KR20230041073A - 멀티플렉스 용액내 단백질 어레이로 스크리닝된 검정 샘플의 멀티플렉스 시퀀싱을 위한 이중 바코드 인덱스 - Google Patents
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Abstract
고유한 DNA 바코드의 협동 세트를 포함하는 조성물 및 단일 차세대 시퀀싱 반응을 사용하여 다수의 샘플에서 다수의 표적 분자의 멀티플렉스 검출 및 측정을 위해 이를 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 특히, 친화성 시약에 연결된 고유한 DNA 바코드가, 샘플에 존재하는 경우 항원에 결합하는 샘플에 접촉되고, 이어서 PCR-기반 증폭 반응이 유니버셜 시퀀싱 어댑터 뿐만 아니라 고유한 바코드 서열을 함유하는 바코드화된 인덱스 서열을 첨가하고, DNA 시퀀싱을 위한 친화성 시약-결합된 표적을 증폭시키는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 7월 24일에 출원된 미국 출원 번호 63/056,282의 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방정부 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 R21 CA196442 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
많은 변수를 동시에 측정하는 것에 기반하여 샘플 및 질환을 계층화하는 다양한 '오믹스' 기술 및 방법의 도래와 함께, 특이적 표적을 정량화하는 고처리량 도구에 대한 요구가 증가하고 있다. 유전자 발현, 유전자 카피 수, 돌연변이 등을 전반적 규모에서 평가하여 요법의 예상 및 관리에 유용할 수 있는 질환의 하위유형을 결정하는 다수의 게노믹스 도구가 이미 있다. 그러나, 게놈 (이는 청사진임)은 항상 생물학의 실제 상태를 아무때나 반영하는 것은 아니며, 유전자 측정은 혈액과 같은 용이하게 접근가능한 샘플로부터 항상 가능하지는 않음이 널리 공지되어 있다. 따라서, 게놈의 생성물인 프로테옴을 측정하고 생물학의 현재의 상태를 보다 가깝게 반영하는 유사한 고처리량 도구를 가질 것이 강하게 요망되고 있다. 그러나, 프로테옴의 고처리량 측정은 유사한 게놈 측정보다 훨씬 더 난제인데, 이는 DNA의 고유한 이중-가닥 성질로부터 생기는 염기 쌍형성 측정에 대해 등가인 단백질이 없기 때문이다.
단백질을 측정하는 폭넓게 다양한 방법이 있다. 이들은 일반적으로 항체-기반 방법 및 화학-기반 방법으로 나누어질 수 있다. 지금까지, 가장 통상적인 화학-기반 방법은 질량 분광법이며, 이는 펩티드 (단백질분해적 소화에 의해 생성됨)를 이온화하고, 자기장에서의 그들의 이동을 측정함으로써 가장 통상적으로 채용된다. 이들 기기의 정확성은 그의 스펙트럼을 게놈으로부터 예측되는 스펙트럼과 비교함으로써 사실상 임의의 단백질을 확인하는데 충분하다. 단백질 및 심지어 변형된 단백질을 검출하는 그의 능력에 있어서 거의 보편적이지만, 질량 분광법은 매우 저처리량이다. 단일 샘플의 철저한 조사는 수 시간이 걸릴 수 있고, 하나의 실행을 다음 것과 비교하는 것을 허용하는 방식으로 세트 샘플을 실행하는 것은 깊은 주의를 요구한다. 단백질을 화학적으로 검출하는 많은 다른 도구가 있지만, 이들은 특이적 단백질을 보편적인 방식으로 확인할 수 없다.
단백질의 검출은 가장 통상적으로 항체 (또는 보다 일반적으로, 친화성 시약)로 달성되며, 많은 상이한 구성, 예컨대 웨스턴 블롯, 면역침전, 유동 세포계측법, 역상 단백질 어레이, 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 및 많은 다른 것들을 포함한다. 이들 적용은 모두 특이적 표적을 인식하고, 비범한 민감성 및 친화성으로 결합할 수 있는 항체에 의존한다. 현재 인간 프로테옴의 많은 부분을 표적화하는 2,000,000종 초과의 항체가 시장에서 입수가능하다. 모든 항체가 고품질인 것은 아니지만, 많은 것들은 꽤 양호하며, 항체를 생성하는 방법은 통상적인 것이 되었음을 주목하는 것이 중요하다. 그의 표적을 측정하기 위한 항체의 사용은 상대적으로 신속할 수 있지만, 많은 항체를 동시에 사용하여 측정을 멀티플렉싱하는 것은 간단하지 않다. 따라서, 풀링된 샘플을 포함하는 다수의 샘플에서 많은 단백질 또는 다른 표적 분자의 동시 멀티플렉스 검출 및 측정을 위한 개선된 비용-효과적인 방법에 대한 필요가 관련 기술분야에 남아 있다.
개시내용의 간단한 요약
제1 측면에서, (i) 복수개의 변형된 친화성 시약으로서, 복수개의 각각의 친화성 시약은 복수개의 다른 친화성 시약에 비해 고유한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 확인 뉴클레오티드 서열은 제1 증폭 뉴클레오티드 서열 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 것인 복수개의 변형된 친화성 시약; (ii) 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 제1 (예를 들어, 정방향) 바코드화된 인덱스 프라이머; 및 (iii) 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 제2 (예를 들어, 역방향) 바코드화된 인덱스 서열을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 서열식별번호(SEQ ID NO):204 - 서열식별번호:233으로부터 선택될 수 있다. 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 서열식별번호:234 - 서열식별번호:253으로부터 선택될 수 있다. 확인 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호:1 및 표 1에 제시된 바코드 서열로부터 선택될 수 있다. 복수개의 친화성 시약은 항체일 수 있다. 복수개의 친화성 시약은 펩티드 압타머 또는 핵산 압타머일 수 있다. 확인 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 링커)은 절단가능한 단백질 광가교제를 포함하는 링커에 의해 친화성 시약에 부착될 수 있다. 확인 뉴클레오티드 서열은 형광 모이어티를 포함하는 링커에 의해 친화성 시약에 부착될 수 있다.
