KR20230036346A - Cyp125a13 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법 - Google Patents

Cyp125a13 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테로이드 C27-히드록시라제인 CYP125A13을 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 상기 CYP125A13 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 종래의 CYP125A13 효소를 이용한 생물전환 방법에 비해 반응 효율이 높고, 생물전환 후 생성물의 분포를 증가시키므로, 약학 분야에서 기존 스테로이드를 대체할 수 있는 약물 개발 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CYP125A13 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법{Bioconversion method for hydroxylizing steroid using CYP125A13}
본 발명은 CYP125A13 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스테로이드 C27-히드록시라제인 CYP125A13을 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 관한 것이다.
촉매 반응 동안 시토크롬 P450 모노옥시게나제(P450)는 분자 산소를 사용하여 산소 원자를 유기 분자인 기질로 삽입한다. 동시에 나머지 산소 원자는 물로 환원된다. P450 효소의 주요 특징은 소수성 기질의 탄소 원자의 하이드록실화이다.
마찬가지로, P450 효소의 다양성과 유연성은 다양한 화확반응에 자연이 준 소중한 선물이 된다. 상기 P450 효소는 C-하이드록실화, 헤테로원자의 산소화, 탈알킬화 및 에폭시화와 같은 다양한 유형의 화학 반응을 촉매하고, 화장품 및 약학적 가치가 있는 다양한 화합물을 생산하는 매력적이고 다재다능한 효소로 만든다.
대부분의 세균성 사이토크롬 P450(CYP)은 NAD(P)H 의존성 페레독신 환원효소(FDR)과 페레독신(FDX)으로 구성된 전자 전달 성분(산화 환원 파트너) 및 촉매 작용 동안 보조 인자에서 헴 철로 전자를 순차적으로 전달하는 페레독신(FDX)에 의존한다.
또한, CYP152 P450 계열의 퍼옥시게나제와 같은 일부 CYP는 산화 환원 파트너가 필요 없는 과산화수소(H2O2)를 사용하여 효율적으로 기능한다. 게놈 서열을 조사한 결과, 다른 원핵생물에 비해 Actinobacteria에는 많은 수의 유전자가 포함되어 있음이 밝혀졌는데, Streptomyces peucetius에만 20개의 P450 유전자가 있다. 대부분의 이러한 모노옥시게나제의 정확한 기능은 아직 알려져 있지 않았다. 그러나 일부는 스테로이드 및 스테롤(콜레스테롤) 대사에 연루된 것으로 추정된다(도 1).
효소를 이용한 생물전환 방법에 관한 종래기술로는 홍삼박에서 효소 및 유산균 발효를 통한 진세노사이드의 생물전환방법(공개특허공보 제10-2021-0087536호) 등이 개시되어 있으나, 효소를 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 대해서는 알려져 있지 않은 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2021-0087536호
본 발명자들은 스테로이드 27-모노옥시게나제(monooxygenase)로서의 CYP125A13의 발현, 분리, 정제 및 특성화에 관한 연구를 수행하여, CYP125A13을 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시킬 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 스테로이드 C27-히드록시라제인 CYP125A13을 이용한 스테로이드의 생물전환 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CYP125A13을 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 스테로이드는 콜레스테롤 또는 4-콜레스테논-3-온(4-cholesten-3-one)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 CYP125A13은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래의 시토크롬 P450일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 CYP125A13은 스트렙토마이세스 퓨세티우스(Streptomyces peucetius) 유래의 시토크롬 P450일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 스테로이드가 콜레스테롤이고, 상기 콜레스테롤에 대한 상기 CYP125A13의 KD 값은 56.5~57.5 μM이며, 상기 콜레스테롤에 대한 상기 CYP125A13의 Km 값은 11~12 μM일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 스테로이드가 4-콜레스테논-3-온(4-cholesten-3-one)이고, 상기 4-콜레스테논-3-온에 대한 상기 CYP125A13의 KD 값은 59~60 μM일 수 있다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 생물전환 방법에 의해 얻어진 27-하이드록시콜레스테롤을 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 생물전환 방법에 의해 얻어진 27-하이드록시-4-콜레스테논-3-온을 제공한다.
본 발명에 의한 상기 CYP125A13 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 종래의 CYP125A13 효소를 이용한 생물전환 방법에 비해 반응 효율이 높고, 생물전환 후 생성물의 분포를 증가시키므로, 약학 분야에서 기존 스테로이드를 대체할 수 있는 약물 개발 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 탄소 원자 위치에 번호가 매겨진 자연계에서 발견되는 다양한 스테롤의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 S. peucetius 유래의 CYP125A13을 포함하는 선택된 CYP125A 계열 효소의 헴 도메인 계통수를 나타낸 것이다.
도 3은 CLUSTALW를 사용하여 다른 CYP125 계열 효소와 비교한 CYP125A13의 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 나타낸 것으로서, 산소 결합 모티프, EXXR 모티프 및 CYP 서브패밀리의 특징적인 헴 결합 모티프를 포함하는 다른 보존된 구조의 모티프는 밑줄이 그어져 있다. 헴 결합 모티프의 보존된 시스테인 잔기는 빨간색으로 강조 표시되었다. 보존된 잔류물은 굵은 글씨로 표시되었다.
