KR20230034331A - 항-염증성 조성물, 이의 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 마누카 꿀은 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 예이다. 당해 조성물은 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 데 유용하다. 이러한 질병은 염증, 통증, 궤양, 크론병, 역류, 치은염, 정신분열증, 신경퇴행성 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 관절염, 심혈관 질환 및 암을 포함한다.
Description
본 발명은 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물, 염증의 예방, 개선 또는 치료 및/또는 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 관련 질병, 예를 들어, 염증, 예컨대, 위장관의 염증과 관련된 질병 및/또는 위장관과 관련된 염증성 질병의 예방, 개선 또는 치료에서의 이의 방법 및 용도에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 뉴질랜드 특허 출원 제765957호 및 PCT 국제 특허 출원 제PCT/NZ2020/050065호로부터 우선권을 주장하며, 상기 특허는 본원에 참조로 포함된다.
면역계와 관련된 염증은 유익할 수 있지만, 항상 그러한 것은 아니다. 흔히 이는 특히 위장계의 맥락에서 부정적인 반응 또는 피해야 할 반응으로 여겨진다.
염증은 광범위한 위장 장애와 결부되어 있다. 건강한 내장에서, 장 점막은 친-염증성 및 항-염증성 사이토카인 및 세포의 복잡한 균형에 의해 조절되는 통제된 반응 상태에 있다. 이러한 균형의 파괴는 면역/비-면역 반응의 지속적인 활성화로 귀결되고, 이는 활성 염증 및 조직 파괴를 초래할 수 있다. 염증을 충분히 예방하거나 해결하지 못하는 것은 위궤양, 염증성 장 질환(IBD), 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하여 여러 위장관 질환의 병인과 결부되어 있다.
치료의 중증도, 정도 및 의학적 목표에 따라, 설파살라진, 메살라진, 코르티코스테로이드 및 메토트렉세이트와 같은 염증성 질병에 대한 통상적인 의약은 주로 면역 및 염증 반응을 조정하는 데 사용된다. 염증성 질병에 대한 현재의 의학적 접근법에서 직면하게 되는 안전성과 효능 둘 모두의 한계로 인해 보다 우수하고 보다 안전한 대안적인 치료제에 대한 연구가 계속 추진되고 있다. 또한 보다 전반적으로, 소비자는 자신의 건강과 웰빙을 보조하는 천연 방법을 찾고 있다.
염증의 특정 원인은 아직 많은 질환에서 확인되지 않았지만, 장 점막계의 사이토카인 활성화가 내장 염증성 질환에서 염증을 조정하기 위한 주요 표적이다. 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 야누스 키나제(JAK) 및 트랜스글루타미나제2(TG2)는 모든 IBD 및 다수의 다른 염증성 질환과 연관성이 있는 것으로 알려져 있다.
위궤양은 또 다른 흔한 염증-관련 위장관 장애이다. 위궤양은, 점막 근육판을 지나 내장벽 깊숙이 침투하여 급성 및 만성 염증 세포 침윤물로 둘러싸인 크레이터(crater)를 형성하는 양성 점막 병변이다. 다수 연구에 따르면, 위궤양의 주요 위험 요인은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염, 흡연, 아스피린/비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID) 사용, 알코올 남용 및 스트레스를 포함하는 것으로 보고되어 있다.
COX-2는 친염증성 효소로 알려져 있으며, 여러 염증성 및 통증 관련 질병의 조절에 중요한 역할을 한다. COX-2 과발현은 뇌 저산소증/허혈 및 발작과 같은 여러 질병뿐만 아니라 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 염증성 만성 질환에서 신경독성과 관련이 있다(Minghetti, L (2007); Minghetti (2004)). COX-2는 또한 장 면역 반응의 조절에서 중요한 역할을 한다. 전형적으로, 친염증성 효소로 간주되어, COX-2는 IBD 환자의 염증 조직에서 상향조절되는 것으로 또한 오랫동안 인식되어 왔다.
