KR20230041128A - Novel Biomarker for Diagnosing or Predicting Prognosis of Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A and Uses Thereof - Google Patents
Novel Biomarker for Diagnosing or Predicting Prognosis of Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A and Uses Thereof Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은 신규한 샤르코-마리-투스병 제1A형 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel biomarker for diagnosing Charcot-Marie-Tooth disease type 1A or predicting prognosis and use thereof.
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease, 이하 CMT) 또는 유전운동감각신경병(hereditary motor and sensory neuropathy, HMSN)은 유전적 및 임상적으로 이질성을 갖는 주요 유전성 말초신경병증 질환 중 하나로, 손과 발의 말초신경 발달에 관여하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 유전성 질병으로서, 발병 유형에 따라 신경 수초 이상과 관련이 있는 제1형, 축삭돌기 이상과 관련이 있는 제2형, 그리고 제1형과 제2형이 복합적으로 나타나는 제3형과 제4형, X 염색체와 관련된 X형으로 분류될 수 있다.Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) or hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN) is one of the major hereditary peripheral neuropathy diseases with genetic and clinical heterogeneity. It is a hereditary disease caused by mutations in genes involved in the development of peripheral nerves in the hands and feet. Depending on the type of onset,
CMT의 발생빈도는 2500 명당 한 명으로 유전되는 희귀질환 가운데 높은 빈도를 보인다. 현재까지 유전적 원인으로 밝혀진 유전자는 100여 종에 이르며, 원인 유전자에 따라 세부 아형이 나눠진다. The incidence of CMT is 1 in 2500, showing the highest frequency among inherited rare diseases. So far, about 100 genes have been identified as genetic causes, and detailed subtypes are divided according to the causative gene.
이중 전체 CMT의 40%를 차지하며 가장 빈번하게 관찰되는 아형인 CMT1A는, 대부분의 CMT 원인유전자가 점돌연변이에 의해 발생하는데 비해, 말초 미엘린(myelin) 단백질 22 kDa을 암호화하는 PMP22(Peripheral myelin protein 22)의 중복으로 인해 발병된다.Of these, CMT1A, which accounts for 40% of all CMT and is the most frequently observed subtype, is PMP22 (Peripheral myelin protein 22, which encodes 22 kDa of myelin protein), whereas most CMT causative genes are caused by point mutations. ) is caused by duplication of
PMP22 유전자의 중복은 PMP22 단백질의 과발현을 유도하고, 슈반세포(Schwann cell)에서의 이러한 PMP22 단백질의 과발현은 ER 스트레스 또는 세포사멸을 통해 말초 신경의 탈수초화를 일으켜서 환자의 말초신경 기능저하 및 퇴행을 유발하게 된다.Duplication of the PMP22 gene induces overexpression of the PMP22 protein, and overexpression of the PMP22 protein in Schwann cells causes demyelination of peripheral nerves through ER stress or apoptosis, leading to peripheral nerve dysfunction and degeneration in patients. it causes
그러나, 아직까지 정확하고 효율적인 유전성 신경 질환의 진단 방법 개발은 미흡한 실정이며, 또한, CMT1A 질환의 임상적 표현형과 발병 연령은 매우 이질적이며 확진을 위한 신경 조직검사 (nerve biopsy)도 용이하지 않으므로 정확한 진단과 치료를 어렵게 한다.However, the development of accurate and efficient diagnostic methods for genetic neurological diseases is still insufficient, and the clinical phenotype and age of onset of CMT1A disease are very heterogeneous, and it is not easy to perform a nerve biopsy to confirm the diagnosis. and difficult to treat.
이에 따라, 유전적으로 매우 이질적인 특성을 가진 CMT1A의 맞춤 치료를 위한 정확한 유전적 진단법의 확립이 요구되고 있다.Accordingly, there is a need to establish an accurate genetic diagnosis method for personalized treatment of CMT1A, which has genetically very heterogeneous characteristics.
이러한 상황하에서, 본 발명자들은 CMT1A의 진단을 위한 신규한 바이오마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 CMT1A 환자의 비복신경(sural nerve)을 염색했을 때, 다른 CMT 아형 (CMT2, CMT4) 환자의 비복신경에서와 달리, 슈반세포 내 Nodal 단백질의 과발현을 발견하였고, 이를 바이오마커로 이용하여 다른 유형들로부터 CMT1A 유형만을 정확하게 선별하여 진단 또는 예측할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors intensively researched to develop a novel biomarker for the diagnosis of CMT1A. As a result, when the present inventors stained the sural nerve of CMT1A patients, unlike the sural nerves of patients with other CMT subtypes (CMT2, CMT4), they found overexpression of Nodal protein in Schwann cells, which was used as a biomarker. The present invention was completed by confirming that diagnosis or prediction can be made by accurately selecting only the CMT1A type from other types using .
따라서, 본 발명의 일 목적은, Nodal을 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, one object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosis or prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), including Nodal.
또한, 본 발명의 다른 목적은, Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosis or prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), including an agent for measuring the expression level of Nodal.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing or predicting prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), including an agent for measuring the expression level of Nodal.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 생체외에서 CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information on the diagnosis or prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) in vitro.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, Nodal을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) comprising an inhibitor that inhibits Nodal as an active ingredient.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, Nodal을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다. In addition, another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) containing an inhibitor that inhibits Nodal as an active ingredient.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a screening method for a CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) therapeutic agent.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used herein are used for descriptive purposes only and should not be construed as limiting. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, terms such as "include" or "have" are intended to designate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification, but one or more other features It should be understood that the presence or addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof is not precluded.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by a person of ordinary skill in the art to which the embodiment belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and unless explicitly defined in the present application, they should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning. don't
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Nodal을 포함하는, 샤르코-마리-투스 질환 1A 형(Charcot-Marie-Tooth disease 1A, 이하, CMT1A)의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing or predicting prognosis of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (hereinafter referred to as CMT1A), including Nodal.
