KR20230034357A

KR20230034357A - Glp-1r 작용제/fgf21 융합 단백질

Info

Publication number: KR20230034357A
Application number: KR1020237003788A
Authority: KR
Inventors: 마르크 소머펠트; 토마스 랑거; 올리버 보샤이넨; 우베 슈반; 베르너 디트리히; 크리스티네 루돌프; 안드레아스 에버스
Original assignee: 사노피
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2023-03-09
Also published as: JP2023540663A; EP4175660A1; CN116322739A; US20230265152A1; WO2022002408A1; CA3184546A1

Abstract

본 발명은 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 5(GLP-1R) 작용제 펩티드 및 인간 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)의 변이체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 대상체의 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료를 위한, 의약으로서의 GLP-1R 작용제 펩티드 및 FGF21의 변이체를 포함하는 융합 단백질의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 GLP-1R 작용제 펩티드 및 FGF21의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

GLP-1R 작용제/FGF21 융합 단백질

본 발명은 GLP-1R(글루카곤-유사 펩티드-1 수용체) 작용제 펩티드 및 인간 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)의 변이체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료를 위한 의약으로서의 이들 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.

융합 단백질로서 FGF21 및 GLP-1R 작용제의 사용에는 단점이 있다. FGF21의 약리학적 효과는 약리학적 효과를 나타내는 GLP-1(1차 GLP-1R 작용제)의 혈장 수준보다 더 높은 혈장 수준에서 관찰된다. 또한, 더 높은 혈장 농도에서 GLP-1은 부작용, 예를 들어 메스꺼움 및 구토를 유발하는 것으로 알려져 있다. 종합하면, 이는 융합 단백질 형태의 FGF21 화합물과 GLP-1R 작용제의 조합을 투여할 때 GLP-1-매개 부작용의 위험을 나타낸다. 따라서, FGF21과 GLP-1R 작용제를 결합한 새로운 융합 단백질 및 이의 제형이 필요하다.

본 발명의 목적은 잠재적인 부작용(예를 들어, 메스꺼움 및 구토 등)을 피하면서, (예를 들어, 체중, 지질, 혈당 조절 등의 측면에서) 두 활성제의 유익한 효과를 달성하기 위해 최적화된 GLP-1R 작용제/FGF21 화합물 활성 비율을 갖는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 GLP-1R 작용제 펩티드 및 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열에서 최대 약 15개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 천연 GLP-1(7-36)(서열번호 260)의 변이체이다.

일 실시형태에서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 250 또는 서열번호 251의 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,

(i) 치환 Q55C 및 P147C 또는 치환 Q55C 및 N149C, 및

(ii) G198 및/또는 P199의 치환 또는 결실을 포함하고,

여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 250에 따른다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드 및 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 L - Fc, Fc - L, L₁ - Fc - L₂및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 포함하는 링커 분자를 통해 연결되며, 여기서 L, L₁ 및 L₂는 단일 아미노산 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, Fc는 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체이다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 9 내지 약 531배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 9 내지 약 482배 (또는 약 9.449 내지 약 482.396배) 또는 약 9- 내지 약 319배 (또는 약 9.449 내지 약 319.311배) 또는 약 9 내지 약 121배 (또는 약 9.449 내지 약 121.189배) 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 9 내지 약 319배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 적어도 약 9.4배 또는 적어도 약 9.45배 또는 적어도 약 9.5배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 적어도 약 10배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 최대 약 482.4배 또는 최대 약 482.35배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 최대 약 482배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 10 내지 약 482배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 10 내지 약 319배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 90 내지 약 100배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 적어도 약 18배 (또는 적어도 약 18.268배) 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 18 내지 약 501배 (또는 약 18.268 내지 약 500.686배) 또는 약 18 내지 약 469배 (또는 약 18.268 내지 약 468.679배) 또는 약 18 내지 약 313배 (또는 약 18.268 내지 약 313.214배) 또는 약 18 내지 약 123배 (또는 약 18.268 내지 약 123.466배) 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 18 내지 약 313배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

상기 실시형태 중 하나에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 적어도 약 18.2배 또는 적어도 약 18.3배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

상기 실시형태 중 하나에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 적어도 약 20배 또는 적어도 약 50배 또는 적어도 약 100배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 10배 내지 약 500배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 15배 내지 약 500배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 20배 내지 약 500배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 50배 내지 약 500배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 100배 내지 약 500배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 100배 내지 약 300배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질은 상기 정의된 바와 같은 GLP-1R 작용제 활성을 가진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지며,

X₁-X₂-X₃-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X₂₂-X₂₃-X₂₄-X₂₅-L-X₂₇-X₂₈-X₂₉-X₃₀ (서열번호 4077),

[식에서,

X₁은 W, H, Y 또는 F이고,

X₂는 G, S, T 또는 A이고,

X₃은 E 또는 Q이고,

X₁₀은 K 또는 L이고,

X₁₂는 K, I 또는 Q이고,

X₁₃은 Q 또는 L이고,

X₁₄는 L, M 또는 C이고,

X₁₅는 E, A 또는 D이고,

X₁₆은 E, K 또는 S이고,

X₁₇은 E, R 또는 Q이고,

X₁₈은 L, A 또는 R이고,

X₁₉는 V, A 또는 F이고,

X₂₀은 R, H, Q, K 또는 I이고,

X₂₁은 L, E, H 또는 R이고,

X₂₂는 F 또는 L이고,

X₂₃은 I, Y 또는 F이고,

X₂₄는 E, L 또는 Y이고,

X₂₅는 W 또는 L이고,

X₂₇은 I, L, K 또는 E이고,

X₂₈은 A, K, N 또는 E이고,

X₂₉는 G, T, K 또는 V이고,

X₃₀은 G이거나, 또는 결실되며;

선택적으로, 아미노산 서열은 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 N-말단에 추가로 포함하고;

선택적으로, 아미노산 서열은 최대 약 12, 약 11 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장부를 C-말단에 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G 또는 A이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 단일 아미노산 잔기이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G이다.

일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 서열번호 4009 내지 4063으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 단일 아미노산 잔기, 예를 들어, P이다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261 내지 565로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

X₁-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-X₁₂-X₁₃-L-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-F-X₂₃-E-W-L-X₂₇-X₂₈-X₂₉-G (서열번호 4078),

[식에서,

X₁은 W, H, Y 또는 F이고,

X₁₀은 K 또는 L이고,

X₁₂는 K, I 또는 Q이고,

X₁₃은 Q 또는 L이고,

X₁₅는 E, A 또는 D이고,

X₁₆은 E, K 또는 S이고,

X₁₇은 E, R 또는 Q이고,

X₁₈은 L, A 또는 R이고,

X₁₉는 V, A 또는 F이고,

X₂₀은 R, H, Q, K 또는 I이고,

X₂₁은 L, E, H 또는 R이고,

X₂₃은 I, Y 또는 F이고,

X₂₇은 I, L, K 또는 E이고,

X₂₈은 A, K, N 또는 E이고,

X₂₉는 G, T, K 또는 V이고,

일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 서열번호 4009 내지 4063으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.

H-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-K-Q-L-E-E-E-X₁₈-V-X₂₀-L-F-I-E-W-L-K-A-X₂₉-G (서열번호 4079),

[식에서,

X₁₀은 K 또는 L이고,

X₁₈은 A 또는 R이고,

X₂₀은 R 또는 Q이고,

X₂₉는 G 또는 T이고;

선택적으로, 아미노산 서열은 최대 12, 11 또는 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장부를 C-말단에 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 상기 정의된 바와 같다. 일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 PSSGAPPPS(서열번호 4047) 또는 PKKIRYS(서열번호 4040)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261 또는 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 4064 내지 4076 및 553 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하지 않거나, 이들로 이루어지지 않는다.

일 실시형태에서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 결실된 G198R, G198K, G198Y 및 P199로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 결실을 포함한다.

일 실시형태에서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253, 254, 255 및 256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253 또는 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257, 258 및 259로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 262의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

다른 양태에서, 본 발명은 GLP-1R(글루카곤-유사 펩티드-1 수용체) 작용제 펩티드 및 인간 FGF21(섬유아세포 성장 인자 21)의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서,

여기서, GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261 내지 565로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고;

여기서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253, 254, 255 및 256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고;

여기서, GLP-1R 작용제 펩티드 및 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 L - Fc, Fc - L, L₁ - Fc - L₂및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 포함하는 링커 분자를 통해 연결되며, 여기서 L, L₁ 및 L₂는 단일 아미노산 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, Fc는 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257, 258, 및 259로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-8, 16-31, 33-229 및 566-4007로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 융합 단백질, 또는 서열번호 1-8, 16-31, 33-229 및 566-4007로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 이의 기능적으로 활성인 변이체에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1-8, 18-31, 39, 40, 42-72, 74, 76, 78-84, 88-90, 92-97, 100-102, 105-109, 112, 113, 115, 116, 118, 120-124, 126-130, 132-136, 139, 142-148, 150-153, 155-158, 161-172, 174-177, 180-188, 190, 192-209, 211, 212, 216, 217 및 219-229로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 융합 단백질, 또는 서열번호 1-8, 18-31, 39, 40, 42-72, 74, 76, 78-84, 88-90, 92-97, 100-102, 105-109, 112, 113, 115, 116, 118, 120-124, 126-130, 132-136, 139, 142-148, 150-153, 155-158, 161-172, 174-177, 180-188, 190, 192-209, 211, 212, 216, 217 및 219-229로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 이의 기능적으로 활성인 변이체에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 융합 단백질, 또는 서열번호 2, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 이의 기능적으로 활성인 변이체에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질 (또는 이의 기능적으로 활성인 변이체)은 예를 들어, 인간 GLP-1R을 안정하게 발현하는 세포의 cAMP 반응을 측정하여 결정할 때, 약 15 pmol/L 내지 약 400 pmol/L, 또는 약 20 pmol/L 내지 약 400 pmol/L, 또는 약 50 pmol/L 내지 약 400 pmol/L, 또는 약 100 pmol/L 내지 약 400 pmol/L의 EC50으로 인간 GLP-1R을 활성화한다. 일 실시형태에서, 인간 GLP-1R의 활성화는 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정된다.

일 실시형태에서, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질 (또는 이의 기능적으로 활성인 변이체)는 (i) 약 250 nmol/L 이하, 또는 약 200 nmol/L 이하, 또는 약 150 nmol/L 이하, 또는 약 100 nmol/L 이하, 또는 약 75 nmol/L 이하, 또는 약 50 nmol/L 이하의 EC50으로 (예를 들어, 약 10 nmol/L 내지 약 50 nmol/L, 또는 약 15 nmol/L 내지 약 50 nmol/L, 또는 약 15 nmol/L 내지 약 45 nmol/L의 EC50으로) 인간 FGF 수용체 1c(FGFR1c)의 자가인산화; 및/또는 (ii) 약 100 nmol/L 이하, 또는 약 75 nmol/L 이하, 또는 약 50 nmol/L 이하, 또는 약 25 nmol/L 이하, 또는 약 20 nmol/L 이하, 또는 약 15 nmol/L 이하의 EC50으로 (예를 들어, 약 2.5 nmol/L 내지 약 15 nmol/L, 또는 약 4 nmol/L 내지 약 12 nmol/L의 EC50으로) 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도한다. 일 실시형태에서, 인간 FGFR1c의 자가인산화 및/또는 MAPK ERK1/2의 인산화는 예를 들어, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 세포내 웨스턴(ICW)을 사용하여 결정된다.

일 실시형태에서, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질 (또는 이의 기능적으로 활성인 변이체)는 적어도 약 45℃ 또는 적어도 약 50℃ 또는 적어도 약 55℃ 또는 적어도 약 60℃의 용융 온도 및/또는 응집 온도를 갖는다. 일 실시형태에서, 용융 온도 및/또는 응집 온도는 본질적으로 실시예 5에 기재된 바와 같이 결정된다.

일 실시형태에서, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질 (또는 이의 기능적으로 활성인 변이체)는 적어도 약 15시간 또는 적어도 약 20시간의 비-인간 영장류에서의 말기 혈장 반감기를 갖는다. 일 실시형태에서, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질 (또는 이의 기능적으로 활성인 변이체)는 적어도 약 8시간 또는 적어도 약 10시간 또는 적어도 약 12시간의 마우스에서의 말기 혈장 반감기를 갖는다. 일 실시형태에서, 말기 반감기는 용액 중의 약 0.3 mg/kg의 융합 단백질을 비인간 영장류, 예를 들어 사이노몰구스 원숭이, 또는 마우스, 예를 들어 C57BI/6 마우스에 단일 피하 투여한 후에 결정된다. 일 실시형태에서, 말기 반감기는 본질적으로 실시예 6에 기재된 방법에 의해 결정된다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, NASH 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 진성 당뇨병이다. 일 실시형태에서, 진성 당뇨병은 1형 진성 당뇨병 또는 2형 진성 당뇨병이다.

다른 양태에서, 본 발명은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, NASH 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, NASH 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이며, 본 방법은 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 2형 진성 당뇨병을 갖는 과체중 내지 비만 이상지질혈증 환자의 혈당 조절을 개선하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.