도 4a 및 도 4b는 His-tagged CYP125A13의 정제 및 분광 특성화를 나타낸 것이다. 도 4a는 SDS-PAGE 분석 정제된 CYP125A13(레인 1, 46.6kDa), PDR(레인 2, 58kDa) 및 PDX(레인 3, 10kDa)이고(여기서 M은 표준 단백질 마커임)이고, 도 4b는 CYP125A13의 전형적인 CO-차 스펙트럼(CO-differnece spectra)을 나타낸 것이다. 실선은 산화된 형태, 점선은 sodium dithionite 결합 형태, dot-dash line은 CO 환원 형태를 나타낸 것이다.
도 5 a 내지 도 5c는 CYP125A13의 분광 특성화를 나타낸 것이다. 도 5a는 산화된 CYP125A13의 X-밴드 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트럼으로서, 겉보기 g 값은 스펙트럼에 표시되었다. 도 5b는 콜레스테롤의 결합에 의해 유도된 스펙트럼 이동으로서, P450에 대해 적정된 기질의 다양한 농도, 흡광도 변화 대 기질의 플롯 적정 농도, 적정의 각 위치는 실시예의 실험 절차에 기재되어 있는 바와 같이 긴밀한 결합 2차 방정식으로 플롯되었다. 도 5c의 CYP125A13의 Michaelis-Menten 곡선은 반응속도 대 콜레스테롤 농도 범위 5-350 μM의 플롯에 의해 얻었다.
도 6a 내지 도 6c는 CYP125A13에 의한 콜레스테롤 하이드록실화의 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS) 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 콜레스테롤의 하이드록실화에 대한 GC 크로마토그램(여기서 S는 기질을 나타내고, P는 27-하이드록실화 생성물임), 도 6b는 콜레스테롤의 질량 스펙트럼(콜레스테롤[M]+의 TMS-에테르 = m/z 458), 도 6c는 인비트로 반응에 의한 생성물 피크(27-하이드록시콜레스테롤)의 질량 스펙트럼(27-하이드록시콜레스테롤[M]+의 TMS-에테르 = m/z 546)을 나타낸 것이다.
도 7은 CYP125A13-기질 복합체의 구조 분석 결과를 나타낸 것이다. A는 결합된 콜레스테롤과 함께 CYP125A13의 상동성 모델의 리본(녹색). B는 활성 부위의 콜레스테롤을 둘러싸고 있는 아미노산 잔기 단백질, C는 콜레스테롤의 C3-OH와 Glu200 잔기의 카르복실기 사이의 수소 결합, D 및 E는 활성 부위 내에서 헴을 마주하는 지방족 C27 콜레스테롤(도 7의 D) 및 4-콜레스텐-3-온 (도 7의 E) 각각 3.1 Å 및 4.6 Å의 거리를 나타낸 것이다(갈색 선은 기질과 헴 포르피린 사이의 거리, 콜레스테롤과 4-콜레스테논-3-온은 각각 녹색과 자홍색으로 표시됨).
본 발명에서, "생물전환 방법"이라 함은 미생물 발효 및 효소 처리 등의 생명공학 기술을 통해 새로운 생성물을 생성하거나 기존의 화학 합성공정에 의해 합성 및 생산되고 있는 기존 화학물질을 대체하여 생산할 수 있는 기술을 의미하며, 생물전환(bioconversion, biotransformation), 생합성(biosynthesis), 생촉매(bio-catalysis) 등으로 불리기도 한다.
본 발명은 CYP125A13을 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
상기 스테로이드는 콜레스테롤 또는 4-콜레스테논-3-온(4-cholesten-3-one)일 수 있다.
상기 콜레스테롤은 인간의 세포막 구조 및 유동성, 스테로이드 호르몬 합성 및 담즙 생성에 필수적인 중요한 화합물이다. Mycobacterium tuberculosis(Mtb)에는 콜레스테롤 대사를 담당하는 많은 유전자가 포함되어 있는데, Mtb는 콜레스테롤을 분해하여 에너지로 사용하거나 생합성 전구체로 활용한다.
마이코박테리아 Cyp125(Rv3545c)는 C27-스테로이드의 하이드록실화를 담당하며, 유사하게 Rhodococcus jostii RHA1 유래의 CYP125는 Mtb P450(RV3545c)에 대한 콜레스테롤 수산화효소 상동체(orthologue)이다.
미생물의 콜레스테롤 분해는 스테로이드 개환과 측쇄 제거의 두 가지 과정을 포함한다. 처음에 고리 산화는 원핵생물에서 콜레스테롤 이화작용의 첫 번째 단계라고 가정하였다. 세균의 유형에 따라 고리 산화 또는 스테롤 측쇄 산화가 먼저 발생한다.
