KR20230037508A - 변형된 산화 프로토콜을 사용한 올리고뉴클레오티드의 제조 공정 - Google Patents

변형된 산화 프로토콜을 사용한 올리고뉴클레오티드의 제조 공정 Download PDF

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KR20230037508A
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 신규 산화 프로토콜을 새로운 산화 용액에 적용하여, 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키는 것을 포함하는, 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정에 관한 것이다.

Description

변형된 산화 프로토콜을 사용한 올리고뉴클레오티드의 제조 공정
본 발명은 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 것을 포함하는, 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 신규 제조 공정에 관한 것으로서
Figure pct00001
여기서 산화는 특정 산화 용액 및 신규 산화 용액을 사용한다.
올리고뉴클레오티드 합성은 원칙적으로 원하는 서열이 조립될 때까지 성장하는 사슬의 5'-말단에 뉴클레오티드 잔기를 단계적으로 첨가하는 것이다.
대체로, 각 첨가는 합성 주기로 지칭되며 원칙적으로 하기의 화학 반응들로 구성된다
a1) 고체 지지체 상에서 보호된 하이드록실기 디블로킹,
a2) 고체 지지체 상에서 활성화된 포스포라미디트로서의 제1 뉴클레오시드와 유리 히드록실기의 커플링,
a3) 각각의 P-결합된 뉴클레오시드(포스파이트 트리에스테르)를 산화 또는 황화시켜 각각의 포스포디에스테르(P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트(P=S)를 형성;
a4) 선택적으로, 고체 지지체 상에서 임의의 미반응 히드록실기 캡핑;
a5) 고체 지지체에 부착된 제1 뉴클레오시드의 5' 히드록실기 디블로킹;
a6) 제2 뉴클레오시드를 활성화된 포스포라미디트로서 커플링하여 각각의 P-결합된 이합체 형성;
a7) 각각의 P-결합된 디뉴클레오티드(포스파이트 트리에스테르)를 산화 또는 황화시켜 각각의 포스포디에스테르(P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트(P=S)를 형성;
a8) 선택적으로, 임의의 미반응 5' 히드록실기 캡핑;
a9) 원하는 서열이 조립될 때까지 이전 단계 a5 내지 a8을 반복.
산화 단계는 일반적으로, 요오드, 유기 용매, 대체로 피리딘인 유기 용매 및 물을 포함하는 산화 용액을 사용하여 수행된다.
그러나, 새로 제조된 산화 용액이 적용될 때, 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물의 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로의 원하는 산화가 발생할 뿐만 아니라, 부반응으로서 분자에 존재하는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합은 뉴클레오티드 간 결합에서 P=S에서 P=O로의 전환에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 화학식 II의 화합물 내 포스포디에스테르 결합의 예상된 함량보다 더 높은 함량을 야기함이 관찰되었다.
따라서 본 발명의 목적은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합에 영향을 미치지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시킬 수 있는 산화 프로토콜을 발견하는 것이었다. 본 발명의 추가 목적은 숙성과 같은 추가의 필요 없이 제조될 때 쉽게 적용될 수 있는 산화 용액을 발견하는 것이었다.
본 발명의 목적은 요오드, 유기 용매 및 물을 포함하고 요오드화물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 산화 용액을 사용하여, 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 것을 포함하는, 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정으로 달성될 수 있음이 밝혀졌다.
Figure pct00002
하기의 정의는 본원의 발명을 설명하기 위해 사용된 다양한 용어의 의미 및 범위를 예시하고 정의하기 위해 제시된다.
용어 "C1-6-알킬"은 1 내지 6 개의 탄소 원자, 더욱 특정한 구체예에서 1 내지 4 개의 탄소 원자의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 나타낸다. 전형적인 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸 또는 t-부틸, 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 두 개 이상의 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 정의된다. 치료적으로 가치 있는 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 10 내지 40 개 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 25 개 뉴클레오티드 길이로 합성된다.
올리고뉴클레오티드는 선택적으로 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
본원에서 사용된 임의로 변형된은 동등한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 당 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다.
