KR20230036348A - 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용한 스테로이드의 탈수소화 생물전환 방법 - Google Patents
7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용한 스테로이드의 탈수소화 생물전환 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소(7α-HSDH)를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드에 관한 것으로, 본 발명에 의한 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용한 스테로이드의 탈수소화 생물전환 방법은 NAD+ 재생을 위해 알코올탈수소 효소를 사용하여 7α-HSDH에 의해 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로부터 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)으로 효율적으로 전환할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용한 스테로이드의 탈수소화 생물전환 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 관한 것이다.
장내 세균은 탈접합(deconjugation), 탈히드록시화 또는 탈수소화 반응을 매개하는 효소적 과정을 통해 담즙산(스테로이드 분자)을 이차 담즙산으로 전환시킬 수 있다.
특히, 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소(7α-HSDH)는 상업적으로 유용한 스테로이드 분자의 전환을 위한 생체 촉매로서 대단한 관심사로 떠오르고 있다. 예를 들어, 7α-HSDH는 케노디옥시콜산(CDCA)을 우르소디옥시콜산(UDCA)으로 생물전환용으로 사용될 수 있는데, 상기 7α-HSDH는 담즙의 콜레스테롤 포화도를 낮추어, 결과적으로 담석 질환에 대한 의학적 치료법으로의 적용할 수 있다.
7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소(7α-HSDH)는 NAD+또는 NADP+를 보조 인자로 사용하여 스테로이드 기질의 7α 위치에서 히드록시기의 탈수소화를 촉매한다.
이전 연구에서 이원 및 삼원 복합 구조를 결정했지만, 리간드가 없는 구조가 아직 사용 가능하지 않기 때문에, 리간드 및 보조 인자 결합에 의해 유도된 자세한 구조적 변화는 아직 명확하지 않다.
효소를 이용한 생물전환 방법에 관한 종래기술로는 홍삼박에서 효소 및 유산균 발효를 통한 진세노사이드의 생물전환방법(공개특허공보 제10-2021-0087536호) 등이 개시되어 있으나, 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 대해서는 알려져 있지 않은 실정이다.
본 발명자는 기질과 보조인자 결합에 의해 유도된 주요 구조적 변화를 나타낸 아포 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소의 결정 구조에 관한 연구를 수행하여, 아포 형태가 테트라머를 구성하는 4 개의 서브 유닛 사이에서 β4-α4 루프, α7-α8 나선 및 C-말단 루프에서 실질적인 형태 변화를 겪는다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용한 스테로이드의 탈수소화 생물전환 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 스테로이드가 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 콜산(cholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노디옥시콜산(taurochenodeoxycholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 스테로이드가 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)인 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소가 대장균 유래인 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시켜 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 생산하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시켜 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 생산하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소 및 알코올탈수소 효소를 이용하여 95% 이상의 전환률로 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로부터 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 생산하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 알코올탈수소 효소가 NADH로부터 NAD+를 재생시키는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 알코올탈수소 효소의 투입량이 2n배 증가함에 따라, 상기 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)의 생산량이 2배 증가하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 생물전환 방법에 의해 얻어진 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 생물전환 방법에 의해 얻어진 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 제공한다.
본 발명에 의한 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법은 NAD+ 재생을 위해 알코올탈수소 효소를 사용하여 7α-HSDH에 의해 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로부터 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)으로 효율적으로 전환할 수 있는 장점이 있다.
도 1a 내지 도 1c는 apo Eco-7α-HSDH의 결정 구조를 나타낸 것이다.
도 1a에서, Eco-7α-HSDH(체인 A)의 전체 단량체 구조는 전면 및 90도 회전된 뷰에 표시되었고, 리본 표시는 시안색의 β-가닥과 노란색의 α-나선이 있는 Eco-7α-HSDH(체인 A)이다.
도 1b는 Eco-7α-HSDH의 사량체 구조를 나타낸 것이다.
