KR20230038230A - 포유동물 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents
포유동물 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암을 특징으로 하는 질병으로부터 고통받는 대상체의 혈장 중 Ksp37의 수준을 치료적으로 효과적인 농도 수준으로 상승시킴으로써, 상기 대상체를 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암을 특징으로 하는 질병에 대해 보호하거나 치료하기 위한 신규한 방법 및 약학적 조성물 또는 약제가 기재되어 있다. 본 발명에 따르면, 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질; 및/또는 Ksp37 단백질로 번역될 Ksp37 유전자로 암호화된 벡터; 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질; 및/또는 극성 화합물 중 하나 이상의 치료적 유효량이 대상체에게 투여된다.
Description
본 발명은 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암을 특징으로 하는 포유동물 질병의 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
레트로바이러스(retrovirus)로 분류되는, 인간 면역결핍 바이러스("HIV", Human Immunodeficiency Virus)로 알려진 바이러스는 전 세계 수백만 명의 삶에 영향을 미쳤다. 상기 바이러스는 치료를 받지 않는 경우 몇 년 내에 후천성 면역결핍 증후군("AIDS", Acquired Immunodeficiency Syndrome)으로 발전하는 건강한 개체를 감염시킨다(Mann, J. et al. (2016) 'The latest science from the IAS Towards an HIV Cure Symposium 16 - 17 July 2016, Durban, South Africa', (July), pp. 235-241.).
HIV는 레트로바이러스과의 렌티바이러스(lentivirus)속에 속한다(Teich et al., 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss et al., eds., CSH-press, pp. 949-956). 레트로바이러스는 단일 가닥 RNA 게놈을 포함하는 작은 외피 바이러스이며, RNA 의존성 DNA 중합효소인 바이러스로 암호화된 역전사효소에 의해 생성된 DNA 중간체를 통해 복제한다(Varmus, H., 1988, Science 240:1427-1439).
다른 레트로바이러스들은 예를 들어, 인간 T세포 백혈병 바이러스 (HTLV-1, -II, -III) 및 고양이 백혈병 바이러스와 같은 발암성 바이러스를 포함한다.
HIV 구조 및 게놈 구성
성숙한 HIV 비리온(virions)은 직경이 100nm - 120nm인 구형 구조로 밀도가 높은 원뿔 모양의 뉴클레오캡시드 ("코어(core)")를 둘러싸는 지질 이중층막으로 구성된다. 상기 코어는 2개의 9.8 kb 길이 포지티브 센스, 단일 가닥, 선형 RNA 분자, cDNA 합성을 개시하는 분자, 세포 tRNA, Gag 다단백질, 바이러스 엔벨로프 (Env) 단백질 및 3개의 효소: 역전사효소 (RT), 바이러스 프로테아제 (PR), 인테그라제 (IN) 및 일부 기타 세포 인자를 포함한다(S Sierra, et al.,2005).
상기 HIV 게놈은 긴 말단 반복 ("LTR", long terminal repeats) 옆에 보조 및 조절 유전자를 포함한다. 상기 바이러스 게놈에는 세가지 기능 그룹으로 나눌 수 있는 총 9개의 유전자가 있다:
●
구조 유전자, Gag, Pol 및 Env;
●
조절 유전자, Tat 및 Rev; 및
●
보조 유전자, Vpu, Vpr, Vif 및Nef (JM Costin, 2007).
Gag 유전자는 코어 단백질을 암호화하고, Pol 유전자는 역전사효소(RT), 프로테아제, 인테그라제를 암호화하고, Env 유전자는 엔벨로프 단백질 (gp160)을 암호화한다. Tat 유전자는 Tat 단백질을 암호화하고, Rev 유전자는 Rev 단백질을 암호화한다. Tat 및 Rev 조절 단백질은 RNA 결합 단백질로 기능한다. RNA 결합 외에도, Tat 단백질은 HIV의 전장 게놈(full length genomes)이 형성되도록 하는 전사 활성화제 역할도 한다. Rev 단백질은 또한 HIV의 유전자 발현이 초기 단계에서 후기 단계로 이동하는 것을 돕는다. 반면에, 보조 유전자에 의해 암호화되는 보조 단백질은 다기능적이다. Nef 또는 음성 인자는 T세포 활성화, 기존 주조직적합성 복합체 (MHC, major histocompatibility complex) I 의 하향 조절 및 리소좀의 탈과립화에 의한 세포 표면의 CD4에 관여하고, 또한 비리온 감염성을 활성화시킨다. Vpr은 HIV가 비분열 세포를 감염시키도록 하는 핵-세포질 수송 인자로 작용한다. Vpu는 이온 채널의 발달을 통해 비리온의 방출을 향상시키고, 또한 유비퀴틴 매개 분해를 통해CD4의 발현을 하향 조절한다. 림프구, 단핵구 및 대식세포에서의 HIV 복제는 Vif에 의해 조절된다.
비리온의 엔벨로프는 막관통 단백질인 gp120 과 gp41을 포함하고 있으며, 이들은 비리온에서 바깥쪽으로 스파이크 형태로 돌출되어 있다 (최대 72개). CD4 수용체에 결합하는 고면역원성 단백질인 gp120은 대부분의 숙주 항체에 적합한 표적이다. 이들 균주 특이적 항체의 대부분은 이러한 수용체에 결합함으로써 CD4 수용체와 gp120 단백질의 상호작용을 차단한다. 지질 이중층 아래에 있는 매트릭스는 Gag 단백질 17 (하이러스 gag 단백질 절단 생성물)로 구성된다. 상기 코어 또는 캡시드는 p24 단백질 (Gag 유전자의 생성물) 및 세 번째 Gag 단백질 p7의 커버링(covering)을 포함한다 (Lampejo T et al., 2013).
HIV 생활사(HIV Life cycle)
인간 면역결핍 바이러스의 바이러스 유입은 기본적으로 세 단계로 나뉜다:
(1) 결합;
(2) 활성화; 및
(3) 융합.
주요 HIV-1 및 HIV-2 수용체 및 보조수용체는 각각 CD4 및 CCR5, CXCR4 이다. 주기는 세포 표면에서 MHC 클래스 II 분자의 CD4 수용체 (58 kDa 단량체 당단백질) 주요 보조수용체와 함께 HIV로 둘러싸인 삼량체 복합체, gp120 및 gp41의 인식으로 시작된다. CD4와 gp120의 결합 시 구조적 변화가 발생하여 CCR5 케모카인(chemokine) 보조수용체가 결합하는 gp120 도메인이 노출된다. 지금까지, 이 과정에서 17개의 케모카인 수용체 리간드가 확인된다(Fanales- Belasio et al., 2010).
gp120의 이중 결합에 이어, gp120 펩티드의 N-말단 측이 원형질막에 침투할 수 있도록 하는 안정한 부착 복합체가 형성된다. gp41 단백질에서, HR1 및 HR2 서열은 함께 작용하며 gp41의 헤어핀 구조를 형성하여, 바이러스와 세포막의 융합을 일으킨다(S Sierra et al.,2005).
융합 바이러스 코어가 세포질에서 방출된 후, 바이러스의 MA, Nef 및 Vif 단백질 인자에 의해 매개되는 바이러스 캡시드의 비코팅(uncoating)이 발생한다(Lampejo T et al.,2013).
바이러스 RT 리보뉴클레아제 H 부위에 의해 바이러스 RNA는 프라이머 결합 부위에서 시작하여 DNA로 전사된다. 전사 완료 후, 리보뉴클레아제 H는 dsRNA/DNA 혼성체를 분해하고, RT에 의해 중합 활성부위가 dsDNA로 전환된다(Fanales-Belasio et al., 2010). 프로바이러스 상태는 인테그라제 효소에 의해 상기 dsDNA를 숙주 세포 게놈으로 통합(integration)함으로써 얻어진다. 인테그라제 단백질은 각 DNA 가닥의 3
말단에서 점착성(sticky) 말단을 생성한다. 이제 변형된 바이러스 DNA는 바이러스 Vpr에 의해 지시되는 핵공을 통해 핵으로 내보내지고 통합 기능은 상기 인테그라제에 의해 수행된다(Sierra S).
바이러스 게놈이 발현되려면, 숙주 게놈 통합 부위가 활성 상태여야 한다(Fanales-Belasio).
프로바이러스 상태에서, 바이러스 DNA는 숙주 게놈에 몇 년 동안 남아있을 수 있으며 활성화 신호를 받으면 숙주 중합효소를 사용하여 mRNA를 발현한다(Yousaf MZ et al., 2011).
잠재적으로 감염된 T세포, 대식세포, 단핵구 및 미세교세포(microglial cells)는 HIV 게놈의 주요 저장소이다. 활성 세포 상태에서, HIV 게놈의 전사는 바이러스 LTR과 결합하여 숙주 RNA 중합효소 II 및 기타 전사 인자로 인해 시작된다. 전사 후, 번역은 기본 양의 단백질 (Tat, Rev 및 Nef)을 생성한다. Tat가 적절하게 생성되면, 추가 전사는 LTR 및 기타 전사 세포 활성화제에 있는 TAR 요소와 결합함으로써 조절된다(Sierra S).
초기 단계에서, 다중 접합된 mRNA는 Rev, Tat 및 Nef를 생성한다. 적절한 양의 Rev를 달성하면, 폴리솜(polysome)이라는 비접합 및 더 긴 mRNA가 생성되어 다른 바이러스 단백질 및 게놈 RNA가 생성된다. 스플라이싱되지 않은 RNA RRE에서, Rev 반응 요소는 Rev가 결합하는 곳에 존재하고, 번역을 위해 세포질에 스플라이싱 없이 안전하게 수송되도록 한다(Lampejo T).
REV는 또한 효소 및 구조 단백질의 발현과 조절 단백질 억제를 유발하므로 성숙한 비리온을 생성하는 역할을 한다. 세포질에서, ENV 유전자는 ER에서 글리코실화된 gp160으로 번역되어 HIV-1 프로테아제에 의해 성숙한 gp120 및 gp140이 된다(Fanales-Belasio).