또 다른 측면에서, 복수개의 샘플에서의 표적 분자의 고처리량 멀티플렉스 확인 및 정량화를 위한 방법으로서, (a) 복수개의 샘플의 각각에 대해, 접촉된 샘플에 존재하는 경우 표적 분자에의 변형된 친화성 시약의 결합을 촉진시키는 조건 하에서 샘플을 복수개의 변형된 친화성 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수개의 각각의 변형된 친화성 시약은 복수개의 다른 친화성 시약에 비해 고유한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 확인 뉴클레오티드 서열은 제1 증폭 뉴클레오티드 서열 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 것인 단계; (b) 제1 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에의 제1 바코드화된 인덱스 프라이머 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 단계 (a)의 접촉된 샘플을 제1 (예를 들어, 정방향) 바코드화된 인덱스 프라이머 및 제2 (예를 들어, 역방향) 바코드화된 인덱스 프라이머에 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하고, 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 것인 단계; (c) (b)의 접촉된 샘플을 증폭시켜 증폭된 생성물을 생성하는 단계; 및 (d) 증폭된 생성물을 시퀀싱하고, 그에 의해 복수개의 샘플의 각각의 표적 분자가 확인 뉴클레오티드 서열 및 제1 및 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열의 검출에 기초하여 확인되고 정량화되는 것인 단계를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 방법이 본원에서 제공된다. 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 서열의 상이한 조합은 복수개의 샘플의 각각에 대해 사용될 수 있다. 접촉된 샘플은 증폭 전에 풀링될 수 있다. 확인 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호:1 또는 표 1에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 서열식별번호:204 - 서열식별번호:233으로부터 선택될 수 있다. 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 서열식별번호:234 - 서열식별번호:253으로부터 선택될 수 있다. 방법은 링커를 친화성 시약에 첨가하여 변형된 친화성 시약을 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 링커는 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 각각의 단부 상에 플랭킹된 확인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 친화성 시약은 항체 또는 압타머일 수 있다. 친화성 시약은 항체일 수 있고, 여기서 첨가 단계는 링커를 항원 결합 영역이 아닌 항체의 영역에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 친화성 시약은 항체일 수 있고, 여기서 첨가 단계는 링커를 항체의 단편 결정화가능한 영역 (Fc 영역)에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 확인 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 링커 서열의)은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제1 증폭 서열은 서열식별번호:2를 포함할 수 있고, 제2 증폭 서열은 서열식별번호:3을 포함할 수 있다. 링커는 형광 단백질 또는 절단가능한 단백질 광가교제를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 측면에서, 고처리량 멀티플렉스 단백질 정량화를 위한 키트로서, X개의 변형된 친화성 시약(들) 및 바코드화된 인덱스 서열의 Y개의 쌍을 포함하고, 여기서 X는 1 이상이고; Y는 1 이상이고; 각각의 변형된 친화성 시약은 링커를 포함하고, 링커는 한 쌍의 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 각각의 변형된 친화성 시약은 다른 변형된 친화성 시약과는 상이한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 바코드화된 인덱스 프라이머의 각각의 쌍은 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머의 고유한 조합을 포함하고, 여기서 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하고, 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 것인 키트가 본원에서 제공된다. 링커는 서열식별번호:104-203으로부터 선택될 수 있다. 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 표 3으로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용의 하기 상세한 설명을 고려할 때 본 개시내용이 보다 잘 이해될 것이고, 상기 제시된 것들 이외의 특색, 측면, 및 이점이 명백하게 될 것이다. 이러한 상세한 설명은 하기 도면을 참조한다:
도 1은 용액내 DNA-바코드화된 단백질 어레이의 이중 인덱스 바코드 분석의 실시양태를 예시하는 개략도이다.
도 2는 멀티플렉스 시퀀싱 인덱스의 예시적인 성분을 예시하는 개략도이다.
도 3은 이중 인덱스 바코드 프라이머의 상이한 조합으로의 증폭 후의 질환 양성 혈청에서의 항체의 풍부화를 제시하는 DNA 겔의 화상을 제시한다.
도 4는 고유한 이중 인덱스 바코드를 첨가한 후, 4개의 샘플 (바코드화된 단백질 라이브러리와 함께 인큐베이션된 HPV 양성 1-3 및 HPV 음성 4-5 혈청 샘플)에 대한 PCR 반응을 제시하는 DNA 아가로스 겔을 제시한다.
도 5는 본 개시내용의 멀티플렉싱된 검출 방법에 대한 예시적인 작업 흐름을 예시하는 개략도를 제시한다.
도 1은 용액내 DNA-바코드화된 단백질 어레이의 이중 인덱스 바코드 분석의 실시양태를 예시하는 개략도이다.
도 2는 멀티플렉스 시퀀싱 인덱스의 예시적인 성분을 예시하는 개략도이다.
도 3은 이중 인덱스 바코드 프라이머의 상이한 조합으로의 증폭 후의 질환 양성 혈청에서의 항체의 풍부화를 제시하는 DNA 겔의 화상을 제시한다.
도 4는 고유한 이중 인덱스 바코드를 첨가한 후, 4개의 샘플 (바코드화된 단백질 라이브러리와 함께 인큐베이션된 HPV 양성 1-3 및 HPV 음성 4-5 혈청 샘플)에 대한 PCR 반응을 제시하는 DNA 아가로스 겔을 제시한다.
도 5는 본 개시내용의 멀티플렉싱된 검출 방법에 대한 예시적인 작업 흐름을 예시하는 개략도를 제시한다.
본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 간행물은 본 출원에서 그 전문이 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 수 백 내지 수 천개의 관심의 샘플 및 수 백개 이상의 단백질과의 그들의 상호작용의 동시 분석을 허용하는 본 발명자들의 이중 바코드 인덱스의 개발에 적어도 부분적으로 기반한다. 본원에 기재된 바와 같이, 기술은 그들의 표적을 인식하는 항체 (또는 사실상 임의의 친화성 시약)의 능력 및 예를 들어, 차세대 DNA 시퀀싱 방법을 사용하여 항체 및 다른 친화성 시약의 검출을 가능하게 하는 고유한 DNA 바코드의 능력을 이용한다.
본 발명자들은 12-bp DNA 서열을 사용하여 수 백개의 단백질을 고유하게 바코드화하고, 그에 의해 용액내 DNA-바코드화된 단백질 라이브러리를 생성하는 전략을 이전에 개발하였다. 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,938,523을 참조한다. 이 단백질 라이브러리를 "관심의 샘플" (예를 들어, 다른 단백질, 약물, 환자 샘플)과 함께 인큐베이션함으로써, 상기 전략은 차세대 시퀀싱 (NGS)을 사용한 신규한 단백질-단백질 상호작용, 면역 반응, 및 관심의 다른 생물학적 프로세스의 확인을 허용하였다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 어떻게 "관심의 샘플"을 멀티플렉싱하고 다수의 표적의 동시 분석을 달성할 것인지의 문제를 해결한다. 본원에 기재된 바와 같이, 방법은 단일 단계에서 폴리머라제 연쇄 반응을 통해 고유한 인덱스 바코드를 첨가하는 것을 포함한다. 결과적으로, 본 기재된 방법 및 조성물 및 방법의 이점은 여러 가지이며, 예를 들어, 단일 차세대 시퀀싱 실행에서 수 백개의 표적에 대해 많은 수의 관심의 샘플을 검정하고, 그에 의해 DNA 바코드화된 단백질 어레이의 고처리량 용량을 증가시키고, 어레이의 비용을 저하시키는 능력을 포함한다. 본 개시내용의 방법은 또한 샘플 프로세싱 시간을 감소시키는데, 이는 이들이 멀티플렉스 검출을 위한 통상적인 프로토콜에 의해 요구되는 다수의 PCR 사이클 및 서열 어댑터 라이게이션 반응을 요구하지 않기 때문이다.
