KR20230038722A - 시스템 - Google Patents

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사스키아 줄리 폴락
카렌 엘리자베스 마샬
루이즈 샬롯 세르펠
클로드 미셸 위시크
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지틴벤트 리미티드
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Abstract

본 발명은 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체에 대한 치료학적 효능에 대해 제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 시험관 내 뉴우런 세포에서 Tau 단백질 응집을 연구하기 위한 시스템을 제공한다.

Description

시스템
본 발명은 tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체(aggregate)에 대한 치료학적 효과를 위한 제제(agent)를 스크리닝(screening)하는데 사용될 수 있는 시험관 내(in vitro)에서 신경 세포내 tau 단백질 응집의 연구를 위한 시스템(system)을 제공한다.
tau 단백질의, 응집체로서 쌍식 나선형 필라멘트(paired helical filament; PHF) 및 일자형 필라멘트(straight filament)로의 조립(assembly)은 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease; AD)의 주요 특징이다. tau의 응집은 신경변성(neurodegeneration), 세포 독성(cellular toxicity) 및 질환 진행을 동반하는 전파(propagation)와 연관되어 왔다. 엉킨(in tangle) tau 단백질의 미스폴딩(misfolding), 자가 조립(self-assembly) 및 축적은 타우병증(tauopathy)이 공유하는 주요 병리학적 특징이며, 이 중 가장 일반적인 것은 알츠하이머 질환(AD)이다. 병리학적 상태 하에서, tau 단백질의 쌍식 나선형 필라멘트(PHF)로 신경섬유 매득(neurofibrillary tangle; NFT)으로의 비정상적인 응집은 tau 단백질의 기능 상실 및 신경 기능장애(neuronal dysfunction)를 동반한다.
tau는 세포 흡수 및 템플레이티드 씨딩(templated seeding)을 포함하는, 프리온-유사 거동(prion-like behaviour)을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 시험관 내 연구는 세포외 tau 응집물이 뉴우런에 의해 내재화되어 세포내 내인성 tau의 자가-조립을 유도할 수 있으며, 이는 이후 이웃하거나 시냅스적으로 연결된 뉴우런으로 방출 및 전달될 수 있다. 배양된 세포주에서, 헤파린 또는 AD 뇌-유래된 tau 응집체를 사용하여 유도된 재조합 tau의 내재화된 응집체는 엔도솜 구획(endosomal compartment)에서 관찰될 수 있으며 내인성 및 응집-경향이 있는 tau를 모집하여 응집시킬 수 있다. 이러한 연구에서 일관된 발견은 tau와 엔도솜 및 라이소좀의 공동-국소화(co-localisation)이다.
뉴우런 및/또는 신경아교 세포 사이에 tau 응집체의 전달을 위한 강력한 지지체(support)가 존재하지만, 이에 관여하는 종(species)이 논의되어 왔다. 연구는 tau의 씨딩 기능(seeding competence)은 tau 응집체의 크기 및 구조에 의존하며 tau 올리고머(oligomer)는 rTg4510 마우스로부터 정제된 단량체(monomer) 또는 보다 긴 원섬유(fibril)보다는 증식을 유도하기 위한 주요 종으로서 작용하는 것을 시사하였다. 하나의 연구에서 큰 tau 응집체(>10mers)는 P301S tau 유전자이식 마우스에서 씨드-적격성 종(seed-competent species)인 것이 보고되었지만, 다른 연구에서는, tau 삼량체(trimer)가 사람 tau-발현 HEK-293 세포에서 구조적 주형 씨딩 및 세포내 tau 응집에 필수적인 최소 단위인 것으로 밝혀졌다.
많은 연구에서 사람 및/또는 돌연변이체 tau가 과발현된 동물 또는 세포 모델이 사용되었다. 시험관 내 연구는 헤파린-유도된 섬유화(fibrilisation)를 필요로 하는 전체 길이 또는 트렁케이트된(truncated) tau 단백질을 활용하였다. 둘 다의 접근법은 전체 길이의 tau의 낮은 응집 경형성 및 세포독성의 결여를 극복하는 것에 목표를 두고 있다. 그러나, 헤파린-유도된 tau 필라멘트는 자가조립하지 않고 AD 필라멘트의 주요 특징을 재생산하지 않으므로 헤파린-유도된 tau 필라멘트의 생리학적 관련성에 대한 의구심이 증가하고 있다. AD 뇌 조직으로부터의 단백질분해적으로 안정한 PHF 코어 제제에서 생화학적으로 최초 확인된 잔기 297 내지 391에 걸쳐있는 TAU의 트렁케이트된 반복체-도메인 단편(truncated repeat-domain fragment)(dGAE로 지칭됨(참고: Despres et al ACS Chem. Biol., vol. 14, no. 6, pp. 1363-1379, (2019); Zhang et al Elife, vol. 8, p. e43584, (2019); Wischik et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 85, no. 12, pp. 4506-4510, (1988))은 저온-전자 현미경검사(cryo-electron microscopy)에 의해 조합된 교차-베타/베타-나선 구조를 형성하도록 조립된 C-형 소단위를 형성하는 것으로 특징화된 코어 서열(306-378)과 오버랩된다. AD에서 tau 응집의 공정을 개시하는 것은 이해되어 있지 않지만, 트렁케이트된 dGAE는 세포-유리된 및 세포 모델(Harrington et al. J. Biol. Chem., vol. 290, no. 17, pp. 10862-10875, 2015), Wischik et al Proc Natl Acad Sci USA, vol. 93, no. 20, pp. 11213-11218 (1996)), 및 유전자이식 마우스(Melis et al. Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 11, pp. 2199-2222, (2015))에서 tau의 주형-지시된 응집을 위해 제공된다. tau의 dGAE 영역(297 내지 391)은 생리학적 조건 하에서 자발적으로 조립하여 헤파린과 같은 부가물의 부재하에 시험관 내에서 PHF-유사 필라멘트를 형성한다.
조직 배양 세포 모델에서 외인적으로 적용된 tau의 특성을 조사하는 이전의 연구는 흔히 응집을 개시하기 위한 tau의 비-생리학적 단편 또는 제제를 사용하는, 사람 야생형 또는 돌연변이체 tau를 과발현하는 비-뉴우런성 또는 뉴우런성 시험관 내 모델의 사용에 의해 방해받았다(Falcon et al., J. Biol. Chem., vol. 290, no. 2, pp. 1049-1065, (2015); J. L. Guo and V. M. Y. Lee, J. Biol. Chem., vol. 286, no. 17, pp 15317-15331 (2011); 및 Kfoury et al., J. Biol. Chem., vol. 287, no. 23, pp. 19440-19451, (2012)).
전체 길이의 tau, 돌연변이된 tau 및 상이한 포스포릴화 상태를 지닌 tau 응집체는 세포 다양성(cell viability)에서 최소의 효과를 가짐이 또한 보고되었다(Kumar et al., J. Biol. Chem., vol. 289, no. 29, pp. 20318-20332, (2014); Tepper et al., J. Biol. Chem., vol. 289, no. 49, pp. 34389-34407, (2014) 및 Kaniyappan et al., Alzheimer's Dement., vol. 13, no. 11, pp. 1270-1291, (2017)). 예를 들면, 변이체 반복물(variant repeat) tau 분획으로부터 형성된 올리고머(Lys-280 결실을 지닌 tau244-372에 상응함; TauRDDK)는 세포 다양성에 영향을 미치지 않고 가지돌기 가시(dendritic spine))에 대해 선택적으로 독성임이 관찰되었다(Kaniyappan et al.,Alzheimer's Dement., vol. 13, no. 11, pp. 1270-1291, (2017)).
다른 연구는 또한 독성이 사용된 tau의 정밀한 단편에 의존함을 밝혔다(Flach et al., J. Biol. Chem., vol. 287, no. 52, pp. 43223-43233, (2012); Lasagna-Reeves et al., Biochemistry, vol. 49, no. 47, pp. 10039-10041, (2010); 및 Lasagna-Reeves et al., Mol. Neurodegener., vol. 6, no. 1, p. 39, (2011)). tau 독성 검정(assay)에서의 변화는 사용된 tau 단편 및 이의 제조 방법에서의 차이와 부분적으로 관련될 수 있다.
Tau 응집 억제제의 확인은 제WO 1996/030766호 및 제WO 2002/055720호에 기술되어 있다. Tau의 쌍식 나선형 필라멘트의 억제제에 대한 스크리닝은 제WO 2001/018546호에 기술되어 있다. Tau 응집의 억제제를 확인하는데 사용된 고-처리량 스크리닝은 문헌: Bulic et al (J. Med. Chem. Vol. 56, pp 4135-4155 (2013))에서 고찰되었다. 문헌: Liu et al (Pharm. Pat. Anal. Vol.3 pp 429-447 (2014))은 또한 Tau 응집 억제제와는 구별되는 수개의 상이한 메카니즘을 사용한 다양한 Tau 표적화 접근법을 보고하고 있다. 확인된 화합물의 임상 개발은 문헌: Panza et al (BioMed Research Int., Vol. 216, Article ID 3245935, (2016))에 논의되어 있다. 이러한 보고에도 불구하고, 기술된 메틸렌 블루(Methylene Blue; MB) 또는 LMT((류코-메틸티오니늄 비스-하이드로메탄설포네이트, LMTM; LMT-X 또는 TRx0237로서 또한 공지됨) 이외의 억제제 중 어느 것도 진행되어 제III상 임상 시험을 충족한 것이 없다(Panza et al (BioMed Research Int., Vol. 216, Article ID 3245935, (2016)).
본원에 기술된 신규 시스템은 신규한 치료학적 접근법의 개발 측면에서 보다 생리학적 방식으로 시험관 내에서 연구될 tau 응집 병리학의 분자적 증식 메카니즘을 허용한다. 본원에 기술된 신규 모델 시스템은 돌연변이체 tau 과발현 또는 외인성 씨딩 인자의 부재하에 사람 뉴우런 세포(neuronal cell)내 tau의 PHF 형성 영역의 내인성 tau에 대한 내재화, 세포독성 및 효과의 조사를 허용한다.
본 발명의 제1 양태에 따라서,
(a) 뉴우런 세포를 제제의 존재하에 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하는 단계; 또는
(b) 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 제제의 존재하에 배양하는 단계; 및
(c) 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행한 후에 뉴우런 세포에 대한 Tau 단백질의 단편의 세포독성을 측정(determining)하는 단계를 포함하는, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85%의 동일성(identity)을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질 단편의 세포독성을 억제하는데 효과적인 제제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 뉴우런 세포의 집단에서 생체 외에서 적합하게 수행된다. 따라서, 본 발명의 방법은 tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체에 대해 목적한 활성을 지닌 제제를 스크리닝하기 위한 생체 외(ex vivo) 방법이다.
뉴우런 세포는 제제의 존재하에 배양될 수 있으며 이후 Tau 단백질의 단편의 존재하에 추가로 배양될 수 있다. 대안적으로, 뉴우런 세포는 Tau 단백질의 단편의 존재하에 배양된 후 제제의 존재하에 추가로 배양될 수 있다.
상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편은 적합하게 응집되어 자가-조립된 구조, 예를 들면, 올리고머 및/또는 필라멘트를 형성한다. Tau 단백질의 단편은 주로 랜덤 코일 구조(random coil conformation)이고/이거나 가용성 단량체 및 이량체(dimer) 형태로 이루어진다. 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체는 Tau 단백질의 임의의 적합한 형태일 수 있다. 적합하게는, Tau 단백질은 Tau 단백질의 재조합 형태이다. Tau 단백질의 이러한 단편은 또한 tau 응집체로서 지칭된다. Tau 단백질의 단편은 정제된 제제로 존재할 수 있고 여기서 오염물질(보다 짧은 펩타이드 단편)은 제제로부터 제거되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편은 포스포릴화없이 자가-응집(self-aggregate)될 수 있다. 본원에 기술된 Tau 단백질의 단편은 내인성 Tau 단백질과 함께 응집(co-aggregation)한다. 함께 응집한 후, 본원에 기술된 Tau 단백질의 단편 및 내인성 Tau 단백질은 뉴우런 세포 내에서 엔도솜 및/또는 라이소좀 구획 안에서 함께 축적된다.
dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편은 서열 번호: 4의 아미노산으로부터의 적어도 70개 아미노산의 연속된 서열을 적합하게 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편은 길이가 70 내지 97개 아미노산, 임의로 길이가 71 내지 97개 아미노산일 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편은 길이가 71, 73, 94, 95, 97개 아미노산인 단편의 그룹으로부터 적합하게 선택될 수 있다.
따라서, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편은 서열 번호:4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 7에 기술된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열을 갖는 Tau 단백질의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
dGAE95는 서열 번호: 4에 기술된 바와 같이, 잔기 Ile-297에서 N-말단 및 잔기 Glu-391에서 C-말단을 지닌, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 95개 잔기를 지칭한다(언급된 잔기가 사람 또는 마우스 Tau 서열을 지칭하는 경우, 이는 이러한 영역에서 동일하다).
따라서 본 발명에 따라 사용된 Tau 단백질의 단편은 또한 단편 dGAE97(dGAE97는 서열 번호: 3에 기술된 바와 같이, 잔기 Asp-295에서 N-말단 및 잔기 Glu-391에서 C-말단을 지닌, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 97개 잔기 단편을 지칭한다), dGA("dGA"는 서열 번호: 5에 기술된 바와 같이, 잔기 Ile-297에서 N-말단 및 잔기 Ala-390에서 C-말단을 지닌, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 94개 잔기 단편을 지칭한다), dGAE73(dGAE73은 서열 번호: 6에 기술된 바와 같이, 잔기 Val-306에서 N-말단 및 잔기 Phe-378에서 C-말단을 지닌, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 단편을 지칭한다), 및 서열 번호: 7에 기술된 바와 같이, 잔기 Ile-308에서 N-말단 및 잔기 Phe-378에서 C-말단을 지닌, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 잔기 308 내지 378번의 아미노산 서열을 지칭한다.
본 개시내용에서 Tau 단백질 서열 및 구조의 모든 잔기 번호는 서열 번호: 1의 잔기를 지칭하고, 이는 사람 Tau 단백질의 4개의 반복체 동형(four-repeat isoform) 2N4R(Uniprot ID P10636-8), 또는 다른 종 또는 이의 변이체에서 상동성 위치의 서열이다. 사람 Tau 동형 2N4R(Uniprot ID P10636-8)은 서열 번호: 2로서 제공된, 전체 길이의 Tau, Uniprot ID P10636 또는 P10636-1의 아미노산 1 내지 124번, 376 내지 394번 및 461 내지 758번을 지칭한다. 서열 번호: 2는 말초 신경계(peripheral nervous system ; PNS)에서는 발견되지만 중추 신경계(central nervous system; CNS)에서는 발견되지 않는 Tau의 보다 긴 형태에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "전체-길이" tau에 대한 참고는 서열 번호: 1(CNS에 대한 관련 서열)을 지칭하나 서열 번호: 2(는 CNS에서 관련되지 않는다)를 지칭하지 않는다.
서열 번호: 1(Tau-4로서 또한 공지된, 동형 Tau-F, 2N4R, 441개 아미노산):
Figure pct00001
서열 번호: 2(전체 길이의 사람 Tau, 동형 PNS-Tau, 758개 아미노산);
Figure pct00002
dGAE97은 서열 번호: 3에 기술된 바와 같이 잔기 Asp-295에서 N-말단 및 잔기 Glu-391에서 C-말단, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 97개 잔기 단편을 지칭한다(언급된 잔기가 사람 또는 마우스 Tau 서열을 지칭하는 경우, 이는 이러한 영역에서 동일하다). 숙련가에게 익숙한 바와 같이, dGAE97은 또한 Asp-612에서 N-ter 및 Glu-708에서 C-ter을 지닌 동형 PNS-Tau(P10636-1)의 단편에 상응한다.
서열 번호: 3 (dGAE97, 사람/마우스, 97개 아미노산):
Figure pct00003
dGAE95는 서열 번호: 4에 기술된 바와 같이 잔기 Ile-297에서 N-말단 및 잔기 Glu-391에서 C-말단, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 95개 잔기 단편을 지칭한다(언급된 잔기가 사람 또는 마우스 Tau 서열을 지칭하는 경우, 이는 이러한 영역에서 동일하다). 숙련가에게 익숙한 바와 같이, dGAE95는 또한 Ile-614에서 N-ter 및 Glu-708에서 C-ter을 지닌 동형 PNS-Tau(P10636-1)의 단편에 상응한다. 이러한 서열은 때때로 단순하게 "dGAE"로서 지칭될 수 있다. Tau(2N4R)의 잔기 297 내지 391번은 또한 쌍식 나선형 필라멘트(PHF)의 단백질분해적으로 안정한 코어로부터 단리된 우세한(predominant) 단편으로서 공지되어 있다.
서열 번호: 4(dGAE95 또는 "dGAE", 사람/마우스, 95개 아미노산):
Figure pct00004
tau(297-391)의 dGAE 영역은 생리학적 조건 하에서 자발적으로 조립하여 헤파린과 같은 첨가제(additive)의 부재하에 시험관 내에서 PHF-유사 필라멘트를 형성한다.
"dGA"는 서열 번호: 5에 기술된 바와 같이 잔기 Ile-297에서 N-말단 및 잔기 Ala-390에서 C-말단, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 94개 잔기 단편을 지칭한다(언급된 잔기가 사람 또는 마우스 Tau 서열을 지칭하는 경우, 이는 이러한 영역에서 동일하다).