용어 "마커(marker)"는, 생물학적 현상의 존재와 정량적으로 또는 정성적으로 관련된 분자를 의미한다. 이러한 "마커"의 예에는, 상기 현상의 기본이 되는 기작에 직접적으로 또는 간접적으로 관련이 있는 유전자 또는 유전자 단편, RNA 또는 RNA 단편과 같은 폴리뉴클레오타이드; 또는 펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편과 같은 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 산물; 또는 상기 산물에 의한, 관련된 대사산물, 또는 항체 또는 항체 단편과 같은 기타의 동정 분자가 있다. 본 발명의 마커에는 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, GenBank 서열), 특히 전장 서열, 임의의 코딩 서열, 임의의 단편, 또는 이의 상보체, 및 상기 정의된 바와 같은 이의 임의의 측정가능한 마커가 포함된다.The term “marker” means a molecule that is quantitatively or qualitatively related to the presence of a biological phenomenon. Examples of such "markers" include polynucleotides such as genes or gene fragments, RNA or RNA fragments directly or indirectly related to the mechanism underlying the phenomenon; or a gene product comprising a polypeptide such as a peptide, oligopeptide, protein or protein fragment; or other identification molecules, such as by, related metabolites of, or antibodies or antibody fragments. A marker of the present invention includes a nucleotide sequence described herein (eg, a GenBank sequence), particularly a full-length sequence, any coding sequence, any fragment, or complement thereof, and any measurable marker thereof as defined above. is included
본 발명의 바이오마커로서 "Nodal"은, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 Nodal 유전자 또는 이의 단백질을 이용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 NCBI accession no. NM_018055.5, NM_013611.5 및 NM_001106394.1을 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.As the biomarker of the present invention, "Nodal" can use any Nodal gene or protein thereof, as long as the object of the present invention can be achieved, and in one embodiment of the present invention, NCBI accession no. NM_018055.5, NM_013611.5 and NM_001106394.1 were used, but are not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 상기 "CMT1A의 진단"은, CMT1A의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미할 수 있고, "진단 마커(diagnosis marker)"는 상기 CMT1A의 발병 여부 또는 발병 가능성을 진단할 수 있는 물질을 의미할 수 있다.As used herein, the term "diagnosis" means to confirm the presence or characteristics of a pathological state, and the "diagnosis of CMT1A" may mean to confirm whether or not there is an onset of CMT1A, or to predict the risk of onset, , "diagnosis marker" may refer to a substance capable of diagnosing whether or not the CMT1A is onset or onset.
본 발명자들은, Nodal이 CMT 제2형 및 CMT 제4형에 비해, CMT1A 환자의 비복신경(sural nerve) 내 슈반세포(Schwann cells)에서 수준이 증가되며, 상기 Nodal이 CMT1A의 주요 증상인 슈반세포의 탈수초화(demyelination)를 유도하고, 슈반세포의 Krox20, Oct6, MBP 및 MPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 발현 수준을 감소시킨다는 것을 최초로 발견하였다.The present inventors found that the level of Nodal is increased in Schwann cells in the sural nerve of CMT1A patients compared to
이에, 본 발명은, 슈반세포의 탈수초화를 유도하는 Nodal의 발현 수준을 진단 마커로서 이용하여, 다른 CMT의 아형과 구별된, CMT1A만을 효과적으로 진단할 수 있다는 데 특징이 있다.Accordingly, the present invention is characterized in that it is possible to effectively diagnose only CMT1A, which is distinguished from other subtypes of CMT, by using the expression level of Nodal, which induces demyelination of Schwann cells, as a diagnostic marker.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정할 수 있다. 유의성 있는 진단 마커란 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고, 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미할 수 있다. 상기 진단 마커로서 Nodal은 CMT1A 환자에서만 검출이 되고, 대조군(다른 CMT 아형 환자 및/또는 정상인)에서는 검출될 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 따라서, 상기 Nodal의 존재 여부를 검출하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.The selection and application of significant diagnostic markers can determine the reliability of diagnostic results. Significant diagnostic markers may refer to markers that have high validity because the results obtained through diagnosis are accurate and have high reliability so as to show consistent results even during repeated measurements. As the diagnostic marker, Nodal is a highly reliable marker that is detected only in CMT1A patients and has little probability of being detected in the control group (patients with other CMT subtypes and/or normal subjects). Therefore, the diagnosis result based on the result obtained by detecting the presence or absence of the Nodal can be reasonably reliable.
본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과가 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있는 데, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.As used herein, the term "prediction of prognosis" refers to the act of predicting the course and outcome of a disease in advance. More specifically, prognosis prediction refers to all activities that predict the course of a disease after treatment by comprehensively considering the patient's condition, as the course of a disease after treatment may vary depending on the patient's physiological or environmental state. can be interpreted
본 발명에서 "예후"는, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명의 목적상, 예후란 CMT1A 치료 후 해당 개체에서 치료 성공 여부, 생존, 재발, 전이, 약물반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 즉, 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.In the present invention, "prognosis" means prediction of disease progression and recovery, and refers to prospect or preliminary evaluation. For the purpose of the present invention, prognosis means determining whether or not treatment success, survival, recurrence, metastasis, drug response, tolerance, etc. in a subject after CMT1A treatment. That is, it means the prediction of medical outcome (eg, long-term viability, disease-free survival rate, etc.), and includes a positive prognosis (positive prognosis) or a negative prognosis (negative prognosis), and the negative prognosis is recurrence, drug resistance, etc. A positive prognosis includes disease progression or mortality, and a positive prognosis includes remission of the disease, such as a disease-free state, and improvement or stabilization of the disease.
따라서, 본 발명에 있어서, 예후 예측은 환자의 치료 후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 환자로부터 CMT1A이 재발하거나 또는 CMT1A 로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.Therefore, in the present invention, prognosis prediction can be interpreted as an act of predicting the disease-free survival rate or survival rate of a patient by predicting in advance the course of the disease and whether or not it is completely cured after treatment of the patient. For example, predicting "good prognosis" means that the patient's disease-free survival rate or survival rate after treatment is high and the patient is likely to be cured, and predicting "poor prognosis" means that the patient's disease-free survival rate or survival rate is high after treatment. The disease-free survival rate or survival rate is low, which means that there is a high possibility of CMT1A recurrence or death due to CMT1A from the patient.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing or predicting prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), including an agent for measuring the expression level of Nodal.
본 발명의 목적상, CMT1A 진단이란 해당 질환의 발병 여부를 확인하는 것으로 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 Nodal 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재(과발현) 또는 부재를 측정함으로써 상기 유전자의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.For the purpose of the present invention, CMT1A diagnosis is to determine whether or not the disease is caused by measuring the presence (overexpression) or absence of the Nodal polypeptide of the present invention and a polynucleotide encoding it in a biological sample or tissue sample, thereby determining the expression and expression of the gene. It means confirming the presence or characteristics of a related disease.
본 발명의 Nodal이 과다 발현된 상태를 표현하기 위해 사용된 용어 "과발현(overexpression)"은 적합한 발현 분석법을 통해 Nodal의 발현 수준을 측정한 경우에 있어서, 비교 대상의 Nodal 발현 수준에 비하여 2 배 이상인 것을 의미하고, 상기 비교 대상은 샤르코마리투스 질환의 아형인 CMT 제2형 및 CMT 제4형이 바람직하다.The term "overexpression" used to express a state in which Nodal is overexpressed in the present invention refers to an expression level that is twice or more than the Nodal expression level of a comparison target when the Nodal expression level is measured through a suitable expression analysis method. That means, the comparison target is preferably
따라서, 본 발명의 진단 마커는 비교 대상의 세포 또는 조직에 비하여, CMT1A에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내며; 본 발명의 해당 예후 예측 마커는 CMT1A 발병 이후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 높은 수준의 발현을 나타낸다.Thus, the diagnostic markers of the present invention show a specific high level of expression in CMT1A compared to cells or tissues of comparison; The corresponding prognostic marker of the present invention shows a high level of expression compared to cells of cells or tissues that serve as standards for predicting patients with good or poor prognosis after CMT1A onset.