따라서, 제1 측면에서, 이중 바코드 인덱스를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 본원에 사용된 용어 "이중 바코드 인덱스"는 고유한 핵산 바코드의 2개의 세트의 조합을 지칭한다. 하나의 세트는 복수개의 단백질에 첨부되어 DNA-바코드화된 단백질 라이브러리를 형성하는 고유한 DNA 바코드를 포함한다. 제2 세트는 다수의 샘플이 조합되는 경우 관심의 개별적 샘플을 확인하는데 사용되는 고유한 DNA 바코드의 상이한 세트이다. DNA 바코드의 제1 세트로 바코드화된 단백질 라이브러리가 관심의 샘플에 접촉되는 경우, DNA 바코드의 제1 세트는 차세대 시퀀싱에 의해 다양한 생체분자 상호작용 (예를 들어, 대상체의 면역 반응의 샘플에서의 증거)의 확인을 허용한다. 그러나, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 DNA 바코드의 제2 세트를 첨가함으로써, 다수의 샘플이 조합되는 경우에도 주어진 샘플에서 이들 고유한 생체분자 상호작용을 확인하는 것이 가능하다. DNA 바코드의 제2 세트가 없으면, 다수의 샘플이 조합되는 경우 특정한 샘플과 연관된 생체분자 상호작용을 구별하는 것이 불가능할 것이다. 따라서, 이중 바코드 인덱스는 단일 차세대 시퀀싱 실행에서 수 백개의 표적에 대해 많은 수의 관심의 샘플을 검정하고, 그에 의해 각각의 DNA 바코드화된 단백질 어레이의 고처리량 용량을 증가시키는데 특히 유리하다.
일부 경우에, 이중 바코드 인덱스는 DNA 바코드의 제1 세트 및 DNA 바코드의 제2 세트를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "바코드"는 바코드가 연관되는 핵산의 일부 특색이 확인되는 것을 허용하는 공지된 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 바코드는 공통적인 서열 ("플랭킹 서열")의 세트에 의해 그의 5' 및 3' 단부에서 플랭킹된다. 특정 실시양태에서, 바코드는 DNA 바코드이다. 예를 들어, 제1 세트의 DNA 바코드는 GCTGTACGGATT (서열식별번호:1)의 뉴클레오티드 서열 및/또는 표 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 1의 각각의 바코드 서열은 5' 플랭킹 서열 및 3' 플랭킹 서열에 의해 플랭킹되고, 따라서 보다 긴 "링커" 서열을 형성하며, 그의 예는 표 2에 제시되고, 여기서 DNA 바코드 서열은 볼드체로 제시된다. 일부 실시양태에서, 5' 플랭킹 서열은 (CCACCGCTGAGCAATAACTA; 서열식별번호:2)이다. 일부 실시양태에서, 3' 플랭킹 서열은 (CGTAGATGAGTCAACGGCCT; 서열식별번호:3)이다.
일부 실시양태에서, 이중 바코드 인덱스의 DNA 바코드의 제2 세트는 표 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 세트의 DNA 바코드는 DNA-바코드화된 단백질 어레이에 첨가되고, DNA 증폭 및 시퀀싱을 위한 정방향 및 역방향 프라이머로서 기능한다. 이 방식에서, 제2 세트의 DNA 바코드는 본원에서 "바코드화된 인덱스 프라이머"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바코드화된 인덱스 프라이머는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 2019/0366237에 기재된 바와 같은 고유한 DNA 바코드를 포함하는 친화성 시약과 조합으로 사용된다. 표 3에 제시된 바와 같이, 정방향 바코드화된 인덱스 프라이머는 DNA 바코드의 제1 세트의 5' 플랭킹 서열 (CCACCGCTGAGCAATAACTA; 서열식별번호:2)을 함유하고, 역방향 바코드화된 인덱스 프라이머는 DNA 바코드의 제1 세트의 3' 플랭킹 서열 (CGTAGATGAGTCAACGGCCT; 서열식별번호:3)을 함유한다. 바코드화된 인덱스 프라이머는 또한 공지된 서열, 예컨대 차세대 시퀀싱에 요구되는 특정한 시퀀싱 어댑터인 유니버셜 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 바코드화된 인덱스 프라이머 서열은 단지 예시적이다. 바코드화된 인덱스 프라이머 서열이 상응하는 플랭킹 서열에 어닐링하도록 디자인되는 한, 다른 바코드화된 인덱스 프라이머 및 플랭킹 서열이 본 개시내용의 이중 바코드화된 인덱스와 함께 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
일부 경우에, 바코드화된 인덱스 프라이머는 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플, 환자 샘플)에 첨가되어 DNA 바코드화된 단백질의 멀티플렉스 용액내 어레이에 접촉되고, 샘플-접촉된 어레이는 임의의 적절한 DNA 증폭 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭된다. 바람직하게는, 샘플-접촉된 어레이는 PCR을 사용하여 증폭된다. DNA 증폭 동안, 바코드화된 인덱스 프라이머는 멀티플렉스 용액내 단백질 어레이의 바코드화된 친화성 시약에 어닐링하고, 많은 샘플의 멀티플렉스 분석을 위해 증폭된다. 바람직하게는, 각각의 이중 바코드 인덱스는 DNA 바코드 및 서열 인덱스 프라이머의 상이한 조합을 포함하고, 그에 의해 각각의 반응에 필요한 고유한 샘플 식별자의 수를 감소시킨다. 예를 들어, 도 2를 참조하면, 바코드화된 인덱스 프라이머의 유니버셜 서열 U1 및 U2는 용액내 DNA 바코드화된 단백질 어레이 상의 5' 및 3' 플랭킹 서열 (서열식별번호:2 및 3)을 고유하게 확인하고 그에 어닐링할 수 있다. 정방향 및 역방향 서열 (n=9-12 염기 쌍)의 인덱스 바코드 영역은 "관심의 샘플"에 대한 고유한 식별자를 제공한다. 도 2는 용액내 단백질 어레이에 접촉되어 표적-친화성 시약 복합체를 형성한 9개의 관심의 샘플을 수반하는 실험을 예시한다. 모든 9개의 샘플 (N1 내지 N9)을 단일 NGS 실험에서 분석하기 위해, 샘플은 이들 구축물의 상이한 조합을 사용하여 단일 폴리머라제 연쇄 반응 단계에서 증폭된다. 예를 들어, 정방향 및 역방향 DNA 서열의 하기 조합이 사용될 수 있다:
이 예는 6개의 바코드화된 인덱스 프라이머 (3개의 정방향 및 3개의 역방향)가 모든 9개의 샘플에 대한 시퀀싱 어댑터를 고유하게 바코드화하고 도입할 수 있음을 입증한다. 이 조합 전략으로, 10개의 바코드화된 정방향 프라이머 및 10개의 바코드화된 역방향 프라이머는 100개의 생물학적 샘플에 대한 고유한 시퀀싱 인덱스를 도입하고, 따라서 다수의 샘플의 분석의 비용을 감소시키면서 단일 NGS 실험의 처리량을 실질적으로 증가시킬 수 있다.