번역 중에, Gag pol 단백질을 생성하는 리보솜-1 프레임 이동에는 PR, RT 및 IN이 포함된다. 성숙한 비리온의 핵은 Gag 및 Pol 유전자 단백질에 의해 형성된다. 큰 160 kDa 전구체로부터 Gag 및 Pol 단백질은 바이러스 프로테아제에 의해 절단되어 p24, p9, p7, p17 Gag 최종 생성물 및 Pol 생성물로 형성된다. 이 절단은 ENV 단백질의 감염성 바이러스 입자에 필요하며 번역 후 막으로 이동하여 삽입된다. Gag 및 Gag-Pol 다단백질도 세포막으로 이동하여 Gag 다단백질에 의해 조립되기 시작한다. 전체 크기의 게놈 RNA, 세포 tRNAlys-3-프라이머, 효소 및 모든 세포 화합물은 미성숙 바이러스 코어와 연결된다(Sierra S).
미성숙 바이러스의 출아(budding)는 원형질막을 통해 일어난다. 바이러스 조립 및 출아가 일어날 때 세포 표면에 있는 CD4 분자의 수 감소가 필요하다. Nef, ENV 및 Vpu가 이 프로세스에 관여한다. Nef는 초기 단계에서 MHC 클래스 I 및 II 분자의 엔도사이토시스 및 고사(mortification)를 매개한다. 이후 단계에서 Npu는 CD4 분자의 분해를 유도한다. 출아하는 동안 단백질 프로테아제의 활성화가 일어나 Gag 및 Gag-Pol 다단백질을 자가촉매적으로(auto-catalytically) 절단하여 구조 단백질 및 바이러스 효소를 생성한다. 개별 단백질과 캡시드, 뉴클레오캡시드 단백질의 추가 상호작용은 원추형 뉴클레오캡시드를 생성하고, MA는 바이러스 외피와 연관된 상태로 존재한다(Sierra S).
HIV 감염에 대한 현재의 치료방법
HIV 감염에 대한 현재의 치료방법은 하기의 조합을 포함한다:
● 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제
● 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제; 및
● 프로테아제 억제제.
이러한 약물 조합은 일반적으로 고강도 항레트로바이러스 치료(Highly Active Anti-Retroviral Treatment, "HAART") 라고 한다. HAART는 바이러스 DNA가 숙주 DNA에 혼입되는 것을 억제하고, 또한 바이러스 RNA로부터 바이러스 DNA의 형성을 억제함으로써 AIDS 발병을 늦추는 것을 목표로 환자에게 제공된다(Chupradit K et al., 2017 '백신시대를 넘어 HIV 요법에 도전하는 현재의 펩티드 및 단백질 후보', Viruses, 9(10), pp. 1-14. doi: 10.3390/v9100281).
이들은 HIV에 대해 양성 반응을 보인 환자에게 제공되는 약물 및 작용 기전의 일부에 불과하다.
현재까지 HIV 감염에 대한 백신 개발 또는 치료 시도는 성공하지 못했다.
백신 개발에 대한 일반적인 접근 방식은 바이러스의 일부를 신체에 감염시켜 항체 반응을 유도하는 것이다. 이후에 백신을 접종한 숙주가 실제 바이러스에 감염되면 면역체계가 백신에 포함된 바이러스의 항원을 인식하고 즉각적으로 강력한 면역반응을 촉발한다. 이러한 백신 개발 전략은 일부 바이러스에는 효과가 있지만, HI-바이러스의 돌연변이 능력 때문에 HIV 감염 및 이후 AIDS의 원인이 되는 HI-바이러스에는 효과가 없다. HI-바이러스의 돌연변이로 인해 바이러스 항원의 검출이 지연되어 바이러스에 감염된 세포의 증식이 가능해진다.
인간의 경우, HIV 복제는 CD4+ T 림프구 집단에서 두드러지게 발생하며, HIV 감염은 이 세포 유형의 고갈을 초래하고 결국 면역 부전(immune incompetence), 기회 감염(opportunistic infections), 신경학적 기능장애(neurological dysfunctions), 종양성 증식(neoplastic growth) 및 궁극적으로 사망으로 이어진다.
남아프리카 특허 1998/04649 "바이러스, 미생물 감염 및 소모성 증후군을 치료하기 위한 약물 전달 장치 및 방법 Drug Delivery Devices and Methods for Treatment of Viral and Microbial Infections and Wasting Syndromes" 는 치료제의 경피 투여를 위한 약물 전달 장치로서, 극성 화합물 N,N-디메틸포름아미드("DMF")를 포함하는 치료 조성물을 함유하거나 흡수한 저장소를 포함하는 것을 개시한다.
ZA 1998/064649 의 개시한 연구는 개체가HIV에 감염되었음에도 불구하고 항레트로바이러스 치료를 받지 않고 20년 이상 동안 350개 이상의 CD4+ T세포 수를 유지했다. 이러한 개체는 여기에서 장기 비진행자(Long-term Non-Progressors, "LTNP")라고 한다.
이런 개체 중 한명은 1996년 12월에 혈장 ml당 63.298 HIV-1 RNA 복사체(copies/ml) 를 검출하는 HIV PCR을 처음으로 제시했다. 경피 DMF 연구에 참여한 지 몇 년 후, 2006년 3월에 수행된 후속 HIV PCR에서 혈장 ml당 <40 HIV-1 RNA 복사체(copies/ml)가 검출되었다; 그리고 더욱 고무적인 사실은, 2011년 추가 후속 HIV PCR에서 혈장 ml당 HIV-1 RNA 복사체(copies/ml)가 검출되지 않았고 920/μL의 CD4 카운트가 검출되었다는 것이다.
DMF 작용 방식은 완전히 밝혀지지 않았지만, 이 그룹의 LTNP 대상에 대한 추가 연구에서 그들의 CD8+ 세포가 Ksp37로 알려진 높은 수준의 단백질을 생성한다는 것이 밝혀졌다.
Ksp37을 생성하는 CD8+ 세포의 특징은 다음을 포함한다:
● 이러한 세포에 대한 표현형 마커는 CD27, CD45RO 및 CD57이고; 그리고
● 이들 세포에 대한 신호 분자는 MIP-1β인 것으로 확인되었다 β (Bennett, Salter and Smith, 2018 'HIV Vif-의존성 분해로부터 APOBEC3을 보호함으로써 선천성 면역을 가능하게 하는 새로운 종류의 항레트로바이러스', Trends in Molecular Medicine. Elsevier Ltd, 24(5), pp. 507-520. doi: 10.1016/j.molmed.2018.03.004.).
Ksp37은 모든 인간과 다른 많은 동물에 존재하지만 일반적으로 400 ng/mL 미만의 양으로 존재한다. LTNP 대상의 Ksp37 수준이 이러한 대상에서 HIV가 진행될 수 없는 주요 원인일 수 있다는 가설이 있다.
단백질Ksp37의 특성
KSP37 유전자(FGBP2로도 알려짐)는 일반적으로 NK, CD8+ T, cd T 및 CD4+ T 세포에서 발현되며 223개의 아미노산으로 구성된다(Ogawa et al., 2001 '세포독성 림프구에서 선택적으로 생성되는 새로운 혈청 단백질', The Journal of Immunology, 166(10), pp. 6404-6412. doi: 10.4049/jimmunol.166.10.6404).
Ksp37 또는 37 kDa의 킬러-특이적 분비 단백질 또는 섬유아세포성장인자-결합단백질2(Fibroblast Growth Factor-Binding Protein 2, FGF-BP2)로 알려진 단백질이 분리되었으며, 서열은 하기와 같다:
기원(ORIGIN)
1 ccctttaaag ggtgactcgt cccacttgtg ttctctctcc tggtgcagag ttgcaagcaa
61 gtttatcaga gtatcgccat gaagttcgtc ccctgcctcc tgctggtgac cttgtcctgc
121 ctggggactt tgggtcaggc cccgaggcaa aagcaaggaa gcactgggga ggaattccat
181 ttccagactg gagggagaga ttcctgcact atgcgtccca gcagcttggg gcaaggtgct
241 ggagaagtct ggcttcgcgt cgactgccgc aacacagacc agacctactg gtgtgagtac
301 agggggcagc ccagcatgtg ccaggctttt gctgctgacc ccaaacctta ctggaatcaa
361 gccctgcagg agctgaggcg ccttcaccat gcgtgccagg gggccccggt gcttaggcca
421 tccgtgtgca gggaggctgg accccaggcc catatgcagc aggtgacttc cagcctcaag
481 ggcagcccag agcccaacca gcagcctgag gctgggacgc catctctgag gcccaaggcc
541 acagtgaaac tcacagaagc aacacagctg ggaaaggact cgatggaaga gctgggaaaa
601 gccaaaccca ccacccgacc cacagccaaa cctacccagc ctggacccag gcccggaggg
661 aatgaggaag caaagaagaa ggcctgggaa cattgttgga aacccttcca ggccctgtgc
721 gcctttctca tcagcttctt ccgagggtga caggtgaaag acccctacag atctgacctc
781 tccctgacag acaaccatct ctttttatat tatgccgctt tcaatccaac gttctcacac
841 tggaagaaga gagtttctaa tcagatgcaa cggcccaaat tcttgatctg cagcttctct
901 gaagtttgga aaagaaacct tcctttctgg agtttgcaga gttcagcaat atgataggga
961 acaggtgctg atgggcccaa gagtgacaag catacacaac tacttattat ctgtagaagt
1021 tttgctttgt tgatctgagc cttctatgaa agtttaaata tgtaacgcat tcatgaattt
1081 ccagtgttca gtaaatagca gctatgtgtg tgcaaaataa aagaatgatt tcagaaat
상기 서열은 BLAST 식별을 위한 수탁번호 AB021123에 해당한다. 상기 단백질은 인간 섬유아세포 결합 단백질 2(Human Fibroblast Binding Protein 2)와 99% 상동성을 갖는다(Ogawa et al., 2001). 따라서 FGFBP2는 일반적으로 킬러-특이적 분비 단백질 37의 동의어로 사용된다. FGFBP2 유전자는 침팬지, 붉은털원숭이, 닭, 제브라피시 및 개구리에서 보존된다. 137 유기체는 인간 유전자 FGFBP2를 가진 동원체를 갖는다.