상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 Nodal mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브 (probe) 및 안티센스 (anti-sense) 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 한정되는 것은 아니다.The agent for measuring the expression level of Nodal may be at least one selected from the group consisting of a primer, a probe, and an anti-sense nucleotide that specifically binds to the Nodal mRNA, but of the present invention As long as the purpose can be achieved, it is not limited thereto.
상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 Nodal 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 한정되는 것은 아니다.Agents for measuring the expression level of Nodal include oligopeptides, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, ligands, PNA (peptide nucleic acid) and aptamers that specifically bind to the Nodal protein. It may be one or more selected from the group consisting of (aptamer), but is not limited thereto as long as it can achieve the object of the present invention.
본 발명에서 상기 Nodal의 발현 수준은, "Nodal mRNA 발현 수준 측정"을 포함하고, 이는 CMT1A를 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 Nodal 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the expression level of Nodal includes "Measurement of Nodal mRNA expression level", which is a process of confirming the presence and expression level of the Nodal marker gene mRNA in a biological sample in order to diagnose or predict CMT1A prognosis, It can be determined by measuring the amount of mRNA. Analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting blotting), DNA chips, etc., but are not limited thereto.
본 발명에서 상기 Nodal의 발현 수준은, "Nodal 단백질 발현 수준 측정"을 포함하고, 이는 CMT1A를 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 Nodal 마커 유전자에서 발현된 Nodal 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the expression level of Nodal includes "Measurement of Nodal protein expression level", which measures the presence and expression level of Nodal protein expressed in the Nodal marker gene in a biological sample in order to diagnose CMT1A or predict prognosis. As an identification process, the amount of the protein is confirmed using an antibody that specifically binds to the protein of the gene. Analysis methods for this include Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis , tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, etc., but are not limited thereto.
바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 Nodal 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)이며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다.Preferably, the agent for measuring the mRNA level is a primer pair, probe, or anti-sense nucleotide for the Nodal polynucleotide or a fragment thereof of the present invention, and the polynucleotide sequence of the present invention This allows one skilled in the art to easily design primers, probes, or antisense nucleotide sequences.
본 발명에서 용어, "프라이머 (primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 Nodal 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 CMT1A를 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 하여 적절하게 변형할 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3'-hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template, and copying a template strand. refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for A primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature. In the present invention, PCR amplification is performed using sense and antisense primers of Nodal polynucleotide, and CMT1A can be diagnosed or prognosticated through whether a desired product is produced. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately modified based on those known in the art.
본 발명에서 용어, "프로브 (probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 (labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.In the present invention, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases to several hundreds of bases as short as possible to achieve specific binding to mRNA, and is labeled. Thus, the presence or absence of a specific mRNA can be confirmed. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
본 발명에서는, 본 발명의 Nodal 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 CMT1A의 발병 여부를 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, by performing hybridization using the Nodal polynucleotide of the present invention and a complementary probe, diagnosis or prognosis of CMT1A can be predicted through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more homologues of a natural nucleotide, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phossotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.) or to charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
상기 프라이머 또는 프로브는 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 하이브리드화 방법은 본 발명의 Nodal 폴리뉴클레오티드에 상기 프라이머 또는 프로브를 노출 또는 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게 이들 서열은, 비특이적 결합을 최소화 하도록 적절히 조절된 조건에서 혼성화 되며, 예를 들면 약 80% 내지 90%의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은, 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 42℃에서 밤새 (overnight) 혼성화시키고, 0.1 Υ SSC, 0.1% SDS 내, 55℃에서 최종 세척하는 것을 포함한다. 또한 약 90% 이상의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 65℃에서 밤새 혼성화시키고, 0.1 Υ SSC, 0.1% SDS 내, 60℃에서 최종 세척하는 것을 포함할 수 있다.The primer or probe preferably contains 8 or more nucleotides, and the hybridization method can be achieved by exposing or contacting the primer or probe with the Nodal polynucleotide of the present invention. Preferably, these sequences are hybridized under appropriately controlled conditions to minimize non-specific binding, for example, suitable conditions for detection of about 80% to 90% identical sequences are 0.25M Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 6.5 % SDS in 10% dextran sulfate, overnight at 42°C, followed by a final wash in 0.1Υ SSC, 0.1% SDS at 55°C. Also suitable conditions for the detection of at least about 90% identical sequences are hybridization overnight at 65°C in 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% dextran sulfate, and 60°C in 0.1 Υ SSC, 0.1% SDS. may include a final wash in
본 발명의 Nodal 단백질(이하 'Nodal 폴리펩티드'와 혼용) 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. 본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 Nodal 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 Nodal 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체를 포함한다.An agent for measuring the level of Nodal protein (hereinafter referred to as 'Nodal polypeptide') of the present invention is preferably an antibody. As used herein, the term "antibody" is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purpose of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to Nodal polypeptide, which is the marker of the present invention, and such an antibody is encoded by the marker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. Obtain a protein to be, and can be prepared from the obtained protein by a conventional method. This includes partial peptides that can be made from the protein, and the partial peptides of the present invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, and more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or any antibody having antigen-binding properties is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies. Antibodies to the Nodal protein of the present invention include all antibodies that can be produced by methods known in the art.
본 발명의 CMT1A 진단 또는 예후 예측 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.Antibodies used for the detection of CMT1A diagnostic or prognostic markers of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), including an agent for measuring the expression level of Nodal.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.The kit may be a RT-PCR kit, a microarray chip kit, or a protein chip kit.
본 발명의 키트는 CMT1A 진단 또는 예후 예측 마커인 Nodal 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 CMT1A의 진단 또는 예후 예측 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 항원 결합능을 유지하는 이의 단편뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다. The kit of the present invention can detect the marker by checking the expression level of the Nodal polypeptide, which is a CMT1A diagnostic or prognostic marker, or a polynucleotide encoding the same. The kit of the present invention includes primers, probes, and optionally marker-recognizing antibodies or fragments thereof that maintain antigen-binding ability, as well as primers and probes for measuring the expression level of CMT1A diagnostic or prognostic markers, as well as those suitable for the polypeptide or polynucleotide analysis method One or more other component compositions or devices may be included.
예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 정량 검출을 위한 진단 또는 예후 예측용 키트는 Nodal 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 1 종 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, Nodal의 뉴클레오티드 또는 일부 서열에 대응하는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 발현 수준을 측정하기 위해 상기 "mRNA 발현 수준 측정"과 관련하여 기술된 분석 방법을 이용한 키트를 이용할 수 있다.For example, the diagnostic or prognostic kit for quantitatively detecting a polynucleotide or gene of the present invention may include one or more oligonucleotides that specifically bind to a polynucleotide encoding a Nodal polypeptide, including Nodal nucleotides or A kit that may include primers corresponding to some sequences, reverse transcriptase, Taq polymerase, primers for PCR, and dNTPs, and which uses the analysis method described in connection with "measurement of mRNA expression level" above to measure the polynucleotide expression level. is available.