도 1c는 상동 단백질과 함께 Eco-7α-HSDH의 다중 서열 정렬을 나타낸 것으로, 정렬된 서열은 Eco-7α-HSDH(UniProtKB: P0AET8), Bme-7α-HSDH(UniProtKB: Q8YIN7), Cab-7α-HSDH(UniProtKB: G9FRD7), Chryseobacterium sp. (UniProtKB: X2D0L0), 및 Bacillus anthracis로부터의 3-옥소아실-ACP 환원효소(UniProtKB: G9FRD7)를 포함하고, 촉매적으로 중요한 잔기(S146, Y159 및 K163)는 검은색 원으로 표시되었으며, Bme-7α-HSDH는 브루셀라 멜리텐시스 7α-HSDH, Cab-7α-HSDH은 클로스트리디움 압소눔 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소, Eco-7α-HSDH는 대장균 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 각각 의미한다.
도 2는 apo Eco-7α-HSDH에서 4개의 서브 유닛의 구조적 비교를 나타낸 것이다. (A)는 스테레오 뷰에서 4개의 소단위(사슬 A-D, 도 1b에서 식별된 것과 동일한 색상)의 중첩, (B)는 사슬 A의 카툰 표현이고, (E)는 사슬 D의 카툰 표현이며, 여기서 잔기 L254는 기질 결합 부위의 입구를 차단, (C)눈 사슬 B의 카툰 표현이고 (D)는 사슬 C의 카툰 표현이며, 여기서 잔기 M147은 기질 결합 부위로의 입구를 차단, (F)는 사슬 A의 정전하 표면 뷰이고 (G)는 사슬 B의 정전하 표면 뷰이다.
도 3은 apo Eco-7α-HSDH와 이원 및 삼원 복합 구조의 구조 비교를 나타낸 것이다. (A)는 이원(PDB: 1AHH) 및 삼원(PDB: 1AHI)-복합체 구조를 갖는 apo Eco-7α HSDH(사슬 A 및 B)의 구조적 중첩의 입체도, (B) NAD+ 결합 및 (C) 7-옥소글리코케노데옥시콜산(7-oxoglycochenodeoxycholic acid) 결합은 스틱 모델로 표시된다.
도 4는 활성 부위에 보조인자(NAD 또는 NADH) 및 기질 7-옥소글리코케노데옥시콜산(7-oxoglycochenodeoxycholic acid) 결합시 Eco-7α-HSDH의 순차적인 변화를 나타낸 것이다. (A)는 apo Eco-7α HSDH(사슬 B 및 C)와 이원(PDB: 1AHH)-복합체의 구조적 중첩의 입체도를 나타낸 것이고, (B)는 apo Eco-7α HSDH(사슬 B 및 C)와 삼원(PDB: 1AHI)-복합체의 구조적 중첩의 입체도를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 조합 접근법을 사용한 생성물(7-KLCA) 형성을 나타낸 것이다.
도 5의 (A) 반응에는 Eco-7α HSDH(2mg/mL), Eco-ADH/ADH-2(2mg/mL), CDCA(10mM), DTT(1mM), NAD+(0.5mM) 및 500μL의 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 중 10% 아세톤이 포함되고, 반응을 1시간 동안 수행하였다. 도 5의 (B)는 증가하는 Eco-ADH 농도와 함께 시험관 내 7-KLCA의 형성을 나타낸 것이고, 도 5의 (C)는 NAD+ 재생을 위한 Eco-ADH의 존재 하에 보조기질 아세톤을 사용한 생체내 7-KLCA의 형성을 나타내 것이다.
도 5에서, 7-KLCA는 7-케톨리토콜산, ADH는 알코올 탈수소효소, CDCA는 케노데옥시콜산, Eco-7α-HSDH는 대장균 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소, Eco ADH는 대장균 알코올 탈수소효소를 각각 의미한다.
도 1a에서, Eco-7α-HSDH(체인 A)의 전체 단량체 구조는 전면 및 90도 회전된 뷰에 표시되었고, 리본 표시는 시안색의 β-가닥과 노란색의 α-나선이 있는 Eco-7α-HSDH(체인 A)이다.
도 1b는 Eco-7α-HSDH의 사량체 구조를 나타낸 것이다.