서열 번호: 5 (dGA, 사람/마우스, 94개 아미노산):
Figure pct00005
dGAE73은 서열 번호: 6에 기술된 바와 같이 잔기 Val-306에서 N-말단 및 잔기 Phe-378에서 C-말단, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 단편을 지칭한다(언급된 잔기가 사람 또는 마우스 Tau 서열을 지칭하는 경우, 이는 이러한 영역에서 동일하다). 이러한 단편은 AD 뇌 조직으로부터 단리된 PHF의 코어인 것으로서 cryo-EM에 의해 확인된 서열의 잔기 306 내지 378번에 상응한다(Fitzpatrick et al, 2017; Nature). 코어는 이러한 잔기를 능가하여 연장할 수 있지만 cryo-EM의 해상도에 의해 제한된다. 숙련가에게 명백할 바와 같이, dGAE73은 또한 Val-623에서 N-ter 및 Phe-695에서 C-ter을 지닌 동형 PNS-Tau(P10636-1)의 단편에 상응한다.
서열 번호: 6 (dGAE73, 사람/마우스, 73개 아미노산):
Figure pct00006
PHF 코어의 추가의 단편은 서열 번호: 7에 기술된 바와 같이 잔기 Ile-308에서 N-말단 및 잔기 Phe-378에서 C-말단, 또는 다른 종에서 상동성 위치에서 N-말단 및 C-말단을 지닌 Tau(2N4R)의 잔기 308 내지 378번이다(언급된 잔기가 사람 또는 마우스 Tau 서열을 지칭하는 경우, 이는 이러한 영역에서 동일하다).
서열 번호: 7(2N4R의 잔기 308 내지 378번, 사람/마우스, 71개 아미노산):
Figure pct00007
Tau 단백질의 하나의 바람직한 형태는 서열 번호: 4에 따라서, 아미노산 잔기 297 내지 391번(2N4R tau로부터의 넘버링(numbering)을 사용함), 적합하게는 이의 재조합 형태에 상응하는, Tau 단백질의 dGAE 단편이다. 정제 후, dGAE는 우세하게 랜덤 코일 구조로 존재하고 dGAE의 가용성 단량체 및 이량체 형태로 주로 이루어진다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 Tau의 단편은 dGAE95(서열 번호:4)의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 단편이다. 임의로, 서열은 이에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다.
따라서, 이러한 서열은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 서열(서열 번호를 참고로)에 대해 특정 퍼센트의 서열 동일성을 갖는 것으로 정의된다. 서열 동일성은 임의의 편리한 방법으로 평가할 수 있다. 그러나, 서열 사이의 서열 동일성 정도를 측정하기 위해, 서열의 쌍식(pairwise) 또는 다중 정렬을 이루기 위한 컴퓨터 프로그램이 유용하며, 임의의 다른 적절한 프로그램을 사용할 수 있지만, 예를 들면, EMBOSS Needle 또는 EMBOSS stretcher(둘 다 Rice, P. et al., Trends Genet., 16, (6) pp276-277, 2000)는 쌍식 서열 정렬을 위해 사용될 수 있지만 Clustal Omega(Sievers F et al., Mol. Syst. Biol. 7:539, 2011) 또는 MUSCLE(Edgar, R.C., Nucleic Acids Res. 32(5):1792-1797, 2004)는 다중 서열 정렬을 위해 사용될 수 있다. 정렬이 쌍식이거나 다중(multiple)인 것에 상관없이, 이는 국소적으로(locally)보다는 전반적으로(globally)(즉, 참고 서열의 전체에 걸쳐서) 수행되어야 한다.
서열 정렬 및 동일성 퍼센트(%) 계산은 예를 들면 표준 Clustal Omega 매개변수: 매트릭스 곤넷(matrix Gonnet), 갭 오프닝 패널티(gap opening penalty) 6, 갭 연장 패널티(gap extension penalty) 1을 사용하여 측정할 수 있다. 대안적으로, 표준 EMBOSS Needle 매개변수를 사용할 수 있다: 매트릭스(matrix) BLOSUM62, 갭 오프닝 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5. 임의의 다른 적합한 매개변수를 대안적으로 사용할 수 있다.
이러한 적용 목적을 위하여, 상이한 방법으로 수득한 서열 동일성 값들 사이에 논쟁이 존재하는 경우, 디폴트 매개변수(default parameter)를 지닌 EMBOSS Needle을 사용한 전반적인 쌍식 정렬로 수득한 값이 유효한 것으로 고려될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위해, Tau 단백질의 응집체 또는 Tau 단백질의 단편(Tau 단백질의 응집체)는 생리학적 염수 용액, 예컨대, 포스페이트 완충제(생리학적 pH, 예를 들어, 포스페이트 완충된 용액의 경우 적합하게는 pH 7.4) 속에서 적합하게 희석되고 뉴우런 세포에 투여되기 전에 적합하게 교반하면서 생리학적 온도(적합하게는 37℃)에서 항온처리될 수 있다. 포스페이트 완충된 용액의 적합한 형태는 인산수소 이나트륨 및 염화나트륨, 또는 염화칼륨 및 인산이수소 칼륨의 수용액을 포함할 수 있다. 교반은 500 rpm 내지 1000 rpm, 예를 들면, 700rpm일 수 있다. 교반은 24시간 내지 96시간, 예를 들면, 24,시간, 36,시간, 48시간, 60시간, 72시간, 또는 96시간 동안일 수 있다.
한가지 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 따라서, Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체의 적합한 제제는 100 μM의 단백질을 10 mM의 포스포이트 완충제(pH 7.4) 속에 희석시켜 제조하고 37℃에서 적합하게 교반하면서, 예를 들면, 뉴우런 세포에 투여하기 전에 72시간 이하 동안 700 rpm의 속도에서 교반하면서 항온처리할 수 있다.
뉴우런 세포는 적합하게는 단백질의 내인성 형태를 발현할 수 있다. 예를 들면, 세포주 SH-SY5Y는 내인성 Tau 단백질을 발현한다. 따라서, 뉴우런 세포는 Tau 단백질을 발현하도록 형질감염되지 않는다.
뉴우런 세포는 뉴우런 세포주, 예를 들면, 신경아세포종 세포주, 예컨대, 세포주 SH-SY5Y로부터 기원할 수 있다. 세포는 미분화(undifferentiating)될 수 있으므로 적절한 성장 인자, 예를 들면, 레티노산의 존재하에 배양물 속에서 분화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 미분화된 뉴우런 세포, 예를 들면, 미분화된 SH-SY5Y를 사용할 수 있다. 적합하게는, 뉴우런 세포는 분화된 뉴우런 세포, 예를 들면, 분화된 SH-SY5Y(dSH-SY5Y)이다. 세포가 미분화된 세포형인 경우, 본 발명의 방법은 따라서 초기 예비-단계를 포함할 수 있고 여기서 미분화된 세포는 성장 인자의 존재하에 배양물 속에서 분화된다. 성장 인자는 레티노산일 수 있다.
적합하게는, 뉴우런 세포주의 세포는 배양 배지, 예를 들면, 저-혈청 또는 혈청-유리된(serum-free) 배양 배지, 예를 들면, DMEM 성장 배지; 또는 임의로 분화 인자 및/또는 성장 인자가 보충된, 포스페이트 완충된 염수 용액 속에 제공될 수 있다. 뉴우런 세포는 본 발명에 따른 이러한 배지 속에서 배양시킬 수 있다.
미분화된 SH-SY5Y 사람 신경아세포종 세포는 일반적으로 적합한 성장 배지, 예를 들면, 10% 태아 소 혈청(Foetal Calf Serum; FCS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 1% L-글루타민이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/영양소 혼합물 F-12(DMEM/F-12) 속에서 배양할 수 있다. 분화를 위해, SH-SY5Y 세포는 예를 들면, 25,000 내지 30,000 cm2, 임의로 24-웰 플레이트 속에서 웰 당 50,000개의 세포 또는 6-웰 플레이트 속에서 웰 당 300,000개의 세포의 밀도로 플레이팅할 수 있다. 분화 1일째에, 배지는 적합하게는 10 μM 모두-트랜스(trans)인 레티노산(RA)(Sigma-Aldrich)을 함유하는 저-혈청 배양 배지(1% 태아 소 혈청(FCS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 1% L-글루타민)로 적합하게 대체할 수 있고 세포는 48시간 동안 항온처리할 수 있다. 3일째에, 이러한 공정은 신선한 RA를 사용하여 반복할 수 있고 세포는 추가로 48시간 동안 배양할 수 있다. 5일째에, 세포를 혈청-유리된 배지 속에서 1회 세척하여 미량의 혈청을 제거할 수 있다. 50 ng/ml의 뇌-유래된 신경영양 인자(STEMCELL Technologies)를 함유하는 혈청-유리된 배양 배지(1% P/S 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEM/F-12)를 세포에 가하고 48시간 동안 항온처리할 수 있다. 분화된 세포(dSH-SY5Y)는 7일째에 실험에 사용하기 위해 적합하게 준비된다.
제제로 뉴우런 세포를 항온처리하는 것은 12시간 내지 72시간 이하, 예를 들면, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 또는 72시간 동안일 수 있다.
Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체는 세포에(24-웰(well) 또는 6 웰 플레이트(well plate) 각각 속에 웰 당 50,000 내지 300,000의 밀도로 플레이팅됨) 또는 25,000 내지 30,000/cm2로 0.01μM 내지 100μM, 예를 들면, 1μM, 5μM, 또는 10μM의 농도에서 투여될 수 있다.
적합하게는, 제제로 뉴우런 세포를 배양하는 것은 제제가 뉴우런 세포에 의해 내재화되도록 하기에 충분한 시간, 예를 들면, 1 내지 24시간, 1 내지 36시간 또는 1 내지 48시간 동안 수행된다.
Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체를 뉴우런 단계에 투여하는 것은 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체가 뉴우런 세포에 의해 내재화되도록 하는 조건 하에서, 예를 들면, 24 내지 48시간 동안 수행된다.
본 발명에 따라서 사용된 뉴우런 세포와 관련한 세포독성은 상대적인 산화 스트레스(oxidative stress), tau의 내인성 보충, 뉴우런 세포 내 라이소솜/미토콘드리아 손상 등의 측정을 포함하는, 배양물 속의 세포의 생존 퍼센트로서 정의될 수 있다.
독성의 감소는 세포 생존능(viability), 세포 형태학, 또는 뉴우런 세포 내 Tau 단백질의 세포골격 분포에 의해 측정될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 스크리닝되는 제제는 뉴우런 세포에 Tau 단백질을 뉴우런 세포에 투여하는 것과 관련하여 상이한 시점, 즉, Tau 단백질의 단편을 투여하기 전에, 또는 Tau 단백질의 단편을 투여한 후에 가해질 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 시험 중인 제제가 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 세포독성을 방지하거나 감소시킬 수 있는지의 여부를 평가할 수 있다. Tau 단백질의 단편의 세포독성의 감소는 제제의 부재하에 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편과 함께 배양된 뉴우런 세포의 배양물 속의 세포 사멸 퍼센트와 비교하여 제제의 존재하에 상기 정의된 Tau 단백질의 단편과 함께 배양된 뉴우런 세포의 배양물 속의 세포 사멸 퍼센트의 감소로 나타낼 수 있다.
적합하게는, 단계 (c)에서 세포독성의 억제의 측정은 뉴우런 세포를 시험 중인 제제의 부재하에 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체와 함께 항온처리하는 경우 뉴우런 세포에 대한 대조군 값과 비교함을 포함할 수 있다. 세포독성의 측정은 대조군-처리된 세포(제제의 부재하에 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편과 함께 항온처리된 뉴우런 세포)의 퍼센트로서 나타낼 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 독성에 대한 참고 수준은 또한 임의의 주어진 검정에서 사용된 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 농도에 대한 절대적인 독성 수준을 제공할 완충제-처리된 세포에 대한 참고로 확립될 수 있다.
검정의 결과가 제제가 세포독성을 방지하거나 감소시킬 수 있는지를 나타내는지의 여부를 확립하기에 적합한 방법은 통계학적 시험, 즉, 차이의 유의성을 시험하기 위한 통계적 시험(예컨대, 비쌍식 T 시험)의 수단일 수 있다. 따라서, 감소는 세포독성에서 통계적으로 유의적인 감소일 수 있다. 예를 들면, Tau 단백질의 세포독성 단편은 대조군 배양 배지, 예를 들면, 저-혈청 또는 혈청-유리된 배양 배지, 예컨대, DMEM 성장 배지; 또는 포스페이트 완충된 염수 용액 속에서 뉴우런 세포 배양물의 경우 20%의 세포 사멸의 대조군 값과 비교하여 뉴우런 세포의 배양물 속에서 40% 내지 60%의 세포 사멸을 야기할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 세포독성을 위한 검정은 제제의 부재하에 또는 처리 비히클(vehicle)의 존재하에 처리된 세포에 대해 수득된 결과에 대해 적합하게 표준화시킬 수 있다. 약 2 μM 이하의 적합한 농도에서 제제를 사용하여 50% 억제를 나타내는 화합물은 세포독성의 활성 억제제로서 고려될 수 있다. 상대적인 활성은 또한 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 상이한 제제에 대해 비교할 수 있다.
임의의 물질의 세포독성은 세포 생존능 검정의 수단으로 검정할 수 있다. 세포 생존능 검정은 임의의 일반적인 방법, 예를 들면, (i) 형광측정 검정(fluorometric assay); (ii) 비색 검정(colorimetric assay); (iii) 발광측성 검정(luminometric assay); 또는 (iv) 색소 배제 검정(dye exclusion assay)을 사용하여 착수할 수 있다.
세포독성에 대한 형광측정 검정은 ReadyProbes® 세포 생존능 영상 키트(Cell Viability Imaging Kit)(Life Technologies), 레사주린, alamarBlue 검정 또는 CFDA-AM 검정을 포함한다. 세포독성을 위한 비색 검정은 MTT 검정, MTS 검정, XTT 검정, WST-1 검정, WST-8 검정, LDH 검정, SRB 검정, NRU 검정 또는 결정성 바이올렛 검정(crystal violet assay)을 포함한다. 세포독성에 대한 발광측성 검정은 ATP 검정 또는 실시간 생존능 검정(real-time viability assay)을 포함한다. 세포독성에 대한 색소 배제 검정은 TUNEL, 카스파제-3, 트립판 블루, 에오신, 콩고 레드(Congo red), 에리트로신 B 검정(erythrosine B assay)을 포함한다.
세포 생존능 및 세포독성의 형광측정 검정은 형광 현미경, 형광계, 형광성 미세플레이트 판독기 또는 유동 세포분석기의 사용으로 수행하기에 용이하고, 이는 전통적인 색소 배제 및 비색 검정보다 많은 장점을 제공한다. 형광측정 검정은 또한 부착되거나 현탁된 세포주에 적용가능하고 사용하기에 용이하다. 따라서, 형광측정 검정은 본 발명의 방법에 따라 뉴우런 세포에서 Tau 단백질 또는 이의 단편의 세포독성에 대한 목적한 제제의 효과를 평가하는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 형광측정 접근법을 사용하는 하나의 이러한 접근법은 상이한 형광서 접근법을 적합하게 사용할 수 있다. 뉴우런 세포, 예컨대, dGAE의 집단에 대한 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체의 첨가 후, 세포 생존능은 ReadyProbes® 세포 생존능 영상 키트(Life Technologies)를 사용하여 측정할 수 있다. 키트는 모든 세포를 표지하는데 사용될 수 있는 NucBlue® 시약(청색) 및 죽은 세포 만을 표지하는 NucGreen® 시약(녹색)을 함유한다. Tau 단백질 또는 이의 단편, 예컨대, dGAE의 태그된(tagged) 응집체의 경우, NucRed® 시약을 사용하여 죽은 세포를 표지할 수 있다(적색).
뉴우런 세포는 적합하게는 37℃에서 15분 동안 시약과 함께 항온처리할 수 있다. DAPI 형광성은 G 365 여기 필터(excitation filter) 및 FT 395 이색성을 지닌 LP 420 방출 필터(emission filter)를 사용하여 포획할 수 있다. 녹색 형광성은 FITC 필터 세트(BP 450-490 여기 필터, BP 515-565 방출 필터 및 FT 510 이색성)를 사용하여 포획할 수 있다.
완충제-처리된 세포 사멸의 비율은 영상을 흑백(grayscale)으로 전환시킨 다음 한계점(threshold)를 수동으로 조절하고 이를 이원 영상(binary image)으로 전환시켜 살아있는 DAPI-염색된 세포를 강조시킴으로써 정량시킬 수 있다. 세포의 수는 자동적으로 계수할 수 있다. 죽은 세포는 동일한 방식으로 계수할 수 있고 세포 사멸은완충제-처리된 세포의 퍼센트로 나타낼 수 있다.
형광성 활성화된 세포 분류(fluorescent activated cell sorting; FACS)를 또한 형광성 강도의 대량 측정을 위해 사용할 수 있다. Tau 단백질의 내재화되고 표지되지 않은 단편의 정량화는 면역형광성을 사용하여 측정할 수 있다. 대안적으로, Tau 단백질의 표지되지 않은 단편은 티오플라빈 S(thioflavin S; ThS) 염료 또는 유사한 것을 사용하여 측정할 수 있다.
비색 검정은 세포의 대사 활성을 평가하기 위해 생화학적 마커(biochemical marker)를 측정한다. 비색 검정에서 사용된 시약은 세포의 생존능에 대해 반응하여 발색함으로써, 분광광도계를 통해 세포 생존능의 비색 측정을 허용한다. 비색 검정은 부착되거나 현탁된 세포주에 적용가능하다.
발광측정 검정은 포유동물 세포 내에서 세포 증식 및 세포독성의 신속하고 단순한 측정을 제공한다. 이러한 검정은 편리한 96-웰 및 384-웰 미세역가 플레이트 양식으로 수행될 수 있고 발광측정 미세플레이트 판독기로 측정될 수 있다.
세포독성을 평가하기 위한 가장 단순하고 광범위한 방법은 색소 배제 방법(dye exclusion method)이다. 색소 배제 방법에서, 생존 세포는 염료를 배출하지만, 죽은 세포는 이를 배출하지 않는다. 다양한 이러한 염료, 예를 들면, 에오신, 콩고 레드, 에리트로신 B, 및 트립판 블루를 사용할 수 있다.
