산의 성숙한 GDF11 폴리펩티드를 발생시킨다. GDF11 폴리펩티드 분자의 성숙한 형태는 디술피드-연결 동종이량체를 형성한다. 따라서, "천연" GDF11 분자의 임의의 유도체, 변이체 또는 변형된 형태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법 및 기술을 사용하여 (동종이량체로서 그의 완전히 활성인 형태로) 천연 인간 GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태의 활성에 대한 대상 분자의 약리학적 활성의 비교에 의해 "치료 활성" GDF11 분자인 것으로 결정될 수 있다.

따라서, 본 개시내용의 특정 바람직한 측면에서, 방법에서 사용하기 위해 선택된 GDF11 분자는 동종이량체의 형태로 제공될 수 있는 GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태일 수 있다. 선택된 GDF11 분자는 대안적으로 인간 GDF11의 천연 서열과 적어도 91% 서열 상동성을 가진 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는, GDF11 분자는 성숙한 형태의 재조합 인간 GDF11 (rhGDF11)이다. 다른 측면에서, GDF11 분자는 인간 GDF11 분자의 치료 활성 변이체 또는 유도체이다. 이러한 변이체 또는 유도체는 인간 GDF11 분자의 천연 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있고 하나 이상의 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 선택된 GD11 분자는 변형된 GDF11 폴리펩티드일 수 있으며, 예를 들어 분자가 인산화, 당화, 글리코실화, PEG화, HES화, ELP화, 지질화, 아세틸화, 아미드화, 말단-캡핑되어 있는 경우, 시아노 기, 알부민을 포함하거나, 또는 고리화된다. 대안적으로, 변형된 GDF11 분자는 적어도 2개의 모이어티, 즉 제1 GDF11 분자 모이어티 및 제2 모이어티를 갖는 키메라 폴리펩티드일 수 있으며, 예를 들어, 여기서 제2 모이어티가 트랜스페린, 성장 호르몬 또는 Fc 단편으로부터 유래된다. 바람직한 측면에서, 변형된 GDF11 분자는 천연 GD11 폴리펩티드의 성숙한 형태에 비해 증가된 반감기를 가질 것이다. 아무튼, 선택된 GDF11 분자는 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있는 대상체에게 투여하기 위한 적합한 제약 조성물로 제제화된다.

GDF11 분자의 투여는 GDF11이 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르는 것으로는 보이지 않으며 전신적으로 이용가능하게 될 때 효과적이기 때문에 비경구 투여를 통해 수행된다. GDF11 분자의 투여는 추가로 1일 1회 (QD) 기준, 1일 2회 (BID), 1일 3회 (TID), 1일 4회 (QID), 매시간 ("q_h" 여기서 "h"는 용량 사이의 시간의 수를 나타냄) 등으로 수행될 수 있으며, 각각의 치료일은 치료 과정에 걸쳐 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시내용의 특정한 측면에서, 투여는 1일 1회 (QD) 수행된다. 예를 들어, GDF11 분자를 함유하는 조성물은 중심 정맥 카테터 라인 또는 유사한 IV 카테터와 같은 카테터를 통해 대상체에게 정맥내로 투여될 수 있다. 대안적으로, GDF11 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 주사를 통해 투여될 수 있다. 따라서 특정 측면에서, 조성물은 주사용수와 같은 적합한 주사용 비히클을 포함하도록 간단하게 제제화될 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 주입 펌프와 같은 외부 약물 펌프를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물은 제어, 지속 또는 지연 방출 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법의 실시에서, 조성물은 리포솜과 같은 나노입자의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 생침식성 중합체 또는 비중합체 제어 방출 부형제를 추가로 포함할 수 있고 주사가능한 액체 임플란트의 형태 또는 마이크로입자의 형태로 제공될 수 있다. 본 개시내용의 방법의 실시에서, GDF11 분자는 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태로 조성물에 존재할 수 있다.

본 개시내용의 특정한 측면에서, 방법의 실시에 이용되는 치료의 정확한 투여량 및 지속기간은 공지된 테스트 프로토콜을 사용하거나 생체내 또는 시험관내 시험 데이터 또는 후속 임상 테스트로부터의 외삽에 의해 해결되고 경험적으로 결정될 수 있는 졸중 및 생성된 졸중 손상의 유형과 함수 관계에 있다. 농도 및 투여량 값은 해결하여야 할 졸중의 중증도에 따라 또한 달라질 수 있다는 점에 주목하여야 한다. 임의의 특정한 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 개인의 필요 및 본 GDF11 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있으며, 본원에 제시된 농도 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 방법의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도는 아니다. 본 개시내용의 다른 측면에서, 조성물의 투여는 1회 수행될 수 있거나, 고려되는 구체적 치료에 적합한 임의의 수의 치료 요법을 수반할 수 있다. 예를 들어, 적합한 치료 요법은 GDF11 분자의 첫 번째 용량의 1차 투여 (치료 1일차)에 이어서 GDF11 분자의 2차 또는 그 초과의 더 높거나 더 낮은 용량으로의 2차 투여 또는 후속 투여 (예를 들어, 치료 2일차부터 7일차까지)를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 측면에서, 투약 요법은 상승 또는 하향 용량으로 GDF11 분자의 고전적 적정을 수반하며, 예를 들어 여기서 1차 투여는 치료 기간의 1일차에 대상체 체중에 비해 적어도 약 최소한의 고용량의 GDF11의 초기 용량으로 수행되며 2차, 더 높은 용량으로 종료된다. 대안적으로, GDF11 분자의 적정은 GDF11 분자의 초기 (1일차) 고용량을 수반할 수 있고 대상체에서 GDF11의 적어도 약 최소한의 고용량의 최종 용량으로 종료할 수 있다. 임의의 적정 전략에서, GDF11 분자에 대한 중앙 독성 용량 (MTD)에 접근하거나 적어도 투여된 GDF11 분자에 대한 치료 창의 최대 용량에 접근하는 제1 고용량으로 GDF11 분자를 투여한 후에, 더 낮은 수준의 후속 용량 (또는 용량들)으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 본 개시내용의 다른 측면에서, GDF11 치료 요법은 소위 "약물 휴지기"를 사용하여, 즉, 예를 들어, 구조화된 치료 중단, 내약성 단절 또는 치료 단절에 따라 다수회 (예를 들어, 반복) 수행될 수 있으며, 여기서 후속 치료(들)는 초기 치료 완료 후 2일 내지 7일에 발생한다. 여기서 다시, 임의의 특정한 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 개인의 필요 및 본 GDF11 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있으며, 본원에 제시된 투약 전략은 단지 예시적인 것이며 청구된 방법의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도는 아니다.

본 방법의 성공적인 수행은 관련 기술분야에 널리 공지된 진단 및 임상 검사 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기술은 전형적으로 대상체의 신체 운동 기능 및/또는 인지 기능의 개선을 평가하기 위한 물리적 및 신경학적 검사 (예컨대 NIHSS)를 기반으로 하며, 의료 영상화 기술 예컨대 CT 스캔, MRI 스캔, 도플러 초음파 및 동맥조영술에 의해 지원될 수 있으며 종종 보조 검사 예컨대 심전도 (ECG) 및 혈액 검사에 의해 지원될 수 있다. 의료 영상화 기술은 대상체에서 졸중 부위 또는 그 근처에서, 예를 들어 혈류가 원래 손상 (허혈) 위치 근처에서 국부적으로 감소된 졸중 반음영부에서 신생혈관형성, 신경발생, 개선된 뇌혈관 구조, 및/또는 기능 또는 혈류를 시각화함으로써 대상체의 성공적인 졸중 치료를 평가할 수 있다. 명료성을 위해, 본 개시내용의 방법을 사용하는 성공적인 졸중 요법은 상기-언급된 기준 중 임의의 하나 이상 (및 그의 임의의 조합)을 평가함으로써 및/또는 상기-언급된 진단 및 영상화 기술 중 임의의 하나 이상을 이용함으로써 확립될 수 있다.

본 개시내용의 이들 측면, 뿐만 아니라 다른 측면은 본 출원의 하기 섹션에서 상세히 기재되고 첨부된 청구범위에 명시적으로 제시된다.

도 1은 실시예 1에 기재된 중대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 신체 스윙(body swing) (거동) 검사에서 평가되었다. GDF11을 1 mg/kg QD로 받은 동물은 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.001) 및 28일차 (p<0.001)에 위약 (단지 비히클) 동물과 비교하여 우수한 졸중 회복을 나타냈다. n=24마리 래트.
도 2는 실시예 1에 기재된 MCAO 연구의 두 번째 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 뒷다리 배치(hindlimb placing) (거동) 검사에서 평가되었다. GDF11을 1 mg/kg QD로 받은 동물은 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.001) 및 28일차 (p<0.001)에 위약 (단지 비히클) 동물과 비교하여 우수한 졸중 회복을 나타냈다. n=24마리 래트.
도 3은 실시예 1에 기재된 MCAO 연구의 세 번째 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 앞다리 배치(forelimb placing) (거동) 검사에서 평가되었다. GDF11을 1 mg/kg QD로 받은 동물은 14일차 (p<0.05)에 위약 (단지 비히클) 동물과 비교하여 우수한 졸중 회복 및 21일차에 대한 추세 (p=0.60)를 나타냈다. n=24마리 래트.
도 4는 실시예 1에 기재된 MCAO 연구의 네 번째 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 부작용 프로파일이 평가되었다. rGDF11을 1 mg/kg으로 받은 동물은 비히클-처리된 동물과 비교하여 유의한 체중 감소를 나타냈다 (p<0.001). rGDF11 처리된 동물의 체중은 수술 직후 그의 체중에 비해 수술 후 3일차에 7.03% 만큼 감소되었다. 그 후, rGDF11 처리된 동물은 비히클 처리된 동물에 필적하는 비율로 체중이 증가하였다. n=24마리 래트.
도 5는 실시예 2에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 앞다리 배치 (거동) 검사에서 평가되었다. rGDF11을 1일차부터 7일차까지 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.0001), 및 30일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다.
도 6은 실시예 2에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 뒷다리 배치 (거동) 검사에서 평가되었다. rGDF11을 1일차부터 7일차까지 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.01), 7일차 (p<0.0001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.0001), 및 30일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다.
도 7은 실시예 2에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 신체 스윙 (거동) 검사에서 평가된다. rGDF11을 3일차부터 16일차까지 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 7일차 (p<0.05), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.001), 및 30일차 (p<0.01)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다.
도 8은 실시예 3에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 앞다리 배치 (거동) 검사에서 평가되었다. rGDF11을 3일, 5일, 및 7일 동안 매일 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 졸중 후 14일에 비히클-처리된 동물과 비교하여 통계적으로 개선된 회복을 나타냈다 (3일 처리의 경우 p<0.05, 5일 처리의 경우 p<0.0001, 7일 처리의 경우 p<0.001).
도 9는 실시예 3에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 뒷다리 배치 (거동) 검사에서 평가되었다. rGDF11을 1일, 3일, 5일, 및 7일 동안 매일 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 졸중 후 14일에 비히클-처리된 동물과 비교하여 통계적으로 개선된 회복을 나타냈다 (1일 처리의 경우 p<0.05; 3일 처리의 경우 p<0.001, 5일 처리의 경우 p<0.0001, 7일 처리의 경우 p<0.0001).
도 10은 실시예 3에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 신체 스윙 (거동) 검사에서 평가되었다. rGDF11을 5일 및 7일 동안 매일 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 졸중 후 14일에 비히클-처리된 동물과 비교하여 통계적으로 개선된 회복을 나타냈다 (5일 처리의 경우 p<0.001, 7일 처리의 경우 p<0.0001).
도 11은 실시예 4에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 앞다리 배치 (거동) 검사에서 평가되었다. 1 mg/kg, 2 mg/kg, 및 4 mg/kg의 rGDF11 i.p. 용량을 받은 동물은 졸중 후 28일에 비히클-처리된 동물과 비교하여 통계적으로 개선된 회복을 나타냈다 (1 mg/kg의 경우 p<0.05, 2 mg/kg의 경우 p<0.001, 4 mg/kg의 경우 p<0.001).
도 12는 실시예 4에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 뒷다리 배치 (거동) 검사에서 평가되었다. 1 mg/kg, 2 mg/kg, 및 4 mg/kg의 rGDF11 i.p. 용량을 받은 동물은 졸중 후 28일에 비히클-처리된 동물과 비교하여 통계적으로 개선된 회복을 나타냈다 (1 mg/kg의 경우 p<0.001, 2 mg/kg의 경우 p<0.0001, 4 mg/kg의 경우 p<0.0001).
도 13은 실시예 4에 기재된 MCAO 연구의 한 갈래로부터의 결과를 도시하며, 여기서 rGDF11 투여의 치료 효능은 신체 스윙 (거동) 검사에서 평가되었다. 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 및 4 mg/kg의 rGDF11 i.p. 용량을 받은 동물은 졸중 후 28일에 비히클-처리된 동물과 비교하여 통계적으로 개선된 회복을 나타냈다 (0.5 mg/kg의 경우 p<0.001, 1 mg/kg의 경우 p<0.001, 2 mg/kg의 경우 p<0.0001, 4 mg/kg의 경우 p<0.0001).
도 14는 C57Bl6/j 마우스에 대한 A군 (rGDF11 처리군; 1 mg/kg, 칠(7)일 동안 1일 1회 투여됨) 및 B군 (비히클 군)의 퍼센트 생존을 ICH-후 일수의 함수로서 도시한다. 비히클 군은 rGDF11 처리군과 비교하여 사망률 증가 추세를 나타냈다.
도 15a는 죽은 동물을 포함한, 주사 후 A군 및 B군의 일수에 걸친 ICH-후 신경중증도 점수(NeuroSeverity Score)를 도시한다. 비히클 군은 28일에 rGDF11 처리군과 비교하여 증가된 신경중증도를 나타냈다 (p<0.05).
도 15b는 죽은 동물을 제외한, 주사 후 A군 및 B군의 일수에 걸친 ICH-후 신경중증도 점수를 도시한다. 비히클 군은 28일에 rGDF11 처리군과 비교하여 증가된 신경중증도를 나타냈다 (p<0.01).
도 16a는 죽은 동물을 포함한, A군 및 B군에 대한 ICH-후 손상 일수의 함수로서 로타로드 레이턴시(rotarod latency)의 플롯을 도시한다. A군은 28일에 B군과 비교하여 로타로드 레이턴시의 개선을 나타냈다 (p<0.05).
도 16b는 죽은 동물을 제외한, A군 및 B군에 대한 ICH-후 손상 일수의 함수로서 로타로드 레이턴시의 플롯을 도시한다. A군은 28일에 B군과 비교하여 로타로드 레이턴시의 개선을 나타냈다 (p<0.0001).
도 17a는 1차 처리 후 칠(7)일에 초당 센티미터 단위의 평균 속도를 나타낸다 (p<0.05).
도 17b는 비히클 군 (B군)과 비교하여 rGDF11 투여 군 (A군)에 대한 1차 처리 후 칠(7)일에 앞다리 지지 베이스(base of support)를 도시한다 (p<0.05).
도 18a - 18d는 손상 부위에 대해 동측인 뇌실하 구역에서 전구 세포의 보충을 도시한다: 29일차에 도 18a (비히클), 도 18b (1 mg/kg), 도 18c (2 mg/kg), 및 도 18d (4 mg/kg).
도 19는 29일차에 비히클-처리된 동물과 비교하여 손상 부위에 대해 동측인 뇌실하 구역에서 GDF11의 1 mg/kg 용량, 2 mg/kg 용량, 및 4 mg/kg 용량에 대한 신경발생의 증가를 도시한다.
도 20a - 20d는 손상 부위에 대해 반대측인 뇌실하 구역에서 전구 세포의 보충을 도시한다: 29일차에 도 20a (비히클), 도 20b (1 mg/kg), 도 20c (2 mg/kg), 및 도 20d (4 mg/kg) ).
도 21은 손상 부위에 대해 반대측인 뇌실하 구역에서 GDF11의 1 mg/kg 용량, 2 mg/kg 용량, 및 4 mg/kg 용량에 대한 신경발생의 증가를 도시한다.
도 22는 손상 부위에 대해 동측 반구와 반대측 반구를 비교하는 분석을 도시한다.

편의상, 이 전체 출원 (명세서, 도면 및 첨부된 청구범위 포함)에 이용된 특정 용어가 전반에 걸쳐 명시적으로 정의되어 있다. 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 내용이 달리 명시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 실체 등의 혼합물을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 제시된 정의된 요소에 더하여 다른 요소가 또한 존재할 수 있음을 의미한다. 따라서 "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다. 용어 "이루어진"은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 그의 각각의 성분을 지칭하며, 이는 측면의 그 설명에 언급되지 않은 임의의 요소를 배제한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "본질적으로 로 이루어진"은 주어진 측면에 필요한 그러한 요소를 지칭한다. 상기 용어는 개시내용의 그 측면의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.

일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질, 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에서 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 그리고 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lan, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Principles of Neural Science, 4th ed., Eric R. Kandel, James H. Schwart, Thomas M. Jessell eds. McGraw-Hill/Appleton & Lange: New York, N.Y. (2000); The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Research Laboratories (2006) (ISBN 0-911910-19-0), Robert S. Porter et al. eds., The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd. (1994) (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Current Protocols in Protein Sciences (2009) Wiley Intersciences, Coligan et al., eds] 참조.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

작동 실시예에서 또는 달리 나타낸 경우 외에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 수량을 나타내는 모든 숫자는 그와 같이 명시적으로 나타냈는지 여부에 관계없이 용어 "약"에 의해 모든 경우에 수식된 것으로 이해되어야 한다. 백분율, 일수 또는 투여량 또는 다른 양과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "약"은 +/- 10%를 의미할 수 있다. 　