도 1c는 상동 단백질과 함께 Eco-7α-HSDH의 다중 서열 정렬을 나타낸 것으로, 정렬된 서열은 Eco-7α-HSDH(UniProtKB: P0AET8), Bme-7α-HSDH(UniProtKB: Q8YIN7), Cab-7α-HSDH(UniProtKB: G9FRD7), Chryseobacterium sp. (UniProtKB: X2D0L0), 및 Bacillus anthracis로부터의 3-옥소아실-ACP 환원효소(UniProtKB: G9FRD7)를 포함하고, 촉매적으로 중요한 잔기(S146, Y159 및 K163)는 검은색 원으로 표시되었으며, Bme-7α-HSDH는 브루셀라 멜리텐시스 7α-HSDH, Cab-7α-HSDH은 클로스트리디움 압소눔 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소, Eco-7α-HSDH는 대장균 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소를 각각 의미한다.
도 2는 apo Eco-7α-HSDH에서 4개의 서브 유닛의 구조적 비교를 나타낸 것이다. (A)는 스테레오 뷰에서 4개의 소단위(사슬 A-D, 도 1b에서 식별된 것과 동일한 색상)의 중첩, (B)는 사슬 A의 카툰 표현이고, (E)는 사슬 D의 카툰 표현이며, 여기서 잔기 L254는 기질 결합 부위의 입구를 차단, (C)눈 사슬 B의 카툰 표현이고 (D)는 사슬 C의 카툰 표현이며, 여기서 잔기 M147은 기질 결합 부위로의 입구를 차단, (F)는 사슬 A의 정전하 표면 뷰이고 (G)는 사슬 B의 정전하 표면 뷰이다.
도 3은 apo Eco-7α-HSDH와 이원 및 삼원 복합 구조의 구조 비교를 나타낸 것이다. (A)는 이원(PDB: 1AHH) 및 삼원(PDB: 1AHI)-복합체 구조를 갖는 apo Eco-7α HSDH(사슬 A 및 B)의 구조적 중첩의 입체도, (B) NAD+ 결합 및 (C) 7-옥소글리코케노데옥시콜산(7-oxoglycochenodeoxycholic acid) 결합은 스틱 모델로 표시된다.
도 4는 활성 부위에 보조인자(NAD 또는 NADH) 및 기질 7-옥소글리코케노데옥시콜산(7-oxoglycochenodeoxycholic acid) 결합시 Eco-7α-HSDH의 순차적인 변화를 나타낸 것이다. (A)는 apo Eco-7α HSDH(사슬 B 및 C)와 이원(PDB: 1AHH)-복합체의 구조적 중첩의 입체도를 나타낸 것이고, (B)는 apo Eco-7α HSDH(사슬 B 및 C)와 삼원(PDB: 1AHI)-복합체의 구조적 중첩의 입체도를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 조합 접근법을 사용한 생성물(7-KLCA) 형성을 나타낸 것이다.
도 5의 (A) 반응에는 Eco-7α HSDH(2mg/mL), Eco-ADH/ADH-2(2mg/mL), CDCA(10mM), DTT(1mM), NAD+(0.5mM) 및 500μL의 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 중 10% 아세톤이 포함되고, 반응을 1시간 동안 수행하였다. 도 5의 (B)는 증가하는 Eco-ADH 농도와 함께 시험관 내 7-KLCA의 형성을 나타낸 것이고, 도 5의 (C)는 NAD+ 재생을 위한 Eco-ADH의 존재 하에 보조기질 아세톤을 사용한 생체내 7-KLCA의 형성을 나타내 것이다.
도 5에서, 7-KLCA는 7-케톨리토콜산, ADH는 알코올 탈수소효소, CDCA는 케노데옥시콜산, Eco-7α-HSDH는 대장균 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소, Eco ADH는 대장균 알코올 탈수소효소를 각각 의미한다.
본 발명에서, "생물전환 방법"이라 함은 미생물 발효 및 효소 처리 등의 생명공학 기술을 통해 새로운 생성물을 생성하거나 기존의 화학 합성공정에 의해 합성 및 생산되고 있는 기존 화학물질을 대체하여 생산할 수 있는 기술을 의미하며, 생물전환(bioconversion, biotransformation), 생합성(biosynthesis), 생촉매(bio-catalysis) 등으로 불리기도 한다.