JAK 및 세포내 전사 인자 패밀리 - 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) -를 조합하여 'JAK-STAT' 경로의 활성화를 통해 많은 사이토카인 기능을 발휘한다. 새로운 약물 표적 중에서, JAK 억제제는 임상 시험에서 유리한 안전성 프로파일과 함께 효능을 입증한 유망한 새로운 부류의 약물이다. 토파시티닙은 궤양성 대장염의 치료를 위해 승인된 최초의 JAK 억제제이다.
TG2는 단백질에서 글루타민 잔기의 폴리아민화를 촉매작용하는 칼슘-의존성 효소이다. TG2는 IBD, 및 셀리악병 및 패혈증을 포함하는 많은 다른 염증성 질환과 관련이 있다. TG2는 또한 조직 손상, 염증 또는 저산소증으로 인한 산화 스트레스에 의해 활성화된다. TG2는 염증을 유발하는 역할을 한다.
위궤양에 대한 통상적인 치료는 오메프라졸 및 라니티딘과 같은 약을 이용한 약학적 관리를 포함한다. 이러한 약은 골수억제 및 비정상적인 심장 박동과 같은 심각한 부작용을 가질 수 있으며, 높은 재발률을 갖는 것으로 알려져 있다.
따라서, 염증, 통증 및/또는 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 관련 질병을 치료하는 데 사용하기 위한 다른 항염증제 및 진통제, 예를 들어, 위장 염증을 치료하는 데 사용하기 위한 항염증제 및 진통제를 찾는 것이 관심을 받고 있다.
꿀은 이의 항균 활성으로 잘 알려져 있다. 또한 꿀은 항-염증 활성을 지닌다는 것이 당분야에 제안되어 있지만, 그 이유는 잘 특성규명되지 않았다. 본원에 참조로 포함되는 한 가지 특허 공개 제WO2015/030609호에는 꿀의 특정 분획의 항-염증 활성이 연구되어 있다. 상기 간행물에는 꿀로부터의 저분자량 분획이 항-염증 효과를 일반화하였고, 면역-자극 효과가 없다고 교시되어 있다. 이는 특정 항-염증 작용을 논의하고 있지 않다.
위장관과 관련된 염증성 질병을 포함하는 염증성 질병을 치료하는 대안적인 방법을 제공하는 것이 유용할 것임이 상기로부터 인지될 것이다.
본 발명의 목적은 위장관과 관련된 염증성 질병을 포함하는 염증성 질병을 치료하는 방법을 제공하고/하거나, 상술된 문제 중 하나 이상을 해결하고/해결하거나, 적어도 유용한 선택을 대중에게 제공하는 것이다.
생산물들, 조성물들, 방법들 및 용도들의 추가 양태 및 이점은 단지 예로서 주어지는 후속 설명으로부터 명백해질 것이다.
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물, 및 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 관련 질병, 위장관의 염증, 위장관과 관련된 염증성 질병, 및/또는 통증의 예방, 개선 또는 치료를 위해 이를 사용하는 방법이 본원에 기재된다.
본 발명자들은 꿀로부터의 프테리딘인 3,6,7-트리메틸루마진이 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 화합물을 단리하고 항-염증 및 COX-2, TG2 및/또는 JAK 억제 활성을 특성규명할 수 있는 것은 염증성 질병 및 통증을 포함하여 TG2, JAK, 및/또는 COX-2와 관련된 질병, 예를 들어, 위장관과 관련된 염증 및 통증의 치료, 예방 및 개선을 포함하는 다양한 용도를 위한 의약을 생산하는 능력을 제공한다.
첫 번째 특정 양태에서, 본 발명은 대상체에서 COX-2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 염증성 질병이다. 일 구현예에서, 염증성 질병은 위장관의 염증과 관련된다.