본 발명 당시 LTNP에서 Ksp37의 수준, 또는 LTNP 사이의 Ksp37 수준의 차이, HIV 음성 대상, HAART에서 HIV 양성 대상 및 아직 치료를 시작하지 않은 HIV 양성 대상에 대해 실시된 적절한 연구는 없었다.
상기의 관점에서, 장기 비진행자(Long Term Non Progressors)의 활성화된 CD8+ T 림프구에서 분비되는 단백질 또는 펩티드를 확인하고 특성화하여 이들 장기 비진행자에서 생성되는 Ksp37의 수준을 결정하고, 이러한 결과를 바이러스 감염 및/또는 바이러스성 암의 치료 또는 예방을 위한 치료용 백신 개발에 이용할 필요가 있다.
따라서 본 발명의 실시예는 적어도 어느 정도 상기 언급된 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 인간을 포함하는 포유 동물의 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병의 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 24 kDa - 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 Ksp37로 식별된 단백질이 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암에 대한 대상의 면역 반응을 향상시키는 최적 농도 범위를 확인하는 것을 기반으로 하며, 그리고 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암의 치료를 위한 단백질의 이러한 확인된 농도 범위를 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암의 치료를 위한 의약품 및 의약의 제조에도 이용한다.
본 발명에 따르면, Ksp37 단백질이 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암에 대한 대상의 면역 반응을 향상시키는 최적 농도 범위는 혈장 mL당 400 ng Ksp37 - 혈장 mL당 700 ng Ksp37 이다.
따라서 본 발명은 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 보호하는 방법 및/또는 대상의 혈장 내 Ksp37 수준을 치료 유효 농도 수준으로 상승시킴으로써 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서 Ksp37의 치료 유효 수준은 400 ng/mL - 700 ng/mL 사이이다.
대상의 Ksp37 수준은 하기의 경로 중 하나 이상에 의해 증가될 수 있다:
a) 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa - 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질을 치료적 유효량으로 포함하는 약제를 대상에게 투여함으로써; 및/또는
b) Ksp37 단백질 및/또는 대상에서 치료적 유효 수준으로 Ksp37의 생성을 자극함으로써 대상에 대한 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애와 관련된 질병 및/또는 바이러스성 암과 싸우는 데 유용한 24 kDa - 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질로 번역될 KSP37 유전자로 암호화된 벡터를 투여함으로써; 및/또는
c) 증가된 Ksp37 생성을 활성화하기 위해, 대상을 극성 화합물로 화학적으로 처리함으로써 대상에서 Ksp37 생성을 치료적 유효 수준으로 자극함으로써.
Ksp37의 치료적 유효 수준은 바람직하게는 400 ng/mL - 700 ng/mL의 혈장 농도 수준이고, 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질의 치료적 유효량은 Ksp37 혈장 농도 수준이 400 ng/mL - 700 ng/mL가 되는 양이다.
본 발명은 또한 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 보호하는 방법에 사용하기 위한, 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질, 및/또는 Ksp37 단백질 및/또는24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질로 번역될 KSP37 유전자로 암호화된 벡터를 제공한다.
본 발명은 나아가 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 치료 및/또는 보호하기 위한 약제의 제조에서, 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질, 및/또는 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질로 번역될 KSP37 유전자로 암호화된 벡터를 제공한다. 여기서 상기 약제는 대상에서 KSP37 단백질의 수준을 400 ng/mL 와 700ng/mL 사이로 증가시킨다.
본 발명은 더 나아가 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 보호하는 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 다음 중 하나 이상의 치료적 유효량을 포함한다; 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질, 및/또는 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질로 번역될 KSP37 유전자로 암호화된 벡터, 및/또는 극성 화합물.
Ksp37 단백질 또는 변형된 단백질의 치료적 유효량은 적절한 기간에 걸쳐 1회 이상 투여될 때 대상에서 Ksp37 단백질의 수준을 400 ng/mL 와 700 ng/mL 사이로 증가시킬 수 있는 양을 포함하고, 포유동물 체중 kg당 0.001 마이크로그램(μg/kg)과 포유동물 체중 kg당 20 마이크로그램(μg/kg) 사이이다.
약학적 조성물 또는 약제는 물, 식염수, 인산염 완충 용액, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 폴리에틸렌 글리콜 함유 생리평형염액(physiological balanced salt solution) 및 기타 수성 생리평형염액 뿐 아니라 고정유, 참깨유, 에틸렌 올레이트 트리글리세리드와 같은 비수성 운반체(non-aqueous vehicles)을 포함하는 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
약학적 조성물 또는 약제는 또한 Ksp37을 포유동물 내로 서서히 방출할 수 있는 조절 방출 조성물을 포함할 수 있다.
약학적 조성물 또는 약제는 비강, 경구, 국소, 흡입, 경피, 직장 또는 비경구 투여를 포함하는 허용 가능한 투여 경로를 통해 대상에게 투여될 수 있다.
바이러스 감염을 특징으로 하는 질병으로부터 포유동물을 보호하는 Ksp37의 능력을 향상시킬 수 있는 추가 화합물이 상기 약학적 조성물 또는 약제에 포함될 수 있으며, 상기 화합물은 세포 매개 면역 반응을 조절할 수 있는 화합물, 도움 T세포 활성을 조절할 수 있는 화합물, 비만 세포의 탈과립화를 조절할 수 있는 화합물, 감각 신경 말단을 보호할 수 있는 화합물, 호산구(eosinophil) 및/또는 아세포 활성을 조절할 수 있는 화합물, 및/또는 평활근 수축의 예방 또는 완화할 수 있는 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
Ksp37 단백질은 혈액 성분 및/또는 조직에서 추출한 다음 정제, 아세틸화, 유전자 조작, 클로닝 및 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 치료 및/또는 예방 백신으로서 포유동물 숙주에게 다시 전달될 수 있다.
바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병과 싸우는 데 유용한 KSP37 유전자로 암호화된 벡터는 자연 발생 KSP37 단백질과 동일한 단백질로 번역되는 핵산 서열을 포함한다.
적절한 벡터는 pGEM-T 벡터 또는 pCMV3-C-GFPSpark 를 포함한다.
숙주 세포는 Ksp37 생성을 위한 주요 위치로 식별되는 숙주 면역계와 관련된 모든 혈액 성분 및 포유 동물 조직 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 더 나아가 치료적 유효량의 극성 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 치료적 유효량의 극성 화합물은 대상에서 400 ng/mL 와 700 ng/mL 사이의 수준으로 증가된 Ksp37 생성을 활성화시키기에 충분한 양이다.
상기 극성 화합물은 바람직하게는 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)이다.
Ksp37 생성을 활성화하기 위한 DMF의 치료적 유효량은 약 2 mg/l - 200 mg/l, 더 바람직하게는 약 100 mg/l - 200 mg/l, 더욱 더 바람직하게는 약 150 mg/l 의 DMF의 최고 혈장 수준을 초래하는 용량일 수 있다. 특히 바람직하게는 100 mg/l - 150 mg/l 또는 150 mg/l - 200 mg/l 의 DMF의 최고 혈장 수준이다.
상기 바이러스는 레트로바이러스일 수 있으며, 상기 바이러스성 암은 난소암(ovarian cancer), 백혈병(Leukaemia), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 비인두암종(nasopharyngeal carcinoma) 및 일부 형태의 호지킨병(Hodgkin's disease)을 포함할 수 있다.
상기 대상은 포유동물이다.
본 발명은 또한 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 치료 및/또는 예방 백신을 제공하며, 상기 백신은 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질, 및/또는 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병과 싸우는 데 유용한 KSP37 유전자로 암호화된 벡터의 치료적 유효량을 포함한다.
하기의 설명은 본 발명의 교시를 가능하게 하는 것으로 제공되는 것으로, 본 발명과 관련된 원리를 설명하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 결과를 여전히 달성하면서 및/또는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한, 도시되고 설명된 실시예(들)을 변경할 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 결과 또는 이점은 다른 특징을 이용하지 않고 본 발명의 일부 특징을 선택함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 당업자는 본 발명에 대한 변경 및 조정이 가능할 수 있고 특정 환경에서는 바람직할 수 있으며, 본 발명의 일부를 형성할 수 있음을 인식할 것이다.
1. 다른 샘플 그룹 간의 Ksp37 수준 비교
5명의 알려진 LTNP 개체 (LTNP1-LTNP5) 샘플 뿐 아니라 15명의 지원자 무작위 샘플이 조지 무카리 아카데믹 병원(George Mukhari Academic Hospital)에서 선택되었다. 상기 15명의 무작위 지원자는 하기 분류로 더 나뉘었다:
-
HIV 양성이고 HAART 중인 지원자 5명 (HAART1-HAART5);
-
최근 HIV 진단을 받았고 아직 HAART를 시작하지 않은 지원자 5명 (NAIVE1-NAIVE5); 및
-
HIV 음성인 지원자 5명 (NEG1-NEG5).
5명의 LTNP 개체의 샘플 크기는 알려진 LTNP 개체의 희소성에 의해 결정되었다.
