KR20230037658A - 식용 중공 섬유 상에서 성장한 근육 세포로 생성된 소비성 조직-유사 구조 - Google Patents

식용 중공 섬유 상에서 성장한 근육 세포로 생성된 소비성 조직-유사 구조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식용 중공 섬유 및 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 카트리지 및 생물반응기, 뿐만 아니라, 본 발명의 중공 섬유, 카트리지 및 생물반응기로 생성된 구조화된 청정 육류 생성물의 생성 방법 및 상기 방법에 의해 생성된 구조화된 청정 육류 생성물에 관한 것이다. 식용 중공 섬유 상에서 성장한 구조화된 청정 육류의 거시적 구조는 독특한 최종 구조를 제공할 것이다. 이 최종 구조는 단위 면적 당 유한한 양의 섬유를 함유할 것이며; 육류는 섬유의 외측 상에 있다.

Description

식용 중공 섬유 상에서 성장한 근육 세포로 생성된 소비성 조직-유사 구조
종종 "청정 육류(clean meat)"로서 언급되는 실험실 재배 육류 또는 육류-유사 생성물은 계속 증가하는 인구에게 식품을 제공하는 데 있어 중요한 역할을 할 것이다. 그러나, 이 분야에서의 노력은 단지 제한된 성공만을 거두었다. 그 이유의 일부는 현재 기술로 생성된 생성물이 기껏해야 육류-유사 구조 및 텍스처를 제공하기 위해 다른 성분과 조합되어야 하는 다진 육류-유사 물질과 닮은 구조를 갖지 않거나 거의 갖지 않기 때문이다.
구조화된 청정 육류를 생성하기 위해서는, 스캐폴딩이 사용되어야 한다. 실용가능하고 비용 효율적이 되기 위해, 스캐폴딩은 식용이고/거나 용해가능하여야 하고 실제 육류 또는 자연 육류 (즉, 동물로부터 유래된 육류)를 연상시키는 식감을 제공하는 최종 생성물에서의 텍스처 및 구조를 제공하여야 한다. 이는 스캐폴딩이 적어도 세 가지 품질을 제공하여야 함을 의미한다: 1) 식용임, 2) 실제 육류와 유사한 텍스처 및 식감을 제공함, 및 3) 효율적으로 성장하고 자연 근육과 유사한 근육 구조를 형성 (예를 들어, 근소관을 형성하고 조직-유사 세포 밀도를 달성함)하기 위해 근세포 또는 근세포-유사 세포 및 다른 세포 유형에 적합한 배양 환경임.
이들 목표 각각의 달성은 관련 기술분야에서 도전이었다. 세 가지 목표 중 어느 하나의 달성이 다른 것들 중 하나 또는 둘 다에 대항하여 작용할 수 있기 때문에 하나의 배양 시스템에서의 이들 목표 세 가지 모두의 달성은 대부분 관련 기술분야에서 달성되지 않았다.
그 이유는 다양하다. 본 발명자들은 이들 중 몇몇을 여기에서 검토할 것이다. 식용 마이크로캐리어가 시도되었지만 식용 마이크로캐리어는 추가의 프로세싱 단계 및/또는 물질 없이 조직 유사 세포 밀도를 달성하거나 육류-조직 식감 또는 텍스처를 제공할 수 없다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2015/0079238 (Marga) 참조).
히드로겔 튜브가 사용되어 왔다. 하나의 이점은 근세포가 히드로겔 튜브 상에서 근소관을 형성할 수 있다는 것이다. 그러나, 세포 밀도가 충분히 높지 않으며 최종 거시적 구조가 자연 육류와 유사하지 않다. 예를 들어, 근관 정렬을 위해, 추가 프로세싱이 필요하다 (문헌 [Qiang, Li, et al., 2018 Biofabrication 10:025006] 참조).
3차원 (3D) 히드로겔 매트릭스는 널리 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 불행히도, 이 형식은 조직-유사 세포 밀도에 잘 적합화되지 않는다. 이는, 적어도 부분적으로, 혈관화/배지 확산이 제한되기 때문이다 (Bramfeldt, et al., Curr Med Chem. 2010;17(33):3944-3967). 추가로, 구조가 비-자연적 스폰지-유사 식감을 제공한다.
3차원 프린팅이 레데파인 미트, 리미티드(Redefine Meat, Ltd.) (이스라엘 네스 지오나) 등의 회사에 의해 착수되었고, 비-육류(nonmeat) 기재의 구조화된 육류-유사 생성물을 조립하는 구조 및 세포 밀도 측면에서의 진보가 이루어졌다. 그러나, 이 접근은 마무리 단계이다. 대부분의 세포 성장이 미리 완료되고 세포가 3D 구조로 프로세싱되어야 하여 과도한 프로세싱 시간 및 비용이 추가된다.
탈세포화된 식물 물질 (예를 들어, 셀러리 및 대황)이 스캐폴딩 물질로서 기재되었다 (문헌 [Gershlak, J., et al., Biomaterials, 2017 May;125:13-22] 참조). 그러나, 유체 관리는 실험실 규모를 넘어서는 문제가 되어 탈세포화된 식물 물질을 사용하는 임의의 공정을 생산 규모로 확장하기 어렵게 만든다. 또한, 최종 구조는 식물 물질을 반영하여 육류-유사 생성물에 대한 식감 및 텍스처를 불만족스럽게 만든다. 탈세포화된 식물 물질은 세포의 올바른 배향을 가능하게 하는 것으로 보이고 배양된 세포의 혈관화를 돕지만, 확장은 극복해야 할 중요한 장애물임이 입증되었다. 또한, 식감이 자연 육류보다 식물성 물질과 더 유사할 수 있다. 예를 들어, 발행 문헌 [Decellularized Plant-based Scaffold for Guided Alignment of Myoblast Cells - Santiago Campuzano, et al., 2020] 및 www.new-harvest.org/santiago_campuzano 참조.
식물 기재의 중공 섬유는 식용 생성물을 제공하는 것과 관련하여 문제가 될 수 있다. 통곡물 전분은 식용이지만 세포 배양 배지 중에 용해되고, 따라서, 세포 배양 또는 세포 접착에 적합하지 않다. 셀룰로스가 여과 산업에서 폭넓게 사용되어 왔다. 셀룰로스는 기존 식품 내에서 물질로서 인식되지만, 멤브레인 형식에서 셀룰로스는 전형적으로 화학적으로 변형되고 플라스틱과 같이 거동한다. 셀룰로스의 이러한 거시적 거동은 이를 소비에 바람직하지 않게 만든다. 마찬가지로, 콜라겐 블렌딩된 중공 섬유가 기재되었다. 그러나, 이들 생성물은 인간 소비 또는 청정 육류 산업에서의 사용을 위해 디자인되지 않았으며 (하기 참조: WO2018162857 A1, Hollow Cellular Microfibre and Method for Producing Such a Hollow Cellular Microfibre) 이 분야에서 사용하기에 적합하지 않을 수 있다.
또한, 기존의 식용 스캐폴딩은 수백 마이크론보다 두꺼운 구조화된 육류를 생성하는 데 있어 필요한 혈관화를 허용하지 않는다. 상기에 언급된 바와 같이, 식용 스캐폴딩의 일례는 마이크로캐리어이다. 마이크로캐리어는 배양 용기 또는 충전 층 또는 벌크 물질 형태 중에 현탁되어야 한다. 이들 경우, 세포 배양은 단지 스캐폴드가 잠겨 있는 배지로부터 공급된다. 따라서, 배양 성장은 조직 내의 배지의 확산에 의해 제한되며, 이는 200 μm 미만인 것으로 보고되어 있다.
스캐폴딩은 또한 물질의 전기방사 시트와 같은 본질적으로 2차원 형식으로 보고되었다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Yang, F., et al., Materials (Basel), 2017 Oct 12;10(10)). 이들 2차원 시트는 시트를 통한 배지의 확산 뿐만 아니라 주변 배지에 의해 공급될 수 있다.
추가로, 선행 기술 스캐폴드에서 성장한 근육 조직의 배향은 근육 원섬유의 형성을 포함하도록 정확하게 배향되지 않는다. 식용의 구조화된 청정 육류 생성물을 생성하기 위해 필요한, 또한 이에 대해 기재된 스캐폴딩은 관련 기술분야에 공지되어 있지 않으며 상업적으로 입수가능하지 않다.
따라서, 구조화된 청정 육류 생성물의 생성을 위한, 개선된 세포 배양 물질 뿐만 아니라 이들 물질을 사용하는 장치 및 방법에 대한 현재의 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 1) 식용이고, 2) 실제 육류와 유사한 텍스처, 구조 및 식감을 제공하고, 3) 자연 근육과 유사한 구조로의 근세포 및 다른 세포 유형의 성장을 촉진시키는 스캐폴드를 포함하는 식용 청정 육류 생성물을 제공하는 세포 배양 장치 및 시스템에 관한 것이다. 또한, 스캐폴드 및 그에서의 청정 육류 성장은, 예를 들어, 프로세싱 (즉, 절단 또는 슬라이싱) 및 조리 동안 자연 육류와 유사한 텍스처 및 취급 품질을 갖는다. 다시 말해서, 본 발명은 텍스처화된, 구조화된 육류 생성물의 생성을 위해 적합한 물질 및 방법을 제공한다. 본 발명은 식용 중공 섬유를 기재로 하는 배양 시스템, 본 발명의 식용 중공 섬유를 활용하는 배양 장치 및 본 발명의 배양 장치를 활용하는 배양 방법을 통해 이들 목표를 달성한다. 본 발명의 중공 섬유는 또한, 하기에서 논의되는 바와 같이, 부분적으로 또는 완전히 용해가능할 수 있다.
본 발명자들은, 본 발명의 식용 중공 섬유를 사용함으로써, 비용 효율적인 구조화된 청정 육류가 생성될 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 중공 섬유는 근육 구조 뿐만 아니라 다른 바람직한 특성과 관련하여 구조화된 청정 육류의 최종 생성물의 품질을 증가시킨다. 또한, 배양 기간 종료시 중공 섬유의 루멘을 지질 기재의 성분으로 충전시킴으로써, 목적하는 최종 생성물의 지방 함량이 조율되고 생성물 전반에 걸쳐 균질하게 분포될 수 있다.
본 발명의 중공 섬유 조성물은 또한 최종 생성물의 식감 뿐만 아니라 최종 생성물의 맛을 보조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 콜로이드 물질 또는 다른 물질로 배양 기간 종료시 중공 섬유의 중심에 향미가 부가될 수 있다. 콜로이드 물질은 지질 (지방) 및 향미제 중 하나 또는 둘 다, 뿐만 아니라 다른 성분을 포함하는 액체 또는 슬러리일 수 있다.
중공 섬유 생성을 위해 베이스 물질의 가변성을 사용함으로써, 구조화된 청정 육류 최종 생성물의 향미 및 텍스처가 영향받을 수 있다. 이러한 의미에서, 본 발명의 중공 섬유는 목적하는 최종 생성물에 따라 맞춤화될 수 있다. 예를 들어, 중공 섬유의 제조에 사용되는 물질이 성장하는 육류의 유형에 따라 조정될 수 있고, 예를 들어 상이한 최종 텍스처를 제공하기 위해 간격 (즉, 중공 섬유 사이 및 중공 섬유의 직경)이 변형될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본 명세서의 교시내용으로, 목적하는 바와 같이, 마지막 최종 생성물의 특징에 영향을 주기 위해 본 발명의 중공 섬유 및 임의의 관련 중공 섬유 장치 (예를 들어, 중공 섬유 카트리지)를 변형시킬 수 있다.
세포 성장 특징 또한 본 발명의 중공 섬유의 구조 및 조성에 기초하여 제어될 수 있다. 예를 들어, 입자 또는 미립자가 아닌, 중공 섬유의 구성에서의 섬유성 성분의 활용은, 섬유 및 최종 청정 육류 생성물 둘 다의 상이한 세포 접착 특징, 또한 궁극적으로, 상이한 최종 생성물 텍스처를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중공 섬유의 구성에서의 섬유성 성분의 활용은 세포 성장을 섬유를 따라 배향시키는 것으로 본 발명자에 의해 이해된다. 유사하게, 텍스처화된 표면을 갖는 섬유는 최종 생성물에 영향을 줄 수 있다. 또한, 본 발명의 섬유는 본 발명의 중공 섬유의 표면 내에 혼입된 또는 표면 상에 적용된 인자 (예를 들어, 성장 인자, 부착 인자)를 가질 수 있다. 본 발명의 중공 섬유에 대한 상기에서 논의된 변형 중 일부는 또한 최종 생성물의 맛, 구조, 강도, 텍스처 및 식감 중 하나 이상에 영향을 줄 수 있다.