본 발명은 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
상기 스테로이드의 생물전환 방법에서, 상기 스테로이드는 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 콜산(cholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노디옥시콜산(taurochenodeoxycholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스테로이드의 생물전환 방법에서, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소는 대장균(E. coli) 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스테로이드의 생물전환 방법은 바람직하게는, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시켜 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스테로이드의 생물전환 방법은 바람직하게는, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시켜 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스테로이드의 생물전환 방법은 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소 및 알코올탈수소 효소를 이용하여 95% 이상, 바람하게는 95~99%의 전환률로 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로부터 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스테로이드의 생물전환 방법에서, 상기 알코올탈수소 효소는 NADH로부터 NAD+를 재생시킬 수 있는데, 상기 알코올탈수소 효소의 투입량이 2n배 증가함에 따라, 상기 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)의 생산량이 2배 증가할 수 있고, 상기 n은 1 이상의 정수, 바람직하게는 n은 1~10의 정수, 보다 바람직하게는 n은 1~5, 가장 바람직하게는 n은 1~2의 정수일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기의 생물전환 방법에 의해 얻어진 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid) 또는 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 제공한다.
케토-담즙산은 결장 세균에 의한 담즙산 히드록시기, 특히 7-히드록시 기의 산화의 결과로 인간 내에서 이차적으로 생성되고, 상기 케토-담즙산은 간에 의해 대응하는 α 또는 β-히드록시 담즙산으로 신속히 환원되는데, 예컨대 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)의 대응하는 케토 담즙산은 7-케토리토콜산(ketolithocholic acid)이고, 그것의 대응하는 β-히드록실 담즙산에 의한 환원 생성물 중의 하나는 삼차 담즙산인 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
(1). 화학물질 및 재료
케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA), 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid; 7-KLCA), 아세톤, 카나마이신 및 NAD+는 Sigma-Aldrich(서울, 한국)에서 구입하였다. 상업적인 ADH-2 단백질은 Cambrex(Wiesbaden, 독일)에서 구입하였다.
(2). 클로닝 및 단백질 정제
Eco-7α-HSDH(UniProtKB: P0AET8)를 암호화하는 유전자 및 그 E. coli(Eco-ADH) 유래의 암호화 ADH(UniProtKB: P37686)는 BamHI와 XhoI 제한 소화 및 pET28a(+) 벡터로의 클로닝 후 최적화 및 합성되었다.
두 결찰 구축물은 모두 E. coli C41 세포를 형질전환하는데 사용되었다. 전배양물(1mL seed)을 카나마이신(100μg/mL)을 함유하는 LB 배지 100mL에 첨가하고, 37℃에서 200rpm으로 성장시켰다. 세포가 600 nm에서 0.6의 광학 밀도에 도달한 후, 과발현을 위하여 이소프로필 β-D-1-티오 갈락토피라노사이드(0.5mM)로 세포를 유도하였다. 그런 다음 단백질 합성을 위하여 25℃에서 16시간 동안 배양하였다.
세포를 3500 rpm에서 20분 동안 한외 원심분리하여 수확하고, 건조 세포를 세척 완충액(50mM 인산칼륨 완충액)으로 2회 세척한 후, 초음파 처리를 통하여 용해시켰다.
그런 다음 용해물을 10,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 정제하기 위하여 수지와 혼합하였다.
수지 결합 단백질을 다른 농도의 이미다졸로 용출시킨 후, Eco-ADH용 30kDa 필터 및 Eco-7α-HSDH용 10kD용 필터(Centricon; Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 농축시켰다.
(3). 보조인자 재생 시스템
Eco-7α-HSDH는 촉매작용을 위한 보조인자로 NAD+를 필요로 하기 때문에, 본 발명자는 효율적인 NAD+ 재생을 위하여 보조기질 아세톤과 함께 ADH를 사용하였다 (하기 반응식 1).
[반응식 1]
다양한 농도의 Eco-ADH와 함께 CDCA로부터 7-KLCA 생산의 효율성을 관찰하였다. 7α-HSDH(2mg/mL), CDCA(10mM), DTT(1mM), ADH(4mg/mL), NAD+(0.5mM) 및 500μL의 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 중의 10% 아세톤을 사용하여 1시간 동안 시험관 내 반을을 수행하였다.