이들 20명의 개체로부터 혈액 샘플을 채취하였다.
a. 세포 분리 (Cell Isolation)
제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트 (Thermo Fischer Tempus Spin RNA Isolation Kit)를 사용하여 전혈에서 전체 RNA를 분리하였다. 5분/초(min/s) 동안 250 x g 로 원심분리 하여 전혈에서 세포를 분리하였다. 다음으로 세포 펠렛을 얼음처럼 차가운 PBS, pH7.4로 두번 세척하고 β-메르캅토에탄올이 보충된 600 μl 용해 완충액에 재현탁한 다음 10초/초(sec/s) 동안 와류 혼합하였다. 360 μl 의 에탄올을 세포 용해물에 첨가하고 흡입에 의해 혼합하였다. 그런 다음 700 μl 용해물을 수집 튜브에 삽입된 RNA 정제 칼럼으로 옮겼다. 칼럼 내용물을 1분 동안 12 000 x g 로 원심분리 하였다. 통과액은 버렸다. 정제 칼럼을 세척 완충액 1 및 2로 세척한 다음, 1분 동안 12 000 x g로 원심분리하고 통과액을 버렸다. RNA를 뉴클레아제 없는 멸균 탈이온수 50 μl로 용출한 다음 1분 동안 12 000 x g 로 원심분리 하였다. 용출 RNA는 -70 ℃에서 보관하였다.
b. RNA의 cDNA로 전환
추출된 RNA는 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트 (Thermo Scientific Superscript VILO cDNA Synthesis Kit)를 사용하여 cDNA로 역전사되었다. cDNA 반응 혼합물은 10 μl 주형 RNA, 2 μl 올리고 d(T) 프라이머, 12 μl 뉴클레아제 없는 탈이온수, 4 μl 5x 반응 완충액, 1 μl 리봅록(RibobLock) RNase 억제제 및 1 μl MuLV 역전사효소를 함유했다. 생성된 cDNA는 사용하기 전까지 -70 ℃에서 보관하였다.
c. 그 결과로 생성된 cDNA의 증폭 및 정량화
cDNA는 제조사의 지시에 따라 중합효소 연쇄 반응 키트(polymerase chain reaction kit (Kapa Bio systems, USA)를 사용하여 증폭하였다. PCR 반응 혼합물에는 정방향 5'-CTTCCGAGGGTGACAGGTGA-3' 및 역방향 5'-TCCAGTGTGAGAACGTTGGATTG-3' 프라이머 (각각 0.4μM) 2μl, 주형 cDNA 5μl, 뉴클레아제 없는 탈이온수 16 μl 및 2x Ready Mix 25 μl가 포함되어 있다. PCR 반응은 95 ℃에서 90초 동안 변성(denaturation), 59 ℃에서 30초 동안 프라이머 어닐링(primer annealing) 및 1분 동안 72 ℃에서 7분 동안 신장(elongation)으로 구성되었다. 실온에서 최소 60분 동안 75볼트(V)에서 2퍼센트(%) 아가로스겔 전기영동으로 PCR 생성물을 분석했다. 상기 겔을 관찰하고, Chemo (Bio-Rad)를 사용하여 밴드 강도를 추정하였다. 그런 다음 제한효소단편장다형(restriction fragment length polymorphism, RFLP)을 사용하여 단백질 다형(Protein polymorphism)을 결정하였다.
d. 다른 그룹의 사이토카인 정량화
선택된 사이토카인 (IFN-y, IL-5, GM-CSF, TNF-aIL-2, IL-13, IL-4IL-10, IL12p70) 의 양은 건강한 공여자의 신선한 말초 혈액으로부터의 단일 인간 CD8 림프구에 있는 사이토카인 단백질의 직접적인 정량 측정을 사용하여 다른 그룹 사이에서 결정되었다 donors (Saxena et al., 2018 생체외 자극 후 인간 혈액의 단일 림프구에서 사이토카인 단백질의 초고감도 정량화 Ultrasensitive Quantification of Cytokine Proteins in Single lymphocytes from Human Blood following ex-vivo stimulation Front. Immunol., 9:2462. doi: 10.3389/fimmu.2018.02462.eCollection2018).
결과
실시간 PCR 분석은 하기 표와 같이 Ksp37 수준을 나타냈다:
| 샘플 | Ksp37 값 (ng/mL) |
| LTNP1 | 507.24 |
| LTNP2 | 473.23 |
| LTNP3 | 530.99 |
| LTNP4 | 571.53 |
| LTNP5 | 655.88 |
| HAART1 | 173.98 |
| HAART2 | 152.70 |
| HAART3 | 158.31 |
| HAART4 | 158.90 |
| HAART5 | 176.70 |
| NAIVE1 | 375.34 |
| NAIVE2 | none |
| NAIVE3 | 348.40 |
| NAIVE4 | 236.28 |
| NAIVE5 | 433.81 |
| NEG1 | 243.49 |
| NEG2 | 274.41 |
| NEG3 | 249.38 |
| NEG4 | - |
| NEG5 | - |
실시간 PCR 결과는 하기 그래프에 나타난 바와 같이, 다른 연구 그룹의 혈청과 비교할 때 LTNP 혈액 혈청 (평균 26주기)에서 Ksp37 검출에 대해 더 적은 주기로 관찰된 HPLC 피크를 확인하였다:
그래프 1: 실시간 PCR 결과
상기 결과는 장기 비진행자 그룹(LTNP)의 혈청이 단백질 Ksp37의 수준이 상당히 더 높은 것을 나타낸다.
상기 단백질은 또한 하기의 표 2에 나타낸 바와 같이, IL-12p70, IFN-γ 및 IL-4 와 같은 다른 사이토카인 및 단백질이 더 높은 수준과 관련이 있는 것으로 나타났다. 수준은 ng/mL로 측정된다.
| 샘플 | IFN-γ | IL-5 | GM-CSF | TNF-a | IL-2 | IL-13 | IL-4 | IL-10 | IL12p70 |
| LTNP1 | 4,5 | 3,5 | -1 | 15 | 4 | 6,5 | 3,5 | 1,5 | 4 |
| LTNP2 | 2,5 | 2 | -2 | 8,5 | 4 | 3 | 2 | 5,5 | 2,5 |
| LTNP3 | 2 | 3 | -1 | 45,5 | 4 | 2,5 | 1,75 | 4 | 2,5 |
| LTNP4 | 2,5 | 3,25 | 1,5 | 85 | 8,5 | 3 | 2,5 | 0 | 2,5 |
| LTNP5 | 3,5 | 2,5 | 1 | 105 | 7,75 | 1 | 1 | -10 | 2 |
| HAART1 | 0 | 0,5 | -5,5 | 12 | 1 | 0 | 0,5 | 0 | 0 |
| HAART2 | 0 | 2,5 | -3,5 | 26 | 4 | 2 | 2,5 | 6 | 1 |
| HAART3 | -1 | 0,5 | -4,5 | 16 | 1 | 1 | 0,5 | -1 | 0 |
| HAART4 | 2 | 0,5 | -4,5 | 6 | 0 | 2 | 0,5 | 1 | 1 |
| HAART5 | 6 | 1,5 | -2,5 | 10 | 0,5 | 2 | 0,5 | 2,5 | 2 |
| NAIVE1 | -1 | -0,5 | -6,5 | 18 | 0 | 1 | 0,5 | -9 | 0 |
| NAIVE2 | 0 | 2,5 | -2,5 | 6 | 0 | 1 | -0,5 | -2 | 1 |
| NAIVE3 | 0 | 0,5 | -5,5 | 10 | 0 | 1 | -0,5 | 1 | 0 |
| NAIVE4 | 1 | 1,5 | -4,5 | 3 | 1 | 1 | -0,5 | 1 | 1 |
| NAIVE5 | 0 | 1,0 | -4,0 | 6 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| NEG1 | 0 | 0,5 | -5,5 | 5 | 0 | 0 | -0,5 | -2 | 0 |
| NEG2 | 1 | 0,5 | -2,5 | 8 | 1 | 1 | 0,5 | 1 | 0 |
| NEG3 | 0 | 1,5 | -5,5 | 6 | 0 | 2 | 0,5 | 4 | 1,5 |
| NEG4 | 1 | 2,5 | -4,5 | 19 | 0,5 | 3 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| NEG5 | 1 | 1,5 | -5,5 | 11 | 1 | 1 | 0,5 | 0 | 1 |
사용된 샘플은 배양된 세포에서 얻은 것이고 따라서 상기 표에 나온 값은 인간 숙주에서 직접 채취한 샘플에서 예상되는 사이토카인 값을 의미하지 않는다는 점을 염두에 두어야 한다. 그러나 그 값은 Ksp37의 높은 수준과 관련된 면역 경로에 대한 관찰을 가이드한다.
IFN-γ 및 IP-12p70의 생성은 양성 피드백 루프에 의해 부분적으로 조절되며, IFN-γ 및 GM-CSF는 IL-12p70 생성을 촉진하고 차례로IL-12p70은 IFN-γ 및 GM-CSF 분비를 자극한다. IL-12p70 및 IFN-γ 는 Th1 분화를 촉진하여, 세포 매개 면역을 선호하고 Th2 반응을 억제한다.
상기 IFN-y 결과를 고려할 때, LTNP의 평균값은 다른 연구 그룹의 값보다 상당히 높다. IFN-γ는 선천성 면역과 후천성 면역 모두에 중요한 사이토카인이며, 자연 살해 세포와 호중구를 자극하는 것 외에도 대식세포의 1차 활성화제 역할을 한다.
IFN-γ는 HIV 감염에서 더 나은 질병 예후의 상관자(correlator)로 확인되었으며, CD8+ T세포 및 활성화된 NK 세포 수와 긍정적 연관이 있음을 확인하였다(L
pez M et al., 2011'HIV 특이적 CD8 + T 세포의 질적이 아닌 확장 능력은 장기 비진행자에게 있어서 보호적 인간 백혈구 항원 클래스 I 대립유전자와 관련이 있다', Immunology, 134(3), pp. 305-313. doi: 10.1111/j.1365-2567.2011.03490.x.).
마찬가지로, IL-12p70 값을 고려할 때, LTNP의 평균값은 다른 연구 그룹의 값보다 상당히 높다. IL-12p70은 T세포의 성장 및 기능, T세포 및 자연 살해(NK) 세포로부터의 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 생성을 자극하고, IFN-γ 의 IL-4-매개 억제를 감소시킨다.
SIV에 감염된 마카크(macaques)에서 급성 감염 동안 IL-12p70 치료는 바이러스 부하 감소, CD8+ NK 및 T 세포 증가, 귀환 마커를 발현하는 나이브(na
ve) CD4+ T 세포 감소, HIV 특이적 CTL 유지 및 생존 연장과 관련이 있었다.
상기 결과는 또한 다른 연구 그룹과 비교할 때 LTNP 그룹에서 더 높은 수준의 IL-4를 가리킨다. IL-4는 활성화된 B세포 및 T세포 증식 자극, B세포의 형질 세포로의 분화를 포함하는 많은 생물학적 역할을 한다. 이것은 체액성(humoral) 및 후천성(adaptive) 면역의 핵심 조절자이다. IL-4는 B세포 클래스를 IgE로 전환하도록 유도하고 MHC 클래스 II 생성을 상향 조절한다. IL-4 와 IL-12p70은 보완적인 역할을 한다. IL-4의 주요 기능은 후천성 면역계와 CD8+ 세포독성 세포를 자극하는 것이다. 전체 IL-12p70은 IL-4의 억제를 방지한다.