본 발명의 시스템을 사용하여 뉴우런 세포에서 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응접체의 효과를 변경시키는데 있어서 목적한 제제의 효능을 평가할 수 있다. 제제는 임의의 약제학적으로 활성인 분자 또는 물질, 예를 들면, 화합물 또는 생물학적 분자, 적합하게는 특이적인 결합 분자, 예를 들면, 항체(예를 들면, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체, 예를 들면, 이특이적인(bispecific) 항체, 또는 항체 단편, 예를 들면, Fab, F(ab') 2 , Fc, Fd, Fv, dAb, scFv, CDR 단편, 디아보디(diabody), 또는 이의 변이체 또는 유도체)일 수 있다. 제제는 직접적으로 투여하거나 적합한 보조제(adjuvant), 희석제 또는 용액(예컨대, 적합한 생리학적으로 완충된 용액, 예를 들면, 포스페이트 완충된 염수), 속에 제형화하거나, 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 약제학적 제형으로서 제형화시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 공지된 활성을 지닌 양성 대조군으로서 제제의 활성을 확립시키는 단계를 포함할 수 있다. 양성 대조군으로서 사용하기 위한 Tau 단백질의 단편에 대한 확립된 억제 활성을 지닌 공지된 시험 화합물의 예는 메틸렌 블루(MB; 또한 메틸티오니늄 클로라이드로서 공지됨) 또는 LMT(류코-메틸티오니늄 비스-하이드로메탄설포네이트, LMTM; 또한 LMT-X 또는 TRx0237로서 공지됨)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 따라 검정된 제제의 활성은 양성 대조군과 비교할 수 있다.
본 발명의 방법은 음성 대조군(공지된 활성이 없음)을 사용하여 제제의 활성이 없는 것에 대한 기본선(baseline)을 확립시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 음성 대조군의 예는 뉴우런 세포에 대한 배양 배지, 포스페이트 완충된 염수 용액, 또는 유사 배지를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 검정된 제제의 활성은 음성 대조군과 비교할 수 있다.
임의로, 본 발명의 방법은 타우병증을 지닌 대상체를 상기 제제, 임의로 예를 들면, 타우병증의 치료에 적합한 치료학적으로 활성인 물질을 사용하여 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 대상체의 뉴우런 세포 내에 Tau 단백질의 비정상적인 축적으로 특징화된 타우병증 또는 질환의 치료시 제제의 효능을 평가하는데 사용될 수 있는 Tau 단백질 또는 이의 단편의거동에서 제제의 효능 연구를 위한 시스템을 제공한다.
Tau 단백질의 응집은 "타우병증"으로 지칭된 질환의 특질(hallmark)이다. 뉴우런 및/또는 신경아교에서 중요한 tau 병리학을 특징으로 하는 다양한 타우병증 장애가 인식되었고 이러한 용어는 당해 분야에서 수년 동안 사용되어 왔다. AD와 같은 질환에서 이러한 병리학적 포함과 특징적인 tau 포함 사이의 유사성은 구조적 특징이 공유되어 있고 이것이 관찰된 상이한 임상적 표현형에 관여하는 병리학의 지형학적 분포임을 나타낸다. 특히, AD, 픽 질환(Pick's disease)(전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)의 아형), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy; CTE) 및 피질-기저핵 변성(cortico-basal degeneration; CBD)에서 응집된 Tau의 극저온 전자 현미경(cryo-electron microscope) 구조가 이미 수득되었고, 모두는 일반적인 구조적 특징을 나타내며, 이는 예컨대, PHF(AD에서 관찰된 바와 같이)에서 Tau 응집을 조절하는 능력을 가진 화합물이 또한 다른 타우병증에서 Tau를 조절할 수 있음을 나타낸다. 하기 논의된 특정 질환 이외에, 당해 분야의 숙련가는 인지 또는 거동 증상의 조합에 의해서, 및 추가로 제WO 02/075318호에 기술된 것과 같이, PET 또는 MRI를 사용하여 가시화시킨 응집된 tau에 대한 적절한 리간드의 사용을 통해 타우병증을 확인할 수 있다.
알츠하이머 질환(Alzheimer's disease; AD) 뿐만 아니라, 신경변성 장애(neurodegenerative disorder), 예를 들면, 픽 질환 및 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy; PSP)의 병리학은 신피질(neocortex)의 치아 이랑(dentate gyrus) 및 별모양 피라미드 세포(stellate pyramidal cell) 각각에서 병리학적인 트렁케이트된 tau 응집체의 축적과 관련된 것으로 여겨진다. 최근의 타우병증(tau-관련된 치매(dementia))은 전두-측두 치매(fronto-temporal dementia; FTD); 염색체 17과 연결된 파킨슨증후군(parkinsonism linked to chromosome 17)(FTDP-17); 탈억제-치매-파킨슨중후군-근위축증 복합체(disinhibition-dementia-parkinsonism-amyotrophy complex; DDPAC); 팔리도-폰토-니그릴 변성(pallido-ponto-nigral degeneration; PPND); 구암-ALS 증후군(Guam-ALS syndrome); 팔리도-니그로-루이시안 변성(pallido-nigro-luysian degeneration; PNLD); 피질-기저핵 변성(cortico-basal degeneration; CBD); 은친화성 그레인 치매(Dementia with Argyrophilic grains; AgD); 권투선수 치매(Dementia pugilistica; DP)(여기서 상이한 형태(topography)에도 불구하고, NFT는 AD에서 관찰된 것과 유사하다)(Bouras et al., 1992); 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy; CTE), DP를 포함하는 타우병증 뿐만 아니라 반복된 및 스포츠-관련 뇌진탕(repeated and sports-related concussion)(McKee, et al., 2009)에서 관찰된 것과 유사하다)를 포함한다. 다른 것은 문헌: Wischik et al. 2000에 논의되어 있고, 상세한 논의에 대해서는, 특히 표 5.1에 논의되어 있다.
NFT에서 비정상적인 tau는 다운 증후군(Down's Syndrome; DS)(Flament et al., 1990)에서, 및 루이소체(Lewy bodies)를 지닌 치매(dementia with Lewy bodies; DLB)(Harrington et al., 1994)에서 발견된다. Tau-양성 NFT는 또한 뇌염 후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism; PEP)(Charpiot et al., 1992)에서 발견된다. 아교세포 tau 꼬임상태(tangle)는 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis; SSPE)(Ikeda et al., 1995)에서 발견된다. 다른 타우병증은 니만-피크 질환 제C형(Niemann-Pick disease type C; NPC)(Love et al., 1995); 산필립포 증후군 제B형(Sanfilippo syndrome type B)(또는 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) III B, MPS III B)(Ohmi, et al., 2009); 근긴장 디스트로피(myotonic dystrophies; DM), DM1(Sergeant, et al., 2001 및 이에 인용된 참고문헌) 및 DM2(Maurage et al., 2005)에서 발견된다. 또한 tau 병리학은 또한 보다 일반적으로 인시 결손(cognitive deficit) 및 저하(decline), 예를 들면, 경도 인지 장애(mild cognitive impairment; MCI)에 기여할 수 있다(참고: 예컨대, Braak, et al., 2003, Wischik et al., 2018).
비정상적인 tau 응집에 의해 주로 또는 부분적으로 특징화되는, 이러한 질환 모두는 본원에서 "타우병증" 또는 "Tau 단백질 응집의 질환"으로서 지칭된다. 타우병증과 관련된 본 발명의 양태에서, 타우병증은 본원에 정의된 임의의 타우병증으로부터 선택될 수 있다.
타우병증은 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 원발성 노화-관련 타우병증(Primary age-related tauopathy; PART), 신경섬유다발-우세한 노인성 치매(Neurofibrillary tangle-predominant senile dementia), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy; CTE), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy; PSP), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration; CBD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia; FTD), 염색체 17과 연관된 전두측두엽 치매 및 파킨슨증(Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17; FTDP-17), 픽 질환, 탈억제-치매-파킨슨증-근위축증 복합체(disinhibition-dementia-parkinsonism-amyotrophy complex; DDPAC), 팔리도-폰토-니그랄 변성(pallido-ponto-nigral degeneration; PPND), 구암-ALS 증후군(Guam-ALS syndrome); 팔리도-니그로-루이시안 변성(pallido-nigro-luysian degeneration; PNLD), 은친화 과립성 치매(Dementia with Argyrophilic grain; AgD), 다운 증후군(Down's Syndrome; DS), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies; DLB), 뇌염 후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism; PEP), 권투선수 치매(Dementia pugilistica; DP), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury; TBI), 뇌졸중(stroke), 빈혈(ischemia), 라이티코-보딕 질환(Lytico-bodig disease)(구암의 파킨슨-치매 복합체(Parkinson-dementia complex of Guam)), 신경절 교세포종(Ganglioglioma), 신경절세포종(Gangliocytoma), 수막혈관주위세포종(Meningioangiomatosis), 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis; SSPE), 납중독 뇌병(Lead encephalopathy), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 판토테네이트 키나제-관련 신경변성(Pantothenate kinase-associated neurodegeneration), 리포푸신증(lipofuscinosis) 및 경도 인지 장애(mild cognitive impairment; MCI)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
타우병증은 알츠하이머 질환일 수 있다.
본 발명은 또한 예방학적 척도로서의 치료를 포함한다. 치료는 예방학적 치료일 수 있다. 치료는 활성 면역화(active immunization) 또는 수동 면역화(passive immunization)일 수 있다.
활성 tau 면역화는 단일 또는 다수의 포스포-에피토프(phospho-epitope), 아미노 말단, 전체 길이의 정상 및 돌연변이체 tau 또는 응집된 tau를 표적화함으로써 tau 병리학을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 병리학적 tau에서의 감소는 거의 보고되지 않은 부작용으로 달성되며, 장기-지속하는 면역 반응은 활성 면역화가 촉망되는 선택사항이 되도록 한다. 그러나, 천연 단백질에 대한 항체의 도출(elicitation)은 역 면역 반응(adverse immune reaction)의 위험 및 정상 단백질의 유해한 표적화를 항상 수반한다.
수동 면역화(passive immunization)는 활성 전략으로부터 발생하는 안전성에 대한 잠재적인 해결책을 제공한다. 환자는 자체의 항체를 발달시키지 않을 것이고, 면역화의 효과는 일시적일 가능성이 있으며, 이는 면역학적 부작용의 위험을 감소시킨다. 수동 면역화는 또한 표적화되는 에피토프에 대해 보다 큰 특이성을 제공한다. 항체는 tau 병리학의 확산을 차단함으로써 질환 진행을 변형시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 의해 대상체의 뉴우런 세포에서 Tau 단백질의 비정상적인 축적에 의해 특징화된 타우병증 또는 질환에 대해 치료학적 효능을 지닌 제제는 초기 단계 타우병증 및/또는 경증 증후군에 의해 특징화된 타우병증의 치료에 사용될 수 있다. 제제는 경도 인지 장애(MCI)의 치료에 사용될 수 있다.
제제는 타우병증으로 진행될 위험이 있는 대상체에서 타우병증의 치료시 사용할 수 있다. 타우병증으로 진전될 위험이 있는 대상체는 임의의 적합한 수단, 예를 들면, 의학적 병력, 신체 검사, 신경학적 검사, 뇌 영상, 정신 상태 시험(예를 들면, 미니-정신 상태 시험(Mini-Mental State Exam; MMSE) 및 미니-Cog 시험(Mini-Cog test)), 컴퓨터처리된 인지 시험(computerised cognitive test)(예를 들면, 칸탭 모바일(Cantab Mobile), 코니그램(Cognigram), 콕니뷰(Cognivue), 인지 및 자동화된 신경심리학적 평가 매트릭스(Cognision and Automated Neuropsychological Assessment Metrics; ANAM) 장치), 기분 평가(mood assessment) 및 유전 시험(genetic testing)으로 확인될 수 있다.
숙련가는 타우병증 진단이 사후까지 항상 결정적이지 않을 수 있음을 인식하고 있다. 따라서, 제제는 타우병증으로 진전될 위험이 있는 대상체에서 타우병증의 치료에 사용될 수 있다. 대상체는 타우병증을 가진 것으로 예측될 수 있다. 대상체는 타우병증의 하나 이상의 증상을 가질 수 있다. 제제는 타우병증 또는 예측된 타우병증의 진행을 늦추기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 경우, 용어 "치료학적 유효량"은 목적한 치료 요법에 따라 투여된 경우, 충분한 이익/위험 비에 비례하는, 일부 목적한 치료학적 목적을 생산하는데 효과적인 본 발명의 조합 방법론의 실행시 사용된 제제의 양에 관한 것이다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 또한 예방학적 척도로서의 치료를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 대상체에서 타우병증의 예방학적 치료 방법을 제공하고, 이러한 방법은 본 발명의 방법에 의해 확인된 제제를 상기 대상체에게 투여함을 포함한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "예방학적 유효량"은 목적한 치료 요법에 따라 투여된 경우, 충분한 이익/위험 비와 비례하여, 일부 목적한 예방학적 효과를 생산하는데 효과적인 본 발명의 방법에 의해 확인된 제제의 양에 관한 것이다. 본 명세서의 문맥에서 "예방"은 완전한 성공, 즉, 완전한 보호 또는 완전한 예방에 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 오히려 본 문맥에서 예방은 이러한 특수한 상태를 지연, 완화 또는 회피에 도움을 줌으로써 건강을 보존할 목적으로 증상 상태의 검출에 앞서 투여되는 조치를 지칭한다.
본 발명의 제2 및 후속적인 양태의 바람직한 특징은 제1의 양태에 필요한 변경을 가한 것(mutatis mutandis)에 대한 것이다.
본 발명의 제2 양태에 따라서,
(a) 뉴우런 세포를 제제의 존재하에 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에 Tau 단백질의 단편과 배양하는 단계; 또는
(b) 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 배양하고 후속적으로 제제의 존재하에서 뉴우런 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행한 후에, 뉴우런 세포 내 Tau 단백질의 단편의 내재화를 측정하는 단계를 포함하여, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호:4) 내 적어도 70개 아미노산 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 내재화를 억제하는데 효과적인 제제에 대해 스크리닝하는 방법이 제공된다.
본원에 기술된 바와 같이, 상기 정의한 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 내재화는 불용성 tau 종(즉, 응집체), 비정상적인 인산화 및 내인성의 전체 길이(full-length) Tau 단백질의 트렁케이션(truncation)의 생산을 야기한다.
본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 내재화의 억제는 면역형광성 및/또는 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy; TEM)을 사용하여 검정할 수 있다. 이러한 기술은 활성제의 존재 하에서 뉴우런 세포에 의해 내재화된 Tau 단백질의 단편의 상대적인 양을 나타낼 수 있다. 적합한 양성 및 음성 대조군을 또한 본원에 기술된 바와 같이 제조하여 제제의 존재하에서 공지된 억제 활성 및 기본선 활성 각각을 지닌 제제에 대한 공지된 수준의 활성을 확립할 수 있다.
면역형광성을 사용하는 방법에서, 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편은 검출가능한 형광성 표지로 표지할 수 있다. 방법은 적합한 형광단에 연결된 단일(1차) 항체를 사용할 수 있고 여기서 항체는 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편을 특이적으로 인식하고 이에 결합한다. 대안적으로, 방법은 2개의 항체를 사용할 수 있고, 여기서 표지되지 않은 제1(1차) 항체는 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편을 특이적으로 인식하여 이에 결합하고, 형광단으로 표지된 2차 항체는 1차 항체를 인식하여 이에 결합한다.
면역금(Immunogold) 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy; TEM)은 본원에 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 항체에 부착될 수 있는 콜로이드성 금 입자를 사용한다. 콜로이드성 금 입자는 본원에 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 1차 항체에 부착될 수 있거나, 콜로이드성 금 입자는 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 1차 항체를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 2차 항체에 부착될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 내재화는 또한 Tau 단백질의 검출가능하게 표지된 단편, 예를 들면, Tau 단백질의 형광성 표지된 단편을 사용하여 검정할 수 있다.
따라서, 뉴우런 세포 내에서 Tau 단백질의 단편의 내재화 억제를 측정하는 단계는 뉴우런 세포내에 내재화된 Tau 단백질 단편의 상대적인 양을 가시화하기 위해 사진술 또는 TEM을 사용할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이 처리된 세포의 면역형광성 및 면역금 투과 전자 현미경검사(TEM)는, 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편, 예컨대, 예를 들면, dGAE는 세포의 엔도솜/라이소솜 구획 내에서 축적된다.
항온처리 후, 뉴우런 세포를 영상화하고, 예를 들면, "ImageJ"와 같은 적합한 분석 프로그램을 사용하여 분석함으로써, 세포체 내 형광성 강도를 정량함으로써 내재화의 판독을 제공하고 통계적 분석을 수행하여 양성 및 음성 대조군의 형광성 감도를 제제 처리된 샘플과 비교할 수 있다. 세포의 수는 계수하여 시야에서 세포의 상이한 수를 고려하여 평균 형광성/세포로서 내재화의 수준을 나타낼 수 있다.
검정 결과가 이러한 제제가 Tau 단백질의 단편의 내재화를 나타낼 수 있는지의 여부를 확립하기 위한 적합한 방법은 통계 시험, 즉, 차이의 유의성(예컨대, 비쌍식 T 시험)을 나타내기 위한 통계 시험의 수단으로 수행될 수 있다. 따라서, 환원은 내재화에서 통계적으로 유의적인 감소일 수 있다. 예를 들면, Tau 단백질의 단편은 대조군 배양 배지, 예컨대, DMEM 성장 배지 속에서 뉴우런 세포에 대해 20% 억제의 대조군 값과 비교하여 뉴우런 세포의 배양물 속에서 Tau 단백질의 단편의 내재화의 40% 내지 60% 억제를 야기할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 Tau 단백질의 단편의 내재화 억제를 위한 검정을 제제의 부재하에 또는 처리 비히클의 존재하에 처리한 세포에 대해 수득된 결과에 대해 적합하게 표준화할 수 있다. 약 2 μM 이하의 적합한 농도에서 제제를 사용하여 50% 억제를 나타내는 화합물은 내재화의 활성 억제제로서 고려될 수 있다. 따라서 상대 활성을 또한 본원에 기술된 바와 같은 방법에 따라 상이한 제제에 대해 비교할 수 있다.