스테롤 개환(ring opening)은 콜레스테롤 3β-히드록실기의 산화 및 Δ5의 Δ4로의 후속 이성질체화를 통하여 콜레스테롤 산화효소 또는 3β-하이드록시스테로이드의 도움으로, 4-콜레스틴-3-온 형성에 의해 시작된다.
또한, 고리 A와 B의 산화는 고리 분해 효소인 3-ketosteroid 9α hydroxylase와 3-ketosteroid dehydrogenase에 의해 일어난다. 측쇄 제거는 하이드록실화를 통해 C26 위치에서 일어난다. 이어서 말단 산의 추가적인 산화가 일어난다. 이 말단 산의 추가적인 분해는 β-산화와 유사한 과정에 의해 일어난다.
상기 콜레스테논(4-Cholesten-3-one)은 콜레스테롤의 중간 산화 생성물로서, 주로 간에서 대사된다. 콜레스테논은 막에서 이동성이 높으며, 콜레스테롤 플립-플롭(flip-flop) 및 유출에 영향을 준다. 콜레스테논은 세포에 장기적간의 기능적 결함을 일으킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 CYP125A13은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래의 시토크롬 P450일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 CYP125A13은 스트렙토마이세스 퓨세티우스(Streptomyces peucetius) 유래의 시토크롬 P450일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 콜레스테롤에 대한 상기 CYP125A13의 KD 값은 56.5~57.5 μM, 바람직하게는 56.8~57.1 μM, 보다 바람직하게는 56.9~57.0 μM일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 콜레스테롤에 대한 상기 CYP125A13의 Km 값은 11~12 μM, 바람직하게는 11.1~11.5 μM, 보다 바람직하게는 11.2~11.4 μM일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 4-콜레스테논-3-온에 대한 상기 CYP125A13의 KD 값은 59~60 μM, 바람직하게는 59.0~59.5 μM, 보다 바람직하게는 56.2~56.3 μM일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 생물전환 방법에 의해 얻어진 27-하이드록시콜레스테롤을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생물전환 방법에 의해 얻어진 27-하이드록시-4-콜레스테논-3-온을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
(1) 화학물질 및 효소
모든 스테로이드, 스테롤 화합물 및 유도체화 시약 N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA)는 Sigma-Aldrich(미국) 또는 Tokyo Chemical Industry(일본)에서 구입하였다. 제한효소, ligase 및 polymerase는 Takara(일본)에서 구입하였다. 구매한 모든 제품은 가장 높은 등급이며, 상업적 출처에서 얻었다.
(2). 계통수 및 다중 서열 정렬(Multiple Sequence Alignment)
Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 (MEGA7)을 사용하여 CYP125A13(NCBI 유전자 수탁 번호, AJ605549)의 계통수 분석을 수행하였다. 거리는 2-매개변수 모델로 유지되었고. neighbor-joining 방법으로 클러스터링을 수행하였으며, 1000번의 복제를 기반으로 부트스트랩 값을 사용하여 분석하였다.
GeneDoc 및 ClustalW를 사용하여 Multiple Sequence Alignment를 수행하였다.
마찬가지로, 뉴클레오티드 및 아미노산 비교 및 분석을 위해, National Center for Biotechnology(NCBI) Basic Local Alignment Search Tools (BLAST)가 사용되었다.
(3). 박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건
클로닝 호스트로 E. coli XL1-Blue MRF'(Stratagene, USA)를 사용하였고, 발현 호스트로 E. coli BL21(DE3)을 사용하였다. E. coli의 성장을 위해 Luria-Bertani(LB) 한천 또는 브로스를 사용하였다. 승인된 프로토콜은 결찰 및 효소 소화와 같은 모든 DNA 조작이 뒤따랐다.
(4). CYP125A13의 클로닝 및 과발현
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머(Geno-Tech, Korea) 5'- GAA TTC ATG TCC TGC CCC CAT CTG -3'(EcoRI) 및 5'- AAG CTT TCA CCC GG TCG TCA CCT GGA GT -3')(HindIII)이 각각 설계되었다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 94℃에서 7분간의 초기 변성, 94℃, 1분간 30 반복, 67℃에서 1분간의 어닐링, 72℃에서 1분간의 중합, 72℃에서 7분 동안의 최종 연장으로 수행되었다.
DNA 증폭을 위해 E. coli XL1-Blue로 연속적인 형질전환과 함께, pGEM-T Easy vector는 정제된 PCR 산물의 클로닝에 사용되었다. 유전자는 PCR 동안에 발생할 수 있는 오류를 식별하기 위해 시퀀싱되었다.
그런 다음 유전자는 각각의 엔도뉴클레아제 효소(EcoRI 및 HindIII) 및 이전에 자유화된 pET28a(+) 및 pET32a(+) 발현 벡터로의 삽입을 위해 T-벡터로부터 분리되었다.
N-말단 6xHis-태그 및 이소프로필-β-D 티오갈락토시드(IPTG)-유도성 T7 파지 프로모터를 보유하는 최종 DNA 구성물을 수용성 E. coli BL21(DE3) 및 C41 발현 호스트로 형질전환시켰다.