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하다", "투여하는", 및 "투여되는"은 치료 활성제를 치료받는 대상체에게 제공하는 것을 지칭한다. GDF11 분자의 투여는 임의의 적합한 기준, 예컨대 1일 1회 (QD), 1일 2회 (BID), 1일 3회 (TID), 1일 4회 (QID), 매시간 ("q_h" 여기서 "h"는 용량 사이의 시간의 수를 나타냄) 등으로 수행될 수 있으며, 각각의 치료일은 치료 과정에 걸쳐 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 측면에서, GDF11 분자는 정상적인 복강내, 피하, 또는 정맥내 전달 기술을 통해 대상체에게 도입되는 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 투여되나, 대상체에서 특정한 부위로의, 미세주사, 정위 주사, 및/또는 직접 적용을 포함할 수 있다.

용어 "생분해성" 및 "생침식성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 생체내에서 시간 경과에 따라 분해되거나 침식되어 더 작은 화학종을 형성할 중합체와 같은 물질을 지칭하며, 여기서 분해 또는 침식은, 예를 들어, 효소적, 화학적, 및 물리적 과정으로부터 발생할 수 있다. 가장 통상적으로, 이러한 물질은 가수분해를 통해 분해되거나 침식되어 대상체의 신체에 어떠한 유의하거나, 유해하거나 바람직스럽지 못한 영향도 미치지 않는 분해 생성물을 생성한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 생분해성 중합체의 예는 폴리(락티드); 폴리(글리콜리드); 폴리(락티드-코-글리콜리드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 및 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(카프로락톤); 폴리(말산); 폴리아미드; 폴리무수물; 폴리아미노산; 폴리오르토에스테르; 폴리에테르에스테르; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리포스파진; 폴리포스포에스테르; 폴리에스테르아미드; 폴리디옥사논; 폴리아세탈; 폴리케탈; 폴리카르보네이트; 폴리오르토카르보네이트; 분해성 폴리우레탄; 폴리히드록시부티레이트; 폴리히드록시발레레이트; 폴리알킬렌 옥살레이트; 폴리알킬렌 숙시네이트; 키틴; 키토산; 산화 셀룰로스; 및 상기 물질의 임의의 것의 공중합체, 삼원공중합체, 블렌드, 조합 또는 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "제어 방출"은 치료 활성 분자의 지연된, 일정 기간에 걸쳐 둔화된, 연속적, 불연속적, 또는 지속 방출을 제공하는 제약 투여 형태 또는 조성물을 지칭한다.

용어 "줄이다", "감소시키다", "감소된", "감소", "줄이다", 및 "억제하다"는 일반적으로 참조에 비해 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에서 모두 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 의심의 여지를 피하기 위해, 이러한 용어는 전형적으로 참조 수준과 비교하여 적어도 10% 만큼의 감소를 의미하며, 예를 들어 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 만큼의 감소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 주어진 실체 또는 파라미터의 완전한 부재, 또는 주어진 치료의 부재와 비교하여 10-99% 사이의 임의의 감소까지 포함할 수 있다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 어구 "GDF11의 용량" 또는 "GDF11 분자의 용량"은 대상체에게 특정된 기간에 걸쳐 투여된 GDF11의 수량을 나타내며, 여기서 이러한 수량은 치료받는 대상체의 체중에 대해 상대적으로 측정된다. 현재까지, GDF11의 실제 생체내 투약에 대한 모든 공개된 보고서는 설치류 (마우스 및 래트) 동물 모델 시스템에 있었다. 이들 공개된 연구로부터, 두 가지 뚜렷한 투약 패러다임이 생겨났다. 치료적 GDF11 전략인 첫 번째 패러다임이 분명히 생겨났고, 본원에서는 일반적으로 "중간 정도의 용량의 GDF11"을 표적으로 하는 것으로 지칭된다. 이 중간 정도의 용량 전략은, 마우스 또는 래트 대상체가 매일 약 0.1 mg/kg 체중의 전형적인 양으로 매일 투여되는 GDF11로 매일 처리된, 처리된 대상체에서 순환 GDF11의 약 1 내지 4배 증가를 표적으로 하는 방대한 대부분의 공개된 생체내 GDF11 투약 연구를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zhang et al (2016) Scientific Reports 6(1): 34624; Mei et al. (2016) Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy 24(11): 1926-1938; Du et al. (2017) Basic Research in Cardiology 112(1): 7; Li et al. (2017) Diabetes 66(7): db170086-1927; Onodera et al. (2017) Thorax (April); Bajikar et al. (2017) Developmental Cell 43(4): 418-435; Harper et al. (2018) Circulation Research 7 Sep 2018; Zhang et al. (2018) Diabetes; Ma et al. (2018) Brain Research Bulletin 139(February): 38-47; Zhang et al. (2018) Journal of Alzheimer's Disease 62(2); Lu et al. (2018) Front Cell Neurosci 12: 205; Wang et al. (2018) Am J Physiology Gastrointest Liver Physiology]; 및 [Wang et al. (2018) Inflammation] 참조. GDF11의 이러한 중간 정도의 용량 투여는 0.001 mg/kg에서 최대 0.5 mg/kg 체중까지 연장되는 것으로 특징지어졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,434,779; 및 미국 특허 공개 번호 US2016/074477 및 US2016/220640 참조). 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "중간 정도의 용량의 GDF11"은 전형적으로 대상체에서 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg 체중의 범위로 그리고 바람직하게는 설치류 대상체에서 매일 약 0.1 mg/kg 체중으로 그리고 일반적으로 인간 대상체까지를 포함하여 다른 대형 포유동물 종으로 외삽되는, 특정된 기간에 걸쳐, 광범위한 GDF11 분자의 대상체로의 중간 정도의 적용을 의미할 것이다. 상기에 언급한 바와 같이, 중간 정도의 용량의 GDF11의 생체내 투여에 대한 공개된 보고서는 최고 수준(high end) (0.5 mg/kg)을 피하고, 대신에 최적 표준으로서 0.1 mg/kg의 구체적 중간 정도의 용량에 집중하였다. 이들 간행물에서 이러한 "중간 정도의 용량의 GDF11"의 치료적 투여는 광범위한 질환 및 병태에 걸쳐 치료적 이점을 입증하였다.

본원에서 "과도한 용량의 GDF11"로 지칭되는 두 번째 GDF11 투약 패러다임은 GDF11로 치료받는 대상체에서 치료적 이점을 일부 제공하거나 전혀 제공하지 않긴 하지만, 유해하거나 달리 허용되지 않는 부작용 또는 부작용 프로파일 생성을 발생시킬 수 있는 GDF11의 용량이다. 본원에 사용된 바와 같이, "부작용"은 의도된 것에 부차적인 GDF11 투여의 임의의 약리학적 또는 생리학적 효과이고, "유해 부작용"은 바람직하지 않고/않거나 해롭고, 가역적이거나 비가역적일 수 있는 치료받은 대상체에서 이환율, 사망률, 기능 상실 또는 다른 병리학적 변화와 같은 결과로 나타나는 임의의 이러한 부차적인 효과이다. 마우스 또는 래트 대상체가 매일 약 5 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중 또는 그 초과의 전형적인 양으로 매일 투여되는 GDF11로 처리된, 과도한 용량의 GDF11을 표적으로 하는 다수의 공개된 생체내 GDF11 투약 연구는, GDF11의 이러한 초생리학적 용량이 악액질, 근육 위축, 식욕부진, 섬유증 또는 심지어 사망을 포함한 유의한 유해 효과를 일으킬 수 있다고 보고하였다 (예를 들어, 문헌 [Hammers et al. (2017) EMBO Molecular Medicine 9(4): 531-544; Pons et al. (2018) Surgery (May)]; 및 [Jones et al. (2018) Cell Reports 22(6): 1522-1530]) 참조.

본원에 사용된 바와 같이, "GDF11" 또는 "GDF11 분자"는 "성장 및 분화 인자 11" (NCBI 유전자 식별 번호: 10220), 성장 인자의 형질전환 성장 인자-β ("TGF-β") 수퍼패밀리의 구성원을 지칭한다. GDF11은 ALK4, ALK5, 및 ALK7을 포함한 TGF-β 수퍼패밀리 유형 I 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 용어 "rGDF11"은 재조합 방법을 사용하여 생성된 GDF11 분자를 지칭하고, 용어 "rhGDF11"은 천연 인간 GDF11 분자로부터 유래되는 이러한 분자를 지칭한다. rhGDF11은 서열식별번호: 1에 정의된 아미노산 서열을 갖는다. 포유동물 발달에서 신호전달을 위해, GDF11은 주로 ALK4 및 ALK5를 사용한다. 일부 측면에서, GDF11 신호전달은 또한 ACVR2B 수용체를 통해 발생할 수 있다. GDF11은 또한 성장 및 분화 인자 8 (GDF8, 미오스타틴으로도 공지됨)과 밀접하게 관련이 있다. GDF11은 골격 형태발생 단백질(Bone Morphogenic Protein) 11, 즉 BMP11이라고도 지칭된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "GDF11" 또는 "GDF11 분자"에 대한 언급은 인간 전구체 폴리펩티드 (NCBI 참조 서열: NP_005802); 인간 프로-펩티드; 인간 N-말단 폴리펩티드, 및 GDF11의 인간 성숙한 형태뿐만 아니라 소, 개, 고양이 닭, 뮤린, 래트, 돼지, 양, 칠면조, 말, 어류, 개코원숭이, 및 다른 영장류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 종으로부터의 상동체를 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어 적절한 동물 모델에서 측정된 바와 같이, 성숙한 GDF11의 생리학적 (치료적) 효과의 적어도 50%를 유지하는 GDF11의 단편, 유도체 또는 변이체를 지칭한다. 야생형 GDF11의 적합한 활성을 유지하는 보존적 치환 변이체는 본원에 정의된 바와 같은 보존적 치환을 포함할 것이다. 야생형 활성의 적어도 50%를 유지하면서 보존적 치환을 견딜 가능성이 가장 큰 아미노산의 식별은, 예를 들어, 다른 종으로부터의 GDF11 상동체 또는 파라로그와의 서열 정렬에 의해 가이드된다. GDF11 상동체 간에 동일한 아미노산은 변화를 견딜 가능성이 덜하며, 한편 보존적 차이를 나타내는 아미노산은 인공 변이체 맥락에서 보존적 변화를 견딜 가능성이 훨씬 더 크다. 유사하게, 비보존적 차이를 가진 위치는 기능에 중요할 가능성이 덜하며 인공 변이체에서 보존적 치환을 견딜 가능성이 더 크다. 변이체는, 예를 들어, 치료 효능을 평가하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 적절한 동물 모델에서 대상체에게 변이체를 투여함으로써 활성에 대해 시험될 수 있다. 인간 GDF11의 경우, 프로-펩티드에 더하여 신호 서열 (예를 들어, 전구체 폴리펩티드)은 길이가 407개 아미노산이다. 24개 아미노산 신호 펩티드의 절단은 383개 아미노산의 프로-펩티드를 생성하고 프로-펩티드의 절단은 프로-펩티드의 C-말단 109개 아미노산에 상응하는 109개 아미노산의 성숙한 GDF11 폴리펩티드를 발생시킨다. 성숙한 폴리펩티드는 디술피드-연결 동종이량체를 형성한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "고용량의 GDF11"은 관련 대상체에서 중간 정도의 용량의 GDF11과 과도한 용량의 GDF11 사이에 해당하며, 놀랍게도, 본 개시내용에 제시된 바와 같이 졸중의 치료에서 예상치 못한 유익한 효과를 입증한, 대상체에게 투여된 GDF11 분자의 용량을 정의한다. 고용량의 GDF11 분자는 일반적으로 GDF11의 보고된 중간 정도의 용량의 상한선 초과로부터 시작되어 GDF11의 최하위 보고된 과도한 용량 미만까지의 괄호로 묶인 용량 범위를 포함하는 것으로 본원에 정의되며, GDF11의 이러한 중간 정도의 및 과도한 용량 둘 다 매일 그리고 관련 대상체에 보고된 바와 같다. 보다 특히, GDF11의 표준 고용량은 매일 설치류 대상체 (마우스 또는 래트)의 약 1 mg/kg 체중에 상당하는 것으로 본원에 정의되며, 따라서 이러한 종에서 GDF11의 정상 중간 정도의 용량 (즉, 약 0.1 mg/kg)보다 약 1배 초과이다. 따라서, "GDF11의 최소한의 고용량"은 설치류 종에서 적어도 약 0.8 mg/kg (체중), 및 서열식별번호: 1에 의해 정의된 바와 같이 rhGDF11의 분자량으로 정규화된, 대형 포유동물 종에서 동일한 이러한 용량이다. 유사한 방식으로, "GDF11의 최대 고용량"은 설치류 종에서 약 4 mg/kg (체중), 및 서열식별번호: 1에 의해 정의된 바와 같이 rhGDF11의 분자량으로 정규화된, 대형 포유동물 종에서 동일한 이러한 용량이다. 이와 관련하여, GDF11의 최대 고용량은 치료 대상체에서 유해 부작용을 피하는 용량이다. 구체적 투여량 값은 해결될 졸중의 중증도에 따라 달라질 수 있다는 점에 주목하여야 한다. 임의의 특정한 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 개인의 필요 및 본 GDF11 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있으며, 본원에 제시된 농도 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 방법의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도는 아니다. 정확한 투약은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 시험관내 및 생체내 시스템을 시험함으로써 경험적으로 예측할 수 있고 이어서 인간 대상체를 포함한 대상체에서 사용하기 위해 그로부터 외삽할 수 있다. 이어서 인간 용량은 전형적으로 임상 시험에서 미세-조정되고 반응에 따라 적정된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 설치류 대상체에서 정의된 바와 같은, 고용량의 GDF11은 적어도 약 0.8 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 또는 적어도 약 0.9 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 일부 경우에 적어도 약 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 그리고 본 개시내용의 특정 측면에서 적어도 약 1 내지 2 mg/kg이고, 임의의 대형 포유동물 종에서 상응하는 용량을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "히드로겔"은, 예를 들어 물 또는 다른 수성 시스템의 존재 하에 팽윤하고, 물의 양의 부재 또는 감소에 수축하고, 그의 구조 내에서 유의한 분획의 물을 유지할 수 있고, 전형적으로 물에 용해되지 않는 중합체를 지칭하기 위해, 관련 기술분야 내에 그의 통상적인 방식으로 사용된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 중합체 또는 중합체 시스템이 히드로겔로서 작용하는지, 예를 들어, 그것이 이식되거나 달리 포유동물 대상체 내로 생체내 전달될 때와 같이 수성 시스템에 침지될 때 히드로겔을 형성하는지를 결정하기 위해 이용할 수 있는 다수의 표준 검사가 있음을 인지할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, "이식" 또는 "이식가능한 조성물 또는 장치"는 대상체에게 치료 활성 물질의 전달에서 사용하기 위한 임의의 이식가능한 시스템을 지칭한다. 통상적인 이식가능한 장치는 관심 작용제의 국부적 (부위 특이적) 및/또는 전신 투여를 허용하며, 예는 바늘 및 주사기 또는 투관침, 및 이식가능한 약물 펌프 장치를 사용한 피하 또는 근육내 주사를 통해 투여할 수 있는, 고체 구조물 예컨대 수술 부위의 조직 상에 또는 조직 내에 남을 수 있는 스텐트 또는 웨이퍼, 막대 또는 미세입자를 포함한다. 고체 이식가능한 조성물 또는 장치는 통상적으로 관심 작용제의 제어 방출을 제공할 수 있는 생침식성 중합체를 사용하여 형성된다. 주사가능한 이식가능한 조성물 또는 장치는 점성 액체 담체, 히드로겔 조성물, 나노입자 조성물, 미세구체 또는 미세입자, 또는 가소화된 중합체 담체의 형태로 제공될 수 있다.

용어 "증가된", "증가하다" 또는 "증강된"은 일반적으로 정적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하는 것으로 본원에서 모두 상호교환적으로 사용되며; 의심의 여지를 없애기 위해, 상기 용어는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가, 또는 100% 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가까지의 포함을 나타내며, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 초과의 임의의 증가를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 적어도 하나의 치료 활성제 (GDF11 분자)를 포함한 임의의 제조물 (예를 들어, 패키지 또는 용기)을 의미한다. 특정 키트에서 제조물은 본 개시내용의 방법을 수행하기 위한 단위로서 홍보되거나, 유통되거나, 판매될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리포솜"은 본 개시내용의 치료 활성제를 포함한 다른 성분을 함유할 수 있는 수성 코어로 채워진 특정 지질 (포스파티딜콜린과 같은 인지질)에 의해 형성된 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 구형 소포를 지칭한다. 리포솜은 크기가 최대 약 10 마이크로미터일 수 있지만, 바람직하게는 본 개시내용의 조성물 및 방법의 실시에 이용되는 리포솜은 크기가 마이크로미터 이하, 즉 나노입자 형태이다. 　

본원에 사용된 바와 같은 용어 "국부적" 또는 "국부적으로"는 치료 활성제의 대상체에게 대한 전달 또는 투여와 관련하여, 이러한 작용제가 대상체의 국부화된 부위로 전달되나 대상체의 혈장에서 생물학적으로 유의한 수준으로 검출가능하지 않을 수 있음을 의미한다.