또한, 본 발명의 키트는 Nodal 단백질의 수준을 측정하는 CMT1A 진단 또는 예후 예측용 키트이고, 본 발명의 Nodal 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 단백질 수준을 측정하는 키트는 "단백질 발현 수준 측정"을 위해 사용되는 상기 기술된 방법을 이용한 키트를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 ELISA 키트 또는 단백질칩 키트일 수 있다.In addition, the kit of the present invention is a kit for diagnosing or predicting prognosis of CMT1A by measuring the level of Nodal protein, and may include an antibody specifically binding to Nodal protein of the present invention. In addition, kits for measuring protein levels may be used without limitation kits using the above-described method used for "measuring protein expression levels", and may preferably be ELISA kits or protein chip kits.
항체를 이용한 단백질 발현 여부 측정은 Nodal 단백질 및 그의 항체 간의 항원-항체 복합체를 형성함으로써 측정되며, 다양한 방법에 의해 상기 복합체의 형성량을 측정함으로써 정량적으로 검출할 수 있게 된다.Protein expression using an antibody is measured by forming an antigen-antibody complex between Nodal protein and its antibody, and can be quantitatively detected by measuring the amount of formation of the complex by various methods.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 CMT1A의 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적인 측정이 가능하다.In the present invention, the term antigen-antibody complex means a combination of a marker protein of CMT1A and an antibody specific thereto, and the amount of formation of the antigen-antibody complex can be quantitatively measured through the size of the signal of the detection label. do.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.In addition, the kit of the present invention is an antibody that specifically binds to a marker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a label that develops color by reaction with the substrate, a color-developing substrate solution that will react with the label, a washing solution, and It may contain an enzyme reaction stop solution, etc., and may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing reagent components to be used.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생체외에서 CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for providing information on the diagnosis or prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) ex vivo comprising the following steps:
(a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 Nodal의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(a) measuring the expression level of Nodal in a biological sample isolated from the subject; and
(b) 상기 시료 내 측정된 Nodal의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계.(b) comparing the expression level of Nodal measured in the sample with a control group.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 유전자 또는 단백질의 발현이 검출될 수 있는 대상 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.The term "biological sample" as used herein refers to any sample obtained from a subject in which the expression of the gene or protein of the present invention can be detected.
바람직하게는, 상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 복수, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.Preferably, the biological sample may be at least one selected from the group consisting of saliva, biopsy, blood, serum, plasma, lymph, cerebrospinal fluid, ascites, skin tissue, liquid culture, feces and urine, , It is not particularly limited thereto, and may be prepared by treatment by a method commonly used in the technical field of the present invention.
본 발명의 방법은, 대조군에서의 Nodal 발현 수준을 CMT 개체의 발현 수준과 비교함으로써 CMT1A 의심 개체의 실제 CMT1A 질환 발병 여부를 진단할 수 있다. In the method of the present invention, by comparing the expression level of Nodal in the control group with the expression level of the CMT individual, it is possible to diagnose whether or not the CMT1A suspected individual actually has CMT1A disease.
즉, (c) 상기 시료 내 측정된 Nodal의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 CMT1A인 것으로 진단하는 단계를 추가적으로 포함한다.That is, (c) further comprising the step of diagnosing that the subject is CMT1A when it is confirmed that the expression level of Nodal measured in the sample is higher than that of the control group.
또한, 본 발명의 목적상 상기 예후 예측은 CMT1A 환자의 치료 후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 CMT1A 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 해당 치료 후 암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 CMT1A 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, CMT1A 환자로부터 CMT1A이 재발하거나 또는 이로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.In addition, for the purpose of the present invention, the prediction of prognosis may be interpreted as an act of predicting the disease-free survival rate or survival rate of a CMT1A patient by predicting in advance the course of the disease and whether or not it is completely cured after treatment of the CMT1A patient. For example, predicting "a good prognosis" means that the disease-free survival rate or survival rate of a cancer patient after the treatment is high, so that the cancer patient is likely to be treated, and predicting "a poor prognosis" means that the cancer patient has a high probability of being treated. Since the disease-free survival rate or survival rate of CMT1A patients after radiation therapy is low, it means that there is a high possibility that CMT1A will recur or die from CMT1A patients.
구체적으로, CMT1A으로 추정되는 시료 또는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 시료 또는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 비교 시료의 것보다 본 발명의 마커의 발현 수준이 해당 CMT1A으로 추정되는 시료 유래에서 더 높은 수준으로 발현되면 해당 CMT1A으로 추정되는 시료를 CMT1A으로 진단 또는 예후를 예측할 수 있는 것이다.Specifically, after measuring the expression level of the marker of the present invention from a sample or cell presumed to be CMT1A, measuring the expression level of the marker of the present invention from the sample or cell, comparing both, If the expression level of the marker is expressed at a higher level in the sample derived from the corresponding CMT1A, the sample estimated to be the CMT1A can be diagnosed or predicted as CMT1A.
상기 비교 대조군은 샤르코마리투스 질환의 아형인 CMT 제2형(이하, CMT2) 및 CMT 제4형(이하, CMT4)이다.The comparative control groups were CMT type 2 (hereinafter referred to as CMT2) and CMT type 4 (hereinafter referred to as CMT4), which are subtypes of Charcomaritus disease.
용어, "대상"은 CMT1A의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 포유동물일 수 있으며, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.The term "subject" refers to an individual whose risk of developing CMT1A is determined or predicted. The subject may be a vertebrate, specifically mammals, amphibians, reptiles, birds, etc., and more specifically mammals, for example, may be humans (Homo sapiens).
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nodal을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) comprising an inhibitor that inhibits Nodal as an active ingredient.
상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, Nodal의 단백질에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.The inhibitor is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme (ribozyme), DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, proteins of Nodal It may be at least one selected from the group consisting of a compound that directly binds to inhibit its activity and a natural extract.
본 발명에 있어서, 상기 억제제는 Nodal의 뉴클레오티드의 발현 또는 Nodal 단백질의 활성을 억제하는 것을 모두 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the inhibitors may include those that inhibit the expression of Nodal nucleotides or the activity of Nodal proteins, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서, Nodal의 뉴클레오티드의 발현을 억제하는 억제제는, Nodal의 mRNA에 대한 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the inhibitor for inhibiting the expression of Nodal nucleotides is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNA ( peptide nucleic acids) and at least one selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, but is not limited thereto.
본 발명의 용어 "siRNA (small interfering RNA)"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서 (Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. The term "small interfering RNA (siRNA)" of the present invention refers to a small nucleic acid molecule of about 20 nucleotides in size that can mediate RNA interference or gene silencing, and when siRNA is introduced into cells, Dicer ) is recognized by the protein and degrades the gene encoding the target polypeptide, eventually inhibiting the expression of the gene.
본 발명의 용어 "shRNA (short hairpin RNA)"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA)를 의미한다.The term "short hairpin RNA (shRNA)" of the present invention refers to a short hairpin RNA in which sense and antisense sequences of a siRNA target sequence are interposed with a loop consisting of 5 to 9 bases interposed therebetween.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 작은 사이즈를 가지는 올리고머 분자이다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.The term "aptamer" of the present invention refers to a small RNA fragment, and is an oligomeric molecule having a small size of about 20 to 60 nt. Depending on the sequence, it may have various three-dimensional structures and may have high affinity with a specific substance, so that it may react with a target sequence and effectively inhibit it.