항생제가 포함된 LB 한천 플레이트에서 형질전환된 콜로니를 선택하였다. 단백질 발현을 위하여, 항생제가 포함된 LB-배지 50ml에 밤새 자란 종자 1.0ml를 접종하고, orbital 진탕기(180rpm)에서 37℃로 배양하였다.
세포 밀도가 OD600에서 0.6에 도달하고, 0.5mM의 FeCl3 및 1mM의 α-아미노레불린산(ALA)을 배양물에 첨가하였다. 20℃에서 20분간 배양한 후에, 1mM IPTG를 첨가하여 세포를 유도하고 20℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
3,000 xg에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하고, 50mM의 15% 글리세롤을 포함하는 Tris-HCl 완충액(pH 7.4)으로 두 번 세척하였다. 세포 펠렛을 동일한 완충액 1.0 ml에 혼합하고 French press로 균질화하였다. 불용성 세포 분획으로부터 4℃에서 30분 동안 12,000rpm으로 원심분리하여 용해성 단백질 분획을 분리하였다. 마지막으로 12% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 상기 얻어진 단백질을 조사하였다.
(5). 산화환원(Redox) 파트너의 발현
CYP125A13의 전자 수송 시스템을 조사하기 위해, 푸티다레독신(PDX)의 과발현 및 푸티다레독신 환원효소(PDR)는 다음과 같이 수행하였다. Pdx 및 PdR은 다음과 같은 pET28a(+) 및 pET32a(+)에 연결되었다.
제한 효소 NdeI 및 XhoI을 사용하여 pETDuet-P450cam/Pdx 플라스미드의 Pdx를 절단시켜 이전에 선형화된 pET28a(+)에 연결시켰다. 유사하게, 제한 효소 NcoI 및 XhoI를 사용하여 pACYDuet-PdR 벡터로부터 PdR을 절단시켜 pET32a(+) 벡터에 연결시켰다. 생성된 DNA 구축물 pET28a-Pdx 및 pET32a(+)-PdR은 N-말단 6xHis-Tagged Pdx 및 PdR을 인코딩하였다.
상기 DNA 구축물을 수용성 클로닝 및 발현 숙주로 형질전환시켜, 항생제가 첨가된 LB-agar 상에서 스크리닝하였다. 상기 DNA 구축물을 보유하는 E. coli BL21에 의한 재조합 Pdx 및 PdR의 발현을 위하여, 상기 언급된 CYP125A13의 발현과 유사한 절차를 수행하였다.
(6) CO 환원 분석
CYP125A13의 CO 환원 분석은 정의된 프로토콜에 따라 수행되었다. 10% 글리세롤을 포함하는 인산칼륨 완충액(50mM)에 상기 단백질을 희석하였다. 소량의 나트륨 디티오나이트를 첨가하고 용액을 두 개의 큐벳으로 나누었다. 하나의 큐벳은 참조용으로 사용되었고 다른 하나는 초당 한 개의 기포 속도로 60-70 CO 기포로 포화시켰다.
그런 다음 상기 용액을 Shimadzu 1601PC 분광 광도계를 사용하여 실온에서 400 및 500 nm로 스캔하였다. CYP 농도는 91mm-1cm-1의 소광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 450nm와 490nm에서 흡광도의 차이로 계산됩니다.
(7) 전자 상자성 공명(EPR) 측정
CYP125A13 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트럼을 기록하기 위하여, 5K의 기본 온도를 달성하는 데 사용된 헬륨 저온 유지 장치 ESR 900의 연속 공급 및 ITC 4 온도 컨트롤러가 구비된 Bruker X-band 분광계(9.5GHz)가 사용되었다.
사용된 마이크로파 주파수 및 변조 주파수는 각각 9.647GHz와 100kHz이었다. 한국기초과학연구원 서울서부센터에서 데이터를 기록하고 분석하였다.
측정 전 180μM CYP12A13의 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.4)에서 산화된 형태는 EPR 석영 튜브(Wilmad)의 액체 질소에서 동결시켰다. 헴 중심의 g-텐서 및 선 너비를 포함하는 스펙트럼 데이터는 Simfonia 또는 Xsophe(Bruker) 프로그램에서의 스펙트럼 누적에 의해 획득되었다.
(8) 기질 결합 분석
기질 결합 분석(substrate-binding assay)은 1μM 효소와 함께 0.1mM의 EDTA 및 포화될 때까지 농도가 증가하는 기질을 포함하는 pH 7.4의 50mM 인산칼륨 완충액에서 수행되었다.
5mM 스테로이드의 저장 용액은 10%(w/v) β-메틸 사이클로덱스트린(BMCD)이 포함된 완충액에서 제조되었으며, 모든 흡광도 스펙트럼은 Biochrome Libra S35PC UV/Visible Spectrophotometer(England)를 사용하여 시료를 측정하였다. 스펙트럼 차이는 350에서 500 nm까지 기록되었다. 적정 데이터 포인트는 KD 값: Aobs = Amax(([S]+[Et]+KD)-(([S]+[Et]+KD)2-(4[S][Et]])0.5)/2[Et]을 결정하는 GraphPad Prism 7.0(GraphPad 소프트웨어, 미국)을 사용하여 2차 방정식에 맞춰졌다. 상기 방정식에서 Aobs는 리간드의 어떤 농도에서 관찰된 흡수 이동이고, Amax는 포화 상태에서 관찰된 최대 흡수 이동이며, KD는 겉보기 해리 상수, [Et]는 사용된 효소의 농도이고; [S]는 기질 농도이다.