"나노입자"는 일반적으로 1 내지 100 nm 범위의 크기를 가진 이러한 입자의 미립자 물질 또는 집단을 지칭하며 나노구체, 예를 들어 지질 시스템 예컨대 리포솜 및 미셀, 나노결정 및 나노입자를 포함할 수 있다. 나노구체는 약리학적 작용제 (분자 또는 화합물)뿐만 아니라 다른 물질 예컨대 무기 나노입자 예컨대 금 또는 자성 입자를 함유할 수 있거나, 나노입자는 중합체 예컨대 생분해성 중합체로부터 형성될 수 있거나 이를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법의 실시에서, 합성 중합체 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리-L-락트산, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(락트산-코-글리콜산 및 천연 중합체 예컨대 알기네이트 및 키토산이 나노구체 또는 나노캡슐을 제공하기 위한 나노입자의 나노제작에서 사용될 수 있다. 나노입자는 일반적으로 장기간 동안 혈액 순환계에 남아 있어, 작용제의 연장된 방출 및 연장된 약리학적 작용제 수명 주기를 가능하게 한다. 그의 나노크기로 인해, 나노입자 구조는 조직계에 용이하게 침투하고 세포에 의해 쉽게 흡수되어 표적 위치에 효율적인 전달을 달성한다.

용어 "제약상 허용되는"은 관련 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 제약 용도로 승인되었거나 승인될 수 있고/있거나 동물 대상체에서, 그리고 보다 특히 인간에서 사용을 위해 미국 약전 또는 또 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 물질을 지칭한다. "제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클"은 치료 활성 화합물과 함께 투여되는 임의의 비히클, 희석제, 아주반트, 부형제 또는 담체를 지칭한다.　

"제약상 허용되는 염"은 제약상 허용되고 모 분자 또는 화합물의 원하는 약리학적 활성을 보유하는 치료 활성 분자 또는 화합물의 염을 지칭한다. 본원에 기재된 치료 활성제의 제약상 허용되는 염은 제약상 허용되는 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 그러한 염들을 포함한다. 적합한 산 염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트 염을 포함한다. 옥살산과 같은 다른 산은 그 자체가 제약상 허용되지 않지만, 제약상 허용되는 산 부가 염을 수득하는데 중간체로서 유용한 염의 제조에 이용될 수 있다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨), 알칼리 토금속 (예를 들어, 마그네슘), 암모늄 및 염을 포함한다.　

본원에 사용된 바와 같이, "중합체"는 달리 명시적으로 정의되지 않는 한 임의의 중합체, 공중합체 및 블렌드를 의도한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 관련하여 사용하기 위한 중합체는 표준 중합 및 공중합 기술, 예컨대 그라프트 공중합, 중축합 및 중부가를, 임의로 적절한 촉매와 함께 사용하여 생성될 수 있다. 이들 기술은 시간, 온도 및 기타 파라미터와 관련하여 중합체 분야에 널리 공지된 통상적인 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용되는 중합체는 중합체의 표준 블렌딩 기술 또는 공중합체의 블렌딩을 사용하여 생성될 수 있으며, 다시 중합체 분야에서 널리 공지된 통상적인 방식으로 수행될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 알파-아미노 및 카르복시 기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 따라서 상기 용어는 크기나 기능에 관계없이, 변형된 아미노산 (예를 들어, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함한, 단백질 아미노산의 중합체를 지칭한다. 단백질 및 폴리펩티드는 상대적으로 대형 폴리펩티드와 관련하여 종종 사용되며, 한편 용어 "펩티드"는 종종 소형 폴리펩티드와 관련하여 사용되나, 관련 기술분야에서 이들 용어의 용법은 중복된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 유전자 발현 생성물 및 그의 단편을 언급할 때 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 전술한 것들의 유전자 발현 산물, 자연 발생 단백질, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편, 및 다른 등가물, 변이체, 유도체, 단편, 및 유사체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 대상체의 "졸중 사건"은 뇌로의 부적당한 혈류가 신경학적 세포 사멸을 발생시키는 의학적 병태를 지칭한다. 졸중 사건은 두 가지 주요 유형으로 분류된다: 허혈성 (뇌로의 혈액 공급 중단으로부터 생김); 및 출혈성 (혈관 파열 또는 비정상적인 혈관 구조로부터 생김). 두 유형의 졸중 사건 모두 뇌의 일부가 제대로 기능하지 못하게 한다. 허혈성 졸중 사건은 전형적으로 뇌의 일부로의 혈액 공급이 감소되어, 그 영역의 뇌 조직의 기능장애를 야기하는 혈관의 봉쇄에 의해 유발된다. 이러한 허혈증; 혈전증; 색전증; 전신 저관류; 및 대뇌 정맥동 혈전증에 대한 네 가지 원인이 있다. 출혈성 졸중 사건은 뇌로 직접 출혈하거나 뇌의 막 사이의 공간으로 출혈에 의해 유발되며, 여기서 이러한 출혈은 파열된 뇌 동맥류로 인해 발생할 수 있다. 출혈성 졸중의 두 가지 주요 유형인 뇌내 출혈 (뇌 자체내 출혈) 및 지주막하 출혈 (뇌 조직 외부이나 뇌강 내에서 출혈)이 있다. 대상체에게 발생하는 졸중 사건의 징후 및 증상은 의학 분야에 널리 공지되어 있으며 갑작스러운 안면 쇠약 발병, 팔 떨어짐(arm drift), 비정상적인 언어 구사, 신체의 한쪽으로 움직이거나 느낄 수 없음, 이해의 어려움, 어지럼증 또는 현기증, 한쪽 시력 상실, 및 심한 두통을 포함할 수 있다. 허혈성 졸중 사건은 졸중 사건의 정도, 영향을 받는 뇌 영역, 근본적인 원인 및 예후를 예측하는, 총 전방 순환 경색 (TACI); 부분 전방 순환 경색 (PACI); 열공 경색 (LACI); 또는 후방 순환 경색 (POCI)으로서 분류될 수 있다. 졸중 사건의 임상 진단은 의료 분야에서 또한 널리 공지되어 있으며 전형적으로 의료 영상화 기술 예컨대 CT 스캔, MRI 스캔, 도플러 초음파 및 동맥조영술에 의해 지원되며 종종 보조 검사 예컨대 심전도 (ECG) 및 혈액 검사에 의해 지원되는 물리적 및 신경학적 검사 (예컨대 NIHSS)를 기반으로 한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 임의의 동물 (예를 들어, 인간, 영장류, 개, 소, 암소, 말, 캥거루, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물), 트랜스제닉 비인간 동물, 어류, 개구리, 및 도롱뇽에 제한되지는 않는 양서류, 파충류, 다른 척추동물 및 무척추동물 등을 의미하며, 이들은 특정한 치료 방법의 수령자가 된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "전신성" 또는 "전신적으로"는, 대상체에게 치료 활성제의 전달 또는 투여와 관련하여, 이러한 작용제가 대상체의 혈장에서 생물학적으로-유의한 수준으로 검출가능함을 의미한다. 상기 용어는 치료 활성제를 대상체에게 경구 또는 비경구 투여하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료 활성"은 효과가 의도된 대상체에서 바람직한 치료 결과와 일치하는 GDF11 분자 또는 화합물의 활성을 지칭할 수 있다. 용어 "치료 활성제", "치료 활성 GDF11 분자" 또는 "치료 활성 유도체, 변이체 또는 변형된 GDF11"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 그 효과가 대상체에서 바람직한 결과와 일치하는 치료 활성을 갖는 분자를 지칭하고, 변이체, 유도체 및/또는 변형된 분자의 경우에는 모 분자의 약리학적 활성과 일치한다. 치료 활성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 시험관내 또는 생체내 방법론을 사용하여 측정될 수 있으며, 예를 들어 바람직한 치료 효과는 세포 배양에서 검정될 수 있다.

"치료 유효량"은 대상체에게 투여될 때 대상체에 존재하는 질환, 병태, 합병증 또는 장애에 대한 원하는 치료에 영향을 미치기에 충분한 치료 활성제 (분자 또는 화합물)의 양을 지칭한다. 본원의 임의의 특정한 방법에서 사용하기 위한 치료 활성제의 "치료 유효량"은 분자 또는 화합물, 질환, 병태, 합병증 또는 장애, 및 그의 중증도 및 대상체의 연령 및 체중에 따라 달라질 것이다. 완전한 치료 효과는 치료 활성제 (분자 또는 화합물)의 하나의 단일 용량의 투여에 의해 반드시 발생하는 것은 아니며 일련의 그의 용량을 투여한 후에만 발생할 수 있다. 치료 유효량은 또한 활성제(들)의 정체, 다루고 있는 질환, 병태, 장애 또는 합병증 (및 그의 중증도), 뿐만 아니라 연령, 체중, 대상체에서 관련 활성제의 흡착, 분포, 대사 및 배설에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 치료 유효량은 대상체에게 1회 이상의 투여로 투여될 필요가 있을 수 있다. 치료 활성 분자 또는 화합물의 적절한 치료 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 몇몇 잘-확립된 프로토콜 중 임의의 하나에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트 또는 대형 포유동물을 사용한 연구와 같은 동물 연구는, 제약 화합물의 적절한 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 이어서 이러한 동물 연구로부터의 결과는 예를 들어 인간과 같은 다른 종에서 사용하기 위한 용량을 결정하기 위해 외삽될 수 있다.　

용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체에서 졸중 사건으로부터 발생하는 임의의 하나 이상의 영향, 합병증, 정상 또는 기존 기능 또는 능력의 감소, 불구 또는 장애의 임의의 개량, 재활, 원기회복, 개선, 감소 또는 완화, 및/또는 이러한 영향, 합병증, 정상 또는 기존 기능 또는 능력의 감소, 불구 또는 장애, 또는 그의 적어도 하나의 임상 증상 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학상 (예를 들어 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 다의 진행 또는 악화, 및/또는 대상체에 대해 식별할 수 없는 적어도 하나의 물리적 파라미터를 억제하는 것을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료"는 또한 대상체에서 미래의 또는 추가의 졸중 사건을 금지할 가능성을 지칭한다. 본 개시내용의 방법의 실시에서, 졸중 사건을 치료하는 것은 조기 개시 (졸중 사건으로부터 약 12시간 내지 3일의 어디든 이내에)를 표적으로 하는 투약 요법을 사용한 치료 유효량의 GDF11 분자 (둘 다 본원에 정의된 바와 같음)의 대상체에 대한 투여, GDF11 분자의 고용량 투여 (적어도 1 mg/kg)를 수반하며, 일일 치료의 제한 지속기간 (2일에서 7일의 기간에 걸쳐 1일 1회)은 관련 기술분야에 널리 공지된 진단 및 임상 검사 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 이러한 기술은 전형적으로 대상체에서 개선된 신체 운동 기능 및/또는 인지 기능을 평가하기 위한 물리적 및 신경학적 (거동) 검사 (예컨대 NIHSS)를 기반으로 하며, 의료 영상화 기술 예컨대 CT 스캔, MRI 스캔 (예를 들어, 스핀-에코 MRI 또는 시네 자기 공명), 도플러 초음파 및 동맥조영술에 의해 지원될 수 있으며 종종 보조 검사 예컨대 심전도 (ECG) 및 혈액 검사에 의해 지원될 수 있다. 이러한 기술을 사용하여, 통상의 기술자는 대상체에서 졸중 부위 또는 그 근처에서 신생혈관형성, 신경발생, 개선된 뇌혈관 구조, 및/또는 기능 또는 혈류를 시각화함으로써 대상체에서 성공적인 졸중 치료를 평가할 수 있다. 여기서 다시, 명료성을 위해, 본 개시내용의 방법을 사용하는 성공적인 졸중 요법은 상기-언급된 기준 중 임의의 하나 이상 (및 그의 임의의 조합)을 평가함으로써 및/또는 상기-언급된 진단 및 영상화 기술 중 임의의 하나 이상을 이용함으로써 확립될 수 있다.

본 개시내용은 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않으며 따라서 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 측면을 기재하기 위해 사용된 것이며, 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 본 발명은 청구범위에 의해서만 정의된다.

(치료 방법, 제약 조성물) :

포유동물 대상체에서 졸중을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법은 치료 유효량의 GDF11 분자를 대상체에게 투여하는 것을 이용한다. GDF11 분자는 대상체에서 졸중 사건 후 약 12시간 내지 3일의 제한된 시간 창 내에서 대상체에게 투여되고, GDF11 분자의 고용량 투여를 특징으로 하는 투약 요법 하에 수행되며, 여기서 이러한 투약은 2일 내지 약 14일의 제한된 기간 동안 계속된다.

놀랍게도, 졸중 사건 후 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 유효량의 GDF11 분자 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것이 -- 졸중 후 특정한 시간 창 내에서 선택된 고용량으로 그리고 제한된 기간에 걸쳐 상기 분자를 투여하는 경우 -- 본원에 기재된 바와 같이 졸중을 효과적으로 치료할 수 있음이 밝혀졌다. 본 개시내용은 이러한 매일 투여를 위한 그리고 이러한 구조화된 투약 요법 하에 치료 유효량의 GDF11 분자가 바람직하게는 설치류 대상체에서 적어도 약 0.8 mg/kg-체중 내지 약 4 mg/kg-체중, 또는 더 대형 대상체에서 동등한 (상응하는) 양의 이 독특한 치료 활성제를 포함함을 나타낸다.

따라서, 대상체에서 졸중을 치료하는 방법을 제공하는 것이 본 개시내용의 주요 측면이다. 상기 방법은 대상체에서 졸중 사건 후 약 12시간 내지 72시간의 시간 프레임 내에 치료 유효량의 GDF11 분자를 대상체에게 투여함으로써 투약 요법을 시작하는 것을 수반한다. GFD11 분자는 설치류 대상체에서 체중 kg당 적어도 약 0.8 mg의 양 (0.8 mg/kg) 또는 대형 포유동물 대상체에서 상응하는 양으로 투여되며 2일 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 수행된다. 본 개시내용의 한 측면에서, GDF11 분자는 설치류 대상체의 체중 kg당 적어도 약 1 mg의 양 (1 mg/kg) 또는 더 대형 대상체에서 상응하는 양으로 투여된다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, GDF11 분자는 약 7일의 단축된 기간 동안 투여되고, 또 다른 측면에서, GDF11 분자는 2일 내지 4일의 훨씬 더 짧은 기간 동안 투여된다. 본 개시내용의 하나의 특정한 측면에서, 방법은 GDF11 분자를 포함하는 제약 조성물의 투여를 수반한다. 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있다.

GDF11 분자의 투여는 전신성 및/또는 국부적일 수 있으며 임의의 적합한 비경구 투여 기술을 통해 수행된다. 예를 들어, 조성물은 표준 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 주사를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 따라서 GDF11 분자를 함유하는 조성물은 주사용수와 같은 적합한 주사용 비히클을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 제어 방출 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법의 실시에서, 조성물은 리포솜과 같은 나노입자의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 생침식성 중합체를 추가로 포함할 수 있거나 고체 또는 주사가능한 임플란트 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법의 실시에서, GDF11 분자는 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태로 조성물에 존재할 수 있다.

본 개시내용의 특정한 측면에서, 방법은 대상체에서 졸중 사건으로부터 발생하는 임의의 하나 이상의 영향, 합병증, 정상 또는 기존 기능 또는 능력의 감소, 불구 또는 장애의 임의의 개량, 재활, 원기회복, 개선, 감소 또는 완화, 및/또는 이러한 영향, 합병증, 정상 또는 기존 기능 또는 능력의 감소, 불구 또는 장애, 또는 그의 적어도 하나의 임상 증상 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학상 (예를 들어 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 다의 진행 또는 악화, 및/또는 적어도 하나의 물리적 파라미터를 억제하는 것을 발생시키는데 적합하다.

본 개시내용의 방법의 성공적인 수행은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 상기에 본원에 논의된 바와 같이, 대상체에서 졸중 사건의 성공적인 치료는 관련 기술분야에 널리 공지된 진단 및 임상 검사 기술을 사용하여 평가될 수 있으며, 여기서 이러한 기술은 대상체의 신체 운동 기능 및/또는 인지 기능의 개선을 평가하기 위한 물리적 및 신경학적 (거동) 검사에 의존하며, 보조 검사에 의해 보충되는 의료 영상화 기술 예컨대 CT 스캔, MRI 스캔 (예를 들어, 스핀-에코 MRI), 도플러 초음파 및 동맥조영술에 의해 지원될 수 있다. 이러한 기술을 사용하여, 통상의 기술자는 대상체에서 졸중 부위 또는 그 근처에서 신생혈관형성, 신경발생, 개선된 뇌혈관 구조, 및/또는 기능 또는 혈류를 시각화함으로써 대상체에서 성공적인 졸중 치료를 평가할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 방법을 사용하는 성공적인 졸중 요법은 상기-언급된 기준 중 임의의 하나 이상을 평가하거나, 상기-언급된 진단 및 영상화 기술 중 임의의 하나 이상을 이용하거나, 상기-언급된 기준 중 임의의 하나 이상 (및 그의 임의의 조합)을 평가하기 위한 본 개시내용의 임의의 다른 방법을 사용함으로써 확립될 수 있다.

본 개시내용의 방법의 실시에서, 선택된 GDF11 분자는 본원에 개시된 투약 요법(들) 과정에 걸쳐 이용된 조성물에서 동일하거나 상이할 수 있는 GDF11 분자의 임의의 치료 활성 형태이다. 예를 들어, GDF11 폴리펩티드의 성숙한 인간 형태가 특히 바람직하다. 대안적으로, "천연" GDF11 분자의 임의의 유도체, 변이체 또는 변형된 형태는 이러한 분자가 본원에 정의된 바와 같이 치료 활성인 한 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여되는 GDF11 분자는 GDF11 폴리펩티드 동종이량체를 포함할 수 있다. GD11 분자는 또한 GDF11 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 특정한 측면에서, GDF11 폴리펩티드의 변이체, 유도체 또는 단편이 대상체에게 투여된다. 이와 관련하여, GDF11의 변이체, 유도체 또는 단편은 인간 GDF11의 성숙한 형태의 천연 서열의 보존적으로 변형된 변이체, 유도체 또는 단편일 수 있다. 본 개시내용의 특정 측면에서, 대상체는 콜렉틴 신장 1 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 78989) (서열식별번호: 4), 카테스핀 D (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 1509), 딕코프(Dickkopf)-관련 단백질 4 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 27121), 적혈구 막 단백질 4.1 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 2035), 에스테라제 D (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 2098), 헤모글로빈 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 3043 또는 3047), 인터루킨-1 수용체 보조 단백질 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 3556), 자연 살해자 군 2 구성원 D (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 22914), Ras-관련 C3 보툴리눔 독소 기질 1 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 5879), GTP-결합 핵 단백질 Ran (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 5901), 메탈로프로테아제 3의 조직 억제제 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 7078), 또는 티미딜레이트 신타제 (예를 들어 NCBI 유전자식별번호: 7298)로부터 선택된 제2 폴리펩티드 모이어티를 포함하는 변형된 GDF11 분자를 투여받을 수 있다.