도 1은 GLP-1 감쇠 계수에 따른 부작용(위 배출(GE)률) 및 약력학적 효과(즉, HbA1c, 트리글리세리드, 지방산, 비-HDL, 지방량)의 EC50을 나타내는 그래프이다(12-개월 시뮬레이션):
· 9.449(9로 반올림 가능)보다 큰 GLP-1 감쇠 계수의 경우, GLP-1-매개 위장 부작용(위 배출; GE-률)의 EC50은 약력학적 효과(즉, HbA1c, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드)의 EC50보다 컸으며;
· 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 FGF21- (지질) 및 GLP-1-매개 효과(HbA1c)의 확산에 의해 정상화된 부작용 (GE률) 사이의 최대 거리는 121.189였으며; 즉 121.189(121로 반올림 가능)에서, GLP-1-매개 효과(HbA1c)와 평균 FGF21-매개 효과(즉, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드) 사이의 최소 거리에서 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리가 있으며(도 2 참조);
· 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 319.311(319로 반올림 가능)였고;
· 평균 약력학적 효과(즉, HbA1c, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 482.396(도 2 참조; 482로 반올림 가능)이었고;
· 531.0에서 위 배출률의 최대였다;
(모두: 수직선).
도 2는 GLP-1 감쇠 계수에 따른 위 배출(GE)률 및 평균 약력학적 효과(즉, HbA1c, 트리글리세리드, 지방산, 비-HDL, 지방량)의 EC50을 나타내는 그래프이다(12-개월 시뮬레이션):
· 평균 약력학적 효과(즉, HbA1c, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 482.396(오른쪽 수직선; 482로 반올림 가능)이었고;
· 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 FGF21- (지질) 및 GLP-1-매개 효과(HbA1c)의 확산에 의해 정상화된 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 121.189였다(왼쪽 수직전; 121로 반올림 가능). 곡선 "(최대-GE률)/범위"는 HbA1c와 GE률 사이의 최대 거리와 HbA1c와 평균 FGF21-매개 효과(즉, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드) 사이의 최소 거리 사이의 비율을 나타낸다. "(최대-GE률)/범위" 곡선의 최소 값(즉 121.189)에서, GLP-1-매개 효과(HbA1c)와 FGF21-매개 효과(즉, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드) 사이의 최소 거리에서 약력학 효과(HbA1c)의 최대와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리가 있다.
도 3은 GLP-1 감쇠 계수에 따른 부작용(위 배출(GE)률) 및 약력학적 효과(HbA1c, 트리글리세리드, 지방산, 비-HDL, 지방량)의 EC50을 나타내는 그래프이다(3-개월 시뮬레이션):
· 18.268(18로 반올림 가능)보다 큰 GLP-1 감쇠 계수의 경우, GLP-1-매개 위장 부작용(위 배출; GE-률)의 EC50은 약력학적 효과(즉, HbA1c, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드)의 EC50보다 컸으며;
· 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 FGF21- (지질) 및 GLP-1-매개 효과(HbA1c)의 확산에 의해 정상화된 부작용 (GE률) 사이의 최대 거리는 123.466였으며; 즉 123.466(123으로 반올림 가능)에서, GLP-1-매개 효과(HbA1c)와 평균 FGF21-매개 효과(즉, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드) 사이의 최소 거리에서 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리가 있으며(도 4 참조);
· 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 313.214(313로 반올림 가능)였고;
· 평균 약력학적 효과(즉, HbA1c, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 468.679(도 4 참조; 469로 반올림 가능)이었고;
· 500.686(501로 반올림 가능)에서 위 배출률의 최대였다
(모두: 수직선).
도 4는 GLP-1 감쇠 계수에 따른 위 배출(GE)률 및 평균 약력학적 효과(즉, HbA1c, 트리글리세리드, 지방산, 비-HDL, 지방량)의 EC50을 나타내는 그래프이다(3-개월 시뮬레이션):
· 평균 약력학적 효과(즉, HbA1c, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드)와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 468.679(오른쪽 수직선; 469로 반올림 가능)이었고;
· 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 FGF21- (지질) 및 GLP-1-매개 효과(HbA1c)의 확산에 의해 정상화된 부작용(GE률) 사이의 최대 거리는 123.466였다(왼쪽 수직전; 123으로 반올림 가능). 곡선 "(최대-GE률)/범위"는 HbA1c와 GE률 사이의 최대 거리와 HbA1c와 평균 FGF21-매개 효과(즉, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드) 사이의 최소 거리 사이의 비율을 나타낸다. "(최대-GE률)/범위" 곡선의 최소 값(즉 123.466)에서, GLP-1-매개 효과(HbA1c)와 FGF21-매개 효과(즉, 지방량, 비-HDL, 지방산, 트리글리세리드) 사이의 최소 거리에서 약력학 효과(HbA1c)의 최대와 부작용(GE률) 사이의 최대 거리가 있다.
도 5(A 및 B)는 CHO 세포에서 인간 FGF21 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 검정(세포내 웨스턴, ICW)의 결과를 나타내는 그래프이다. pFGFR은 (A)에 도시되어 있고, pERK는 (B)에 도시되어 있다.
도 6(A 내지 D)은 상이한 GLP-1R 작용제에 대한 HEK-293 세포에서의 인간 글루카곤-유사-펩티드 1(GLP-1) 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 검정의 결과를 나타내는 그래프이다. 서열번호 2는 (A)에 도시되어 있고, 서열번호 7은 (B)에 도시되어 있고, 서열번호 8은 (C)에 도시되어 있고, 서열번호 2, 7, 및 8은 (D)에 도시되어 있다.
도 7(A 내지 F)은 3개의 상이한 생체분석 방법을 사용하여 암컷 C57Bl/6 마우스 또는 수컷 사이노몰구스 원숭이에게 0.3 mg/kg 용액의 단일 피하 투여 후 GLP-1R 작용제/FGF21 Fc 융합 단백질의 혈장 농도를 나타내는 그래프이다. (A)는 마우스에서의 서열번호 2를 도시하고, (B)는 원숭이에서의 서열번호 2를 도시하고, (C)는 마우스에서의 서열번호 7을 도시하고, (D)는 원숭이에서의 서열번호 7을 도시하고, (E)는 마우스에서의 서열번호 8을 도시하고, (F)는 원숭이에서의 서열번호 8을 도시한다.
도 8은 온전한 전장 융합 단백질의 정량화를 위한 생체분석 방법을 사용하여 암컷 C57Bl/6 마우스에 0.3 mg/kg 용액을 단회 피하 투여한 후 GLP-1R 작용제/FGF21 Fc 융합 단백질 및 G-FGF21(서열번호 252)의 혈장 농도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 28일 동안 매주 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군을 1회 투여한 암컷 식이-유도 비만(DIO) 마우스의 체중 발달을 나타내는 그래프이다.
도 10은 28일 동안 매주 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군을 1회 투여한 암컷 DIO 마우스의 누적 음식 섭취량의 발달을 나타내는 그래프이다.
도 11(A 및 B)는 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군으로 1일차(A)에 시작하는 1차 처리 후 또는 22일차(B)에 시작하는 4차 처리 후 db/db 마우스의 24시간 혈당 프로필을 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM을 의미하고; n=8/그룹이다.
도 12는 36일 동안 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군을 매주 1회 투여한 암컷 db/db 마우스의 혈장 HbA1c 함량을 나타내는 그래프이다.
도 13(A 및 B)은 8주 동안 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군을 매주 1회 투여한 후 DIO NASH 마우스에서의 간 중량 및 지질 함량의 발달을 나타내는 그래프이다. (A)는 간 중량 및 지질 수준을 나타내고, (B)는 간 콜레스테롤 및 간 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
도 14는 8주 동안 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군을 매주 1회 투여한 후 DIO NASH 마우스에서의 섬유증 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 활성 점수의 발생 발달을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 15는 8주 동안 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 및 대조군을 매주 1회 투여한 후 DIO NASH 마우스에서의 섬유증 및 NAFLD 활성 점수가 더 높거나, 같거나, 더 낮은 동물의 수를 나타내는 그래프를 도시한다.

본 발명이 하기에 상세히 기술되어 있지만, 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약이 달라질 수 있으므로, 본 발명이 이들에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 특정 실시형태를 기술하기 위한 목적으로만 사용되고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다는 것이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

하기에서, 본 발명의 특정 요소가 기술될 것이다. 이러한 요소들은 특정 실시형태들과 함께 열거될 수 있지만, 이들은 임의의 방식으로, 그리고 임의의 수로 조합되어서 추가의 실시형태들을 생성할 수 있음이 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 예시적인 실시형태는 본 발명을 단지 명백하게 기술된 실시형태에 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 명시적으로 기술된 실시형태를 임의의 수의 개시된 요소 및/또는 예시적인 요소와 조합시킨 실시형태를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 본 출원에 기술된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.

본원에 사용되는 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kφlbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기술된 바와 같이 정의된다.

본 발명의 실행에서는, 달리 표시되지 않는 한, 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학의 통상적인 방법, 및 재조합 DNA 기술(이는 본 분야의 문헌에 설명되어 있음(문헌[Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny]))을 사용할 것이다.

맥락이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 하기의 청구범위 전체에 걸쳐 용어 "포함하다" 및 변이형, 예컨대 "포함하는" 및 "포함하고 있는"은 진술된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 포함을 암시하며, 일부 실시형태에서 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군이 배제될 수도 있지만 그러한 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 배제를 암시하는 것은 아니며, 즉, 요지는 진술된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군을 포함하는 것에 있음이 이해될 것이다. 본 발명을 기술하는 맥락에서 (특히, 하기 청구범위의 맥락에서) 단수형 용어 및 유사한 언급(reference)은 본원에서 달리 표시되지 않거나 맥락에 의해 명확하게 반박되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값들의 범위들의 나열은 그 범위 내에 있는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기법으로서의 역할을 하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 이것이 본원에 개별적으로 나열되는 것처럼 본 명세서 내에 포함된다. 본원에 개시된 모든 방법은, 본원에서 달리 표시되지 않거나 맥락에 의해 달리 명확하게 반박되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된, 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은)의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하고자 하는 것이며, 청구된 본 발명의 범위에 대한 제한을 제기하는 것이 아니다. 본 명세서에서의 언어는 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 여러 문헌이 인용된다. 각각의 본원에 인용된 문서 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업자의 사양, 설명서 등을 포함함)는, 상기 문헌이든지, 하기 문헌이든지 간에, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

용어 "융합 단백질"은 일반적으로, 2가지 이상의 특유한 단백질(예를 들어, 단백질 및/또는 펩티드)를 연결함으로써, 특히 공유적으로 연결함으로써 생성된 단백질을 나타내며, 이는 원래의 단백질 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 분자를 생성한다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질은 GLP-1R 작용제 활성 및 FGF21 활성을 나타낸다. 융합 단백질은 유전자 융합에 의해 (예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해), 또는 화학적 및/또는 효소적 콘쥬게이션에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질에서, 융합 단백질의 성분들은 (N-말단에서 C-말단까지) A - B - C 또는 C - B - A의 순서로 배열될 수 있으며, 여기서 A는 GLP-1R 작용제 펩티드이고, B는 링커 분자이고, C는 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "GLP-1R 작용제 펩티드"는 (1차 GLP-1R 작용제로서) GLP-1과 같은 GLP-1 수용체에 결합하여 이를 활성화시키는 펩티드를 지칭한다. GLP-1R 작용제 펩티드는 또한 본원에서 간단히 "GLP-1R 작용제"로 지칭될 수 있다.

용어 "펩티드"는 일반적으로, 예를 들어 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 약 2개 이상, 또는 약 3개 이상, 또는 약 4개 이상, 또는 약 6개 이상, 또는 약 8개 이상, 또는 약 9개 이상, 또는 약 10개 이상, 또는 약 13개 이상, 또는 약 16개 이상, 또는 약 21개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 펩티드는 예를 들어, 최대 약 100개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 큰 펩티드를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "폴리펩티드"는 약 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

일 실시형태에서, GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 변이체이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 GLP-1(7-36)"은 서열번호 260의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 지칭하며, 임의로 C-말단에 아미드기를 포함한다.

일반적으로, 천연 GLP-1(7-36)의 변이체는 천연 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열 내/에 대한 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 치환을 기반으로 할 수 있다.

일 실시형태에서, 변이체는 천연 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열(서열번호 260)에서의 아미노산 잔기의 최대 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개 또는 약 5개의 치환을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체(이들은 구조가 D 및 L 입체이성체 형태를 허용할 경우 모두 D 및 L 입체이성체로 존재함)를 지칭한다. 아미노산은 본원에서, 명칭, 당업계에 알려진 세 글자 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장하는 한 글자 기호로 지칭된다.

아미노산과 관련하여 사용될 때, 용어 "천연 발생"은 20가지의 통상적인 아미노산(즉, 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 리신(Lys 또는 K), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라긴(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Gln 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Val 또는 V), 트립토판(Trp 또는 W), 및 티로신(Tyr 또는 Y))과, 셀레노시스테인, 피롤리신(PYL), 및 피롤린-카르복시리신(PCL)을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "비천연 아미노산"은 임의의 유기체의 유전자 코드에서 천연적으로 암호화되지 않거나 발견되지 않는 아미노산을 지칭하는 의미이다. 이러한 아미노산은 예를 들어 순전히 합성인 화합물일 수 있다. 비천연 아미노산의 예는 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트, O-포스포세린, 아제티딘카복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노카프로, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3차-부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프탈라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, D-오르니틴, D-아르기닌, p-아미노페닐알라닌, 펜틸글리신, 피페콜산, 및 티오프롤린을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산 유사체"는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 아미노산 유사체는 가역적 또는 비가역적으로, 화학적으로 차단되거나, 그들의 C-말단 카복시기, 그들의 N-말단 아미노기, 및/또는 그들의 측쇄 기능성 기가 화학적으로 변형된 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 이러한 유사체는 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 설폰, S-(카복시메틸)-시스테인, S-(카복시메틸)-시스테인 설폭사이드, S-(카복시메틸)-시스테인 설폰, 아스파트산-(베타메틸에스테르), N-에틸글리신, 알라닌 카복사미드, 호모세린, 노르류신, 및 메티오닌 메틸 설포늄을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반 화학 구조와는 상이하지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 갖는 화학 화합물을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 변이체는 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 단일 아미노산 잔기이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는: 프롤린을 제외한 천연 발생 아미노산; 비천연 아미노산; 아미노산 유사체; 및 아미노산 모방체로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G, A, N 및 C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G 또는 A이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기는 G이다.

일부 실시형태에서, 변이체는 C-말단에 펩티드 연장부를 포함한다. 펩티드 연장부는 예를 들어, 약 12개, 약 11개, 약 10개 또는 약 9개 아미노산 잔기(예를 들어, 약 7개, 약 8개 또는 약 9개 아미노산 잔기)로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 서열번호 4009 내지 4063으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 펩티드 연장부는 단일 아미노산 잔기, 예를 들어, P이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질의 GLP-1R 작용제 펩티드 성분은 본원에 정의된 바와 같은 천연 GLP-1(7-36)의 것과 비교하여 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 나타낸다. 표현 "융합 단백질의 일부로서 GLP-1R 작용제 펩티드"는 GLP-1R 작용제 펩티드가 융합 단백질의 성분이고 반드시 단리된 형태로 있지 않은 경우 (즉, 융합 단백질의 성분이 아닌 경우) 상기 감소된 GLP-1R 작용제 활성이 나타나는 것을 의미한다.

일 실시형태에서, 용어 "GLP-1R 작용제 활성" (또는 "GLP-1R 작용제 효능")은 본원에 사용되는 바와 같이, GLP-1 수용체의 활성화를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어는 시험관내 작용제 활성/효능을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어는 생체내 작용제 활성/효능을 지칭한다. 일 실시형태에서, GLP-1 수용체의 활성화는 시험관내에서 작용제와 접촉시 GLP-1 수용체를 안정하게 발현하는 세포의 cAMP 반응을 측정함으로써 결정된다. 일 실시형태에서, 세포는 HEK-293 세포주로부터 유래한다. 일 실시형태에서, GLP-1 수용체는 인간 GLP-1 수용체이다. 일 실시형태에서, GLP-1 수용체의 활성화는 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정된다. 일 실시형태에서, 활성/효능은 EC50 값을 결정함으로써 정량화된다.

용어 "섬유아세포 성장 인자 21" 또는 "FGF21"은 본원에 사용되는 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 FGF21 단백질을 지칭하고, 특히 인간 FGF21을 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간 FGF21은 서열번호 250의 아미노산 서열을 갖는다(전장 인간 야생형 FGF21). 성숙 인간 야생형 FGF21, 즉, 서열번호 250(즉, 신호 서열/펩티드)의 아미노산 1 내지 28(M1 내지 A28)이 결여된 인간 야생형 FGF21은 서열번호 251로 표시된다. 추가적인 N-말단 Gly를 갖는 성숙 인간 야생형 FGF21은 서열번호 252로 표시되고, 본원에서 G-FGF21로 지칭된다.

일 실시형태에서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 250 또는 서열번호 251의 아미노산 서열과 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,

(i) 치환 Q55C 및 P147C 또는 치환 Q55C 및 N149C, 및

(ii) G198 및/또는 P199의 치환 또는 결실을 포함하고,

여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 250에 따른다.

서열번호 250의 Q55C는 서열번호 251의 Q27C에 상응하고; 서열번호 250의 P147C는 서열번호 251의 P119C에 상응하고; 서열번호 250의 N149C는 서열번호 251의 N121C에 상응하고; 서열번호 250의 G198는 서열번호 251의 G170에 상응하고; 서열번호 250의 P199는 서열번호 251의 P171에 상응한다.

두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은 수동으로 생성되는 것 외에, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이러한 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 의해 생성될 수 있다.

FGF21(예를 들어, 인간 FGF21)과 관련하여 사용될 때 용어 "기능적으로 활성인 변이체"는 FGF21 활성을 갖는 단백질을 지칭한다.

일 실시형태에서, 용어 "FGF21 활성" (또는 "FGF21 효능")은 본원에 사용되는 바와 같이, FGF21 수용체 (FGFR, 예를 들어, FGFR1c)의 활성화를 지칭한다. 일 실시형태에서, FGF21 수용체는 인간 FGF21 수용체이다. 일 실시형태에서, 용어는 시험관내 활성/효능을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어는 생체내 활성/효능을 지칭한다. 일 실시형태에서, FGF21 수용체의 활성화는 FGF21 수용체 자가인산화 및/또는 시험관내에서 FGF21 화합물과 접촉시 MAPK ERK1/2의 인산화를 측정함으로써 결정된다. 일 실시형태에서, 인간 FGFR1c의 자가인산화 및/또는 MAPK ERK1/2의 인산화는 예를 들어, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 세포내 웨스턴(ICW)을 사용하여 결정된다. 일 실시형태에서, 활성 및/또는 효능은 EC50 값을 결정함으로써 정량화된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 내 웨스턴 (ICW) 분석법"은 면역세포화학적 분석법, 더 구체적으로, 정량적 면역형광 분석법 (대개 마이크로플레이트에서 (예를 들어, 96웰 또는 384웰 포맷) 수행됨)을 나타낸다. 이것은 웨스턴 블로팅의 특이성과 ELISA의 재현성 및 처리량을 조합시킨다(예를 들어, 문헌[Aguilar H.N. et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965]). 적절한 ICW 분석 시스템은 (예를 들어 미국 소재의 LI-COR Biosciences로부터) 구매가능하다. 일 실시형태에서, 항-pFGFR 및/또는 및 항-pERK는 ICW 검정에 사용된다.