전형적인 변형은 당 모이어티 또는 잠금 핵산(LNA)에서의 2'-O-(2-M에톡시에틸)-치환(2'-MOE) 치환일 수 있고, 이는 리보스 모이어티가 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 가교로 변형된 변형된 RNA 뉴클레오티드이다.
용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "단위체" 또는 변형된 "단량체"와 상호 교환적으로 본원에서 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 대체로, 두 개의 뉴클레오티드를 함께 공유적으로 커플링하는 포스포디에스테르(P=O) 또는 포스포로티오에이트(P=S) 뉴클레오티드 간 결합에 의해 결합된다.
본 발명에 따르면 적어도 하나의 뉴클레오티드 간 결합은 포스포로티오에이트(P=S)로 구성되어야 한다. 따라서, 일부 올리고뉴클레오티드에서 모든 다른 뉴클레오티드 간 결합은 포스포디에스테르(P=O)로 구성될 수 있거나 다른 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 간 결합의 서열이 변하고 포스포디에스테르(P=O) 및 포스포로티오에이트(P=S) 뉴클레오티드 간 결합 두 가지 모두를 포함한다.
따라서 용어 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오티드 간 결합이 포스포로티오에이트(P=S)로 구성되어야 하고 적어도 하나의 뉴클레오티드 간 결합이 포스포디에스테르(P=O)로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U에 의해 표시될 수 있고, 여기서 각각의 문자는 선택적으로 동등한 기능의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 LNA 뉴클레오시드의 경우 대문자 A, T, G 및 MeC(5-메틸 시토신)로, DNA 뉴클레오시드의 경우 소문자 a, t, g, c 및 MeC로 기재된다. 변형된 핵염기는 tert-부틸페녹시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 아세틸, 이소부티릴 또는 디메틸포름아미디노와 같은 보호기를 보유하는 핵염기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다 (Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016 참조).
바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고 10 내지 40 개, 바람직하게는 10 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드 합성의 원리는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, 2016년 3월 15일자 내용 참조).
오늘날 대규모 올리고뉴클레오티드 합성은 컴퓨터 제어 합성기를 사용하여 자동화된 방식으로 수행된다.
대체로, 올리고뉴클레오티드 합성은 고체상 합성이며, 조립되는 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 히드록시기를 통해 고체 지지체 물질에 공유 결합되고 사슬 조립의 전체 과정에 걸쳐 부착된 상태로 유지된다. 적합한 지지체는 GE Healthcare의 Primer 지지체 5G 또는 Kinovate의 NittoPhase®HL 지지체와 같은 상업적으로 입수 가능한 거대 다공성 폴리스티렌 지지체이다.
수지로부터의 후속 절단은 진한 수성 암모니아를 사용하여 수행될 수 있다. 인산염 및 뉴클레오티드 염기 상의 보호기도 이 절단 절차 내에서 제거된다.
상기 개략된 바와 같이 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정은 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 것을 포함한다.
산화 용액은 요오드화물을 물 및 유기 용매와 혼합하고 후속하여 요오드를 첨가하여 제조될 수 있다.
요오드화물은 요오드화수소, 알칼리-요오드화물 또는 알칼리-삼-요오드화물로부터, 바람직하게는 요오드화수소 또는 알칼리-요오드화물로부터, 더욱 바람직하게는 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨으로부터 선택될 수 있다.
유기 용매는 피리딘으로부터 또는 C1-6 알킬-치환된 피리딘, 예를 들어 루티딘으로부터, 그러나 바람직하게는 피리딘으로부터 선택될 수 있다. 테트라히드로푸란과 같은 추가 유기 용매가 존재할 수 있다.
유기 용매 대 물의 부피비는 대체로 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 5:1 내지 15:1로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 9:1이다.
산화 용액 중의 요오드 대 요오드화물의 몰비는 1.0:0.1 내지 1.0:3.0, 바람직하게는 1.0:1.0 내지 1.0:2.0 범위에서 선택된다.
산화 용액 중의 요오드 농도는 10 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 15 mM 내지 60 mM 범위로 일반적으로 적용된다.