최근 연구에 따르면 또한 IL-10은 단핵구/대식세포에서 HIV-1 복제를 상당히 억제할 수 있다. 단핵구/대식세포에서 HIV-1 생성에 대한 IL-10의 억제 효과는 IL-10이 종양 괴사 인자 알파 및 IL-6과 같은, 이들 세포에서 HIV-1 발현을 상향 조절할 수 있는 다른 사이토카인 합성 억제를 유도한 결과이다.
2. Ksp37의 작용 방식
Ksp37의 작용 방식에 대한 연구가 진행되는 동안, Ksp37의 증가된 수준은 여러가지 다른 메커니즘에 의해 HIV가 AIDS로 진행되는 것을 억제하는 것으로 보인다. 여기에는 다음이 포함된다:
a. CD8 + 고려
증가된 수준의 Ksp37이 HIV에서 AIDS로으 진행을 억제하는 한가지 가능한 메커니즘은 HIV GAG 특이적 세포인 Ksp37의 생성 부위와 연결되어 있다. GAG 특이적 CD8+ 세포는 CD107a IFN-γ MIP-1β IL-2 TNF-α 의 생성 수준을 특징으로 한다(T, H. C. D. et al. (2006) 'IMMUNOBIOLOGY HIV 비진행자는 우선적으로 높은 기능을 유지한다', Blood, 107(12), pp. 4781-4789. doi: 10.1182/blood-2005-12-4818).
이러한 구성요소의 생성은 HIV의 면역 억제 능력을 부정하는 것으로 여겨진다. Ksp37은 이러한 HIV 특이적 CD8+ 세포에서 퍼포린(perforin), TNF-α 및 IL-2 와 같은 성분의 방출을 제어함으로써도 HIV의 면역 억제 효과를 제어하는 것으로 추정된다. LTNP 개체의 HIV 감염에 대한 초기 반응은 다른 연구 그룹에서 볼 수 있는 것과 동일하다. LTNP 개체에서 HIV 특이적 CD8+ 세포가 활성화되면, 몇가지 결과가 관찰된다. TNF-α의 수준은 증가하지만 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이 Ksp37의 수준이 증가함에 따라 감소한다:
| HIV 감염 전 초기 Ksp37 값 | HIV 감염 4시간 후 Ksp37 값 | 초기 TNF-α 값 | 4시간 후TNF-α 값 |
|
|||
| LTNPs | 441 ± 235 ng/ml | 800 ±529 ng/ml | 9 ±2 pg/mL | 3 ± 1 pg/mL | |||
| Progressors | 380 ± 200 ng/ml | 246 ± 127 ng/ml |
7 ± 2pg/mL | 15 ±6 pg/mL | |||
신체에서 TNF-α의 주요 역할은 인체의 염증과 관련이 있다. 감소된 수준의 TNF-α는 활성화 부위의 염증을 감소시켜 CD4+ 세포의 반응을 낮춘다. 이로 인해 바이러스가 혈류에 노출되어 CD4+ 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 된다. 이를 통해 HIV 특이적 CD8+ 세포가 바이러스를 직접 공격할 수 있다. 바이러스는 일반적으로 바이러스 특이적 CD8+ T 세포에 의해 제거되며, 감염된 세포 표면에서 HLA 클래스 I 분자와의 복합체로 제시되는 처리된 바이러스 단백질을 인식한다. T세포 수용체(TCR)를 통한 인식은 일련의 활성화 이벤트를 시작하여 궁극적으로 그랜자임(granzymes) 및 퍼포린(perforin )의 방출과 감염성 자손 비리온이 생성되기 전에 발생할 수 있는 감염된 세포의 사멸로 이어진다(R. Brad Jones et al., 2016).
높은 IL-2 수준은 중심 기억 T 세포를 감소시키고 반응기(effectors)를 증가시킴으로써 초기 기억 T 세포의 전체 발생을 감소시킨다(T. Kaartinen et al., 2017). 따라서, IL-2 수준과 CD8+ T세포의 발생 및/또는 수명 사이에는 반비례 관계가 있다. Ksp37 발현 CD4 및 CD8 T 세포는 IL-2를 생성하는 능력이 부족하다(Ogawa et al., 2001). 따라서, 높은 수준의 Ksp37은 활성화 시 낮은 수준의 IL-2 생성과 관련이 있다. 따라서 Ksp37의 수준은 IL-2의 수준에 반비례한다.
따라서, Ksp37 수준이 높으면, IL-2가 낮고, 그리고 CD8+ 기억 세포 발생이 증가하여 수명이 길어진다. 이것은 바이러스를 죽이는 더 큰 능력을 지원한다. 면역계의 초기 활성화는 IL-2에 의해 이루어지며, IL-2가 제거되면 감염된 세포가 대량으로 사멸하게 된다. HIV 특이적 CD8+ 세포는 IL-2를 생성하는 능력이 부족하기 때문에(Ogawa et al., 2001), IL-2 수준에 크게 영향을 받지 않는다.
언급한 바와 같이, 샘플 연구는 실험실 내부 및 숙주 면역계 외부에서 성장한 세포를 활용했으며, 그 결과 기록된 IL-2 수준은 LTNP 숙주에서 일반적으로 발견되는 것을 완전히 나타내지는 않는다.
발암성 발현에 대한 극성 물질의 작용은 암 세포가 더 양성이 되도록 유도하는 것으로 추정된다. 악성 세포를 양성 유형으로 전환하려면 먼저 악성 종양을 유발하는 유전자 발현의 일부 조절이 있어야 한다는 것이 합리적으로 보일 것이다.
2021년 Ogawa 등이 수행한 연구에 따르면 Ksp37은 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스 환자의 세포독성 림프구 매개 면역의 필수 과정에 관여할 수 있으며, Ksp37은 생체 내에서 세포독성 림프구의 모니터링을 위한 새로운 유형의 혈청 지표로서 임상적 가치를 가질 수 있다. EBV는 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma) 및 일부 형태의 호지킨병(Hodgkin's disease)과 관련이 있다. EBV는 인간 B세포의 유전자 코드를 쉽게 감염시키고 변경할 수 있으며, 면역 억제 환자를 악성 종양에 취약하게 만들 수 있다.
b. Vif 억제제로서의 Ksp37
Ksp37은 또한 Vif 억제제로 작용하는 것으로 여겨진다.
레트로바이러스에 대한 신체의 자연 면역 반응은 APOBEC3 단백질의 기능을 기반으로 한다. 인간 APOBEC3 (A3) 단백질은 바이러스 cDNA를 과돌연변이 시키고/시키거나 역전사를 억제함으로써 레트로바이러스의 복제를 강력하게 제한하는 세포성 시티딘 탈아미노효소(cytidine deaminases)이다. A3A, B, C, D, E, F, G 및 H를 포함하여 이 패밀리의 7개 구성원(members)이 있으며, 모두 인간 염색체 22에 탠덤 배열(tandem array)로 암호화된다. A3F 및 A3G 는 HIV-1의 가장 강력한 억제제이지만, 바이러스로 암호화된 단백질인 Vif가 없는 경우에만 가능하다(Shingo K, et al., 2011).
상기 시티딘 탈아미노효소 APOBEC3G (A3G)는 HIV-1 감염에 대해 다면적인 항바이러스 효과를 발휘한다. 첫째, A3G는 역전사 동안 바이러스 DNA의 마이너스 가닥에 있는 우라실(uracil)로 시토신(cytosine) 잔기를 탈아민화함으로써 HIV 감염을 종료할 수 있는 것으로 나타났다(Sadler H et al., 2010 'APOBEC3G 는 치명적인 돌연변이 유발을 통해 HIV-1 변이에 기여한다', Journal of Virology, 84(14), pp. 7396-7404. doi: 10.1128/jvi.00056-10.). 또한 많은 연구에서 A3G가 비편집 매개(non-editing-mediated) 메커니즘에 의해 HIV-1 역전사를 억제한다는 사실이 밝혀졌다.
HIV Vif는 인간 엘론긴 B/C-큐린- SOCS 박스-유형 E3 유비퀴틴 리가아제(Elongin B/C (EloBC)-cullin-SOCS box (ECS)-type E3 ubiquitin ligase)를 하이재킹하여 인간 항바이러스 단백질 APOBEC3G를 길항하여, APOBEC3G의 폴리유비퀴틴화 및 이후 프로테아좀 분해를 일으킨다(Matsui Y et al., 2016 '코어 결합 인자 β 는 MDM2 매개 분해로부터 HIV, 1형 보조 단백질 바이러스 감염 인자를 보호한다', Journal of Biological Chemistry, 291(48), pp. 24892-24899. doi: 10.1074/jbc.M116.734673.).
HIV Vif 단백질은 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV)에서 발견되는 p23 항원과 유사한 기능을 가지고 있다(다른 기능 중에서도, Hsp90/70 샤페론 단백질과의 각각의 상호 작용에서). 항원 p23은 Vif HIV 단백질의 동형 단백질(Isoform)이다. 동형 단백질 또는 "단백질 변이체(variant)"는 단일 유전자 또는 유전자 패밀리에서 유래하고 유전적 차이의 결과인 매우 유사한 단백질 세트의 구성원이다. 동형 단백질은 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 갖는 경향이 있다. Ogawa 등은 EBV가 존재할 때 Ksp37이 더 많이 생성된다는 것을 발견했다. 이것은 Ksp37의 항바이러스 특성을 나타낸다.
HIV Vif와 EBV p23 항원의 유사성을 고려할 때, EBV와 싸우는 APOBEC3G 단백질의 기능을 지원하는 Ksp37의 메커니즘은 HIV와 싸우는 APOBEC3G 단백질의 기능을 지원하는 Ksp37의 메커니즘과 유사하다고 여겨진다.
따라서, Ksp37의 작용 메커니즘은 E3 리가아제 복합체의 형성을 억제하는 Vif 억제제의 하위 분류를 제공할 수 있다. Vif 단백질의 가능한 억제는 A3G 단백질이 바이러스 DNA의 번역을 방해할 수 있게 한다.
3. Ksp37이 가장 효과적인 농도 수준
상기 표 1 내지 3의 결과는 Ksp37이 400 ng/mL 와 700 ng/mL 사이의 혈중 농도 수준에서 기능함을 나타낸다.