반응 혼합물을 2배 부피의 에틸 아세테이트로 추출한 후 질소 가스로 건조시키고, 메탄올에 용해시켜 분석하였다.
Eco-ADH를 pET32a(+) 벡터에 클로닝하고, 인비보 생물전환을 위하여 상기 클로닝된 pET32a(+) 벡터를 사용하여 Eco-7α-HSDH pET28a(+) 플라스미드를 포함하는 C41 세포를 형질전환시켰다.
세포가 과발현되고 위에서 설명한 대로 건조 세포를 얻었다. 그런 다음 이들 세포를 인산칼륨 완충액에 현탁시키고 CDCA을 7-KLCA으로 전화하는 인비보 생물전환을 500μL 반응 부피의 인산칼륨 완충액(pH 7.4)에 CDCA(10mM) 및 10% 아세톤을 포함하는 1-mL 반응(1.0g/mL 세포 건조 중량)으로 2시간 동안 수행하였다.
(4). 분석 방법
기질 및 생성물은 증발 광산란 검출기(ELSD) (ESA6700; Chromaflo Technologies, Ash tabula, OH, USA)를 사용하여 분석하였고, 시료는 Mightysil 역상 C18 GP 컬럼(4.6mm × 250mm, 5μm, Kanto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하여 분리하였다.
반응 혼합물을 물(A)과 아세토니트릴(B)의 구배 시스템을 사용하여 용리시켰다. 펌프 B 농도는 27분 동안 10%에서 100%로 점진적으로 증가되었고, 점차적으로 1.5mL/min의 유속으로 35분 동안 10%로 감소하였다.
시료 혼합물은 60℃ 및 350kPa 압력(질소 가스)에서 분무되었다. 양이온 모드에서 SYNAPT G2-S/ACUITY UPLC 액체 크로마토그래피(LC) 사중극자 time-of-flight/전자분무 이온 질량 분석법(MS; 물)에 의해 반응 혼합물을 분석하였다.
(5). 결정화 및 데이터 수집
Eco-7α-HSDH의 결정화 스크리닝을 sitting-drop vapor-diffusion method를 사용하여 293K에서 96-well 결정화 플레이트(Emerald Bio, Bainbridge Island, WA, USA) 에서 수행하였다.
high-throughput Mosquito crystallization robot(SPT Labtech, Basingstoke, UK)이 여러 상업적으로 이용 가능한 결정화 스크리닝 키트[MCSG I-IV(Anatrace, Maumee, OH, USA), Index 및 SaltRx(Hampton 연구 Aliso Viejo, CA, USA)]와 함께 사용되었다. 200nL의 단백질 용액으로 구성된 방울 및 200 nL의 저장 용액을 80 μL의 저장 용액에 대해 평형화하였다.
0.1 M HEPES:NaOH pH 7.5, 20%(w/v) PEG 4000 및 10%(v/v) 2-프로판올(MCSG4 #G11)의 존재하에 결정이 성장하였고, 293K에서 2일 배양 후 동결 방지제 없이 단결정을 수확하고 장착하였다. 포항 액셀러레이터 연구실(포항, 한국)의 BL-5C 빔라인에서 X선 회절 데이터 수집하였다.
HKL-2000 프로그램을 사용하여 1° 회전과 함께 이미지 180개를 포함하는 데이터 세트를 인덱싱, 통합 및 스케일링하였다.
(6). 구조 결정 및 정제
Eco-7α-HSDH의 결정 구조는 템플릿 모델로서 NADH 결합 Eco-7α-HSDH(PDB: 1FMC)와 함께 CCP4i suite의 MOLREP를 사용한 분자 교체에 의해 2.7 Å 해상도에서 결정되었다. COOT, REFMAC5 및 phenix.refine을 사용하여 반복적인 모델의 재리빌딩 및 정제(refinement)가 수행되었다.
MolProbity를 사용하여 확인된 Eco-7α-HSDH의 최종 구조 모델은 Rwork 및 Rfree 값이 각각 0.195 및 0.276이었다. 상세한 X선 데이터 수집 및 정제 통계는 하기 표 1에 나와 있다.