개개의 중공 섬유를 따라, 또한 목적하는 패턴으로 배열된 중공 섬유를 따라 균일한 또는 실질적으로 균일한 밀도에 대하여, 또한 상기 배열된 중공 섬유 사이의 공극 공간의 균일한 또는 실질적으로 균일한 분포를 갖는, 세포 물질 (즉, 근육 세포, 지방 세포 및 섬유아세포 등의 (그러나 이에 제한되지 않음) 세포)의 균일한 또는 실질적으로 균일한 성장에 적합한 신규한 및 자명하지 않은 중공 섬유의 발명이 본원에서 제공된다. 본 발명은 또한, 적어도 부분적으로, 본 발명의 중공 섬유를 활용하는 생물반응기 뿐만 아니라 구조화된 청정 육류 생성물의 제조 공정 및 방법 및 본 발명의 중공 섬유로 제조된 구조화된 청정 육류 생성물에 관한 것이다. 본 발명이 이론으로 제한되지는 않지만, 본 발명의 중공 섬유의 놀랍고 예상치 못한 특징은 적어도 섬유 물질(들), 섬유 구성, 섬유 다공도 및 섬유 치수의 조합에 기인할 수 있다고 믿어진다. 또한, 본 발명의 중공 섬유의 이들 특징은 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물의 생성에서 배양되는 세포 유형 또는 세포 유형들과 조합되어 상승작용으로 작용하는 것으로 믿어진다.
하나의 측면에서, 본 발명은, 약 0.2 mm 내지 약 2.0 mm의 외경, 0% 내지 약 75%의 다공도 및 약 0.05 mm 내지 약 0.4 mm의 벽 두께를 갖는, 히드로콜로이드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 식용 중공 섬유에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 중공 섬유는 약 0.08 mm 내지 0.2 mm의 벽 두께를 갖는다. 또 다른 측면에서, 중공 섬유는 약 40% 내지 약 60%의 다공도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 중공 섬유는 알기네이트, 콜라겐, 셀룰로스, 키토산, 콜라겐, 제인, 아가, 이눌린, 글루텐, 펙틴, 콩과식물 단백질, 메틸 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 타피오카, 크산탄 검, 구아 검, 타라 검, 빈 검, 식물 단백질, 전분, 식물 단리물 (예를 들어, 대두/제인/카세인/밀 단백질), 지질, (예를 들어, 유리 지방 산, 트리글리세리드, 천연 왁스, 및 인지질 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 중공 섬유의 단백질은 옥수수 단백질, 감자 단백질, 밀 단백질, 수수 단백질, 동물 단백질, 동물 단백질 단리물, 소고기 단백질 단리물, 카세인 단백질 및 유청 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 중공 섬유의 식물 단리물은 대두, 제인, 카세인, 및 밀 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 중공 섬유의 지질은 유리 지방 산, 트리글리세리드, 천연 왁스 및 인지질 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 또한 또 다른 측면에서, 중공 섬유는 하나 이상의 콩과식물 단백질 및 하나 이상의 히드로콜로이드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 각각의 중공 섬유는 제1 및 제2 단부를 갖고, 여기서 제1 단부 및 제2 단부는 서로 위치적으로 대향하고, 여기서 소정량의 중공 섬유는 평행으로 또는 본질적으로 평행으로 배열되고, 중공 섬유의 제1 단부가 제1 유지 장치에 고정되고 중공 섬유의 제2 단부가 제2 유지 장치에 고정되도록 배치되고, 제1 및 제2 유지 장치는 중공 섬유의 종방향 배향에 대하여 수직으로 또는 본질적으로 수직으로 배향되고 서로 평행으로 또는 본질적으로 평행으로 배향되고, 여기서 적어도 하나의 유지 장치는 중공 섬유의 내부로의 유체의 유동을 허용하고, 이에 의해 중공 섬유 카트리지를 생성한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 약 40 - 약 120개/cm2의 밀도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 약 60 - 약 100개/cm2의 밀도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 약 70 - 약 90개/cm2의 밀도로 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지는 중공 섬유 사이의 공극 공간을 갖고, 중공 섬유 사이의 공극 공간은 중공 섬유 카트리지의 총 부피의 약 25% - 약 75%이다. 본 발명의 또한 또 다른 측면에서, 중공 섬유 사이의 공극 공간은 중공 섬유 카트리지의 총 부피의 약 40% - 약 60%이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 중공 섬유 카트리지는 하우징 내에 제거가능하게 삽입되도록 디자인된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 하우징은 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 부분이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 중공 섬유 세포 배양 카트리지, 본 발명의 중공 섬유 카트리지를 유지하도록 사이징된 하우징, 하우징 내의 하나 이상의 유입구에 유동적으로 연결된 세포 배양 배지 공급원, 하우징 내의 하나 이상의 유출구, 및 배지 유입구(들) 및/또는 유출구(들)를 통해 중공 섬유 카트리지에 배지를 공급하고/거나 그로부터 폐기 배지 및/또는 기체를 제거하기 위한 하나 이상의 펌프를 포함하는 중공 섬유 세포 배양 반응기에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 유입구는 중공 섬유의 내부에 유동적으로 연결된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 유입구는 중공 섬유 사이의 공극 공간에 유동적으로 연결되고, 유출구는 중공 섬유의 내부에 유동적으로 연결되고, 이에 의해 중공 섬유의 외측으로부터 내측으로의 유체 유동을 생성한다. 본 발명의 또한 또 다른 측면에서, 중공 섬유 세포 배양 반응기는 자동화된 제어기를 포함한다. 자동화된 제어기는 컴퓨터를 포함할 수 있다.
본 발명의 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 중공 섬유 반응기 내에서 중공 섬유 사이의 공극 공간에, 약 105개 세포/ml 내지 약 108개 세포/ml의 밀도로 근세포, 근세포-유사 세포 또는 하나 이상의 근세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 중 하나 이상을 시딩하고, 약 80% - 약 99% 컨플루언시(confluency); 약 85% - 약 99% 컨플루언시; 또는 약 90% - 약 99% 컨플루언시를 달성할 때까지 세포를 배양하는 것을 포함하는, 육류 생성물의 생성 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 방법은 세포가 목적하는 컨플루언시를 달성한 후에 중공 섬유 세포 배양 반응기로부터 중공 섬유 카트리지를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은, 중공 섬유의 각각 제1 단부 및 제2 단부로부터 제1 유지 장치 및 제2 유지 장치를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은, 중공 섬유 반응기에 지방세포, 지방세포-유사 세포 또는 하나 이상의 지방세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 및/또는 섬유아세포, 섬유아세포-유사 세포 또는 하나 이상의 섬유아세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 중 하나 이상을 시딩 (즉, 상기에서 논의된 근세포, 근세포-유사 세포 또는 하나 이상의 근세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포에 추가로)하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은, 중공 섬유의 제1 단부 및 제2 단부 중 하나 또는 둘 다를 통해 중공 섬유의 내부로, 중공 섬유의 벽을 통해 세포가 시딩되는 중공 섬유 사이의 공극 공간 내로, 및 상기 하우징 내의 상기 유출구 중 하나 이상을 통해 세포에 배지를 공급하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 배지의 유동은 배양 공정의 적어도 일부에서 역전된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은, 세포가 컨플루언시를 달성한 후, 중공 섬유의 내부 및/또는 세포 사이의 임의의 남아있는 공극 공간에 지방, 향미제, 색소, 염 및 보존제 중 하나 이상을 주입하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 50 - 90% 배양된 동물 세포; b) 10 - 30% 식용 중공 섬유 및/또는 중공 섬유 물질; c) 배양된 동물 세포 사이에 위치하는 및/또는 배양된 동물 세포가 산재되어 있는 1 - 30% 공극 공간; 및 d) 1 - 30% 첨가제를 포함하는 구조화된 청정 육류 생성물에 관한 것이다. 구조화된 청정 육류 생성물은 본 발명의 중공 섬유 세포 배양 반응기 및 중공 섬유를 사용하는 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 측면에서, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에 첨가되는 첨가제는 향미제, 텍스처 향상제, 영양 첨가제, 보존제, 및 지방 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 측면에서, 향미제는 에센셜 오일, 올레오레진 (ESO), 효소 (ENZ), 천연 물질 및 추출물 (NAT), 비-영양 감미료 (NNS), 영양 감미료 (NUTRS), 향신료, 천연 시즈닝 & 향료 (SP), 및 합성 향미제 (SY/FL), 훈증제 (FUM), 인공 감미료 및 효모 추출물 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 텍스처 향상제는 퓨레형(pureed) 식물 물질, 구아 검, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌, 베타 글루칸, 대두, 밀, 옥수수 및 쌀 단리물 및 사탕무 섬유, 완두콩 섬유, 대나무 섬유, 식물 유래 섬유, 식물 유래 글루텐, 카라기난, 크산탄 검, 레시틴, 펙틴, 아가, 알기네이트, 천연 폴리사카라이드, 곡물 껍질, 시트르산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 황산마그네슘 및 염 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 영양 첨가제는 미량 원소, 생물활성(bioactive) 화합물, 내인성 항산화제, A, B-복합체, C, D, E 비타민, 아연, 티아민, 리보플라빈, 셀레늄, 철, 니아신, 칼륨, 인, 오메가-3, 오메가-6, 지방 산, 마그네슘, 단백질, 아미노산 염, 크레아틴, 타우린, 카르니틴, 카르노신, 유비퀴논, 글루타티온, 콜린, 글루타티온, 리포산, 스페르민, 안세린, 리놀레산, 판토텐산, 콜레스테롤, 레티놀, 폴산, 식이 섬유 및 아미노산 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명의 또한 또 다른 측면에서, 지방은 포화, 단일불포화, 다중불포화 지방, 옥수수 오일, 카놀라 오일, 해바라기 오일, 홍화 오일, 올리브 오일, 피넛 오일, 대두, 아마인 오일, 참깨 오일, 카놀라 오일, 아보카도 오일, 종자 오일, 너트 오일, 홍화 및 해바라기 오일, 팜 오일, 코코넛 오일, 오메가-3, 어유, 라드, 버터, 가공 동물 지방, 지방질 조직, 세포 농업 유래 지방 에센셜 오일 및 올레오레진 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 보존제 및/또는 항산화제는 나트륨 염, 클로라이드 염, 아이오딘 염, 니트레이트, 니트로사민, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 나트륨 벤조에이트, 칼륨 벤조에이트 및 벤젠 아스코르브산, 시트르산, 칼륨, 일나트륨 글루타메이트 (MSG), 이산화황, 술파이트, 항생제 중 하나 이상으로부터 선택된다. 여기서 임의의 하나의 첨가제, 향미제, 텍스처 향상제, 영양소 첨가제, 지방/오일 및/또는 보존제/항산화제가 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에 하나 초과의 속성을 제공할 수 있음을 인지한다.
본 발명의 측면에서, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물의 중공 섬유는 하나 이상의 콩과식물 단백질 및 하나 이상의 히드로콜로이드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 공극 공간은 세포 및/또는 세포 물질의 공극이다. 본 발명의 또한 또 다른 측면에서, 공극 공간은 적어도 부분적으로 세포 또는 세포 물질 이외의 물질로 충전된다.
도 1 (a & b)은 본 발명의 중공 섬유의 기하학적 배열의 특정 실시양태를 나타낸다. 도 1a는 직사각형 패턴을 나타내고, 도 1b는 삼각형 패턴을 나타낸다. 도는 단지 섬유 배열의 예시 목적을 위한 것이다. 본 발명의 실제 중공 섬유 카트리지에서의 섬유 간격은 예시된 것보다 섬유 사이의 더 큰 공극 공간을 가질 수 있다. 마찬가지로, 개개의 중공 섬유 사이의 간격은 달라질 수 있다.
도 2 (a & b)는 본 발명의 중공 섬유 상에서의 세포 성장의 단부도 표시의 특정 실시양태이다. 도는 일부 경우에, 세포 성장 후에도, 최소의 공극 공간이 여전히 존재할 수 있음을 보여준다.
도 3은 본 발명의 단일 중공 섬유의 단면의 실시양태의 표시를 나타내며, 여기서 A는 중공 섬유의 중심 또는 루멘이고, B는 다공성 중공 섬유 벽이고, C는 세포 덩어리이다.
도 4는 상이한 섬유 직경 (OD = 외경)에 기초한 청정 육류 ("육류"), 섬유 및 공극 공간의 예시적 백분율 계산치를 나타낸다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 보다 큰 또는 보다 좁은 OD의 섬유에 대하여 이들 도로부터 외삽할 수 있을 것이다.
도 5는 3개의 상이한 섬유 OD에 대한 청정 육류 ("육류"), 섬유 및 공극 공간의 예시적 백분율 계산치를 나타낸다.
도 6은 표 형식의 도 5로부터의 예시적 데이터를 나타낸다.