표 1. 예시적인 바코드 서열
표 2. 예시적인 링커 서열
도 3을 참조하면, 양성 환자 샘플 (관심의 표적이 샘플에서 검출되었음을 의미함)의 분석은 본 개시내용의 이중 바코드 인덱스로 증폭되는 경우 음성 샘플과 비교하여 더 강한 PCR 밴드를 밝혀내었다. DNA 바코드화된 단백질 라이브러리 (HPV 항원을 가짐)를 실온에서 1시간 동안 환자 혈청 샘플 (질환 양성 및 음성)과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 시간은 최소 30분 내지 24시간으로 다양할 수 있다. 보다 긴 기간 동안 인큐베이션되는 경우, 검정은 4℃에서 수행될 수 있다. 그 후, 항원-항체 복합체를 단백질 G, 단백질 A/G 또는 단백질 L 비드를 첨가함으로써 단리하였다. 비결합된 시약을 세척 완충액 (pH 7.4의 0.1-0.2% 트윈(Tween) 20을 갖는 1X 트리스(Tris)-완충 염수)으로 세척하였다. DNA 바코드화된 시약과 복합체를 형성한 풍부화된 환자 항체를 PCR 플레이트 (튜브) 내로 옮겼다. 고유한 정방향 및 역방향 이중 바코드 인덱스 조합 프라이머 쌍을 각각의 환자 풀 다운에 첨가하고, PCR/qPCR 증폭으로 처리하였다. PCR 생성물은 DNA 겔 상에서 점검될 수 있고, 도 3에 제시된 바와 같이 항체 풍부화를 위한 질환 양성 및 질환 음성 혈청 사이에 명백한 차이를 볼 수 있다.
일부 경우에, DNA 바코드화된 단백질 라이브러리는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,938,523에 기재된 방법에 따라 수득된다.
본원에 사용된 용어 "친화성 시약"은 그의 활성을 확인하고/거나, 추적하고/거나, 포획하고/거나, 그에 영향을 미치기 위해 관심의 생물학적 분자 ("생체분자")에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 핵산, 압타머, 또는 다른 소분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 친화성 시약은 항체이다. 다른 실시양태에서, 친화성 시약은 압타머이다. 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 2019/0366237에 기재된 바와 같이, 각각의 친화성 시약 (예를 들어, 항체)은 공통적인 서열 ("플랭킹 서열")의 세트에 의해 그의 5' 및 3' 단부에서 플랭킹된 확인 서열인 고유한 DNA 바코드를 포함하는 링커를 첨가하도록 화학적으로 변형된다.
일부 경우에, 친화성 시약은 특정한 단백질 (예를 들어, 항원) 표적에 대한 특이성을 갖는 항체이며, 여기서 항체는 DNA 바코드에 연결된다. 이러한 경우에, 항체 친화성 시약은 상기 샘플에 존재하는 경우 그의 표적 항원에의 친화성 시약의 결합을 촉진시키는 조건 하에서 샘플에 접촉된다. 그들의 표적 항원에 결합된 항체는 비결합된 시약을 샘플로부터 세척함으로써 비결합된 항체로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화성 시약과 연관된 DNA 바코드는 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 증폭된 바코드 DNA는 DNA 시퀀싱으로 처리되어 접촉된 샘플에서 다소의 표적 항원을 제공한다.
임의의 항체는 본 개시내용의 친화성 시약에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 표적 항원에 긴밀하게 결합한다 (즉, 그에 대한 높은 친화성을 갖는다). 친화성 시약에 사용하기 위해 선택된 항체는 특정한 적용에 따라 다양할 것임이 이해될 것이다. 일부 경우에, 항체는 단지 특정 형태에서 또는 특이적 변형을 갖는 경우 특정한 단백질에 대해 친화성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 변형은 친화성 시약 항체의 단편 결정화가능한 영역 (Fc 영역)에 이루어진다. Fc 영역은 세포 표면 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 꼬리 영역이다. 다른 실시양태에서, 변형은 표적 결합 영역으로부터 멀리 떨어진 공통적인 영역에 이루어진다. 이 방식으로, 목적하는 표적에 대한 특이성을 갖는 항체 친화성 시약의 라이브러리를 수득할 수 있으며, 각각의 항체는 공지된 서열의 연결된 DNA 바코드를 포함하도록 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, DNA 바코드 서열은 공통적인 서열에 의해 플랭킹된다.
다른 실시양태에서, 친화성 시약은 압타머이다. 본원에 사용된 용어 "압타머"는 특정한 표적에 대해 친화성을 갖고 그에 특이적으로 결합하는 핵산 또는 펩티드 분자를 지칭한다. 특히, 압타머는 다양한 생물학적 분자에 특이적으로 결합하고 다양한 생물학적 분자의 시험관내 또는 생체내 국재화 및 정량화에 유용한 화학적으로 합성된 펩티드를 포함하는 단일-가닥 (ss) 올리고뉴클레오티드 및 펩티드를 포함할 수 있다. 압타머는 이들이 통상적으로 사용되는 생체분자, 항체의 그것에 필적하는 분자 인식 특성을 제공하기 때문에 생명공학적 및 치료 적용에 유용하다. 그들의 식별적 인식 외에도, 압타머는 이들이 시험 튜브에서 완전하게 조작될 수 있고, 화학적 합성에 의해 용이하게 생성되고, 바람직한 저장 특성을 갖고, 치료 적용에서 면역원성을 거의 또는 전혀 유발하지 않기 때문에 항체에 비해 이점을 제공한다. 일반적으로, 핵산 압타머는 다양한 분자 표적, 예컨대 소분자, 단백질, 핵산, 및 심지어 세포, 조직, 및 미생물에 결합하도록 시험관내 선택 또는 등가적으로, SELEX (지수적 풍부화에 의한 리간드의 체계적 진화)의 반복된 라운드를 통해 조작된 핵산 종이다.
펩티드 압타머는 특이적 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 조작된 펩티드이다. 이들 단백질은 단백질 스캐폴드에 의해 제시된 가변 서열의 하나 이상의 펩티드 루프로 이루어진다. 이들은 조합적 라이브러리로부터 단리되고, 일부 경우에, 지정 돌연변이 또는 가변 영역 돌연변이유발 및 선택의 라운드에 의해 변형될 수 있다. 생체내에서, 펩티드 압타머는 세포성 단백질 표적에 결합하고, 다른 단백질과의 그들의 표적화된 분자의 통상적인 단백질 상호작용과의 간섭을 포함하는 생물학적 효과를 발휘할 수 있다. 펩티드 압타머의 라이브러리는 조사자가 세포 집단 내로 상이한 펩티드 압타머를 발현하는 라이브러리를 도입하고, 목적하는 표현형에 대해 선택하고, 그 표현형과 연관된 압타머를 확인하는 연구에서 "돌연변이유발원"으로서 사용되었다.
항체 친화성 시약과 같이, 압타머 친화성 시약은 연결된 DNA 바코드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 링커는 항체 또는 압타머로부터 광-절단될 수 있는 절단가능한 단백질 광가교제이다. 다른 경우에, 링커는 융합 태그를 갖는 표적에 첨부될 수 있는 DNA 바코드를 포함하는 리간드이다. 예를 들어, 링커는 할로(Halo) 융합 태그에 첨부된 바코드 서열을 포함하는 할로 리간드일 수 있다. 다른 경우에, 링커는 DNA 바코드 외에도 형광 프로브를 포함한다.