일 실시형태에서, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 야생형 인간 FGF21(예를 들어, 서열번호 250 또는 251 또는 252)의 FGF21 활성과 동일하거나 실질적으로 동일한 FGF21 활성을 나타내며, 여기서 FGF21 활성은 즉 본 발명의 융합 단백질에 포함되지 않거나 임의의 다른 방식으로 변형되지 않은 경우, 인간 FGF21의 단리된 기능적으로 활성인 변이체의 FGF21 활성을 지칭한다.

용어 "실질적으로 동일한"은 FGF21(예를 들어, 인간 FGF21)과 관련하여 사용될 때, FGF21(예를 들어, 야생형 인간 FGF21(예를 들어, 서열번호 250 또는 251 또는 252))의 FGF21 활성의 50 내지 150% 또는 60 내지 140% 또는 65 내지 135% 범위에 있는 FGF21 활성을 지칭한다.

선택적으로, 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 치환(들) G141S 및/또는 P174L을 추가로 포함하고, 이는 인간 FGF21의 천연 발생 돌연변이이며, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 250에 따른다. 서열번호 250의 G141S는 서열번호 251의 G113S에 상응하고; 서열번호 250의 P174L은 서열번호 251의 P146L에 상응한다.

본 발명에 사용하기 위한 추가의 적합한 FGF21 변이체는 예를 들어 본원에 참고로 포함된 PCT/EP2016/079551에 기재되어 있다.

일 실시형태에서, Fc 도메인(Fc 영역으로도 지칭됨)은 면역글로불린 IgG1 또는 IgG4의 Fc 도메인이다. 일 실시형태에서, Fc 도메인의 변이체는 Fc 도메인의 야생형 서열과 비교하여 최대 약 6개, 약 5개 또는 약 4개의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 돌연변이는 아미노산 치환, 아미노산 부가 및 아미노산 결실, 예를 들어, N- 또는 C-말단 결실로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, Fc 도메인 또는 이의 변이체는 IgG1 Fc 영역, 예를 들어, 인간 IgG1 Fc 영역의 야생형 서열에 대해 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있거나, 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, Fc 도메인 또는 이의 변이체는 IgG4 Fc 영역, 예를 들어, 인간 IgG4 Fc 영역의 야생형 서열에 대해 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있거나, 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257, 258 및 259로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, 링커 분자 내의 펩티드(본원에서 "펩티드 링커"로도 지칭됨)는 약 2 내지 약 100개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 90개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 80개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 70개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 60개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 50개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 40개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 30개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 25개 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 약 20개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 일 실시형태에서, 펩티드 링커는 적어도 약 5개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일반적으로, 펩티드 링커는 유연성과 프로테아제 저항성을 제공하도록 설계되어 있다. 일 실시형태에서, 펩티드 링커는 글리신-세린-풍부 링커이고, 여기서, 예를 들어, 아미노산의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%는 각각 글리신 또는 세린 잔기이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 글리신 및 세린으로부터 선택되며, 즉, 펩티드 링커는 글리신 및 세린으로만 구성된다(글리신-세린 링커로도 지칭됨). 일 실시형태에서, 펩티드 링커는 C-말단에 알라닌 잔기를 추가로 포함한다. 펩티드 링커는 하나 이상의 특정 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 펩티드 링커는 서열번호 231 내지 245로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다. L1 및 L2는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, L1 및 L2는 상이하다. 일 실시형태에서, L1은 서열번호 232의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지고, L2는 서열번호 231의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 그 반대이다.

본 발명의 융합 단백질과 관련하여 사용될 때 용어 "기능적으로 활성인 변이체"는 본원에 정의된 바와 같은 범위의 GLP-1R 작용제 활성 및 FGF21 활성을 갖는 융합 단백질을 지칭한다.

일 실시형태에서, 기능적으로 활성인 변이체는 그가 유래된 융합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진다.

일 실시형태에서, 기능적으로 활성인 변이체가 유래된 융합 단백질의 아미노산 서열로부터의 아미노산 서열의 편차는 GLP-1R 작용제 활성 및/또는 FGF21 활성에 관여하지 않는 융합 단백질의 영역에서 발생하는 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가)에 독점적으로 기반한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 융합 단백질에 포함된 GLP-1R 작용제 펩티드 및/또는 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체의 아미노산 서열(들) 외부에서만 독점적으로 발생한다. 일 실시형태에서, 그것이 유래된 융합 단백질의 아미노산 서열로부터 아미노산 서열의 기능적으로 활성인 변이체의 편차는 보존적 아미노산 치환에 독점적으로 기반한다.

보존적 아미노산 치환은 아미노산을 동일한 아미노산 계열의 다른 아미노산, 즉 (예를 들어, 전하 및/또는 크기 관점에서) 측쇄 관련이 있는 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 천연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 계열: 즉 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때로는 함께 방향족 아미노산으로 분류된다.

본 발명에 따르면, "핵산 분자"는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥인 분자의 형태로 있을 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 선형이거나 공유적으로 폐쇄되어 원을 형성할 수 있다.

용어 "DNA"는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하며 선택적으로는 전적으로 또는 실질적으로 데옥시리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자를 지칭한다. "데옥시리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기가 결여된 뉴클레오티드와 관련된다. 용어 "DNA"는 부분적으로 또는 완전히 정제된 DNA, 본질적으로 순수한 DNA, 합성 DNA, 및 재조합적으로 생성된 DNA와 같은 단리된 DNA를 포함한다. 용어 "DNA"는 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 DNA와 상이한 변형된 DNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 DNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어 DNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질이 부가되는 것을 포함할 수 있다. DNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비천연 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변경된 DNA 분자는 유사체 또는 천연 발생 DNA의 유사체로 지칭될 수 있다.

용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하며 선택적으로 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자를 지칭한다. "리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드와 관련된다. 용어 "RNA"는 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA와 같은 단리된 RNA를 포함한다. 용어 "RNA"는 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 RNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질이 부가되는 것을 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비천연 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변경된 RNA 분자는 유사체 또는 천연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따르면, "RNA"는 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA를 나타낸다. 일 실시형태에서, RNA는 mRNA, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 또한 RNA는 예를 들어 RNA의 안정성(예를 들어, 반감기)을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 변형될 수 있다. 그러한 변형은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 5'-캡(cap) 또는 5'캡 유사체를 포함한다.

뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "천연 발생"은 염기 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 우라실(U)을 나타낸다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터 내에 함유/포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터(예를 들어, 람다 파지 벡터), 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터), 또는 인공 염색체 벡터(예를 들어, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 P1 인공 염색체(PAC))를 비롯하여 당업자에게 알려진 모든 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터와 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드와 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로, 목적하는 암호화 서열 및 특정 숙주 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유류) 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 적절한 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로 클로닝 벡터는 목적하는 특정 DNA 단편의 조작 및 증폭에 사용되며, 목적하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능적 서열이 결여되어 있을 수 있다.

대안적으로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 게놈, 예를 들어 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 핵산 분자를 게놈 내로 통합시키는 수단 및 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 예시적인 실시형태에서, 용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 온전한 세포, 즉 효소, 소기관, 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 온전한 막을 가진 세포와 관련된다. 특정 예시적인 실시형태에서, 온전한 세포는 생존가능 세포, 즉, 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 특정 예시적인 실시형태에서, 세포 또는 숙주 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나 형질전환될 수 있는 임의의 세포이다. 특정 예시적인 실시형태에서, 외인성 핵산으로 형질감염되거나 형질전환되어 수용자에게 이전되는 세포는 그 수용자에서 상기 핵산을 발현시킬 수 있다.

용어 "세포"는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 및 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유류 세포를 포함한다. 적합한 박테리아 세포는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus), 및 슈도모나스(Pseudomonas) 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주, 및 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스(Staphylococcus), 및 락토코커스(Lactococcus) 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주로부터 유래된 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 진균류 세포는 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora) 및 아스페르길루스(Aspergillus)의 종으로부터의 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 종(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 종(예를 들어, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 피키아(Pichia) 종(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)) 및 한세눌라(Hansenula) 종으로부터의 세포를 포함한다. 적합한 포유류 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, HEK-293 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, HEK-293 세포가 사용된다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질의 발현을 위해 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포도 또한 사용될 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 포유동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 또는 영장류로부터의 세포)는 입양 전달을 위해 사용된다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있으며, 일차 세포 및 세포주, 예컨대 면역계의 세포(예를 들어, 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포 및 T 세포, 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포) 및 기타 세포 유형을 포함할 수 있다.

항원-제시 세포는 본원에 사용되는 바와 같이, 주조직적합성 복합체의 맥락에서 항원을 표면 상에 보여주는 세포이다. T 세포는 이 복합체를 T 세포 수용체(TCR)를 이용하여 인식할 수 있다. "세포" 또는 "숙주 세포"는 단리되거나, 조직 또는 유기체, 특히 "비 인간 유기체"의 일부일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비인간 유기체"는 비인간 영장류 또는 그 밖의 동물, 예를 들어 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼와 같은 포유류 및 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 및 햄스터)를 포함하는 의미이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 모두 약제학적으로 허용가능한 하나 이상의 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 특정 예시적인 실시형태에서, 약제학적 조성물의 활성 약제의 작용과 상호작용하지 않는 비독성의 물질을 지칭한다.

용어 "담체"는 본원에 사용된 바와 같이, 활성 성분이 적용을 용이하게 하거나, 증강시키거나 가능하게 하기 위하여 조합되는 천연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 용어 "담체"는 대상체에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 봉지화 물질을 또한 포함한다.

비경구 투여용으로 적합한 담체 물질은 살균수, 링거액(Ringer’s solution), 락테이트 링거액(Lactated Ringer’s solution), 생리식염수, 정균 식염수(예를 들어, 0.9% 벤질 알코올을 함유하는 식염수), 인산염 완충 염수 (PBS), 행크 용액(Hank’s solution), 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히 생체적합성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 공중합체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는 약제학적 조성물에 존재할 수 있고 활성 성분이 아닌 모든 물질, 예컨대 염, 결합제(예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨), 충전제, 활택제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충 물질, 착향제, 또는 착색제를 포함하고자 한다.

약제학적으로 허용가능하지 않은 염이 약제학적으로 허용가능한 염의 제조에 사용될 수 있으며, 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약제학적으로 허용가능한 염은 다음의 산으로부터 제조된 것들을 비 제한적인 방식으로 포함한다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약제학적으로 허용가능한 염은 또한 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로 제조될 수 있다. 염은 약제학적 조성물의 이온 강도 또는 장성을 조정하기 위하여 첨가될 수 있다.

약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 보존제는 항산화제, 시트르산, 시트르산나트륨, 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 시스테인, 메티오닌, 파라벤, 티메로살, 페놀, 크레졸 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

약제학적 조성물에서 사용하기에 적합한 완충액 물질은 염 형태의 아세트산, 염 형태의 시트르산, 염 형태의 붕산, 염 형태의 인산 및 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris, THAM, 트로메타몰)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

특정 예시적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 무균 상태이다. 약제학적 조성물은 균일 투여 형태로 제공될 수 있으며, 당업자에게 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어 용액 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있다.

또한 약제학적 조성물은 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 부형제를 선택적으로 포함하는, 적절한 희석제로 재구성되는 안정한 동결건조 생성물로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 다른 활성 약제학적 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 약제학적 성분(API)"은 일부의 약리학적 효과를 제공하고 병태, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용되는 임의의 약제학적 활성 화학물질 또는 생물학적 화합물 및 이의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염 및 이들의 임의의 혼합물을 포함한다.

예시적인 약제학적으로 허용가능한 염은 하기 산 중 하나 이상으로부터 제조된 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 염산(예를 들어, 염화물 염), 황산(예를 들어, 황산 염), 질산(예를 들어, 질산염), 인산(예를 들어, 인산염), 브롬화수소산(예를 들어, 브롬화수소염), 말레산(예를 들어, 말레이트 염), 말산(예를 들어, 말레이트 염), 아스코르브산, 시트르산(예를 들어, 시트르산 염), 타르타르산(예를 들어, 타르타르산염), 파모산(예를 들어, 파모에이트 또는 엠보네이트 염), 라우르산(예를 들어, 라우르산 염), 스테아르산(예를 들어, 스테아레이트 염), 팔미트산(예를 들어, 팔미테이트 염), 올레산, 미리스트산(예를 들어, 미리스테이트 염), 라우릴산, 나프탈린설폰산, 리놀렌산(예를 들어, 리놀레이트 염), 등.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 약제학적 성분", "활성제(active agent)", "활성 성분(active ingredient)", "활성 물질(active substance)" 및 "약물(drug)"은 동의어를 의미하며, 즉, 동일한 의미를 갖는다.

본 발명에 따르면, 활성 약제학적 성분은 선택적으로 다음으로부터 선택된다:

- 문헌[Rote Liste 2014]에 언급된 모든 약물, 예를 들어 문헌[Rote Liste 2014, chapter 12]에 언급된 모든 항당뇨병제(antidiabetic), 문헌[Rote Liste 2014, chapter 06]에 언급된 모든 체중-감소제(weight-reducing agent) 또는 식욕 억제제(appetite suppressant), 문헌[Rote Liste 2014, chapter 58]에 언급된 모든 지질-저하제, 문헌[Rote Liste 2014 chapter 17]에 언급된 모든 항고혈압제, 문헌[Rote Liste]에 언급된 모든 신장보호제(nephroprotective), 또는 문헌[Rote Liste 2014, chapter 36]에 언급된 모든 이뇨제;

- 인슐린 및 인슐린 유도체, 예를 들어: 인슐린 인슐린 글라진(glargine)(예를 들어 Lantus®), 100 U/mL 초과의 농축된 인슐린 글라진, 예를 들어 270 내지 330 U/mL의 인슐린 글라진 또는 300 U/mL의 인슐린 글라진 (유럽 특허 제2387989호에 개시된 바와 같음), 인슐린 글루리신(glulisine)(예를 들어, Apidra®), 인슐린 데테미르(detemir)(예를 들어, Levemir®), 인슐린 리스프로(lispro)(예를 들어, Humalog®, Liprolog®), 인슐린 데글루데크(degludec)(예를 들어, DegludecPlus®, 이데그리라(IdegLira) (NN9068)), 인슐린 아스파르트 및 아스파르트 제형(예를 들어, NovoLog®), 기저 인슐린 및 유사체(예를 들어, LY2605541, LY2963016, NN1436), 페길화된 인슐린 리스프로(예를 들어, LY-275585), 지속성 인슐린(예를 들어, NN1436, 인슈메라(Insumera) (PE0139), AB-101, AB-102, 센슐린(Sensulin) LLC), 중간형 인슐린(예를 들어, Humulin®N, Novolin®N), 속효성 및 단기-작용성 인슐린(예를 들어, Humulin®R, Novolin®R, Linjeta® (VIAject®), PH20 인슐린, NN1218, HinsBet®), 사전혼합된 인슐린, SuliXen®, NN1045, 인슐린 플러스(plus) Symlin®, PE-0139, ACP-002 히드로겔 인슐린, 및 경구, 흡입형, 경피 및 협측 또는 설하 인슐린(예를 들어, Exubera®, Nasulin®, Afrezza®, 인슐린 트레고필(tregopil, TPM-02 인슐린, Capsulin®, Oral-lyn®, Cobalamin® 경구 인슐린, ORMD-0801, 오샤디(Oshadi) 경구 인슐린, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab®). 또한, 2작용성 링커에 의해 알부민 또는 또 다른 단백질에 결합된 인슐린 유도체;

- 글루카곤 유사 펩티드 1 (GLP-1), GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 작용제, 예를 들어 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)아미드, 릭시세나타이드(예를 들어 Lyxumia®), 엑세나타이드(예를 들어 엑센딘-4, r엑센딘-4, Byetta^®, Bydureon®, 엑세나타이드 NexP), 엑세나타이드-LAR, 리라글루타이드(예를 들어 Victoza®), 세마글루타이드, 타스포글루타이드, 알비글루타이드, 둘라글루타이드, 알부곤, 옥신토모듈린, 게니프로사이드, ACP-003, CJC-1131, CJC-1134-PC, GSK-2374697, PB-1023, TTP-054, 란글레나타이드 (HM-11260C), CM-3, GLP-1 엘리젠(Eligen), AB-201, ORMD-0901, NN9924, NN9926, NN9927, 노덱센(Nodexen), 비아도르(Viador)-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, ZP-3022, CAM-2036, DA-3091, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, 엑세나타이드-XTEN (VRS-859), 엑세나타이드-XTEN + 글루카곤-XTEN (VRS-859 + AMX-808) 및 중합체-결합된 GLP-1 및 GLP-1 유사체;

- 이중 GLP-1/GIP 작용제(예를 들어 RG-7697 (MAR-701), MAR-709, BHM081, BHM089, BHM098); 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제(예를 들어 BHM-034, OAP-189 (PF-05212389, TKS-1225), TT-401/402, ZP2929, LAPS-HMOXM25, MOD-6030);

- 이중 GLP-1/가스트린 작용제(예를 들어 ZP-3022);

- 위장관 펩티드, 예컨대 펩티드 YY 3-36(PYY3-36) 또는 이의 유사체 및 췌장 폴리펩티드 (PP) 또는 이의 유사체;

- 글루카곤 수용체 작용제 또는 길항제, 포도당 의존성 인슐린 분비성(insulinotropic) 폴리펩티드(GIP) 수용체 작용제 또는 길항제, 그렐린 길항제 또는 역작용제, 제닌 및 이의 유사체;

- 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-4) 억제제, 예를 들어: 알로글립틴(예컨대, Nesina^®, Kazano^®), 리나글립틴(예컨대, Ondero^®, Trajenta^®, Tradjenta^®, Trayenta^®), 삭사글립틴(예컨대, Onglyza^®, 콤보글라이즈 XR^®), 시타글립틴(예컨대, Januvia^®, Xelevia^®, Tesavel^®, Janumet^®, Velmetia^®, Juvisync^®, Janumet XR^®), 아나글립틴, 테네리글립틴(예컨대, Tenelia^®), 트렐라글립틴, 빌다글립틴(예컨대, Galvus^®, Galvumet^®), 제미글립틴, 오마리글립틴, 에보글립틴, 두토글립틴, DA-1229, MK-3102, KM-223, KRP-104, PBL-1427, 염산 피녹사신 및 Ari-2243;

- 나트륨-의존성 글루코스 수송자 2(SGLT-2) 저해제, 예를 들어: 카나글리플로진, 다파글리플로진, 레모글리플로진, 레모글리플로진 에타보네이트, 세르글리플로진, 엠파글리플로진, 이프라글리플로진, 토포글리플로진, 루세오글리플로진, 얼투글리플로진, EGT-0001442, LIK-066, SBM-TFC-039, 및 KGA-3235 (DSP-3235);

- SGLT-2와 SGLT-1의 이중 억제제(예를 들어 LX-4211, LIK066)가 적합하다.