도 7은 표 형식의 본 발명의 중공 섬유의 실시양태에 대한 예시적 데이터 계산치를 나타낸다.
도 8은 용해된 알기네이트:단백질 혼합물을 나타낸다. 좌측으로부터 우측까지: 대두 산 가수분해물; 소고기 단백질 단리물, 유청 단백질 단리물, 현미 단백질 단리물, 완두콩 단백질 단리물 및 대두 단백질 단리물.
도 9는 다양한 알기네이트 단독 (단백질 없음)을 나타낸다. 큰 병은 오토클레이빙되었고; 작은 병은 오토클레이빙되지 않았다.
도 10 (a - d)은 예시에 따라 제조된 중공 섬유를 나타낸다. (a)는 생성 후 섬유를 나타낸다. (b) & (c)는 100X 배율의 섬유를 나타낸다. (d)는 50X 배율의 또 다른 섬유를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 중공 섬유가 그의 중량을 용이하게 지지할 수 있음을 보여주고, 이는 생물반응기에서 요구될 것이다. 나타낸 섬유는 2 미터 길이이다.
도 12 (a & b)는 5:2 유청 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 주사 전자 현미경사진 (SEM)을 나타낸다. (a) 100X. (b) 5000X.
도 13 (a - d)은 증가하는 배율의 5:2 유청 단백질:알기네이트로부터 제조된 중공 섬유를 나타낸다. (a) 스케일 바 = 10 μm, (b) 스케일 바 = 1 μm, (c) 스케일 바 = 1 μm (도 13b에 비해 보다 큰 스케일 바는 배율이 도 13b의 것의 대략 3X임을 나타냄), (d) 스케일 바 = 100 nm. 이들 샘플은 임계점 건조 후 SEM을 사용하여 제조되었다.
도 14 (a & b)는 대두 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 100X. (b) 5000X.
도 15 (a & b)는 증가하는 배율의 5:2 대두 단백질:알기네이트로부터 제조된 중공 섬유를 나타낸다. (a) 스케일 바 = 10 μm, (b) 스케일 바 = 1 μm. 이들 샘플은 임계점 건조 후 SEM을 사용하여 제조되었다.
도 16 (a & b)은 더욱 증가하는 배율의 5:2 대두 단백질:알기네이트로부터 제조된 중공 섬유를 나타낸다. (a)는 도 15a와 상이한 영역을 나타낸다: 스케일 바 = 1 μm, (b) 스케일 바 = 200 nm. 이들 샘플은 임계점 건조 후 SEM을 사용하여 제조되었다. 또한, 주목할 것은 도 16a에서 보이는 박테리아 오염이고, 이는 본 발명의 식용 중공 섬유의 부패성 성질을 나타낸다.
도 17 (a & b)은 호박 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 1000X. (b) 10,000X.
도 18 (a & b)은 호박 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 20,000X. (b) 40,000X.
도 19 (a - d)는 증가하는 배율의 5:2 호박 단백질:알기네이트로부터 제조된 중공 섬유를 나타낸다. (a) 스케일 바 = 10 μm, (b) 스케일 바 = 1 μm, (c) 스케일 바 = 100 nm, (d) 스케일 바 = 1 μm. 이들 샘플은 임계점 건조 후 SEM을 사용하여 제조되었다.
도 20 (a & b)은 완두콩 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 100X. (b) 5000X.
도 21 (a & b)은 소고기 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 1000X. (b) 10,000X.
도 22 (a & b)는 소고기 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 20,000X. (b) 40,000X.
도 23 (a & b)은 더욱 증가하는 배율의 5:2 소고기 단백질:알기네이트로부터 제조된 중공 섬유를 나타낸다. (a) 스케일 바 = 1 μm, (b) 스케일 바 = 1 μm. 이들 샘플은 임계점 건조 후 SEM을 사용하여 제조되었다.
도 24는 (a) 스케일 바 = 1 μm, (b) 스케일 바 = 100 nm를 나타낸다. 이들 샘플은 임계점 건조 후 SEM을 사용하여 제조되었다. 도 23a, 23b 및 24a로부터의 1 μm 스케일은 중공 섬유의 상이한 영역으로부터의 것이다.
도 25 (a & b)는 쌀 단백질:알기네이트의 혼합물로부터 제조된 본 발명의 중공 섬유의 극저온 SEM을 나타낸다. (a) 1000X. (b) 5000X.
도 26은 본 발명의 중공 섬유 상에서의 C2C12 뮤린 근육 세포의 세포 성장을 나타낸다. 세포 성장은 ATP 생성을 나타내는 원시 발광 단위(raw luminescent unit; RLU)로 측정된 상대적인 것이다. 실시예 1C 참조.
도 27 (a - c)은 실시예 1C에 기재된 바와 같은 본 발명의 중공 섬유에 부착된 성장하는 세포를 나타낸다. (a)는 살아있는 및 죽은 세포 둘 다에 대한 염색을 나타낸다. (b)는 살아있는 세포의 염색을 나타낸다. (c)는 죽은 세포의 염색을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 식용 및/또는 용해가능 중공 섬유, 예를 들어, 구조화된 청정 육류의 생성을 위한 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 생물반응기, 및 이를 사용한 구조화된 청정 육류의 생성 방법 및 본 발명의 중공 섬유로 생성된 구조화된 청정 육류를 고려한다. 청정 육류는 실험실, 공장 또는 세포의 대규모 배양에 적합한 다른 생산 시설에서의 세포로부터 성장한 육류 또는 육류-유사 생성물 (본원에서 총체적으로 "청정 육류" 또는 "청정 육류 생성물"로서 언급됨)로서 관련 기술분야에서 정의된다.
"구조화된 육류 생성물" 또는 "구조화된 청정 육류 생성물"은 동물로부터의 자연 육류와 같은, 그와 유사한 또는 그를 연상시키는 텍스처 및 구조를 갖는 육류 생성물 또는 청정 육류 생성물을 의미한다. 본 발명의 구조화된 육류 생성물은 1) 텍스처 및 외관에서, 2) 조리 및 소비를 위해 준비 중일 때 (예를 들어, 슬라이싱, 분쇄, 조리 중일 때 등)의 취급성에서, 및 3) 사람에 의해 소비될 때의 식감에서 자연 육류와 유사한 텍스처 및 구조를 갖는다. 본 발명의 물질 및 방법은, 구조화된 청정 육류의 생성에서 사용되는 경우, 이들 기준 중 적어도 하나, 이들 기준 중 두 가지 또는 이들 기준 세 가지 모두를 달성한다. 선행 기술은 이들 기준 중 임의의 것을 충분히 충족시키는 구조화된 육류 생성물을 생성할 수 없다.
본 발명의 구조화된 육류 생성물은 적합한 세포 (하기에서 논의됨)를 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 생물반응기 (또한, 하기에서 논의됨)에서 배양함으로써 이들 기준을 충족시킨다. 본 발명의 중공 섬유는, 적어도 상당한 부분에서, 생성물의 목적하는 외관, 취급성 및 식감을 제공하는 구조 및 텍스처를 최종 구조화된 청정 육류 생성물에 제공한다. 또한, 본 발명의 중공 섬유는 구조화된 청정 육류 생성물로의 세포의 성장을 위한 적합한 환경을 제공하는 것을 돕는다. 이와 관련하여, 본 발명의 중공 섬유는, 배양된 세포의 부착, 세포의 근세포 또는 근세포-유사 세포와 유사한 (즉, 구조 및 외관에 있어 근세포와 실질적으로 유사한) 모폴로지로의 연신, 및 근세포의 근소관 또는 근소관-유사 구조 (즉, 구조 및 외관에 있어 근소관과 실질적으로 유사함)로의 형성에 적합한 적어도 하나의 표면을 제공한다.
본 발명의 식용 및/또는 용해가능 중공 섬유는 히드로콜로이드 (예컨대 크산탄, 메틸 셀룰로스(들), 알기네이트, 아가, 펙틴, 젤라틴, 구아/타라/빈/다른 검), 단백질 (예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질 및 아미노산; 예를 들어, 다양한 전분 (옥수수/감자/쌀/밀/수수), 식물 단리물 (예를 들어, 대두/제인/카세인/밀 단백질), 지질, (예를 들어, 유리 지방 산, 트리글리세리드, 천연 왁스, 및 인지질), 알콜 (예를 들어, 폴리알콜), 탄수화물 및 다른 천연 물질, 예컨대 알기네이트 중 하나 이상으로부터 제조됨이 고려된다. 또한, 세포 부착 및 세포 성장을 돕는 다른 물질이 중공 섬유에 첨가되거나 중공 섬유 상에 코팅될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 중공 섬유 첨가제 또는 코팅은, 식물로부터 단리된 또는 보다 단순한 물질로부터 합성된 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 세포외 매트릭스 (ECM) 성분 및 추출물, 폴리-D-리신, 라미닌, 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV), 젤라틴, 피브로넥틴, 식물계 ECM 물질, 콜라겐-유사, 피브로넥틴-유사 및 라미닌-유사 물질을 포함한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 단백질, 히드로겔, 또는 다른 코팅 중 하나 이상임이 고려된다. 전반적 결과로, 본 발명의 섬유는 육류 및 육류 생성물의 텍스처 및 구조를 부여하여, 본 발명에 의해 생성된 구조화된 청정 육류 생성물에 실제 육류와 유사한 텍스처, 외관, 취급성 및 식감을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 중공 섬유는 셀룰로스, 키토산, 콜라겐, 제인, 알기네이트, 아가, 이눌린, 글루텐, 펙틴, 콩과식물 단백질, 메틸 셀룰로스(들), 젤라틴, 타피오카, 크산탄/구아/타라/빈/다른 검, 단백질 (예를 들어, 모두 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는, 다양한 형태의 옥수수/감자/쌀/밀/수수 전분, 식물 단리물 및 대두/제인/카세인/밀 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질 및 아미노산), 지질, (예를 들어, 유리 지방 산, 트리글리세리드, 천연 왁스, 및 인지질) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 셀룰로스 중합체는 셀룰로스 아세테이트-부티레이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 니트로셀룰로스 등을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 중공 섬유는 하나 이상의 콩과식물 단백질 및 히드로콜로이드의 혼합물을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유는 식용 및 용해가능, 또는 식용 또는 용해가능함이 고려된다. 다시 말해서, 섬유는 식용 또는 용해가능 또는 이들 둘 다일 수 있다. 더 나아가, 용해가능한 섬유의 경우, 상이한 정도의 용해성이 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 섬유는 적합한 용매 (예를 들어, 미국 식품의약국 (FDA) 또는 소비성 물질의 안전성을 평가할 자격이 있다고 인정되는 다른 조직에 의해 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 비-독성 용매)에 노출시 쉽게 용해가능할 수 있다. 다른 섬유는 덜 쉽게 용해가능할 수 있다. 이와 관련하여, 덜 쉽게 용해가능한 섬유는 배양 중인 세포가 컨플루언시의 필수 수준에 도달한 후 부분적으로 용해됨으로써 본 발명의 구조화된 청정 육류에 목적하는 식감 및 텍스처를 제공하기에 충분한 섬유를 남기지만, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물이 거칠거나 질긴 것처럼 보이게 만들 수 있는 과도한 섬유를 남기지는 않을 수 있다. 용해가능 중공 섬유 구성성분은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 알기네이트는 Ca2+ 킬레이터에 노출시 용해가능하다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유는 섬유를 부분적으로 용해가능하게 만드는 양의 알기네이트를 포함하고/거나 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 장치 내의 섬유의 일정 비율은 알기네이트를 포함함이 고려된다.
가교제. 본 발명의 실시양태에서, 하나 이상의 가교제가 본 발명의 중공 섬유에 사용됨이 고려된다. 가교제는, 명칭에서 알 수 있듯이, 섬유를 강화시키도록 중공 섬유의 다른 구성성분 중 하나 이상을 결합시킨다. 본 발명의 실시양태에서, 가교제는 용해가능 성분 또는 본 발명의 중공 섬유의 용해가능 성분 중 하나일 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 예시적 가교제 및 가교 메커니즘은, 공유 결합된 에스테르 가교 (미국 특허 번호 7,247,191) 및 UV-가교 (미국 특허 번호 8,337,598) (이들 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 중공 섬유의 생성에서의 가교제의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호: 9,718,031; 8,337,598; 7,247,191; 6,932,859 및 6,755,900 (이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
중공 섬유 제조 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Vandekar, V.D., Manufacturing of Hollow Fiber Membrane, Int'l J Sci & Res, 2015, 4:9, pp. 1990 - 1994], 및 그에 인용된 참조문헌 참조). 공지된 방법은 용융 방사, 건식 방사 및 습식 방사를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용융 방사에서는, 중합체를 통상적으로 불활성 분위기에서 용융까지 또는 그 초과로 가열한다. 이어서 용융된 중합체를 목적하는 크기의 중공 섬유를 생성하도록 사이징된 노즐, "방사구"를 통해 압출한다. 압출된 중합체는 즉시 고화되고, 균일한 구조 및 치수를 갖는 모세관이 형성된다. 섬유를 더욱 신장시켜 50 pm 미만의 직경 및 5 pm만큼 얇은 벽 두께를 갖는 섬유를 생성할 수 있다.