본 발명의 방법은 공지된 활성을 지닌 양성 대조군으로서 제제의 활성을 확립시키는 단계를 포함할 수 있다. 양성 대조군으로서 사용하기 위한 Tau 단백질의 단편에 대해 확립된 억제 활성을 지닌 공지된 시험 화합물의 예는 메틸렌 블루(MB 또한 염화 메틸티온니늄으로서 공지됨) 또는 LMT(류코-메틸티온니늄 비스-하이드로메탄설포네이트, LMTM; 또한 LMT-X 또는 TRx0237로서 공지됨)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 따라 검정된 제제의 활성은 양성 대조군에 대해 비교할 수 있다.
본 발명의 방법은 음성 대조군(공지된 활성이 없음)을 사용하여 제제의 활성이 없는 것에 대해 기본선을 확립하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 음성 대조군의 예는 뉴우런 세포용의 배양 배지, 포스페이트 완충된 염수 용액, 또는 유사의 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 검정된 제제의 활성은 음성 대조군과 비교할 수 있다.
임의로, 본 발명의 방법은 타우병증을 지닌 대상체를 상기 제제, 또한 임의로 예를 들면, 타우병증의 치료에 적합한 다른 치료학적으로 활성인 물질로 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 양태에 따라서,
(a) 뉴우런 세포를 제제의 존재하에서 배양하고 뉴우런 세포를 헤파린의 존재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하는 단계; 또는
(b) 뉴우런 세포를 Tau 단백질의 단편과 헤파린의 부재하에서 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 제제의 존재하에서 배양하는 단계; 및
(c) 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행하기 전에 Tau 단백질의 단편과 뉴우런 세포 내 내인성 Tau 단백질의 상호작용 정도를 측정하는 단계를 포함하여, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편과 내인성 tau 단백질의 상호작용을 파괴하는데 효과적인 제제에 대해 스크리닝하는 방법이 제공된다.
Tau 단백질의 단편과 내인성 Tau 단백질 사이의 상호작용의 파괴는 본원에 기술된 바와 같은 면역형광성 및/또는 면역금 투과 전자 현미경검사(TEM)를 사용하여 적합하게 검정할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 내재화는 불용성 tau 종(species)의 생산, 비정상적인 포스포릴화 및 내인성의 전체 길이의 Tau 단백질의 트렁케이션을 야기한다.
처리된 세포의 면역형광성 및 면역금 TEM은 Tau 단백질 또는 이의 단편, 예컨대, 예를 들면, dGAE의 응집체가 세포의 엔도솜/라이소좀 구획 내에서 축적된다. Tau 단백질과 내인성 Tau 단백질의 단편의 파괴는 Tau 단백질의 단편과 내인성 Tau 단백질 사이의 상호작용의 억제로서 기술될 수 있다.
따라서, Tau 단백질의 단편과 뉴우런 세포 내 내인성 Tau 단백질 사이의 상호작용의 파괴를 측정하는 단계는 사진술 또는 TEM을 사용하여 Tau 단백질 단편 및 뉴우런 세포 내 내인성 Tau 단백질의 상대적인 상호작용을 가시화할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 면역형광성 및/또는 면역금 TEM을 사용하여 Tau 단백질의 단편과 활성제의 존재하에서 뉴우런 세포에 의해 내재화된 내인성 Tau 단백질 사이의 상호작용의 상대적인 파괴를 나타낼 수 있다. 적합한 양성 및 음성 대조군을 또한 본원에 기술된 바와 같이 제조하여 공지된 억제 활성을 지닌 제제에 대한 공지된 수준의 활성 및 제제의 부재하에서 기본선 활성 각각을 확립할 수 있다.
검정의 결과가 제제가 Tau 단백질의 단편과 내인성 Tau 단백질의 상호작용을 파괴할 수 있는지의 여부를 확립하는데 적합한 방법은 통계 시험, 즉, 차이의 유의성을 시험하기 위한 통계 시험(예컨대, 비쌍식 T 시험)의 수단으로 수행할 수 있다. 따라서, 감소는 Tau의 단편과 내인성 Tau 단백질의 상호작용의 파괴에서 통계적으로 유의적인 감소일 수 있다. 예를 들면, 상호작용의 파괴로서 제공될 수 있는 Tau 단백질의 단편은 대조군 배양 배지, 예컨대, DMEM 성장 배지 속에서 뉴우런 세포 배양물에 대해 20% 억제인 대조군 값과 비교하여 뉴우런 세포의 배양물 속에서 Tau 단백질의 단편과 내인성 Tau 단백질의 상호작용의 40% 내지 60% 파괴를 야기할 수 있다.
Tau 단백질의 단편과 본 발명의 방법에 따른 내인성 Tau 단백질의 상호작용의 파괴에 대한 검정은 제제의 부재하에 또는 처리 비히클의 존재하에 처리된 세포에 대해 수득된 결과에 대해 적합하게 표준화시킬 수 있다. 약 2 μM 이하의 적합한 농도에서 제제를 사용하여 50% 활성을 나타내는 화합물을 상호작용의 활성 억제제인 것으로 고려할 수 있다. 따라서, 상대 활성을 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 상이한 제제에 대해 비교할 수 있다.
본 발명의 방법은 공지된 활성을 지닌 양성 대조군으로서 제제의 활성을 확립하는 단계를 포함할 수 있다. 양성 대조군으로서 사용하기 위한 Tau 단백질의 단편에 대해 확립된 억제 활성을 지닌 공지된 시험 화합물의 예는 메틸렌 블루(염화 메틸티온니늄으로서 또한 공지된 MB) 또는 LMT(류코-메틸티온니늄 비스-하이드로메탄설포네이트, LMTM; 또한 LMT-X 또는 TRx0237로서 공지됨)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 따라 검정된 제제의 활성은 양성 대조군과 비교할 수 있다.
본 발명의 방법은 음성 대조군(공지된 활성이 없음)을 사용하여 제제의 활성이 없는 것에 대한 기본선을 확립시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 음성 대조군의 예는 뉴우런 세포에 대한 배양 배지, 포스페이트 완충된 염수 용액, 또는 유사의 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 검정된 제제의 활성은 음성 대조군과 비교할 수 있다.
임의로, 본 발명의 방법은 타우병증을 지닌 대상체를 상기 제제, 또는 임의로 예를 들면, 타우병증의 치료에 적합한 다른 치료학적으로 활성인 물질로 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 양태에 따라서, (i) 뉴우런 세포주, (ii) dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 (iii) 제제의 라이브러리(library)를 포함하는, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호:4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 세포독성을 억제하는데 효과적인 제제에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이 제공되고, 여기서 뉴우런 세포주는 헤파린을 포함하지 않는다.
제제의 라이브러리는 뉴우런 세포에서 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체의 효과를 변경시킬 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 목적한 임의의 제제를 포함할 수 있다. 제제는 임의의 약제학적으로 활성인 분자 또는 물질, 예를 들면, 화합물 또는 생물학적 분자, 적합하게는, 특이적인 결합 분자, 예를 들면, 항체일 수 있다. 라이브러리는 화학적 화합물의 라이브러리 또는 특정 결합 분자의 라이브러리일 수 있다.
본 발명의 이러한 시스템은 뉴우런 세포주의 세포 집단; dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 제제의 라이브러리를 포함하는 부분들의 키트(kit of parts) 형태로 제공될 수 있고; 여기서 뉴우런 세포주는 헤파린을 포함하지 않는다. 본 발명의 이러한 시스템 또는 키트는 또한 사용 설명서를 제공할 수 있다. 세포는 본원에 기술된 바와 같은 적합한 성장 또는 배양 배지 속에 제공될 수 있다. 세포는 또한 적합한 용기(container) 속에 제공될 수 있다.
본 발명의 시스템에 관한 본 발명의 제4 및 후속적인 양태의 다른 바람직한 특징은 상술한 바와 같다.
본 발명의 제5 양태에 따라서, (i) 뉴우런 세포주, (ii) dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호:4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 (iii) 제제의 라이브러리를 포함하는, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호:4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 내재화를 억제하는데 효과적인 제제에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이 제공되고; 여기서 뉴우런 세포주는 헤파린을 포함하지 않는다.
제제의 라이브러리는 뉴우런 세포에서 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체의 효과를 변경시킬 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 목적한 제제를 포함할 수 있다. 제제는 약제학적으로 활성인 분자 또는 물질, 예를 들면, 화합물 또는 생물학적 분자, 적합하게는 특정 결합 분자, 예를 들면, 항체일 수 있다. 라이브러리는 화학적 화합물의 라이브러리 또는 특정 결합 분자의 라이브러리일 수 있다.
본 발명의 이러한 시스템은 뉴우런 세포주, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 제제의 라이브러리를 포함하는 부분들의 키트 형태로 제공될 수 있고; 여기서 뉴우런 세포주는 헤파린을 포함하지 않는다.
본 발명의 제6 양태에 따라서, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편과 (i) 뉴우런 세포주, (ii) dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 (iii) 제제의 라이브러리를 포함하는 내인성 Tau 단백질의 상호작용을 파괴하는데 효과적인 제제에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이 제공되고; 여기서 뉴우런 세포주는 헤파린을 포함하지 않는다.
제제의 라이브러리는 뉴우런 세포에서 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질 또는 이의 단편의 응집체의 효과를 변경시킬 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 목적한 제제를 포함할 수 있다. 제제는 임의의 약제학적으로 활성인 분자 또는 물질, 예를 들면, 화합물 또는 생물학적 분자, 적합하게는 특이적인 결합 분자, 예를 들면, 항체일 수 있다. 라이브러리는 화학적 화합물의 라이브러리 또는 특이적인 결합 분자의 라이브러리일 수 있다.
본 발명의 이러한 시스템은 뉴우런 세포주; dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산; 및 제제의 라이브러리를 포함하는 Tau 단백질의 단편을 포함하는 부분들의 키트의 형태로 제공될 수 있고; 여기서 뉴우런 세포주는 헤파린을 포함하지 않는다.
본 개시내용은 본원에 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 가용성 및 단편, 즉, Tau 단백질의 응집된 형태, 예를 들면, Tau 단백질 단편 dGAE의 세포 흡수를 탐구할 수 있는 방법을 기술하고 있다. 분화된 SH-SY5Y 신경아세포종 세포로의 tau 내재화의 하부 결과는 구조적 및 생화학적 분석과 함께 형광성 및 전자 현미경검사를 사용하여 시험할 수 있다.
본 발명의 임의의 양태의 방법 또는 시스템의 구현예에서, 미분화된 뉴우런 세포를 다중-웰 플레이트(multi-well plate)에 적합한 농도(예를 들면, 웰 당 30,000개 세포)에 플레이팅하고 앞서 기술된 바와 같이, 고갈된 혈청 배지 속에서 레티노산을 사용하여 분화시키거나, 미분화된 상태로 둘 수 있다. 이후에, 세포는 다음의 방법 중 하나로 처리할 수 있다:
(1) 세포를 본원에 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편(이러한 단편은 또한 au 응집체로서 또한 지칭될 수 있다)을 첨가하기 전에 목적한 제제의 존재하에서 예비-항온처리하거나; (2) 세포를 동시에 투여된 목적한 제제 및 tau 응집체와 함께 공-항온처리한다.
세포는 각각의 단계에서 12, 24, 또는 48시간 동안 항온처리할 수 있다. 예를 들면, 세포는 (1)의 경우 총 시간이 48시간 이고 (2)의 경우 24시간임을 의미하는 24시간 동안 항온처리될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같이, Tau 단백질 단편 dGAE-488(예를 들면, 1 μM의 농도에서 사용됨)은 내지화된 Tau 단백질이 관찰되기에 충분한 24시간 동안 세포와 함께 항온처리할 수 있다.
항온처리 후, 세포를 사진을 찍고 영상의 분석을 적합한 분석 소프트웨어 프로그램(예를 들면, ImageJ)을 사용하여 수행함으로써 세포체 내에서 형광성 강도를 정량화할 수 있다. 형광성 강도의 정량화는 Tau 단백질 내재화의 척도(measure)를 제공할 수 있다.
세포의 수는 시야에서 세포의 상이한 수를 고려하여 평균 형광성 강도/세포로 계수할 수 있다.
일 구현예에서, Tau 단백질의 단편, 예를 들면, dGAE-488은 적합한 농도, 예를 들면, 약 1 μM의 농도에서 가해질 수 있다. 스크리닝을 위한 제제는 초기에 단일 농도, 예를 들면, 10 μM에서 시험할 수 있고; 억제 활성을 나타내는 제제를 이후 농도의 범위, 예컨대, 예를 들면, 약 2 μM 내지 약 20 nM의 범위에 걸쳐 시험할 수 있고 화합물의 활성은 예를 들면, 활성의 50% 억제가 관찰된 농도로서 보고되었다.
본 발명의 방법 또는 시스템에 따라 측정된 활성은 본원에 기술된 바와 같이, (i) tau의 내재화(예를 들면, 본원에 기술된 바와 같이 Tau 단백질의 검출가능하게 표지된 단편의 세포내 형광성에 의해 측정된 바와 같음); (ii) 본원에 기술된 바와 같이 Tau 단백질의 검출가능하게 표지된 단편의 세포내 응집(예를 들면, 세포를 수거하고, 이를 용해하고 초원심분리에 의해 Tau 단백질의 표지된 단백질을 분리하고 응집된 tau를 측정(예를 들면, 항-tau 항체를 사용한 면역블롯(immunoblot)에 의해)함으로써 측정된 바와 같음)); 및 (iii) 세포 사멸(cell death)을 측정하기 위한 본원에 기술된 바와 같은(예를 들면, 적합한 세포독성 검정(예를 들면, ReadyProbes® 검정)을 사용하여 측정된 바와 같음) Tau 단백질의 단편의 세포독성을 포함할 수 있다(참고: 예를 들면, 도 2a).
활성은 제제의 부재하에 또는 처리 비히클의 존재하에 처리된 세포에 대해 수득된 결과에 대해 표준화할 수 있다. 적합하게는, 2 μM 이하에서 시험한 제제로 50% 억제를 나타내는 화합물은 활성인 것으로 고려된다. 본원에 기술된 방법 및 시스템은 또한 상대 활성이 상이한 제제에 대해 비교되도록 한다.
본원에 기술된 연구의 결과는 조립된 dGAE가 가용성의 응집되지 않은 형태보다 보다 급성의 세포독성을 나타냄을 나타낸다. 결과적으로, 가용성 형태는 훨씬 더 보다 용이하게 내재화되고, 세포 내에 존재하면, 내인성 tau와 연합하여 내인성 tau의 증가된 포스포릴화 및 응집을 야기하고, 이는 세포의 라이소솜/엔조솜 구획내에 축정된다. 가용성 올리고머 형태가 급성 독성없이 tau 병리학을 증식시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 본원에 기술된 연구는 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 세포독성, 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 내재화 및/또는 내인성 Tau 단백질과 본원에 기술된 바와 같은 Tau 단백질의 단편의 상호작용에 의해 측정된 것으로서 Tau 단백질의 단편의 활성을 억제하는데 있어서 제제의 활성을 측정하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다.
본원에 나타낸 결과는 응집된 dGAE가 세포독성이지만 가용성의 비-원섬유(non-fibrillar) dGAE가 급성 독성이 아니고 뉴우런-유사 세포에 의해 흡수됨을 나타낸다. 내재화는 불용성 tau 종, 비정상적인 포스포릴화 및 내인성의 전체 길이의 tau의 트렁케이션의 생산을 야기한다. 처리된 세포의 면역형광성 및 면역금 TEM은 dGAE가 세포의 엔도솜/라이소솜 구획 내에 축적됨을 나타낸다. 따라서, Tau 단편의 내재화의 하부 결과는 세포독성, 불용성 tau 종으로의 응집 및 tau의 트렁케이션/포스포릴화이다.
본원에 기술된 시험의 24시간 기간에서, 세포 사멸의 증가는 응집된 dGAE에 대한 분화된 신경아세포종 세포의 노출 후 관찰되었지만 가용성 dGAE로 처리한 세포의 생존능에서는 최소의 차이로 관찰되었다.
본원에 사용된 조건 하에서, 응집된 dGAE는 24시간의 항온처리 기간 후 분화된 신경아세포종 세포에 대해 보다 급격하게 독성인 것으로 여겨졌다. 심지어 보다 높은 농도에서 최소로 독성이지만, 그럼에도 불구하고 이의 가용성 형태에서 dGAE는 2시간 노출 이내에 분화된 신경아세포종 세포 내로 내재화되었다. 교반 후, dGAE-488은 훨씬 덜 효율적으로 내재화된다. 본 연구에서, 응집된 제제를 사용한 일부 내재화가 관찰되었지만 이는 필라멘트의 제조 동안 용액 속에 남은 가용성 또는 부분 가용성 종일 수 있다. 교반된(agitated) dGAE-488은 tau 조립체의 크기의 혼합물을 함유하며, 이들 중 일부는 내재화되고 이들 중 일부는 내재화되지 않는 경향이 있다. 내재화되는 정확한 종은 해결되지 않고 남아있지만, 가용성 dGAE 제제는 다수(manifold)의 올리고머 형태를 나타내는 10 내지 80 nm의 범위의 직경의 응집체로 이루어져 있다(도 1a).