방법
또 다른 측면에서, 단일 차세대 서열 실행을 사용한 하나 이상의 샘플에서의 다수의 표적의 멀티플렉싱된 검출 및 측정을 위한 방법이 본원에서 제공된다. 도 5는 본 개시내용의 멀티플렉싱된 검출 방법에 대한 예시적인 작업 흐름을 예시하는 개략도이다. 예를 들어, 용액내 바코드화된 단백질 어레이는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 (예를 들어, 환자 혈청) 또는 생체분자를 포함하는 임의의 다른 샘플에 접촉될 수 있다. 단백질 어레이 및 샘플에서의 생체분자 사이에 형성된 복합체는 용액으로부터 복합체를 분리하기 위해 자기 비드 또는 유사한 기재에 접촉된다. 분리된 샘플은 비-특이적 결합을 제거하기 위해 세척된다. 이어서 인덱스 바코드가 PCR에 의해 첨가된다. PCR 생성물은 정제되고, 차세대 시퀀싱으로 처리된다.
일부 경우에, 복수개의 샘플에서의 표적 분자의 고처리량 멀티플렉스 확인 및 정량화를 위한 방법은 (a) 복수개의 샘플의 각각에 대해, 접촉된 샘플에 존재하는 경우 표적 분자에의 변형된 친화성 시약의 결합을 촉진시키는 조건 하에서 샘플을 복수개의 변형된 친화성 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수개의 각각의 변형된 친화성 시약은 복수개의 다른 친화성 시약에 비해 고유한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 확인 뉴클레오티드 서열은 제1 증폭 뉴클레오티드 서열 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹되는 것인 단계; (b) 제1 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에의 제1 바코드화된 인덱스 프라이머 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 단계 (a)의 접촉된 샘플을 제1 바코드화된 인덱스 프라이머 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머에 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하고, 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 것인 단계; (c) (b)의 접촉된 샘플을 증폭시켜 증폭된 생성물을 생성하는 단계; 및 (d) 증폭된 생성물을 시퀀싱하고, 그에 의해 복수개의 샘플의 각각의 표적 분자가 확인 뉴클레오티드 서열 및 제1 및 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열의 검출에 기초하여 확인되고 정량화되는 것인 단계를 포함한다.
일부 경우에, 접촉된 샘플은 풀링된다. 본 개시내용의 정방향 및 역방향 멀티플렉스 인덱스 프라이머를 사용하면, 증폭 및 시퀀싱을 사용하여, 예컨대 차세대 시퀀싱 실행에 의해 수 백 내지 수 천개의 관심의 샘플을 검정하는 것이 가능하다. 본 개시내용의 방법은 임의의 특정한 시퀀싱 플랫폼에 제한되지 않으며; 오히려 이들은 일반적으로 적용가능하고 플랫폼 독립적이다. 본 개시내용의 방법을 위한 적절한 시퀀싱 플랫폼은 제한 없이, 일루미나(Illumina) 시스템, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 이온 토렌트(Ion Torrent), 및 퀴아젠(Qiagen) 진리더(GeneReader) 시스템을 포함한다.
본원에 사용된 "샘플"은 특정한 질환 또는 감염성 작용제와 연관된 분자 표적을 함유하거나, 잠재적으로 함유하는 임의의 물질을 의미한다. 일부 경우에, 샘플은 병원성 미생물의 존재에 의해 감염되거나 오염될 수 있는 임의의 물질이다. 본원에서 제공된 방법에 따라 사용하는데 적절한 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 유기체 또는 그의 부분 (예를 들어, 모기, 박테리아, 식물 또는 식물 물질), 환자 샘플 (예를 들어, 대변 또는 체액, 예컨대 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇌척수액), 식품 샘플, 음용수, 및 농산물을 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 방법에 따라 사용하는데 적절한 샘플은 전체적으로 또는 부분적으로 "비-생물학적"이다. 비-생물학적 샘플은 제한 없이, 플라스틱 및 패키징 물질, 종이, 의류 섬유, 및 금속 표면을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 예를 들어, 대상체 또는 대상체의 생물학적 유체 또는 다른 물질과 접촉한 표면 상의 또는 비-생물학적 물질 내의 특정한 질환 또는 감염성 작용제와 연관된 분자 표적을 검출하는데 사용된다.
임의의 적절한 방법은 샘플에서의 그들의 표적에의 친화성 시약의 결합을 검출하고 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PCR-기반 증폭은 변형된 친화성 시약에의 접촉 후에 샘플 상에서 직접적으로 수행될 수 있다. PCR-기반 증폭 생성물의 검출의 예시적인 방법은 정량적 PCR (qPCR), 브로민화에티듐 (EtBr) 염색으로 아가로스 겔 상의 DNA의 가시화, 또는 다른 DNA 단편 측정 접근법을 포함한다.
용어 "양(quantity)", "양(amount)" 및 "수준"은 동의어이며, 일반적으로 관련 기술분야에서 널리 이해되어 있다. 본원에 사용된 상기 용어는 특히 샘플에서의 표적 분자의 절대적 정량화, 또는 샘플에서의 표적 분자의 상대적 정량화, 즉, 또 다른 값에 비한 것, 예컨대 참조 값 또는 바이오마커의 기준선 발현을 지시하는 값의 범위에 비한 것을 지칭할 수 있다. 이들 값 또는 범위는 단일 대상체 (예를 들어, 인간 환자)로부터 수득되거나, 대상체의 그룹으로부터 합계될 수 있다. 일부 경우에, 표적 측정은 표준물 또는 표준물의 세트와 비교된다.