Ksp37은 정상적인 건강한 개체에서 400ng/mL 미만의 농도로 존재한다. 이 수준에서는 HIV 바이러스 및 아마도 다른 레트로바이러스의 면역 장애 복제를 억제하는 데 효과적이지 않다. 반대로, Ksp37의 농도가 750 ng/mL 보다 높으면 Ksp37이 면역계 활성 증가와 관련된 IL-5 및 TNF-α 와 같은 사이토카인에 대해 갖는 긍정적인 영향 때문에 천식 및 다운증후군을 포함한 자가면역 질환을 유발할 수 있다.
이에 비추어, 본 발명은 대상의 Ksp37 수준을 400 ng/mL 와 700 ng/ml 사이로 증가시킴으로써, 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 보호하는 방법을 제공한다.
대상의 Ksp37 수준은 하기의 경로 중 하나 이상에 의해 증가될 수 있다:
(a) 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질을 치료적 유효량으로 대상에게 투여함으로써;
(b) 대상에게 Ksp37 단백질로 번역될 Ksp37 유전자로 암호화된 벡터를 투여함으로써 대상에서 Ksp37의 생성을 400 ng/mL - 700 ng/mL의 농도 수준으로 자극함으로써; 또는
(c) 대상에게 극성 화합물을 처리하여 대상의 Ksp37 생성을 400-700ng/mL의 농도 수준으로 자극하여 증가된 Ksp37 생성을 활성화함으로써.
대상은 모든 포유동물을 포함할 수 있으며 인간에 국한되지 않는다.
4. 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질을 대상에게 투여
본 발명의 한 실시양태에서, 임상적으로 변형/복제되거나 유전자 조작된 Ksp37단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 단백질, 및/또는 임상적으로 변형/복제되거나 유전자 조작된 Ksp37단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 단백질을 포함하는 제제가 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위해 대상에게 투여될 수 있다.
상기 대상은 포유동물이다.
상기 단백질은 포유동물 단백질인 Ksp 단백질 및 모든 종의 그룹으로부터 선택된다.
상기 단백질은 223개의 아미노산 사슬을 가진 약 37 kDa의 분자량을 가지며, N-말단 신호 서열, 짧은 C-말단 소수성 영역, 잠재적인 O-글리코실화 부위 및 시스테인 측쇄를 포함한다.
상기 단백질은 혈액 성분 및/또는 조직에서 추출한 다음 정제, 아세틸화, 유전자 조작, 클로닝 및 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련 질병에 대한 보호 또는 치료를 위한 치료 및/또는 예방 백신으로서 포유동물 숙주에게 다시 전달될 수 있다.
하나 이상의 재조합 분자를 사용하여 체외에서 Ksp37 단백질을 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 암호화된 산물은 단백질을 생산하기에 효과적인 조건 하에서 핵산 분자를 발현시킴으로써 생산된다.
암호화된 단백질을 생산하는 바람직한 방법은 재조합 세포를 형성하기 위해 Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 재조합 분자로 숙주 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. 형질감염에 적합한 세포는 형질감염될 수 있는 임의의 세포이다. 숙주 세포는 형질감염된 세포이거나 적어도 하나의 핵산 분자로 이미 형질전환된 세포일 수 있다.
본 발명에서 유용한 숙주 세포는 박테리아, 진균, 포유동물 및 곤충 세포를 포함하는 Ksp37 단백질을 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있다.
숙주 세포로의 핵산 분자의 형질감염은 핵산 분자가 세포로 삽입될 수 있는 임의의 방법에 의할 수 있다. 형질감염 기술은 형질감염(transfection), 전기영동(electrophoretic), 미세주입(microinjection), 리포펙션(lipofection), 흡착(adsorption) 및 원형질 융합(protoplasm fusion)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서, 발현은 숙주 세포 내에서 형질감염된 핵산 분자에 의해 개선될 수 있으며, Ksp37을 암호화하는 핵산 분자가 전사될 수 있는 효율, 생성된 전사물의 번역 효율 및 핵산 분자의 발현을 증가시키는 데 유용한 번역 후 변형 재조합 기술의 효율이 향상될 수 있다.
Ksp37 단백질의 생체 외 생산에는 핵산 분자를 높은 카피 수의 플라스미드에 작동 가능하게 연결하는 것, 핵산 분자를 하나 이상의 숙주 세포 염색체로 통합하는 것, 플라스미드에 벡터 안정성 서열을 추가하는 것, 전사 제어 신호(프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)를 서브섹션(sub sectioning) 또는 변형하는 것, 번역 제어 신호(예: 리보솜 결합 부위, Shere-Dalogans 신호)를 치환 또는 변형하는 것, 숙주 세포의 코덤(codum) 사용에 해당하는 핵산 분자의 변형 및 전사체를 불안정하게 만드는 서열의 제거가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 발현된 재조합 Ksp37 단백질의 활성은 그러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 단편화, 변형 또는 유도체화함으로써 개선될 수 있다.
Ksp37 단백질을 포함하는 제제를 포유동물의 표적 세포에 전달하는 단계.
"표적 부위"는 치료 제제를 전달하고자 하는 포유동물의 부위를 의미한다. 예를 들어, 표적 부위는 림프구, 줄기 세포, 모든 혈액 성분, 및 세포 및 세포막을 포함하는 천연 지질 함유 전달 운반체; 및 리포좀 및 미셀을 포함하는 인공 지질 함유 전달 운반체를 포함하는 기타 전달 운반체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 전달 운반체는 포유동물의 특정 부위를 표적으로 하고, 이로 인해 그 부위에서 핵산 분자를 표적화하고 이용하도록 공지된 기술에 의해 변형될 수 있다.
적합한 변형은 전달 운반체의 지질 위치의 화학식을 조작하는 것 및/또는 전달 운반체를 바람직한 부위, 예를 들어 바람직한 세포 유형으로 특이적으로 표적화할 수 있는 화합물을 운반체 내로 도입하는 것을 포함한다. 특이적 표적화는 운반체 내의 화합물과 세포 표면의 분자의 상호 작용에 의해 전달 운반체가 특정 세포에 결합하도록 하는 것을 의미한다. 적합한 표적 화합물은 특정 부위에서 또 다른 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 이러한 리간드의 예는 항체, 항원, 수용체 및 수용체 리간드를 포함한다.
전달 운반체의 지질 위치의 화학식을 조작하면 전달 운반체의 세포 외 또는 세포 내 표적을 조절할 수 있다. 예를 들어, 리포좀이 특정 전하 특성을 갖는 특정 세포와 융합하도록 리포좀의 지질 이중층의 전하를 변경하는 화학물질을 리포좀의 지질식에 첨가할 수 있다.
부형제
대상에게 투여되는 Ksp37 단백질을 포함하는 제제는 또한 약학적으로 허용되는 부형제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제제는 대상이 견딜 수 있는 부형제로 제제화될 수 있으며, 이러한 부형제의 예는 물, 식염수, 인산염 완충 용액, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 폴리에틸렌 글리콜 함유 생리평형염액(physiological balanced salt solution) 및 기타 수성 생리평형염액을 포함한다. 고정유, 참깨유 및 에틸렌 올레이트 트리글리세리드와 같은 비수성 운반체도 사용될 수 있다.
다른 유용한 제제는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트린과 같은 점도 향상제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 등장성 및 화학적 안정성 또는 완충제를 향상시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 포함할 수도 있다. 완충제의 예는 인산염 완충액, 중탄산염 완충액, 트레스 완충액을 포함하고, 방부제의 예는 트리메레살, m-오로-크레졸, 포르말린 및 벤질 알코올을 포함한다.
표준 제제는 액체 또는 주사가능하거나 적합한 액체에 현탁액 또는 주사 용액으로 흡수될 수 있는 고체일 수 있다. 따라서, 비-액체 제제에 있어서, 부형제는 투여 전에 멸균수 또는 염수가 첨가될 수 있는 덱스트릴, 인간 혈청 알부민, 방부제 등을 포함할 수 있다.
Ksp37단백질은 경구, 비강, 국소, 흡입, 경피, 직장 및 비경구(피하/근육내) 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경로에 의해 투여될 수 있다.
제어된 방출
포유동물에게 투여하기 위한 Ksp37 단백질 또는 변형 단백질을 포함하는 제제는 Ksp37을 포유동물 내로 서서히 방출시킬 수 있는 제어된 방출 조성물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 제어된 방출 조성물은 Ksp37 단백질 또는 제어된 방출 운반체를 포함한다.
적합한 제어된 방출 운반체는 생체적합성 중합체, 기타 중합체 매트릭스 캡슐, 마이크로 캡슐, 마이크로 입자, 볼루스 제제(Bolus preparations), 삼투압 펌프, 확산 장치, 리포좀, 리포스피어(lipospheres), 건조 분말 및 경피 전달 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 제어된 방출은 포유동물에게 투여 시 제자리(in-situ)에서 고체 또는 겔을 형성하는 액체를 포함한다.
추가 화합물
바이러스 감염을 특징으로 하는 질병으로부터 포유동물을 보호하는 Ksp37의 능력을 향상시킬 수 있는 추가 화합물이 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 화합물은 세포 매개 면역 반응 조절, 도움 T세포 활성 조절, 비만 세포의 탈과립화 조절, 감각 신경 말단 보호, 호산구 및/또는 아세포 활성 조절, 및/또는 평활근 수축을 예방하거나 완화할 수 있는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 추가로 미세혈관 투과성을 유도하거나 Th1 및/또는 Th2 세포 서브셋(subset) 분화를 조절할 것이다.
Ksp37 단백질과 함께 투여될 화합물의 선택은 포유동물의 다양한 특성에 기초하여 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 특히 포유동물의 유전적 배경, 건강 이력, 신체적 징후, 구조 약물 및 혈액 가스 사용, 및 혈액 분석.
투여량
포유동물에게 투여되는 Ksp37 단백질 또는 변형된 단백질의 치료 용량은, 적당한 기간에 걸쳐 1회 이상 투여될 때, 감염 및/또는 Th-1 유형 면역 반응을 특징으로 하는 질병으로부터 포유동물을 보호하고/하거나 질병을 치료할 수 있는 용량을 포함한다.