첫 번째 양태의 일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양, 소화성 궤양, 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병, 조현병, 양극성 기분 장애, 신경퇴행성 장애, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 신경계 장애, 파킨슨병, 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 만성 염증, 심혈관 질환, 통증, 암, 결장직장암(CRC) 및 근골격계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
첫 번째 양태의 일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 통증이다. 일 구현예에서, 통증은 급성 통증, 만성 통증 및/또는 월경통이다.
두 번째 특정 양태에서, 본 발명은 대상체에서 COX-2 관련 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 염증은 대상체의 위장관과 관련된다.
세 번째 특정 양태에서, 본 발명은 대상체에서 COX-2 관련 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 TG2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, TG2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. TG2는 또한 상처 치유에서 역할을 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 JAK 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, JAK 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 기원은 렙토스페르뭄(Leptospermum)으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움(Leptospermum scoparium), 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움(Leptospermum polygalifolium), 렙토스페르뭄 수브테누에(Leptospermum subtenue), 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 스코파리움으로부터 유래된다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 기원은 꿀이다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원의 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원의 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움(마누카로도 지칭됨)으로부터의 꽃 기원의 꿀을 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움(마누카로도 지칭됨)으로부터의 꽃 기원이다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속 식물의 꽃, 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질로부터 직접적으로 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀로 이루어진다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀 추출물을 포함한다. 상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀 추출물을 포함하고, 여기서 꿀 추출물은 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀 추출물로 이루어지고, 여기서 꿀 추출물은 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀 추출물은 추출물이 유래된 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원의 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원의 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움으로부터의 꽃 기원의 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 추가로 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 추가로 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 꿀은 미가공 꿀, 열-처리 꿀 또는 저온살균 꿀이다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 조성물은 꿀로부터 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 꿀을 고상 추출, 이어서 순상 플래쉬 크로마토그래피 및 분취용 박층 크로마토그래피로 처리함으로써 단리된다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 합성이다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 추가로 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 450 약 500 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖, 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖ 내지 90 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖ 내지 350 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖, 약 450 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 약 500 ㎍/㎖ 내지 550 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖ 내지 600 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖ 내지 650 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖ 내지 700 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖ 내지 850 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖ 내지 900 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖ 내지 950 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏ 내지 45 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏ 내지 55 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏ 내지 70 ㎎/㎏ 또는 약 70 ㎎/㎏ 내지 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏ 내지 300 ㎎/㎏, 약 300 ㎎/㎏ 내지 350 ㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏ 내지 400 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏ 내지 450 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏ 내지 550 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏ 내지 600 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏ 내지 650 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏ 내지 700 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏ 내지 750 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏ 내지 800 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏ 내지 850 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏ 내지 900 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏ 내지 950 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏ 내지 1000 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏ 내지 1100 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏ 내지 1200 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏ 내지 1300 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏ 내지 1400 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏ 내지 1500 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏ 내지 1600 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏ 내지 1700 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏ 내지 1800 