본 발명의 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 Nodal 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머이다.The term "antisense" as used herein refers to a group of nucleotide bases in which an antisense oligomer hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, allowing the formation of, typically mRNA and RNA:oligomeric heteroduplexes, within the target sequence. Refers to an oligomer having a backbone between sequences and subunits. Oligomers may have exact sequence complementarity or near complementarity to the target sequence. These antisense oligomers can block or inhibit translation of mRNA and alter the processing of mRNA to produce splice variants of mRNA. Thus, the antisense oligomer of the present invention is an antisense oligomer that is complementary to a polynucleotide encoding a Nodal polypeptide.
또한, 본 발명에 있어서, Nodal 단백질의 발현을 억제하는 억제제는, Nodal에 대한 항체, 앱타머, Nodal의 단백질에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the present invention, the inhibitor for inhibiting the expression of Nodal protein is at least one selected from the group consisting of an antibody against Nodal, an aptamer, a compound that directly binds to and inhibits the activity of Nodal protein, and a natural extract. This includes, but is not limited to.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, etc. can be administered.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.The suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, A ordinarily skilled physician can readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis. According to one embodiment of the present invention, the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-1000 mg/kg.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. or it may be prepared by incorporating into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersing agent or stabilizer.
따라서, 본 발명의 Nodal이 과발현된 CMT1A의 치료 효과는 슈반세포의 탈수초화 억제에 의하여 달성되는 것일 수 있다. 본 발명의 Nodal 발현 및 활성 억제용 조성물은 슈반세포의 탈수초화를 감소시켜서, 궁극적으로 CMT1A를 치료할 수 있을 것으로 기대된다.Therefore, the therapeutic effect of Nodal-overexpressed CMT1A of the present invention may be achieved by inhibiting Schwann cell demyelination. The composition for inhibiting Nodal expression and activity of the present invention is expected to be able to ultimately treat CMT1A by reducing demyelination of Schwann cells.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Nodal을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A)의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a food composition for preventing or improving CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) comprising an inhibitor that inhibits Nodal as an active ingredient.
상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, Nodal의 단백질에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.The inhibitor is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme (ribozyme), DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, proteins of Nodal It may be at least one selected from the group consisting of a compound that directly binds to inhibit its activity and a natural extract.
본 발명의 조성물은 해당 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명에서, "건강기능식품"이란, CMT1A의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야한다.The composition of the present invention may be added to health functional food for the purpose of preventing or improving the disease. In the present invention, "health functional food" refers to food having bioregulatory functions such as prevention and improvement of CMT1A, biodefense, immunity, and recovery after illness, and should be harmless to the human body when taken for a long time.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.When the composition of the present invention is used as a food additive, the composition may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods. The mixing amount of active ingredients may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, the composition of the present invention is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw material during production of food or beverage. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, it may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the type of food. Examples of foods to which the substance can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, chewing gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health foods in a conventional sense.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1g 이다.The health beverage composition of the present invention may include various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages. The aforementioned natural carbohydrates may include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame. The proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 10 g, preferably about 0.01 to 0.1 g per 100 ml of the composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages; and the like. In addition, the composition of the present invention may include fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 part by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides a screening method for a CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) therapeutic agent comprising the following steps:
(a) 대상 세포에 CMT1A 치료제 후보물질을 처리하는 단계;(a) processing a target cell with a CMT1A therapeutic candidate;
(b) 상기 (a) 단계의 세포에서 Nodal의 발현 수준을 측정하는 단계; 및(b) measuring the expression level of Nodal in the cells of step (a); and
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 세포에서의 Nodal의 발현 수준이 CMT1A 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 경우 CMT1A 치료제로 판단하는 단계.(c) determining that the cell is a CMT1A therapeutic if the expression level of Nodal in the cells measured in step (b) is reduced compared to the control group not treated with the CMT1A therapeutic candidate.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "후보물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 시험물질을 의미한다. 상기 후보물질은 예를 들어, 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질, 항체 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "candidate" used while referring to the screening method of the present invention refers to an unknown test substance used in screening to examine whether or not it affects the expression level of a gene or affects the expression or activity of a protein. do. The candidate substances include, for example, compounds, nucleotides, proteins, antibodies, and natural product extracts, but are not limited thereto.
상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 분석법은 상기 Nodal mRNA를 검출하기 위한 것으로, 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The assay for measuring the expression level of Nodal is for detecting the Nodal mRNA, with reverse transcription polymerase reaction, competitive reverse transcription polymerase reaction, real-time reverse transcription polymerase reaction, RNase protection assay (RPA), Northern blotting and DNA chip It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 분석법은 상기 Nodal 단백질을 검출하기 위한 것으로, 웨스턴 블랏팅, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay), ELLA (enzyme-linked lectin assay), 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The assay method for measuring the expression level of Nodal is for detecting the Nodal protein, Western blotting, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay), ELLA (enzyme-linked lectin assay), radiation immunoassay, radiation immunodiffusion, Ouktero It may be at least one selected from the group consisting of Outterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, and protein chip, but is not limited thereto.
본 발명의 CMT1A 치료제 스크리닝 방법은 후보 물질의 처리에 의해 Nodal 발현이 증가되는 경우, 상기 후보 물질을 CMT1A을 촉진시키는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보 물질에 의해 Nodal 발현이 감소하는 경우, 처리된 후보 물질이 CMT1A 치료제로 사용될 수 있을 것으로 판단할 수 있게 된다. 이러한 스크리닝 방법에 있어서, 그 활성 측정은 Nodal 발현 수준에 따라 용이하게 판단될 수 있다.In the CMT1A therapeutic screening method of the present invention, when Nodal expression is increased by treatment of a candidate substance, the candidate substance can be determined as a substance that promotes CMT1A. In addition, when Nodal expression is reduced by the candidate material, it can be determined that the treated candidate material can be used as a CMT1A therapeutic agent. In this screening method, the activity measurement can be easily judged according to the Nodal expression level.
본 발명의 방법은 상술한 Nodal 유전자의 발현 수준을 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method of the present invention uses the expression level of the above-described Nodal gene, the description of duplicated information is omitted to avoid excessive complexity in the present specification.
본 발명의 Nodal을 CMT1A 진단 또는 예후 예측용 마커로 이용하는 경우, 높은 특이도로, 샤르코-마리-투스병1 A형에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 진단 또는 예후 예측을 가능하게 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료 효과를 극대화할 수 있어 CMT1A으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있다.When Nodal of the present invention is used as a marker for CMT1A diagnosis or prognosis, it enables accurate diagnosis or prognosis prediction through genetic testing for Charcot-Marie-Tooth disease type 1 A with high specificity, and accordingly, recently developed and There is an advantage that can greatly contribute to the reduction of mortality due to CMT1A by maximizing the treatment effect by early application of the available treatment method.
도 1은 CMT의 아형별 환자들에서의 비복신경(sural nerve) 내 Nodal 단백질 발현 수준을 보여준다.
도 2a 및 2b는 각 CMT1A 마우스 모델들에서의 좌골신경(sciatic nerve) 내 Nodal 단백질 발현 수준을 보여준다.