또한, 0h dGAE가 독성이 되는데 걸리는 시간은 이러한 시험의 기간보다 더 길 수 있다. 본원에 기술된 내재화는 응집 또는 세포 흡수를 위한 외인성 인자를 필요로 하지 않는다.
본 연구는 내인성 tau가 보충될 수 있고 세포질 내로 가용성 dGAE의 흡수 후 불용성 형태로 전환되는지의 여부를 연구하였다. 세포내이입된(endocytosed) tau와 세포질성 tau의 상호작용은 사람 tau의 과발현을 요구한 다양한 세포 모델에서, 또는 단백질 전달 제제의 도움으로 외인성 tau를 도입함으로써 이미 연구되었다.
본원에 나타낸 데이타는 dGAE의 가용성 형태와의 항온처리가 AD에서 tau 병리학과 일치하는, 정상 수준의 내인성 tau를 지닌 세포 내에서 내인성 포스포-tau의 국소 증가를 야기함을 나타낸다. 내인성 Tau 단백질의 포스포릴화 상태를 프로브(probe)하기 위한 반복체 도메인(repeat domain) 외부의 에피토프를 인식하는 항체와 함께 dGAE-488을 사용하여, T231 및 S202-T205에서 내인성 tau의 포스파릴화의 증가가 존재함을 본원에서 밝혔다. 이러한 변하는 순차적인 추출 후 불용성 포스포릴화된 Tau 단백질의 수준에서의 증가를 동반하지만, 전체 분해물에서는 그렇지 않다. 전체 분해물로부터의 웨스턴 블롯(western blot)은 AT80 또는 AT180을 사용하여 포스포-tau 수준에서 어떠한 명확한 차이도 나타내지 않으며 이는 전체 수준이 일정하게 남아있지만 국소 포스포-tau 수준은 면역형광성 및 후속적인 순차적인 추출에 의해 나타난 바와 같이 불용성/응집된 tau의 영역 내에서 증가함을 시사할 수 있다. dGAG의 가용성 형태의 흡수 후 응집의 유도 또는 증가된 포스포릴화의 메카니즘은 당해 단계에서 알려져 있지 않다. 이러한 트렁케이트된 tau 종은 어떠한 포스포릴화 요구없이 자발적으로 자가-응집할 수 있다. 여기서, 본 발명자는 dGAE가 내인성 tau와 공-응집하고(co-aggregate) 이는 엔도솜/라이소솜 구획 내에서 함께 축적됨을 나타낸다.
본 개시내용은 세포에 의해 내재화된 dGAE의 대부분이 라이소솜 구획에 국소화됨을 나타낸다. 면역금 TEM을 사용하여, 소낭 구조(vesicular structure)에 대한 dGAE-488의 국소화(localisation)를 라이소솜 구획을 제시하는 크기 범위로 입증하였다.
면역형광성 및 TEM 발견은 함께 엔도-라이소솜 구획 내에서 dGAE 및 내인성 tau 둘 다의 축적을 시사한다. 이러한 발견은 tau의 병리학적 형태의 내재화 후 세포의 초구조(ultrastructure)에서 신규 관점을 제공하며 자가소화 경로(autophagy pathway)가 이의 분해에 연루될 수 있음을 시사한다.
tau의 생리학적 및 병리학적 형태는 프로테오솜 및 자가소화 시스템에 의해 명확해지며 병리학적 tau는 자가소화-라이소솜 시스템에 의해 우선적으로 분해됨을 시사하였다. 병리학적 tau의 축적이 이러한 분해 공정의 정상적인 기능화를 방해할 수 있는 것이 가능하다. AD에서, 병리학적 tau의 불완전한 제거(clearance)가 신경 기능장애(neuronal dysfunction)에 기여할 수 있음을 시사하는 라이소솜에 의한 자가소화 소낭(autophagic vacuole)의 손상된 분해를 뒷받침하는 것이 존재한다. 축적된 tau 종이 세포로부터 제거될 수 있는 방법을 이해하는 것은 tau 응집의 억제 뿐만 아니라 상보적인 치료학적 접근법의 개발을 허용할 수 있다.
가용성 dGAE가 자가-조립하여 뉴우런 세포 내로 내재화하는 용이성은 세포 환경에서 이의 자가-조립의 효과, 특히 급성 독성에서 이의 효과 및 포스포릴화 상태에서 이의 영향 및 초구조 수준에서 내인성 tau의 불용성을 연구하는 것을 가능하도록 한다. 이러한 접근법은 단백질의 임의의 과발현의 부재하에서 tau 응집, 해독 후 변형, 또는 조립, 및 궁극적으로 AD 및 관련된 타우병증에서 tau 씨딩 및 뉴우런 전달을 표적화하는 tau 응집 억제제의 작용 메카니즘을 연구하기 위한 유도인자를 연구하기에 유용한 도구를 제공할 것이다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 제2 및 후속적인 양태의 바람직한 특징은 제1 양태에 필요한 변경을 가한 것이다.
본 발명을 이제 단지 참고 목적으로 포함하고 본 발명을 제한하는 것으로 고려되지 않아야 하는 다음의 실시예를 참고로 추가로 기술할 것이며, 참고는 또한 다수의 도면에 대해 이루어지고 여기서:
도 1은 구조적으로 유사한 원섬유를 형성하기 위한 dGAE 및 dGAE-488 자가-조립체를 나타낸다. dGAE 및 dGAE-488는 100 μM에서 72시간 동안 항온처리하였다. 조립체 혼합물의 분취량을 음성-염료 TEM, SDS-PAGE 겔 전기영동 및 DC 분광기에 대한 섬유화 전(0 h) 및 후(72 h)에 취하였다. (A) 0 h 및 72 h에 교반에서 dGAE 종의 전자 현미경사진. 기준자(scale bar): 500 nm. 중간 패널은 좌측 패널에서 백색 박스의 보다 높은 확대이다(기준자: 200 nm). (B) 꼬마지에 염료(Coomassie stain)(좌측 패널) 및 형광성(우측 패널)으로 나타낸 dGAE 및 dGAE-488의 비-환원 SDS-PAGE 겔. 검정색 화살촉은 웰 내 단량체 및 이량체, 사량체 및 불용성 원섬유를 나타낸다. (C) 0 h 및 72 h 교반에서 dGAE 및 dGAE-488에 대한 전체 조립체 혼합물의 CD 스펙트럼.
도 2는 응집된 dGAE에 대한 노출이 증가된 세포 사멸을 야기하지만 가용성(단량체/이량체) dGAE는 증가된 세포 사멸을 야기하지 않음을 나타낸다. 100 μM의 dGAE를 72 시간 동안 교반하여 원섬유를 생산하였다. 가용성(0 h) 또는 응집된(72 h) 종(1 μM)을 세포에 가하고 24시간 동안 항온처리되도록 하였다. (A) ReadyProbes® 시약과 함께 완충제 또는 dGAE에 대한 노출 후 대표적인 시야 영상은, 청색의 총 핵 및 녹색의 죽은 세포의 핵을 나타낸다. 기준 자(scale bar): 100 μm (B) 세포 사멸의 퍼센트는 모든 조건에 대해 정량하였다. 나타낸 데이타는 4 내지 6개의 별개의 시험으로부터의 6개의 시야로부터의 평균 ± SEM이다. 일-원(one-way) ANOVA는 그룹 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(F = 11.26, R2 = 0.12, p < 0.0001). 던넷 다중 비교(Dunnett's multiple comparison)는 완충제 만으로 처리한 세포(21.6 ± 1.6%) 및 dGAE 원섬유로 처리한 세포(72 h dGAE) 사이에 유의적인 차이(34.0 ± 2.9%)(p < 0.0001)를 나타내지만 완충제-처리된 세포와 가용성 dGAE-처리된 세포 사이에는 유의적인 차이가 없음을 나타낸다(24.1 ± 1.2%).
도 3은 가용성 dGAE-488이 dSH-SY5Y 세포 내로 용이하게 내재화됨을 나타낸다. (A) 1 μM의 가용성 dGAE-488(교반되지 않음) 또는 72시간 교반된(응집된)) dGAE를 dSH-SY5Y 세포의 배지에 가한 다음 고정시키고 24시간 노출 후 공초점 현미경검사(confocal microscopy)로 가시화하였다. 모든 기준자: 20 μm. (B) 세포 체 내에서 488 형광성 강도를 6개의 별개의 시험으로부터 N = 273개의 세포(0 h) 및 3개의 별개의 시험으로부터 N = 120개의 세포(72 h)로부터의 x-스택(z-stack)의 중간으로부터 정량하였다. 웰치 보정(Welch's correction)을 사용한 비쌍식 t-시험은 0 시간째(1114 ± 66.75 AU)와 72 시간째(474.1 ± 95.97 AU) 사이의 488 형광성 강도에서의 유의적인 차이를 나타낸다(t = 5.475, df = 237.7, R2 = 0.112, p < 0.0001). 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다. (C) 5 μM의 가용성 dGAE-488(교반되지 않음)의 내재화는 t = 0 h 내지 t = 14 h에서 공초점 현미경검사 사용하여 살아있는 것으로 모니터링되었다. 488-양성 부점(puncta)은 dGAE-488의 초기 첨가 후 2시간째로부터 세포 체 및 신경돌기 내로 내재화되어 관찰되었다(백색 화살표). 기준 자: 50 μm. (D) 24시간 노출 후 내재화된 가용성 dGAE-488의 보다 높은 확대 영상은 세포 체 내 반점 패턴(punctate pattern)(백색 화살표) 및 보다 큰 핵주위 축적(적색 화살표)를 나타낸다. 기준 자: 15 μm. 하나의 z-슬라이스는 모든 패널에 대해 세포 체의 중간으로부터 나타낸다.
도 4는 dGAE-488에 대한 노출이 dSH-SY5Y 세포에서 내인성 포스포-tau의 축적을 초래함을 나타낸다. 1 μM의 가용성 dGAE-488(교반되지 않음)을 24시간 동안 dSH-SY5Y 세포의 배지에 가하였다. 세포를 p-tau 항체(Ai) AT180, (Bi) AT8 및 (Ci) 탈포스포릴화된 Tau-1을 사용하여 내인성 tau에 대해 면역표지하였다. 하나의 z-슬라이스를 세포체의 중간으로부터 나타낸다. 직교 뷰(orthogonal view)를 Ai 및 Bi로 나타내어 dGAE-488과 내인성 tau의 잠재적인 공국소화(colocalisation)를 나타낸다. 기준 자: 20 μm. 각각의 패널은 완충제-처리된 세포의 퍼센트로서 형광성 강도의 정량화를 나타낸다. (Aii) AT180 형광성의 정량화(4개의 별개의 시험으로부터의 N = 69개 세포(완충제), 76개 세포(dGAE)). 웰치 보정을 사용한 비쌍식 t-test은 dGAE-(143.5 ± 7.8%)와 완충제-처리된 세포(100 ± 5.2%) 사이의 AT180 형광성 강도에서 유의적인 차이를 나타낸다(t = 4.702, df = 128.2, R2 = 0.1471, p < 0.0001). (Bii) AT8 형광성의 정량화. 3개의 별개의 시험으로부터 N = 348개 세포(완충제), N = 338개 세포(dGAE). 웰치 보정을 사용한 비쌍식 t-시험은 dGAE-(270.7 ± 22.5%)와 완충제-처리된 세포(100 ± 3.51%) 사이의 AT8 형광성 강도에서의 유의적인 차이를 나타낸다(t = 7.103, df = 353.4, R2 = 0.1249, p < 0.0001). (Cii) Tau1 형광성의 정량화. 3개의 독립된 시험으로부터 N = 68개 세포(완충제), 96개 세포(dGAE). 웰치 보정을 사용한 비쌍식 t-test은 dGAE(59.17 ± 3.6%) 및 완충제-처리된 세포(100 ± 7.3%) 사이에 Tau-1 형광성 강도에서의 유의적인 차이를 나타낸다(t = 5.011, df = 99.84, R2 = 0.201, p < 0.0001).
도 5는 24시간 동안 dGAE에 대한 노출이 dSH-SY5Y 세포의 트리톤-불용성 분획내 내인성 포스포-tau의 축적을 초래함을 나타낸다. (Ai) SH-SY5Y 세포 분해물의 대표적인 웨스턴 블롯. 1 μM의 가용성 dGAE(교반되지 않음)를 dSH-SY5Y 세포의 배지에 가하였다. 24시간 후, 세포를 RIPA 완충제 속에서 분해하고 SDS-PAGE에서 작동시켰다. 블롯을 총 tau, AT180 및 AT8에 대해 프로브하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. (Aii) 50 내지 70 kDa에서 밴드의 강도를 각각의 항체에 대해 정량화하고 GAPDH에 대해 표준화하였다. AT180 및 AT8에 대해 표준화된 값은 총 tau의 비(완충제의 퍼센트)로서 나타낸다. 데이타는 3개의 별개의 시험으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 비쌍식 T-시험은 완충제-처리된 대조군과 dGAE-처리된 세포 사이에 총 tau(p = 0.3101), AT180(p = 0.4662) 또는 AT8(p = 0.2119) 면역반응성에서 유의적인 차이가 없음을 나타낸다. (Bi) 세포를 또한 트리톤-X 100 분해 완충제 속에서 순차적으로 분해하고 SDS-PAGE에서 작동시켰다. S = 트리톤-X 100 가용성 분해물; I = 트리톤-X 100 불용성 분해물. AT180-항체를 사용하여 내인성의 포스포릴화된 tau를 검출하고 GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. B) 불용성 및 가용성 분획 속의 tau의 비를 밀도측정법(densitometry)으로 정량화하고 완충제-처리된 대조군의 퍼센트로 나타낸다. 데이타는 4개의 별개의 시험(시험 당 1개의 생물학적 반복체)으로부터의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 비쌍식 t-시험은 완충제-(100 ± 0)와 dGAE-처리된 세포(139.4 ± 14.54) 사이의 불용성 tau에서 유의적인 차이(t = 2.709, df = 6, R2 = 0.5501, p = 0.0352) 및 완충제(100 ± 0)와 dGAE-처리된 세포(82.98 ± 5.48) 사이에서 가용성 tau에서 유의적인 차이(t = 3.106, df = 6, R2 = 0.6165, p = 0.0201)를 나타낸다.
도 6은 내재화된 가용성 dGAE-488이 dSH-SY5Y 세포 내에서 산성 소낭으로 국소화됨을 나타낸다. Ai) 24시간 동안 1 μM의 가용성 dGAE-488(교반되지 않음)에 노출된 세포의 대표적인 면역형광성 영상. 세포를 LysoTracker®로 표지하여 라이소솜 및 엔도솜을 포함하는 산성 소낭을 염색하였고 살아있는 것으로 영상화되었다. dGAE-488 및 LysoTracker® 표지화는 세포 체 내에서 주로 국소화된다(백색 화살표). 하나의 z-슬라이스를 세포 체의 중간으로부터 나타낸다. 기준자: 50 μm. (Aii) 완충제-처리된 세포의 퍼센트로서 LysoTracker® 형광성 강도의 정량화. 데이타는 3개의 별개의 시험으로부터 풀링된(pooled) 평균 ± SEM을 나타낸다. N = 170개의 세포(완충제), N = 146개의 세포(dGAE). 웰치 보정을 사용한 비쌍식 t-시험은 dGAE (211.9 ± 9.89%)와 완충제-처리된 세포(100 ± 5.23%) 사이의 LysoTracker® 형광성 강도에서의 유의적인 차이(t = 10, df = 222.6, R2 = 0.3101, p < 0.0001)를 나타낸다. Bi) 내재화된 dGAE-488을 함유하는 LysoTracker®로 표지된 단일 세포의 보다 큰 확대. 최종 패널은 dGAE-488와 LysoTracker®의 공국소화를 나타내는 직교 뷰(orthogonal view)를 나타낸다. 하나의 z-슬라이스를 세포 체의 중간으로부터 나타낸다. 기준 자: 10 μm. (Bii) (Bi)에서 최종 패널의 백색 선(20 μm)으로 나타낸 영역을 따라 488(녹색) 및 LysoTracker(적색)에 대한 형광성 강도의 표준화된 값. dGAE-488 및 LysoTracker®의 공국소화는 녹색과 적색 채널 사이의 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)로 확인하였다. 평균 피어슨 R 값(average Pearson's R value)은 0.8382 ± 0.036(각각의 세포에 대해 p < 0.0001)이었다(N = 7개 세포).
도 7은 내재화된 가용성 dGAE-488이 dSH-SY5Y 세포에서 소낭 구조에 국소화함을 나타낸다. dSH-SY5Y 세포를 1 μM의 가용성 dGAE-488(교반되지 않음)에 24시간 동안 노출시키고 면역금 전자 현미경검사를 진행시켰다. 항-488 항체를 사용하여 dGAE를 표지하고, 10-nm 금 입자로 검출하였다. A) 전자 현미경사진은 주요 세포 구획이 표지된, 세포의 보존된 초구조를 나타낸다: n, 핵; nu, 핵소체(nucleolus); m, 미토콘드리아; v, 소낭 구조. 검정색 화살촉은 소낭 구조를 나타낸다. 검정으로 요약된 영상은 백색 박스 내 영역의 확대된 영상을 나타낸다. 좌측 기준 자: 5 μm. 우측 기준 자: 1 μm. B) 소낭 직경의 정량화. 데이타는 2개의 별개의 시험으로부터 혼주된 평균 ± SEM으로 나타낸다. N = 34개 소낭(완충제), N = 45개 소낭(dGAE-488). 비쌍식 t-시험은 완충제(303.7 ± 20.03)와 dGAE-처리된 세포(478.4 ± 22.48) 사이의 소낭 직경에서 유의적인 차이(t = 5.601, df = 77, p < 0.0001, R2 = 0.2895)를 나타내었다. C) 완충제-처리된 세포와 dGAE-488 처리된 세포로부터의 소낭 구조의 보다 높은 확대 전자 현미경사진. 검정색 화살촉은 금 입자의 일부 예를 나타낸다. 기준 자: 200 nm.