Eco-7α-HSDH의 좌표 및 구조적 인자는 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/, accession code: 7ENY)에 기탁되었다. 구조적 모형은 PyMOL 프로그램을 사용하여 생성되었다.
2. 결과 및 논의
(1). Eco-7α-HSDH의 Apo 구조
기질 및 보조인자 결합과 관련된 구조적 변화에 대해 조사하기 위해, 2.7Å 분해능에서 Eco-7α-HSDH의 apo 구조를 결정하였다. 데이터 수집 및 정제 통계에 대해서는 하기 표 1에 요약되어 있다.
단일 구조의 전체 구조는 9개의 α-헬릭스와 7개의 β-스트랜드가 있는 Rossmann-fold 모티프를 가지고 있으며(도 1a), 동종사량체(homotetrameric)의 4차 구조를 보여준다(도 1b).
비슷한 구조를 가지고 있는 비교대상 단백질들의 소단위 구조 중첩에서는 β4-α4 루프, α7-α8 나선 및 C-말단 루프에서 상당한 형태적 차이를 나타냈다(도 1c).
상기 표 1에서, Bme-7α-HSDH는 브루셀라 멜리텐시스 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소이고, Eco-7α-HSDH는 대장균 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소이며, PDB는 단백질 데이터 은행이고, 참고문헌(Reference) 5는 Biochemistry 35 (1996) 7715-7730이다.
(1-1). Apo Eco-7α-HSDH는 β4-α4 루프, C-말단 루프 영역 및 α7-α8 나선 에 고유한 구조적 유연성을 가지고 있다.
β4-α4 루프는 다른 사슬에서 누락되거나 모델링되지 않은 잔기를 포함하며, 이는 이 영역이 높은 정도의 유연성을 가지고 있음을 나타낸다.
α7-α8 나선은 사슬 B 구조(도 2의 B-E)에서 가장 열린 형태의 나선이다. 특히, α7-α8 나선 영역은 이웃 분자와 결정 패킹 상호작용을 형성하였다. C-말단 루프는 기질 결합 부위를 덮거나, L254 잔기가 α5-α6 및 α8-나선 영역과 소수성 상호작용을 형성한다(도 2의 F).
대조적으로, β4-α4 루프는 소수성 기질 결합 포켓을 덮으며, M147 잔기가 β6-α8 및 α7-나선 영역의 잔기와 소수성 상호작용을 일으키며(도 2의 2G), 이는 β4-α4 루프가 기질 결합으로 압출되는 결과를 초래한다.
본 발명자는 기질 결합을 차단하면 비특이적 소수성 분자가 Eco-7α-HSDH의 기질 결합 부위에 들어가는 것을 막을 수 있다는 점을 추측하였다.
(1-2). apo Eco-7α-HSDH와 이원 및 삼원 복합체 구조의 구조적 비교
Eco-7α-HSDH의 이원 및 삼원-복합체 구조와 apo 구조의 구조 비교는 α7-α8 나선의 형태가 세 구조 사이의 주요 차이점을 나타내는 것으로 나타났다. (도 3의 A).
삼원 복합체의 구조는 α7-α8 나선의 닫힘 운동으로 인해 완전히 닫힌 형태를 갖는다. 이와 대조적으로, 본질적인 구조적 유연성으로 인해 개방정도가 다른 구조와 다르지만, Apo Eco-7α-HSDH 서브 유닛은 일관되게 개방된 구조를 보여준다.
NAD+와의 상호작용을 촉진하는 I43, I69 및 R194의 측쇄에서 α7-α8 나선과 구조적 변화에 의한 약간의 폐쇄 운동이 있었지만, Apo 구조의 Chain B는 가장 넓은 개방향 구조를 보인 반면, Chain A는 보조인자 결합 이진복합 구조와 유사하였다.
열린 구조와 닫힌 구조의 비교는 Y159, L254, M209 및 I201 잔기가 기질 결합시 큰 구조를 겪는다는 것을 가르키며, Y159가 촉매잔기로 작용되는 반면, S146과 K163은 각각 기질 및 보조인자결합에 중요한 역할을 한다는 점이 시사된다(도 3의 B).