50mM의 요오드 함량을 기준으로, 요오드화물은 산화 용액이 ≥ 1500 μS/cm의 전도도를 가질 때까지의 양으로 첨가된다.
바람직한 구체예에서 요오드화물은 요오드화칼륨이고, 산화 용액은 50mM KI 및 50mM I2의 함량을 기준으로, ≥ 1500 μS/cm, 바람직하게는 1650 내지 2050 μS/cm, 더욱 바람직하게는 1750 내지 1950 μS/cm의 전도도를 갖는다.
10mM의 요오드 함량을 기준으로, 요오드화물은 산화 용액이 ≥ 300 μS/cm의 전도도를 가질 때까지의 양으로 첨가된다.
바람직한 구체예에서, 요오드화물은 요오드화칼륨이고 산화 용액은 10mM KI 및 10mM I2를 기준으로 ≥ 300 μS/cm, 바람직하게는 350 내지 550 μS/cm, 더욱 바람직하게는 400 내지 500 μS/cm의 전도도를 갖는다.
20mM의 요오드 함량을 기준으로, 요오드화물은 산화 용액이 ≥ 600 μS/cm의 전도도를 가질 때까지의 양으로 첨가된다.
바람직한 구체예에서, 요오드화물은 요오드화칼륨이고 산화 용액은 20mM KI 및 20mM I2를 기준으로 ≥ 600 μS/cm, 바람직하게는 750 내지 950 μS/cm, 더욱 바람직하게는 800 내지 900 μS/cm의 전도도를 갖는다.
100mM의 요오드 함량을 기준으로, 요오드화물은 산화 용액이 ≥ 3000 μS/cm의 전도도를 가질 때까지의 양으로 첨가된다.
바람직한 구체예에서, 요오드화물은 요오드화칼륨이고 산화 용액은 100mM KI 및 100mM I2를 기준으로 ≥ 3000 μS/cm, 바람직하게는 3200 내지 3900 μS/cm, 더욱 바람직하게는 3350 내지 3750 μS/cm의 전도도를 갖는다.
일반적으로 산화 용액은 반응 용액 중의 P=O 함량이 2.5 % 미만, 바람직하게는 2.0 % 미만의 값에 도달하는 방식으로, 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시킬 수 있다.
본 발명의 추가 구체예로서 다음 단계를 포함하는 산화 용액의 품질을 평가하기 위한 방법이 제공된다
a) 요오드 유기 용매 및 물을 포함하는 산화 용액을 제공하는 단계,
b) 산화 용액의 전도도를 측정하는 단계 및
c) 측정된 전도도의 특정 임계값에 기초하여 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 것에 대한 산화 용액의 적합성을 평가하는 단계.
산화 용액의 품질을 평가하기 위한 방법의 본 발명의 추가의 더욱 바람직한 구체예로서, 산화 용액은 추가로 요오드화물을 포함한다.
산화 반응의 제조에 사용되는 요오드의 양은 일반적으로 1.1 당량 내지 15 당량, 더욱 바람직하게는 1.5 당량 내지 4.5 당량으로부터 선택된다.
산화 반응은 15 ℃ 내지 27 ℃, 더욱 바람직하게는 18 ℃ 내지 24 ℃에서 수행된다.
상기 개략된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구체예로, 즉 요오드 및 요오드화물의 화학량론적 비율 또는 과량의 요오드화물이 존재하는 비율로 산화 용액은 제조 후 즉시 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 그러나 덜 바람직한 구체예에서 아화학량론적 양의 요오드화물이 있는 요오드 및 요오드화물의 비율이 사용될 수 있다.
이러한 산화 용액은 전도도 및 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키는 잠재성 측면에서 요구되는 특성을 가질 때까지 특정 시간의 숙성을 필요로 할 수 있다.
최적의 숙성 기간은 상기 산화 용액이 숙성되는 온도에 크게 좌우된다. 숙성 온도가 낮을수록 숙성 기간이 길어지지만, 숙성 온도가 높을수록 숙성 시간이 상당히 단축된다.