도 3은 랫트 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 인간 PMP22를 과발현시켰을 때 Nodal 유전자의 mRNA 발현 수준을 보여준다.
도 4a는 랫트 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 Nodal 단백질을 처리했을 때 수초화(demyelination) 마커인 Krox20의 mRNA 발현 수준을 보여준다. 도 4b는 랫트 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 Nodal 단백질을 처리했을 때 수초화(demyelination) 마커인 Oct6의 mRNA 발현 수준을 보여준다. 도 4c는 랫트 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 Nodal 단백질을 처리했을 때 수초화(demyelination) 마커인 MBP의 mRNA 발현 수준을 보여준다. 도 4d는 랫트 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 Nodal 단백질을 처리했을 때 수초화(demyelination) 마커인 MPZ의 mRNA 발현 수준을 보여준다.Figure 1 shows the Nodal protein expression level in the sural nerve in patients with each subtype of CMT.
2a and 2b show the expression level of Nodal protein in the sciatic nerve in each of the CMT1A mouse models.
Figure 3 shows the mRNA expression level of the Nodal gene when human PMP22 was overexpressed in the rat Schwann cell line RT4-D6P2T.
Figure 4a shows the mRNA expression level of Krox20, a myelination marker, when the rat Schwann cell line RT4-D6P2T was treated with Nodal protein. Figure 4b shows the mRNA expression level of Oct6, a myelination marker, when the rat Schwann cell line, RT4-D6P2T, was treated with Nodal protein. Figure 4c shows the mRNA expression level of MBP, a myelination marker, when the rat Schwann cell line RT4-D6P2T was treated with Nodal protein. Figure 4d shows the mRNA expression level of MPZ, a myelination marker, when the rat Schwann cell line, RT4-D6P2T, was treated with Nodal protein.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the examples are only for explaining the present invention in more detail, and those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention It will be self-evident for
실시예 1. CMT1A 환자에서의 Nodal 수준 분석Example 1. Nodal level analysis in CMT1A patients
본 발명자들은, CMT1A을 진단할 수 있는 신규한 바이오 마커로서 Nodal을 선정하고, 면역 화학염색을 통해 각 CMT 아형 환자군의 비복신경(sural nerve)에서의 Nodal(NM_018055.5, human; NM_013611.5, mouse; NM_001106394.1, rat)의 발현 수준을 분석하였다.The present inventors selected Nodal as a novel biomarker capable of diagnosing CMT1A and, through immunochemical staining, in the sural nerve of each CMT subtype patient group, Nodal (NM_018055.5, human; NM_013611.5, mouse; NM_001106394.1, rat) expression levels were analyzed.
환자군 정보는 하기 표 1에 나타내었다. Patient group information is shown in Table 1 below.
CMT; Charcot-Marie-Tooth diseaseCMTX; X-linked Charcot-Marie-Tooth diseaseCMT; Charcot-Marie-Tooth diseaseCMTX; X-linked Charcot-Marie-Tooth disease
CIDP; chronic inflammatory demyelinating polyneuropathyCIDP; chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
간략하게는, 다음과 같다: 다양한 CMT 아형별 환자들 (CMT1A, CMT2, CMT4, CMTX 및 CIDP)의 비복신경(sural nerve) 검체를 파라핀으로 고정하였다. 상기 검체에 Nodal (Santa Cruz Biotechnology)과 S-100 (Abcam) 단백질에 특이적인 일차 항체를 결합시키고, 각각 Alexa Fluor 488 (녹색 형광)-컨쥬게이티드 이차 항체(S-100) 및 Cy3(적색 형광)-컨쥬게이티드 이차 항체(Nodal)를 처리한 후 공초점 현미경(Confocal microscopy)으로 형광염색을 관찰하였다.Briefly, as follows: Sural nerve specimens from patients of various CMT subtypes (CMT1A, CMT2, CMT4, CMTX and CIDP) were paraffin-fixed. Nodal (Santa Cruz Biotechnology) and S-100 (Abcam) protein-specific primary antibodies were bound to the sample, and Alexa Fluor 488 (green fluorescence)-conjugated secondary antibody (S-100) and Cy3 (red fluorescence) were respectively After treatment with )-conjugated secondary antibody (Nodal), fluorescence staining was observed by confocal microscopy.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, CMT1A 환자의 비복신경(sural nerve)을 염색했을 때, CMT1A 환자의 슈반세포에서만 Nodal 단백질의 발현 증가가 관찰된 반면, 다른 CMT 아형인 CMT2 및 CMT4 환자에서는 관찰되지 않았다.As a result, as shown in FIG. 1, when the sural nerve of CMT1A patients was stained, an increase in Nodal protein expression was observed only in Schwann cells of CMT1A patients, whereas it was observed in other CMT subtypes, CMT2 and CMT4 patients. It didn't work.
또한, Nodal 단백질은 슈반세포의 마커인 S-100과 병합되어 관찰된 반면, 다른 아형 (CMT2와 CMT4)의 환자들에서는 거의 관찰되지 않거나 슈반세포와는 무관한 위치에서 발현되는 것이 관찰되었다.In addition, Nodal protein was observed in combination with Schwann cell marker S-100, whereas it was rarely observed in patients with other subtypes (CMT2 and CMT4) or was expressed at a location unrelated to Schwann cells.
따라서, 대상체로부터 분리된 시료 내 Nodal 수준을 측정하는 것이 다른 아형 그룹과 비교하여 높은 민감도 및 특이도로 CMT1A 검출에 효과적이라는 것을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that measuring the level of Nodal in a sample isolated from a subject is effective in detecting CMT1A with high sensitivity and specificity compared to other subtype groups.
실시예 2. CMT1A 동물 모델에서의 Nodal 수준 분석Example 2. Nodal level analysis in CMT1A animal model
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 확인한 바와 같이 Nodal이 CMT1A의 발병 여부를 판단하는 데 중요한 지표로 적용할 수 있음을 입증하기 위해, CMT1A의 마우스 모델인 C22 마우스 [Tg(PMP22)C22Clh, 인간 PMP22 유전자 7 copy가 삽입된 마우스 모델] 및 C3 마우스 [B6.Cg-Tg(PMP22)C3Fbas/J, 인간 PMP22 유전자 4 copy가 삽입된 마우스 모델]의 좌골신경(sciatic nerve)에서의 Nodal 수준을 확인하였다.As confirmed in Example 1, the present inventors, in order to prove that Nodal can be applied as an important indicator for determining the onset of CMT1A, C22 mouse [Tg(PMP22)C22Clh, human PMP22 gene, a mouse model of CMT1A, 7 copy inserted mouse model] and C3 mouse [B6.Cg-Tg(PMP22)C3Fbas/J, human PMP22 gene 4 copy inserted mouse model] Nodal level in the sciatic nerve was confirmed.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, C22 마우스 [Tg(PMP22)C22Clh, 인간 PMP22 유전자 7 copy가 삽입된 마우스 모델]로부터 분리한 좌골 신경 조직의 동결절편(frozen section)에, Nodal (Santa Cruz Biotechnology) 및 S100 (Abcam) 단백질에 각각 특이적인 일차 항체(antibody)와 결합시키고, 각각 Alexa Fluor 488 (녹색 형광)-컨쥬게이티드 이차 항체(S100) 및 Cy3(적색 형광)-컨쥬게이티드 이차 항체(Nodal)를 처리한 후 공초점 현미경(Confocal microscopy)으로 형광염색을 관찰하여 분석했을 때, 정상 마우스의 좌골 신경에 비해, C22 마우스에서 Nodal 단백질의 발현량 증가가 관찰되었다.As a result, as shown in FIG. 2a, frozen sections of sciatic nerve tissue isolated from C22 mice [Tg(PMP22)C22Clh, a mouse model with human PMP22 gene 7 copy inserted], Nodal (Santa Cruz Biotechnology ) and S100 (Abcam) proteins, respectively, and Alexa Fluor 488 (green fluorescence)-conjugated secondary antibody (S100) and Cy3 (red fluorescence)-conjugated secondary antibody ( Nodal), when fluorescence staining was observed and analyzed by confocal microscopy, an increase in the expression of Nodal protein was observed in C22 mice compared to the sciatic nerve of normal mice.