추가의 측면에서, 질환 (예를 들어, 암, 자가면역 장애) 또는 감염성 작용제, 예컨대 병원성 미생물에 대한 대상체의 면역 반응을 검출하고 정량화하는 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 경우에, 친화성 시약은 특정한 질환 또는 감염성 작용제와 연관된 분자 표적에 대한 그들의 친화성에 대해 선택된다. 유리하게는, 본원에 기재된 친화성 시약은 많은 상이한 감염에 대한 샘플의 멀티플렉싱된 스크리닝에 매우 적합하다. 예를 들어, 많은 감염에 대한 샘플을 동시에 검정하여 어느 것이 면역 반응을 유도하였고 어느 감염-연관 단백질이 반응을 촉발시켰는지를 알 수 있다. 예를 들어, DNA 바코드화된 친화성 시약은 HPV (인간 유두종바이러스) 프로테옴의 상이한 하위유형에 대해 제조될 수 있고, 이를 사용하여 HPV 관련 암의 검출을 위한 초기 바이오마커를 찾을 수 있다. 또 다른 적용에서, DNA 친화성 시약은 SARS-CoV2, 및 다른 코로나 바이러스 프로테옴에 대해 제조되어 상이한 임상적 증상을 갖는 COVID-19 환자 중에서 전반적 면역 반응을 볼 수 있다. 일반적으로, 이들 항원 라이브러리는 병원체의 프로테옴, 세포성 신호전달 경로로부터의 단백질 등으로부터의 임의의 것일 수 있다. 관심의 항원은 무세포 발현 시스템, 박테리아, 곤충 또는 포유동물 발현 시스템에서 단백질을 생성함으로써 제조될 수 있다. 고유한 DNA 바코드로 관능화된 할로 리간드는 발현된 단백질 내로 첨가되어 할로 융합 태그와 공유 결합을 형성할 수 있다. 바코드화된 단백질은 발현된 항원에서 플래그(Flag) 태그를 이용함으로써 항-FLAG 자기 비드로 포획될 수 있다. 비결합된 단백질, 과량의 바코드 등을 세척한 후, DNA 바코드화된 단백질/항원은 3X 플래그 펩티드의 과량의 양으로 용리될 수 있다. 모든 용리된 DNA 바코드화된 단백질은 함께 풀링되어 단백질의 상응하는 패널 (100-300)을 갖는 DNA-바코드화된 친화성 시약을 생성할 수 있다. 제조된 DNA 바코드화된 친화성 시약은 다수의 하류 적용 (환자 혈청에서의 면역 반응, 단백질 상호작용, 바이오마커, 단백질-약물 상호작용 등)에 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 친화성 시약은 감염성 병원체에 대한 대상체의 면역 반응을 검출하고, 일부 경우에, 모니터링하는데 사용된다. 예로서, 병원체는 제한 없이, 플라바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 에볼라 바이러스, 단일 가닥 RNA 바이러스, 단일 가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 RNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스를 포함하는 바이러스를 포함할 수 있다. 다른 병원체는 기생충 (예를 들어, 말라리아 기생충 및 다른 원생동물 및 후생동물 병원체 (플라스모디아(Plasmodia) 종, 라이슈마니아(Leishmania) 종, 쉬스토소마(Schistosoma) 종, 트리파노소마(Trypanosoma) 종)), 박테리아 (예를 들어, 미코박테리아(Mycobacteria), 특히, 엠 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 살모넬라(Salmonella), 스트렙토코쿠스(Streptococci), 이. 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스(Staphylococci)), 진균 (예를 들어, 칸디다(Candida) 종, 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii) 및 다른 뉴모시스트 종), 및 프리온을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 병원성 미생물, 예를 들어 병원성 박테리아는 특정 인간 세포 유형에서 암을 유발하는 것일 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 제한 없이, 코로나바이러스 (예를 들어, SARS-Cov-2), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, 예컨대 지카 바이러스 (예를 들어, 미국으로부터의 지카 균주, ZIKV), 황열 바이러스, 및 뎅기 바이러스 혈청형 1 (DENV1) 및 3 (DENV3), 및 가깝게 관련된 바이러스, 예컨대 치쿤구니아 바이러스 (CHIKV), HPV, 및 칼리시비리다에(Caliciviridae) 과의 바이러스 (예를 들어, 인간 장 바이러스, 예컨대 노로바이러스 및 사포바이러스)를 포함하는 인간-병원성 바이러스 (인간 질환 또는 병리증상을 유발하는 바이러스를 의미함)를 검출한다.
본원에 사용된 용어 "검출하다" 또는 "검출"은 샘플, 반응 혼합물, 분자 복합체, 및 플랫폼 및 어레이를 포함하는 기재를 포함하나 이에 제한되지는 않는 공간의 제한된 부분에서의 표적 분자의 존재(existence), 존재(presence) 또는 사실의 결정을 지시한다. 검출은 그것이 표적 또는 신호의 양 또는 비율을 결정하도록 디자인된 임의의 분석을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표적 또는 신호의 양 또는 양의 측정 (또한 정량으로 지칭됨)을 지칭하거나, 이와 관련되거나, 이를 수반하는 경우 "정량적"이다. 검출은 그것이 정량화되지 않는 또 다른 표적 또는 신호에 대한 상대 풍부도의 관점에서 표적 또는 신호의 품질 또는 종류의 확인을 지칭하거나, 이와 관련되거나, 이를 수반하는 경우 "정성적"이다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 핵염기 및 산성 모이어티를 포함하는 화합물, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어, 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자이고, 여기서 인접한 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결을 통해 서로에 연결된다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별적 핵산 잔기 (예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개별적 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체 (예를 들어, 적어도 3개의 뉴클레오티드의 스트링)를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA를 포괄한다. 핵산은 예를 들어, 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 다른 천연 발생 핵산 분자의 맥락에서 천연 발생일 수 있다. 한편, 핵산 분자는 비-천연 발생 분자, 예를 들어, 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 혼성체일 수 있거나, 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함한다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외를 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제되고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되고, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성되는 등을 할 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 및 백본 변형을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 지시되지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드 (예를 들어 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 염기); 개재된 염기; 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포로아미다이트 연결)이거나 이를 포함한다.
용어 "단백질", "펩티드", 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산의 길이일 것이다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 개별적 단백질 또는 단백질의 집합을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드에서의 아미노산 중 하나 이상은 예를 들어, 화학적 실체, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합, 관능화, 또는 다른 변형을 위한 링커 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 또한 단일 분자일 수 있거나, 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 단지 천연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 천연 발생, 재조합, 또는 합성, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어, 핵산 결합 도메인 및 핵산 절단 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어, 핵산 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어, 핵산 절단제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다.
제조품
또 다른 측면에서, 감염-연관 또는 질환-연관 분자 (예를 들어, 암 연관)를 포함하는 표적 분자의 멀티플렉스 검출에 유용한 제조품이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 제조품은 고처리량 멀티플렉스 단백질 정량화를 위한 키트로서, X개의 변형된 친화성 시약(들) 및 바코드화된 인덱스 서열의 Y개의 쌍을 포함하고, 여기서 X는 1 이상이고; Y는 1 이상이고; 각각의 변형된 친화성 시약은 링커를 포함하고, 링커는 한 쌍의 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 각각의 변형된 친화성 시약은 다른 변형된 친화성 시약과는 상이한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 바코드화된 인덱스 서열의 각각의 쌍은 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 서열의 고유한 조합을 포함하고, 여기서 제1 바코드화된 인덱스 서열은 유니버셜 시퀀싱 어댑터, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하고, 제2 바코드화된 인덱스 서열은 유니버셜 시퀀싱 어댑터, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 것인 키트이다. 일부 경우에, 링커는 서열식별번호:104-203으로부터 선택된다. 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 서열은 표 3으로부터 선택될 수 있다. 임의로, 키트는 본원에 기재된 멀티플렉스 검출 및/또는 증폭 방법을 수행하기 위한 지시서를 추가로 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 기술 및 과학 용어를 포함하는 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 추가의 지침에 의해, 용어 정의는 본 발명의 교시내용을 보다 잘 이해하기 위해 포함된다.
명세서에서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수 형태는 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "한 실시양태", "실시양태", 또는 유사한 언어에 대한 언급은 실시양태에 관하여 기재된 특정한 특색, 구조, 또는 특징이 본 발명의 적어도 한 실시양태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 어구 "한 실시양태에서", "실시양태에서" 및 유사한 언어의 출현은 모두 동일한 실시양태를 지칭할 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다.
달리 지시되지 않는 한, 각각, 임의의 핵산 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 쓰여지고, 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 쓰여진다.