예를 들어, 산화 용액은 20 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서, 그러나 바람직하게는 30 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 숙성될 수 있다.
산화 용액의 숙성에 필요한 기간은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합에 영향을 미치지 않으면서 화학식 I의 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 선택적으로 산화시키기에 충분해야 한다.
대체로 산화 용액은 적어도 1 일, 3 일, 5 일, 10 일, 15 일 또는 적어도 20 일의 기간 동안 숙성될 수 있다.
기간은 언급된 바와 같이 숙성 온도에 따라 크게 변하고 30 ℃ 내지 35 ℃의 숙성 온도의 경우 10 일 내지 150 일, 더욱 일반적으로 20 일 내지 60 일에서 변할 수 있는 한편, 60 ℃ 내지 65 ℃의 숙성 온도의 경우 1 일 내지 30 일, 더욱 일반적으로 2 내지 15 일에서 변할 수 있다.
숙성은 대체로 특정 안정기에 도달할 때까지 전도도(μS/cm)의 증가 및 pH의 감소와 함께 진행된다.
추가 구체예에서 본 발명은 다음을 포함할 수 있는 새로운 산화 용액을 포함한다:
a) 10 내지 100 mM 요오드
b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 0.1 내지 3.0 몰 당량의 요오드화물
c) 유기 용매 및
d) 물, 여기서 유기 용매 대 물의 부피비는 20:1 내지 1:1임
바람직하게는,
a) 15 내지 60 mM 요오드
b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 1.0 내지 2.0 몰 당량의 요오드화물
c) 유기 용매 및
d) 물, 여기서 유기 용매 대 물의 부피비는 5:1 내지 15:1임
더욱 바람직하게는,
a) 15 내지 60 mM 요오드
b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 1.0 내지 2.0 몰 당량의 요오드화수소 또는 알칼리 요오드화물
c) 피리딘 및
d) 물, 여기서 피리딘 대 물의 부피비는 5:1 내지 15:1임.
더욱더 바람직하게는,
a) 15 내지 60 mM 요오드
b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 1.0 내지 2.0 몰 당량의 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨
c) 피리딘 및
d) 물, 여기서 피리딘 대 물의 부피비는 9:1임.
예시로서 올리고뉴클레오티드는 다음으로부터 선택될 수 있다:
5' - Me C S Me U O Me C O A O G STSASAS MeCSASTSTSGSAS MeCS A O Me C O Me C O A S Me C- 3'
밑줄로 강조된 잔기는 2'-MOE 뉴클레오시드이다. 포스포로티오에이트 및 포스페이트 디에스테르 결합의 위치는 각각 S 및 O로 지정된다. 2'-O-(2-메톡시에틸)-5-메틸우리딘(2'-MOE MeU) 뉴클레오시드는 때때로 2'-O-(2-메톡시에틸)리보티미딘(2'-MOE T)으로 지칭됨에 유념해야 한다.
본원에 개시된 화합물은 하기 핵염기 서열을 갖는다.
서열 번호 1: cucagtaacattgacaccac
실시예
5' - Me C S Me U O Me C O A O G S T S A S A S Me C S A S T S T S G S A S Me C S A O Me C O Me C O A S Me C - 3'의 합성
올리고뉴클레오티드는 AKTA 올리고파일롯(Oligopilot) 100 및 프라이머 서포트 유니링커(Primer Support Unylinker [NittoPhase LH Unylinker 330])를 사용하여 2.20 mmol 규모로 고체상에서 표준 포스포라미디트 화학에 의해 생성되었다. 일반적으로 1.4 당량의 DNA/MOE-포스포라미디트를 사용했다. 다른 시약(디클로로아세트산, 1-메틸이미다졸, 4,5-디시아노이미다졸, 아세트산 무수물, 페닐아세틸 디설파이드, 피리딘, 트리에틸아민)을 상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 수령한 그대로 사용하고 적절한 농도의 시약 용액을 제조했다 (하기 세부 사항 참조). 산화제 용액을 새로 제조했다 (하기 참조). 수산화암모늄을 사용하여 절단 및 탈보호를 달성하여 미정제 올리고뉴클레오티드를 얻었다.