대안적으로, Ksp37 단백질 또는 변형된 단백질의 치료 용량은 포유동물의 면역계를 개선하는 용량을 포함한다. 보다 대안적으로, Ksp37 단백질 또는 변형된 단백질의 치료 용량은 바이러스 감염을 감소시키고/시키거나 Th1형 사이토카인을 증가시키는 용량을 포함한다.
치료적 또는 예방적 결과를 발휘하는 것으로 추정되는 Ksp37 단백질 또는 변형된 단백질의 바람직한 단일 용량은 포유동물 체중 kg당 0.001 마이크로그램(μg/kg)과 포유동물 체중 kg당 20마이크로그램(μg/kg) 사이인 것으로 확인되었다.
4. 세포에서 KSP37의 발현을 자극하는 방법
유전자 요법은 다양한 유전 및 후천적 장애의 치료를 위해 고려 중인 새로운 치료 방식이다. 그것은 치료의 종결을 향한 유전자 발현 조작을 전제로 한다. 생명 공학의 최근 발전은 치료 유전자를 생체 내 세포로 직접 전달하는 것을 기반으로 하는 생체 내 유전자 치료 접근법의 개발을 자극했다. 유전자 치료는 단백질의 기능을 회복, 증가 또는 변형하기 위해 해당 유전자의 정상적인 카피(copy)를 도입하는 것을 목표로 한다.
Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 전체 (완전한) 유전자 또는 이의 일부로서 천연 원료에서 얻을 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (중합효소 연쇄 반응 증폭 클로닝) 또는 화학적 합성을 사용하여 생산될 수 있다.
핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 동족체를 포함하며, 본 발명의 방법에 유용한 Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 능력 실질적으로 방해하지 않는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실된 치환 및/또는 반전된 천연 대립형질 변이체 및 변형된 핵산 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, HIV 및 바이러스성 암과 같은 바이러스 면역계 관련 감염과 싸우는 데 유용한 Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 분자는, 자연 발생 Ksp37 단백질과 동일한 단백질로 번역되는 핵산 서열이다.
분리된(isolated) 또는 생물학적 순수 핵산 분자는 자연 환경에서 제거된 핵산 분자이다.
Ksp37 단벡질을 암호화하는 핵산 분자는, 재조합 DNA 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이(site directed mutagenesis), 돌연변이를 유도하기 위한 극성 화합물로 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 관류(irrigation), 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 핵산 서열의 선택 영역의 돌연변이, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 구축하기 위한 혼합물 그룹의 결찰(ligation) 및 이들의 조합을 포함하는 당업자에게 알려진 여러 방법 중 임의의 것을 사용하여 생산될 수 있다. 핵산 분자 엔벨로프는 핵산에 의해 암호화되는 기능의 스크리닝에 의해 변형된 핵산의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 Ksp37 단백질을 암호화하는 데 사용되는 핵산 분자는 재조합 분자를 형성하도록 하나 이상의 전사 조절 서열에 작동가능(operatively)하게 연결될 수 있다. "작동가능하게 연결"이라는 어구는 분자가 전체 세포로 형질감염(transfected), 형질도입(transduced) 또는 형질전환(transformed)될 때 발현될 수 있도록 하는 방식으로 핵산 분자를 전사 조절 서열에 연결하는 것을 의미한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 신장 및 종료를 조절하는 서열이다. 여기서 특히 중요한 것은 조절된 전사 개시, 프로모터, 인핸서(enhancer), 오퍼레이터(operator) 및 리프레서(repressor) 서열이다.
적합한 전사 조절 서열은 Ksp37 단백질의 발현에 유용하고/하거나 본 발명의 방법에서 포유동물에 투여하기에 유용한 재조합 세포에서 전사할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 바람직한 전사 조절 서열은 포유동물, 박테리아 또는 곤충 세포에서 기능하는 것들을 포함한다.
본 발명의 전사 조절 서열은 또한 본 발명의 방법에 유용한 KSP 37 단백질을 암호화하는 유전자와 자연적으로 관련된 자연 발생 전사 조절 서열을 포함할 수 있다.
DNA 또는 RNA일 수 있는 본 발명의 재조합 분자는 또한 번역 조절 서열, 오리진 또는 복제, 및 재조합 세포와 호환되는 다른 조절 서열과 같은 추가 조절 서열을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 분자는 발현된 Ksp37 단백질이 단백질을 생산하는 세포로부터 분비될 수 있도록 하는 분비 신호(신호 세그먼트(segment) 핵산 서열)를 함유한다.
적합한 신호 세그먼트는 상기 언급된 임의의 Ksp37 단백질 및 Ksp37 단백질의 모든 관련 종 및 뉴클레오티드와 자연적으로 관련된 신호 세그먼트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
유전자 치료의 속도 제한 기술은 유전자 전달을 수행하는 데 사용되는 벡터로 알려진 유전자 전달 수단이다. 벡터는 또한 특정 단백질의 유전자 생산을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
적합한 벡터
Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 투여에 특히 유용한 제약 등급으로 허용되는 벡터의 예는 하기와 같다:
●
pGEM-T 벡터
●
pCMV3-C-GFPSpark
이들은 현재 시장에서 KSP37 서열용 벡터로 사용되는 일부 벡터이다.
발현 구조라고도 알려진 발현 벡터는, 일반적으로 세포에서 유전자 발현을 위해 설계된 플라스미드 또는 바이러스이다. 상기 벡터는 특정 유전자를 표적 세포에 도입하는 데 사용되며, 유전자에 의해 암호화된 단백질을 생산하기 위해 세포의 단백질 합성 메커니즘을 지휘할 수 있다.
이 경우 관심 유전자는 KSP37이며, 이는 인간 숙주의 후천성 면역의 일부인 CD8+ 세포에 의해 정상적으로 생산된다(Lopez et al., 2011)
pCMV3-C-DDK (플래그)는 포유동물 세포에서 KSP37의 발현에 사용되는 발현 벡터이다. 상기 벡터는 발현을 허용하는 특정 세그먼트를 포함해야 하며, 여기에는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 종결 코돈 및 전사 종결 서열과 같은 정확한 번역 개시 서열이 포함된다. 유전자 산물의 발현 후, 발현된 단백질을 정제하는 것이 필요할 수 있다; 그러나, 숙주 세포의 대부분의 단백질로부터 관심 단백질을 분리하는 것은 오래 걸리는 과정일 수 있다. 이 정제 과정을 더 쉽게 하기 위해 복제된 유전자에 정제 태그를 추가할 수 있다.
벡터는 세포에 형질감염되고 안정적인 형질감염의 경우 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 DNA가 게놈에 통합되거나, 또는 세포가 일시적으로 형질감염될 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 플라스미드 벡터의 pSV 및 pCMV 시리즈, 벡시니아(vaccinia) 및 레트로바이러스 벡터, 뿐만 아니라 바큘로바이러스(baculovirus)를 포함한다. 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 및 SV40에 대한 프로모터는 일반적으로 유전자 발현을 유도하기 위해 포유동물 발현 벡터에서 사용된다.
특히, 시노바이오로지컬(SinoBiological)사에서 공급하는 pGEM-T 벡터인 KSP37/FGFBP2 cDNA ORF CLONE은 포유동물의 레트로바이러스 감염, 바이러스성 암 및 프리온에 대한 유전자 치료에 사용하기 위한, 인간 섬유아세포 성장 인자 결합 단백질 2.2 단위 내지 10 단위의 전장 클론 DNA의 적합한 복제 벡터로 확인되었다.
부형제/전달 운반체
본 발명에 따르면, Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 천연 지질 함유 기질, 오일, 에스테르, 글리콜, 바이러스, 금속 입자 또는 양이온성 분자를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
표적화할 수 있는 약학적으로 허용되는 부형제는 본원에서 "전달 운반체"로 지칭된다. 본 발명의 약학적으로 혀용되는 부형제는 Ksp37 단백질 및/또는 Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 제제를 포유동물의 표적 세포에 전달할 수 있다. "표적 부위"는 치료 제제를 전달하고자 하는 포유동물의 부위를 의미한다. 예를 들어, 표적 부위는 림프구, 줄기 세포, 모든 혈액 성분일 수 있다.
전달 운반체는 세포 및 세포막을 포함하는 천연 지질 함유 전달 운반체, 리포좀 및 미셀(micelles)을 포함하는 인공 지질 함유 전달 운반체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 전달 운반체는 포유동물의 특정 부위를 표적으로 하여 그 부위에서 핵산 분자를 표적으로 하고 이용하도록 변형될 수 있다. 적합한 변형은 전달 운반체의 지질 위치의 화학식을 조작하는 것 및/또는 전달 운반체를 바람직한 부위, 예를 들어 바람직한 세포 유형으로 특이적으로 표적화할 수 있는 화합물을 운반체로 도입하는 것을 포함한다.
특이적으로 표적화하는 것은 운반체 내의 화합물과 세포 표면 상의 분자의 상호작용에 의해 전달 운반체가 특정 세포에 결합하도록 하는 것을 말한다. 적합한 표적화 화합물은 특정 부위에서 다른 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 이러한 리간드의 예는 항체, 항원, 수용체 및 수용체 리간드를 포함한다.
전달 운반체의 지질 위치의 화학식을 조작하면 전달 운반체의 세포 외 또는 세포 내 표적을 조절할 수 있다. 예를 들어, 리포좀이 특정 전하 특성을 갖는 특정 세포와 융합되도록 리포좀의 지질 이중층의 전하를 변경하는 화학 물질을 리포좀의 지질식에 첨가할 수 있다.
벡터의 투여
벡터는 비강, 경구, 국소, 흡입, 경피 또는 비경구 투여를 포함하는 허용되는 투여 경로를 통해 대상에게 투여된다.
추가 화합물
바이러스 감염을 특징으로 하는 질병으로부터 포유동물을 보호하는 Ksp37의 능력을 향상시킬 수 있는 추가 화합물이 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 화합물은 세포 매개 면역 반응 조절, 도움 T세포 활성 조절, 비만 세포의 탈과립화 조절, 감각 신경 말단 보호, 호산구 및/또는 아세포 활성 조절, 및/또는 평활근 수축을 예방하거나 완화할 수 있는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 추가로 미세혈관 투과성을 유도하거나 Th1 및/또는 Th2 세포 서브셋(subset ) 분화를 조절할 것이다.