(9) 카이네틱 분석
카이네틱 연구는 5 ~ 350μM 범위의 기질 농도를 사용한 50mM 인산나트륨 완충액에 1 μm CYP125A13, 10 μM PDX, 1 μM PDR, 100ng 카탈라제, 500μM NADH 및 500 μM NADH로 이루어진 반응 시스템으로 수행되었다.
기질 농도에 대한 생성물 형성 속도를 플롯팅하고, Km 및 kcat 효소의 카이네틱 매개변수는 비선형 회귀를 사용하여 GraphPad Prism과 함께 Michaelis-Menten 방정식을 사용하여 계산되었다.
(10) CYP125A13에 의한 27-하이드록시콜레스테롤에 대한 콜레스테롤의 인비트로 분석
CYP125A13의 활성은 C-27 스테로이드를 기질로 사용하여 결정되었다. 반응 혼합물은 1μm CYP125A13, 1μM PDR, 10μM PDX, 10U 포름산염 탈수소효소, 150mM 포름산나트륨, 100ng 카탈라아제, 10mM MgCl2, 및 50mM 인산나트륨 완충액에 150μM 기질로 이루어져 있었다. 250μM NADH의 첨가에 의해 반응이 시작되었다.
30℃에서 2.5시간 동안 배양 후, 반응물을 100mM Tris 완충액으로 ??칭하고, 2배 부피의 디에틸 에테르로 추출하였다. 상기 디에틸 에테르 추출물을 질소 기체 하에서 건조시키고, BSTFA(1% TMCS) 및 피리딘으로 유도체화한 후, 가스 크로마토그래피-질량 분광법(GC-MS)으로 분석하였다.
(11) 상동성 모델링 및 도킹 연구
콜레스트-4-엔-3-온 기질을 갖는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로부터의 CYP125 결정 구조(PDB ID: 2X5W, 1.58 Å 및 CYP125A13과의 55.96% 서열 동일성)을 주형으로 선택하였다. Modeller 9.9.2를 사용하여 CYP125A13의 3차원(3D) 모델을 생성시켰다. 상동성 검증 모델은 Ramachandran 플롯과 ProSA 2003 z-점수에 의해 수행되었다.
분자 도킹은 AutoDock Vina-1.1.2 사용하여 완성하였다. 단백질 및 리간드의 PDBQT 파일 및 그리드 상자 생성을 위하여 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램인 AutoDock Tools 1.5.6이 사용되었다.
1 Å 간격의 24.5 Å × 24.5 Å × 24.5 Å의 격자 상자가 전체 리간드 분자를 덮는 그리드 맵을 준비하는 데 사용되었다. 다른 모든 매개변수는 기본값(default value)으로 설정하였다. 도킹된 단백질과 리간드의 시각화는 PyMOL을 사용하여 수행하였다.
2. 결과 및 논의
(1) CYP125A13의 계통수 및 서열 정렬(Sequence Alignment)
다양한 박테리아 균주 사이에서 CYP125 서브패밀리 모노옥시게나제의 유사성을 찾기 위하여, 계통 발생 헴 도메인의 관계를 조사하였다. 계통수는 CYP125A13이 다른 Streptomyces 종과 클러스트되어 있음을 보여주었다(도 2). CYP125 서브패밀리 내의 서열 상관관계는 별개이지만, S. peucetius는 CYP125A1과 유사한(55.96% 서열 동일성) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. CYP125A13에 의해 암호화된 것과 동일한 단백질을 찾기 위해 BLAST가 적용되었다.
헴 도메인과 CYP125A 계열의 다른 member의 비교는 서열 동일성과 유사성을 보였다. 헴 도메인 서열 정렬은 extremities가 제대로 보존되지 않았음을 보여주었으며, 효소 활성 및 기질 결합을 위한 중요한 영역에서 보다 높은 서열 동일성이 관찰되었다.
단백질 서열의 상동체를 찾기 위하여, PSI-BLAST 검색(NCBI 서버)을 수행하였다. 다수의 CYP125A13의 서열 보존 및 시그니처 모티프를 확인하기 위해 서열 정렬을 수행하였다.
CYP125A13의 보존된 서열, 퍼센트 서열 동일성 및 사슬 길이를 다른 CYPs와 비교하였다. CYP125A13의 다양한 시그니처 모티프(signature motif)가 보존되었다. CYP125A13의 시그니처 모티프는 산소 결합 모티프, EXXR(EIVR) 모티프 및 CYP 서브패밀리 FxxGxHxCxG(FGGGPHFCLG)의 특징적인 시그니처 헴 결합 모티프 (도 3). 시그니처 모티프는 헴 철(Fe)에 결찰된 보존된 시스테인 잔기를 보여주었다.