- 회장 담즙산 수송(ileal bile acid transfer; IBAT) 억제제(예를 들어 GSK-1614235 + GSK-2330672)와 같은 항비만약과 조합된 SGLT-1 억제제(예를 들어 LX-2761, KGA-3235) 또는 SGLT-1 억제제;

- 비구아니드(예를 들어 메트포르민, 부포르민, 펜포르민);

- 티아졸리딘디온(예를 들어 피오글리타존, 로시글리타존), 글리타존 유사체(예를 들어 로베글리타존);

- 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체(PPAR-)(알파, 감마 또는 알파/감마) 작용제 또는 조절제(예를 들어, 사로글리타자르(saroglitazar)(예를 들어, Lipaglyn^®), GFT-505) 또는 PPAR 감마 부분 작용제(예를 들어, Int-131);

- 술포닐우레아(예를 들어 톨부타미드, 글리벤클라미드, 글리메피리드, Amaryl^®, 글리피지드) 및 메글리티니드(예를 들어 나테글리니드, 레파글리니드, 미티글리니드);

- 알파-글루코시아다제 억제제(예를 들어 아카르보스, 미글리톨, 보글리보스);

- 아밀린 및 아밀린 유사체(예를 들어 프람린티드, Symlin^®);

- G-단백질 커플링 수용체 119(GPR119) 작용제(예를 들어 GSK-1292263, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ARRY-981, ZYG-19, DS-8500, HM-47000, YH-Chem1);

- GPR40 작용제(예를 들어 TUG-424, P-1736, P-11187, JTT-851, GW9508, CNX-011-67, AM-1638, AM-5262);

- GPR120 작용제 및 GPR142 작용제;

- 전신성 또는 저흡수성 TGR5(GPBAR1 = G-단백질 커플링된 담즙산 수용체 1) 작용제(예를 들어 INT-777, XL-475, SB756050);

- 당뇨 면역치료제, 예를 들어: 경구형 C-C 케모카인 수용체 2형(CCR-2) 길항제(예컨대, CCX-140, JNJ-41443532), 인터류킨 1 베타(IL-1β) 길항제(예컨대, AC-201), 또는 경구형 단일 클론 항체(MoA)(예컨대, 메탈로자미드(methalozamide), VVP808, PAZ-320, P-1736, PF-05175157, PF-04937319);

- 대사 증후군 및 당뇨 치료용 항염증제, 예를 들어: 핵 인자 카파 B 저해제(예컨대, Triolex^®);

- 아데노신 모노포스페이트-활성화되는 단백질 키나아제 (AMPK) 자극제, 예를 들어 이메글리민(Imeglimin)(PXL-008), 데비오(Debio)-0930 (MT-63-78), R-118;

- 11-베타-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 1 (11-베타-HSD-1)의 억제제(예를 들어 LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336, AZD-8329, HSD-016, BI-135585);

- 글루코키나아제의 활성제(예를 들어, PF-04991532, TTP-399 (GK1-399), GKM-001 (ADV-1002401), ARRY-403 (AMG-151), TAK-329, TMG-123, ZYGK1);

- 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(diacylglycerol O-acyltransferase; DGAT)의 억제제(예를 들어 프라디가스타트(pradigastat(LCQ-908)), 단백질 티로신 포스파타아제 1의 억제제(예를 들어 트로두스퀘민(trodusquemine)), 글루코스-6-포스파타아제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타아제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라아제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제의 억제제, 글리코겐 신타아제 키나아제의 억제제, 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제의 억제제;

- 글루코스 수송자-4의 조절자, 소마토스타틴 수용체 3 작용제(예를 들어 MK-4256);

- 하나 이상의 지질 저하제가 또한 병용 파트너로서 적합함. 예를 들어 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A-리덕타아제(HMG-CoA-리덕타아제) 억제제, 예컨 심바스타틴(예를 들어 Zocor^®, Inegy^®, Simcor^®), 아토르바스타틴(예를 들어 Sortis^®, Caduet^®), 로수바스타틴(예를 들어 Crestor^®), 프라바스타틴(예를 들어 Lipostat^®, Selipran^®), 플루바스타틴(예를 들어 Lescol^®), 피타바스타틴(예를 들어 Livazo^®, Livalo^®), 로바스타틴(예를 들어 Mevacor^®, Advicor^®), 메바스타틴(예를 들어 Compactin^®), 리바스타틴, 세리바스타틴 (Lipobay^®), 피브레이트, 예컨대 베자피브레이트(예를 들어 Cedur^® 리타드(retard)), 시프로피브레이트(예를 들어 Hyperlipen^®), 페노피브레이트(예를 들어 Antara^®, Lipofen^®, Lipanthyl^®), 겜피브로질(예를 들어 Lopid^®, Gevilon^®), 에토피브레이트, 심피브레이트, 로니피브레이트, 클리노피브레이트, 클로피브리드, 니코틴산 및 이의 유도체(예를 들어, 니아신의 서방성 제형을 포함하는 니아신), 니코틴산 수용체 1 작용제(예를 들어 GSK-256073), PPAR-델타 작용제, 아세틸-CoA아세틸트랜스퍼라아제 (ACAT) 억제제(예를 들어 아바시미브(avasimibe)), 콜레스테롤 흡수 억제제(예를 들어 에제티미브, Ezetrol^®, Zetia^®, Liptruzet^®, Vytorin^®, S-556971), 담즙산-결합 물질(예를 들어 콜레스티라민, 콜레세벨람), 회장 담즙산 수송 (IBAT) 억제제(예를 들어 GSK-2330672, LUM-002), 미세소체 트리글리세리드 운반 단백질 (MTP) 억제제(예를 들어 로미타피드 (AEGR-733), SLx-4090, 그라노타피드), 전구단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 타입 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; PCSK9)의 조절제(예를 들어 알리로쿠맙 (REGN727/SAR236553), AMG-145, LGT-209, PF-04950615, MPSK3169A, LY3015014, ALD-306, ALN-PCS, BMS-962476, SPC5001, ISIS-394814, 1B20, LGT-210, 1D05, BMS-PCSK9Rx-2, SX-PCK9, RG7652), LDL 수용체 상향조절제, 예를 들어 간 선택성 갑상선 호르몬 수용체 베타 작용제(예를 들어 에프로티롬 (KB-2115), MB07811, 소베티롬 (QRX-431), VIA-3196, ZYT1), HDL-상승 화합물, 예컨대: 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(cholesteryl ester transfer protein; CETP) 억제제(예를 들어 아나세트라핍 (MK0859), 달세트라핍, 에바세트라핍, JTT-302, DRL-17822, TA-8995, R-1658, LY-2484595, DS-1442), 또는 이중 CETP/PCSK9 억제제(예를 들어 K-312), ATP-결합 카세트 (ABC1) 조절제, 지질 대사 조절제(예를 들어 BMS-823778, TAP-301, DRL-21994, DRL-21995), 포스포리파아제 A2 (PLA2) 억제제(예를 들어 다라플라딥, Tyrisa^®, 바레스플라딥, 릴라플라딥), ApoA-I 증강제(예를 들어 RVX-208, CER-001, MDCO-216, CSL-112), 콜레스테롤 합성 억제제(예를 들어 ETC-1002), 지질 대사 조절제(예를 들어 BMS-823778, TAP-301, DRL-21994, DRL-21995) 및 오메가-3 지방산 및 이의 유도체(예를 들어 이코사펜트 에틸 (AMR101), Epanova^®, AKR-063, NKPL-66, PRC-4016, CAT-2003);

- 브로모크립틴(예를 들어, Cycloset^®, Parlodel^®), 펜테르민 및 펜테르민 제형 또는 조합물(예를 들어, 아디펙스(Adipex)-P, 이오나민(Ionamin), Qsymia^®), 벤즈페타민(예를 들어, Didrex^®), 디에틸프로피온(예를 들어, Tenuate^®), 펜디메트라진(예를 들어, Adipost^®, Bontril^®), 부프로피온 및 조합물(예를 들어, Zyban^®, Wellbutrin XL^®, Contrave^®, Empatic^®), 시부트라민(예를 들어, Reductil^®, Meridia^®), 토피라마트(예를 들어, Topamax^®), 조니사미드(예를 들어, Zonegran^®), 테소펜신, 오피오이드 길항제, 예컨대 날트렉손(예를 들어, Naltrexin^®, 날트렉손 + 부프로피온), 칸나비노이드 수용체 1 (CB1) 길항제(예를 들어, TM-38837), 멜라닌-농축 호르몬 (MCH-1) 길항제(예를 들어, BMS-830216, ALB-127158(a)), MC4 수용체 작용제 및 부분 작용제(예를 들어, AZD-2820, RM-493), 신경펩티드 Y5 (NPY5) 또는 NPY2 길항제(예를 들어, 벨네페리트, S-234462), NPY4 작용제(예를 들어, PP-1420), 베타-3-아드레날린 수용체 작용제, 렙틴 또는 렙틴 모방체, 5-히드록시트립타민 2c (5HT2c) 수용체의 작용제(예를 들어, 로르카세린, Belviq^®), 프람린티드/메트렐렙틴, 리파아제 억제제, 예컨대 세틸리스타트(예를 들어, Cametor^®), 오르리스타트(예를 들어, Xenical^®, Calobalin^®), 혈관형성 억제제(예를 들어, ALS-L1023), 베타히스티딘 및 히스타민 H3 길항제(예를 들어, HPP-404), AgRP (아구티 관련 단백질) 억제제(예를 들어, TTP-435), 세로토닌 재흡수 억제제, 예를 들어, 플루옥세틴(예를 들어, Fluctine^®), 둘록세틴(예를 들어, Cymbalta^®), 이중 또는 삼중 모노아민 섭취 억제제 (도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌 재흡수), 예컨대 세르트랄린(예를 들어, Zoloft^®), 테소펜신, 메티오닌 아미노펩티다아제 2 (MetAP2) 억제제(예를 들어, 벨로라닙), 및 섬유모세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4)(예를 들어, ISIS-FGFR4Rx) 또는 프로히비틴 표적화 펩티드-1(예를 들어, Adipotide^®)의 생성에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드;

- 산화질소 공여체, AT1 길항제 또는 안지오텐신 II (AT2) 수용체 길항제, 예컨대 텔미사르탄(예를 들어 Kinzal^®, Micardis^®), 칸데사르탄(예를 들어 Atacand^®, Blopress^®), 발사르탄(예를 들어 Diovan^®, Co-Diovan^®), 로사르탄(예를 들어 Cosaar^®), 에프로사르탄(예를 들어 Teveten^®), 이르베사르탄(예를 들어 Aprovel^®, CoAprovel^®), 올메사르탄(예를 들어 Votum^®, Olmetec^®), 타소사르탄, 아질사르탄(예를 들어 Edarbi^®), 이중 안지오텐신 수용체 차단제 (이중 ARB), 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, ACE-2 활성제, 레닌 억제제, 프로레닌 억제제, 엔도텔린 전환 효소 (ECE) 억제제, 엔도텔린 수용체 (ET1/ETA) 차단제, 엔도텔린 길항제, 이뇨제, 알도스테론 길항제, 알도스테론 신타아제 억제제, 알파-차단제, 알파-2 아드레날린 수용체의 길항제, 베타-차단제, 혼합 알파-/베타-차단제, 칼슘 길항제, 칼슘 채널 차단제 (CCB), 칼슘 채널 차단제 딜티아젬의 비강 제형(예를 들어 CP-404), 이중 미네랄로코르티코이드/CCB, 중추 작용성 항고혈압제, 중성 엔도펩티다아제의 억제제, 아미노펩티다아제-A 억제제, 바소펩티드 억제제, 이중 바소펩티드 억제제, 예컨대 네프릴리신-ACE 억제제 또는 네프릴리신-ECE 억제제, 이중-작용 AT 수용체-네프릴리신 억제제, 이중 AT1/ETA 길항제, 최종 당화 산물 (AGE) 분해제, 재조합 레날라아제, 혈압 백신, 예컨대 항-RAAS (레틴-안지오텐신-알도스테론-시스템) 백신, AT1- 또는 AT2-백신, 고혈압 게놈약학을 기반으로 한 약물, 예컨대 항고혈압 반응을 갖는 유전자 다형성의 조절제, 혈소판 응집 억제제, 및 기타의 것 또는 이들의 조합물이 적합하다.

본원에서 사용되는 용어 "부품 키트(간략히, 키트)"는 하나 이상의 용기 및 임의로 데이터 캐리어를 포함하는 제조 물품을 지칭한다. 상기 하나 이상의 용기는 본 발명의 상기 언급된 제제 중 하나 이상, 예를 들어 융합 단백질, 약제학적 조성물 및 핵산 분자 및 숙주 세포와 같은 관련 제제로 채워질 수 있다. 예를 들어 희석제, 완충제, 및 추가 시약을 포함하는 추가 용기가 키트에 포함될 수 있다. 상기 데이터 캐리어는 비전자 데이터 캐리어, 예를 들어 그래픽 데이터 캐리어, 예컨대 정보 리플릿, 정보 시트, 바코드, 또는 액세스 코드, 또는 전자 데이터 캐리어, 예컨대 콤팩트 디스크(CD), 디지털 다기능 디스크(DVD), 마이크로칩, 또는 다른 반도체-기반 전자 데이터 캐리어일 수 있다. 액세스 코드는 데이터베이스, 예를 들어 인터넷 데이터베이스, 중앙 집중식 또는 분산형 데이터베이스에 대한 접속을 허용할 수 있다. 상기 데이터 캐리어는 본 발명의 제제, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질, 약제학적 조성물 및 핵산 분자 및 숙주 세포와 같은 관련 제제의 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 에이전트 및 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구 투여되거나, 폐 투여되거나, 흡입에 의해 투여되거나, 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하여 비경구 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 비경구 투여, 예를 들어 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 근육내 투여가 사용된다. 본원에 개시된 에이전트 및 조성물은 또한 지속 방출 투여를 통하여 투여될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 대개 활성 화합물의 살균 수성 또는 비수성 제제를 포함하는데, 상기 제제는 선택적으로 수용자의 혈액에 대하여 등장성이다. 상용성 담체/용매/희석제의 예로는 살균수, 링거액, 락테이트 링거액, 생리식염수, 정균 식염수(예를 들어, 0.9% 벤질 알코올을 함유하는 식염수), 인산염 완충 식염수(PBS) 및 행크 용액이 있다. 게다가, 대개 살균성인 고정유가 용액 또는 현탁액 매질로서 사용될 수 있다.