표준 시약 용액
Figure pct00003
요오드/요오드화칼륨 용액의 제조
요오드화칼륨을 실온에서 물에 첨가하고, 이어서 피리딘을 첨가했다. 요오드를 첨가하고 혼합물을 양압의 건조 질소하에 1 시간 동안 교반한 후 사용했다.
Figure pct00004
요오드/요오드화나트륨 용액의 제조
7.49 g 요오드화나트륨을 실온에서 101 g의 물에 첨가하고, 이어서 886 g의 피리딘을 첨가했다. 12.7 g의 요오드를 첨가하고 혼합물을 양압의 건조 질소하에 1 시간 동안 교반한 후 사용했다.
숙성 없이 상이한 산화제 용액을 사용하는 산화 예
Figure pct00005
1 질량 분석법에서 결정된 원하는 화합물의 분자 질량에 대해 16 Da의 질량 차이를 갖는 분자의 백분율, 즉 1 개의 P=S 결합이 P=O 결합으로 변환된 분자의 백분율을 지칭한다.
30-35 ℃에서 KI (50 mM)/I 2 (50 mM) 용액의 숙성
용액을 사용할 때까지 황색 유리병 내에 30-35 ℃에서 보관했다.
(30-35 ℃에서) 숙성된 KI (50 mM)/I 2 (50 mM) 용액을 사용하는 산화 예
Figure pct00006
1 질량 분석법에서 결정된 원하는 화합물의 분자 질량에 대해 16 Da의 질량 차이를 갖는 분자의 백분율, 즉 1 개의 P=S 결합이 P=O 결합으로 변환된 분자의 백분율을 지칭한다.
SEQUENCE LISTING <110> F.Hoffmann-La Roche Ltd. <120> Process for the preparation of oligonucleotides using modified oxidation protocol <130> P36240 WO <150> EP20184839.7 <151> 2020-07-09 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Oligonucleotide <400> 1 cucagtaaca ttgacaccac 20

Claims (26)

  1. 요오드, 유기 용매 및 물을 포함하는 산화 용액을 사용하여, 하기 반응식에 따라 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 것을 포함하는, 혼합 P=O/P=S 골격 올리고뉴클레오티드의 제조 공정으로서, 산화 용액은 요오드화물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 공정.
    Figure pct00007
  2. 제1항에 있어서, 요오드화물은 요오드화수소, 알칼리-요오드화물 또는 알칼리-삼요오드화물로부터 선택되는, 공정.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 요오드화물은 요오드화수소 또는 알칼리 요오드화물로부터 선택되는, 공정.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 요오드화물은 알칼리 요오드화물로부터 선택되는, 공정.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 용액 중의 요오드 대 요오드화물의 몰비는 1.0:0.1 내지 1.0:3.0, 바람직하게는 1.0:1.0 내지 1.0:2.0 범위에서 선택되는, 공정.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 피리딘 또는 C1-6 알킬-치환된 피리딘으로부터, 그러나 바람직하게는 피리딘으로부터 선택되는, 공정.
  7. 제6항에 있어서, 유기 용매는 피리딘으로부터 선택되는, 공정.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매 대 물의 부피비는 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 5:1 내지 15:1, 더욱 바람직하게는 9:1인, 공정.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 용액 중의 요오드 농도는 10 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 15 mM 내지 60 mM인, 공정.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 50 mM의 요오드 함량을 갖는 산화 용액이 사용되며, 산화 용액이 ≥ 1500 μS/cm의 전도도를 가질 때까지 산화 용액에 요오드화물이 첨가되는, 공정.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 50mM KI 및 50mM I2의 함량을 기준으로, ≥ 1500 μS/cm, 바람직하게는 1650 내지 2050 μS/cm의 전도도를 갖는 산화 용액이 사용되는, 공정.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 10mM의 요오드 함량을 갖는 산화 용액이 사용되며, 산화 용액이 ≥ 300 μS/cm의 전도도를 가질 때까지 산화 용액에 요오드화물이 첨가되는, 공정.