건식 방사는 중합체를 매우 휘발성인 용매 중에 용해시키는 것을 포함한다. 용매/중합체 혼합물을 가열하고 압출 및 용매의 증발 후 중합체가 고화된다.
습식 방사는 공정이 변화될 수 있는 보다 많은 수의 파라미터를 포함하기 때문에 보다 다용성이다. 중합체 및 용매 혼합물을 비-용매조 중으로 압출하고, 여기서 용매 및 비-용매의 교환으로 인해 탈혼합 및/또는 상 분리가 발생한다. 압출 및 비-용매조 사이에는 에어 갭이 존재하며, 여기서 중공 섬유 멤브레인 형성이 시작된다.
용매의 사용을 제거하거나 최소화할 수 있는 기술은 저온 신장을 사용한 용융 방사 (MSCS)이다. 이 접근은 비용 효율적인 생성을 제공하지만, 구조 제어 및 식품 물질의 잠재적인 열화를 희생시킬 수 있다. 이 기술에서는, 물질을 압출을 위해 가열하고 이어서 중공 섬유 벽에 기공을 기계적으로 형성하기 위해 이들이 냉각됨에 따라 당긴다. 이들 기술 세 가지 모두 폭넓게 연구되었고 관련 기술분야에 공지되어 있고 이들이 잘 요약되어 있다 (문헌 [Tan, XM. and Rodrigue, D., Polymers (Basel), 2019, Aug 5:11(8)] 참조).
이들 기술의 변형 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 다중 중합체 및 중합체 층을 포함하는 중공 섬유의 생성을 위한 변형된 습식 방사 압출 공정이 개시되어 있는 WO 2011/108929 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조. 비-합성 물질로부터의 중공 섬유의 제조 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,824,569 (Suzuki) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조.
본 발명의 중공 섬유의 거시적 구조는, 실시양태에서, 섬유를 따르는 세포의 배향을 촉진하는 것으로 고려된다. 이와 관련하여, 중공 섬유를 구성하는 성분 분자의 배향이 중공 섬유의 길이에 평행하게, 본질적으로 평행하게 또는 주로 평행하게 배향되는 것이 본 발명에 의해 요망된다. 성분 분자가 중공 섬유의 적어도 외부 표면 상에 세포 부착을 돕고 세포 배향을 돕는 표면 텍스처를 형성한다는 것이 추가로 고려된다. 따라서, 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유의 표면 텍스처는 세포 부착을 위한 부착점을 생성함이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 상에서 성장한 세포 (특히, 근세포, 근세포-유사 세포 또는 근세포의 특징을 갖는 세포)는 생체내에서의 근세포와 유사하게, 또한 비슷하게 중공 섬유의 길이를 따라 배향되고 연장된다는 것이 추가로 고려된다.
따라서, 스캐폴드의 표면 구조의 배향은 형성 동안 근관의 정렬에 직접적으로 상관된다. 골격근이 기존 구조를 따라 형성되기를 원하는 것처럼 생각될 수 있다. 섬유 다발이 정렬된 근관의 형성을 위해 골격근 구조를 가깝게 모방함을 구상할 수 있다. 따라서, 중공 섬유 생물반응기는 조직-유사 세포 밀도를 달성할 뿐만 아니라 다른 기술이 달성하지 못하는 근관 정렬을 달성하여, 논의된 모든 기술 중 가장 현실적인 식감을 제공한다. 하기 문헌을 검토함으로써 정렬 현상을 더 잘 이해할 수 있다: My mistake: Decellularized Apium graveolens Scaffold for Cell Culture and Guided Alignment of C2C12 Murine Myoblast - Santiago Campuzano, 2020, Ph.D. thesis, University or Ottawa, pp 58-59.
본 발명의 중공 섬유는 본 발명에 적합할 크기 범위를 가짐이 고려된다. 본 발명의 중공 섬유는 중공 섬유 상에서 성장한 세포가 실제 육류의 것과 유사한 밀도를 달성하고 세포 사이의 공극 공간을 최소로 갖도록 이격되어 있다는 것이 또한 고려된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유는 약 0.1 mm 내지 약 3.0 mm의 외경, 약 0% 다공도 (확산 기반의 것으로 함) 내지 약 75%의 다공도, 및 약 .008 내지 약 0.5 mm 또는 약 0.01 mm 내지 약 0.2 mm 또는 상기에 구체적으로 반복되지 않은 .008 mm 내지 0.5 mm 사이의 임의의 두께의 벽 두께를 가짐이 고려된다. 이 크기는 섬유의 루멘을 통한 배지의 수송에 적합하고 중공 섬유의 벽을 통한 배지의 적절한 유동을 허용하면서 동시에 세포 성장을 지지하고, 또한 목적하는 최종 생성물 구조, 텍스처, 취급성 및 식감을 제공하기에 충분히 강성임이 본 발명자들에 의해 확인되었다. 그러나, 목적하는 구조화된 청정 육류 생성물 (예를 들어, 소고기, 가금류 고기, 생선, 돼지고기 등)에 따라, 섬유의 직경, 벽 두께 및 다공도의 변동과 관련하여 다른 실시양태가 고려되며; 이는 하기에서 논의된다.
섬유 다공도. 본 발명의 중공 섬유는 섬유의 벽을 통한 배지의 적절한 유동을 허용하며 동시에 세포 성장 및 세포 지지에 적합한 표면을 보장하는 다공도를 가져야 한다. 중공 섬유의 다공도는, 부분적으로, 중공 섬유의 벽의 두께 및 중공 섬유의 조성과 관련된다. 벽이 충분히 얇은 경우, 중공 섬유 벽을 통한 배지 확산을 허용하기에 0% 다공도로 충분할 수 있다. 본 발명의 중공 섬유의 다공도는 75%만큼 높을 수 있다. 따라서, 본 발명의 중공 섬유의 다공도의 범위는 0% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 또는 상기에 구체적으로 반복되지 않은 0% 내지 75% 사이의 임의의 백분율이다.
본 발명의 중공 섬유는 또한 기공 형성 단계에 적용될 수 있다. 기공 형성 메커니즘은 멤브레인 형성 기술분야에서 널리 공지된 하기 기술 중 하나일 것이다: IPS = 열 유도 상 분리, NIPS = 비-용매 유도 상 분리, VIPS = 증기-유도 상 분리, MSCS = 신장과 조합된 용융-방사 (문헌 [Review on Porous Polymeric Membrane Preparation. Part II: Production Techniques with Polyethylene, Polydimethylsiloxane, Polypropylene, Polyimide, and Polytetrafluoroethylene Xue Mei Tan 1, 2, 2019] 참조). 모든 시나리오에서, 중합체는 이것의 열 용융 또는 화학적 용해에 의해 액체 상 중에 존재할 것이다. 그로부터, 중합체를 실린더 형상으로 압출하고, 스핀들 상에 드로잉한다. 압출 단계 동안, 보어(bore) 유체를 사용하여 중공 섬유 형태가 자체적으로 붕괴되는 것을 막을 수 있다. 압출 노즐과 재권취(rewind) 스핀들 사이에는, 수조 또는 대기 환경 챔버 등의 기공 형성 챔버가 또한 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 생물반응기에서의 본 발명의 중공 섬유의 구성을 고려한다. 섬유 구성은 섬유 배치 및 간격 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 섬유는 컨플루언시에서 세포 사이의 최소 공극 공간으로 세포 집단의 성장을 허용하는 임의의 구성으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 섬유는 정사각형/직사각형 (행과 열, 도 1a 참조) 또는 삼각형/육각형 (벌집, 도 1b 참조) 패킹 모드로 배향될 수 있다. 다른 패킹/간격 구성이 도 2에 나타나 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 섬유가 단부에서 볼 때 행과 열의 질서화된 패턴을 형성하도록 섬유가 배열됨이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 섬유가 단부에서 볼 때 벌집 패턴을 형성함이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 섬유는 무작위로 또는 반-무작위로 배열됨이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 중공 섬유는 다양한 밀도의 질서화된 또는 반-질서화된 패턴으로 배열됨이 고려된다.
중공 섬유는 외경이 약 0.1 mm 내지 약 3.0 mm, 약 0.5 mm 내지 약 2.0 mm 및 약 0.8 mm 내지 약 1.3 mm, 및 언급된 값들 사이의 임의의 값의 범위일 수 있다. 1.0 mm 중공 섬유는 외경 주위의 약 0.3 mm 내지 약 0.5 mm의 육류 성장을 가정한다. 대략 1.1 mm의 단부 직경은 약 85개 중공 섬유/cm2를 갖는 육류를 제공할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 섬유는 섬유 사이에 다양한 정도 또는 양의 공간을 가짐이 고려된다. 예를 들어, 보다 낮은 밀도의 섬유 사이에 산재된 보다 높은 밀도의 섬유의 열을 갖는 것이, 천연 어육에서 통상적인 것과 같이, 최종 구조화된 청정 육류 생성물의 텍스처 변화를 생성하는 데 사용될 수 있다. 더 나아가, 다양한 직경, 다공도 및 벽 두께의 섬유가, 또한 자연 육류의 외관, 텍스처, 취급성 및 식감을 모사하기 위해, 동일한 중공 섬유 카트리지에서 사용될 수 있음이 고려된다.
임의의 구성에서, 섬유는, 섬유 사이의 간격이 모든 세포 덩어리에 도달하기 위한 배지 (또한 그에 함유된 영양소, 성장 인자 등)의 적절한 유동을 허용하는 거리를 갖도록 이격되어 있다. 이는, 물론, 적어도 부분적으로 배지의 유속 및 중공 섬유 벽의 다공도와 관련될 것이지만, 대부분 중공 섬유의 외벽의 표면으로부터 세포까지의 물리적 거리와 관련된다. 다시 말해서, 배지 및 영양소는 세포 덩어리를 통해 단지 제한된 거리를 이동하거나 완화될 것이다. 현재, 산소 및 영양소의 확산의 최대는 200 μm인 것으로 생각된다. Rouwkema, J. , et al., (2009) Supply of Nutrients to Cells in Engineered Tissues, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 26:1, 163-178. 따라서, 섬유 사이의 간격은 하나의 섬유의 외벽으로부터 인접 섬유의 외벽까지 약 400 μm여야 한다. 임의의 특정 치수로 제한되지는 않으며, 도 2는 중공 섬유의 구성에 대한 세포 덩어리의 표시를 나타낸다. 임의의 특정 치수로 제한되지는 않으며, 도 3은 본 발명의 단일 중공 섬유의 단면의 실시양태의 표시를 나타내며, 여기서 A는 중공 섬유의 중심 또는 루멘이고, B는 다공성 중공 섬유 벽이고, C는 세포 덩어리이다. 배지가 중공 섬유를 통해, 또한 중공 섬유 사이의 간격을 통해 유동하는 배양 조건에서는, 간격이 더 클 수 있다. 예를 들어, 간격은 하나의 섬유의 외벽으로부터 인접 섬유의 외벽까지 800 μm일 수 있다. 이들 수치는 배양 과정이 확산 단독에만 의존하는 경우이다. 그러나, (예를 들어) 펌프의 사용은 중공 섬유로부터, 중공 섬유 사이의 세포 배양 공간을 통해, 또한 하우징 출구까지의 배지의 유동을 생성할 것이고 (확산 단독에만 의존하지 않고), 이는 섬유가 더 멀리 이격될 수 있게 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 섬유 사이의 최대 거리는 약 0.05 mm (50 μm) 내지 약 5.0 mm; 약 0.1 mm 내지 약 3.0 mm; 약 0.1 mm 내지 약 2.0 mm; 약 0.1 mm 내지 약 1.0 mm 또는 약 0.2 mm 내지 약 0.5 mm 또는 언급된 값들 사이의 임의의 거리임이 고려된다. 배지가 중공 섬유의 중심으로부터 배양을 통해 하우징 출구까지 유동하는 것이 바람직한 실시양태이지만, 목적하는 바에 따라, 배지 유동이 역방향일 수 있거나 하나의 방향으로부터 다른 방향까지 교호될 수 있음이 또한 고려된다. 배지 유동 방향의 교호는 모든 세포가 적절한 배지 공급을 갖는 것을 보장하도록 돕는 것으로 믿어진다.