보다 특히 상세히, GDF11 분자는 천연 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 수득되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 언급된 바와 같은 "변이체" 또는 "유도체"는 천연 또는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 상동이나 하나 또는 복수개의 결실, 삽입 또는 치환 때문에 천연 또는 참조 폴리펩티드의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드 분자를 코딩하는 DNA 서열은 천연 또는 참조 DNA 서열과 비교할 때 뉴클레오티드의 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 포함하나 참조 단백질에 비해 관련된 생물학적 활성을 유지하는 변이체 또는 유도체 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 단편)를 코딩하는 서열을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 백분율, (예컨대 5% 이하, 또는 4% 이하, 또는 3% 이하, 또는 1% 이하)의 아미노산을 변경하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적으로 변형된 유도체"임을 인식할 것이며, 여기서 변경은 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 발생시킨다. 일부 변화는 관련된 활성을 잠재적으로 개선할 수 있는 것으로 고려되며, 따라서 변이체 또는 유도체는 보존적이든 아니든, 야생형 GDF11 활성의 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 약 95% 또는 100%, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 관련 GDF11 분자의 야생형 (천연) 형태 활성의 약 110% 이상을 갖는다.

치환될 수 있는 아미노산 잔기를 확인하는 한 가지 방법은, 예를 들어, 인간 GDF11을 하나 이상의 비인간 종으로부터의 GDF11 상동체에 정렬하는 것이다. 정렬은 기능에 필요할 가능성이 있는 잔기뿐만 아니라, 반대로, 변화를 견딜 가능성이 있는 그러한 잔기에 관한 지침을 제공할 수 있다. 예를 들어 정렬이 상응하는 위치에서 두 개의 동일하거나 유사한 아미노산을 나타내는 경우, 그 부위가 기능적으로 중요할 가능성이 더 크다. 반대로, 정렬이 크기, 전하, 소수성 등에서 유의하게 상이한 상응하는 위치의 잔기를 나타내는 경우, 그 부위가 기능적 폴리펩티드의 변화를 견딜 수 있는 가능성이 더 크다. 유사하게, 동일한 종으로부터의 관련 폴리펩티드와의 정렬, 예를 들어 동일한 활성을 나타내지 않는 GDF8이 또한 GDF11 활성에 필요한 지역 또는 구조에 대한 지침을 제공할 수 있다. 변이체 또는 유도체 아미노산 서열은 천연 또는 참조 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과 동일할 수 있다. 천연 서열과 돌연변이 서열 사이의 상동성 정도 (퍼센트 동일성)는, 예를 들어, 월드 와이드 웹 상에서 이러한 목적을 위해 통상적으로 이용되는 무료로 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 변이체 아미노산은 그것이 유래된 서열 (본원에서 "원래" 서열로 지칭됨)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과 유사할 수 있다. 원래 서열과 돌연변이 서열 사이의 유사성 (퍼센트 유사성)은, 예를 들어, 유사성 매트릭스를 사용함으로써 결정될 수 있다. 유사성 매트릭스는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 유사성 매트릭스를 사용하여 2개의 서열을 비교하기 위한 다수의 도구, 예를 들어 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov의 월드 와이드 웹에서 이용가능)를 온라인에서 무료로 이용가능하며, 여기서 디폴트 파라미터가 설정되어 있다.

성숙한 GDF11 폴리펩티드는, 예를 들어, 아미노산 313과 372; 341과 404; 및 345와 406 사이에 쇄내 디술피드 결합을 포함할 가능성이 있으며 (신호 서열을 포함한, 전장 폴리펩티드에 대해 넘버링됨) 아미노산 371은 쇄간 디술피드 결합에 참여할 가능성이 있다는 점에 주목한다.

주어진 아미노산은 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기에 의해 대체될 수 있는데, 예를 들어, 하나의 지방족 잔기가 또 다른 잔기에 대해 치환 (예컨대 Ile, Val, Leu, 또는 Ala가 서로 대체), 또는 한 극성 잔기가 또 다른 잔기에 대해 치환 (예컨대 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn 사이)될 수 있다. 다른 이러한 보존적 치환, 예를 들어, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환은 널리 공지되어 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 천연 또는 참조 폴리펩티드의 원하는 아폽토시스 활성이 유지되는지 확인하기 위해 본원에 기재된 검정 중 어느 하나에서 시험될 수 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 개시내용과 일치하는, 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자에 더해지며 이를 배제하지는 않는다. 서로에 대한 전형적인 보존적 치환은 다음을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 및 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M).

폴리펩티드의 적절한 입체형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한, 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교결합을 방지할 수 있다. 반대로, 그의 안정성을 개선하거나 올리고머화를 용이하게 하기 위해 시스테인 결합(들)을 폴리펩티드에 첨가할 수 있다.

대상체에게 투여되는 GDF11 폴리펩티드 분자는 또한 하나 이상의 아미노산 치환, 변형 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치환 및/또는 변형 또는 부가는 대상체에서 단백질분해성 분해를 방지하거나 감소시키고/시키거나 GDF11 분자의 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있다. GDF11 폴리펩티드는 또한 이를 또한 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 예컨대, 비제한적 예로서 트랜스페린, 알부민, 성장 호르몬; 셀룰로스 및/또는 Fc 단편에 접합 또는 융합함으로써 변형될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,434,779 참조). GDF11 폴리펩티드는 또한 성장 및 분화 인자 8 (GDF8) 전구체 모이어티, 또는 그의 임의의 단편 또는 유도체에 대한 접합 또는 융합에 의해 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 게다가, 본원에 기재된 바와 같은 GDF11 폴리펩티드는 적어도 하나의 펩티드 결합 대체를 포함할 수 있다. 단일 펩티드 결합 또는 다수의 펩티드 결합, 예를 들어 2개의 결합, 3개의 결합, 4개의 결합, 5개의 결합, 또는 6개 또는 그 초과의 결합, 또는 모든 펩티드 결합이 대체될 수 있다. 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 GDF11 폴리펩티드 분자는 한 유형의 펩티드 결합 대체 또는 다수 유형의 펩티드 결합 대체, 예를 들어, 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 그 초과의 종의 펩티드 결합 대체를 포함할 수 있다. 펩티드 결합 대체의 비제한적 예는 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 술포닐 우레아, 트리플루오로에틸아민, 오르토-(아미노알킬)-페닐아세트산, 파라-(아미노알킬)-페닐아세트산, 메타-(아미노알킬)-페닐아세트산, 티오아미드, 테트라졸, 보론산 에스테르, 올레핀계 기, 및 그의 유도체를 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 측면에서, 현재 방법에서 사용하기 위한 GDF11 폴리펩티드 분자는 살아있는 유기체에 의해 생성되는 폴리펩티드 및/또는 단백질에서 흔히 발견되는 자연 발생 아미노산, 예를 들어, Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (O), Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R), 및 His (H)로 구성될 수 있다. 다른 측면에서, GDF11 폴리펩티드 분자는 대안적 아미노산을 포함할 수 있다. 대안적 아미노산의 비제한적 예는, D-아미노산; 베타-아미노산; 호모시스테인, 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트; 히푸르산, 옥타히드로인돌-2-카르복실산, 스타틴, 1,2,3,4,-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 페니실라민 (3-메르캅토-D-발린), 오르니틴, 시트룰린, 알파-메틸-알라닌, 파라-벤조일페닐알라닌, 파라-아미노 페닐알라닌, p-플루오로페닐알라닌, 페닐글리신, 프로파르길글리신, 사르코신, 및 tert-부틸글리신), 디아미노부티르산, 7-히드록시-테트라히드로이소퀴놀린 카르복실산, 나프틸알라닌, 비페닐알라닌, 시클로헥실알라닌, 아미노-이소부티르산, 노르발린, 노르류신, tert-류신, 테트라히드로이소퀴놀린 카르복실산, 피페콜린산, 페닐글리신, 호모페닐알라닌, 시클로헥실글리신, 데히드로류신, 2,2-디에틸글리신, 1-아미노-1-시클로펜탄카르복실산, 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산, 아미노-벤조산, 아미노-나프토산, 감마-아미노부티르산, 디플루오로페닐알라닌, 니페코트산, 알파-아미노 부티르산, 티에닐-알라닌, t-부틸글리신, 트리플루오로발린; 헥사플루오로류신; 플루오르화 유사체; 아지드-변형 아미노산; 알킨-변형 아미노산; 시아노-변형 아미노산; 및 그의 유도체를 포함한다.

본 개시내용의 추가 측면에서, 변형된 GDF11 폴리펩티드 분자는, 예를 들어, 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 중 하나 이상에 모이어티의 첨가에 의해 변형된 분자와 같이 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 GDF11 폴리펩티드는 하나 이상의 모이어티 분자, 예를 들어, 펩티드당 1개 이상의 모이어티 분자, 펩티드당 2개 이상의 모이어티 분자, 펩티드당 5개 이상의 모이어티 분자, 펩티드당 10개 이상의 모이어티 분자 또는 펩티드당 더 많은 모이어티 분자를 포함할 수 있다. 적합한 GDF11 변형된 폴리펩티드는 하나 이상의 유형의 변형 및/또는 모이어티, 예를 들어 1종의 변형, 2종의 변형, 3종의 변형 또는 그 초과의 종의 변형을 포함할 수 있다. 변형 및/또는 모이어티의 비제한적 예는 PEG화; 글리코실화; HES화; ELP화; 지질화; 아세틸화; 아미드화; 말단-캡핑 변형; 시아노 기; 인산화; 알부민, 및 고리화를 포함한다. 대안적으로, 말단-캡핑 변형은 N-말단에서의 아세틸화, N-말단 아실화, 및 N-말단 포르밀화를 포함할 수 있거나, 말단-캡핑 변형은 C-말단에서의 아미드화, C-말단 알콜, 알데히드, 에스테르, 및 티오에스테르 모이어티의 도입을 포함할 수 있다. 따라서 변형된 GDF11 폴리펩티드의 반감기는 선택된 이러한 모이어티, 예를 들어 PEG 또는 알부민의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 아무튼, GDF11 분자는 생물학적 분포, 투여 용이성, 대사 안정성, 및 이들 중 적어도 두 가지의 조합 중 적어도 하나를 개선하기 위해 공지된 의화학 기술을 통해 변형될 수 있다.

본 개시내용의 다른 측면에서, 변형된 GDF11 폴리펩티드 분자는 제약상 허용되는 전구약물로서 제시될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "전구약물"은 일부 화학적 또는 생리학적 과정 (예를 들어, 효소적 과정 및 대사적 가수분해)을 통해 치료 활성제로 전환될 수 있는 화합물을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 또한 제약상 허용되는 치료 활성 화합물의 전구체를 지칭한다. 전구약물은, 예를 들어, 에스테르로서 대상체에게 투여될 때 불활성일 수 있으나, 예를 들어 유리 카르복실산 또는 유리 히드록실로의 가수분해에 의해 활성 화합물로 생체내에서 전환된다. 전구약물 분자는 대상체에서 종종 용해도, 조직 적합성 또는 지연 방출의 이점을 제공한다. 전구약물은 또한 이러한 전구약물이 대상체에게 투여될 때 생체내에서 활성 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함할 수 있다. 활성 화합물의 전구약물은 활성 분자에 존재하는 관능기를 변형하여 일상적인 조작 또는 생체내에서 모 활성 분자로 절단되는 방식으로 제조할 수 있다. 전구약물은 히드록시, 아미노 또는 메르캅토 기가 임의의 기에 결합되어 있는 분자를 포함하며, 전구약물이 대상체에게 투여될 때 임의의 기가 절단되어 각각 유리 히드록시, 유리 아미노 또는 유리 메르캅토 기를 형성한다. 전구약물의 예는 알콜의 아세테이트, 포르메이트 및 벤조에이트 유도체 또는 활성 화합물 내의 아민 관능기의 아세트아미드, 포름아미드 및 벤즈아미드 유도체 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Harper, Drug Latentiation in Jucker, ed. Progress in Drug Research 4:221-294 (1962); Morozowich et al, Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design in E. B. roche ed. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs, APHA Acad. Pharm. Sci. 40 (1977); Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design, Theory and Application, E. B. roche, ed., APHA Acad. Pharm. Sci. (1987); Design of Prodrugs, H. Bundgaard, Elsevier (1985); Wang et al. (1999) Curr. Pharm. Design. 5(4): 265-287; Pauletti et al. (1997) Adv. Drug. Delivery Rev. 27: 235-256; Mizen et al. (1998) Pharm. Biotech. 1 1: 345-365; Gaignault et al. (1996) Pract. Med. Chem. 671-696; Asgharnejad, Improving Oral Drug Transport, in Transport Processes in Pharmaceutical Systems, G. L. Amidon, P. I. Lee and E. M. Topp, Eds., Marcell Dekker, p. 185-218 (2000); Balant et al. (1990) Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet., 15(2): 143-53; Balimane et al. (1999) Adv. Drug Delivery Rev. 39(1-3): 183-209; Browne (1997) Clin. Neuropharmacol. 20(1): 1-12; Bundgaard H. (1979) Arch. Pharm. Chem 86(1): 1-39; Bundgaard H. (1987) Controlled Drug Delivery 17: 179-96; Bundgaard H. (1992) Arfv. Drug Delivery Rev. 8(1): 1-38; Fleisher et al. (1996) Arfv. Drug Delivery Rev. 1 9(2): 115-130; Fleisher et al. (1985) Methods Enzymol. 1 12: 360-81; Farquhar D, et al. (1983) Pharm. Sci. 72(3): 324-325; Freeman et al. (1991) Chem. Soc., Chem. Commun. 875-877; Friis et al. (1996) Eur. J. Pharm. Sci. 4: 49-59; Gangwar et al. (1977) Des. Biopharm. Prop. Prodrugs Analogs, [Symp.] Meeting Date 1976: 409-21; Nathwani et al. (1993) Drugs 45(6): 866-94; Sinhababu et al. (1996) Adv. Drug Delivery Rev. 1 9(2): 241-273; Stella et al. (1985) Drugs 29(5): 455-73; Tan et al. (1999) Adv. Drug Delivery Rev. 39(1-3): 117-151; Taylor (1996) Adv. Drug Delivery Rev. 1 9(2): 131-148; Valentino et al. (1997) Drug Discovery Today 2(4): 148-155; Wiebe et al. (1999) Adv. Drug Delivery Rev. 39(1-3): 63-80 (1999)]; 및 [Waller et al. (1989) Br. J. Clin. Pharmac. 28: 497-507] 참조.

본원에서 사용하기에 적합한 GDF11 폴리펩티드 분자는 재조합 방법 및 화학적 합성을 포함한 널리 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입하여 펩티드를 생산하는 재조합 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Vols 1 to 8, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); M. W. Pennington and B. M. Dunn, Methods in Molecular Biology Peptide Synthesis Protocols, Vol 35, Humana Press, Totawa, N.J. (1994)]에 기재된 것들이다. 적합한 폴리펩티드는 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Merrifield et al. (1964) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, N.Y.; Kimmerlin et al. (2005) Pept. Res. 65: 229-260; Nilsson et al. (2005) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34: 91-118; W. C. Chan and P. D. White (Eds.) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, Cary, N.C. (2000); N. L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, Fla. (2005); J. Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, 2.sup.nd Ed, Oxford University Press, Cary, N.C. (2002)]; 및 [P. Lloyd-Williams, F. Albericio, and E. Giralt, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1997)] 참조. 펩티드 유도체는 또한 미국 특허 번호 4,612,302; 4,853,371 및 4,684,620; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0263843에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

GDF11 폴리펩티드 분자의 원래 아미노산 서열의 변경은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 기술 중 임의의 것에 의해 완수될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정한 유전자좌에 돌연변이를 도입할 수 있으며, 천연 서열의 단편에 라이게이션할 수 있는 제한 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 라이게이션 후, 생성된 재구축된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 갖는 유사체를 코딩한다. 대안적으로, 필요한 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정한 코돈을 갖는 변경된 뉴클레오티드 서열을 제공하기 위해 올리고뉴클레오티드-지향 부위-특이적 돌연변이유발 절차를 이용할 수 있다. 이러한 변경을 행하기 위한 기술은 미국 특허 번호 9,434,779에 개시된 것들을 포함하며, 상기 특허는 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 변형된 변이체 또는 유도체 GDF11 폴리펩티드 분자는 화학적으로 합성될 수 있고 돌연변이는 화학적 합성 과정의 일부로서 혼입될 수 있다.