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏ 내지 1900 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏ 내지 2000 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏ 내지 2100 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏ 내지 2200 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏ 내지 2300 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏ 내지 2400 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏ 내지 2500 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏ 내지 2600 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏ 내지 2700 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏ 내지 2800 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏ 내지 2900 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 의약, 치료 제품 또는 건강 보충제로서 제형화된다. 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 액체 제형, 캡슐, 츄어블 정제, 정제, 좌약, 일용 소비재, 정맥내 제제, 근육내 제제, 피하 제제, 용액, 식품, 음료, 식이 보충제, 화장품 제형, 겔, 로션, 분말 및 스프레이를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 전달 시스템으로 제형화될 수 있다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 방법은 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 일일 1 회, 2 회, 3 회, 4 회 또는 5 회 투여하는 단계를 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 방법은 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 주 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회 또는 7 회 투여하는 단계를 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 단회 용량으로서 또는 분할 용량으로서 투여된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 1 회, 2 회, 3 회 또는 4 회 개별 용량으로서 투여된다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 방법은 약 1 ㎎ 내지 약 3000 ㎎의 용량의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 방법은 약 1 ㎎, 10 ㎎, 20 ㎎, 30 ㎎, 40 ㎎, 50 ㎎, 60 ㎎, 70 ㎎, 80 ㎎, 90 ㎎, 100 ㎎, 150 ㎎, 200 ㎎, 250 ㎎, 300 ㎎, 350 ㎎, 400 ㎎, 450 ㎎, 500 ㎎, 550 ㎎, 600 ㎎, 650 ㎎, 700 ㎎, 750 ㎎, 800 ㎎, 850 ㎎, 900 ㎎, 950 ㎎, 1000 ㎎, 1100 ㎎, 1200 ㎎, 1300 ㎎, 1400 ㎎, 1500 ㎎, 1600 ㎎, 1700 ㎎, 1800 ㎎, 1900 ㎎, 2000 ㎎, 2100 ㎎, 2200 ㎎, 2300 ㎎, 2400 ㎎, 2500 ㎎, 2600 ㎎, 2700 ㎎, 2800 ㎎, 2900 ㎎, 또는 3000 ㎎의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 방법은 약 5 g 내지 약 100 g의 용량의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은
a. 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 제1 조성물을 선택하고;
b. 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 적어도 하나의 추가 조성물을 선택하고;
c. 제1 조성물을 제2 조성물과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 최종 조성물을 수득함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은
a. 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 제1 조성물을 선택하고;
b. 선택된 제1 조성물을
● 합성 3,6,7-트리메틸루마진;
● 단리된 3,6,7-트리메틸루마진;
● 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 꿀 추출물; 및/또는
● 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된 3,6,7-트리메틸루마진 중 하나 이상과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 조성물을 형성함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 조성물은 꿀, 꿀 추출물, 단리된 3,6,7-트리메틸루마진 및/또는 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 식물로부터 직접적으로 유래된 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속 식물의 꽃, 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질로부터 직접적으로 유래된다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏이다. 일 구현예에서, 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진이다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 크로마토그래피, 분석용 측정, 분광광도계 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 역상 HPLC에 의해 결정된다.
네 번째 특정 양태에서, 본 발명은 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물을 제조하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 꿀을 포함하는 제1 조성물을 시험하는 단계;
b. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 꿀을 포함하는 적어도 하나의 추가 조성물을 시험하는 단계;
c. 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀을 포함하는 조성물을 선택하는 단계;
d. 약 5 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀을 포함하는 적어도 하나의 추가 조성물을 선택하는 단계;
e. 꿀을 포함하는 선택된 조성물을 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
네 번째 양태의 일 구현예에서, 꿀을 포함하는 조성물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진의 농도를 갖는 경우 선택된다.
네 번째 양태의 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 크로마토그래피, 분석용 측정, 분광광도계 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 역상 HPLC에 의해 결정된다.
네 번째 양태의 일 구현예에서, 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물은 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 양태 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합하다.
다섯 번째 특정 양태에서, 본 발명은 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 것으로 조성물을 식별하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 조성물을 시험하고;
i. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 것으로 조성물을 식별하거나;
ii. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 미만의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖지 않는 것으로 조성물을 식별하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀 또는 꿀 추출물을 포함한다.
다섯 번째 양태의 일 구현예에서, 꿀을 포함하는 조성물은 조성물이 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏ 초과를 함유하는 경우 항-염증 활성을 갖는 것으로 결정된다.
다섯 번째 양태의 일 구현예에서, 조성물은 꿀 또는 꿀 추출물을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
다섯 번째 양태의 일 구현예에서, 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물은 첫 번째 양태 내지 세 번째 양태 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합하다.