포함된 개략적 흐름도는 일반적으로 논리적 흐름도 도해로서 제시된다. 따라서, 도시된 순서 및 표지된 단계는 제시된 방법의 한 실시양태를 지시한다. 예시된 방법의 하나 이상의 단계, 또는 그의 부분에 대해 기능, 논리, 또는 효과에 있어서 등가인 다른 단계 및 방법이 상정될 수 있다. 추가로, 채용된 형식 및 기호는 방법의 논리적 단계를 설명하기 위해 제공되며, 방법의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다. 다양한 화살표 유형 및 선 유형은 흐름도 도해에 채용될 수 있지만, 이들은 상응하는 방법의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해된다. 사실, 일부 화살표 또는 다른 접속자는 단지 방법의 논리적 흐름을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 화살표는 도시된 방법의 열거된 단계 사이에 비특정된 지속기간의 대기 또는 모니터링 기간을 지시할 수 있다. 추가로, 특정한 방법이 일어나는 순서는 제시된 상응하는 단계의 순서를 엄격하게 고수할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
실시예
물질 및 방법
HPV 프로테옴의 상이한 하위유형을 발현하는 단백질을 써모 피셔 IVTT 무세포 발현 시스템을 사용하여 생성하였다. 공통적인 플랭킹 영역을 갖는 5 uL의 각각의 고유한 DNA 바코드를 생성된 항원/단백질의 각각에 첨가하고, 1시간 동안 공유 결합을 형성하게 하였다. 1시간 후, 각각의 반응을 위해, 항-FLAG 자기 비드의 50 ul 비드 슬러리를 첨가하고, 16시간 동안 교반 (800rpm)하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 비드를 3회 세척하여 임의의 비결합된 단백질 및 과량의 바코드를 제거하였다. DNA 바코드화된 단백질을 2시간 동안 인큐베이션한 후 100 uL의 500 nM 3X FLAG 펩티드 용리 완충액으로 용리하였다. 바코드화된 단백질/항원을 하나의 용기 내로 풀링하고, 분취하고 (각각 50 uL), -80℃에서 저장하였다.
용액내 바코드화된 단백질 어레이의 50 μL 분취물 (또는 분취물들)을 -80℃ 냉동고로부터 꺼내었다. 이어서 이 라이브러리를 50 μL의 1:100 희석된 (1X, 트리스-완충 염수/트윈 20 완충액, pH 7.4) 혈청 샘플, 질의 단백질 등과 혼합하였다. 샘플을 96 딥 웰 블록에 첨가하고, 4℃/950 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다.
단백질 A/G 자기 비드 또는 질의 단백질 코팅된 자기 비드 등 (샘플당 20 μL의 비드 슬러리)의 요구된 양을 미세 원심분리 튜브에 첨가하였다. 비드를 3 충진 부피의 1 X TBST (1% 트윈 20을 갖는 1X 트리스-완충 염수, pH 7.4)로 세척하였다. 각각의 세척 후, 튜브를 자기 스탠드 상에 정치하여 비드를 수집하였다. 상청액을 제거하고, 세척 단계를 3회 반복하였다. 최종 세척 후, 1X TBST pH 7.4 중 25 vL의 비드 슬러리를 딥 웰 블록 중의 샘플에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 3시간 동안 950 rpm에서 인큐베이션하였다. 3시간 후, 플레이트를 자기 플레이트 스탠드 상에 정치하였다. 상청액을 제거하고, 비드를 300 μl의 1X TBST pH 7.4로 3회 부드럽게 세척하고, 이어서 1X TBS pH 7.4로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 150 μL의 1X TBS pH 7.4를 첨가하고, 샘플을 95℃에서 5분 동안 비등시키고, 상청액을 PCR 증폭까지 -20 ℃에서 저장하였다.
이중 바코드 인덱스로의 PCR 증폭.
5 μl의 상호작용된 샘플에 대해, 고유한 이중 인덱스 바코드 정방향 (IndBCF1, 2.....등 이중 인덱스 프라이머) 및 역방향 (IndBCR1, 2.....등)을 PCR 플레이트에서 25.00 μL의 2X 사파이어(Sapphire) PCR 믹스 및 18 μL의 물과 함께 첨가하였다 (0.5 μM 최종 농도). 각각의 샘플은 정방향 및 역방향 이중 인덱스 바코드의 고유한 조합을 갖는다. PCR 반응을 15 사이클 동안 수행하였다 (초기 단계 1분/94℃, 변성 15초/98℃, 10초/60℃, 연장 10초/72℃, 최종 연장 15초/72℃). PCR 생성물을 PCR 클린업 (퀴아젠)으로 정제하고, 동등한 부피의 각각의 이중 인덱스 바코드화된 샘플을 풀링하고, 차세대 시퀀싱으로 처리하였다. 시퀀싱이 완결되었으면, 샘플을 탈-멀티플렉싱하고, 풍부화에 대해 분석하였다. 도 3 및 4는 시약과 상호작용한 후, 다양한 환자 샘플 풀다운 (단백질 A/G 비드)에 대한 고유한 이중 샘플 인덱스를 첨가한 후의 증폭을 제시한다. 도 3 및 4에 제시된 바와 같이, HPV 양성 암 환자의 환자 혈청은 항체 반응의 명백한 풍부화를 나타낸 반면, HPV 음성 환자 샘플은 단지 약한 배경 신호를 나타내었다.