또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, C3 마우스 [B6.Cg-Tg(PMP22)C3Fbas/J, 인간 PMP22 유전자 4 copy가 삽입된 마우스 모델]의 좌골 신경 조직의 동결절편(frozen section)에, Nodal (Santa Cruz Biotechnology) 및 S100 (Abcam) 단백질에 각각 특이적인 일차 항체(antibody)와 결합시키고, 각각 Alexa Fluor 488 (녹색 형광)-컨쥬게이티드 이차 항체(S100) 및 Cy3(적색 형광)-컨쥬게이티드 이차 항체(Nodal)를 처리한 후 공초점 현미경(Confocal microscopy)으로 형광염색을 관찰하여 분석했을 때, 정상 마우스의 경우 Nodal 단백질은 거의 발현되지 않거나, 슈반세포와는 무관한 위치에서 일부 발현된 반면, C3 마우스의 경우, 좌골신경에서만 발현되었다. In addition, as shown in FIG. 2B, in a frozen section of sciatic nerve tissue of a C3 mouse [B6.Cg-Tg(PMP22)C3Fbas/J, a mouse model with human PMP22 gene 4 copy inserted], Nodal ( Santa Cruz Biotechnology) and S100 (Abcam) proteins, respectively, respectively, Alexa Fluor 488 (green fluorescence)-conjugated secondary antibody (S100) and Cy3 (red fluorescence)-conjugated When fluorescence staining was observed and analyzed by confocal microscopy after treatment with a secondary antibody (Nodal), in the case of normal mice, Nodal protein was hardly expressed or partially expressed at a location unrelated to Schwann cells, whereas , in C3 mice, it was expressed only in the sciatic nerve.
또한, CMT1A 마우스 모두에서 Nodal 단백질은 슈반세포 마커인 S100 단백질과 같이 병합되어 관찰되었다.In addition, in all CMT1A mice, Nodal protein was observed to be merged with Schwann cell marker S100 protein.
실시예 3.Example 3. CMT1A-유발 세포주에서의 Nodal 의 확인Identification of Nodal in CMT1A-induced cell lines
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 확인한 바와 같이 Nodal이 CMT1A의 발병 여부를 판단하는 데 중요한 지표로 적용할 수 있음을 입증하기 위해, 랫트의 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 인간 PMP22를 과발현시켜 제작한 세포주에서의 Nodal 수준을 확인하였다.As confirmed in Example 1, the present inventors, in order to demonstrate that Nodal can be applied as an important indicator for determining the onset of CMT1A, a cell line prepared by overexpressing human PMP22 in RT4-D6P2T, a rat Schwann cell line Nodal levels were confirmed.
간략하게는 다음과 같다:Briefly:
인간 PMP22 유전자(NM_000304.4)의 과발현을 유도하기 위해, lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 이용하여, 랫트의 슈반세포주인 RT4-D6P2T에, pCMV-Myc-PMP22 플라스미드 각 0.5, 1, 1.5μg을 트랜스펙션시키고, 48 시간 후 세포를 수확하여 mRNA를 추출하였다. 상기 추출된 mRNA를 reverse transcriptase를 처리하여 cDNA를 합성하였다. 이를 real-time PCR의 주형(template)으로 사용하고, β-actin을 internal control로 이용하여 Nodal 유전자의 mRNA의 상대적인 발현량을 측정하였다.To induce overexpression of the human PMP22 gene (NM_000304.4), using lipofectamine 3000 (Invitrogen), the rat Schwann cell line RT4-D6P2T was transfected with 0.5, 1, and 1.5 μg of pCMV-Myc-PMP22 plasmid, respectively. After 48 hours, cells were harvested and mRNA was extracted. The extracted mRNA was treated with reverse transcriptase to synthesize cDNA. Using this as a template for real-time PCR, and using β-actin as an internal control, the relative expression level of mRNA of the Nodal gene was measured.
이때, 대조군으로서, RT4-D6P2T에 pCMV-Myc 플라스미드를 트랜스펙션시켜 이용하였다.At this time, as a control, RT4-D6P2T was transfected with pCMV-Myc plasmid and used.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 PMP22 유전자를 과발현시킨 슈반세포에서 농도 의존적으로 Nodal 유전자의 mRNA 발현량이 유의하게 증가한 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the mRNA expression level of the Nodal gene was significantly increased in a concentration-dependent manner in Schwann cells overexpressing the PMP22 gene compared to the control group.
또한, 본 발명자들은, Nodal 단백질의 발현 증가가 슈반세포에서 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 랫트 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 Nodal 단백질 처리 후 CMT1A의 주요 증상인 탈수초화(demyelination) 수준을 확인하였다.In addition, in order to confirm the effect of the increase in expression of Nodal protein in Schwann cells, the present inventors confirmed the level of demyelination, which is a major symptom of CMT1A, after treatment with Nodal protein in RT4-D6P2T, a rat Schwann cell line.
간략하게는, 랫트의 슈반세포주인 RT4-D6P2T에 Nodal 단백질 (100 ng/ml, 200 ng/ml)을 처리하고, 48 시간 후 세포를 수확하여 mRNA를 추출하였다. 상기 추출된 mRNA를 reverse transcriptase를 처리하여 cDNA를 합성하고, 이를 real-time PCR의 주형(template)으로 사용하였다. Real-time PCR에서 β-actin을 internal control로 이용하고, 수초화 마커로서, 수초화 유전자의 전사인자인 Krox20와 Oct6 및 주요 수초단백질인 MBP와 MPZ mRNA의 상대적인 발현량을 측정하였다.Briefly, Nodal protein (100 ng/ml, 200 ng/ml) was treated with RT4-D6P2T, a rat Schwann cell line, and 48 hours later, the cells were harvested and mRNA was extracted. The extracted mRNA was treated with reverse transcriptase to synthesize cDNA, which was used as a template for real-time PCR. In real-time PCR, β-actin was used as an internal control, and as myelination markers, the relative expression levels of Krox20 and Oct6, which are transcription factors for myelination genes, and MBP and MPZ mRNA, which are major myelin proteins, were measured.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해, 100 ng/ml과 200 ng/ml의 Nodal 단백질을 처리한 슈반세포에서 수초화 마커들의 mRNA 발현량이 유의하게 감소하였고, 이는 Nodal 단백질에 의해 슈반세포의 탈수초화가 유도 및 진행된다는 것을 입증한다.As a result, as shown in FIG. 4, compared to the control group, the mRNA expression level of myelination markers was significantly reduced in Schwann cells treated with 100 ng/ml and 200 ng/ml Nodal protein, which was It is demonstrated that demyelination is induced and progresses.