본원에 개시된 에이전트 및 조성물은 대개 치료적 유효량으로 투여된다. "치료적 유효량"은 선택적으로 허용가능하지 않은 부작용을 야기하지 않고서, 단독의, 또는 추가 용량과 함께, 원하는 치료적 반응 또는 원하는 치료적 효과를 성취하는 양을 나타낸다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 목적하는 반응은 해당 질환 경과의 억제와 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에서의 목적하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 발병 지연 또는 발병 예방일 수 있다. 본원에 개시된 제제 또는 조성물의 유효량은 치료될 병태, 질환의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기 및 중량을 포함하는 대상체의 개별 파라미터, 치료 지속 기간, (존재할 경우) 수반되는 치료법의 유형, 특정 투여 경로 및 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 개시된 제제의 투여 용량은 다양한 그러한 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 대상체에서의 반응이 처음 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량 (또는 상이한, 더 국소화된 투여 경로에 의해 성취되는 효과적으로 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "질환 또는 장애"는 임의의 병리학적 상태 또는 건강하지 않은 상태, 특히 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증을 지칭한다.

용어 "비만"은 과도한 체지방이 건강에 부정적인 영향을 줄 수 있을 정도까지 축적된 의학적 상태를 나타낸다. 인간 (성인) 대상체 면에서, 비만은 30 kg/m² 이상의 체질량 지수(body mass index; BMI) (BMI > 30 kg/m²)로 정의될 수 있다.

용어 "과체중"은 체지방량이 최선으로 건강한 것보다 더 높은 의학적 상태를 나타낸다. 인간 (성인) 대상체 면에서, 비만은 25 kg/m² 이상의 체질량 지수 (BMI)(예를 들어, 25 kg/m² < BMI < 30 kg/m²)로 정의될 수 있다.

BMI는 성인에 있어서 과체중 및 비만을 분류하는 데 일반적으로 사용되는 신장 대비 체중의 단순 인덱스이다. 이것은 kg 단위의 사람의 체중을 미터 단위의 신장의 제곱으로 나눈 것 (kg/m²)으로 정의된다.

"대사 증후군"은 하기의 의학적 상태들 중 적어도 3가지의 클러스터링으로 정의될 수 있다: 복부 (중심성) 비만(예를 들어, 유럽계 남성의 경우 > 94 cm의 허리 둘레 및 유럽계 여성의 경우 > 80의 허리 둘레로서 정의되며, 다른 군의 경우 민족 특이적 값을 가짐), 상승된 혈압(예를 들어, 130/85 mmHg 이상), 상승된 공복 혈장 글루코스(예를 들어, 100 mg/dL 이상), 높은 혈청 트리글리세리드(예를 들어, 150 mg/dL 이상, 및 낮은 고밀도 리포단백질 (HDL) 수준(예를 들어, 남성의 경우 40 mg/dL 미만 및 여성의 경우 50 mg/dL 미만).

"진성 당뇨병" (간단히 "당뇨병"으로도 칭해짐)은 인슐린 생성, 인슐린 작용 또는 이들 둘 다에서의 결함에서 생기는 고수준의 혈중 글루코스를 특징으로 하는 대사성 질환들의 군을 나타낸다. 일 실시형태에서, 진성 당뇨병은 1형 진성 당뇨병, 2형 진성 당뇨병, 임신성 진성 당뇨병, 성인에서의 후기 발병형 자가면역 당뇨병(late onset autoimmune diabetes in the adult; LADA), 청소년기의 성인 발병 당뇨병(maturity onset diabetes of the young; MODY) 및 특정한 유전적 상태, 약물, 영양실조 감염 및 기타 질병에서 생기는 다른 유형의 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

진성 당뇨병에 대한 현재 WHO 진단 기준은 다음과 같다: 공복 혈당 ≥ 7.0 mmol/l (126 mg/dL) 또는 2-시간 혈당 ≥ 11.1 mmol/l (200 mg/dL).

"1형 진성 당뇨병" ("인슐린 의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes; IDDM)" 또는 "소아 당뇨병"으로도 공지됨)은 인슐린의 전적인 결여에 의해 야기되는 고 혈당 수준을 특징으로 하는 병태이다. 이것은 신체 면역계가 췌장에서 인슐린 생산 베타 세포를 공격하여 이를 파괴할 때 일어난다. 그러면 췌장은 인슐린을 거의 생산하지 않거나 전혀 생산하지 않는다. 췌장의 제거 또는 질환은 또한 인슐린-생산 베타 세포의 손실을 초래할 수 있다. 1형 진성 당뇨병은 당뇨병 사례의 5% 내지 10%를 차지한다.

"2형 진성 당뇨병" ("인슐린 비의존성 진성 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes; NIDDM)" 또는 "성인 발병 당뇨병"으로도 공지됨)은 인슐린의 이용성에도 불구하고 과도한 글루코스가 생성되는 것을 특징으로 하는 병태이며, 순환 글루코스 수준은 부적당한 글루코스 제거 (인슐린 작용)의 결과로서 여전히 과도하게 높은 채로 있다. 2형 진성 당뇨병은 당뇨병 사례의 약 90% 내지 95%를 차지할 수 있다.

"임신성 당뇨병"은 이전에 당뇨병으로 진단되지 않은 여성이 임신 동안 (특히 임신 후기 동안) 높은 혈당 수준을 나타내는 병태이다. 임신성 당뇨병은 연구되는 집단에 따라 3~10%의 임신에 영향을 준다.

"성인에서의 후기 발병형 자가면역 당뇨병(LADA)"("느린 발병형 제1형 당뇨병"으로도 지칭됨)은 종종 더 느린 발병 과정을 갖는, 성인에서 발생하는 1형 진성 당뇨병 형태이다.

"청소년기의 성인 발병 당뇨병(MODY)"은 인슐린 생산을 파괴하는 상염색체 우성 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 유전형의 당뇨병을 나타낸다.

"당뇨병성 망막병증"은 당뇨병 환자에서 발생하는 대사 장애에 의해 유발되는 안구 질환으로, 진행성 실명을 초래한다.

용어 "고혈당증"은 혈액 중의 과도한 당 (글루코스)을 나타낸다.

용어 "이상지질혈증"은 리포단백질 과다생성 ("고지혈증") 또는 결핍 ("저지혈증")을 포함하는 리포단백질 대사의 장애를 나타낸다. 이상지질혈증은 혈중 콜레스테롤, 저밀도 리포단백질 (LDL) 콜레스테롤 및/또는 트리글리세리드 총 농도의 상승, 및/또는 고밀도 리포단백질 (HDL) 콜레스테롤 농도의 감소로 나타날 수 있다.

비알코올성 지방간염(NASH)은 간세포의 염증 및 감퇴와 함께, 지방(지질 소적)의 축적을 특징으로 하는 간질환이다. 일단 정착되면, 상기 질환에는 간기능이 변경되고 간부전으로 진행할 수 있는 상태인 고위험도의 간경변이 수반된다. 그 후, NASH는 종종 간암으로 진행된다.

"아테롬성 동맥경화증"은 동맥 내강의 협착을 야기하고 섬유증 및 석회화로 진행할 수 있는, 큰 크기 및 중간 크기의 동맥의 내막에서의 경화반으로 칭해지는 불규칙 분포 지질 침적물을 특징으로 하는 혈관 질환이다. 병변은 대개 국소(focal) 병변이며, 느리게 그리고 간헐적으로 진행한다. 가끔, 경화반 파열이 일어나서 혈액 폐색을 초래하여서 폐색 원위부의 조직 유동의 방해를 초래하여서 조직사를 야기한다. 혈류 제한이 대부분의 임상 소견을 차지하며, 이는 폐색의 분포 및 중증도에 따라 달라진다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "의약"은 치료법에서, 즉, 질환 또는 장애의 치료에서 사용되는 물질/조성물을 나타낸다.

"치료"는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방하거나 개선하거나, 제거하기 위해; 대상체에서 질환 또는 장애를 저지하거나 늦추기 위해; 대상체에서 새로운 질환 또는 장애의 발병을 억제하거나 늦추기 위해; 질환 또는 장애가 현재 있거나 이전에 있었던 대상체에서 증상 및/또는 재발의 빈도 또는 중증도를 감소시키기 위해; 그리고/또는 대상체의 수명을 연장, 즉 증가시키기 위해 대상체에게 화합물 또는 조성물, 또는 화합물 또는 조성물의 조합물을 투여하는 것을 의미한다.

특히, 어구 "질환 또는 장애를 치료하는 것" 및 "질환 또는 장애의 치료"는 질환 또는 장애 또는 이의 증상에 대한 치유, 지속기간의 단축, 개선, 예방, 진행 또는 악화의 늦춤 또는 억제, 또는 발병의 예방 또는 지연을 포함한다.

용어 "대상체"는 본 발명에 따르면, 치료를 위한 대상체, 특히 질환에 걸린 대상체("환자"로도 지칭됨)를 지칭하며, 이는 인간, 비인간 영장류 또는 그 밖의 동물, 예컨대 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼 또는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 또는 햄스터)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 대상체 또는 환자는 인간이다.

이제, 하기 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 추가로 설명하며, 이는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위함이다.

실시예

실시예 1: 시스템 약리학 모델링을 통한 최적의 GLP-1RA/FGF21 활성 비율 결정

인간에서 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질의 약리학적 효과에 대한 향상된 기계론적 통찰력을 사용하여 최적의 GLP-1RA/FGF21 효능 비율을 확인했다. 인간의 글루코스, 지질 및 에너지 대사에 대한 GLP-1 및 FGF21의 효과를 기술하는 기계론적 시스템 약리학 모델이 개발되었다(문헌[Cuevas-Ramos et al. (2009) Curr Diabetes Rev 5(4): 216-220]; 문헌[Deacon et al. (2011) Rev Diabet Stud 8(3): 293-306]; 문헌[Kim et al. (2008) Pharmacol Rev 60(4): 470-512]; 문헌[Kharitonenkov et al. (2014) Mol Metab 3(3): 221-229]).

모델은 GLP-1 및 FGF21 효과에 대한 관련 경로를 나타낸다. 혈당 조절(즉, HbA1c, 공복 혈당, 식후 포도당), 지질 매개변수(즉, 혈장 트리글리세리드, 지방산, 콜레스테롤), 및 에너지 균형(즉, 체중, 음식 섭취, 에너지 소비)을 포착하여 모의 약물 치료(예를 들어, GLP-1RA/FGF21 융합 단백질, 리라글루티드, FGF21 유사체 Ly2405319)에 대한 치료 반응을 평가했다. LY2405319에 대해서는, 문헌[Kharitonenkov et al. (2013) PLoS ONE 8(3): e58575]를 참조한다.

이 모델은 호르몬 인슐린, 글루카곤 및 특정 인크레틴(예를 들어, GLP-1, GIP)에 의해 제어되는 포도당 항상성의 주요 측면을 다루었다. 혈당 조절에 관한 주요 모델 평가변수는 HbA1c였으며, 이는 이전 몇 달 동안 평균 혈당 농도를 추정하는 데 사용되는 일반적인 임상 평가변수이다. HbA1c는 문헌[Nathan et al. (2008) Diabetes Care 31(8): 1473-1478]에 의해 보고된 바와 같이, 평균 혈당과 HbA1c 사이의 선형 상관관계를 사용하여 모델 내에서 추정되었다.

이 모델은 콜레스테롤 표현을 포함하여 기본적인 지질 대사를 처리하기에 적절한 수준에서 트리글리세리드 및 지방산 대사를 통합했다. HDL 및 비-HDL, 즉, LDL 플러스 VLDL 콜레스테롤은 순환 지단백질이다. 지질 대사의 표현은 지질에 대한 FGF21 화합물의 영향 및 스타틴과의 상호작용을 시뮬레이션할 수 있게 했다. FGF21 화합물은 지질 농도에 유의한 영향을 미쳤다(문헌[Gaich et al. (2013) Cell Metab 18(3): 333-340]; 문헌[Fisher et al. (2011) Endocrinology 152(8): 2996-3004]).

모델의 체중 감소 또는 증가는 체지방량의 변화로 측정되었다. 지방량과 체중 사이에는 직접적인 관계가 있었다(문헌[Broyles et al. (2011) Br J Nutr 105(8): 1272-1276]). 음식 섭취는 기초 대사율과 안정시 대사율을 기반으로 했다(문헌[Amirkalali et al. (2008) Indian J Med Sci 62(7): 283-290]). 체지방량은 에너지 소비가 칼로리 섭취와 같을 때 일정하게 유지되었다. 음식 섭취에 대한 치료 효과는 문헌[Gobel et al. (2014) (Obesity (Silver Spring) 22(10): 2105-2108)]의 제형을 사용하여 모델에서 구현되었다.

음식은 탄수화물(포도당 등가물), 지방(지방산 등가물) 및 단백질(아미노산 등가물)로 간주되었다. 모든 영양소는 위장으로 들어가, 지연 노드를 통과한 다음, 3구획 위장관으로 들어간다. 위장관 디자인은 식품 소화 및 흡수와 관련하여 문헌[Bastianelli et al. (1996) (J Anim Sci 74(8): 1873-1887)] 및 문헌[Worthington (1997) (Med Inform (Lond) 22(1): 35-45)]에 의해 수행된 작업을 기반으로 하였다.

영양분, 호르몬, 약물 및 질환 상태는 위 배출을 지연시킬 수 있다. 건강한 조건에서, 위 배출률은 식사의 크기, 에너지 밀도, 및 위의 영양분 양에 따라 달라진다(문헌[Achour et al. (2001) Eur J Clin Nutr 55(9): 769-772]; 문헌[Fouillet et al. (2009) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 297(6): R1691-1705]). 당뇨병이 있는 개체는 종종 경구 포도당 내성 검사 또는 식사 검사에서 관찰되는 바와 같이 포도당 흡수가 지연된다(문헌[Bharucha et al. (2009) Clin Endocrinol (Oxf) 70(3): 415-420]; 문헌[Chang et al. (2012) Diabetes Care 35(12): 2594-2596]). 이 지연은 위 배출이 느려지기 때문이다. 위와 소장 사이의 이동 지연은 당뇨병 환자에서 지연된 위 배출을 설명하기 위해 본 실시예의 모델에 추가되었다. 약물 및 호르몬(예를 들어, GLP-1)은 기계적 혼합 및/또는 연동 운동을 감소시키는 위의 미주 신경 긴장도에 영향을 미칠 수 있으며, 또한 위 배출을을 늦춘다(문헌[Jelsing et al. (2012) Diabetes Obes Metab 14(6): 531-538]; 문헌[Little et al. (2006) J Clin Endocrinol Metab 91(5): 1916-1923]; 문헌[Nauck et al. (2011) Diabetes 60(5): 1561-1565]; 문헌[van Can et al. (2013) Int J Obes (Lond) 38(6): 784-93]).

본원에 기재된 융합 단백질의 한 가지 목적은 GLP-1 관련 부작용, 즉 메스꺼움 및 구토를 예방하거나 감소시키는 것이었다(문헌[Lean et al. (2014) Int J Obes (Lond) 38(5): 689-697]). 위 배출 측정은 낮은 비율의 위 배출과 관련된 메스꺼움 및 구토와 같은 부작용의 추정치를 제공했다. 따라서, 모델에서 위 부작용에 대한 마커는 위배출률의 합이었다.

질환의 다른 단계에서 건강한 2형 당뇨병 환자를 나타내는 모델 플랫폼에서 다른 가상 환자가 구현되었다. 또한, 가상 환자는 다양한 정도의 비만과 이상지질혈증을 다루었다. 가상 환자는 임상에서 관찰된 질환 중증도 및 병태생리학의 가변성 및 표현형 가변성을 나타냈다.

즉, GLP-1RA/FGF21 융합 단백질, 리라글루티드, FGF21 유사체 LY2405319, 메트포르민, 아토르바스타틴, 시타글립틴 및 인간 인슐린과 같은 여러 요법이 모델에서 구현되었다. 이러한 요법은 시뮬레이션에서 켜거나 끌 수 있다. 가상 환자는 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질을 투여했을 때 메트포르민과 아토르바스타틴의 배경에 있다고 가정했다.