단백질에 영구적으로 결합된 헴은 2가 철(Fe)에 결합할 수 있는 리간드를 결합하는 데 도움이 된다. 결합된 분자는 P450의 기능을 조절할 수 있습니다. 기질 결합 포켓의 CYP125A13는 또한 콜레스테롤 대사에 관련된 다양한 패밀리에 속하는 진핵생물 CYP와 주요 아미노산 잔기를 공유하며, CYP125A13의 기질로서 스테롤을 제안한다.
Rhodococcud jostii RHA1에서 스테롤 측쇄의 C-26 하이드록실화에 대한 유사한 관찰이 Rosloniec et al.(Mol. Microbiol. 2009. 74: 1031-1043)에 의해 보고되었다.
(2) 클로닝, CYP125A13의 과발현 및 CO 환원 분석
E. coli BL21(DE3) 세포는 이종적으로 과발현된 CYP125A13의 더 나은 수율을 보여주었다. CYP125A13(레인 1, 46.6kDa), PDR(레인 2, 58kDa) 및 PDX(레인 3, 10kDa)를 SDS-PAGE로 분리하여 분석하였다(도 4a).
이종 발현된 CYP125A13에서 얻은 세포질 분획은 UV-Vis 분광법에 의한 P450 효소의 특징적인 스펙트럼 특성을 나타내었다. CYP125A13의 주요 Soret 밴드는 LS 상태에서 단백질-헴 복합체의 존재를 나타내는 420 nm에서 최대의 피크를 보였다. 일산화탄소의 결합 형태의 스펙트럼은 450 nm에서 최대값을 갖는 전형적인 피크를 나타내었는데(도 4b), 이는 P450s의 천연 FeII-CO 복합체를 의미한다.
(3) CYP125A13의 EPR 스펙트로스코피
천연 CYP125A13에 대한 EPR 스펙트럼은 산화된 형태로 수집되어 CYP125A13의 조정된 헴을 특성화하였다. 도 5a는 산화된 형태의 EPR 스펙트럼의 X-밴드를 보여주는데, 특징적인 P450 마름모꼴 스펙트럼이 관찰되었다.
철(Fe)은 EPR 분광법에서 시토크롬 P450과 같은 금속 단백질의 휴지 또는 중간 반응성 종에서 짝을 이루지 않거나 홀수인 전자의 존재에 의해 밝혀졌는데, 이는 모든 금속이 특정한 핵 스핀을 가지고 있기 때문이다. EPR 신호는 환원되거나 산화된 형태 또는 두 형태 모두를 검출할 수 있고, 효소에 존재하는 금속 이온의 유형에 대한 단서를 제공한다.
유사하게, g-값은 단백질이 고스핀 상태에 있는지 여부를 나타낸다. 리간드가 없는 CYP125A13 LS 티올레이트-배위 P450 단백질과 일치하는 gz = 2.416/2.41, gy = 2.25 및 gx = 1.93의 g 값을 가지고, B. megaterium(gz, gy 및 gx에 대해 각각 2.42, 2.26 및 1.92) 및 클래스 I 시토크롬 P450 마이코박테리움 결핵 콜레스테롤 27-수산화효소 CYP125(gz, gy 및 gx에 대해 각각 2.40, 2.25 및 1.94)로부터 잘 연구된 클래스 III CYP102A1의 헴 도메인에 대해 이미 보고된 스펙트럼과 비교할 수 있다.
3개의 주요 피크의 존재는 ½(2I + 1)의 핵 스핀 상태를 나타낸다. 최종 gz, gy 및 gx 값은 전형적인 저스핀 철(Fe III) 헴을 나타낸다(도 5a).
(4) CYP125A13 기질 결합 분석, 인비트로 활성 분석 및 정상 상태 스테롤 카이네틱
CYP125A13은 UV-Vis 흡수 스펙트로스코피에서 P450 효소의 스펙트럼 특성을 나타내었다. CYP125A13은 대부분의 헴 철(heme iron)이 390 nm에서 Soret 밴드가 있는 고스핀 상태를 차지하는 철(III) 형태의 스펙트럼 특성을 나타내었다.
활성 P450 부위에 대한 기질 결합은 일반적으로 물 분자가 헴 철에 대해 변위될 때 Soret 밴드의 유형 I 이동을 초래한다. 4-콜레스텐 3-온(4-cholesten-3-one)과 에탄올에서 제조된 콜레스테롤 모두 CYP의 도입과 함께 현저한 유형 1의 스펙트럼 변화를 초래하였다.
소수성 스테롤의 용해도를 증가시키기 위하여, 15%(w/v) β-메틸 사이클로덱스트린(MBCD)을 사용하였다. 10% (w/v) MBCD에서 콜레스테롤과 4-콜레스텐 3-온의 저장 용액을 제조하였다. CYP125A13으로의 콜레스테롤로과 4-콜레스텐 3-온의 첨가로 고스핀 형태로 거의 완전한 전환을 보였다.