도 4 - 7은 본 발명에 대해 허용가능한 섬유, 세포 및 공극 공간 사이의 비율의 계산된 데이터 및 개략적 표시를 제공한다. 도 4는 상이한 섬유 직경 (OD = 외경)에 기초한 청정 육류 ("육류"), 섬유 및 공극 공간의 예시적 백분율 계산치를 나타낸다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 보다 큰 또는 보다 좁은 OD의 섬유에 대하여 이들 도로부터 외삽할 수 있을 것이다. 도 5는 3개의 상이한 섬유 OD에 대한 청정 육류 ("육류"), 섬유 및 공극 공간의 예시적 백분율 계산치를 나타낸다. 도 6은 표 형식의 도 5로부터의 예시적 데이터를 나타낸다. 도 7은 표 형식의 본 발명의 중공 섬유의 실시양태에 대한 예시적 데이터 계산치를 나타낸다.
무작위성의 정도는 본 발명의 중공 섬유의 거리에 내재될 것이라는 것이 본 발명의 실시양태이다. 이전 단락에 주어진 수치는 주어진 어셈블리에 대한 평균 섬유간 거리이다. 본 발명의 실시양태에서, 스페이서 및/또는 조립 기술은 섬유 사이의 거리를 보장, 정규화 또는 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Han G, Wang P, Chung TS., Highly robust thin-film composite pressure retarded osmosis (PRO) hollow fiber membranes with high power densities for renewable salinity-gradient energy generation, Environ Sci Technol. 2013 Jul 16;47(14):8070-7. Epub 2013 Jun 28 또는 Chun Feng Wana, Bofan Li a, Tianshi Yang a, Tai-Shung Chung, Design and fabrication of inner-selective thin-film composite (TFC) hollow fiber modules for pressure retarded osmosis (PRO), Separation and Purification Technology, 172:32 - 42, 2017.
세포 밀도가 지나치게 조밀해지거나 세포 덩어리의 두께가 지나치게 두꺼워지면, 배지가 중공 섬유로부터 가장 멀리 떨어진 세포에 도달하는 능력이 어려워진다. 이들 세포에 대한 배지의 부족은 반응기 내의 죽은 세포 및/또는 세포가 성장할 수 없는 죽은 공간을 초래할 수 있다. 그 결과, 배지는 중공 섬유 카트리지를 통해 하우징 출구로 유동하여야 한다. 즉, 배지의 유동은 적어도 컨플루언시에 도달하고 구조화된 청정 육류 생성물이 수확될 때까지 유지되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서의 교시내용에 기초하여, 주어진 목적하는 구조화된 청정 육류 생성물에 대해 본 발명의 섬유의 정확한 간격 및 다공도를 계산할 수 있을 것이다.
본 발명의 중공 섬유는 본원에서 "중공 섬유 카트리지"로서 언급되는 것에 배열되고 고정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 중공 섬유 카트리지는 중공 섬유의 단부가 목적하는 배열로 단부 피스에 고정되도록 함으로써 만들어짐이 고려된다. 예를 들어, 각각의 섬유는 제1 단부 및 제2 단부를 갖는다. 각각의 단부는 단부 피스, 즉, 제1 및 제2 단부 피스에 고정된다. 단부 피스는, 예를 들어, 불활성이고 세포에 대해 비-독성인 것으로 관련 기술분야에 공지된 수지 또는 플라스틱일 수 있다. 중공 섬유의 제1 또는 제2 단부 중 적어도 하나는, 중공 섬유의 내부 루멘이 외부 환경과 유체 소통되도록 단부 피스에 배치된다. 따라서, 단부 피스에서의 중공 섬유의 이러한 배치로, 배지는 중공 섬유의 외부 환경 (즉, 중공 섬유의 외측이지만 예를 들어 멸균 생물반응기의 내측)으로부터 중공 섬유의 내부 루멘으로 유동될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 중공 섬유를 모듈 또는 카트리지로 조립하는 방법을 이해한다. 이들 기술은 본 발명의 중공 섬유에 적용가능하다. 요약하면, 방사 후, 중공 섬유를 길이로 절단하고, 섬유의 단부를 섬유 단부 주위로 유동하고 고화될 수지 내에 인케이싱한다 (즉, 포팅한다). 때때로, 섬유의 단면을, "포팅 용액", 즉, 액체 수지가 섬유의 기공에 들어가거나 이를 플러깅하지 않도록 섬유의 기공을 폐쇄시키기 위한 물질 (예를 들어, 파리 석고(Plaster of Paris) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 용이하게 제거가능한 물질) 내에 인케이싱할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vandekar, V.D., Manufacturing of Hollow Fiber Membrane, Int'l J Sci & Res, 2015, 4:9,pp. 1990 - 1994], 및 그에 인용된 참조문헌 참조. 본 발명에서는, "포팅된" 다발의 단부 중 하나 또는 둘 다를 트리밍하거나 절단하여 섬유의 개방 단부를 노출시켜, 본 발명의 구조화된 청정 육류의 생성에서의 사용을 위해 다발이 하우징 내에 삽입되면 배지의 유동을 허용한다.
더 나아가, 일부 실시양태에서는, 본 발명의 중공 섬유 카트리지가 제1 및 제2 단부 피스 사이의 목적하는 거리를 유지하기 위해 고정 장치를 가짐이 고려된다. 이는, 예를 들어, 본 발명의 중공 섬유 카트리지의, 예를 들어, 생물반응기 하우징으로의 보다 용이한 삽입을 위해, 필수적이거나 바람직할 수 있다.
따라서, 하나의 실시양태에서 본 발명의 중공 섬유 카트리지는 목적하는 배열로 배열된 과잉의 중공 섬유를 함유함이 고려된다. 본 발명의 중공 섬유는 제1 단부 및 제2 단부를 갖는다. 배열은 중공 섬유의 제1 단부 및 제2 단부를 제1 및 제2 단부 피스에 고정함으로써 유지된다. 중공 섬유는, 기재된 바와 같이 고정되면, 이어서 서로 평행하게, 실질적으로 평행하게 또는 본질적으로 평행하게 배치된다. 또한, 제1 및 제2 단부 피스는 서로 평행하게, 실질적으로 평행하게 또는 본질적으로 평행하게 배치된다. 더 나아가, 본 발명의 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 본 발명의 중공 섬유 카트리지의 단부 피스에 수직으로, 실질적으로 수직으로 또는 본질적으로 수직으로 배치된다. 중공 섬유 카트리지의 직경 및 길이는 생성되는 목적하는 구조화된 청정 육류 생성물 및 생물반응기 구성에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 약 40 - 약 120개/cm2의 평균 밀도, 약 60 - 약 100개/cm2의 평균 밀도, 약 70 - 약 90개/cm2 또는 상기에 주어졌지만 구체적으로 반복되지는 않은 값들 사이의 임의의 값의 평균 밀도로 존재함이 고려된다.
본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지에서의 중공 섬유는 세포의 첨가 전에 중공 섬유 사이의 공극 공간을 갖고, 중공 섬유 사이의 공극 공간은 중공 섬유 카트리지의 총 면적의 약 25% - 약 75% 또는 중공 섬유 카트리지의 총 면적의 약 40% - 약 60% 또는 상기에 주어졌지만 구체적으로 반복되지는 않은 값들 사이의 임의의 값임이 고려된다.
본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지는 하우징으로 제거가능하게 삽입되도록 디자인됨이 고려된다. 즉, 카트리지는 생성 실행의 시작시에 하우징에 삽입되고, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물의 임의의 추가의 목적하는 프로세싱을 위해 생성 실행 종료시에 제거, 즉 수확될 수 있다. 구조화된 청정 육류 생성물의 수확 후, 새로운 본 발명의 중공 섬유 카트리지를 하우징에 삽입하고 공정을 반복할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 중공 섬유 카트리지에 대한 하우징은 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 부분이다.
반응기 구성. 본 발명은, 적절한 배지 유동이 배양을 통해 유지되고 폐기물이 제거될 수 있는 한 임의의 특정 반응기 구성 또는 반응기 시스템 구성으로 제한되지 않는다. 중공 섬유 반응기는 전형적으로 형상이 튜브형이지만, 이들은 타원형, 편평형 (시트-유사), 직사각형 또는 임의의 다른 형상일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 반응기는 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 삽입가능/제거가능 삽입부를 포함한다. 컨플루언트 세포 성장 (본원에서 정의된 바와 같음)에 도달한 후, 삽입부를 제거할 수 있고, 삽입부 단부의 제거 및 임의의 목적하는 추가의 프로세싱에 의해 생성물을 마무리할 수 있다. 추가의 프로세싱은, 예를 들어, 슬라이싱, 표면 텍스처링, 향미제 첨가 등의 형태를 취할 수 있다. 대안적으로, 추가의 육류 향상이 장치의 수확 및 분해 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 배지를 중공 섬유 장치 외부로 플러싱할 수 있고, 이어서 첨가제를 섬유 내에 또는 주위에 직접 펌핑한다.
적합한 반응기 시스템의 비-제한적 예. 반응기 시스템의 가장 적합한 유형은 공급 배치 시스템이지만, 임의의 이용가능한 반응기가 본 발명의 중공 섬유 및 중공 섬유 카트리지와의 사용을 위해 적합할 것임이 고려된다. 예를 들어, 모비우스(Mobius)® 시스템 (밀리포어시그마(MilliporeSigma), 미국 매사추세츠주 벌링턴)은 본 발명과의 사용으로 용이하게 전환될 수 있는 상업적 시스템의 일례이다. 구조화된 청정 육류 생성물이 생성되는 생물반응기 (즉, 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 반응기)를 또 다른 생물반응기에서 성장한 세포로 시딩할 수 있다. 중공 섬유 장치를 시딩하는 생물반응기 (세포 성장 (증식) 및 세포 확장에 적합한 반응기)는 기존의 상업적 반응기, 예를 들어 교반 탱크 또는 파동-유형 반응기일 수 있다. 증식/확장 생물반응기는, 예를 들어, 교반 탱크 또는 파동-유형 반응기 (관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같음)이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 현탁액, 응집된 바이오매쓰, 마이크로캐리어 배양, 또는 다른 적합한 반응기인 것으로 고려된다. 생성 생물반응기 (즉, 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 반응기)는, 예를 들어, 단일 사용, 다중-사용, 반-연속적 또는 연속적일 수 있음이 고려된다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 다중 반응기의 매니폴드를 고려한다.
따라서, 본 발명의 예시적 반응기 시스템은 본 발명의 하나 이상의 중공 섬유 카트리지, 상기 중공 섬유 카트리지를 유지하도록 사이징된 하우징; 상기 하우징 내의 하나 이상의 유입구에 유동적으로 연결된 배지 공급원; 상기 하우징 내의 하나 이상의 배지 유출구; 및, 상기 배지 유입구(들) 및/또는 유출구(들)를 통해 상기 중공 섬유 카트리지에 배지를 공급하고/거나 그로부터 폐기 배지를 제거하기 위한 하나 이상의 펌프를 포함함이 고려된다. 더 나아가, 유입구는 중공 섬유의 내부에 유동적으로 연결된다. 또한 더 나아가, 중공 섬유 생물반응기는 자동화된 제어기 또는 자동 제어 시스템을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 중공 섬유 반응기 내의 중공 섬유 사이의 공극 공간을 근세포, 근세포-유사 세포 또는 하나 이상의 근세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 중 하나 이상으로, 예를 들어, 100,000개 세포 내지 100,000,000 (105- 108)개의 밀도로 시딩하고 (Radisic, et al., Biotechnol Bioeng, 2003 May 20:82(4):403-414.), 약 80% - 약 99% 컨플루언시, 85% - 약 99% 컨플루언시, 약 90% - 약 99% 컨플루언시, 약 95% - 약 99% 컨플루언시, 약 98% - 약 99% 컨플루언시 또는 약 100% 컨플루언시 (또는 언급된 퍼센트 값 사이의 임의의 값)까지 세포를 배양하고, 상기 중공 섬유의 각각 제1 단부 및 제2 단부로부터 상기 제1 유지 장치 및 상기 제2 유지 장치를 제거하는 것을 포함하는, 육류 생성물의 생성 방법을 고려한다.
시딩 후, 중공 섬유 카트리지는 중공 섬유의 제1 단부 및 제2 단부 중 하나 또는 둘 다를 통해 중공 섬유의 내부로, 중공 섬유의 벽을 통해 세포가 시딩되는 중공 섬유 사이의 공극 공간 내로, 및 상기 하우징 내의 상기 유출구 중 하나 이상을 통해 세포에 공급된 배지를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 배지는 또한 장치의 유입구(들) 및 유출구(들) 둘 다로부터 섬유 사이에서 유동할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 하나의 유체 경로는 섬유 벽을 통한 것이고, 제2 유체 경로는 섬유 주위의 것이다. 장치는 다수의 유입구 및 유출구를 가질 수 있음이 고려된다. 세포가 컨플루언시를 달성한 후, 임의의 잔류 배지 및 폐기물을 플러싱하고 중공 섬유의 내부 및/또는 세포 사이의 임의의 남아있는 공극 공간에 지방, 향미제, 색소, 염 및 보존제 중 하나 이상을 주입한다.