이어서, 선택된 GDF11 분자는 대상체에 대한 투여에서 사용하기 위한 약리학적 조성물로서 제제화된다. 예를 들어, GDF11 분자는 제약상 허용되는 용매화물로서 제공될 수 있다. 용어 "용매화물"은 적합한 용매의 분자가 결정 격자에 혼입된 고체 상태의 본원에 기재된 바와 같은 GDF11 분자를 지칭한다. 치료적 투여에 적합한 용매는 투여되는 투여량에서 생리학상 허용된다. 치료적 투여에 적합한 용매의 예는 에탄올 및 물이다. 물이 용매인 경우, 용매화물을 수화물로 지칭한다. 일반적으로, 용매화물은 적절한 용매에 분자를 용해시키고 냉각시키거나 반용매를 사용하거나 냉각하여 용매화물을 단리함으로써 형성된다. 용매화물은 전형적으로 주위 조건 하에 건조되거나 공비혼합된다.

그 안에 용해 또는 분산된 활성 성분 (GDF11 분자)을 함유하는 제약 조성물의 적절한 제조는 관련 기술분야에서 잘 이해되며 일반적으로 제제를 기반으로 하여 제한될 필요는 없다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 것으로 제조되나, 사용 전에 액체 중 용액, 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화되거나 리포솜 조성물로서 제시될 수 있다. GDF11 분자는 제약상 허용되고 GDF11 분자와 상용성인 부형제와 그리고 본 개시내용에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 양으로 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그의 조합이다. 게다가, 원하는 경우, 제약 조성물은 활성 성분의 유효성을 증강시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 그 안에 성분의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기 산 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성되는 산 부가 염 (폴리펩티드의 유리 아미노 기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실 기로 형성된 염은 또한 무기 염기 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물, 및 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제약상 허용되는 담체, 부형제 및 비히클은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 액체 담체는 활성 성분 및 물 외에 어떠한 물질도 함유하지 않는 멸균 수용액이고/이거나, 완충제 예컨대 생리학적 pH 값의 인산나트륨, 생리식염수 또는 둘 다, 예컨대 인산염-완충 식염수를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 추가 측면에서, 수성 담체는 하나 초과의 완충제 염, 뿐만 아니라 염 예컨대 염화나트륨 및 염화칼륨, 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 용질을 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물에 더하여 그리고 물을 제외하고 액상을 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 액상의 예시는 글리세린, 식물성 오일 예컨대 면실유, 및 수-유 에멀젼이다. 대상체에서 졸중 장애 또는 병태의 치료에 효과적일 본 방법에 사용되는 GDF11 분자의 양은 이러한 장애 또는 병태의 특성에 따라 달라질 것이며 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.

본 개시내용의 특정 측면에서, GDF11 분자는 제어 방출 투여 형태 또는 조성물을 사용하여 투여될 수 있다. 제어 방출 의약품은 그의 비제어된 방출 대응물에 의해 달성되는 것에 비해 약물 요법을 개선한다는 공통 목표를 가지고 있다. 이상적으로는, 의학적 치료에서 최적으로 설계된 제어 방출 투여 형태 또는 조성물의 사용은 최소량의 시간 내에 장애 또는 병태를 해결하기 위해 이용되는 최소한의 약물 물질을 특징으로 한다. 제어 방출 접근법의 이점은 다음을 포함한다: 1) GDF11 분자의 연장된 활성; 2) 투여 빈도 감소; 3) 순응도 증가; 4) 투여 형태에서 더 적은 총 GDF11의 사용 가능성; 5) 국부적 또는 전신적 부작용의 감소; 6) 약물 (GDF11) 축적의 최소화; 7) 혈중 수준 변동 감소; 8) 치료 효능의 개선; 9) 약물 (GDF11) 활성의 강화 또는 상실 감소; 및/또는 10) 질환 또는 병태 제어 속도의 개선.

통상적인 투여 형태 및 조성물은 일반적으로 제제로부터 신속하거나 즉각적인 약물 방출을 제공한다. 약물의 약리학 및 약동학에 따라, 통상적인 투여 형태의 사용은 대상체의 혈액 및 다른 조직에서 약물 농도의 광범위한 변동을 야기할 수 있다. 이들 변동은 다수의 파라미터, 예컨대 용량 빈도, 작용 시작, 효능 지속기간, 치료적 혈중 수준 유지, 독성, 부작용 등에 영향을 미칠 수 있다. 유리하게는, 제어 방출 투여 형태 또는 조성물을 사용하여 GDFD11 분자의 작용 시작, 작용 지속기간, 치료 창 내의 혈장 수준, 및 최고 혈중 수준을 제어할 수 있다. 특히, 제어 방출은 GDF11 분자의 최대 유효성을 둘 다 약물의 과소-투약 (즉, 최소 치료 수준 미만) 뿐만 아니라 약물의 독성 수준 초과로 인해 발생할 수 있는, 잠재적 유해 효과 및 안전 문제를 최소화하면서 달성되는 것을 보장하기 위해 사용할 수 있다.

대부분의 제어-방출 투여 형태 또는 조성물은 초기에 원하는 치료 효과를 즉시 생성하는 양의 약물 (활성 성분)을 방출하고, 점차적으로 그리고 지속적으로 추가 양의 약물을 방출하여 연장된 기간에 걸쳐 이러한 수준의 약리학적 효과를 유지하도록 설계된다. 체내에서 일정한 수준의 약물을 유지하기 위해, 약물은 대사되고 신체로부터 배설되는 약물의 양을 대체할 속도로 투여 형태로부터 방출되어야 한다. 선택된 투여 형태 또는 조성물로부터의 GDF11 분자의 제어 방출은 pH, 이온 강도, 삼투압, 온도, 효소, 물, 및 다른 생리학적 조건, 분자 또는 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다. 다양한 공지된 제어 방출 투여 형태 및 조성물이 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예는 미국 특허 번호 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566; 및 6,365,185에 기재된 것들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 투여 형태는 원하는 방출 프로필을 제공하기 위해 부형제 예컨대 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 기타 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 또는 삼투 시스템, 또는 그의 조합을 사용하여 제어 방출을 제공한다.

GDF11 분자는 대상체에서 바람직하지 않은 부작용의 부재 또는 최소화에서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 조성물에 포함된다. 이러한 치료 유효 농도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서 GDF11 분자를 시험함으로써 경험적으로 예측된 다음에 인간에 대한 투여량에 대해 그로부터 외삽될 수 있다. 이어서 인간 용량은 전형적으로 임상 시험에서 미세-조정되고 원하는 치료 반응을 발생시키도록 적정된다. 조성물을 제제화하기 위해, 화합물의 중량 분획을 유효 농도로 선택된 담체, 부형제 또는 비히클에 용해, 현탁, 분산 또는 달리 혼합된다. 이어서 GDF11 분자를 함유하는 제제화된 제약 조성물은 예를 들어 단위 용량의 형태로 통상적으로 투여될 수 있다. 제약 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "단위 용량"은 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 이산된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클과 연관되어 원하는 약리학적 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 수량의 GDF11 분자를 함유한다. 단위 투여 형태의 예는 앰플 및 주사기를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 하나의 바람직한 측면에서, GDF11 분자는 주사용수를 포함하는 제약 조성물의 형태로 제공된다. 관련 측면에서, 제약 조성물에 치료 유효량의 GDF11 분자를 포함하는 주사기가 제공된다. 단위-용량 형태는 그의 분획 또는 배수로 투여될 수 있다. 다중 용량 형태는 분리된 단위 용량 형태로 투여하기 위해 단일 용기에 포장된 복수개의 동일한 단위 용량 형태이다. 다중 용량 형태의 예는 바이알, 정제 또는 캡슐 병 또는 파인트 또는 갤런 병을 포함한다. 따라서, 다중 용량 형태는 포장에서 분리되지 않은 단위 용량의 배수이다. 대안적으로, GDF11 조성물은 적어도 하나의 치료 활성제 (GDF11 분자)를 포함한 키트 (예를 들어, 패키지 또는 용기)로 제공된다. 특정 키트에서 제조물은 본 개시내용의 방법을 수행하기 위한 단위로서 표지되거나, 홍보되거나, 유통되거나, 판매될 수 있다.

상기에 논의된 바와 같이, 본 조성물에 대한 바람직한 투여 경로는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 주사를 통한, 비경구이다. 이러한 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 조성물의 pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 주사용으로 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 에멀젼 또는 현탁액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) EL.TM. (바스프(BASF), 뉴저지주 파시패니) 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 무균 상태여야 하고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 조성물의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 선택된 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당류, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물에 포함된다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 부형제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 특정된 양의 GDF11 분자를 혼입한 후에, 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 GDF11 분자를 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것들 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 것들로부터 선택된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하여 사전에 멸균-여과된 그의 용액으로부터 GDF11 분자의 분말에 더하여 임의의 추가의 원하는 성분을 산출한다.

본 개시내용의 특정 측면에서, 본 발명의 조성물은 대상체에 이식하기에 적합하다. 예를 들어, 이식가능한 장치 또는 시스템은 성형품, 예컨대 구체, 막대, 슬래브, 필름, 섬유, 바늘, 실린더, 시트, 튜브, 또는 미세입자, 미세구체, 및/또는 미세캡슐을 포함한 임의의 다른 적합한 기하학적 구조로 구성될 수 있다. 임플란트는 예를 들어 카테터, 션트, 연속 지주막하 주입을 위한 장치, 공급 튜브, 외과적 유착을 방지하기 위한 고체 임플란트, 자궁 임플란트, 인공 괄약근, 요도주위 임플란트, 부목, 안과용 임플란트, 콘택트 렌즈, 성형외과용 임플란트, 식도 스텐트, 위장 스텐트, 혈관 스텐트, 담도 스텐트, 결장 스텐트, 췌장 스텐트, 요관 스텐트, 요도 스텐트, 누선 스텐트, 유스타키오관 스텐트, 나팔관 스텐트, 비강 스텐트, 부비강 스텐트, 기관 스텐트, 또는 기관지 스텐트를 포함한 스텐트 (활성제를 포함하거나 활성제로 코팅됨), 또는 정맥 접근 장치를 포함한 포트, 이식된 포트, 경막외 카테터 또는 중앙 카테터 (PICC)와 같은 특수한 위치에 적합한 임의의 적합한 크기 및 형상으로 제공될 수 있다. 임플란트는 외과적으로, 또는 투관침, 카테터 등을 이용하는 최소 침습 기술을 사용하여 원하는 부위에 이식될 수 있다. 임플란트는 대안적으로 피내, 진피하, 피하, 복강내, 근육내, 또는 내강내 (예를 들어, 동맥내, 정맥내, 질내, 직장으로, 또는 치주 공간으로)로의 이식과 같은 표준 기술을 사용하여 임의의 적합한 조직에 이식될 수 있다. 임플란트는 매트릭스, 그래프트, 보철물 또는 코팅의 일부로 대안적으로 제작될 수 있다. 이식가능한 장치가 미립자 형태, 예를 들어 미세입자, 미세구체 또는 미세캡슐로 제조된다면, 이는 입자의 현탁액을 주입하기 위해 캐뉼러, 바늘 및 주사기 또는 유사한 기기를 사용하여 적합한 조직에 이식될 수 있다.

GDF11 분자의 투여는 전형적으로 중심 정맥 카테터 라인 또는 유사한 IV 카테터와 같은 카테터에 의해 정맥내로 수행된다. 대안적으로, GDF11 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 주사를 통해 투여될 수 있다. 따라서 특정 측면에서, 조성물은 주사용수와 같은 적합한 주사용 비히클을 포함하도록 간단하게 제제화될 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 주입 펌프와 같은 외부 약물 펌프를 사용하여 투여될 수 있다. 본 개시내용의 방법의 실시에서, GDF11 분자는 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태로 조성물에 존재할 수 있다.

본 개시내용의 특정한 측면에서, 방법의 실시에 이용되는 치료의 정확한 투여량 및 지속기간은 공지된 테스트 프로토콜을 사용하거나 생체내 또는 시험관내 시험 데이터 또는 후속 임상 테스트로부터의 외삽에 의해 해결되고 경험적으로 결정될 수 있는 졸중 및 생성된 졸중 손상의 유형과 함수 관계에 있다. 농도 및 투여량 값은 해결하여야 할 졸중의 중증도에 따라 또한 달라질 수 있다는 점에 주목하여야 한다. 임의의 특정한 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 개인의 필요 및 본 GDF11 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있으며, 본원에 제시된 농도 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 방법의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도는 아니다.

본 개시내용의 다른 측면에서, 조성물의 투여는 임의의 적합한 기준, 예컨대 1일 1회 (QD), 1일 2회 (BID), 1일 3회 (TID), 1일 4회 (QID), 매시간 ("q_h" 여기서 "h"는 용량 사이의 시간 수를 나타냄) 등으로 수행될 수 있으며, 각각의 치료일은 치료 과정에 걸쳐 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시내용의 다른 측면에서, 치료는 1회 수행될 수 있거나, 고려되는 구체적 치료에 적합한 임의의 수의 치료 요법을 수반할 수 있다. 예를 들어, 적합한 치료 요법은 GDF11 분자의 첫 번째 용량의 1차 투여 (치료 1일차)에 이어서 GDF11 분자의 2차 또는 그 초과의 더 높거나 더 낮은 용량으로의 2차 투여 또는 후속 투여 (예를 들어, 치료 2일차부터 14일차까지)를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 하루 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 2일 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 3일 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 4일 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 5일 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 6일 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 7일 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 변형에서, GDF11 치료 요법은 간헐적 일자에 수행될 수 있다. 이러한 투여에서, 임의의 1일, 2일, 또는 3일은 임의의 조합으로 생략될 수 있다. 예를 들어, 투약은 1일차, 3일차, 및 6일차; 1일차, 3일차, 및 7일차, 1일차, 2일차, 4일차, 및 6일차; 1일차, 1일차, 2일차, 3일차, 5일차, 및 7일차 등에 수행될 수 있다.

특정 측면에서, 투약 요법은 상승 또는 하향 용량으로 GDF11 분자의 고전적 적정을 수반하며, 예를 들어 여기서 1차 투여는 치료 기간의 1일차에 적어도 최소한의 고용량의 GDF11의 초기 용량으로 수행되며 2차, 더 높은 용량으로 종료되며, 여기서 이러한 첫 번째 용량과 두 번째 용량 사이에 임의의 수의 상이한 중간 용량이 수행된다. 대안적으로, GDF11 분자의 적정은 GDF11 분자의 초기 (1일차) 고용량을 수반할 수 있고 GDF11의 적어도 최소한의 고용량의 최종 용량으로 종료할 수 있으며, 다시 여기서 이러한 초기 용량과 최종 용량 사이에 임의의 수의 상이한 중간 용량이 수행된다. 임의의 적정 전략에서, GDF11 분자에 대한 중앙 독성 용량 (MTD)에 접근하거나 적어도 투여된 GDF11 분자에 대한 치료 창의 최대 용량에 접근하는 제1 고용량으로 GDF11 분자를 투여한 후에, 더 낮은 수준의 후속 용량 (또는 용량들)으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

본 개시내용의 다른 측면에서, GDF11 치료 요법은 소위 "약물 휴지기"를 사용하여, 즉, 예를 들어, 구조화된 치료 중단, 내약성 단절 또는 치료 단절에 따라 다수회 (예를 들어, 반복) 수행될 수 있으며, 여기서 후속 치료(들)는 초기 치료 완료 후 2일 내지 7일에 발생한다. 여기서 다시, 임의의 특정한 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 개인의 필요 및 본 GDF11 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있으며, 본원에 제시된 투약 전략은 단지 예시적인 것이며 청구된 방법의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도는 아니다. 하나의 특정한 요법에서, GDF11 분자의 처음 또는 처음 몇 번의 투여는 대상체가 중심 정맥 카테터 라인 또는 유사한 IV 카테터와 같은 카테터를 가지고 있는 집중 치료 환경에서 수행된다. 안정화 및 준중환자실(step-down unit), 졸중 회복실, 또는 기타 적합한 환경으로 이동 직후, 이어서 바늘과 주사기를 사용하여 GDF11 분자의 후속 투여를 수행할 수 있다. 후속 치료 요법 (예를 들어, 약물 휴지기 이후)은 임플란트 또는 외부 약물 펌프를 사용하여 수행할 수 있다. 후속 치료 요법은 초기 치료와 동일한 고용량, 짧은 투여 지속기간을 표적으로 할 수 있거나, 연장된 치료 지속기간의 유무에 관계없이 GDF11 분자의 저용량 투여를 표적으로 할 수 있다.

또 다른 측면에서, 치료 유효량의 GDF11 분자가 상가적 또는 상승적 효과를 달성하기 위해 적어도 하나의 추가 활성제와 함께 투여되는 상기 방법이 실시된다. 본 개시내용의 특정 바람직한 측면에서, GDF11 분자 및 제2 치료 활성제가 혼합물로서 부수적으로, 개별적으로 그리고 동시에, 개별적으로 그리고 공동으로, 또는 개별적으로 및 순차적으로 투여될 수 있는 방법이 제공된다. 예를 들어, GDF11 분자는 하기를 포함한 투여 방법 군 중 하나에 따라 추가 활성제와 함께 투여될 수 있다: i) 적어도 1회 용량의 추가 활성제 및 적어도 1회 용량의 GDF11 분자를 동시에 그러나 개별적으로 투여하는 것; ii) 적어도 1회 용량의 추가 활성제 및 적어도 1회 용량의 GDF11 분자를 혼합하여 함께 투여하는 것; iii) 적어도 1회 용량의 추가 활성제 및 적어도 1회 용량의 GDF11 분자를 순차적으로 투여하고, 적어도 1회 용량의 추가 활성제는 GDF11 분자의 적어도 1회 용량의 투여 전에 투여되는 것; iv) 적어도 1회 용량의 추가 활성제 및 적어도 1회 용량의 GDF11 분자를 순차적으로 투여하고, 적어도 1회 용량의 GDF11 분자를 투여한 후 적어도 1회 용량의 추가 활성제를 투여하는 단계; 및 v) 적어도 1회 용량의 추가 활성제 및 적어도 1회 용량의 GDF11 분자를 순차적으로 그리고 혼합하여 함께 투여하는 것.　 이러한 투여 전략은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서 다양한 조합 및 순서를 시험함으로써 경험적으로 예측할 수 있고, 이어서 인간 대상체에서 사용하기 위해 그로부터 외삽할 수 있다. 이어서 인간 용량은 전형적으로 임상 시험에서 미세-조정되고 반응에 따라 적정된다.