따라서, Nodal 단백질은 단순 바이오마커가 아니라 병리기전의 핵심 단백질임을 의미하며, 이를 타겟팅하여 억제하는 경우, CMT1A에 대한 치료제로 적용할 수 있음을 유추할 수 있다.Therefore, it can be inferred that Nodal protein is not a simple biomarker, but a key protein of pathology, and can be applied as a therapeutic agent for CMT1A when it is targeted and inhibited.
결론적으로, 본 실시예에 따른 결과들을 종합하면, CMT1A에 있어 Nodal 수준은 다른 CMT 아형 및 정상에 비해 매우 높게 나타나며, Nodal은 슈반세포의 탈수초화에 영향을 미치는 인자이므로, Nodal은 다른 아형들과 명확하게 구별할 수 있는 CMT1A 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커로서 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현할 수 있다.In conclusion, taking together the results according to this example, the level of Nodal in CMT1A is very high compared to other CMT subtypes and normal, and since Nodal is a factor that affects the demyelination of Schwann cells, Nodal is As a biomarker for CMT1A diagnosis and prognosis prediction that can be clearly distinguished, customized diagnosis and treatment for each patient can be realized.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific parts of the present invention in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (20)
A biomarker composition for diagnosis or prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), including Nodal.
상기 Nodal은 슈반세포(Schwann cells)의 탈수초화(demyelination)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 1,
The composition, characterized in that Nodal induces demyelination of Schwann cells.
상기 Nodal은 슈반세포의 Krox20, Oct6, MBP 및 MPZ로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 발현 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 1,
The composition characterized in that Nodal reduces the expression level of one or more species selected from the group consisting of Krox20, Oct6, MBP and MPZ of Schwann cells.
A biomarker composition for diagnosis or prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), comprising an agent for measuring the expression level of Nodal.
상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 Nodal mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브 (probe) 및 안티센스 (anti-sense) 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 4,
Characterized in that the agent for measuring the expression level of Nodal is at least one selected from the group consisting of a primer, a probe, and an anti-sense nucleotide that specifically binds to the Nodal mRNA, composition .
상기 Nodal의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 Nodal 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 4,
Agents for measuring the expression level of Nodal include oligopeptides, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, ligands, PNA (peptide nucleic acid) and aptamers that specifically bind to the Nodal protein. Characterized in that at least one selected from the group consisting of (aptamer), the composition.
A kit for diagnosing or predicting prognosis of CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A), comprising an agent for measuring the expression level of Nodal.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 키트.
According to claim 7,
Characterized in that the kit is an RT-PCR kit, a microarray chip kit or a protein chip kit.
(a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 Nodal의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 시료 내 측정된 Nodal의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계.
A method for providing information about the diagnosis or prognosis of Charcot-Marie-Tooth disease 1A (CMT1A) ex vivo comprising the following steps:
(a) measuring the expression level of Nodal in a biological sample isolated from the subject; and
(b) comparing the expression level of Nodal measured in the sample with a control group.
(c) 상기 시료 내 측정된 Nodal의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 CMT1A인 것으로 진단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
According to claim 9,
(c) further comprising the step of diagnosing that the subject is CMT1A when the expression level of Nodal measured in the sample is found to be higher than that of the control group.
(c-1) 상기 시료 내 측정된 Nodal의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 치료 예후가 나쁘다고 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
According to claim 9,
(c-1) further comprising determining that the subject has a poor treatment prognosis when the measured expression level of Nodal in the sample is found to be higher than that of the control group.
상기 대조군은 샤르코마리투스 질환의 아형인 CMT2 및 CMT4인 것을 특징으로 하는, 방법.
According to claim 9,
The control group is characterized in that CMT2 and CMT4, which are subtypes of Charcomaritus disease, method.
상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 복수, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
According to claim 9,
Characterized in that the biological sample is at least one selected from the group consisting of saliva, biopsy, blood, serum, plasma, lymph, cerebrospinal fluid, ascites, skin tissue, liquid culture, feces and urine. .
A pharmaceutical composition for preventing or treating CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) comprising an inhibitor that inhibits Nodal as an active ingredient.
상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, Nodal의 단백질에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 14,
The inhibitor is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme (ribozyme), DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, proteins of Nodal Characterized in that at least one member selected from the group consisting of a compound and a natural extract that binds directly and inhibits its activity, the composition.
A food composition for preventing or improving CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) comprising an inhibitor that inhibits Nodal as an active ingredient.
상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, Nodal의 단백질에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to claim 16,
The inhibitor is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme (ribozyme), DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, proteins of Nodal Characterized in that at least one member selected from the group consisting of a compound and a natural extract that binds directly and inhibits its activity, the composition.
(a) 대상 세포에 CMT1A 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 세포에서 Nodal의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 세포에서의 Nodal의 발현 수준이 CMT1A 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 경우 CMT1A 치료제로 판단하는 단계.
A screening method for a therapeutic agent for CMT1A (Charcot-Marie-Tooth disease 1A) comprising the following steps:
(a) processing a target cell with a CMT1A therapeutic candidate;
(b) measuring the expression level of Nodal in the cells of step (a); and
(c) determining that the cell is a CMT1A therapeutic if the expression level of Nodal in the cells measured in step (b) is reduced compared to the control group not treated with the CMT1A therapeutic candidate.
상기 Nodal의 발현 수준은, 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 Nodal mRNA를 검출 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
According to claim 18,
The expression level of Nodal is determined by detecting at least one Nodal mRNA selected from the group consisting of reverse transcription polymerase reaction, competitive reverse transcription polymerase reaction, real-time reverse transcription polymerase reaction, RNase protection assay (RPA), Northern blotting, and DNA chip. characterized in that it is measured as, method.
상기 Nodal의 발현 수준은, 웨스턴 블랏팅, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay), ELLA (enzyme-linked lectin assay), 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 Nodal 단백질 검출 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.According to claim 18,
The expression level of Nodal was determined by western blotting, ELISA (enzymelinked immunosorbent assay), ELLA (enzyme-linked lectin assay), radiation immunoassay, radiation immunodiffusion method, Ouchterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, Characterized in that the measurement is performed by at least one Nodal protein detection method selected from the group consisting of immunohistochemical staining, immunoprecipitation analysis, complement fixation analysis, FACS, and protein chip.
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|---|
| Harding et al., Brain 103:259-280 (1980) |
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