여섯 번째 특정 양태에서, 본 발명은 임의의 첫 번째 양태 내지 세 번째 양태의 방법에 사용하기에 적합한 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물을 식별하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 조성물을 시험하고;
i. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 조성물을 임의의 첫 번째 양태 내지 세 번째 양태에 사용하기에 적합한 것으로 식별하거나;
ii. 조성물이 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 작은 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 조성물을 임의의 첫 번째 양태 내지 세 번째 양태에 사용하기에 적합하지 않은 것으로 식별하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
여섯 번째 양태의 일 구현예에서, 조성물은 조성물이 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 양태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합한 것으로 식별된다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀 또는 꿀 추출물을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 크로마토그래피, 분석용 측정, 분광광도계 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 역상 HPLC 시스템에 의해 결정된다.
일곱 번째 특정 양태에서, 본 발명은 첫 번째 양태 내지 세 번째 양태 중 어느 하나의 방법에 사용하기에 적합한 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 제공한다.
일곱 번째 양태의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 기원은 렙토스페르뭄으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 스코파리움으로부터 유래된다.
일곱 번째 양태의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 기원은 꿀이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움(마누카)으로부터의 꽃 기원이다.
일곱 번째 양태의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속 식물의 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질로부터 직접적으로 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
일곱 번째 양태의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀을 포함한다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀로 본질적으로 이루어진다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀로 이루어진다.
상기 양태들의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀 추출물로 구성된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀 추출물을 포함하고, 여기서 꿀 추출물은 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀 추출물로 본질적으로 이루어지고, 여기서 꿀 추출물은 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀 추출물로 이루어지고, 여기서 꿀 추출물은 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀 추출물은 추출물이 유래된 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 꿀은 미가공 꿀, 열-처리 꿀 또는 저온살균 꿀이다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀로부터 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 꿀을 고상 추출, 이어서 순상 플래쉬 크로마토그래피 및 분취용 박층 크로마토그래피로 처리함으로써 단리된다.
일 구현예에서, 조성물은 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 450 약 500 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖, 또는 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖ 내지 90 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖ 내지 350 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖, 약 450 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 약 500 ㎍/㎖ 내지 550 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖ 내지 600 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖ 내지 650 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖ 내지 700 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖ 내지 850 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖ 내지 900 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖ 내지 950 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 또는 약 10 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏, 또는 약 15 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 또는 약 20 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 또는 약 25 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 또는 약 30 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏, 또는 약 35 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 또는 약 40 ㎎/㎏ 내지 45 ㎎/㎏, 또는 약 45 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 또는 약 50 ㎎/㎏ 내지 55 ㎎/㎏, 또는 약 55 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏, 또는 약 60 ㎎/㎏ 내지 70 ㎎/㎏ 또는 약 70 ㎎/㎏ 내지 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏ 내지 300 ㎎/㎏, 약 300 ㎎/㎏ 내지 350 ㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏ 내지 400 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏ 내지 450 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏ 내지 550 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏ 내지 600 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏ 내지 650 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏ 내지 700 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏ 내지 750 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏ 내지 800 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏ 내지 850 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏ 내지 900 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏ 내지 950 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏ 내지 1000 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏ 내지 1100 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏ 내지 1200 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏ 내지 1300 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏ 내지 1400 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏ 내지 1500 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏ 내지 1600 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏ 내지 1700 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏ 내지 1800 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏ 내지 1900 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏ 내지 2000 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏ 내지 2100 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏ 내지 2200 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏ 내지 2300 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏ 내지 2400 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏ 내지 2500 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏ 내지 2600 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏ 내지 2700 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏ 내지 2800 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏ 내지 2900 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 의약, 치료 제품 또는 건강 보충제로서 제형화된다. 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 액체 제형, 일용 소비재, 캡슐, 츄어블 정제, 정제, 좌약, 정맥내 제제, 근육내 제제, 피하 제제, 용액, 식품, 음료, 식이 보충제, 화장품 제형, 겔, 로션, 분말 또는 스프레이를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 전달 시스템으로 제형화될 수 있다.