본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에 대한 첨가에 적합한 지방은 하기의 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 포화, 단일불포화, 다중불포화 지방, 예컨대 옥수수 오일, 카놀라 오일, 해바라기 오일, 및 홍화 오일, 올리브 오일, 피넛 오일, 대두, 아마인 오일, 참깨 오일, 카놀라 오일, 아보카도 오일, 종자 오일, 너트 오일, 홍화 및 해바라기 오일, 팜 오일, 코코넛 오일, 오메가-3, 어유(들), 라드, 버터, 가공 동물 지방, 지방질 조직, 또는 세포 농업 유래 지방, 또는 이들의 조합. 합성 지방, 예컨대 올레오레진이 사용될 수도 있다. 사실상, 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 인정되는 임의의 지방이 본 발명에서의 사용에 적합하고, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. FDA 식품 첨가제 목록에는, 천연 물질 및 추출물 (NAT), 영양소 (NUTR), 에센셜 오일 및/또는 올레오레진 (용매 무함유) (ESO)이 있다.
본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용에 적합한 향미제는 FDA의 식품 첨가제 목록에 기재된 임의의 향미제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들은 천연 향미 작용제 (FLAV), 에센셜 오일 및/또는 올레오레진 (용매 무함유) (ESO), 효소 (ENZ), 천연 물질 및 추출물 (NAT), 비-영양 감미료 (NNS), 영양 감미료 (NUTRS), 향신료, 다른 천연 시즈닝 & 향료 (SP), 합성 향미 (SY/FL), 훈증제 (FUM), 아스파탐, 수크랄로스, 사카린 및 아세술팜 칼륨 및 효모 추출물을 포함한 인공 감미료, 또는 이들의 조합으로서 기재될 수 있으며, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다.
본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용에 적합한 텍스처 향상제는 퓨레형 식물 물질, 구아 검, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌, 베타 글루칸, 대두, 밀, 옥수수 또는 쌀 단리물 및 사탕무 섬유, 완두콩 섬유, 대나무 섬유, 식물 유래 섬유, 식물 유래 글루텐, 카라기난, 크산탄 검, 레시틴, 펙틴, 아가, 알기네이트, 및 다른 천연 폴리사카라이드, 곡물 껍질, 시트르산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 황산마그네슘 및 염, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들은 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. 이들은 가용화 및 분산 작용제 (SDA), 및 천연 물질 및 추출물 (NAT)로서 FDA의 식품 첨가제 목록에 기재되어 있을 수 있다.
본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용에 적합한 영양 첨가제는 비타민, 미량 원소, 생물활성 화합물, 내인성 항산화제, 예컨대 A, B-복합체, C, D, E 비타민, 아연, 티아민, 리보플라빈, 셀레늄, 철, 니아신, 칼륨, 인, 오메가-3, 오메가-6, 지방 산, 마그네슘, 단백질 및 단백질 추출물, 아미노산 염, 크레아틴, 타우린, 카르니틴, 카르노신, 유비퀴논, 글루타티온, 콜린, 글루타티온, 리포산, 스페르민, 안세린, 리놀레산, 판토텐산, 콜레스테롤, 레티놀, 폴산, 식이 섬유, 아미노산, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들은 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 또는 FDA에 의해 승인된 임의의 식품 첨가제 또는 첨가제들이 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려되며, 이들은 본원에 포함된다. 예를 들어 하기 참조: www.fda.gov/food/food-additives-petitions/food-additive-status-list.
안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 또는 FDA에 의해 승인된 천연 또는 인공의 임의의 색소 또는 색소들이 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. 예를 들어 하기 참조: www.fda.gov/industry/color-additive-inventories/color-additive-status-list.
예언적 세포 유형. 본 발명의 중공 섬유는 시험관 또는 실험실내 성장 육류 및 육류 생성물, 즉, 본 발명의 구조화된 청정 육류의 생성에 적합한 특정 세포 유형을 성장시키기 위해 사용되도록 디자인된다. 따라서, 많은 상이한 유형의 세포가 중공 섬유 상에서 (또한, 목적하는 경우, 본 발명의 중공 섬유 카트리지에서) 성장할 수 있지만, 근육 세포 (즉, 근세포), 또는 근육 세포의 특징을 갖는 또는 근육 세포의 특징을 갖도록 조작된 세포 (본원에서 총체적으로 근육 세포 또는 근세포로서 언급됨)를 컨플루언시까지 성장시키기 위해, 또한 근육 (즉, 육류)의 자연 구조를 모방하기 위해 사용되도록 섬유가 개발되었다. 바람직하게는, 근육은 골격근이다. 즉, 본 발명의 중공 섬유는 근세포를 성장시켜 근육 섬유 또는 근원섬유를 얻기에 적합하도록 본 발명자에 의해 디자인된다. 또한, 다른 유형의 세포가 본 발명의 중공 섬유 상에서, 또한 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 반응기 내에서 성장할 수 있다. 이들 세포는 독립적으로 또는 근육 세포와 조합되어 성장할 수 있다. 예를 들어, 지방세포 또는 지방세포의 특징을 갖는 또는 지방세포의 특징을 갖도록 조작된 세포 (본원에서 총체적으로 지방세포로서 언급됨)를 근육 세포와 배양하여 자연 근육 또는 육류와 유사한 최종 생성물을 달성할 수 있다. 본 발명의 중공 섬유는 또한, 다른 세포, 예를 들어, 섬유아세포, 섬유아세포의 특징을 갖는 세포 또는 섬유아세포의 특징을 갖도록 조작된 세포를 본 발명의 근육 세포와 공동-배양되기 위해 포함시키기에 적합하다.
특히 근육 세포 및 지방세포의 공동-배양과 관련하여, 근육 세포 대 지방세포의 비율은 99:1, 95:5, 92:8, 90:10, 88:12, 85:15 82:18, 80:20, 75:25 또는 100:0 내지 75:25 (포함적)의 임의의 범위일 수 있다.
본 발명에서의 사용에 적합한 세포는 식품이 현재 얻어지는 임의의 동물로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 눈에 띄는 예는 소, 돼지, 양, 어류 (예를 들어, 참치, 연어, 대구, 해덕, 상어 등과 같은 생선), 조개류, 조류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리 등)이다. 양식되기보다는 전통적으로 사냥되는 동물 (예를 들어, 사슴, 엘크, 무스, 곰, 토끼, 메추라기, 야생 칠면조 등) 또는 이들의 조합과 같은 보다 외래적인 세포 공급원이 사용될 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 세포는 목적하는 특징을 갖는 분화된 세포의 생성에 적합한 임의의 방식에 의해 유래될 수 있다. 예를 들어, 임의의 절차가 분화된 근세포-유사 특징, 지방세포-유사 특징 등을 갖는 세포 유래에 적합하다. 근세포에 대한 이러한 특징은, 예를 들어 (그러나, 반드시 이에 제한되는 것은 아님), 긴 튜브형 세포의 외관을 갖는 것, 또한 미오신 및 액틴의 큰 보완을 갖는 것을 포함한다. 근세포는 또한, 다른 근세포와 융합되어, 근육, 즉, 육류에 그의 독특한 텍스처를 제공하는 데 도움이 되는 근육 단위인 근원섬유를 형성하는 능력을 갖는다. 지방세포 (또한 관련 기술분야에서 리포사이트 및 지방 세포로서 언급됨)에 대한 이러한 특징은, 예를 들어 (그러나, 반드시 이에 제한되는 것은 아님), 세포 부피의 90% 이상을 차지할 수 있는 큰 지질 액포를 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 중공 섬유는, 적어도 부분적으로, 골격근에서 전형적으로 나타나는 결합 조직 (관련 기술분야에서 "근막"으로서 언급됨)의 대체물을 제공한다.
본 발명에서 유용한 세포는, 중간엽 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. iPSC는 수많은 세포 유형이 유래될 수 있는 만능 상태로 되돌아가도록 조작된 세포이다. 다시 말해서, iPSC는 체세포로부터 직접 생성될 수 있는 만능 줄기 세포이다. 기술은 2006년에 처음 보고되었고 (Takahashi K, Yamanaka S, 25 August 2006, "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors" Cell, 126 (4): 663-76), 그 시점부터 진보되었고 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Li, et al., 30 April 2014, "Generation of pluripotent stem cells via protein transduction" Int. J. Dev. Biol., 58: 21 - 27), 이는 근육 세포의 생성을 포함하고 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Rao, et al., 9 January 2018, "Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue" Nat Commun., 9 (1): 1 - 12), 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용 또는 그의 바람직한 실시양태(들)의 요소를 도입할 때, 단수형 "하나" 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 존재함을 의미하도록 의도된다. 용어 "포함하는(comprising, including)" 및 "갖는"은 포함적인 것으로 의도되며 열거된 요소 이외의 추가의 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
전환 어구 "포함하는", "본질적으로 ~로 이루어진" 및 "~로 이루어진"은 MPEP 2111.03 (특허 심사 절차 매뉴얼; 미국 특허청)에 주어진 바와 같은 의미를 갖는다. 전환 어구 "본질적으로 ~로 이루어진"을 사용한 청구항은 본 발명의 필수 요소만을 언급하는 것으로 이해될 것이고, 종속 청구항에서 언급된 임의의 다른 요소는 이들이 종속되는 청구항에서 언급된 본 발명에 있어 비-필수적인 것으로 이해된다.
모든 범위는 모든 정수, 분수 및 십진수를 포함한 인용된 범위 내의 모든 값을 포함적으로 포함한다.
예시
실시예 1A
본 발명의 중공 섬유의 생성의 예언적 예시.
제인, 글루텐 및 알기네이트의 블렌드를 글리세롤 및 에탄올의 용매 블렌드 중으로 혼합한다. 이어서 이 점성 혼합물을 0.5 μm의 내경을 갖는 가열된 방사구를 통해 압출한다. 노즐로부터 빠져나오면, 용매 풍부 섬유를 수조에 담가, 중공 섬유의 상 분리를 완성한다. 재권취 동안 섬유 상의 장력은 당김 효과를 제공하여 섬유를 더욱 구조화한다. 이어서 섬유의 스풀을 절단하고, 여기서 섬유는 평행 배향으로 존재하여, 다발을 생성한다. 이어서 이로부터 다발을 카트리지 내에 삽입하고, 포팅하고, 이어서 절단한다. 추가의 단부 캡핑 단계는 루멘을 통한 유체 경로를 완성한다.
중공을 함유하는 장치는 실린더형 (카트리지) 형식 또는 직사각형 (카세트) 형식일 수 있다. 두 구성 모두에서 중공 섬유는 포팅 단계 개시 전에 목적하는 바와 같이 배향될 것이다. 중공 섬유를 코어 주위에 랩핑하여 섬유 주위의 배지의 유동을 도울 수 있다. 코어 구성요소에 대한 대안으로, 외부 하우징과 중공 섬유 사이에 확산 배리어가 사용될 수 있다. 포팅 물질은 중공 섬유와 동일한 물질 또는 또 다른 GRAS 승인 물질; 또는 대안적으로, 식품 등급 합성 중합체일 수 있다. 포팅 물질의 고화는 열경화성 또는 열가소성일 수 있다. 단부 캡이 하우징에 접합되기 전에 중공 섬유의 모든 개방 단부를 노출시키기 위해 일부 절단 절차가 존재할 것이다. 단부 캡은 섬유의 루멘에 대한 유입구/유출구를 가질 것이다. 섬유 주위의 유체 경로에 대한 유입구/유출구는 하우징에 또는 단부 캡에 통합될 수 있다.
실시예 1B
본 발명의 예시적 중공 섬유의 생성의 예시
에탄올 중에서의 제인의 용해도는 이를 이 응용으로부터 흥미로운 물질로 만든다. 불행히도, 수조에서의 그의 부분적 용해도로 인해 압출-기반 상 분리 기술에서는 이것이 불량하게 작동할 것이다. 본 발명자들은 제인이 하나의 성분이고 알기네이트, 키토산, 또는 셀룰로스와 같은 2차 중합체가 3차원 구조를 셋업하는 데 도움을 주기 위해 사용되는 시스템을 고려하였다. 그러나, 이들 친수성 및 소수성 중합체의 블렌딩은 어려웠다.
알기네이트는 에탄올로 침전될 수 있다. 본 발명자들은, 2% 알기네이트가 약 25% 에탄올에서 겔화되기 시작함을 확인하였다. 본 발명자들은, 최종 생성물의 기공 크기를 증가시킬 가능성이 있는 기공 형성 거동에 도움이 될 것으로 믿으며 응고조 또는 중합체 도프 자체에 알콜이 포함되는 시스템을 고려하였다.