가상 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질은 본 실시예에 기술된 모델에서 구현되었다. 융합 단백질은 FGF21 및 GLP-1 작용제 활성을 모두 함유하고 있으며, FGF21 및 GLP-1 수용체 작용제와 동일한 효과를 가졌다. 가상 융합 단백질의 약동학적 프로필은 둘라글루타이드와 유사한 것으로 추정되었다(문헌[Geiser et al. (2016) Clin Pharmacokinet 55(5): 625-34]).

이 모델은 수많은 데이터 세트와 비교하여 검증되었다. 시뮬레이션 결과는 관련 데이터 및 지식, 예를 들어, 문헌[Hellerstein et al. (1997) J Clin Invest 100(5): 1305-1319]; 문헌[Muscelli et al. (2008) Diabetes 57(5): 1340-1348]과 정량적으로 일치했다. 모델은 관련 정량적 테스트 데이터, 예를 들어, 문헌[Aschner et al. (2006) Diabetes Care 29(12): 2632-2637]; 문헌[Dalla Man, Caumo et al. (2005) Am J Physiol Endocrinol Metab 289(5): E909-914]; 문헌[Dalla Man et al. (2005) Diabetes 54(11): 3265-3273]; 문헌[Fiallo-Scharer (2005) J Clin Endocrinol Metab 90(6): 3387-3391]; 문헌[Hahn et al. (2011) Theor Biol Med Model 8: 12]; 문헌[Herman et al. (2005) Clin Pharmacol Ther 78(6): 675-688]; 문헌[Herman et al. (2006) J Clin Pharmacol 46(8): 876-886] 및 문헌[J Clin Endocrinol Metab 91(11): 4612-4619]; 문헌[Hojlund et al. (2001) Am J Physiol Endocrinol Metab 280(1): E50-58]; 문헌[Monauni et al. (2000) Diabetes 49(6): 926-935]; 문헌[Nauck et al. (2009) Diabetes Care 32(1): 84-90]; 문헌[Nauck et al. (1993) J Clin Invest 91(1): 301-307]; 문헌[Nauck et al. (2004) Regul Pept 122(3): 209-217]; 문헌[Tzamaloukas et al. (1989) West J Med 150(4): 415-419]; 문헌[Sikaris (2009) J Diabetes Sci Technol 3(3): 429-438]; 문헌[Vicini and Cobelli (2001) Am J Physiol Endocrinol Metab 280(1): E179-186]; 문헌[Vollmer et al. (2008) Diabetes 57(3): 678-687]와 일치했다.

FGF21 유사체 및 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 기존 요법은 직접적인 비교를 위해 모델에서 구현되었다. FGF21 유사체의 효과는 임상 데이터, 예를 들어, 문헌[Gaich et al. (2013) Cell Metab 18(3): 333-340]으로 검증되었다. GLP-1 수용체 작용제 리라글루티드는 표적에 대한 직접적인 경쟁자였으며, 그 구현은 예를 들어, 문헌[Jacobsen et al. (2009) Br J Clin Pharmacol 68(6): 898-905]; 문헌[Elbrond et al. (2002) Diabetes Care 25(8): 1398-1404]; 문헌[Chang et al. (2003) Diabetes 52(7): 1786-1791]; 문헌[Kolterman et al. (2003) J Clin Endocrinol Metab 88(7): 3082-3089]; 문헌[Degn et al. (2004) Diabetes 53(5): 1187-1194]; 문헌[Kolterman et al. (2005) Am J Health Syst Pharm 62(2): 173-181]; 문헌[Vilsboll et al. (2008) Diabet Med 25(2): 152-156]; 문헌[Buse et al. (2009) Lancet 374(9683): 39-47]; 문헌[Jelsing et al. (2012) Diabetes Obes Metab 14(6): 531-538]; 문헌[Hermansen et al. (2013) Diabetes Obes Metab 15(11): 1040-1048]; 문헌[Suzuki et al. (2013) Intern Med 52(10): 1029-1034]; 문헌[van Can et al. (2013) Int J Obes (Lond) 38(6): 784-93)]; 문헌[Zinman et al. (2009) Diabetes Care 32(7): 1224-1230]; 문헌[Russell-Jones et al. (2009) Diabetologia 52(10): 2046-2055]; 문헌[Pratley et al. (2011) Int J Clin Pract 65(4): 397-407]; 문헌[Nauck et al. (2013) Diabetes Obes Metab 15(3): 204-212]; 문헌[Flint et al. (2011) Adv Ther 28(3): 213-226]; 문헌[Kapitza et al. (2011) Adv Ther 28(8): 650-660]; 및 문헌[Astrup et al. (2012) Int J Obes (Lond) 36(6): 843-854]에 기술된 데이터와 같은 다양한 임상 데이터와 비교되었다.

모델 플랫폼은 다양한 활성 비율로 가상 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질의 유익한 효과와 부작용을 시뮬레이션할 수 있게 했다. 효과적인 FGF21-매개 EC50 값은 문헌[Gaich et al. (2013) Cell Metab 18(3): 333-340]으로부터 유래된 값으로 일정하게 설정되었다. 효과적인 GLP-1-매개 EC50 값은 내인성 GLP-1에 비해 1씩 증가하여 2에서 600의 요소까지 감소했다(표 1).

[표 1]

각 가상 융합 단백질에 대해, 관련 약력학적 평가변수들, 즉, HbA1c, 트리글리세리드, 지방산, 비-HDL 콜레스테롤, 및 지방량에 대해 노출-반응 관계를 시뮬레이션하였다. GLP-1-매개 부작용에 대한 마커로 위 배출률을 사용하였다. GLP-1RA/FGF21 융합 단백질을 사용한 평균 비만 이상지질혈증 2형 당뇨병 가상 환자의 52주 치료를 광범위한 용량 범위에 대해 시뮬레이션하였다. 52주 동안의 치료 후, 관련된 모든 약력학적 평가변수는 정상 상태에 도달할 것으로 예상되었다. 각 평가변수에 대해, 노출-반응 곡선에서 최대 유효 농도의 절반(EC50 값)을 결정했다. EC50 값은 특히, 주로 GLP-1-매개 평가변수 HbA1c 및 위 배출률에 대한 활성 비율에 따라 다양했다. 도 1은 GLP-1 감쇠 계수에 따른 EC50 값을 도시한다. 증가된 GLP-1 감쇠 계수는 GLP-1R 작용제 활성의 감소를 나타냈다.

이 절차를 통해 약력학적 효과를 매개하는 혈장 수준과 비교하여 더 높은 혈장 수준에서 부작용이 관찰되는 관련 활성 비율을 확인할 수 있었다. 9보다 큰 GLP-1 감쇠 계수의 경우, GLP-1-매개 위 부작용의 EC50은 약력학적 효과의 EC50보다 컸다. 따라서, 약력학적 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 높은 혈장 수준에서 위 부작용이 발생했다. GLP-1-매개 위 부작용을 피하면서 모든 바람직한 약력학적 효과를 제공하는 용량을 설명하는 것이 가능했다.

위 배출률의 최대 EC50 값은 감쇠 계수 531에 도달했다. 부작용과 평균 약력학적 효과사이의 최대 거리는 감쇠 계수 482에 도달했다(도 2). 따라서, 1:482를 초과하는 활성 비율은 관련이 없다. 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 부작용 사이의 최대 거리는 319였다. 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 FGF21-(지질) 및 GLP-1-매개 효과(HbA1c)의 확산에 의해 정상화된 부작용 사이의 최대 거리는 121이었다.

효능 비율이 1:10 내지 1:482인 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질은 지질 프로필, 체중 및 포도당 대사를 개선하는 데 가장 유익한 것으로 예측되었으며, 위 배출 반응에 기초하여 유의미한 부작용을 일으키지 않았을 가능성이 있다. 더 낮은 효능 비율은 예상되는 강력한 위 배출 억제 및 부작용 가능성에 근거하여 좋은 후보가 아닐 가능성이 있다. 더 높은 효능 비율은 충분히 효과적이지 않고 따라서 경쟁력이 없는 것으로 생각되었다.

GLP-1RA/FGF21 융합 단백질을 사용한 평균 비만 이상지질혈증 2형 당뇨병 가상 환자의 12주 치료는 넓은 용량 범위에 대해 시뮬레이션되었는데, 이는 HbA1c 수준의 주로 GLP-1-매개 매개변수가 임상적으로 당업계에 공지된 GLP-1 수용체 작용제 및 FGF21 제제를 이용한 치료 12주 후에 정상 상태에 도달하기 때문이다.

도 3은 12주 시뮬레이션 기간 동안 GLP-1 감쇠 계수에 대해 얻은 EC50 값을 도시한다. 18보다 큰 GLP-1 감쇠 계수의 경우, GLP-1-매개 위 부작용의 EC50은 약력학적 효과의 EC50보다 컸다. 위 배출률의 최대 EC50 값은 감쇠 계수 501에 도달했다. 부작용과 평균 약력학적 효과사이의 최대 거리는 감쇠 계수 469에 도달했다(도 4). 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 부작용 사이의 최대 거리는 313이었다. 약력학적 최대 효과(HbA1c)와 FGF21-(지질) 및 GLP-1-매개 효과(HbA1c)의 확산에 의해 정상화된 부작용 사이의 최대 거리는 123이었다.

상이한 활성 비율을 갖는 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질에 대한 부작용에 대한 효능 및 가능성을 기술된 시스템 약리학적 접근법에 의해 조사하였다. 아마도 계산된 이상적인 역가 비율을 갖는 융합 단백질이 확인되었고, 위 배출 반응에 기초하여 GLP-1RA 관련 유의미한 부작용을 일으키지 않으면서 지질 프로필, 체중 및 혈당 조절을 개선하는 데 도움이 될 것으로 예측되었다. 선택된 모델-정보 효능 비율을 가진 화합물은 우수한 효능 대 위험 프로필을 제공할 것으로 예측되었다.

실시예 2: HEK-293, CHO 및 에셰리키아 콜라이 세포에서 동종이량체 GLP-1RA/FGF21 융합 단백질의 발현 및 단리된 GLP-1R 작용제 펩티드의 화학적 합성

GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질은 HEK-293 또는 CHO 세포에서 일시적인 형질감염에 의해 생산되었다. 융합 단백질의 DNA 서열은 IL2 신호 서열(서열번호 246) 에 N-말단으로 융합되었고, 히스티딘이 풍부한 서열(His-tag) 및 TEV 프로테아제-절단 부위(서열번호 247 또는 248)가 뒤따랐다. 신호 서열은 배양 배지 내로의 원하는 단백질의 분비에 요구되었다. 단백질을 고정 금속-이온 친화성 크로마토그래피(immobilized metal-ion affinity chromatography; IMAC) (컴플리트 His-태그 정제 컬럼(cOmplete His-Tag Purification Column™), 로슈(Roche))를 사용하여 배양 상청액으로부터 정제하였다. IMAC-컬럼으로부터의 용출 후, N-말단 His-태그를 TEV 프로테아제의 첨가에 의해 선택적으로 절단하였다. His-태그 절단 후, 절단 반응 용액을 IMAC-컬럼(컴플리트 His-태그 정제 컬럼™, 로슈)에 두 번째로 통과시켜 (His-태그 비함유) 유통 분획을 수집하였다. 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피(rProtein A Sepharose, GE Healthcare) 및 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)를 러닝 완충액으로 사용하는 겔 여과 컬럼을 사용하여 추가로 정제했다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 풀링하고, 농축시키고, 추가 사용때까지 -80℃에서 보관하였다.

서열번호 252의 FGF21 단백질(추가적인 N-말단 Gly를 갖는 성숙한 인간 야생형 FGF21; 본원에서 G-FGF21로 지칭됨)은 에셰리키아 콜라이에서 발현되었다. FGF21 단백질들의 DNA 서열들을 N-말단에서 히스티딘-풍부 서열 (His-태그) 및 TEV 또는 SUMO 프로테아제-절단 부위 (서열 번호 248 또는 249)에 융합하였다. 원하는 단백질을 고정 금속-이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC) (His트랩(Trap) HP, 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 이용하여 정제하고, 이어서 TEV 또는 SUMO 프로테아제의 첨가에 의해 N-말단 His-태그를 절단하였다. His-태그의 절단 후, 절단 반응 용액을 이온 교환 컬럼(Source 15, GE Healthcare), 이어서 러닝 완충액으로서 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)를 사용한 겔여과 컬럼(Superdex 75, GE Healthcare)을 이용하여 정제하였다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 풀링하고, 농축시키고, 추가 사용때까지 -80℃에서 보관하였다.

대안적인 접근법에서, 융합 단백질은 에셰리키아 콜라이 봉입체에서의 발현에 이어 트리스-완충된 염화 구아니디늄 용액에서 봉입체를 펼치고 카오트로픽 염 없이 완충액에서 희석하여 리폴딩하여 접힌 융합 단백질을 얻는 리폴딩 단계에 의해 생성되었다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect SuRe, GE Healthcare)를 사용하여 융합 단백질을 정제한 후 TEV 프로테아제를 첨가하여 N-말단 전서열을 절단했다. 절단 반응 용액은 음이온 교환 컬럼(POROS 50 HQ, ThermoFisher)을 사용하여 정제하였다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 수집하고 풀링하였다. 최종 완충액 조건 및 단백질 농도는 PBS(Gibco)를 사용하는 한외여과/정용여과 단계에 의해 확립되었다. 샘플을 추가 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.

융합 단백질이 재조합 방법(상기 참조)에 의해 생성된 반면, 단리된 펩티드성 GLP-1R 작용제는 화학적으로 합성되었다.

보다 구체적으로, 하기 수동 합성 절차를 사용하여 펩티드를 합성하였다:

0.3g의 건조 Rink 아미드 MBHA 수지(0.66 mmol/g)를 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 배치하였다. 수지를 1시간 동안 DCM(15 mL) 중에서, 그리고 1시간 동안 DMF(15 mL) 중에서 팽윤시켰다. 수지 상의 Fmoc기를 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). 카이저(Kaiser) 검정(정량적 방법)을 고체 지지체로부터의 Fmoc의 제거의 확인을 위해 사용하였다. 건조 DMF 중 C-말단 Fmoc-아미노산(수지 부하 대비 5 당량 과량)을 탈보호된 수지에 첨가하고, 5 당량 과량의 DMF 내 DIC 및 HOBT로 다음 Fmoc-아미노산의 커플링을 개시하였다. 반응 혼합물에서 각 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전자에서 회전시켰다. 수지를 여과하고, DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). 커플링의 완료시 펩티드 수지 분취액에서의 카이저 검정은 음성이었다(수지상에서 무색). 첫번째 아미노산 부착 후, 수지내에, 존재하는 경우 미반응 아미노기를 20분 동안 아세트산 무수물/피리딘/DCM(1:8:8)을 이용해서 캡핑하여 서열의 임의 결실을 배제하였다. 캡핑 후, 수지를 DCM/DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6/6/6/6회). 펩티딜 수지에 부착된 C-말단 아미노산 상의 Fmoc 기를 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). Fmoc-탈보호의 완료 시에 펩티드 수지 분취액에서 수행된 카이저 검정은 양성이었다.

Rink 아미드 MBHA 수지상의 표적 서열 내의 나머지 아미노산을 DMF 중 수지 부하에 상응하는 5 당량 과량을 사용하는 Fmoc AA/DIC/HOBt 방법을 사용하여 순차적으로 커플링시켰다. 반응 혼합물에서 각 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전자에서 회전시켰다. 수지를 여과하고, DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). 각 커플링 단계 및 Fmoc 탈보호 단계 후에, 카이저 검정을 수행하여, 반응의 완료를 확인하였다.

선형 서열의 종료 후, 분지점 또는 변형점으로 리신의 ε-아미노기를 이용하고, 15분 동안 2회 DMF 중 2.5% 하이드라진 수화물을 이용해서 탈보호하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). DMF 중에서 DIC/HOBt 방법으로(수지 부하 대비 5 당량 과량 사용) Fmoc-Glu(OH)-OtBu을 이용하여 글루탐산의 γ-카르복실 말단을 Lys의 ε-아미노기로 부착하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고, DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6x30 mL). 글루탐산 상의 Fmoc기를 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하여 탈보호하였다(각각 25 mL). 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). Fmoc-탈보호의 완료시 펩티드 수지 분취액에서의 카이저 검정은 양성이었다.