도 8은 항체의 존재 및 부재하에 조립되 dGAE의 투과 전자 현미경검사 영상을 나타낸다. (A) dGAE(100 μM); (B) dGAE(25 μM); (C) dGAE(10 μM); (D) dGAE(100 μM) + s1D12(25 μM; 4:1); (E) dGAE(25 μM) + s1D12(25 μM; 1:1); (F) dGAE(10 μM) + s1D12(2.5 μM; 4:1); (G) dGAE(10 μM) + 항-오브알부민(2.5 μM; 4:1); (H) s1D12(25 μM); (I) 항-오브알부민(2.5 μM). 원섬유는 s1D12(A-C)의 부재하에서의 제제 또는 비-tau IgG 항체, 항-오브알부민(G)의 존재하에서 제조된 dGAE의 대조군 속에서만 관찰된다. s1D12를 1:1 또는 4:1dGAE 단백질:항체 비에서 조립 혼합물에 가하는 경우(D, E, 및 F), 원섬유 형성을 관찰되지 않는다. 원섬유는 또한 dGAE의 부재하에서 항체 대조군으로부터 부재한다(H 및 I). 기준 자(모든 패널에 대해 I), 200 nm.
도 9는 (A) 25 μM s1D12(4:1의 비) 및 항체 단독 존재(사선) 및 부재(실선) 하에서 (B) 감해진 항체 스펙트럼 하에서 100 μM dGAE의 밀리도(mdeg)의 CD 스펙트럼을 나타낸다. dGAE(실선)은 b-시이트(sheet) 구조(~200 nm에서 양성, ~220 nm에서 음성)를 나타내지만 s1D12 스펙트럼을 감하는 경우 랜덤 코일(~200 nm에서 음성, ~220 nm에서 양성)을 나타내고(B; 사선 및 점선), 이는 dGAE가 원섬유로 조립되지 않음을 나타낸다.
도 10은 ThS와 함께 항온처리한 샘플의 형광성을 나타낸다. 483 nm에서 방출 피크(emission peak)가 25(A, 1:1) 및 100 μM(B, 4:1)의 dGAE(실선)로 명확하게 관찰되며, 이는 s1D12를 조립체 혼합물에 포함시킨 경우 없어지며(사선), 이는 s1D12를 포함하지 않는 샘플 만이 자가-조립된 아밀로이드 원섬유를 함유함을 나타낸다. 점선은 s1D12 만이 형광성에 기여하지 않음을 나타낸다.
물질 및 방법
재조합 dGAE의 제조
정제된 재조합 트렁케이트된 tau(dGAE, 2N4R tau로부터의 넘버링을 사용하는 아미노산 잔기 297 내지 391에 상응함)를 연구 전체에서 사용하였다. 재조합 Tau 단백질 297 내지 391을 문헌: Al-Hilaly et al., J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)에 이미 기술된 바와 같이 정제하였다. 정제 후, dGAE는 주로 랜덤 코일 구조로 존재하며 주로 Al-Hilaly et al., J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)에서 이미 특징화되고 기술된 바와 같이 가용성 단량체 및 이량체로 이루어진다.
Tau 단백질의 Alexa Fluor ® 488 표지화(labelling)
형광성 태그된 Tau 단백질(dGAE-488)을 생성시키기 위해, dGAE을 200 μl의 단백질(425.2 μM)을 10 μl의 113 nM Alexa Fluor ® TFP 에스테르 및 20 μl의 1M 중탄산나트륨(pH 8.3)과 혼합시킴으로써 Alexa Fluor 488®(Life Technologies)로 공유결합으로 표지시켰다. 혼합물을 암실에서 15분 동안 실온에서 항온처리되도록 두었다. Zeba 7K MWCO 컬럼(Thermo Scientific)을 1 ml의 10 mM 포스페이트 완충제(pH 7.4)를 가하고 1,000 x g에서 2분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 평형화시켰다. 용출물을 버리고 공정을 3회 반복하였다. 단백질/염효 혼합물을 컬럼의 상부에 적가한 직 후 40 μl의 포스페이트 완충제를 가하고 1,000 x g에서 2분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 단백질 용액을 빙상(on ice)에 유지시키고 280 nm에서의 흡광도(A280)를 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도를 A494에서 염료의 흡수를 고려하여, A280 및 dGAE의 몰 소멸 계수(molar extinction coefficient)(1,400 cm-1 M-1)를 사용하여 계산하였다. dGAE는 14개의 라이신 잔기를 가지고, 이는 488개 염료가 결합할 수 있는 모든 전위 부위이다. 표지화 정도는 A494 및 염료의 몰 소멸 계수(71,000 cm-1 M-1)로 측정하였다. 단백질(dGAE-488)을 후속적인 시험을 위해 즉시 사용하거나 시험관 내에서 교반에 적용시켰다.
dGAE 및 dGAE-488의 시험관 내 조립
dGAE 및 dGAE-488의 시험관 내 조립을 문헌: Al-Hilaly et al., J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)에 이미 기술된 바와 같이 환원제의 부재하에서 수행하였다. 요약하면, 100 μM 단백질을 10 mM 포스페이트 완충제(pH 7.4) 속에서 희석시키고 37℃에서 Eppendorf ThermoMixer® 상에서 700 rpm의 속도로 72시간 동안 교반하면서 항온처리하였다. 샘플을 음성 염료 투과 전자 현미경 검사(negative stain transmission electron microscopy; TEM)를 사용하여 가시화하였다. 모든 시험을 포스페이트 완충제 속에서 스톡 100 μM dGAE를 사용하여 수행하였다.
음성 염료 TEM
dGAE 조립체 혼합물(포스페이트 완충제, pH 7.4 중 100 μM)의 분취량(4 μl)을 400-메쉬의 탄소-코팅된 격자 위에 두고 1분 동안 항온처리하였다. 과도한 용액을 여과지로 제거한 후, 격자를 4 μl의 여과된 Milli-Q 물로 1분 동안 세척하고 블롯팅하였다. 격자를 4 μl의 여과된 2%(w/v)의 우라닐 아세테이트로 1분 동안 세척하고, 무수 블롯팅하고 적어도 5분 동안 공기 건조되도록 두었다. 격자를 JEOL JEM1400-Plus 투과 전자 현미경 상에서 100 kV에서 시험하고 전자 현미경사진 영상을 4k x 4k One View (Gatan) 카메라를 사용하여 수집하였다.
원편광 이색성 분광법(Circular dichroism spectroscopy)
원편광 이색성 분광법(CD)을 Jasco 분광기 J715를 사용하여 수행하고 스펙트럼을 21℃의 유지된 온도에서 수집하였다. 단백질 샘플을 0.02 mm 경로 길이의 석영 큐벳(Hellma) 내로 두고 180 내지 320 nm에서 스캐닝하였다. CD 데이타를 몰 타원성(molar ellipticity)(deg·cm2·dmol-1)으로 전환시켰다.
세포 배양 및 dGAE 처리
미분화된 SH-SY5Y 사람 신경아세포종 세포를 10% 태아 소 혈청(FCS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 1% L-글루타민이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/영양소 혼합물 F-12(DMEM/F-12) 속에서 성장시켰다. 분화를 위해, SH-SY5Y 세포를 24-웰 플레이트 속에서 웰 당 50,000개의 세포 또는 6-웰 플레이트 속에서 웰 당 300,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 면역형광성을 위해, 세포를 Menzel-Gl
Figure pct00008
ser 커버슬립(Thermo Scientific) 위에 두었다. 살아있는 세포 영상화를 위해, 세포를 1.5-mm 커버슬립(Mattek) 상의 35-mm 디쉬에 플레이팅하였다. 분화 첫날에, 배지를 10 μM의 모든-트랜스 레티노산(RA)(Sigma-Aldrich)을 함유하는 저-혈청 배양 배지(1% FCS, 1% P/S 및 1% l-글루타민을 함유하는 DMEM/F-12)로 대체하고 세포를 48시간 동안 항온처리하였다. 3일째에, 이러한 공정을 새로운 RA로 반복하고 세포를 추가로 48시간 동안 항온처리하였다. 3일 째에, 당해 공정을 신선한 RA로 반복하고 세포를 추가로 48시간 동안 항온처리하였다. 5일째에, 세포를 혈청-유리된 배양물로 1회 세척하여 미량의 혈청을 제거하였다. 50 ng/ml 뇌-유래된 신경영양 인자(STEMCELL Technologies)를 함유하는 혈청-유리된 배양 배지(1% P/S 및 1% l-글루타민을 함유하는 DMEM/F-12)를 세포에 가하고 48시간 동안 항온처리하였다. 분화된 세포(dSH-SY5Y)를 7일째에 시험을 위해 사용하기 위해 준비하였다. dGAE 처리를 위해, 세포를 1 μM dGAE(교반없이 또는 교반 후에 가용성)에 노출시키고 24시간 동안 항온처리하였다. 모든 시험을 dSH-SY5Y 세포를 사용하여 수행하였다.
세포 생존능 검정
dGAE의 첨가 후, 세포 생존능을 ReadyProbes® 세포 생존능 영상화 키트(Cell Viability Imaging Kit)(Life Technologies)를 사용하여 측정하였다. 키트는 NucBlue® 시약을 함유함으로써 모든 세포(청색)을 표지하였고 NucGreen® 시약을 함유함으로써 죽은 세포(녹색) 만을 표지하였다. 태그된 dGAE의 경우, NucRed® 시약을 사용하여 죽은 세포(적색)를 표지하였다. 각각의 시약 1 방울을 제조 프로토콜(Life Technologies)에 기술된 바와 같이 500 μl의 배지 속의 세포에 가하였다. 세포를 시약과 함께 37℃에서 15분 동안 항온처리하고 배지를 살아있는 세포 영상화 용액(Live Cell Imaging Solution)(InvitrogenTM, Thermo Scientific)으로 대체하였다. 세포를 Zeiss Cell Observer Axiovert 200M 현미경을 사용하여 영상화하였다. DAPI 형광성을 G 365 여기 필터 및 FT 395 이색성을 지닌 LP 420 방출 필터를 사용하여 포획하였다. 녹색 형광성을 FITC 필터 세트(BP 450-490 여기 필터, BP 515-565 방출 필터 및 FT 510 이색성)를 사용하여 포획하였다. 동일한 획득 설정(acquisition setting)을 모든 반복체에 대해 사용하여 영상을 FIJI를 사용하여 분석하였다. 6개의 시야를 샘플 당 취하고 평균 4500개의 세포를 조건 당 분석하였다. 완충제-처리된 세포 사멸의 비를 영상을 흑백으로 전환시킨 다음 한계치를 수동으로 조정하고 이를 이원 영상(binary image)로 전환시켜 살아있는 DAPI-염색된 세포를 강조하였다. 세포의 수를 자동적으로 계수하였다. 죽은 세포를 동일한 방법으로 계수하고 세포 사멸을 완충제-처리된 세포의 퍼센트로 나타내었다.
세포 분해 및 분획화
세포를 0.25% 트립신-EDTA(GibcoTM) 속에 항온처리함으로써 커버슬립으로부터 탈착시킨 다음 5 ml의 배양 배지와 혼합하였다. 세포를 500 x g에서 5분 동안 우너심분리함으로써 수거하고 상층액을 버렸다. 세포 펠렛을 빙냉 PBS 속에 재현탁시키고 500 x g에서 4℃에서 원심분리하였다. 세포를 Halt TM 프로테아제 억제제(Thermo Scientific) 및 포스파타제 억제제(Thermo Scientific)를 함유하는 1% 트리톤 분해 완충액(1% 트리톤 X-100(v/v), 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스-HCl, pH 7.6) 속에서 15분 동안 빙 상에서 재현탁시켰다. 샘플을 16,000 x g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상층액을 수집하였다(트리톤-가용성 분획). 펠렛을 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 SDS 분해 완충제(1% SDS (w/v), 150 mM NaCl 및 50 mM 트리스-HCl, pH 7.6) 속에 재현탁시켰다. 샘플을 16,000 x g에서 30분 동안 실온에서 원심분리하고 상층액을 수집하였다(트리톤-불용성 분획). 트리톤-가용성 분획 속의 단백질 농도를 Pierce TM BCA 단백질 검정 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅
세포 분해물의 경우, 트리톤-가용성 단백질(20 μg) 및 등 용적의 트리톤-불용성 단백질을 5% (v/v) b-머캅토에탄올을 함유하는 램믈리 샘플 완충제(Læmmli sample buffer)(4 x)(Bio-Rad Laboratories)와 각각 혼합하고 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 재조합 단백질의 경우, 3 μg을 환원제의 부재하에 또는 비등시키면서 샘플 완충제와 혼합하였다. 모든 샘플을 5분 동안 1000 x g에서 원심분리하고 샘플을 4 내지 20% Mini-PROTEAN® 프레캐스트 겔(precast gel)(Bio-Rad Laboratories) 위에 로딩하고 120 V에서 1시간 동안 트리스-글리신 작동 완충제(25 mM 트리스, 192 mM 글리신, pH 8.3) 속에서, 또는 샘플 완충제가 겔의 끝에 도달할 때까지 작동시켰다. 꼬마지에 염색을 위해, 겔을 이중 증발시킨 물 속에서 5분 동안 3회 세척하고 ImperialTM 단백질 염료(Thermo Scientific)로 1시간 동안 염색한 다음 밤새 이중 증류수 속에서 탈염시켰다. 염색된 겔을 HP Photosmart C5280 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 겔 상의 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막(0.45 μm)으로 200 mA에서 90분 동안 이전시켰다. 막을 0.1%(v/v) 트윈-20(TBS-T)을 함유하는 트리스-완충된 염수(50 mM 트리스-HCl, pH7.4, 150mM NaCl) 중 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA) 속에서 1시간 동안 진동 하에 실온에서 차단시켰다. 막을 TBS-T 속에서 5% BSA 속에 희석시킨 1차 항체와 함께 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 다음의 1차 항체 및 희석을 사용하였다: 항-Tau(폴리클로날, 총 tau)(Thermo Scientific)(1:2500), AT180(항-pT231)(Thermo Scientific)(1:1000), AT8(항-pS202-T205)(1:1000)(Thermo Scientific), 항-GAPDH(1:5000)(Abcam). 다음 날, 막을 TBS-T 중 5% BSA 속의 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-항-마우스 항체(1:5000)(Sigma-Aldrich) 또는 HRP-항-토끼 항체(1:5000)(Abcam) 속에서 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 막을 항체 항온처리 상이에 3 x 10 min으로 TBS-T 속에서 세척하였다. 면역활성 단백질 밴드를 ECL 기질(ClarityTM, Bio-Rad)을 사용하여 검출하고 X-선 필름을 HP Photosmart C5280 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다. FIJI를 사용하여 비드를 임의 밀도측정 단위(arbitrary densitometry unit)로 정량하였다. 전체 길이의 tau(50 내지 70 kDa)에 상응하는 밴드의 밀도를 측정하고 GAPDH의 양에 대해 표준화하였다. 이러한 값을 사용하여 포스포릴화된 총 tau의 비를 계산하고, 완충제-처리된 대조군 그룹의 퍼센트로서 비를 나타내었다. 트리톤-불용성 및 가용성 단백질의 정량화를 위해, 불용성 및 가용성 분획 내 tau의 비를 식 불용성/(가용성 + 불용성) 또는 가용성/(가용성 + 불용성) 각각을 사용하여 계산하고 각각의 가용성 또는 불용성 대조군 값의 퍼센트로 나타내었다.
면역형광성
세포 배양 배지 dSH-SY5Y 세포로부터 흡입하고 PBS로 1회 세척하였다. 세포를 PBS 중 4%(w/v) 파라포름알데하이드(PFA) 속에서 15분 동안 고정시킨 후 PBS 속에서 3회 세척하였다. 투과(permeabilization) 후, 세포를 PBS 중 0.25%(v/v) 트리톤 X-100 속에서 10분 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS 중 2%(w/v) BSA 속에서 1시간 동안 차단시키고 PBS 속에서 3회 세척하였다. PBS 중 2%(w/v) BSA 속에 희석시킨 1차 항체를 세포와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 사용된 1차 항체 및 희석은 다음과 같았다: AT180(항-pT231)(1:250)(Thermo Scientific), AT8(항-pS202-T205)(1:500)(Thermo Scientific) 및 Tau1(S195, 198, 199 및 202에서 탈포스포릴화된 tau)(Merck Millipore). 세포를 PBS 중 2%(w/v) BSA 속에 희석시킨 염소 항-마우스-Alexa Fluor® 594(1:1000) (InvitrogenTM, Thermo Scientific)와 함께 1시간 동안 암실에서 항온처리하였다. 세포를 항체 항온처리 사이에 PBS 속에서 3회 세척하였다. 세포를 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 Prolong Gold 봉입제(mounting medium)을 사용하여 유리 슬라이드 위에 올려놓았다. 올려놓은 슬라이드를 암실에서 실온으로 24 내지 48시간 동안 저장한 후 영상을 찍고 4℃에서 장기간 저장을 위해 유지시켰다. 세포를 Leica SP8 공초점 현미경을 사용하여 영상을 찍었다.
산성 세포기관(acidic organelle)의 표지화
세포를 35-mm 디쉬 상에서 1.5-mm 커버슬립(Mattek) 위에서 플레이팅하였다. 부화 후, dGAE-488(5 μM)을 세포에 24시간 동안 가하였다. 라이소솜 및 엔조솜을 표지하기 위해, LysoTracker ® 레드(Life Technologies)를 배양 배지 속에서 50 nM의 최종 농도로 희석시키고 90분 동안 항온처리한 후 Leica SP8 공초점 현미경을 사용하여 사진을 찍었다.