SEQUENCE LISTING
<110> ARIZONA BOARD OF REGENTS ON BEHALF OF ARIZONA STATE
UNIVERSITY
LaBaer, Joshua
Park, Jin
Rauf, Femina
<120> DUAL BARCODE INDEXES FOR MULTIPLEX SEQUENCING OF ASSAY SAMPLES
SCREENED WITH MULTIPLEX IN-SOLUTION PROTEIN ARRAY
<130> 112624.01270
<140> PCT/US2021/042784
<141> 2021-07-22
<150> 63/056,282
<151> 2020-07-24
<160> 253
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- 3' flanking sequence
<400> 3
ccaccgctga gcaataacta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 4
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- Halo_BC66
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<223> Synthetic- Halo_BC72
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<211> 12
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<223> Synthetic- Halo_BC73
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<223> Synthetic- Halo_BC74
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic- Halo_BC79
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cggtagtttg ct 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- Halo_BC80
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic- Halo_BC83
<400> 86
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<210> 87
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- Halo_BC84
<400> 87
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<210> 88
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- Halo_BC85
<400> 88
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<210> 89
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- Halo_BC86
<400> 89
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- Halo_BC87
<400> 90
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 91
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- Halo_BC89
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<220>
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<400> 101
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<220>
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<400> 102
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<220>
<223> Synthetic- Halo_BC100
<400> 103
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 104
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<223> Synthetic- linker
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 107
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 108
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 110
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 113
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 114
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<220>
<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 118
ccaccgctga gcaataacta gcctaagttc cacgtagatg agtcaacggc ct 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 119
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<210> 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 120
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<220>
<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 123
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 124
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 125
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 126
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 127
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 128
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 129
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 131
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 132
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 135
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 136
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 139
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 140
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 141
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 143
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 144
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<220>
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<400> 147
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 148
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<220>
<223> Synthetic- linker
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<223> Synthetic- linker
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 151
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<210> 152
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 152
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 153
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 154
ccaccgctga gcaataacta gaagccaagc atcgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 155
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 155
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 156
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 157
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 158
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<210> 159
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 159
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<210> 160
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 160
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<210> 161
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 161
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<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- linker
<400> 163
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<210> 164
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 164
ccaccgctga gcaataacta ttttctctgc ggcgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 165
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 165
ccaccgctga gcaataacta tcagccgagt tacgtagatg agtcaacggc ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 166
ccaccgctga gcaataacta ctcgtgatca gacgtagatg agtcaacggc ct 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- linker
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<223> Synthetic- linker
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<212> DNA
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<223> Synthetic- linker
<400> 170
ccaccgctga gcaataacta agaatcgcaa cccgtagatg agtcaacggc ct 52
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<212> DNA
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<220>
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<400> 171
ccaccgctga gcaataacta ggaaggaact gtcgtagatg agtcaacggc ct 52
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<400> 172
ccaccgctga gcaataacta cttggcatct tccgtagatg agtcaacggc ct 52
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<400> 173
ccaccgctga gcaataacta aggccgattt gtcgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 174
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 174
ccaccgctga gcaataacta aacaaagggt cccgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 175
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 175
ccaccgctga gcaataacta caattggtag cccgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 176
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 176
ccaccgctga gcaataacta accatcgact cacgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 177
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 177
ccaccgctga gcaataacta cgtgagatga accgtagatg agtcaacggc ct 52
<210> 178
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 178
ccaccgctga gcaataacta ccatggtctt gtcgtagatg agtcaacggc ct 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 179
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- linker
<400> 180
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- linker
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic- linker
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<223> Synthetic- linker
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<223> Synthetic- linker
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aat 63
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aat 63
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caagcagaag acggcatacg agatatccag gagttcagtc agccagcccc accgctgagc 60
aat 63
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aat 63
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aat 63
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<223> Synthetic- IndBCR16
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- IndBCR18
<400> 251
caagcagaag acggcatacg agatcttgtc ctcacaagtc agccagcccc accgctgagc 60
aat 63
<210> 252
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- IndBCR19
<400> 252
caagcagaag acggcatacg agatgtccaa agcaagagtc agccagcccc accgctgagc 60
aat 63
<210> 253
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic- IndBCR20
<400> 253
caagcagaag acggcatacg agatgaacac atgagcagtc agccagcccc accgctgagc 60
aat 63
Claims (24)
- (i) 복수개의 변형된 친화성 시약으로서, 복수개의 각각의 친화성 시약은 복수개의 다른 친화성 시약에 비해 고유한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 확인 뉴클레오티드 서열은 제1 증폭 뉴클레오티드 서열 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 것인 복수개의 변형된 친화성 시약;
(ii) 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 제1 바코드화된 인덱스 프라이머; 및
(iii) 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 제2 바코드화된 인덱스 서열
을 포함하는 조성물. - 제1항에 있어서, 제1 바코드화된 인덱스 프라이머가 서열식별번호:204 - 서열식별번호:233으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 제2 바코드화된 인덱스 프라이머가 서열식별번호:234 - 서열식별번호:253으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 확인 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호:1 및 표 1에 제시된 바코드 서열로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 복수개의 친화성 시약이 항체인 조성물.
- 제1항에 있어서, 복수개의 친화성 시약이 펩티드 압타머 또는 핵산 압타머인 조성물.
- 제1항에 있어서, 확인 뉴클레오티드 서열이 절단가능한 단백질 광가교제를 포함하는 링커에 의해 친화성 시약에 부착되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 확인 뉴클레오티드 서열이 형광 모이어티를 포함하는 링커에 의해 친화성 시약에 부착되는 것인 조성물.
- 복수개의 샘플에서의 표적 분자의 고처리량 멀티플렉스 확인 및 정량화를 위한 방법으로서,
(a) 복수개의 샘플의 각각에 대해, 접촉된 샘플에 존재하는 경우 표적 분자에의 변형된 친화성 시약의 결합을 촉진시키는 조건 하에서 샘플을 복수개의 변형된 친화성 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 복수개의 각각의 변형된 친화성 시약은 복수개의 다른 친화성 시약에 비해 고유한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 확인 뉴클레오티드 서열은 제1 증폭 뉴클레오티드 서열 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 것인 단계;
(b) 제1 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에의 제1 바코드화된 인덱스 프라이머 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 단계 (a)의 접촉된 샘플을 제1 바코드화된 인덱스 프라이머 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머에 접촉시키는 단계로서,
여기서 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하고,
제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 것인 단계;
(c) (b)의 접촉된 샘플을 증폭시켜 증폭된 생성물을 생성하는 단계; 및
(d) 증폭된 생성물을 시퀀싱하고, 그에 의해 복수개의 샘플의 각각의 표적 분자가 확인 뉴클레오티드 서열 및 제1 및 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열의 검출에 기초하여 확인되고 정량화되는 것인 단계
를 포함하는 방법. - 제9항에 있어서, 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 서열의 상이한 조합이 복수개의 샘플의 각각에 대해 사용되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 접촉된 샘플이 증폭 전에 풀링되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 확인 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호:1 또는 표 1에 제시된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 제1 바코드화된 인덱스 프라이머가 서열식별번호:204 - 서열식별번호:233으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 바코드화된 인덱스 프라이머가 서열식별번호:234 - 서열식별번호:253으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 링커를 친화성 시약에 첨가하여 변형된 친화성 시약을 형성하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 링커는 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 각각의 단부 상에 플랭킹된 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 친화성 시약이 항체 또는 압타머인 방법.
- 제16항에 있어서, 친화성 시약이 항체이고, 첨가 단계가 링커를 항원 결합 영역이 아닌 항체의 영역에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 친화성 시약이 항체이고, 첨가 단계가 링커를 항체의 단편 결정화가능한 영역 (Fc 영역)에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 확인 뉴클레오티드 서열이 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 제1 증폭 서열이 서열식별번호:2를 포함하고, 제2 증폭 서열이 서열식별번호:3을 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 링커가 형광 단백질 또는 절단가능한 단백질 광가교제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 고처리량 멀티플렉스 단백질 정량화를 위한 키트로서, X개의 변형된 친화성 시약(들) 및 바코드화된 인덱스 서열의 Y개의 쌍을 포함하고, 여기서
X는 1 이상이고;
Y는 1 이상이고;
각각의 변형된 친화성 시약은 링커를 포함하고, 링커는 한 쌍의 증폭 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
각각의 변형된 친화성 시약은 다른 변형된 친화성 시약과는 상이한 확인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
바코드화된 인덱스 프라이머의 각각의 쌍은 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머의 고유한 조합을 포함하고, 여기서 제1 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 A, 제1 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제1 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하고, 제2 바코드화된 인덱스 프라이머는 유니버셜 서열 B, 제2 고유한 인덱스 뉴클레오티드 서열, 및 제2 증폭 뉴클레오티드 서열에 어닐링하도록 구성된 서열을 포함하는 것인 키트. - 제22항에 있어서, 링커가 서열식별번호:104-203으로부터 선택되는 것인 키트.
- 제22항에 있어서, 제1 및 제2 바코드화된 인덱스 프라이머가 표 3으로부터 선택되는 것인 키트.
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