측쇄 분지가 또한 γ-글루탐산을 하나 더 함유한 경우, DMF 중에서 DIC/HOBt 방법을 사용하여 (수지 부하 대비 5 당량 과량으로) γ-글루탐산의 자유 아미노기에 부착하기 위해 두번째 Fmoc-Glu(OH)-OtBu을 이용하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고, DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6x30 mL). γ-글루탐산 상의 Fmoc기를 5분 및 15분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액(25 mL)으로 2회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6회). Fmoc-탈보호의 완료시 펩티드 수지 분취액에서의 카이저 검정은 양성이었다.

수지로부터의 펩티드의 최종 분해:

수동 합성에 의해 합성된 펩티딜 수지를 DCM(6 x 10 mL), MeOH(6 x 10 mL) 및 에테르(6 x 10 mL)로 세척하고, 진공 데시케이터에서 밤새 건조시켰다. 고체 지지체로부터 펩티드의 분해는 시약 칵테일(80% TFA / 5% 티오아니솔/ 5% 페놀/ 2.5% EDT/ 2.5% DMS/ 5% DCM)로 펩티드-수지를 실온에서 3시간 동안 처리함으로써 달성되었다. 절단 혼합물을 여과에 의해 수집하고, 수지를 TFA(2 mL) 및 DCM(2 x 5 mL)으로 세정하였다. 과량의 TFA 및 DCM을 질소 하에서 적은 부피로 농축시키고, 소량의 DCM(5 내지 10 mL)을 잔류물에 첨가하고, 질소 하에 증발시켰다. 공정을 3회 내지 4회 반복하여 대부분의 휘발성 불순물을 제거하였다. 잔류물을 0℃까지 냉각하고, 무수 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 원심분리하고, 상층액 에테르를 제거하고, 신선한 에테르를 펩티드에 첨가하고, 다시 원심분리하였다. 미정제 샘플를 분취용 HPLC로 정제하고, 동결건조시켰다. 펩티드의 아이덴티티를 LCMS에 의해 확인하였다.

실시예 3: CHO 세포에서의 인간 FGF21 수용체 효능에 대한 시험관 내 세포 분석 (세포 내 웨스턴)

G-FGF21(서열번호 252) 및 본 발명의 융합 단백질의 세포 시험관내 효능은 특이적이고 매우 민감한 세포내 웨스턴(ICW) 검정을 사용하여 측정하였다. ICW 검정은 통상 마이크로플레이트 형식을 사용하여 수행되는 면역조직화학 검정이다. 인간 베타-클로토 (KLB)와 함께 인간 FGFR1c를 안정적으로 발현하는 CHO Flp-In 세포 (독일 다름스타트 소재의 인비트로겐(Invitrogen))를 FGF-21 수용체 자가인산화 ICW 검정에 사용하였다 (문헌[Aguilar et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965]). MAP 키나제 ERK1/2의 수용체 자가인산화 수준 또는 다운스트림 활성화를 결정하기 위해, 2×10⁴ 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하고 48시간 동안 성장시켰다. 세포를 무혈청 배지(Ham's F-12 Nutrient Mix with GlutaMAX, Gibco, Darmstadt, Germany)로 3~4시간 동안 혈청 고갈시켰다. 이어서 세포를 증가하는 농도의 G-FGF21(서열번호 252) 또는 지시된 융합 단백질로 37℃에서 5분 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 배지를 버리고 세포를 20분 동안 새로 준비한 3.7% 파라-포름알데히드에 고정시켰다. 세포를 PBS 중 0.1% Triton-X-100으로 20분 동안 투과시켰다. 실온에서 2시간 동안 Odyssey 차단 완충액(LICOR, Bad Homburg, Germany)을 사용하여 차단을 수행하였다. 일차 항체로서, 항-pFGFR Tyr653/654 (독일 프랑크푸르트 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 또는 항-pERK 포스포-p44/42 MAP 키나아제 Thr202/Tyr204 (셀 시그널링(Cell Signaling))를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 일차 항체의 인큐베이션 후, 세포를 PBS + 0.1% 트윈20(Tween20)으로 세정하였다. 그런 다음 세포를 실온에서 1시간 동안 2차 항-마우스 800CW 항체(LICOR, Bad Homburg, Germany)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 다시 PBS + 0.1% Tween20으로 세정하였다. 염료 신호는 Odyssey 이미저(LICOR, Bad Homburg, Germany)로 정량화하였다. 결과를 TO-PRO3 염료 (독일 카를스루헤 소재의 인비트로겐)를 사용한 DNA의 정량화에 의해 정규화시켰다. 데이터를 임의 단위(arbitrary unit; AU)로 얻고, EC50 값을 용량-반응 곡선으로부터 얻었다(표 2 및 3에 요약되어 있음). 도 5은 인간 FGFR1c + KLB를 과발현하는 CHO 세포를 이용한 ICW로부터의 결과를 나타낸다.

[표 2]

[표 3]

실시예 4: 인간 글루카곤-유사-펩티드 1(GLP-1) 수용체 효능에 대한 시험관내 세포 검정

인간 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체에 대한 화합물의 효능작용을, 인간 GLP-1 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포주의 cAMP 반응을 측정하는 기능 검정에 의해 결정하였다.

재조합 HEK-293 세포는 37℃에서 배지(10% FBS가 포함된 DMEM)에 거의 합류할 때까지 배치된 T175 배양 플라스크에서 성장했으며, 1-5×10⁷ 세포/mL 농도의 10% DMSO를 함유하는 세포 배양 배지에서 2 mL 바이알에 수집하였다. 각 바이알에는 1.8 mL 세포 현탁액이 들어 있다. 바이알을 이소프로판올 챔버에서 80℃로 천천히 동결시킨 다음, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다.

사용하기 전에 냉동 세포를 37℃에서 빠르게 해동하고, 20 mL 세포 완충액(1× HBSS; 20 mM HEPES, 0.1% BSA으로 세척하고 900 rpm에서 5분 동안 원심분리했다. 세포를 분석 완충액(세포 완충액 + 2 mM IBMX)에 재현탁하고 1×10⁶ 세포/mL의 세포 밀도로 조정했다. 측정을 위해, 5 μL 세포 현탁액(최종 5×10³ 세포/웰)과 5 μL의 시험 화합물을 384-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. Bachem (Bubendorf, Switzerland, H-6795)의 인간 GLP-1(7-36) 아미드(서열번호 260)를 대조군으로 취하였다. 세포의 cAMP 함량을 균일 시간 분해 형광(HTRF)에 기초하여, Cisbio Corp.(카탈로그 번호 62AM4PEC)으로부터의 키트를 사용하여 결정하였다. 용해 완충제(키트 구성요소) 중에 희석시킨 HTRF 시약의 첨가 후에, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 665/620 ㎚에서 형광비를 측정하였다. 효능제의 시험관 내 효력을 최대 반응의 50% 활성화를 야기한 농도 (EC50)의 결정에 의해 정량화하였다.

결과는 표 4에 요약되어 있으며, 용량-반응 곡선은 도 6에 나타나 있다.

[표 4]

실시예 5: GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질의 구조 및 열 안정성 분석

GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질 using a UNit(Unchained Labs, CA, USA)를 사용하여 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질에 대해 구조적 안정성 및 응집 경향을 동시에 측정하였다. Unit은 단백질의 풀림을 감지하기 위해 단백질의 고유 형광 분석과 결합하고, 응집 거동을 조사하기 위해 정적 광 산란(SLS) 측정과 결합하였다.

pH 7.4의 인산염 완충액에 제형화된 5 mg/mL 농도의 융합 단백질에 대한 데이터를 획득했다. 각 샘플의 9 μL 부피를 UNi 모세관 홀더에 넣고 UNit에서 3회 분석했다. 온도는 0.3℃/분의 일정한 선형 속도로 20에서 95℃로 증가하였다. 용융 온도(Tm) 및 응집 시작 온도(Tagg)를 얻기 위해 적용된 온도에 대해 266 nm 레이저로 검출된 고유 형광 및 SLS 신호를 나타내는 BaryCentric Mean(BCM)을 플롯했다. 데이터는 UNit 분석 소프트웨어 v. 2.1을 사용하여 분석되었으며, 표 5에 요약되어 있다.

또한, 일부 단백질의 경우, 시차 주사 형광측정법(DSF 또는 ThermoFluor™) 분석을 모방하여 열안정성을 분석하기 위해 열 이동 검정을 적용했다(문헌[Ahmad S. et al. (2012) Protein Science 21: 433-446]; 문헌[Pantoliano et al. (2001) J. Biomol. Screen 6: 429-440]; 문헌[Niesen et al. (2007) Nat. Protoc. 2: 2212-21]). 이 분석법은 소수성 형광 염료, 예컨대 사이프로(Sypro)™ 오렌지(Orange) (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 카탈로그 번호 S6651)가 단백질 상의 소수성 패치(patch)에 결합할 때 형광을 증가시킨다는 관찰을 기반으로 한다. 그러한 소수성 패치는 가열시에 폴딩해제될 때 단백질에서 노출되어서, 형광의 증가는 폴딩 해제 정도에 대한 척도로서, 그리고 그에 따라 단백질의 열안정성의 척도로서 이용될 수 있다.

PBS (깁코) 중 각 단백질의 용액을 사이프로™오렌지의 160x 용액 (공급자에 의해 제공된 5000X DMSO 스톡으로부터 물에 희석됨)과 혼합함으로써 단백질을 테스트하였다. 샘플 부피를 PBS를 이용하여 20 μL까지 조정하였다. 전형적인 조건은 최종 혼합물 중 0.8 mg/mL의 단백질 및 8x 사이프로™오렌지를 포함하지만, 단백질 농도는 0.4 mg/mL과 1.2 mg/mL 사이에서 변할 수 있었다. 샘플을 96웰 PCR 플레이트 (바이오라드 세미-스커트(BioRad Semi-Skirt) 96 화이트(white))에 분배하고, 짧게 원심분리하여 기포를 제거하였다. 플레이트를 바이오라드 iQ5 실시간 PCR 기기 내에 넣고, 1℃/분의 램프 속도(ramp speed)에서 10℃로부터 90℃까지의 열구배를 가하였다. 여기 및 형광의 정량화를 위하여, 485 nm 및 575 nm의 파장을 위한 필터를 선택하였다. 바이오라드 iQ5 스탠다드 에디션(Standard Edition) 소프트웨어 (v. 2.0.148.60623)를 데이터 처리에 사용하였다. 온도에 대한 형광 강도의 곡선에서, 변곡점을 용융 온도 (Tm)의 척도로서 선택하였다.

[표 5]

실시예 6: 마우스 및 비-인간 영장류에서의 약동학

GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질의 혈장 농도 및 약동학적 매개변수는 세 가지 다른 방법을 사용하여 암컷 C57Bl/6 마우스 또는 수컷 사이노몰구스 원숭이에게 용액 중 0.3 mg/kg의 단회 피하 투여 후 결정되었다. 투여 후 30분 내지 168시간 시점에서 혈액 샘플을 얻었다.

a.) GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질의 온전한 FGF21 부분의 정량화를 위한 생체분석 스크리닝 방법

ELISA 키트(F1231-K01, Eagle Biosciences, USA)를 사용하여 융합 단백질의 온전한 FGF21 부분에 대해 혈장 샘플을 분석하였다. 검정은 인간 온전한 FGF21의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 선택된 항체로 2-부위 샌드위치 기술을 활용했다. 항체 중 하나는 인간 FGF21의 N-말단 아미노산(aa 29-35)에 특이적으로 결합하고, 다른 항체는 인간 FGF21의 C-말단(aa 203-209)에 특이적으로 결합한다. 검정 표준, 대조군 및 미지의 샘플을 항-인간 FGF21(aa 29-35)-특이적 항체로 코팅된 마이크로플레이트의 웰에 직접 첨가하였다. 동시에, 항-인간 FGF21(aa 203-209)-특이적 항체가 접합된 홀스래디쉬 퍼옥시다제를 각 웰에 첨가하였다. 첫 번째 인큐베이션 기간 후, 마이크로타이터 웰의 벽에 있는 항체는 샘플에서 인간 FGF21을 포획하고 각 마이크로타이터 웰의 결합되지 않은 단백질을 세정해 버렸다. "항-FGF21 항체-인간 온전한 FGF21-HRP 접합된 추적자 항체"의 "샌드위치"가 형성되었다. 결합되지 않은 추적자 항체는 후속 세정 단계에서 제거되었다. 면역복합체의 검출을 위해, 웰을 기질 용액과 함께 일정 반응 시간 동안 인큐베이션한 후 분광 광도계 마이크로플레이트 판독기에서 측정하였다. 마이크로타이터 웰의 벽에서 인간 온전한 FGF21에 결합된 면역복합체의 효소 활성은 샘플 내 온전한 FGF21의 양에 정비례했다.

b.) 온전한 전장 융합 단백질의 정량화를 위한 생체분석 스크리닝 방법

혈장 내 전장 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질의 농도는 ELISA 방법을 이용하여 결정하였다. 융합 단백질의 N-말단은 마우스 단클론 항-GLP1 항체(Mesoscale Discovery, MSD)에 의해 포획되었다. 실온(RT)에서 1시간 동안 150 μL의 Blocker A(MSD)로 플레이트를 차단하고, 부드러운 진탕과 300 μL 세척 완충액으로 3회 세정한 후 50 μL의 희석된 혈장 샘플(표준 및 PK 연구 샘플)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 300 μL 세척 완충액으로 3회 세정한 후, 50 μL의 프라이머 검출 항체(C-말단 토끼 항-FGF21 항체, Pineda Antikφrper-Service, Berlin, Germany)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 300 μL 세척 완충액으로 3회 세척한 후, PBS-Tween 0.05%(PBS-T)에 희석된 25 μL 염소-항-토끼 항체(Sulfo-Tag 표지됨, MSD)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 300 μL PBS-T 로 3회 세척한 후 150 μL 리드 완충액을 웰에 추가했다.

c.) GLP-1 FGF21 Fc 융합 단백질의 온전한 GLP-1 부분의 정량화를 위한 생체분석 스크리닝 방법

GLP-1 ELISA 방법을 사용하여 융합 단백질의 온전한 GLP-1 부분에 대해 혈장 샘플을 분석하였다. ELISA 플레이트를 마우스 단클론 항-GLP-1 항체(Mesoscale Discovery, MSD)로 코팅하였다. 실온(RT)에서 1시간 동안 150 μL의 Blocker A(MSD)로 차단하고, 부드러운 진탕과 300 μL PBS-T로 3회 세정한 후 50 μL의 희석된 혈장 샘플(표준 및 PK 연구 샘플)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 300 μL PBS-T로 3회 세척한 후, PBS-T(Sulfo-Tag 표지됨, MSD)에 희석된(1/3,333) 염소 항-인간 IgG 25 μL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 300 μL PBS-T 로 3회 세척한 후, 150 μL 리드 완충액을 웰에 추가했다.

약동학적 파라미터를 비-구획 모델 및 선형 사다리꼴 보간 계산법을 이용하여 WinNonlin 6.4라는 프로그램으로 계산하였다. 결과는 표 6 뿐만 아니라 도 7 및 8에 제시되어 있다. 결과는 새로운 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질이 반감기가 최대 20~40시간인 ng/mL 범위에서 혈장 수준을 유지했음을 보여준다.

[표 6]

실시예 7: 뮤린 모델에서의 생체내 효능

a.) 다회 투여 식이-유도 비만(DIO) 마우스

12시간 명암 주기의 특정 병원균 부재 장벽 시설에 암컷 C57BL/6N Charles River 마우스를 군별로 수용시키고, 물과 표준 또는 고지방 식이(ssniff 조정 지방 식이 E15797)에 자유롭게 접근하도록 하였다. 고지방 식이를 20주 사전-공급한 후, 각 군이 비슷한 평균 체중을 나타내도록 마우스를 체중에 대해 처리군으로 나누었다(n = 8). 표준 식단(ssniff R/M-H, V1534-0)에 자유롭게 접근하도록 한 연령을 매치시킨 군을 표준 대조군으로 포함시켰다. 둘라글루티드 처리 군도 비교군으로 포함시켰다. 치료 시작하기 전에, 마우스에 비히클 용액을 피하(s.c.)주사하고, 3일 동안 체중을 측정하여 절차에 순응시켰다.