공초점 현미경검사
모든 공초점 현미경검사 영상화를 Leica SP8 공초점 현미경을 사용하여 수행하였다. The instrument setting used PMT 3 및 PMT Trans 채널/레이저를 사용한 장치 설정 및 영상을 HC PLAPoCs2 63 x/1.40 오일-침지 대물 렌즈(oil-immersion objective len)로 획득하였다. 샘플을 순차적으로 스캐닝하여 스펙트럼 누출(spectral bleed through)을 방지하였다. 모든 영상을 0.5 μm의 단계 크기를 사용하여 모든 채널에 대해 Z-스택(Z-stack)으로서 수집하였다. 5 내지 10개의 Z-스택을 각각의 샘플에 대해 취하고 각각의 시험을 3회 이상 반복하였다. dGAE-488의 실시간 흡수를 모니터링하기 위해, 환경을 가습된 CO2로 37℃에서 유지시키고 적응형 초점 제어 특징(Adaptive Focus Control feature)을 사용하여 시험 과정 전체에서 일정한 초점 면을 유지시켰다.
TEM을 위한 세포의 가공
DSH-SY5Y 세포를 Alexa Fluor® 488 함유 완충제, 또는 10 μM의 새로이 제조된 dGAE-488을 사용하여 24시간 동아 처리하였다. 세포를 PBS 속에서 1회 세척하고, 튜브내로 스크랩핑(scrapping)하고 500 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 배지를 제거하고 세포를 예비-가온된 배양 배지: 4%(v/v) PFA의 1:1 혼합물 속에 37℃에서 현탁시켰다. 세포를 500 xg에서 5분 동안 원심분리하고 세포를 0.1 M 포스페이트 완충제(pH 7.4) 중 새로운 4%(v/v) PFA 및 0.1%(v/v) 글루타르알데하이드(GA) 속에서 3시간 동안 실온에서 재현탁시켰다. 고정된 세포를 1,000 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 PBS 중 50 mM 글리신 속에 10분 동안 실온에서 현탁시켰다. 세포를 1,000 xg에서 5분 동안 원심분리하고 펠렛을 0.1 M 카코딜레이트 완충제(pH 7.4)로 3회 세척하였다. 대략 200 μl의 4%(w/v) 저 융점 아가로스를 세포에 가하고 1,000 xg에서 10분 동안 30℃에서 즉시 원심분리하였다. 튜브를 4℃에 또는 빙상에 20분 동안 즉시 이전시켜 아가로스를 고화시켰다. 아가로스-봉매된 세포 펠렛을 새로운 튜브로 이전시키고 0.1 M 카코딜레이트 완충제(pH 7.4)로 2 내지 3회 세척하였다. 펠렛을 감소된 삼투압 용액(1%(v/v) 사산화오스늄, 0.1M 카코딜레이트 완충 제 중 1.5%(w/v) 육시아노철칼륨, pH 7.4) 속에 1시간 동안 4℃에서 후-고정시킨 다음 0.1 M 카코딜레이트 완충제(pH 7.4)로 3회 세척하고 이중-증발시킨 H2O로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 펠렛을 30, 50, 75, 90 및 95% 에탄올로 이루어진 일련의 에탄올 속에서 각각 15분 동안 4℃에서 탈수시킨 후 100% 에탄올 속에서 20분 동안 각각 4℃에서 3회 항온처리하였다. 이후에, 샘플을 100% 에탄올:UnicrylTM 수지의 2:1 혼합물(30분 동안에 이어서 100% 에탄올:UnicrylTM 수지의 1:2 혼합물(BBI 용액) 속에 30분 동안 침투시켰다. 최종적으로, 펠렛을 BEEM 캡슐(Agar Scientific)에 이전시키고 완전 UnicrylTM 수지 속에서 밤새 4℃에서 침투시켰다. 수지를 광-중합을 사용하여 48시간 동안 35 cm의 거리에서 12 V, 100 W 유형 6834 Philips 투사용 램프(projection lamp)로부터 BEEM 캡슐의 밑면으로부터 조명을 비추어 경화시켰다. 초박 절편(Ultrathin section)(70 nm)을 다이아몬드 나이프를 사용하여 Leica M80 현미경(Leica Microsystems)이 장착된 Leica EM UC7 초마이크로톰(ultramicrotome)에서 취하고 300 메쉬 헥사곤 니켈(Mesh Hexagon Nickel) 3.05 mm 결자(Agar Scientific Ltd) 상에 둔 후 면역금 표지화를 진행하였다.
면역금 표지화 TEM
1% BSA, 500 μl/L 트윈-20, 10 mM Na-EDTA 및 0.2 g/L NaN3 를 함유하는 개질된 PBS(pH 8.2)(PBS+로 명명됨)를 항체 및 금 프로브의 모든 희석물에 대해 다음의 과정 전체에서 사용하였다. 극박 단면(ultrathin section)을 정상의 염소 혈청(PBS+ 속에 1:10 희석으로 희석시킴; Sigma-Aldrich)을 사용하여 30분 동안 실온에서 차단시킨 다음 항-Alexa Fluor® 488 1차 항체(1:50)(Thermo Scientific)와 함께 항온처리하였다. 단면을 PBS+ 속에서 각각 2분 동안 3회 세척한 후 10 nm 금 입자-접합된 염소 항-토끼 IgG 2차 프로브와 함께 PBS+ 속에서 1:10 희석으로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 단면을 PBS+ 속에서 각각 10분 동안 3회 세척하고 증류수로 각각 5분 동안 4회 세척하였다. 면역금-표지된 박 단면을 후속적으로 2% (w/v) 아세트산우라닐 속에서 1시간 동안 후-염색시킨 후 TEM에서 사진을 찍었다.
영상 분석
FIJI(https://fiji.sc) 영상화 공정 패키지(J. Schindelin et al., Nat. Methods, vol. 9, no. 7, pp. 676-682, (2012))를 모든 영상 분석에 사용하였다. 형광성 강도의 정량화를 위해, 영상을 최대 강도까지 Z-투사하였다. 5 내지 10개의 시야(field of view)를 각각의 조건으로부터 획득하고 조건 당 평균 50개의 세포를 분석에 적용시켰다. 첫번째로, 목적한 영역(세포 체)을 개개 세포 주변에 그리고 융합된 핵을 갖는 세포를 배제시켰다. 영역-통합 강도(area-integrated intensity) 및 평균 회색 값 뿐만 아니라 형광성이 없는(배경) 세포 주변으로부터 3회 선택 항목을 측정하였다. 이후에, 수정된 총 세포 형광성(corrected total cell fluorescence; CTCF)을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
CTCF = 통합 밀도 - (선택된 세포의 면적 x 배경 판독치의 평균 형광성)
내재화된 dGAE-488의 정량화를 위해, 최대 DAPI 형광성을 함유한 세포의 중간으로부터의 초점면(focal plane)을 선택하고 분석에 적용시켰다.
데이타 분석
데이타 및 통계 분석을 Microsoft Excel 및 GraphPad Prism 7을 사용하여 수행하였다. 모든 데이타는 평균 ± 평균의 표준 오차(standard error of the mean; SEM)로 나타낸다. 2개 그룹을 비교하는 경우, 웰치 보정을 사용한 스튜던츠 비쌍식 t-시험을 사용하여 통계적 유의성을 측정하였다. 2개 이상의 그룹을 비교하는 경우, 던넷 사후 시험(Dunnet's post-hoc test)을 사용한 변량의 일원 분석(one-way analysis of variance; ANOVA)을 사용하여 시험 그룹과 대조군 그룹 사이에서의 차이를 측정하였다. 차이는 p < 0.05인 경우 통계적으로 유의성인 것으로 고려하였다.
실시예 1: dGAE 및 dGAE-488에 의한 원섬유 형성의 시험
가용성 dGAE를 Alexa-fluor 488 태그(dGAE-488)를 사용하여 형광표지함으로써 dGAE 조립의 내재화를 모니터링하고 내인성 발현된 tau로부터 외인성 dGAE를 구별하였다. 평균적으로, 모든 표지화 반응 후 단백질의 몰 당 488의 0.1 몰이 존재하였다. Alexafluor-태그는 N-말단에서 아미노 그룹 및 라이신 잔기를 표지하므로, 본 발명자는 태그된 및 태그되지 않은 dGAE를 TEM, SDS-PAGE 및 CD 분광법을 사용하여 시험함으로써 표지가 응집 및/또는 필라멘트 형성에 영향을 미치는지의 여부를 측정하였다. 이미 확립된 응집에 대한 비-환원 조건을 사용하여(Al-Hilaly et al., J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)), dGAE 및 dGAE-488은 형태학적으로 유사한 짧은 꼬인 원섬유를 생산하였다(도 1a). dGAE 및 dGAE-488의 SDS-PAGE는 10/20-kDa 및 12/24-kDa 형태(단량체/이량체) 모두의 존재를 나타내었고, 후자는 0시간째에 비-교반된(non-agitated) dGAE 제제에서 우세하였다. 본 발명자는 용액이 저 분자량 종의 혼합물을 함유할 가능성이 있지만, dGAE가 0시간째에 랜덤 코일이고 주로 SDS 가용성 단량체 및 이량체로 이루어짐을 아미 나타내었다. 시간에 걸쳐, dGAE는 자가-조립하여 β-시이트가 풍부한 필라멘트를 형성한다(Al-Hilaly et al.,l J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)). dGAE-488 제제는 0시간째에 이량체 밴드의 약간 증가된 강도를 나타내었다. 0시간 및 72시간 째에 단백질의 전자 현미경사진은 0시간째에 직경이 10 내지 80 nm의 범위인 원형 종(도 S1Aii) 및 72시간 째에 길이가 20 내지 350 nm의 범위인 원섬유(도 S1Bii)와 함께, dGAE 및 dGAE-488 제제 둘 다에서 유사한 크기 종을 나타낸다(도 S1). 72시간 동안 교반으로 유도된 피브릴화 후, dGAE-488과 비교하여 dGAE에 대한 12-kDa 단량체 형태가 거의 존재하지 않았고, 제제 둘 다 중 더 많은 것이 겔 웰 속에 유지되었다(Al-Hilaly et al., J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)). CD 스펙트럼은 0시간 째에 198 nm에서 유사한 강도 최소값(주로 랜덤 코일 구조) 및 72시간 째에 랜덤 코일 신호에서 예측된 감소로, 제제 둘 다에 대해 유사하였고, 이는 218 nm 주변에서 최소인 불용성 β-시이트 구조에서의 증가를 동반하였다. 본 발명자는 원심분리 후 펠렛에서 218 nm에서 β-시이트 신호를 이미 입증하여 이를 상층액으로부터 분리하였다(Al-Hilaly et al., J. Mol. Biol., vol. 429, no. 23, pp 3650-3665 (2017)). 나타낸 결과는 dGAE 및 dGAE-488이 구조적으로 및 형태학적으로 유사한 원섬유를 형성함을 나타낸다.
실시예 2: dGAE에 의한 세포 사멸의 유도에 대한 연구
응집된 dGAE(72시간 동안 교반된 100 μM) 및 가용성 dGAE(0시간째에 교반 없이, 100 μM)를 1 μM의 농도에서 dSH-SY5Y 세포에 직접 적용시키고 24시간 동안 항온처리하였다. 세포 생존능을 24시간 후 ReadyProbes® 검정을 사용하여 측정함으로써 세포 사멸을 측정하였다(도 2a). 완충제 처리와 비교하여 가용성 dGAE로 인하여 사멸한 세포의 퍼센트에 일부 증가가 존재하였지만, 이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다(도 2b). 완충제 만의 대조군(21.6 ± 1.6%)과 비교하여 응집된 dGAE (34 ± 2.9%, p < 0.0001)와의 항온처리 후 세포 사멸에서 유의적인 증가가 존재하였다. 가용성 dGAE의 농도를 20 μM 까지 증가시키는 것은 24시간 동안 항온처리 후 세포 사멸에서 추가의 증가를 생산하지 않았다(도 S2). dGAE-488의 가용성 형태가 미미하게 보다 독성이지만, dGAE 및 dGAE-488은 세포와 1 μM의 가용성 또는 응집된 단백질과의 항온처리 후 세포 사멸에서 비교가능한 효과를 나타내었지만, 72시간 섬유화 후 차이를 나타내지 않았다. 결과는 세포외적으로 적용된 응집된 dGAE는 급성 세포 사멸을 유도하지만 가용성 dGAE는 급성 세포 사멸을 유도하지 않았다.
실시예 3: dGAE-488의 내재화
가용성 및 응집된 dGAE의 dSH-SY5Y 세포로의 흡수를 시험하여 응집 상태가 내재화의 효능에 영향을 미치는지의 여부를 실험하였다. 표지된 dGAE-488 형태를 사용하여 흡수가 가시화되도록 하였고 총 세포 형광성에 대해 수정하여 측정하였다. 가용성 또는 응집된 (72h) dGAE-488을 dSH-SY5Y 세포와 함께 1 μM에서 24시간 동안 항온처리하였다. 공초점 현미경검사 분석은 가용성 dGAE-488에 대한 노출 후, 형광성을 세포 내에서 점상 염색(punctate staining)으로서 관찰하였다(도 3a). 응집된 dGAE-488을 가용성 형태보다 유의적으로 훨씬 더 효율적으로 내재화하였고(세포 당 474 ± 96 대 1,114 ± 67 AU, p < 0.0001; 도 3b), dGAE-488 형광성의 보다 큰 축적은 세포 외부에서 관찰될 수 있었다. 살아있는 세포 영상을 사용하여 가용성 dGAE-488의 내재화를 모니터링하였다. 일부 dGAE-488은 세포 외부에 남아서 시간에 걸쳐 밝기 및 크기를 증가시키며, 이는 배지 속에서 일부 지속된 조립과 일치한다. 내재화된 dGAE-488을 2시간의 항온처리 후 뉴우런 내에서 검출하고 흡수는 시간에 걸쳐 증가하는 것으로 발견되었다(도 3c). 24시간 까지, 명백한 점상 염색 패턴 뿐만 아니라 보다 큰 핵 주위 축적이 관찰되었다(도 3c & 3d). 살아있는 세포 영상의 시간-간격은 세포내 수송의 상세한 시험을 허용하지 않았지만, 내재화된 dGAE-488은 공정에 걸쳐 트래피킹(trafficking)되는 것으로 관찰되었다. 결과는 표지된 dGAE-488이 dSH-SY5Y 세포에 의해 내재화됨을 나타낸다.
실시예 4: dGAE 내재화 후 포스포릴화 변화
본원에 나타낸 결과는 응집된 dGAE와의 항온처리가 단지 24시간 항온처리 후 유의적인 세포 사멸을 초래하지만, 가용성 dGAE는 내재화되지만 24시간 항온처리 후 유의적으로 독성인 것으로 여겨지지 않는다. 따라서, 내재화된 가용성 dGAE-488이 내인성 tau의 응집 또는 포스포릴화 상태를 병경시킬 수 있는지의 여부를 추가로 시험하였다. 가용성 1 μM dGAE-488에 대한 노출 후, 세포를 고정시키고 내인성 tau 만의 특이적인 검출을 허용하는 dGAE 서열의 외부의 tau 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 면역표지하였다(도 4a 내지 4c). 세포를 내재화된 dGAE-488 및 내인성 tau의 공국소화에 대해 시험하고 세포체 내 표지된 tau의 형광성 강도를 각각의 항체에 대해 개개 세포에서 정량화하였다. AT180(T231에서 포스포릴화된 tau; pT231) 및 AT8(202 내지 205에서 포스포릴화된 tau; pS202-pT205)을 사용한 표지화는 완충제-처리된 세포에서 크게 부재하였지만 가용성 dGAE-488과의 항온처리 후 유의적으로 증가하였고, 일부 세포는 dGAE-488과 포스포릴화된 내인성 tau의 공국소화를 나타낸다(도 4a, b). 본 발명자는 Tau-1 항체를 사용하여 검출된 아미노산 192 내지 204번 사이에 탈포스포릴화된 tau가 dSH-SY5Y 세포 내 핵에서 발견됨을 이미 밝혔다(Maina et al., Acta Neuropath. Comm, Vol. 6 No. 70, pp 1-13 (2018)). 여기서, 본 발명자는 에측된 바와 같이 핵내에서 tau-1 표지화를 확인하였지만, dGAE-488과의 공국소화는 존재하지 않았음을 발견하였다. Tau-1 형광성의 정량화는 dGAE-488로 처리한 세포내 형광성 강도에서의 유의적인 감소(도 4c)를 나타내었고 이는 tau가 포스포릴화됨을 나타낼 수 있다. 결과는 내재화된 dGAE-488이 내인성 tau의 증가된 포스포릴화를 초래함을 나타낸다.
실시예 5: 가용성 dGAE-488에 대한 세포의 노출 효과
전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 수행하여 내인성 tau 포스포-에피토프에서 외인성 적용된 dGAE의 효과를 시험하였다. 가용성 dGAE와 함께 항온처리된 세포와 완충제-처리된 대조군 세포의 비교는 총 tau의 수준에서 변화가 없고 통계적 유의성에 도달하지 않은 AT8 또는 AT180 면역반응성에서의 약간의 증가를 나타내었다. 웨스턴 블롯은 세포 내 포스포-tau의 총 수준을 측정하지만, 면역형광성 영상화는 임의의 증가의 세포내 국소화를 강조할 수 있다. 뉴우런에서 내인성 tau의 용해도에서 내재화된 가용성 dGAE-488의 효과를 측정하기 위하여, 본 발명자는 1% 트리톤 X-100을 사용한 가용화 및 원심분리(16,000g로 30분 동안)루 세포 분해물로부터 Tau 단백질의 순차적인 추출을 수행하였다. 완충제-처리된 대조군과 비교하여 가용성 dGAE와 함께 24시간 동안 항온처리 후, 트리톤-X 100-가용성 내지 트리톤-X 100-불용성 단편으로부터 AT180으로 면역표지된 Tau 단백질의 명확한 재분포가 존재하였다. dGAE 항온처리는 AT180과 면역반응성인 가용성 tau의 감소(83.0 ± 5.5%, p = 0.0201) 및 불용성 형태의 증가(139.4 ±14.5%, p = 0.0352)를 생산하였다(도 5a 및 5b). 예측하지 못하게, 소량의 tau가 완충제 처리된 대조군의 불용성 분획에서 관찰되었지만 대조군과 처리된 세포 사이의 차이는 유의적이었다. 또한, tau 분자의 N-말단에 위치한 에피토프를 지닌 20 내지 25 kDa의 겔 이동성을 갖는 새로이 트렁케이트된 tau 종은 불용성 분획 속에서 나타났다. 이는 완충제 단독보다 dGAE와 함게 항온처리된 세포 내에서 보다 강하였다. 결과는 가용성 dGAE-488에 대한 세포의 노출이 트리톤-불용성 내인성 tau의 증가를 초래함을 나타낸다.