Apo 구조의 Tyr159 잔기는 이원 복합 구조의 β4-α4 루프에 위치한다. 보조 인자 결합 후 Tyr159의 측쇄는 보조 인자 결합 주머니의 안쪽으로 뒤집히고 결합된 보조 인자의 리보스 당 고리로 향하게 된다(도 4a).
다음으로 기질 결합은 α7-α8 나선(잔기 195-211)의 폐쇄 이동 및 C-말단 루프 영역(잔기 247-255)의 구조적 변화와 관련될 수 있다. Met209 및 Leu254 잔기는 소수성 상호작용을 형성함으로써 기질 결합에 직접 관여한다는 점에 유의해야 한다. 삼원 복합 구조(PDB 코드 1AHI)에서 결합된 기질(7-옥소글리코케노데옥시콜산)은 보조인자(NADH) 및 Tyr159 잔기와 소수성 상호작용을 형성한다(도 4b).
따라서, 보조인자 결합은 기질 결합을 촉진하고 유도할 수 있다고 생각된다.
(2). 보조인자 재생 시스템을 사용한 CDCA의 7-KLCA로의 생물전환
Eco-7α-HSDH 및 Eco-ADH의 공동 발현은 효율적인 촉매 작용을 통해 CDCA에서 7-KLCA로의 생체 내 변화를 보였다. LC-MS 분석을 통하여 22.4분에 분자량 781.564 m/z의 질량을 갖는 이량체를 보였다.
Eco-7α-HSDH의 촉매 작용에는 비싼 NAD+를 필요로 하는데(상기 반응식 1), 이는 Eco-ADH 시스템의 도입을 통하여, Eco-7α-HSDH, NAD+ 및 기질의 일정한 수준과 함께 증가된 Eco-ADH 농도가 시험관 내(in vitro) 반응에서 7-KLCA의 생산을 두 배로 증가시킨다는 것을 발견하였다(도 5의 B). 이는 UCDA 합성을 표적으로 하는 보조 인자 재생을 위해, Eco-ADH의 존재하에 Eco-7α-HSDH를 사용하여 7-KLCA 중간체의 효율적이고 신뢰할 수 있는 합성을 입증하였다.
상업용 ADH-2를 사용한 Eco-7α-HSDH 활성과 유사한 최적 조건에서 Eco-ADH를 사용한 것과의 비교를 통하여, ADH-2를 사용한 NAD+ 재생 시스템은 95% 이상의 CDCA에서 7-KLCA로의 전환을 보여주었다(도 5의 A). 또한 생체 내(in vivo) 시스템에서 Eco-7α-HSDH와 Eco-ADH는 ~50%의 생성물을 형성하였디(도 5의 C).
(3). 결론
본 발명자는 보조 인자 및 보조 인자와 관련된 3가지 주요 구조요소의 구조적 변화를 설명할 수 있는 Apo Eco-7α-HSDH의 구조를 해결하였고, L254 및 M147이 보조인자 및 기질 결합전에 기질결합 부위를 차단하는 게이트키퍼의 역할을 한다는 점을 관찰하였으며, Eco-7α-HSDH를 사용한 CDCA으로부터 7-KLCA의 생성을 통하여 보조 인자 재활용을 가능하게 하는 Eco-ADH와의 공동 발현을 통해 Eco-7α-HSDH 활성을 평가하는 효율적인 방법을 개발하였다.
Claims (11)
- 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 스테로이드의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스테로이드가 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 콜산(cholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노디옥시콜산(taurochenodeoxycholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid) 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스테로이드가 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소가 대장균 유래인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시켜 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 생산하는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소를 이용하여 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 7α 위치에서 히드록시기를 탈수소화시켜 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid)을 생산하는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 7α-히드록시스테로이드 탈수소 효소 및 알코올탈수소 효소를 이용하여 95% 이상의 전환률로 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로부터 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)을 생산하는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 알코올탈수소 효소는 NADH로부터 NAD+를 재생시키는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 알코올탈수소 효소의 투입량이 2n배 증가함에 따라, 상기 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid)의 생산량이 2배 증가하는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 생물전환 방법에 의해 얻어진 7-케토리토콜산(7-ketolithocholic acid).
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 생물전환 방법에 의해 얻어진 우르소디옥시콜산(ursodeoxycholic acid).
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