  13. 제1항 내지 제9항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 10mM KI 및 10mM I2의 함량을 기준으로, ≥ 300 μS/cm, 바람직하게는 350 내지 550 μS/cm의 전도도를 갖는 산화 용액이 사용되는, 공정.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 20mM의 요오드 함량을 갖는 산화 용액이 사용되며, 산화 용액이 ≥ 600 μS/cm의 전도도를 가질 때까지 산화 용액에 요오드화물이 첨가되는, 공정.
  15. 제1항 내지 제9항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 20mM KI 및 20mM I2의 함량을 기준으로, ≥ 600 μS/cm, 바람직하게는 750 내지 950 μS/cm의 전도도를 갖는 산화 용액이 사용되는, 공정.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 100mM의 요오드 함량을 갖는 산화 용액이 사용되며, 산화 용액이 ≥ 3000 μS/cm의 전도도를 가질 때까지 산화 용액에 요오드화물이 첨가되는, 공정.
  17. 제1항 내지 제9항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 100mM KI 및 100mM I2의 함량을 기준으로, ≥ 3000 μS/cm, 바람직하게는 3200 내지 3900 μS/cm의 전도도를 갖는 산화 용액이 사용되는, 공정.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 용액은 반응 용액 중의 P=O 함량이 2.5 % 미만, 바람직하게는 2.0 % 미만의 값에 도달하는 방식으로, 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시킬 수 있는, 공정.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 용액의 제조에 사용되는 요오드의 양은 1.1 당량 내지 15 당량, 더욱 바람직하게는 1.5 당량 내지 4.5 당량으로부터 선택되는, 공정.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 반응을 위한 반응 온도는 15 ℃ 내지 27 ℃, 더욱 바람직하게는 18 ℃ 내지 24 ℃로부터 선택되는, 공정.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 10 내지 40 개, 바람직하게는 10 내지 25 개 뉴클레오티드 길이인, 공정.
  22. 다음을 포함하는 산화 용액
    a) 10 내지 100 mM 요오드
    b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 0.1 내지 3.0 몰 당량의 요오드화물
    c) 유기 용매 및
    d) 물, 여기서 유기 용매 대 물의 부피비는 20:1 내지 1:1임.
  23. 제22항에 있어서, 다음을 포함하는 산화 용액
    a) 15 내지 60 mM 요오드
    b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 1.0 내지 2.0 몰 당량의 요오드화물
    c) 유기 용매 및
    d) 물, 여기서 유기 용매 대 물의 부피비는 5:1 내지 15:1임.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 다음을 포함하는 산화 용액
    a) 15 내지 60 mM 요오드
    b) 1.0 몰 당량의 요오드에 대해 1.0 내지 2.0 몰 당량의 요오드화수소 또는 알칼리 요오드화물
    c) 피리딘 및
    d) 물, 여기서 유기 용매 대 물의 부피비는 5:1 내지 15:1임.
  25. 산화 용액의 품질을 평가하는 방법으로서,
    a) 요오드 유기 용매 및 물을 포함하는 산화 용액을 제공하는 단계;
    b) 산화 용액의 전도도를 측정하는 단계 및
    c) 측정된 전도도의 특정 임계값에 기초하여 화학식 I의 중간 포스파이트 트리에스테르 화합물을 화학식 II의 포스포디에스테르 화합물로 산화시키는 것에 대한 산화 용액의 적합성을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 산화 용액은 요오드화물을 추가로 포함하는, 방법.
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US7135565B2 (en) * 2000-07-28 2006-11-14 Agilent Technologies, Inc. Synthesis of polynucleotides using combined oxidation/deprotection chemistry
ATE467679T1 (de) * 2003-12-23 2010-05-15 Santaris Pharma As Oligomere verbindungen zur modulation von bcl-2
US20050267300A1 (en) * 2004-04-05 2005-12-01 Muthiah Manoharan Processes and reagents for oligonucleotide synthesis and purification
CN111164091A (zh) * 2017-06-02 2020-05-15 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其使用方法
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