C27-스테로이드에 대한 KD 값은 스펙트럼 적정 곡선에서 얻었다(도 5b). 적정 플롯을 긴밀한 결합 이차 방정식(tight binding quadratic equation)에 맞추어 59.23 ± 3.9 및 56.92 ± 11.28 μM의 4-콜레스테논-3-온 및 콜레스테롤 각각의 KD 값을 얻었다.
Capyk et al.은 Cyp125 촉매의 콜레스테롤 C27-스테로이드의 말단 수산화를 위하여, 4-콜레스테논-3-온 및 콜레스테롤에 대한 KD 값을 각각 0.27 ± 0.05 μM 및 0.20 ± 0.02 μM 보고하였다.
유사하게, Rosłoniec et al.은 4-콜레스테논-3-온의 KD 값이 0.20 ± 0.03μM이고, Rhodococcus jostii의 C26-하이드록실화를 위한 콜레스테롤의 KD 값을 0.20 ± 0.08μM으로 보고하였다. 이러한 KD 값은 계산된 값에 비해 매우 낮으며, 이는 기질에 대한 효소의 결합 친화도가 더 약함을 시사한다.
도 5c는 기질이 없을 때 NADH 산화의 배경 속도를 고려하면, 콜레스테롤의 경우 11.3 ± 2.8μM의 겉보기 Km 및 Vmax 27.9 ± 1.5 min-1과 함께, 1:10:3 비율의 P450:PDX:PDR로 구성된 반응 혼합물에서 콜레스테롤 농도에 대한 NADH 산화율의 쌍곡선 의존성을 보여 준다.
보조 단백질 및 NADH 재생 시스템으로 이종 전자 공여 파트너 PDX 및 PDR을 사용하여 인비트로 효소 분석을 수행하였다. CYP125A13과 2.5시간 배양 후 콜레스테롤 산화는 GC 크로마토그램에서 새로운 피크를 표시하였다(도 6a). 546(-CH2OH)의 m/z 값은 콜레스테롤이 하이드록실화 생성물로 전환되었음을 시사하였다(도 6b 및 6c). 질량 스펙트럼에서 m/z 456, m/z 417 및 m/ 73의 존재는 화합물이 27-하이드록시콜레스테롤임을 확인시켜 주었다. 27-히드록시콜레스테롤의 유사한 m/z값이 McLean et al.에 의해 보고되었다.
생성물의 확인은 질량 값이 GC 질량 데이터 뱅크(The Wiley/NBS Registry of Mass Spectral Data 7판)에서 트리메틸실릴(TMS) 유도체화된 27-하이드록시콜레스테롤 표준품과 정확히 일치한 것으로부터 이루어졌다.
50 μM의 기질 농도에서 콜레스테롤의 촉매 전환율은 1.95 nmol min-1 nmol-1 CYP인 것으로 결정되었다. 놀랍게도, 4-콜레스테논-3-온에서는 생성물 형성이 검출되지 않았다. 인간 P450 동형 CYP7A1은 이온성 트윈-20 계면활성제 첨가 후 콜레스테롤에 대한 효소 활성이 증가된 것으로 나타났다.
트윈 20을 MBCD로 대체할 때, 두 기질에 대해 활성은 관찰되지 않았다. NADH의 산화에 대한 일부 관찰에도 불구하고. 수성 완충액에서 콜레스테롤 용해도의 부족은 촉매 매개변수의 정확한 측정을 방해하였다.
(5) 상동성 모델링 및 도킹 연구
3D 단백질 모델은 Mycobacterium tuberculosis 유래의 가장 상동성인 템플릿 2X5W를 사용한 Modeller에 의해 생성되었다. 상동성 모델의 품질을 검증하기 위해 Ramachandran 플롯 및 ProSA가 활용되었다. Ramachandran 플롯에서 정제된 구조의 아미노산 잔기의 백본 이면각 ψ 및
Figure pat00001
의 분포에 의해, 95.6%가 선호 영역, 3.2%가 허용 영역, 1.2%는 이상치(outlier) 영역에 있는 것으로 나타났다.
또한 z-score 값은 -10.38로서, 다른 소스(X-선 및 NMR)에서 유사한 크기의 천연 단백질의 점수 범위 내에서, 최적화된 모델의 수용성과 신뢰성을 나타내었다.
CYP125A13의 모델링된 3D 구조는 헴 포르피린(heme porphyrin) 바로 위에 큰 주머니가 잠재적으로 C27-스테롤을 수용할 수 있음을 보여주었다(도 7의 A). 기질 결합 도메인은 기질 선호도를 설명하는 다양한 토폴로지를 보여주었다. 기질 결합 주머니는 모양과 모양이 깔때기 모양이었는데, 상기 모양은 리간드의 지방족 측쇄를 둘러싸기 위해 촉매 부위 쪽으로 좁혀졌다. 매립된 기판과 상호작용할 것으로 예상되는, 부분적으로 보존된 소수성 잔기는 내부의 공동(cacity)을 차지하였다.