따라서, 상기 설명 및 하기 실시예에 의해 뒷받침되는 바와 같은 청구된 발명의 측면의 요약은 다음과 같다: (1) 대상체에서 졸중 사건 후 12시간 내지 72시간 이내에 치료 유효량의 성장 분화 인자 11 (GDF11) 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 졸중을 치료하는 방법이며, 여기서 GDF11 분자가 1일 내지 약 14일의 치료 기간에 걸쳐 하루에 대상체의 체중에 비해 적어도 최소한의 고용량의 GDF11의 양으로 투여되는 것인, 대상체에서 졸중을 치료하는 방법;

(2) (1)에 있어서, GDF11 분자의 투여가 졸중 사건 후 12시간 내지 24시간 이내에 개시되는 것인 방법;

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, GDF11 분자의 투여가 2일 내지 4일의 치료 기간에 걸쳐 수행되는 것인 방법;

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자가 대상체에게 1일 1회 (QD) 기준으로 투여되거나, 대안적으로 간헐적 일자에 1일 1회 투여되는 것인 방법;

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자가 GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태인 방법;

(6) (5)에 있어서, GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태가 동종이량체를 형성하는 것인 방법;

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열과 적어도 91% 서열 상동성을 가진 폴리펩티드인 방법;

(8) (7)에 있어서, GDF11 분자가 재조합 인간 GDF11 (rhGDF11)인 방법;

(9) (7)에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 변이체인 방법;

(10) (7)에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 유도체인 방법;

(11) (9) 또는 (10)에 있어서, 변이체 또는 유도체 GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 것인 방법.

(12) (11)에 있어서, GDF11 분자가 아미노산 유사체를 포함하는 것인 방법;

(13) (7)에 있어서, GDF11 분자가 변형된 GDF11 폴리펩티드인 방법;

(14) (13)에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 인산화, 당화, 글리코실화, PEG화, HES화, ELP화, 지질화, 아세틸화, 아미드화, 말단-캡핑되거나, 시아노 기, 알부민을 포함하거나, 또는 고리화되는 것인 방법;

(15) (13)에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 제1 GDF11 분자 모이어티 및 제2 모이어티를 포함하는 키메라 폴리펩티드인 방법;

(16) (15)에 있어서, 제2 모이어티가 트랜스페린, 성장 호르몬 또는 Fc 단편으로부터 유래되는 것인 방법;

(17) (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 천연 GDF11 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖는 것인 방법;

(18) (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자가 대상체에게 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물의 형태로 투여되는 것인 방법;

(19) (18)에 있어서, 제약 조성물이 주사용수를 포함하는 것인 방법;

(20) (19)에 있어서, 제약 조성물이 대상체에게 정맥내 주사를 통해 투여되는 것인 방법;

(21) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자의 투약이 투여 기간의 1일차에 초기 최소한의 고용량으로부터 투여 기간의 마지막 날에 더 높은 용량으로 상향 적정되는 것인 방법;

(22) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자의 투약이 초기 고용량으로부터 투여 기간의 마지막 날에 최종 최소한의 고용량으로 하향 적정되는 것인 방법;

(23) (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 치료 유효량의 GDF11 분자를 대상체에게 2차 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 2차 투여가 초기 투여 완료 후 2일 내지 7일 후에 수행되는 것인 방법;

(24) (1) 내지 (23) 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 치료가 대상체에서 개선된 신체 운동 또는 인지 기능을 특징으로 하는 것인 방법;

(25) (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 졸중 사건이 허혈성인 방법;

(26) (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 졸중 사건이 출혈성인 방법;

(27) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 치료가 대상체에서 졸중 부위 또는 그 근처에서 신생혈관형성, 개선된 뇌혈관 구조, 기능 또는 혈류를 특징으로 하는 것인 방법;

(28) 대상체에서 졸중을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 치료 유효량의 성장 분화 인자 11 (GDF11) 분자를 포함하는 조성물로서, 상기 방법은 대상체에서 졸중 사건 후 12시간 내지 72시간 이내에 상기 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 개시하는 것을 포함하며, 여기서 조성물이 GDF11 분자를 하루에 대상체의 체중에 비해 적어도 최소한의 고용량의 GDF11의 양으로 포함하고 조성물이 대상체에게 1일 내지 약 14일의 치료 기간에 걸쳐 투여되는 것인 조성물;

(29) (28)에 있어서, GDF11 분자가 GDF11 분자의 성숙한 형태인 조성물;

(30) (29)에 있어서, GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태가 동종이량체를 형성하는 것인 조성물;

(31) (28) 내지 (30) 중 어느 하나에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열과 적어도 91% 서열 상동성을 가진 폴리펩티드인 조성물;

(32) (31)에 있어서, GDF11 분자가 재조합 인간 GDF11 (rhGDF11)인 조성물;

(33) (31)에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 변이체인 조성물;

(34) (31)에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 유도체인 조성물;

(35) (33) 또는 (34)에 있어서, 변이체 또는 유도체 GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 것인 조성물;

(36) (31)에 있어서, GDF11 분자가 아미노산 유사체를 포함하는 것인 조성물;

(37) (31)에 있어서, GDF11 분자가 변형된 GDF11 폴리펩티드인 조성물;

(38) (37)에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 인산화, 당화, 글리코실화, PEG화, HES화, ELP화, 지질화, 아세틸화, 아미드화, 말단-캡핑되거나, 시아노 기, 알부민을 포함하거나, 또는 고리화되는 것인 조성물;

(39) (37)에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 제1 GDF11 분자 모이어티 및 제2 모이어티를 포함하는 키메라 폴리펩티드인 조성물;

(40) (39)에 있어서, 제2 모이어티가 트랜스페린, 성장 호르몬 또는 Fc 단편으로부터 유래되는 것인 조성물;

(41) (37) 내지 (40) 중 어느 하나에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 천연 GDF11 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖는 것인 조성물;

(42) (28) 내지 (41) 중 어느 하나에 있어서, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함하는 조성물;

(43) (42)에 있어서, 제약 조성물이 주사용수를 포함하는 조성물;

(44) (42) 또는 (43)에 있어서, 대상체에게 정맥내 주사를 통해 투여하기 위해 제제화된 조성물;

(45) (28) 내지 (44) 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 허혈성 졸중을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 조성물; 및

(46) (28) 내지 (44) 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 출혈성 졸중을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 조성물.

상기 설명은 예시를 위한 것이며 제한적이지 않음을 이해하여야 한다. 많은 다른 측면이 상기 설명을 읽은 직후 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 설명의 상이한 부분에서 논의되고 및/또는 도면에서 참조되는 구체적 측면은 본 개시내용의 추가 측면을 형성하기 위해 조합될 수 있다는 점에 주목하여야 한다. 따라서, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위를 이러한 청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 참조하여 결정되어야 한다. 모든 간행물, 특허 및 특허 문서는 마치 본원에 그 전문이 개별적으로 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.

실시예

본 개시내용은 하기 실시예에 의해 기재된 실험에 의해 본원에서 예시되며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고 본원에 제시된 측면에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 이들 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용이 완전히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 본 개시내용의 많은 수정 및 다른 측면이 전술한 설명에 제시된 교시내용의 이점을 갖는 본 개시내용과 관련된 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 떠오를 것이다. 특정 용어가 이용되더라도, 이들은 달리 나타내지 않는 한 관련 기술분야에서와 같이 사용된다. 　

실시예 1 :

본 실시예의 목적은 폐색 후 28일까지 신체 운동 기능을 측정한 래트 영구 중대뇌 동맥 폐색 모델 (pMCAO) 연구에서 폐색 후 14일 동안 1일 1회 (QD) 투여되는 단일 용량의 rGDF11로 이루어진 GDF11 분자 투여 요법의 치료 효과를 평가하는 것이었다. pMCAO 방법론 및 모델은 인간 임상 시험의 개시를 지원하는데 사용된 졸중 회복의 검증된 설치류 모델이다 (예를 들어, 문헌 [Iaci et al. (2013) Stroke 44: 1942-1950 (dalfampridine)] 및 [Iaci et al. (2016) Journal of Neuroscience Research 94: 253-265 (Neuregulin 1β3, Glial Growth Factor)] 참조).

pMCAO 모델. 국소 뇌경색은 타무라(Tamura)와 동료들의 방법의 변형을 사용하여 근위 우측 중대뇌 동맥 (MCA)의 영구 폐색에 의해 만들어졌다 (문헌 [Tamura et al. (1986) No To Shinkei 38: 747-751; Iaci et al. (2013) Stroke 44(7): 1942-1950]; 및 [Iaci et al. (2016) J Neurosci Res 94(3): 253-265] 참조). 수컷 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 래트 (수술 당시에 300-400 g)를 N₂O:O₂ (2:1) 혼합물 중 3% 이소플루란으로 마취하고 N₂O:O₂ (2:1) 혼합물 중 2-2.5% 이소플루란으로 유지하였다. 측두근을 이등분하고 눈과 고막 사이의 중간 절개를 통해 반영시켰다. 근위 MCA는 관골 궁을 제거하지 않고 안면 신경을 횡절단하지 않고 측두하 두개골절제술을 통해 노출되었다. 이어서 동맥은 후각 기관 바로 근위부에서 하대뇌 정맥까지 미세양극성 응고에 의해 막혔다. 직장 온도 프로브와 연결된 가열 패드를 사용하여, 절차 전반에 걸쳐 목표 체온을 37.0 ± 1℃로 설정하였다. 세파졸린 (40 mg/kg; 호스피라(Hospira), 로트(Lot): 319002.1, 만료일: 28Feb22)은 감염을 예방하기 위해 수술 전에 복강내 주사 (i.p.)로 제공되었다. 피하 (s.c) 투여된 부프레노르핀 (~0.1 mg/kg, 심바돌(Simbadol), 로트: B195093, 만료일: 31Oct2020)이 또한 진통제로서 MCAO 수술 전에 제공되었다.

동물 및 동물 준비. 이 연구는 총 24마리의 군당 12마리의 동물을 가진 2개의 실험 군을 포함하였다. 순응 목적으로 수술 전 오(5)일 동안 거동 평가를 위해 모든 래트를 수용하고 처리하였다. 처리 기간의 종료시에, 래트를 무작위화하고 케이지당 상이한 군에 배정하였다. 스물 네(24)마리의 성체, 상기한 바와 같은 수컷 스프라그-다우리 래트를 연구에 사용하였다. 래트를 무작위화하고 케이지별로 상이한 군으로 배정하였다. 래트는 꼬리 마킹에 의해 고유 식별 번호를 제공받았다.

투약. MCA의 외과적 폐색 후 3일차에 시작하여 MCAO 후 16일차까지 매일 계속 투약하면서 동물에게 투여하였다. 동물은 1일 1회 비히클을 1 ml/kg 또는 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg (1 ml/kg)로 받았다.

체중. 수술일부터 투약 마지막 날 (16일차), 이어서 MCAO 후 21일차 및 28일차까지 동물의 체중을 매일 측정하였다.

혈액 수집. 혈액 샘플 (약 300마이크로리터 (μL)의 전혈)을 16일차에 마지막 수행 후 한 시간에 수집하고 혈청에 대해 처리하였다. 생체내 rGDF11 활성의 기계론적 바이오마커에 대해 혈청 샘플을 평가할 것이다.

기능적 거동 검사. 기능적 활동은 사지 배치 및 신체 스윙 거동 검사를 사용하여 평가되었다. 거동 검사는 두 가지 모두 수행된 날에 약물 투여 전에 수행되었다.

사지 배치. 사지 배치 검사는 앞다리와 뒷다리 검사 둘 다로 나뉘었다. 앞다리 배치 검사는 래트가 수염, 시각, 촉각 또는 고유감각 자극에 반응하여 탁상 표면 위에 그의 앞다리를 놓는 능력을 채점하였다. 뒷다리 배치 검사는 래트가 촉각 및 고유감각 자극에 반응하여 탁상 표면 위에 그의 뒷다리를 놓는 능력을 채점하였다. 함께, 이들 검사는 감각운동 시스템의 기능 및 회복을 반영한다 (예를 들어, 문헌 [De Ryck et al. (1992) Brain Res 573:44-60] 참조). 앞다리 배치 검사의 경우, 검사자는 래트를 탁상 표면에 가깝게 고정시키고 수염, 시각, 촉각, 또는 고유감각 자극에 반응하여 탁상 표면 위에 앞다리를 놓는 래트의 능력을 채점하였다. 유사하게, 뒷다리 배치 검사의 경우, 검사자는 촉각 및 고유감각 자극에 반응하여 탁상 위에 뒷다리를 놓는 래트의 능력을 평가하였다. 감각 입력의 각각의 모드에 대해 별도의 하위-점수를 얻고 (0.5점 지정 가능) 추가하여 총 점수를 제공하였다 (앞다리 배치 검사의 경우: 0 = 정상, 12 = 최대 손상; 뒷다리 배치 검사의 경우: 0 = 정상 ; 6 = 최대 손상). 이들 검사는 수술 1일 전 (-1일차 또는 전일), 수술 후 1일 (1일차), 3일 (3일차), 7일 (7일차), 14일 (14일차), 21일 (21일차) 및 MCAO 후 28일 (28일차)에 수행되었다. (0일차 = MCAO의 일).

신체 스윙 검사. 래트는 그의 꼬리 밑 부분으로부터 대략 1인치 정도 고정되었다. 이어서 래트는 탁상 표면 위로 1인치로 올려졌다. 래트는 좌측 또는 우측으로 10˚ 이하로 정의된 수직축에 고정되었다. 래트가 그의 머리를 수직축에서 양측으로 움직일 때마다 스윙을 기록하였다. 다음 스윙을 계수하기 위해 래트가 수직 위치로 복귀되었어야 한다. 총 삼십 (30)회의 스윙이 계수되었다. 신체 스윙 검사는 선조체 기능의 대칭을 반영하다 (예를 들어, 문헌 [Borlongan et al. (1995) J Neurosci 15: 5372-5378] 참조). 정상적인 래트는 전형적으로 어느 쪽이든 같은 횟수의 스윙을 한다. 국소 허혈 후, 래트는 반대측 (좌측)으로 스윙하는 경향이 있다. 검사는 사지 배치 검사와 동시에 수행되었다. 본 검사는 선조체 기능의 대칭을 반영하며 (ref) 정상적인 래트는 전형적으로 어느 쪽이든 같은 횟수의 스윙을 한다. 국소 허혈 후, 래트는 반대측 (좌측)으로 스윙하는 경향이 있다.

뇌의 관류 및 수집. MCAO 후 이십팔일 (28일차)에, 래트를 케타민/크실라진 (각각 91 mg/kg 케타민, 9 mg/kg 크실라진)으로 깊이 마취하였다. 래트가 깊은 마취 단계에 들어간 후, 래트를 생리식염수 (헤파린 2 단위/mL 포함)에 이어서 4% 파라포름알데히드로 경심장 관류시켰다. 뇌를 제거하고 밤새 동안 4% 파라포름알데히드에 보관한 다음에 1xPBS로 바꾸고 0-4℃에서 보관하였다. 뇌 샘플은 조직학 및 면역형광 염색에 사용되어 뇌 경색 크기, 신경발생, 신생혈관형성, 및 GDF11 활성의 다양한 기타 마커를 평가할 것이다.

결과:

임상 관찰 및 생존. 이 연구에서 어떠한 사망도 관찰되지 않았다. 모든 동물은 정상으로 나타났다.

거동 검사 1 (앞다리 배치 검사). 앞다리 배치 검사의 결과는 도 1에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 3일차부터 16일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 14일차에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다 (p<0.05); 21일차에 대한 추세 (p=0.060). 7일차 또는 28일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

거동 검사 2 (뒷다리 배치 검사). 뒷다리 배치 검사의 결과는 도 2에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 3일차부터 16일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.001) 및 28일차 (p<0.01)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다. 3일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

거동 검사 3 (신체 스윙 검사). 신체 스윙 검사의 결과는 도 3에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 3일차부터 16일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은, 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.001) 및 28일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다. 3일차 또는 5일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

체중 변화 검사. 체중 검사 결과는 도 4에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 3일차부터 16일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 비히클-처리된 동물과 비교하여 유의한 체중 감소를 나타냈다 (p<0.001). rGDF11 처리된 동물의 체중은 수술 직후 그의 체중에 비해 수술 후 3일차에 7.03% 만큼 감소되었다. 그 후, rGDF11 처리된 동물은 비히클 처리된 동물에 필적하는 비율로 체중이 증가하였다.

결론. 성숙한 수컷 스프라그-다우리 래트에서 중대뇌 동맥 폐색 (MCAO)이 만들어져, 국소 일측성 뇌경색을 발생시켰다. 비히클 (1 ml/kg) 또는 rGDF11 (1 mg/kg, 1 ml/kg)을 i.p. MCAO 후 3일부터 16일까지 제공하였다. 감각운동 기능의 거동 평가: MCAO 이전, MCAO 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 사지 배치 검사를 수행하였다. 신체 스윙 검사는 사지 배치 검사와 동일한 일정으로 수행되었다. 본 실험 결과에 의해 볼 수 있듯이, 본 연구는 rGDF11 처리군에서 특히 신체 스윙, 뒷다리 배치, 및 앞다리 배치 검사에서, 졸중 후 감각운동 성능이 유의하게 증강되었음을 입증하였다. 이들 개선의 크기 및 내구성은 신체 스윙 및 뒷다리 배치 검사에서 가장 컸다. 게다가, rGDF11 처리된 동물의 경우 초기 체중 감소가 관찰되어, 수술 직후 그의 체중에 비해 수술 후 3일차에 7.03% 만큼 감소되었다. 그러나, 비히클 처리된 대조군에 비해 rGDF11 처리된 동물의 감소된 체중이 연구 지속기간 내내 유지되었긴 하지만, rGDF11 처리된 동물은 이후 비히클 처리된 동물에 필적하는 비율로 체중이 증가하였다.