알기네이트 & 단백질 시스템:
이 시스템을 매우 놀랍고 예상치 못한 것으로 만든 것은 다량의 단백질 함량을 혼합하는 능력 및 강력 용매, 산, 또는 염기의 사용 없이 중공 섬유 구조를 즉각적으로 고화시킬 수 있는 능력이다.
본 발명자들은 2 g 나트륨 알기네이트, 7 g 단백질 분말 및 91 g의 물 또는 가교제로서 15 g/L 염화칼슘을 갖는 완충제의 건조 성분을 칭량하여 혼합물을 제조하였다. 2:7 알기네이트: 단백질의 고체 비율이 제공됨. 2:0, 2:2, 2:4, 2:5, 2:7, 2:9의 알기네이트: 단백질의 비율이 또한 형성되었다. 시스템을 훨씬 더 높은 단백질 비율로 추진할 수 있으며, 단백질은 식물 또는 동물 기원의 것일 수 있다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 여기에 예시된 단백질 샘플은 (좌측에서 우측으로의 순서로) 대두 산 가수분해물, 소고기 단백질 단리물, 유청 단백질 단리물, 현미 단백질 단리물, 완두콩 단백질 단리물, 대두 단백질 단리물이었다. 나타내지는 않았지만, 본 발명자들은 또한 다른 것들과 함께 호박 단백질 단리물, 해바라기 종자 단백질 단리물로 실험하였다.
이들 조합을 균질화기 후 혼성화기에 의해 40℃에서 밤새 혼합하였다. 동물 유래 단백질은 보이는 투명도 수준에서 용해 가능성을 갖는 것으로 관찰되었다. 이는 식물-단백질 단리물의 불용성 성분 (통상적으로 고형분의 10% 미만)에 기인할 가능성이 높다.
이들 단백질 단리물을 시린지 펌프를 통해 라메-하르트 인스트루먼트 컴파니(rame-hart instrument co.) (미국 뉴저지주 서카서나)로부터 공급된 동축 바늘을 통해 압출하였다. 사용된 고화조는 15 g/L 염화칼슘을 갖는 밀리큐(MilliQ) 물 (밀리포어시그마, 미국 메사추세츠주 베드포드)이었다. 칼슘조에서 수 분 동안 둔 후, 섬유를 제거하고 밀리큐 물 중에서 헹구었다. 헹구어지면, 이들을 밀리큐 물의 병 내에 담그고 126℃에서 1시간 동안 오토클레이빙하였다.
다음으로 본 발명자들은 단백질 내용물 없이 (즉, 단백질 무함유) 알기네이트 섬유를 사용하여, 열 처리/오토클레이빙으로부터의 영향이 있는지를 입증하였다. 섬유는 고형분에 대하여 100% 알기네이트였다. 도 9에 나타낸 보다 큰 병은 오토클레이빙된 것이었으며, 보다 작은 병은 그렇지 않았다. 오토클레이빙된 섬유는 백색으로 변하였기 때문에, 빛이 더 이상 이들을 통과하지 않는다고 결론지을 수 있으며, 이는 중합체 사슬의 구조적 변화가 있음을 나타낸다.
도 12 - 25는 본 실시예의 식용 중공 섬유의 다공성 성질을 보여주는 SEM을 나타낸다. 이들 혼합물 각각이 상당히 상이한 표면 구조, 스키닝 효과, 표면 다공도, 뿐만 아니라 내부 다공도를 갖는다는 것은 예상치 못한 것이었다. 식물 기재의 단백질 단리물은 섬유 표면 전반에 걸쳐 거대 공극을 갖는 경향이 있었으며, 이는 표면으로부터 제거되는 불용성 입자로부터 형성될 것으로 예상된다. 이들 데이터는 또한, 놀랍고 예기치 않게, 표면 구조 및 기공 크기가 단백질의 공급원을 변화시키거나 단백질을 조합 (즉, 하나 이상)함으로써 제어될 수 있음을 보여준다.
도 10은 섬유 외경 및 내경을 나타낸다. 섬유 외경 및 내경은 동축 바늘을 통한 도프 유속을 통해 제어되었다. 섬유의 치수는 노즐 직경, 유속, 배쓰(bath)로부터의 거리, 또한 이론적으로, 섬유의 드로우/장력을 통해 조율되었다. 도 11은 제조된 섬유가 생물반응기로 들어가야 함에 따라 그의 습윤 중량을 용이하게 지지할 수 있음을 보여준다. 도 11에 나타낸 예는 2 미터 섬유의 것이지만 훨씬 더 긴 섬유가 제조될 수 있고 그 자체의 중량을 지지할 수 있다.
실시예 1C
본 발명의 중공 섬유 상에서의 세포 성장.
실시예 1B에 상술된 바와 같이 제조된, 소고기 단백질:알기네이트, 현미 단백질:알기네이트 또는 완두콩 단백질:알기네이트를 포함하는 중공 섬유를 PBS로 세척하고 DMEM/F12, 1X 글루타민 및 10% 소 태아 혈청 (FBS)과 15 ml 원추형 튜브 내에서 밤새 인큐베이션하였다. C2C12 세포 (뮤린 근육 세포주, ATCC, 미국 버지니아주 머내서스)를 100,000개 세포/2 ml로 시딩하였다. 세포를 6일 동안 성장시키고 2개의 시점, 3 및 6일에 검정하였다. 세포 성장을 ATP 생성 (셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 2.0 세포 생존율 검정, 카탈로그 번호 G9421, 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨)에 의해 검정하였다. 판독치는 원시 발광 단위 (RLU)였으며 결과는 상대적이고 선형이었다. 제3일의 데이터가 나타나 있는 도 26 참조. 각각의 중공 섬유 제제 (소고기:알기네이트, 쌀:알기네이트, 완두콩:알기네이트)를 2개의 상이한 생성 실행으로 생성하였고, 이는 데이터에 1 또는 2로서 나타나 있다. 각각의 조건을 삼중으로 실행하였다. 바는 표준 편차를 나타낸다. 현미:알기네이트 혼합물은 강건한 세포 성장을 지지하는 것으로 보인다. 소고기 단백질:알기네이트 및 완두콩 단백질:알기네이트 혼합물 또한 세포 성장을 지지한다.
본 발명의 프로토콜에 따라 제조된 현미 단백질;알기네이트 중공 섬유 상의 세포 성장 및 세포 부착은 다른 섬유 및 생성 실행을 대표한다. 도 27은 세포 배양의 제3일의 현미;알기네이트 1 중공 섬유 실행으로 제조된 중공 섬유 상의 세포 부착 및 성장을 나타낸다. 도 27a는 살아있는 세포는 셀트레이스(CellTrace)™ 칼세인 그린, AM으로 검출되고 죽은 세포는 BOBOTM-3 아이오다이드로 검출되는 라이브/데드(LIVE/DEAD)™ 세포 이미징 키트 (써모피셔(ThermoFisher), 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용한 살아있는 세포 및 죽은 세포 둘 다의 염색을 나타낸다. 도 27b는 칼세인 그린, AM으로 염색되는 살아있는 세포를 나타내고, 도 27c는 동일한 시야의 BOBOTM-3으로 염색되는 죽은 세포를 나타낸다. 이 조합된 이미지로부터 명백한 바와 같이, 살아있는 세포는 세포 덩어리의 상당 부분을 구성한다. 본 실시예는 본 발명의 중공 섬유가 세포 부착 및 성장을 지지함을 보여준다.
실시예 2
본 발명의 카트리지의 디자인의 예언적 예시.
카트리지를 특정 유체 경로를 갖도록 조작한다. 제1 유체 경로는 배지를 단지 섬유를 통해 통과시키는 유입구 및 유출구를 갖는다. 이 유체 경로는 특정 배지 저장소에 연결된다. 제2 유체 경로는 섬유 주위의 1-방향 유동을 위해 디자인된다. 2개의 유입구는 하나의 단부 캡 상에 있고 2개의 유출구는 다른 단부 캡 상에 있다. 균질 유동을 생성하기 위해, 코어는 코어 벽과 카트리지의 쉘(shell) 사이에 거의 동일한 수의 섬유가 있는 카트리지 중앙에 배치된다. 카트리지의 길이는 카트리지 전반에 걸쳐 세포 성장의 균질성을 최적화하도록 중공 섬유 내경 및 벽 두께를 기준으로 하여 디자인된다.
실시예 3
본 발명의 생물반응기로의 본 발명의 중공 섬유의 조립의 예언적 예시.
장치는 전체 세포 성장 시스템으로 구현된 후 생물반응기로 고려된다. 중공 섬유 생물반응기는 이전 실시예에 기재된 바와 같이 2개의 별도의 유체 경로로 시스템에 플럼빙된다(plumbed). 첫 번째 기재된 유체 경로는 반응기 내의 섬유 주위를 균질하게 이동한다. 이 유체 경로는 식용 중공 섬유의 표면 상에서의 세포의 시딩을 담당한다. 시딩 공정이 완료된 후, 이 유체 경로는 카트리지를 통한, 또한 중공 섬유 주위의 배지의 층류를 갖는다. 이 유체 경로는 섬유 표면으로부터의 세포의 제거를 막기 위해 조정가능하다. 제2 유체 경로는 중공 섬유의 루멘을 통한 것이다. 카트리지 내의 섬유 종횡비, 섬유 카운트, 및 유속을 균형화함으로써, 세포 밀도 구배가 최소화되고, 이에 의해 본질적으로 균일한 세포 덩어리의 형성이 가능하다.
실시예 4
본 발명의 중공 섬유의 실시양태를 활용하는 반응기의 예언적 예시. 본 실시예에서는, 1.1 mm - 1.2 mm의 외경 및 0.1 mm의 벽 두께를 갖는 알기네이트 또는 유사 물질을 포함하는 중공 섬유를 포함하는 반응기를 대략 83개 섬유/cm3을 갖는 중공 섬유 장치로 조립한다. 반응기에 iPSC로부터 유래된 세포를 시딩하고, 근세포 모폴로지 특징을 갖는 세포로 분화되도록 프로그래밍한다. 세포를 107개/cm3의 밀도로 시딩한다. 시딩된 세포는 여전히 확장 배지 중에 있거나 이미 분화를 촉진하는 배지 중에 있는 동안 시딩될 수 있다. 세포가 시딩된 후, 배지는 근세포-유사 세포가 선호하는 배지일 것이다. 반응기를 배지 공급기에 멸균 연결시키고, 여기서 섬유 사이의 10% 미만의 여유 공간으로서 정의되는 세포 컨플루언시가 얻어질 때까지 시딩 밀도 및 세포 유형에 기초하여 14-21일 동안 작동시키고, 세포는 중공 섬유에 접착된 근소관-유사 구조를 형성하는 것을 포함하는 근세포-유사 특징을 나타낸다. 이 시점에, 세포/중공 섬유 혼합물을 반응기로부터, 또한 추가의 프로세싱 (존재하는 경우), 또한 궁극적 소비를 위해 제거한다.
실시예 5
본 발명의 중공 섬유의 실시양태를 활용하는 제2 반응기의 예언적 예시. 본 실시예에서는, 1.1 mm - 1.2 mm의 외경 및 0.1 mm의 벽 두께를 갖는 알기네이트 또는 유사 물질을 포함하는 중공 섬유를 포함하는 반응기를 대략 83개 섬유/cm3을 갖는 중공 섬유 장치로 조립한다. 반응기에 iPSC로부터 유래된 세포를 시딩하고, 근세포 모폴로지 특징을 갖는 세포로 분화되도록 프로그래밍하거나 또는 근세포 모폴로지 특징을 갖는 세포로 분화되도록 프로그래밍된 세포: 지방세포 특징을 갖는 세포로 분화되도록 프로그래밍된 세포의 약 90:10의 비율로 지방세포 특징을 갖는 세포로 분화되도록 프로그래밍한다. 세포를 107개/cm3의 총 밀도로 시딩한다. 반응기를 배지 공급기에 멸균 연결시키고, 여기서 섬유 사이의 10% 미만의 여유 공간으로서 정의되는 세포 컨플루언시가 얻어질 때까지 14 - 21일 동안 작동시키고, 세포는 중공 섬유에 접착된 근소관-유사 구조를 형성하는 것을 포함하는 근세포-유사 특징을 나타낸다. 이 시점에, 세포/중공 섬유 혼합물을 반응기로부터, 또한 추가의 프로세싱 (존재하는 경우), 또한 궁극적 소비를 위해 제거한다.