1) 사육된 암컷 DIO 마우스에서의 혈당에 대한 급성 효과: 각각 비히클(인산염 완충 용액) 또는 GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질(인산완충액에 용해됨)의 첫번째 투여(s.c.)직전에 최초 혈액 샘플을 수집한다. 투여량은 스톡 용액의 농도에 따라 5 또는 10 mL/kg이었다. 동물들은 실험 동안 물과 그의 상응하는 식단에 접근할 수 있었다. 혈당 수준을 t = 0시간, t = 1시간, t = 2시간, t = 3시간, t = 4시간, t = 6시간 및 t = 24시간에 측정하였다(방법: Accu-Check glucometer) 채혈은 마취 없이 꼬리 절개에 의해 수행하였다.

2) 암컷 DIO 마우스에서의 체중에 대한 만성 효과: 마우스를 4주 동안 비히클 또는 테스트 화합물로 가벼운 단계의 시작 시 아침에 매 8일마다 매주 1회 처리했다. 체중과 음식 섭취량을 매일 기록했다. 처리의 시작 2일 전 및 제26일에, 전체 지방 질량을 핵자기공명(NMR)에 의해 측정하였다.

체중과 음식 소비에 대한 융합 단백질의 효과는 각각 도 9 및 도 10에 도시되어 있다. 서열번호 8 또는 서열번호 7의 융합 단백질로 처리된 동물은 연구가 종료될 때 비히클 또는 둘라글루티드 처리된 동물보다 누적적으로 더 많은 음식을 소비했지만, 비히클 또는 둘라글루티드 처리된 동물보다 훨씬 더 많은 체중이 감소했다. 서열번호 7 및 서열번호 8의 두 분자의 GLP-1 수용체 활성 대 FGF21 모방 활성의 균형을 명확하게 입증하는데, 이는 체중 감소에 대한 이들의 효과가 구체화하기 위해 식품 소비를 억제할 필요가 없었기 때문이다.

b.) 섭식한 암컷 당뇨병 db/db 마우스에서 다중 피하 용량의 혈당-강하 효과

동물, 연구 설계(예비-투여 단계, 투여 단계), 약리학적 개입

암컷, 건강한, 마른 (BKS.Cg-(마른)/OlaHsd 또는 BKS.Cg-Dock7(m)+/+ Lepr(db)J) 및 당뇨병에 걸리기 쉬운, 비만 db/db(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/OlaHsd 또는 BKS.CG-m +/+ Lepr(db)/J) 마우스는 Envigo RMS Inc. 또는 Charles River Laboratories에서 주문했다. 모든 동물을 나무 조각 깔개가 있는 신발 상자 우리에 그룹으로 수용하고, 투약 단계 전 대략 2 내지 3주 동안 적응시켰다.

마우스는 12시간의 명암 사이클(밝은 시기 오전 04:00 ~ 오후 4:00), 20~26℃의 실내 온도 및 30~70%의 상대 습도를 포함하는 사육장 조건하에 수용하였다. 모든 동물은 Greenfield 시의 물과 Purina Fomulab Diet 5008에 자유롭게 접근할 수 있었다. 연구 시작시 마우스는 약 10~12주령이었다.

투여-전 단계(15일)

꼬리 클립을 통해 9일째에 HbA1c 및 혈당 측정을 위해 혈액을 수집했다. 혈당 농도는 AlphaTRAK 혈당계 확장 범위(코드 29 스트립)를 사용하여 측정하였다. 혈당계 측정은 다른 생활 활동 전에 수행하였으며, 2회 수행하였다. 값이 20 mg/dL(계산된 혈당계 값) 이상 차이가 나면, 세 번째 값을 기록하였다. 체질량 측정은 9일과 15일에 수집하였다. HbA1c 및 체질량 값은 블록 무작위화에 사용하였다. 블록 무작위화 결과에 따라 15일에 동물을 처리 그룹(n = 8/그룹) 및 새로운 케이지 및 케이지 동료(n = 4마리 동물/케이지)에 할당하였다. 마른 그룹은 연령에 맞는 건강한 참조 그룹으로 연구에 포함되었다.

용량 제형 및 투여

투여 단계 1일, 8일, 15일, 22일 및 27일에 1회 비히클(멸균 PBS), 둘라글루티드, 서열번호 8 또는 서열번호 7의 5 ml/kg의 피하 주사 부피로 동물을 처리하였다. 투약은 오전 10시에서 12시 사이에 완료되었으며, 각 개체의 가장 최근 기록된 체질량으로 조정되었다. Trulicity (둘라글루티드 펜)를 포함한 주사 용액은 적절한 농도를 달성하기 위해 스톡 용액 또는 Pen 제형에 멸균 PBS를 첨가하여 준비하였다.

투여 단계(36일)

1) 아침-급여된 동물들의 혈당 농도: 동물들은 실험 중에 물과 사료에 무제한으로 접근할 수 있었다. 혈당은 1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 27, 및 28일에 오전 10:00 내지 12:00 사이에 뿐만 아니라 2, 9, 16, 23, 및 28일에 투약 후 24시간에 다른 생활 활동 전에 측정하였다. 또한, 1일 및 22일에는 투약 후 1, 2, 3, 4, 6 및 24시간에 채혈하였다(도 11). 테일 클립을 통해 약 5 μL의 혈액을 수집하고, 확장된 범위(코드 29 스트립)의 AlphaTRAK 혈당계를 사용하여 혈당 측정을 두 번 수행했다. 값이 20 mg/dL(계산된 포도당 값) 이상 차이가 나면, 세 번째 값을 기록하였다. 곡선 아래 면적(AUC)을 표시된 대로 각 개체 및 시간에 대해 사다리꼴 방법으로 계산하였다.

2) HbA1c 분석: 사전-투여 단계의 9일째 및 투여 단계의 36일째에 테일 클립을 통해 혈액을 수집하였다. 혈액은 5 μL 무첨가 마이크로 모세관에 수집하였고, 용혈물이 들어 있는 원심분리관에 즉시 넣었다. 용혈액과 혈액이 섞이도록 튜브를 세게 흔든 후 로커(rocker)에 올려 혈액과 시약이 완전히 섞이도록 하였다. 연구 시작 시 및 연구 종료 후 혈장 HbA1c 수준이 도 12에 도시되어 있다.

통계학적 분석: 데이터는 평균 ± SEM로 표시되어 있다. 통계 분석을 위해, 당뇨병, 비만 db/db 비히클 마우스(n=8)를 당뇨병, 비만 db/db 시험 제품처리된 마우스(n=8)의 그룹과 비교함으로써, 일원분산분석(ANOVA) 및 다중 비교(Dunnett's 방법)를 수행하였다. 두 그룹의 평균값의 차이가 0.05보다 큰 경우, 통계적으로 유의한 차이가 있다고 간주되었다. 비-당뇨병, 마른-비히클 그룹 데이터는 도 11 및 12에 도시되어 있지만, 비-비만, 비-당뇨병 상태에 대한 참조 데이터세트로 제공되었다.

서열번호 8 또는 서열번호 7의 융합 단백질로 처리된 동물에서, 혈당 수준에 대한 저하 효과는 비히클 또는 둘라글루티드 처리된 동물에서보다 유의하게 컸다(도 11). 서열번호 8의 융합 단백질의 가장 높은 투여량은 치료 22일째에 측정된 거의 전체 24시간 혈당 프로필에 걸쳐 혈당 수준을 정상 비당뇨병 동물 수준으로 감소시키기까지 했다. 또한, 서열번호 8 또는 서열번호 7의 융합 단백질로 처리된 동물은 도 12에 나타낸 바와 같이 비히클 또는 둘라글루티드 처리된 동물보다 연구 종료 시 HbA1c 증가의 더 현저한 억제를 나타냈다.

c.) DIO-NASH 마우스 모델

동물 및 실험 설정

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대해 국제적으로 인정된 원칙을 준수했다.

5주령의 수컷 C57Bl/6J 마우스는 JanVier(JanVier labs, France)에서 얻었고 각 그룹은 12/12시간 암광 주기에서 케이지당 5마리의 동물을 수용했다. 실내 온도는 22℃ ± 1℃로, 50% ± 10% 습도로 조절하였다. 동물은 이전에 AMLN 식이로 기재된 고지방(트랜스 지방 18% 중 40%), 탄수화물 40%(과당 20%) 및 콜레스테롤 2%(D09100301, Research Diet, United States)(문헌[Clapper et al. (2013) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 305:G483-G495]), 또는 일반 설치류 먹이(Altromin 1324, Brogaarden, Denmark), 및 수돗물(기름기없는 식사, n = 10-12)을 자유롭게 섭취할 수 있었다. 26주 후, 기준선에서 개별 섬유증 및 지방증 병기의 조직학적 평가를 위해 간 생검을 수행했다.

생검 하루 전에 마우스를 엔로플록사진(Bayer, Germany)(5 mg/mL / 1 mL/kg)으로 전처리하였다. 생검 전에, 마우스를 100% 산소에서 이소플루란(2%~3%)으로 마취시켰다. 정중선에 작은 복부 절개가 이루어지고, 간의 왼쪽 측면 엽이 노출되었다. 간 조직(50~100 mg)의 원추형 웨지를 조직학을 위해 4% 파라포름알데히드에 고정된 엽의 원위 부분에서 절제했다. 이전에 Clapper 등이 설명한 생검 절차는 ERBE VIO 100C 전기수술 장치(ERBE, 미국)를 사용하는 양극성 응고에 의한 간 절단면의 전기 응고를 사용하여 개선되었다. 간을 복강으로 되돌리고 복벽을 봉합하고 피부를 스테이플로 고정했다. 카프로펜(Pfizer, United States)(5 mg/mL~0.01 mL/10 g) 및 엔로플록사진(5 mg/mL~1 mL/kg)을 수술 당시와 수술 후 1일 및 2일에 복강내 투여하였고, 수술 후 통증 완화 및 감염을 각각 제어하였다. 생검 절차 후, 동물을 단독 수용하고, 회복을 위해 3주 동안 AMLN 식이를 유지하였다. 10~12마리 동물의 연구 그룹으로의 계층화 및 무작위화는 기준선 간 생검에 의해 평가된 바와 같은 개별 질환 병기를 기반으로 했다.

그런 다음 동물을 50 mg/kg GLP-1RA/FGF21 Fc 융합 단백질, 0.6 mg/kg 둘라글루티드 또는 비히클(PBS)로 매주 1회 피하 주사하여 추가 8주 동안 AMLN 식이 또는 chow 식이로 처리했다. 이어서, 동물을 안락사시키고, 간 중량을 결정하고, 조직학적 및 생화학적 분석을 위해 간 조직을 수집하였다(도 13 참조).

조직학 평가 및 디지털 이미지 분석

기준선 간 생검 및 말단 샘플을 왼쪽 측면 엽(약 100 mg)에서 수집하고, 4% 파라포름알데히드에 밤새 고정했다. 간 조직을 파라핀 포매하고 절편화했다(두께3 μm). 간 형태와 섬유화를 평가하기 위해, 섹션을 각각 헤마톡실린과 에오신 및 시리우스 레드(Sirius Red)로 염색한 다음 Visiomorph 소프트웨어(Visiopharm, 덴마크)로 분석했다. 연구에 대해 맹검인 병리학자가 조직학적 평가 및 스코어링을 수행하였다. NAFLD 활성 점수(NAS)(지방증, 염증, 팽창 변성) 및 섬유증 단계는 문헌[Kleiner et al. (2005) Hepatology 41: 1313-1321]에 개략된 임상 기준을 사용하여 수행하였다. 데이터는 도 14 및 도 15에 두가지 다른 형식으로 표시된다.

서열번호 8의 융합단백질은 간 중량, 간 총 지질 함량, 간 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량 및 NAFLD 활성 점수에 대한 효과를 명확하게 나타내었으며, 이는 GLP-1 작용제 단독의 경우보다 우수하며, 후자는 둘라글루티드의 효과로 예시된다.

Claims

GLP-1R(글루카곤-유사 펩티드-1 수용체) 작용제 펩티드 및 인간 FGF21(섬유아세포 성장 인자 21)의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 융합 단백질로서,
GLP-1R 작용제 펩티드는 천연 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열에서 최대 약 15개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 천연 GLP-1(7-36)(서열번호 260)의 변이체이고;
인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 250 또는 서열번호 251의 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
(i) 치환 Q55C 및 P147C 또는 치환 Q55C 및 N149C, 및
(ii) G198 및/또는 P199의 치환 또는 결실을 포함하고,
여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 서열번호 250에 따르고;
여기서 GLP-1R 작용제 펩티드 및 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 L - Fc, Fc - L, L₁ - Fc - L₂및 Fc로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 포함하는 링커 분자를 통해 연결되며, 여기서 L, L₁ 및 L₂는 단일 아미노산 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, Fc는 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체인, 융합 단백질.
제1항에 있어서,
천연 GLP-1(7-36)의 GLP-1R 작용제 활성과 비교하여 약 9 내지 약 531배 감소된 GLP-1R 작용제 활성을 갖는, 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261 내지 565로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 GLP-1R 작용제 펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하고,
H-G-E-G-T-F-T-S-D-X₁₀-S-K-Q-L-E-E-E-X₁₈-V-X₂₀-L-F-I-E-W-L-K-A-X₂₉-G (서열번호 4079),
[식에서,
X₁₀은 K 또는 L이고,
X₁₈은 A 또는 R이고,
X₂₀은 R 또는 Q이고,
X₂₉는 G 또는 T이고;
선택적으로, 아미노산 서열은 적어도 하나의 추가 아미노산 잔기를 N-말단에 추가로 포함하고;
선택적으로, 아미노산 서열은 최대 약 12, 약 11 또는 약 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연장부를 C-말단에 추가로 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 GLP-1R 작용제 펩티드는 서열번호 261 또는 262의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 결실된 G198R, G198K, G198Y 및 P199로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 결실을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 FGF21의 기능적으로 활성인 변이체는 서열번호 253, 254, 255 및 256으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 변이체는 서열번호 257, 258 및 259로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
서열번호 1-8, 18-31, 39, 40, 42-72, 74, 76, 78-84, 88-90, 92-97, 100-102, 105-109, 112, 113, 115, 116, 118, 120-124, 126-130, 132-136, 139, 142-148, 150-153, 155-158, 161-172, 174-177, 180-188, 190, 192-209, 211, 212, 216, 217 및 219-229로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질, 또는 서열번호 1-8, 18-31, 39, 40, 42-72, 74, 76, 78-84, 88-90, 92-97, 100-102, 105-109, 112, 113, 115, 116, 118, 120-124, 126-130, 132-136, 139, 142-148, 150-153, 155-158, 161-172, 174-177, 180-188, 190, 192-209, 211, 212, 216, 217 및 219-229로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이의 기능적으로 활성인 변이체.
서열번호 2, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질, 또는 서열번호 2, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이의 기능적으로 활성인 변이체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 GLP-1R을 안정하게 발현하는 세포의 cAMP 반응을 측정하여 결정할 때 약 15 pmol/L 내지 약 400 pmol/L, 또는 약 20 pmol/L 내지 약 400 pmol/L, 또는 약 50 pmol/L 내지 약 400 pmol/L, 또는 약 100 pmol/L 내지 약 400 pmol/L의 EC50으로 인간 GLP-1R을 활성화하는, 융합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 (i) 약 250 nmol/L 이하, 또는 약 200 nmol/L 이하, 또는 약 150 nmol/L 이하, 또는 약 100 nmol/L 이하, 또는 약 75 nmol/L 이하, 또는 약 50 nmol/L 이하의 EC50으로 인간 FGF 수용체 1c(FGFR1c)의 자가인산화; 및/또는 (ii) 약 100 nmol/L 이하, 또는 약 75 nmol/L 이하, 또는 약 50 nmol/L 이하, 또는 약 25 nmol/L 이하, 또는 약 20 nmol/L 이하, 또는 약 15 nmol/L 이하, 또는 약 10 nmol/L 이하의 EC50으로 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도할 수 있는, 융합 단백질.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
제13항에 따른 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제13항에 따른 핵산 분자 또는 제14항에 따른 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제13항에 따른 핵산 분자, 제14항에 따른 숙주 세포 또는 제15항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제13항에 따른 핵산 분자, 제14항에 따른 숙주 세포 또는 제15항에 따른 약제학적 조성물.
비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제13항에 따른 핵산 분자, 제14항에 따른 숙주 세포 또는 제15항에 따른 약제학적 조성물.
제18항에 있어서,
상기 진성 당뇨병이 1형 진성 당뇨병 또는 2형 진성 당뇨병인, 융합 단백질, 핵산 분자, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물.