실시예 2:

본 실시예의 목적은 래트 영구 중대뇌 동맥 폐색 모델 (pMCAO) 연구에서 폐색 후 1일에 시작하여 7일 동안 1일 1회 (QD) 투여되는 단일 용량의 rGDF11로 이루어진 GDF11 분자 투여 요법의 치료 효과를 평가하는 것이었다. 신체 운동 기능은 폐색 후 28일까지 측정되었다.

pMCAO 방법론 모델, 동물, 동물 준비는 실시예 1에 기재된 바와 동일하였다.

투약. MCA의 외과적 폐색 후 1일차에 시작하여 MCAO 후 7일차까지 매일 계속 투약하면서 동물에게 투여하였다. 동물은 1일 1회 비히클을 1 ml/kg 또는 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg (1 ml/kg)로 받았다.

체중, 혈액 수집, 기능적 거동 검사, 사지 배치, 신체 스윙 검사, 및 뇌의 관류 및 수집을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하거나 수행하였다.

결과:

거동 검사 1 (앞다리 배치 검사). 앞다리 배치 검사의 결과는 도 5에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 1일차에서 시작하여 7일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.0001), 및 30일차 (p<0.001)차에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다. 5일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

거동 검사 2 (뒷다리 배치 검사). 뒷다리 배치 검사의 결과는 도 6에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 1일차에서 시작하여 7일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.01), 7일차 (p<0.0001), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.0001), 및 30일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다.

거동 검사 3 (신체 스윙 검사). 신체 스윙 검사의 결과는 도 7에 도시되어 있다. 처리 시작 전 2개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 3일차에서 시작하여 7일까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 7일차 (p<0.05), 14일차 (p<0.001), 21일차 (p<0.001), 및 30일차 (p<0.01)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복을 나타냈다. 3일차 또는 5일차에 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

결론. 성숙한 수컷 스프라그-다우리 래트에서 중대뇌 동맥 폐색 (MCAO)이 만들어져, 국소 일측성 뇌경색을 발생시켰다. 비히클 (1 ml/kg) 또는 rGDF11 (1 mg/kg, 1 ml/kg)을 i.p. MCAO 후 1일에서 7일까지 제공하였다. 감각운동 기능의 거동 평가: MCAO 이전, MCAO 후 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 30일에 사지 배치 검사를 수행하였다. 신체 스윙 검사는 사지 배치 검사와 동일한 일정으로 수행되었다. 본 실험 결과에 의해 볼 수 있듯이, 본 연구는 rGDF11 처리군에서 특히 뒷다리 배치, 앞다리 배치, 및 신체 스윙 검사에서, 졸중 후 오래가는 감각운동 기능 개선을 입증하였다. 사지 배치 검사에서 유의한 개선이 2회 용량 후 관찰되었다. 감각운동 기능 개선이 폐색 후 적어도 30일 동안 유지되었다.

실시예 3 :

본 실시예의 목적은 래트 영구 중대뇌 동맥 폐색 모델 (pMCAO) 연구에서 폐색 후 일(1)일차부터 시작하여 1일 내지 7일의 다양한 지속기간 동안 (즉, 1일, 3일, 5일, 또는 7일 동안 치료하는) 투여되는 rGDF11의 1일 1회 용량으로 이루어진 GDF11 분자 투여 요법의 치료 효과를 평가하는 것이었다. 신체 운동 기능은 폐색 후 14일까지 측정하였다.

투약. MCA의 외과적 폐색 후 1일차에 시작하여 MCAO 후 1일, 3일, 5일, 또는 7일 동안 매일 계속 투약하면서 동물에게 투여하였다. 동물은 1일 1회 비히클을 1 ml/kg 또는 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg (1 ml/kg)로 받았다.

결과:

거동 검사 1 (앞다리 배치 검사). 1일, 3일, 5일, 및 7일 동안 rGDF11로 처리된 동물, 및 비히클로 처리된 동물에 대한 앞다리 배치 검사의 결과가 도 8에 도시되어 있다. 처리 시작 전 5개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 단지 1일차에 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으나, 5일차, 7일차, 또는 14일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 3일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.001), 7일차 (p<0.01), 및 14일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.01), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 및 14일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. rGDF11을 7일차까지 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 5일차 (p<0.01), 7일차 (p<0.01), 및 14일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 3일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

거동 검사 2 (뒷다리 배치 검사). 뒷다리 배치 검사의 결과는 도 9에 도시되어 있다. 처리 시작 전 5개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 단지 1일차에 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.05) 및 14일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 5일차 또는 7일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 3일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.05), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 및 14일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 및 14일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 3일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 7일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 및 14일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 3일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

거동 검사 3 (신체 스윙 검사). 신체 스윙 검사의 결과는 도 10에 도시되어 있다. 처리 시작 전 5개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 단지 1일차에 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001) 및 7일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 5일차 또는 14일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 3일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.0001), 및 7일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 14일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 5일차 (p<0.001), 7일차 (p<0.0001), 및 14일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 3일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 7일차까지 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 및 14일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다.

결론.

rGDF11 처리의 더 짧은 지속기간은 일시적인 결과를 산출하였으나 유의한 감각운동 기능 개선이 단 1일 또는 3일 동안 관찰되었다. 구체적으로, 폐색 후 1일에 단지 단일 용량 rGDF11 처리를 받은 군의 경우, 세 가지 평가 모두에 대해 3일차에 유의한 개선이 관찰되었고, 7일차에 신체 스윙 결과에서 유의한 개선이 관찰되었으며, 14일차에 뒷다리 배치 검사에서 유의한 개선이 관찰되었다. 5일 치료 요법은 7일 치료 요법보다 열등하지 않았다. 5일 및 7일의 치료 기간은 놀랍도록 오래가는 치료 효과를 나타냈다.

실시예 4 :

본 실시예의 목적은 rGDF11가 래트 영구 중대뇌 동맥 폐색 모델 (pMCAO) 연구에서 폐색 후 일(1)일차부터 시작하여 투여되는 투약 요법에서 다양한 용량 (0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 및 4.0 mg/kg) 동안 GDF11 분자 투여 요법의 치료 효과를 평가하는 것이었다. 신체 운동 기능은 폐색 후 28일까지 측정하였다.

pMCAO 방법론 모델, 동물, 동물 준비는 실시예 1에 기재된 것과 동일하였다.

투약. MCA의 외과적 폐색 후 1일차에 시작하여 MCAO 후 5일 동안 5가지 상이한 용량: 0.1, 0.5, 1, 2, 및 4 mg/kg으로 매일 계속 투약하면서 동물에게 투여하였다. 동물은 1일 1회 비히클을 1 ml/kg 또는 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg (1 ml/kg)로 받았다.

결과:

거동 검사 1 (앞다리 배치 검사). 0.1, 0.5, 1, 2, 및 4 mg/kg의 용량으로 처리된 동물, 및 비히클로 처리된 동물에 대한 앞다리 배치 검사의 결과는 도 11에 도시되어 있다. 처리 시작 전 6개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 0.1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.01), 5일차 (p<0.001), 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.05), 및 21일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타내며, 28일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 0.5 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.01), 및 14일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타내며, 21일차 또는 28일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 1.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.05), 21일차 ((p<0.01), 및 28일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 2.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.01), 21일차 ((p<0.001), 및 28일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 4.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.001), 5일차 (p<0.001), 7일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.01), 21일차 ((p<0.001), 및 28일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다.

거동 검사 2 (뒷다리 배치 검사). 0.1, 0.5, 1, 2, 및 4 mg/kg의 용량으로 처리된 동물, 및 비히클로 처리된 동물에 대한 뒷다리 배치 검사의 결과는 도 12에 도시되어 있다. 처리 시작 전 6개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 0.1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.01), 5일차 (p<0.0001), 및 7일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타내며, 14일차, 21일차, 또는 28일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 0.5 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 5일차 (p<0.0001), 및 7일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타내며, 14일차, 21일차, 또는 28일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 1.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 14일차 (p<0.01), 21일차 ((p<0.01), 및 28일차 (p<0.01)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 2.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 14일차 (p<0.001), 21일차 ((p<0.0001), 및 28일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 4.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.0001), 5일차 (p<0.0001), 7일차 (p<0.0001), 21일차 ((p<0.001), 및 28일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈으며, 14일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

거동 검사 3 (신체 스윙 검사). 신체 스윙 검사의 결과는 도 13에 도시되어 있다. 처리 시작 전 6개 군 간에 어떠한 차이도 없었다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 0.1 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.05), 5일차 (p<0.05), 및 14일차 (p<0.05)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 개선된 회복 시간을 나타내며, 7일차, 21일차, 및 28일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 0.5 mg/kg으로 받은 동물은 14일차 (p<0.01), 21일차 (p<0.05), 및 28일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 개선된 회복 시간을 나타내며, 3일차, 5일차, 또는 7일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 1.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.01), 5일차 (p<0.001), 14일차 (p<0.05), 21일차 ((p<0.01), 및 28일차 (p<0.001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타내며, 7일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 2.0 mg/kg으로 받은 동물은 3일차 (p<0.05), 5일차 (p<0.001), 7일차 (p<0.01), 14일차 (p<0.0001), 21일차 ((p<0.0001), 및 28일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타냈다. 5일차까지 rGDF11을 i.p. 4.0 mg/kg으로 받은 동물은 14일차 (p<0.01), 21일차 ((p<0.001), 및 28일차 (p<0.0001)에 비히클-처리된 동물과 비교하여 우수한 회복 시간을 나타내며, 3일차, 5일차, 또는 7일차에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

결론.

rGDF11 처리는 넓은 용량-범위에 걸쳐 감각운동 기능 회복을 개선하였다. 다양한 시점에서 모든 처리군에서의 효능이 0.1 - 4.0 mg/kg rGDF11의 용량 범위에서 매일 5일 처리로 관찰되었다. 특히, 0.1 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 용량을 투여한 동물에서, 7일 후 앞다리 및 뒷다리 개선이 관찰되지 않았거나 그 정도가 실질적으로 더 낮았다. 실험 마지막 날 (28일차)에 앞다리 배치 검사 또는 뒷다리 배치 검사에서 어떠한 통계적으로 유의한 개선이 없었다. 그러나, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 및 4.0 mg/kg rGDF11을 투여한 그러한 동물은 놀랍게도 28일차까지 앞다리 배치 검사 및 뒷다리 배치 검사에서 통계적으로 유의한 개선을 나타냈다. 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 및 4.0 mg/kg rGDF11의 용량을 사용한 동물은 더 낮은 0.1 mg/kg 및 0.5 mg/kg 용량과 비교하여 놀랍고 현저한 장기간 치료 효과를 나타냈다.

실시예 5:

본 실시예의 목적은 C57Bl6/j 마우스 모델에서 ICH-후 30분에 단일 용량의 rGDF11을 투여한 다음에 칠(7)일 동안 (q24 x 7) 매일 1회 투여하는 것으로 이루어진 GDF11 분자 투여 요법의 치료 효과를 평가하는 것이었다.

ICH 마우스 모델.

11주령 수컷 C57BL/6J 마우스 (잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory), 메인주 바하버)를 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 표준 아크릴 케이지에 12시간 명/암 주기로 수용하였다. 각각의 실험에서, 마우스는 손상 전에 처리군 또는 비히클 군으로 무작위화하였다.

동물을 맹검 은폐처리하였다. 모든 절차 및 평가는 맹검 방식으로 수행되었다.

선조체내 콜라게나제 주사를 사용하여 마우스에서 ICH를 유도하였다. 기관은 4.6% 이소플루란으로 마취 유도 후 삽관되었고, 폐는 30%/70% O2/N2 혼합물 중 1.5% 이소플루란으로 기계적으로 환기되었다. 직장 온도는 하체 물침대에서 따뜻한 물을 순환시켜 37℃ ± 0.2℃로 유지되었다. 동물의 머리는 정위 프레임에 고정되었다. 정중선 두피 절개가 이루어졌다. 두개골을 노출시킨 후 정수리점의 좌측 측면 2.2 mm에 버 구멍(burr hole)을 생성시키고 0.5 μL 주사기 바늘 (해밀턴(Hamilton), 미국 네바다주 리노)을 피질에서 3 mm 깊이까지 전진시켰다. 유형 IV-S 클로스트리디알 콜라게나제(Clostridial collagenase) (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트루이스)를 2분에 걸쳐 주입하였다 (0.4 μL 생리식염수 중 0.075 U). 절개를 봉합한 후, 동물은 발관되고 음식과 물에 자유롭게 접근하기 전에 자발적 환기로 회복되도록 허용되었다.

동물은 비히클 또는 rGDF11을, i.p. ICH 후 30분에 시작하여 7일 동안 매일 계속 받았다. 모든 검사 항목은 코드로 표지되었다. 거동 평가를 수행한 외과의와 연구원 둘 다 치료 배정에 대해 맹검이었다.

100 μl의 A (1.0 mg/kg rGDF11) 또는 B (비히클) 용액 복강내 (IP) 주사를 매일 ICH 후 30분에 그리고 이후 q24 x 7일에 투여하였다.

신경거동 평가. 동물을 비히클 (n = 22) 또는 (n = 22) rGDF11 군으로 무작위화하고, 사망률, NSS (신경중증도 점수), RR (로타로드 레이턴시), 처리 후 7일 평균 속도 (캣워크(CatWalk)), 및 처리 후 7일 앞다리 지지 베이스 (캣워크)에 대해 평가하였다.

신경중증도 점수. 동물은 자발적 활동, 대칭, 등반, 균형 및 협응, 신체 고유감각, 진동 감촉, 및 촉각 반응을 포함한 7가지 범주의 그의 거동을 기반으로 평가되었다. 자세한 채점 기준은 부록 A에 있다. NSS의 경우 21 = 정상, 3 = 사망. 이들 검사는 ICH 수술 전 (0일차), 및 ICH 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 및 28일(들)에 수행되었다. (1일차 = ICH의 당일).

로타로드 테스트. 자동 로타로드 (우고 바실레(Ugo Basile), 이탈리아 코메리오)를 사용하여 전정운동 기능에 대한 치료적 개입의 효과를 평가하였다. 손상 전날, 마우스는 60초 동안 분당 16회전의 설정 회전 속도로 2회 연속 컨디셔닝 시험을 거친 후에, 가속 회전 속도 (4-40)에서 3회 추가 시험을 거쳤다. 두 번째 시험 세트에서 회전 실린더에서 떨어지는 평균 시간 경과를 기준선 레이턴시로 기록하였다. 운동 결과를 평가하기 위해, 마우스는 손상 후 1-7일차, 14일차, 21일차, 및 28일차에 로타로드 테스트를 거쳤다. 매일, 마우스는 15분의 시험-간 간격으로 3회의 시험을 거쳤다. 막대에서 떨어지는 평균 레이턴시를 기록하였다.

모든 로타로드 테스트 전반에 걸쳐, 하기 상황 하에, 시도는 수동으로 종료되고 특정한 시도에 대해 종료까지의 레이턴시가 기록된다; 1) 마우스가 회전 로드에서에서 계속 달릴 수 없고 두 번의 연속 회전 동안 여전히 막대를 잡을 수 없다; 2) 회전 속도가 최고 속도인 40 rpm에 도달한 후 20초.

캣워크 분석. 캣워크 XT 시스템 (노둘러스 인포메이션 테크놀로지(Noldus Information Technology), 버지니아주 리스부르그)을 사용하여 자발적인 지상 이동의 미세한 특성을 수집하고 분석하였다. 마우스가 내부 조명 유리판을 통과할 때 마우스의 비디오 녹화를 통해 사지 모두의 조명된 발자국 감지가 발생하였다. 이 설정에서 바닥과의 발 접촉은 밝게 나타나며 한편 마우스의 신체는 어둡게 나타난다. 처리군에 대해 맹검 실험자가 모든 절차를 수행하였다. 마우스를 방과 시스템에 적응시킨 다음에, 기준선 데이터 수집 전에 지속적으로 통로를 건너도록 훈련하였다. 성공적인 달리기를 위해서는 멈추지 않고 냄새를 맡지 않고 통로를 가로지르는 지속적인 이동이 필요하였다. 발자국의 자동 표지화는 캣워크 XT 소프트웨어 (v10.6)를 사용하여 발생하였다. 잘못 표지된 발자국의 육안 검사 및 수동 수정이 발생하였다. 자동화된 보행 분석은 캣워크 XT 소프트웨어 (v10.6)를 사용하여 수행되었으며 하기음 관심 파라미터는 세 번의 성공적인 시행에 대해 평균을 내고 분석하였다: 평균 속도, 지지 베이스 (앞다리, 뒷다리), 케이던스, 규칙성 지수, 단일-팔다리 지지, 변화. 평균으로부터 2 표준 편차를 초과하는 이상점 점수는 분석으로부터 제외되었다 (군당 n=1). 군 간 비교는 독립적인 샘플 t-검정을 사용하여 손상 후 7일에 발생하였다.

ICH 연구를 위한 뇌/조직 수집과 관련하여, 손상 후 28일차에 동물을 희생시켰다.