Ksp37 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 함께 투여될 화합물의 선택은 포유동물의 다양한 특성에 기초하여 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 특히 포유동물의 유전적 배경, 건강 이력, 신체적 징후, 구조 약물 및 혈액 가스 사용, 및 혈액 분석.
7. Ksp37 생산을 활성화하기 위한 극성 화합물을 사용한 화학적 처리
상기 개시된 바와 같이, 극성 화합물 디메틸포름아미드 (DMF, dimethylformamide) 및 DMSO는 HIV 생성의 강력한 억제제인 것으로 나타났다. 디메틸포름아미드 (DMF)를 함유하는 경피 패치로 HIV-1에 감염된 환자의 치료가 기대되는 결과를 나타냈다.
발암성 발현에 대한 극성 물질의 작용은 암 세포가 더 양성이 되도록 유도하는 것으로 추정된다. 악성 세포를 양성 유형으로 전환하려면 먼저 악성 종양을 유발하는 유전자 발현의 일부 조절이 있어야 한다는 것이 합리적으로 보일 것이다. HL-60 인간 전골수구성(promyelocytic) 백혈병 세포에서, 디메틸설폭사이드 [Dimethylsulfoxide, DMSO] 는 c-myoncogenes 의 발현을 80 내지 90% 까지 감소시켰다 [5].
이는 세포 분화의 화학적 유도제가 숙주 세포의 세포 메커니즘에 영향을 미침으로써 바이러스 복제에서 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
DMF를 포함하는 극성 화합물은 CD8 세포의 활성화로 시작하여 차례로 Ksp37의 생산을 활성화하는 일련의 사건을 통해 바이러스 감염 및 질병의 임상적 관리에 사용될 수 있다.
디메틸포름아미드 [DMF]와 같은 극성 화합물은 KSP37 단백질의 활성화제로 사용될 수 있다.
DMF는 일반적으로 극성 용매로 사용되며 피부, 흡입 및 경구 섭취 시 쉽게 흡수된다. DMF는 주로 간에서 빠르게 대사되며 주로 소변으로 배설된다.
화학물질의 경피 및 좌제(suppository) 전달은 환자의 호르몬 특성을 변경하는 일반적인 방법이다.
DMF는 임의의 적합한 약물 전달 장치를 사용하여, 예를 들어 하나 이상의 피부 패치 또는 직장 적용을 위한 좌제를 적용하여 Ksp37 생성을 활성화함으로써 경피 적용을 통해 환자에게 투여될 수 있다. Ksp37 생성을 활성화하기 위한 진피 패치 치료는 일주일에 한 번 약 8시간 동안 피부에 패치를 적용하는 것을 포함할 것이며, Ksp37 생성을 활성화 하기 위해 DM를 직장에 적용하는 치료는 이상적으로는 좌제를 일주일에 한 번 사용하는 것을 포함할 것이다.
Ksp37 생성을 활성화하기 위한 DMF의 치료적 유효량은 약 2 mg/l - 200 mg/l, 바람직하게는 약 100 mg/l - 200 mg/l, 보다 더 바람직하게는 약 150 mg/l의 DMF 최고 혈장 수준을 초래하는 용량이다. 특히 바람직하게는 100 mg/l -150 mg/l 또는 150 mg/l - 200 mg/l의 DMF 최고 혈장 수준이다.
극성 화합물의 경피 투여의 경우, 흡수 속도는 대상의 피부에 의해 결정된다. 인간 피부에 노출되면, 액체 DMF는 약 9.4 mg/cm2/시간의 정상 상태 속도(steady-state rate)로 흡수된다(Mraz 및 Nohova, 1992, Occup. Env. Health 64:85-92 참조).
따라서, 각 패치의 면적과 피부에 부착되는 패치의 수를 결정하는 것과 같이, 약물에 노출되는 피부의 표면적을 조절함으로써 원하는 흡수율을 달성할 수 있다. 예를 들어 직경 9 cm의 패치 두 개는 총 피부 표면적 127 cm2를 극성 화합물에 노출시킬 것이다; DMF의 경우, 시간당 약 1.2 g의 DMF 흡수율의 결과가 될 것이다.
약 15 mg/kg의 DMF의 초기 용량이 특히 바람직하다.
Ksp37 단백질의 생성이 최소 20년 동안 필요한 치료 범위로 충분히 유전자 변형되기 전에, DMF로 약 2년의 장기 치료가 필요할 것으로 예상된다.
따라서 본 발명은 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 Ksp37이 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 대상의 면역 반응을 향상시키는 최적의 농도 범위를 확인하며, 그리고 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병의 치료를 위한 의약품 및 약제의 제조를 제공하며, 그리고 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 치료 및/또는 보호 방법을 제공한다.
본원에 인용된 모든 문헌은 그 전체로서 참조로 포함된다. 본원에서 참고 문헌의 인용이나 논의는 그것이 본 발명의 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
Claims (28)
- 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 KSP37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질; 및/또는 Ksp37 단백질로 번역될 Ksp37 유전자로 암호화된 벡터; 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질; 및/또는 극성 화합물 중 하나 이상을 치료적 유효량으로 포함하는, 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 대상의 면역 반응을 향상시키는 데 사용하기 위한 약학적 물질.
- 제 1항에 있어서, 상기 물질은 대상에게 적절한 기간 동안 한 번 이상 투여되었을 때 대상의 Ksp37 혈장 농도 수준을 400 ng/mL 내지 700 ng/mL로 상승시키도록 제제화되는 것인, 약학적 물질.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 물질은 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약학적 물질.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병과 싸우는 데 유용한 KSP37 유전자로 암호화된 것으로, 자연 발생 KSP37 단백질과 동일한 단백질로 번역되는 핵산 서열을 포함하는, 약학적 물질.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 Ksp37 단백질로 번역될 Ksp37 유전자로 암호화된 것으로서, pGEM-T 벡터 또는 pCMV3-C-GFPSpark를 포함하는, 약학적 물질.
- 제 5항에 있어서, 상기 벡터는 pGEM-T 벡터, KSP37/FGFBP2 cDNA ORF CLONE (SinoBiological)인, 약학적 물질.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 극성 화합물은 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)인, 약학적 물질.
- 제 7항에 있어서, 상기 Ksp37 생성을 활성화하기 위한 DMF의 양은 2 mg/l - 200 mg/l, 보다 바람직하게는 100 mg/l - 200 mg/l 이고, 가장 바람직하게는 100 mg/l - 150 mg/l 또는 150 mg/l - 200 mg/l 의 DMF 최고 혈장 수준을 초래하는 용량인, 약학적 물질.
- 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련이 있는 질병으로부터 대상을 보호하고/거나, 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병을 앓고 있는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 약학적 물질.
- 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 보호하고/거나, 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병을 앓고 있는 대상을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 치료적 유효량의 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 약학적 물질의 용도.
- 제 10항에 있어서, 상기 의약은 적절한 기간 동안 1회 이상 투여 시 대상의 Ksp37 혈장 농도 수준을 400 ng/mL 내지 700 ng/mL 로 상승시키는 양으로 투여하기 위해 제제화된 것인, 용도.
- 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37은 포유동물 체중 kg당 0.001 마이크로그램(μg/kg) 내지 포유동물 체중 kg당 20 마이크로그램(μg/kg) 사이의 용량으로 투여하기 위해 제제화된 것인, 용도.
- 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37을 포유동물 내로 서서히 방출시킬 수 있는 제어된 방출 조성물을 포함하는 것인, 용도.
- 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질은 혈액 성분 및/또는 조직으로부터 추출된 후 정제, 아세틸화, 유전자 조작, 클로닝되고 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 치료 및/또는 예방 백신으로서 포유동물 숙주에게 다시 전달되는 것인, 용도.
- 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 비강, 경구, 국소, 흡입, 경피, 직장 또는 비경구 투여를 포함하는 허용가능한 투여 경로를 통해 대상에게 투여하기 위해 제제화된 것인, 용도.
- 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 특히 HIV인, 용도.
- 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스성 암은 난소암 또는 백혈병인, 용도.
- 제 10항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 포유동물인, 용도.
- 바이러스 감염을 특징으로 하는 질병 및/또는 면역계 장애 및 바이러스성 암과 관련된 질병으로부터 대상을 보호하는 방법, 및/또는 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 대상의 Ksp37 단백질 혈장 수준을 400 ng/mL 내지 700 ng/mL 사이로 증가시키기 위하여 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 약학적 물질을 치료적 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질의 치료적 유효량은, 포유동물 체중 kg당 0.001 마이크로그램(μg/kg) 내지 포유동물 체중 kg당 20 마이크로그램(μg/kg) 사이인, 방법.
- 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 약학적 물질은 비강, 경구, 국소, 흡입, 경피, 직장 또는 비경구 투여를 포함하는 허용가능한 투여 경로를 통해 대상에게 투여되는 것인, 방법.
- 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 한에 있어서, 상기 Ksp37 단백질은 혈액 성분 및/또는 조직으로부터 추출된 후 정제, 아세틸화, 유전자 조작, 클로닝 및 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 치료 및/또는 예방 백신으로서 포유동물 숙주에게 다시 전달되는 것인, 방법.
- 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ksp37 생성을 활성화하기 위한 DMF의 치료적 유효량은 2 mg/l - 200 mg/l, 바람직하게는 100 mg/l - 200 mg/l 이고, 가장 바람직하게는 100 mg/l - 150 mg/l 또는 150 mg/l - 200 mg/l 의 DMF최고 혈장 수준을 초래하는 용량인, 방법.
- 제 23항에 있어서, 상기 DMF는 경피 투여되는 것인, 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 특히 HIV인, 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 바이러스성 암은 난소암 또는 백혈병인, 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 대상은 포유동물인, 방법.
- 바이러스 감염 및/또는 면역계 장애 및/또는 바이러스성 암과 관련된 질병에 대한 치료 및/또는 예방 백신으로서, 상기 백신은 임상적으로 변형되거나 유전자 조작된 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질, 및/또는 Ksp37 단백질 및/또는 24 kDa 내지 45 kDa 범위의 분자량을 갖는 단백질로 번역될Ksp37 유전자로 암호화된 벡터를 포함하는, 백신.
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