실시예 6
세포 배양의 컨플루언시 도달 후 중공 섬유의 루멘으로의 지방, 향미제 등의 첨가에 대한 예언적 예시. 본 발명의 배양된 구조화된 청정 육류 생성물에서 목적하는 컨플루언시에 도달한 후 잔류 배지를 플러싱하고, 생성물에 예를 들어 식염수를 주입한다. 식염수의 농도를, 예를 들어, 최종 생성물의 목적하는 염도에 의해 결정한다. 염분이 있는 육류 생성물이 목적하는 경우에는 보다 높은 농도의 염(들)을, 또는 무염 육류 생성물이 목적하는 경우에는 0에 접근하는 보다 낮은 농도의 염을 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에 주입한다. 추가로, 지방, 향미제, 보존제 등을, 목적하는 바와 같이, 또한 최종 생성물에 의해 결정된 바와 같이, 본 발명의 배양된 구조화된 청정 육류 생성물의 공극 공간 및 중공 섬유 루멘에 주입한다.
실시예 7
수확된 세포/중공 섬유의 프로세싱을 나타내는 예언적 예시. 배양된 육류 생성물 (즉, "구조화된 청정 육류")이 본 발명의 배양 방법에 의해 생성되고, 임의의 목적하는 향미제, 지방 또는 다른 첨가제가 중공 섬유의 루멘 및/또는 남아있는 공극 공간에 주입되면, 본 발명의 중공 섬유 카트리지를 하우징으로부터 제거한다. 이어서 중공 섬유 카트리지는 추가의 프로세싱을 거친다. 적어도, 제1 및 제2 단부 피스를 중공 섬유 카트리지로부터 제거하여 본 발명의 중공 섬유 상에 배양된 구조화된 청정 육류 생성물을 온전하게 남겨둔다. 이어서 구조화된 청정 육류 생성물을 슬라이싱하거나, 텍스처화하거나, 향미부여 또는 추가 향미부여 등을 수행하고, 목적하는 바와 같이 도매 또는 소매용으로 패키징할 수 있다.

Claims (40)

  1. 약 0.2 mm 내지 약 2.0 mm의 외경, 0% 내지 약 75%의 다공도 및 약 0.05 mm 내지 약 0.4 mm의 벽 두께를 갖는, 히드로콜로이드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 식용 중공 섬유.
  2. 제1항에 있어서, 상기 벽 두께가 약 0.08 mm 내지 0.2 mm인 중공 섬유.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다공도가 약 40% 내지 약 60%인 중공 섬유.
  4. 제1항에 있어서, 알기네이트, 셀룰로스, 키토산, 콜라겐, 제인, 아가, 이눌린, 글루텐, 펙틴, 콩과식물 단백질, 메틸 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 타피오카, 크산탄 검, 구아 검, 타라 검, 빈 검, 식물 단백질, 전분, 식물 단리물, 지질 및 인지질 중 하나 이상을 포함하는 중공 섬유.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질이 옥수수 단백질, 감자 단백질, 밀 단백질, 수수 단백질, 동물 단백질, 동물 단백질 단리물, 소고기 단백질 단리물, 카세인 단백질 및 유청 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 중공 섬유.
  6. 제4항에 있어서, 상기 식물 단리물이 대두, 제인, 카세인, 및 밀 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 중공 섬유.
  7. 제4항에 있어서, 상기 지질이 유리 지방 산, 트리글리세리드, 천연 왁스 및 인지질 중 하나 이상을 포함하는 것인 중공 섬유.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 콩과식물 단백질 및 하나 이상의 히드로콜로이드를 포함하는 중공 섬유.
  9. 제1항에 있어서, 각각 제1 단부 및 제2 단부를 가지며, 여기서 상기 제1 단부 및 상기 제2 단부는 서로 위치적으로 대향하고, 여기서 소정량의 상기 중공 섬유는 본질적으로 평행으로 배열되고, 상기 중공 섬유의 제1 단부가 제1 유지 장치에 고정되고 상기 중공 섬유의 제2 단부가 제2 유지 장치에 고정되도록 배치되고, 제1 및 제2 유지 장치는 중공 섬유의 종방향 배향에 대하여 본질적으로 수직으로 배향되고 서로 본질적으로 평행으로 배향되고, 여기서 적어도 하나의 유지 장치는 중공 섬유의 내부로의 유체의 유동을 허용하고, 이에 의해 중공 섬유 카트리지를 생성하는 것인 중공 섬유.
  10. 제9항의 중공 섬유 카트리지로서, 상기 중공 섬유가 약 40 - 약 120개/cm2의 밀도로 존재하는 것인 중공 섬유 카트리지.
  11. 제9항의 중공 섬유 카트리지로서, 상기 중공 섬유가 약 60 - 약 100개/cm2의 밀도로 존재하는 것인 중공 섬유 카트리지.
  12. 제9항의 중공 섬유 카트리지로서, 상기 중공 섬유가 약 70 - 약 90개/cm2의 밀도로 존재하는 것인 중공 섬유 카트리지.
  13. 제9항의 중공 섬유 카트리지로서, 중공 섬유 사이의 공극 공간을 갖고, 여기서 중공 섬유 사이의 공극 공간은 중공 섬유 카트리지의 총 부피의 약 25% - 약 75%인 중공 섬유 카트리지.
  14. 제9항의 중공 섬유 카트리지로서, 중공 섬유 사이의 공극 공간이 중공 섬유 카트리지의 총 부피의 약 40% - 약 60%인 중공 섬유 카트리지.
  15. 제9항의 중공 섬유 카트리지로서, 하우징 내에 제거가능하게 삽입되도록 디자인된 중공 섬유 카트리지.
  16. 제15항에 있어서, 상기 하우징이 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 부분인 중공 섬유 카트리지.
  17. a) 제9항의 중공 섬유 카트리지;
    b) 상기 중공 섬유 카트리지를 유지하도록 사이징된 하우징;
    c) 상기 하우징 내의 하나 이상의 유입구에 유동적으로 연결된 배지 공급원;
    d) 상기 하우징 내의 하나 이상의 배지 유출구; 및
    e) 상기 배지 유입구(들) 및/또는 유출구(들)를 통해 상기 중공 섬유 카트리지에 배지를 공급하고/거나 그로부터 폐기 배지를 제거하기 위한 하나 이상의 펌프
    를 포함하는 중공 섬유 세포 배양 반응기.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유입구가 상기 중공 섬유의 내부에 유동적으로 연결된 것인 중공 섬유 세포 배양 반응기.
  19. 제17항에 있어서, 자동화된 제어기를 추가로 포함하는 중공 섬유 세포 배양 반응기.
  20. 제17항에 있어서, 중공 섬유 카트리지가 약 20개/cm2 내지 약 100개/cm2의 밀도로 중공 섬유를 포함하는 것인 중공 섬유 세포 배양 반응기.
  21. 제17항에 있어서, 중공 섬유 카트리지가 약 30개/cm2 내지 약 60개/cm2의 밀도로 중공 섬유를 포함하는 것인 중공 섬유 세포 배양 반응기.
  22. 제17항의 상기 중공 섬유 반응기 내의 중공 섬유 사이의 공극 공간에 약 105개 세포/ml 내지 약 108개 세포/ml의 밀도로 근세포, 근세포-유사 세포 또는 하나 이상의 근세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 중 하나 이상을 시딩하고, 약 80% - 약 99% 컨플루언시를 달성할 때까지 세포를 배양하는 것을 포함하는, 육류 생성물의 생성 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포가 약 80% - 약 99% 컨플루언시를 달성한 후에 중공 섬유 세포 배양 반응기로부터 상기 중공 섬유 카트리지를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 중공 섬유의 각각 제1 단부 및 제2 단부로부터 상기 제1 유지 장치 및 상기 제2 유지 장치를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 약 85% - 약 99% 컨플루언시를 달성할 때까지 상기 세포를 배양하는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 약 90% - 약 99% 컨플루언시를 달성할 때까지 상기 세포를 배양하는 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 중공 섬유 반응기에 지방세포, 지방세포-유사 세포 또는 하나 이상의 지방세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 및/또는 섬유아세포, 섬유아세포-유사 세포 또는 하나 이상의 섬유아세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 중 하나 이상을 시딩하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제22항에 있어서, 중공 섬유의 제1 단부 및 제2 단부 중 하나 또는 둘 다를 통해 중공 섬유의 내부로, 중공 섬유의 벽을 통해 상기 세포가 시딩되는 중공 섬유 사이의 공극 공간 내로, 및 상기 하우징 내의 상기 유출구 중 하나 이상을 통해 세포에 배지를 공급하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제22항에 있어서, 세포가 컨플루언시를 달성한 후, 중공 섬유의 내부 및/또는 세포 사이의 임의의 남아있는 공극 공간에 지방, 향미제, 색소, 염 및 보존제 중 하나 이상을 주입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. a) 50 - 90% 배양된 동물 세포;
    b) 10 - 30% 식용 중공 섬유 및/또는 중공 섬유 물질;
    c) 상기 배양된 동물 세포 사이에 위치하는 및/또는 상기 배양된 동물 세포가 산재되어 있는 1 - 30% 공극 공간; 및
    d) 1 - 30% 첨가제
    를 포함하는 구조화된 청정 육류 생성물.
  31. a) 50 - 90% 배양된 동물 세포;
    b) 10 - 30% 식용 중공 섬유 및/또는 중공 섬유 물질;
    c) 상기 배양된 동물 세포 사이에 위치하는 및/또는 상기 배양된 동물 세포가 산재되어 있는 1 - 30% 공극 공간; 및
    d) 1 - 15% 첨가제
    를 포함하는, 제22항의 방법에 의해 생성된 구조화된 청정 육류 생성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 첨가제가 향미제, 텍스처 향상제, 영양 첨가제, 보존제 및/또는 항산화제, 및 지방 및/또는 오일 중 하나 이상을 포함하는 것인 구조화된 육류 생성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 향미제가 에센셜 오일, 올레오레진 (ESO), 효소 (ENZ), 천연 물질 및 추출물 (NAT), 비-영양 감미료 (NNS), 영양 감미료 (NUTRS), 향신료, 천연 시즈닝 & 향료 (SP), 및 합성 향미제 (SY/FL), 훈증제 (FUM), 인공 감미료 및 효모 추출물 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  34. 제32항에 있어서, 상기 텍스처 향상제가 퓨레형 식물 물질, 구아 검, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌, 베타 글루칸, 대두, 밀, 옥수수 및 쌀 단리물 및 사탕무 섬유, 완두콩 섬유, 대나무 섬유, 식물 유래 섬유, 식물 유래 글루텐, 카라기난, 크산탄 검, 레시틴, 펙틴, 아가, 알기네이트, 천연 폴리사카라이드, 곡물 껍질, 시트르산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 황산마그네슘 및 염 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  35. 제32항에 있어서, 상기 영양 첨가제가 미량 원소, 생물활성 화합물, 내인성 항산화제, A, B-복합체, C, D, E 비타민, 아연, 티아민, 리보플라빈, 셀레늄, 철, 니아신, 칼륨, 인, 오메가-3, 오메가-6, 지방 산, 마그네슘, 단백질, 아미노산 염, 크레아틴, 타우린, 카르니틴, 카르노신, 유비퀴논, 글루타티온, 콜린, 글루타티온, 리포산, 스페르민, 안세린, 리놀레산, 판토텐산, 콜레스테롤, 레티놀, 폴산, 식이 섬유 및 아미노산 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  36. 제32항에 있어서, 상기 지방이 포화, 단일불포화, 다중불포화 지방, 옥수수 오일, 카놀라 오일, 해바라기 오일, 홍화 오일, 올리브 오일, 피넛 오일, 대두, 아마인 오일, 참깨 오일, 카놀라 오일, 아보카도 오일, 종자 오일, 너트 오일, 홍화 및 해바라기 오일, 팜 오일, 코코넛 오일, 오메가-3, 어유, 라드, 버터, 가공 동물 지방, 지방질 조직, 세포 농업 유래 지방 에센셜 오일 및 올레오레진 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  37. 제31항에 있어서, 상기 중공 섬유가 하나 이상의 콩과식물 단백질 및 하나 이상의 히드로콜로이드를 포함하는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  38. 제31항에 있어서, 상기 공극 공간에 세포 및/또는 세포 물질이 없는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  39. 제32항에 있어서, 상기 보존제 및/또는 항산화제가 나트륨 염, 클로라이드 염, 아이오딘 염, 니트레이트, 니트로사민, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 나트륨 벤조에이트, 칼륨 벤조에이트 및 벤젠 아스코르브산, 시트르산, 칼륨, 일나트륨 글루타메이트 (MSG), 이산화황, 술파이트, 항생제 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
  40. 제31항에 있어서, 상기 공극 공간이 세포 또는 세포 물질 이외의 물질로 적어도 부분적으로 충전된 것인 구조화된 청정 육류 생성물.
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