통계 분석: 다중 콜모고로프-스미르노프 검정(Kolmogorov-Smirnov test) 또는 반복 측정을 통한 이원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 시간을 반복 변수로 하여 신경중증도 점수, 로타로드 레이턴시, 및 캣워크 분석을 비교하였다. 본페로니 교정(Bonferroni correction)은 ANOVA의 반복 측정 기법에 사용되었다. p 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 값은 평균 ± 표준 오차로 표현된다. 통계 분석은 SPSS를 사용하여 수행하였다.

사망률.

ICH 주사로 손상 후 24시간에 3마리 사망을 발생시켰다 (#9, 11, 14). 비히클 군은 24시간에 2마리 사망 (#10, 35), 6일차에 4마리 사망 (#26, 28, 29, 36), 10일차에 1마리 사망 (#34)을 발생시켰다.

* ICH를 가진 모든 동물은 손상 후 거동 결손을 가졌음

** 죽은 동물은 NSS에서 최소 3점 그리고 RR에서 0점을 받았음

도 14는 C57Bl6/j 마우스에 대한 A군 (rGDF11 처리군) 및 B군 (비히클 군)의 퍼센트 생존을 0일차 ICH-후 일수의 함수로서 도시한다. 생존 분석은 로그 순위 (프리즘(Prism) 7.0)를 사용하여 수행하였으며, p = 0.1893이다. A군은 손상 후 24시간 이내에 3마리 사망했으며, 이후 28일 동안 나머지 사망은 없었다. B군은 손상 후 24시간 이내에 2마리 사망했으며, 후속적으로 6일차에 4마리 그리고 10일차에 1마리가 사망하였다. B군은 생존이 감소하는 경향이 있었다.

도 15a는 죽은 동물을 포함하여, 주사 후 A군 및 B군 일수에 걸친 ICH-후 신경중증도 점수를 도시한다. 신경중증도 점수는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 14일, 21일, 28일차에 매일 평가되었다. 반복 측정을 가진 이원 분산 분석 (ANOVA)을 SPSS를 사용하여 수행하였으며, p=0.121이다. A군의 신경중증도 점수는 7일차, 14일차, 21일차, 및 28일차에 B군과 비교하여 측정가능한 개선을 나타냈다. 매일 독립적인 t-검정은 21일차 (p=0.048) 및 28일차 (0.019)에 통계적으로 독립적인 결과를 나타냈다.

도 15b는 A군의 경우 n=19이고 B군의 경우 n=15인 죽은 동물을 제외하고, 주사 후 A군 및 B군의 ICH-후 일수에 걸친 신경중증도 점수를 도시한다. 보페로니 교정으로 반복 측정을 가진 이원 분산 분석 (ANOVA)을 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. A군의 신경중증도 점수는 5일차, 7일차, 14일차, 21일차, 및 28일차에 B군과 비교하여 측정가능한 개선을 나타냈다. 이원 ANOVA는 21일차 (p=0.006) 및 28일차 (p=0.008)에서 통계적으로 독립적인 결과를 나타냈다.

도 16a는 죽은 동물을 포함하는 A군 및 B군에 대한 ICH-후 손상 일수의 함수로서 로타로드 레이턴시의 플롯을 도시한다. 로그 순위 (프리즘 7.0)을 사용하여 생존 분석을 수행하였으며, p = 0.1893이다. 일일 로타로드 시험을 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 및 28일차에 수행하였다. 반복 측정을 가진 이원 ANOVA는 SPSS를 사용하여 수행하였으며, p = 0.024이다. 4일차에서 시작하여, A군은 로타로드 레이턴시를 개선했으며 이는 28일까지 계속되었다. 14일차 및 28일차에 B군은 A군 (양측 ANOVA 0.024)과 비교하여 로타로드 레이턴시가 통계적으로 유의하게 (p<0.05) 감소되었다. 6일차, 7일차, 14일차, 21일차, 및 28일차에, A군의 로타로드 레이턴시는 손상-전 로타로드 레이턴시의 통계적 오차 범위 내에 있었다. B군은 14일에 걸쳐 손상-전 로타로드 레이턴시 수준으로 개선되지 않았다. 21일차, 및 28일차에, B군의 로타로드 레이턴시는 손상-전 로타로드 레이턴시의 통계적 오차 범위 내에 있었다.

도 16b는 죽은 동물을 제외한 A군 및 B군에 대한 ICH-후 손상 일수의 함수로서 로타로드 레이턴시의 플롯을 도시한다. 일일 로타로드 시험을 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 및 28일차에 수행하였다. 다중 콜모고로프-스미르노프 검정 또는 교정과 함께 이원 ANOVA을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 4일차에 시작하여, A군은 로타로드 레이턴시가 개선되었고 이는 28일까지 계속되었다. 7일, 14일 및 28일차에, B군 (비히클) A군과 비교하여 로타로드 레이턴시가 통계적으로 유의하게 (p<0.05) 감소한 것으로 나타났다 (GDF11). 6일차, 7일차, 14일차, 21일차, 및 28일차에, A군의 로타로드 레이턴시는 통계적 오차 범위 내에 있거나 손상-전 로타로드 레이턴시보다 컸다. B군은 14일 후 손상-전 로타로드 레이턴시 수준의 통계적 오차 이내로 개선되었다.

0일차, 2일차 및 7일차에 A군 및 B군의 마우스에 대해 캣워크 평가를 수행하였다. 캣워크 검사는 모든 군에 대한 평균 속도 및 앞다리 지지 베이스를 측정하였다.

도 17a 및 17b는 B군과 비교한 A군의 운동 성능을 도시한다. 도 17a는 1차 치료 후 칠(7)일 후 초당 센티미터 단위의 평균 속도를 나타낸다. 도 17b는 비히클 군 (B군)과 비교하여 rGDF11 투여 군 (A군)에 대한 앞다리 지지 베이스를 도시한다.

군 간의 체계적 차이는 치료 배정의 함수 관계로서 나타냈다. B군은 비생존 경향을 나타냈다. 21일차 및 28일차에, B군에서 NSS의 유의한 (p<0.05) 감소가 있었다 (양측 ANOVA 0.121). 7일, 14일, 21일, 28일차에 B군에서 로타로드의 유의한 (p<0.05) 감소가 있었다 (양측 ANOVA 0.024). 캣워크 분석을 사용하여, B군에서 평균 보행 속도에서 유의한 감소가 있었다 (p=0.043). B군은 B군에서의 평균 보행속도에서 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다 (p=0.043). B군은 또한 앞다리 지지 베이스가 통계적으로 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (p=0.015).

실시예 6 :

이 실시예의 목적은 치료 후 24일 동안 졸중 회복에 대해 상이한 용량으로 5일 GDF 11 치료의 신경발생을 평가하는 것이었다. 신경발생은 Sox2 다능성 신경 줄기 세포 마커를 사용하여 측정되었다.

투약. MCA의 외과적 폐색 후 1일차에 시작하여 5일 동안 5가지 상이한 용량: MCAO 후 1, 2, 및 4 mg/kg으로 매일 계속 투약하면서 동물에게 투여하였다. 동물은 1일 1회 비히클을 1 ml/kg 또는 rGDF11을 i.p. 1 mg/kg (1 ml/kg)로 받았다.

영상화: 래트를 PBS에 이어서 4% PFA로 경심 관류시켰다. 뇌를 추출하고, PBS로 세척한 다음에 20% 수크로스로 동결보존하였다. 동결보존 후, 뇌는 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 매립하여 -20℃에서 보관되었다.

라이카(Leica) 저온 유지 장치를 사용하여 자유 부동 50 μm 섹션을 수집하였다. 6마리 래트로부터의 섹션을 공간적으로 일치시키고 면역형광 염색을 위해 준비하였다. 항원 검색은 90℃에서 10분 동안 1x 시트레이트 완충제 (pH 6.0)를 사용하여 수행되었다. 이어서 뇌 절편을 PBS로 세척하고 실온에서 차단 완충제 (1x PBS, 0.5% 트리톤(Triton) X-100, 및 10% 정상 당나귀 혈청)에서 1시간 동안 차단하였다. 샘플을 1차 항체와 함께 인큐베이션하기 전에 세척 완충제 (1x PBS 0.5% 트리톤 X-100)로 세척하였다. 1차 항체 (SOX2에 대한 토끼 폴리클로날, 압캠(Abcam); ab97959)를 항체 희석 완충제 (1x PBS, 1% BSA, 및 0.5% 트리톤 X-100)에 1:200으로 희석하고 부드럽게 교반하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체 인큐베이션 후, 절편을 세척 완충제로 3회 세척하고 항체 희석 완충제에 1:2000으로 희석된 2차 항체 (당나귀 항-토끼 IgG 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488, 인비트로겐(Invitrogen); A-21206)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 2차 항체를 제거하고, PBS에서 핵 염색 시약인 300 nM의 DAPI (인비트로겐; D3571)와 함께 섹션을 10분 동안 인큐베이션한 후 세척 완충제로 3회 세척하였다. 이어서 슬라이드 섹션을 현미경 슬라이드에 놓고 탑재 매체를 추가하기 전에 건조되도록 하고 커버슬립과 매니큐어로 밀봉하였다.

올림푸스(Olympus) VS120에서 20X 배율로 이미지 획득을 수행하고 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어로 분석하였다. 이미지 분석은 사용자-맹검 방식으로 수행되었으며 경색된 반구로부터의 관심 영역을 크로핑하여 졸중에 가장 가까운 심실 구역 (VZ)을 단리하였다. 반대측 반구의 이미지는 경색되지 않은 반구의 VZ에 있는 유사한 영역으로부터 취해졌다. 졸중으로 인해 완전한 VZ를 유지하지 못한 경우 섹션을 분석으로부터 제거하였다. 이미지제이의 입자 분석 도구를 사용하여 각각의 이미지에 대한 Sox2 양성 세포의 수를 정량화하고 통계 분석을 위해 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 독립표본 t 검정 (계획된 비교)을 수행하였다.

결과:

도 18a - 18d는 손상 후 29일에 희생된 동물의 손상 부위에 대해 동측인 뇌실하 구역에서 전구 세포의 보충을 나타내는 일련의 영상을 도시한다. 상이한 투여량을 측정하였다: 도 18a (비히클), 도 18b (1 mg/kg), 도 18c (2 mg/kg), 및 도 18d (4 mg/kg). 단지 관찰로부터, 스캔은 1 mg/kg, 2 mg/kg, 및 4 mg/kg rGDF11 투여에서 실질적으로 증가된 Sox 2 양성 세포를 나타낸다.

도 19는 도 18a - d의 데이터의 분석을 도시한다. 데이터는 독립표본 t 검정 * p-값<0.05를 사용하여 통계적으로 평균 +/- S.E.M.으로 나타냈다. GDF11의 1 mg/kg 용량, 2 mg/kg 용량, 및 4 mg/kg 용량은 각각 Sox 2 양성 세포의 수에서 통계적으로 유의한 증가를 나타낸다. 신경발생의 통계적으로 유의한 증가는 rGDF11 투여 마우스에 대한 개선된 거동 검사에 상응한다. 총체적으로, 데이터는 손상 부위에 대해 동측인 뇌실하 구역에서 전구 세포의 보충을 나타낸다.

도 20a - 20d는 손상 후 29일에 희생된 동물의 손상 부위에 대해 반대측인 뇌실하 구역에서 전구 세포의 보충을 도시한다. 상이한 투여량을 측정하였다: 도 20a (비히클), 도 20b (1 mg/kg), 도 20c (2 mg/kg), 및 도 20d (4 mg/kg). 단지 관찰로부터, 스캔은 1 mg/kg, 2 mg/kg, 및 4 mg/kg rGDF11 투여에서 실질적으로 증가된 Sox 2 양성 세포를 나타낸다.

도 21은 도 20a - d의 데이터의 분석을 도시한다. 데이터는 독립표본 t 검정 * p-값<0.05, # p-값<0.1을 사용하여 통계적으로 평균 +/- S.E.M.으로 나타냈다. 1 mg/kg 용량 및 2 mg/kg 용량은 각각 통계적으로 유의한 (p<0.05) 것으로 나타났다. 4 mg/kg 용량의 GDF11은 각각의 투여 군에 대한 Sox 2 양성 세포의 수에서 p<0.10을 가졌다. 통계적으로 유의한 증가는 rGDF11 투여 마우스에 대한 개선된 거동 검사에 상응한다. 총체적으로, 데이터는 손상 부위에 대해 반대측인 뇌실하 구역에서 전구 세포의 보충을 나타낸다.

도 22는 손상 부위에 대해 동측 반구와 반대측 반구를 비교하는 분석을 도시한다. 데이터는 독립표본 t 검정 * p-값<0.05, # p-값<0.1을 사용하여 통계적으로 평균 +/- S.E.M.으로 나타냈다. 데이터는 GDF11이 반대측 반구보다 경색된 동측 반구의 SVZ에서 전구 세포의 재생에 더 큰 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> ELEVIAN, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING STROKE <130> P390100WO01-121163-003 <140> PCT/US2021/033241 <141> 2021-05-19 <150> 63/026,809 <151> 2020-05-19 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 35 40 45 Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105

Claims

대상체에서 졸중 사건 후 12시간 내지 72시간 이내에 치료 유효량의 성장 분화 인자 11 (GDF11) 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 졸중을 치료하는 방법으로서, 여기서 GDF11 분자가 2일 내지 약 14일의 치료 기간에 걸쳐 하루에 대상체의 체중에 비해 적어도 최소한의 고용량의 GDF11의 양으로 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, GDF11 분자의 투여가 졸중 사건 후 12시간 내지 24시간 이내에 개시되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, GDF11 분자의 투여가 2일 내지 4일의 치료 기간에 걸쳐 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자가 대상체에게 1일 1회 (QD) 기준으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자가 대상체에게 간헐적 일자에 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자가 GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태인 방법.
제6항에 있어서, GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태가 동종이량체를 형성하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열과 적어도 91% 서열 상동성을 가진 폴리펩티드인 방법.
제8항에 있어서, GDF11 분자가 재조합 인간 GDF11 (rhGDF11)인 방법.
제8항에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 변이체인 방법.
제8항에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 유도체인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 변이체 또는 유도체 GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, GDF11 분자가 아미노산 유사체를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, GDF11 분자가 변형된 GDF11 폴리펩티드인 방법.
제14항에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 인산화, 당화, 글리코실화, PEG화, HES화, ELP화, 지질화, 아세틸화, 아미드화, 말단-캡핑되거나, 시아노 기, 알부민을 포함하거나, 또는 고리화되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 제1 GDF11 분자 모이어티 및 제2 모이어티를 포함하는 키메라 폴리펩티드인 방법.
제16항에 있어서, 제2 모이어티가 트랜스페린, 성장 호르몬 또는 Fc 단편으로부터 유래되는 것인 방법.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 천연 GDF11 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자가 대상체에게 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물의 형태로 투여되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 제약 조성물이 주사용수를 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 제약 조성물이 대상체에게 정맥내 주사를 통해 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자의 투약이 투여 기간의 1일차에 초기 최소한의 고용량으로부터 투여 기간의 마지막 날에 더 높은 용량으로 상향 적정되는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자의 투약이 초기 고용량으로부터 투여 기간의 마지막 날에 최종 최소한의 고용량으로 하향 적정되는 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량의 GDF11 분자를 대상체에게 2차 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 2차 투여가 초기 투여 완료 후 2일 내지 7일 후에 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 치료가 대상체에서 개선된 신체 운동 또는 인지 기능을 특징으로 하는 것인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 졸중 사건이 허혈성인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 졸중 사건이 출혈성인 방법.
대상체에서 졸중을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 치료 유효량의 성장 분화 인자 11 (GDF11) 분자를 포함하는 조성물로서, 상기 방법은 대상체에서 졸중 사건 후 12시간 내지 72시간 이내에 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 개시하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 GDF11 분자를 하루에 대상체의 체중에 비해 적어도 최소한의 고용량의 GDF11의 양으로 포함하고 조성물이 대상체에게 1일 내지 약 14일의 치료 기간에 걸쳐 투여되는 것인 조성물.
제28항에 있어서, GDF11 분자가 GDF11 분자의 성숙한 형태인 조성물.
제29항에 있어서, GDF11 폴리펩티드의 성숙한 형태가 동종이량체를 형성하는 것인 조성물.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열과 적어도 91% 서열 상동성을 가진 폴리펩티드인 조성물.
제31항에 있어서, GDF11 분자가 재조합 인간 GDF11 (rhGDF11)인 조성물.
제31항에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 변이체인 조성물.
제31항에 있어서, GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 치료 활성 유도체인 조성물.
제33항 또는 제34항에 있어서, 변이체 또는 유도체 GDF11 분자가 인간 GDF11 분자의 천연 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 것인 조성물.
제31항에 있어서, GDF11 분자가 아미노산 유사체를 포함하는 것인 조성물.
제31항에 있어서, GDF11 분자가 변형된 GDF11 폴리펩티드인 조성물.
제37항에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 인산화, 당화, 글리코실화, PEG화, HES화, ELP화, 지질화, 아세틸화, 아미드화, 말단-캡핑되거나, 시아노 기, 알부민을 포함하거나, 또는 고리화되는 것인 조성물.
제37항에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 제1 GDF11 분자 모이어티 및 제2 모이어티를 포함하는 키메라 폴리펩티드인 조성물.
제39항에 있어서, 제2 모이어티가 트랜스페린, 성장 호르몬 또는 Fc 단편으로부터 유래되는 것인 조성물.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GDF11 폴리펩티드가 천연 GDF11 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖는 것인 조성물.
제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함하는 조성물.
제42항에 있어서, 제약 조성물이 주사용수를 포함하는 것인 조성물.
제42항 또는 제43항에 있어서, 대상체에게 정맥내 주사를 통해 투여하기 위해 제제화되는 조성물.
제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 허혈성 졸중을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 조성물.
제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 출혈성 졸중을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 조성물.