실시예 6: 내재화된 dGAE-488의 국소화
세포내 형광성 점상 입자가 가용성 dGAE-488에 대한 뉴우런의 24시간 노출 후 핵에 가까운 세포질 내에서 관찰되었다. 이러한 염색 패턴은 세포질 소낭내 이의 국소화와 일치하였다. 따라서, 본 발명자는 내재화된 dGAE-488이 엔도솜/라이소솜 구획 내에 국소화되었는지를 시험하였다. 가용성 dGAE-488을 세포와 함께 24시간 동안 항온처리하고 산성 소기관(라이소솜 및 말기 엔도솜)을 표지하는 염료인, LysoTracker®로 30분 동안 염색한 다음 고정시키고 공초점 현미경검사로 가시화하였다. 완충제 처리된 대조군 세포(211.9 ± 9.9%, p < 0.0001; 도 6Ai, Aii)와 비교하여 가용성 dGAE-488에 노출된 세포(211.9 ± 9.9%, p < 0.0001; 도 6Ai, Aii)LysoTracker® 형광성의 강도에서 유의적인 증가가 존재하였다. 내재화된 dGAE-488은 피어슨 상관 계수을 사용한 Z-스택에서 정량화 후 LysoTracker®와의 강력한 공국소화를 나타내었다(0.8382 ± 0.036, p < 0.0001; 도 6Bi, Bii). 결과는 내재화된 dGAE-488이 말초핵 산성 소낭에 국소화됨을 나타낸다.
실시예 7: 세포 내에서 축적된 tau 및 dGAE-488의 초구조물(ultrastructure)
TEM을 사용하여 세포 내에서 축적된 tau 및 dGAE-488의 초구조를 시험하였다. dSH-SY5Y를 10 μM의 가용성 dGAE-488에 24시간 동안 노출시키고 면역급 TEM에 대해 Alexa Fluor® 488에 대한 항체를 사용하여 가공함으로써 dGAE-488을 특이적으로 표지하였다. 소낭 구조 및 미토콘드리아가 단면화된 세포 내에서 관찰되었고 이는 TEM 프로토콜이 세포 구조를 보존하였음을 입증한다(도 7a). 명확한 원섬유 구조가 세포질 내에서 항-488로 표지되지 않지만, 보다 높은 확대에서의 시험은 막-결합된 소낭 구조 내에서 항-488을 사용하여 표지된 조밀하게 표지된 입자의 존재를 나타내었고, 이는 이러한 소기관 내 488-표지된 단백질의 축적을 시사한다(도 7c). 유사한 소낭 구조가 또한 소낭-처리된 세포 내에 존재하였지만 금 표지화는 결여하였다. dGAE-488 세포로 처리한 뉴우런을 나타낸 막-결합된 구획의 직경을 비교하기 위한 분석은 완충제-처리된 대조군 세포보다 더 큰 직경의 소낭을 함유하였고(448.4 ± 22.5 nm 대 303.7 ± 20.0 nm, p < 0.0001), 최대 소낭은 700 내지 800 nm이고 최소의 소낭은 200 내지 300 nm이었다(도 7b). 결과는 내재화된 dGAE-488이 혈관 구획 속에서 패키징됨을 나타낸다.
실시예 8: 뉴우런 세포에서 Tau 단백질의 응집 작용에서의 효과에 대한 제제의 시험
SHSY5Y 세포를 24 웰 플레이트(웰당 30,000개의 세포)에 플레이팅하고 앞서 기술된 바와 같이, 고갈된 혈청 배지 속에서 레티노산을 사용하여 분화시키거나 분화시키지 않고 두었다. 세포를 다음의 방법 중 하나로 처리한다: (1) tau 응집체를 가하기 전에 목적한 제제의 존재하에서 예비-항온처리하거나 (2) 동시에 투여된 목적한 제제 및 tau 응집체와의 공-항온처리. 항온처리 시간은 각각의 단계에서 24시간이고 이는 (1)에 대한 총 시간이 48시간이고 (2)에 대한 총 시간이 24시간임을 의미한다. 세포와 24시간 동안 항온처리된 dGAE-488(1 μM)은 내재화된 단백질이 관찰되기에 충분하다. 항온처리 후, 세포를 사진을 찍고 영상의 분석을 ImageJ를 사용하여 수행함으로써 세포체 내 형광성 강도를 정량화하여 dGAE-488 내재화의 정도(measure)를 제공하였다. 세포의 수를 계수하여 평균 형광성 강도/세포의 수준을 시야내 세포의 상이한 수를 고려하여 나타내었다. dGAE-488의 분획을 1 μM에서 가하였다. 스크리닝용 제제를 초기에 10 μM의 단일 농도에서 시험할 수 있고; 억제 활성을 나타내는 것을 이후에 2 μM 내지 20 nM의 농도 범위에 걸쳐 시험하고 화합물의 활성을 활성의 50% 억제가 관찰되는 농도로서 보고하였다. 측정될 활성은: (i) 세포내 형광성에 의해 측정된 tau의 국소화; (ii) 세포를 수거하고, 이를 분해하고 응집된 tau를 한외여과에의해 분리하고 응집된 tau를 항-tau 항체를 사용한 면역블롯에 의애 측정함으로써 측정된 tau의 세포내 응집; 및 (iii) 세포 사멸을 측정하기 위하여 ReadyProbes® 검정을 사용하여 측정된 세포독성(도 2a). 활성을 모두 제제의 부재하에서 처리하거나 처리 비히클로 처리한 세포에 대해 수득된 결과에 대해 표준화한다. 2 μM 이하에서 제제를 사용하여 50% 억제를 나타내는 화합물은 상이한 제제와 비교하여 활성이고 비교적 활성인 것으로 고려된다.
실시예 9: 시험관 내에서 Tau 응집 억제 검정
dGAE 단백질을 모노클로날 항체 s1D12를 4:1 단백질:Ab(100 mM dGAE + 25 mM s1D12 및 10 mM dGAE + 2.5 mM s1D12) 또는 1:1(25 mM dGAE + 25 mM s1D12)의 비에서 함유하는 10 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4 (PB)내로 희석시켰다.
"s1D12"는 2020년 7월 10일자로 출원된 영국 특허원 제GB2010652.2호 및 2021년 7월 9일 WisTa Laboratories Ltd의 명칭으로 출원된 국제(PCT) 출원에 개시된 모노클로날 항체를 지칭하고, 이들 둘 다는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본원에 "S1D12"로서 지칭된 특이적인 결합 분자의 CDR에 의해 결합된 에피토프는 서열 번호: 1의 잔기 337 내지 349번을 포함하는 아미노산 잔기 또는 바람직하게는 서열 번호: 1의 잔기 341 내지 353번을 포함하는 아미노산 서열 내에 존재할 수 있다. 에피토프는 서열 번호: 8(VEVKSEKLDFKDR)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. S1D12는 CDR, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하고, 여기서 상기 CDR 각각은 다음과 같은 아미노산 서열을 포함한다:
VHCDR1은 서열 번호: 9에 나타낸 서열(NNAVG)을 포함하고;
VHCDR2는 서열 번호: 10에 나타낸 서열(GCSSDGTCYYNSALKS)을 포함하고;
VHCDR3은 서열 번호: 11에 나타낸 서열(GHYSIYGYDYLGTIDY)을 포함하고;
VLCDR1은 서열 번호: 12에 나타낸 서열(SGSSSNVGGGNSVG)을 포함하고;
VLCDR2는 서열 번호: 13에 나타낸 서열(DTNSRPS)을 포함하고;
VLCDR3은 서열 번호: 14에 나타낸 서열(VTGDSTTHDDL)을 포함한다.
s1D12는:
(a) 서열 번호: 15(QVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGFSLNNNAVGWVRQAPGKVPESLVGCSSDGTCYYNSALKSRLDITRDTSKNQISLSLSSVTTDDAAVYYCTRGHYSIYGYDYLGTIDYWGPGLLVTVSS)에 나타낸 서열을 포함하는 VH 도메인; 및/또는
(b) 서열 번호: 16 (QAVLTQPSSVSGSLGQRVSITCSGSSSNVGGGNSVGWYQHLPGSGLKTIIYDTNSRPSGVPDRFSGSRSGNTATLTINSLQAEDEGDYYCVTGDSTTHDDLVGSGTRLTVLG)에 나타낸 서열을 포함하는 VL 도메인;
또는 이의 사람화된 변이체를 포함할 수 있다.
s1D12는:
(a) 서열 번호: 17 (QVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGFSLNNNAVGWVRQAPGKVPESLVGCSSDGTCYYNSALKSRLDITRDTSKNQISLSLSSVTTDDAAVYYCTRGHYSIYGYDYLGTIDYWGPGLLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK)에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는
(b) 서열 번호: 18 (QAVLTQPSSVSGSLGQRVSITCSGSSSNVGGGNSVGWYQHLPGSGLKTIIYDTNSRPSGVPDRFSGSRSGNTATLTINSLQAEDEGDYYCVTGDSTTHDDLVGSGTRLTVLGGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS)에 나타낸 서열을 포함하는 경쇄;
또는 이들 중 어느 것의 사람화된 변이체를 포함한다.
양성 대조군으로서, dGAE를 10 mM PB 속에서 10, 25 또는 100 mM의 최종 농도로 제조하였다. 음성 대조군은 4;1의 비율의 dGAE와 비-tau IgG 항체(10 mM dGAE + 2.5 mM 항-오브알부민), 또는 항체 단독(25 또는 2.5 mM의 s1D12 및 2.5 mM 항-오브알부민)으로 이루어졌다. 샘플을 700 rpm로 37℃에서 3일 동안 교반하였다.
투과 전자 현미경검사(TEM), 원평광 이색성(CD) 및 티오플라빈 S(ThS) 검정을 문헌: Al-Hilaly et. al. (2018) J. Mol. Biol. 430, 4119-4131에 상세히 설명한 바와 같이 수행하였다. 요약하면, TEM 결자를 4 mL의 샘플을 탄소-코팅된 격자에 가한 후 milli-Q 여과수로 세척한 후 2% 우라닐 아세테이트로 2회 염색함으로써 제조하였다. 격자를 건조시킨 후 80 kV에서 작동하는 JEOL 전자 현미경을 사용하여 영상화하였다.
CD의 경우, 60 μL의 샘플을 0.1 mm의 석영 큐베트에 두고 JASCO 분광편광계에 두었다. 20 mM MOPS 완충제 중 100 μL의 ThS를 50 μL의 각각의 샘플에 20 μM의 최종 농도로 가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 형광성 강도를 Cary Eclipse 분광광도계 속에서 440 nm의 여기 파장을 사용하여 측정하였다. 10 mM PB으로부터의 기본선 판독을 CD 및 ThS 측정으로부터 감하였다.
이러한 3개의 실험으로부터의 발견은 s1D12가 시험관 내에서 dGAE의 원섬유로의 조립을 억제함을 시사한다.
우선, dGAE 원섬유는 10 μM로 낮은 농도를 사용하여 샘플 속에서 TEM으로 용이하게 관찰하였고; s1D12의 존재하에 동일한 농도에서, 원섬유는 존재하지 않았고 이는 조립의 억제를 시사한다. 원섬유는 동일한 몰 비의 dGAE:Ab와 비-tau 항체를 사용하는 경우 존재하였고, 이는 억제 효과가 특이적임을 나타낸다.
원편광 이색성은 용액 속의 단백질의 2차 구조 특성화를 보고한다. 10 및 25 μM의 dGAE가 CD를 사용하여 관찰하기에 농도가 너무 낮았지만, 신호는 항체 구조로부터 예측된 특징적인 β-시이트 신호에 의해 두드러진다. 100 μM의 dGAE에서, 랜덤 코일 구조는 항체 CD 신호를 dGAE 심호로부터 감하는 경우 나타난다. 이는 4:1의 비의 s1D12:dGAE에서, dGAE가 β-시이트가 풍부한 원섬유로 조립될 수 없음을 시사한다.
최종적으로, 티오플라빈 S를 사용하여 원섬유의 존재를 보고하였다. ThS는 dGAE 원섬유내 기본 구조인, 아밀로이드에 결합하여, 440 nm의 파장의 광으로 여기되는 경우 483 nm 주변의 특징적인 파장에서 형광성을 띄는 염료이다. 양성 신호는 25 및 100 μM dGAE 원섬유에 대해 명확하게 나타난다. 그러나, 4;1 또는 1:1의 비에서 s1D12와 함께 항온처리하는 경우, 이러한 신호는 없어졌고, 이는 dGAE를 s1D12와 함께 항온처리하는 경우 원섬유가 존재하지 않는다는 앞서의 관찰을 뒷받침하였다.
종합적으로, 이러한 결과는 (i) s1D12가 dGAE의 원섬유로의 조립을 특이적으로 억제하고 (ii) 이러한 검정을 활용하여 알츠하이머 질환의 특징적인 tau 병리학에 존재하는 쌍식 나선형 필라민트와 강력하게 유사한 원섬유의 형성을 파괴하는 다른 항체의 억제 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다는 확신을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> WisTa Laboratories Ltd. <120> System for study of tau aggregation <130> P136457WO <150> GB2010620.9 <151> 2020-07-10 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln 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Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 545 550 555 560 Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys 565 570 575 Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val 580 585 590 Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys 595 600 605 Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln 610 615 620 Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 625 630 635 640 Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val 645 650 655 Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly 660 665 670 Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile 675 680 685 Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp 690 695 700 His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr 705 710 715 720 Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met 725 730 735 Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser 740 745 750 Leu Ala Lys Gln Gly Leu 755 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Claims (12)

  1. (a) 뉴우런 세포(neuronal cell)를 제제(agent)의 존재하에서 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하는 단계; 또는
    (b) 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 제제의 존재하에 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행한 후에 뉴우런 세포에 대한 Tau 단백질의 단편의 세포독성을 측정(determining)하는 단계를 포함하여,
    뉴우런 세포에 대해 dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성(identity)을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 세포독성을 억제하는데 효과적인 제제를 스크리닝(screening)하는 방법.
  2. (a) 뉴우런 세포를 제제의 존재하에서 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하는 단계; 또는
    (b) 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 제제의 존재하에 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행한 후에 뉴우런 세포에서의 Tau 단백질의 단편의 내재화(internalisation)를 측정하는 단계를 포함하여,
    dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 내재화를 억제하는데 효과적인 제제를 스크리닝하는 방법.
  3. (a) 뉴우런 세포를 제제의 존재하에서 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하는 단계; 또는
    (b) 뉴우런 세포를 헤파린의 부재하에서 Tau 단백질의 단편과 함께 배양하고 후속적으로 뉴우런 세포를 제제의 존재하에 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 또는 단계 (b)를 수행한 후에 Tau 단백질의 단편과 뉴우런 세포내 내인성 tau 단백질의 상호작용의 정도를 측정하는 단계를 포함하여,
    dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편과 내인성 tau 단백질의 상호작용을 방해(disrupting)하는데 효과적인 제제를 스크리닝하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편이, 길이가 70 내지 97개 아미노산, 임의로 길이가 71 내지 97개 아미노산일 수 있는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, Tau 단백질의 단편이, 길이가 71, 73, 94, 95, 97개 아미노산의 단편의 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편이 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 7에 기술된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열을 갖는 Tau 단백질의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  7. (i) 뉴우런 세포주, (ii) dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 (iii) 제제의 라이브러리(library)를 포함하는, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 세포독성을 억제하는데 효과적인 제제를 스크리닝하기 위한 시스템으로서, 여기서 뉴우런 세포주가 헤파린을 포함하지 않는, 시스템.
  8. (i) 뉴우런 세포주, (ii) dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 (iii) 제제의 라이브러리를 포함하는, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편의 내재화를 억제하는데 효과적인 제제를 스크리닝하기 위한 시스템으로서, 여기서 뉴우런 세포주가 헤파린을 포함하지 않는, 시스템.
  9. dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편과 (i) 뉴우런 세포주, (ii) dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편; 및 (iii) 제제의 라이브러리를 포함하는, 내인성 tau 단백질의 상호작용을 방해(disrupting)하는데 효과적인 제제를 스크리닝하기 위한 시스템으로서, 여기서 뉴우런 세포주가 헤파린을 포함하지 않는, 시스템.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 Tau 단백질의 단편이, 길이가 70 내지 97개 아미노산, 임의로 길이가 71 내지 97개 아미노산일 수 있는, 시스템.
  11. 제10항에 있어서, Tau 단백질의 단편이, 길이가 71, 73, 94, 95, 97개 아미노산의 단편의 그룹으로부터 선택되는, 시스템.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, dGAE95의 아미노산 서열(서열 번호: 4) 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열 내에 적어도 70개 아미노산을 포함하는 Tau 단백질의 단편이 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 7에 기술된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 85% 동일성을 지닌 서열을 갖는 Tau 단백질의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 시스템.
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