CYP125A13에 대한 콜레스테롤과 4-콜레스테논-3-온의 결합 위치에 접근하는 AutoDock Vina를 사용하여 분자 도킹을 수행하였다. 두 가지 유형의 도킹 구성이 헴 중심을 향하거나 헴 중심에서 멀어지는 방향으로 향하는 알릭 C27과 함께 두 개의 스테로이드에 대해 관찰되었다.
도킹 결과, 콜레스테롤과 4-콜레스테논-3-온은 헴의 말단 표면을 향하는 말단 메틸 그룹(C27)(각각 3.1 및 4.6A의 거리에서)을 포함하는 지방족 측쇄와 함께, CYP125 활성 부위에 깊이 묻혀 있었다(도 7의 D 및 E).
이러한 콜레스테롤과 4-콜레스테논-3-온의 방향은 Val80, Ile92, Ile98, Val94, Leu100, Val201, V255, Ile251, Phe248, Val301, Phe304 및 Leu402와 같은 소수성 아미노산에 의해 안정화되었다(도 7의 B). McLean et al.은 CYP125에서 알킬 사슬이 저-고 스핀 상태 전이에 요구되는 Val267 잔기와 밀접하게 접촉하고 있다고 보고하였다.
다중 서열 정렬 및 도킹 연구에서, Val267에 해당하는 CYP125A13의 Val255가 기질과 상호 작용하는데, 이는 스핀 상태의 전이에서 중요한 역할을 할 수 있다. 또한 Johnston et al.은 피탄산(phytanic acid)에서 메틸기의 하이드록실화가 기질의 단단한 결합과 활성 부위 내의 많은 약한 상호 작용의 결과임을 보고하였다.
본 발명에서는, 활성 부위의 소수성 공동에 있는 하나의 메틸기와 함께 지방족 측쇄의 결합 외에 활성 부위의 스테롤의 테트라사이클릭 부분의 결합에 의해 하이드록실화 위치의 다른 메틸을 블로킹하여 영역 특이적 C27-하이드록실화를 수행하였다.
도킹된 모델에서 콜레스테롤의 하이드록실기와 Glu200의 카르복실기 사이에 수소 결합(2.4 Å)이 관찰되었다(도 7의 C). 물 분자를 통한 수소 결합 또는 수소 결합 네트워크를 형성하여 리간드를 안정화시킴으로써, 친수성 잔기가 C3의 케토 또는 하이드록실기를 둘러쌌다.
3. 결론
본 발명은 (i) 콜레스테롤 이화작용 및 (ii) 27-산으로의 3단계 산화 전환 또는 (ii) 단일 P450 턴오버에 의한 27-하이드록실화 생성물에서 콜레스테롤의 27-모노옥시게나제인 CYP125A13의 생화학적 특성을 제공하였다.
CYP125A13의 분자 기능 및 생리학적 역할을 특성화하기 위하여, 인비트로 분석이 사용되었다. 비교적인 상동성 모델이 구축, 정제 및 검증되었다.
상동성 모델에서 C27-스테로이드의 도킹은 C27-스테로이드의 결합에 관여하는 모든 잔기가 기질 인식 부위에 위치한다는 것을 보여주었다. 인비트로 효소 활성과 함께 결합 연구는 CYP125A13이 콜레스테롤을 하이드록실화의 기질로 활용할 수 있음을 보여주었다.
본 발명은 S. peucetius에서 콜레스테롤 분해 시작에 대한 새로운 통찰력을 제공한다. CYP125A13 연구 결과는 S. peucetius가 27-하이드록시콜레스테롤을 다른 카르복실산 유도체를 전환하는 엑스트라 C27-옥시다제 및 측쇄 분해를 담당하는 유사한 효소의 활성에 관여할 수 있다는 것을 시사한다.
이 필수 단계는 고리 핵의 분해를 시작하는 데 필요하다.
S. peucetius에서 고리를 담당하는 다른 유전자의 탐색이 진행 중이다. 콜레스테롤 하이드록실화의 이러한 중요한 초기 단계에 대한 추가 연구가 S. peucetius의 스테롤 이화작용에 대한 더 나은 이해로 이어질 것이다.

Claims (8)

  1. CYP125A13을 이용하여 스테로이드의 27번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스테로이드가 콜레스테롤 또는 4-콜레스테논-3-온(4-cholesten-3-one)인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CYP125A13은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래의 시토크롬 P450인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CYP125A13은 스트렙토마이세스 퓨세티우스(Streptomyces peucetius) 유래의 시토크롬 P450인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 스테로이드가 콜레스테롤이고, 상기 콜레스테롤에 대한 상기 CYP125A13의 KD 값은 56.5~57.5 μM이며, 상기 콜레스테롤에 대한 상기 CYP125A13의 Km 값은 11~12 μM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 스테로이드가 4-콜레스테논-3-온(4-cholesten-3-one)이고, 상기 4-콜레스테논-3-온에 대한 상기 CYP125A13의 KD 값은 59~60 μM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 생물전환 방법에 의해 얻어진 27-하이드록시콜레스테롤.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 생물전환 방법에 의해 얻어진 27-하이드록시-4-콜레스테논-3-온.
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