여덟 번째 특정 양태에서, 본 발명은 COX-2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
여덟 번째 양태의 일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양, 소화성 궤양, 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병, 조현병, 양극성 기분 장애, 신경퇴행성 장애, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 신경계 장애, 파킨슨병, 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 만성 염증, 심혈관 질환, 암, 통증, 결장직장암(CRC) 및 근골격계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
여덟 번째 양태의 일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 통증이다. 일 구현예에서, 통증은 급성 통증, 만성 통증 및 월경통이다.
아홉 번째 특정 양태에서, 본 발명은 COX-2 관련 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 염증은 위장관과 관련된다.
열 번째 특정 양태에서, 본 발명은 COX-2 관련 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 통증은 급성 통증, 만성 통증 및/또는 월경통이다.
열한 번째 특정 양태에서, 본 발명은 TG2 및/또는 JAK 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
열한 번째 양태의 일 구현예에서, TG2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증, 암 및 상처로 이루어진 군으로부터 선택된다.
열한 번째 양태의 일 구현예에서, JAK 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
열두 번째 특정 양태에서, 상기 양태 중 어느 하나의 방법, 용도 또는 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 COX-2 억제제를 추가로 포함한다.
열세 번째 특정 양태에서, COX-2 억제제의 공동-투여를 추가로 포함하는, 상기 양태 중 어느 하나의 방법 또는 용도가 제공된다. 상기 방법 및 용도의 이점은 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 공급원은 자연 발생적이고, 지속 가능한 기준으로 제조될 수 있다. 3,6,7-트리메틸루마진은 부작용을 가질 것으로 예상되지 않으며, 다양한 투여 방법을 위해 다양한 방식으로 제형화될 수 있다.
본 발명은 또한 광범위하게는, 개별적으로 또는 총괄적으로 본 출원의 명세서에 언급되거나 지시된 부분, 요소 및 특징, 및 상기 부분, 요소 및 특징 중 임의의 둘 이상의 임의의 또는 모든 조합으로 이루어진다고 할 수 있고, 본 발명이 관련된 분야에서 공지된 등가물을 갖는 특정 정수가 본원에서 언급되는 경우, 이러한 공지된 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본원에 포함되는 것으로 간주된다.
본 발명의 모든 신규한 양태에서 고려되어야 하는 본 발명의 추가 양태는 본 발명의 실제 적용의 적어도 하나의 예를 제공하는 하기 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 구현예는 이제 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 기술될 것이다.
도 1은 10 분 동안 MMP-9 활성에 의해 생성된 형광 강도를 예시하는 그래프이다.
도 2는 2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖ 범위의 3,6,7-트리메틸루마진으로부터 MMP-9 활성의 억제 백분율을 예시하는 그래프이다.
도 3은 3,6,7-트리메틸루마진 농도와 MMP-9 억제 사이의 상관관계를 예시하는 그래프이다.
도 4는 120 분에 걸쳐 412 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 MMP-9 활성을 예시하는 그래프이다.
도 5는 MMP-9의 활성에 대한 3,6,7-트리메틸루마진에 의한 억제 백분율을 예시하는 그래프이다.
도 6은 20 분 동안 3,6,7-트리메틸루마진과 발색 기질(A) 또는 반응 생성물(B) 사이에 유의한 상호작용이 없다는 것을 예시하는 그래프이다.
도 7은 일반적인 현상 완충액(컬럼 3 내지 컬럼 5), 3,6,7-트리메틸루마진 보충 완충액(컬럼 6 내지 컬럼 8), 및 NNGH(컬럼 9 내지 컬럼 11)에서 인큐베이션된 겔을 보여주는 전형적인 젤라틴 겔 자이모그래피를 나타낸 것이다.
도 8은 젤라틴 자이모그래피를 이용한 3,6,7-트리메틸루마진으로부의 억제 백분율을 예시하는 그래프이다(n=5).
도 9는 3,6,7-트리메틸루마진이 MMP-9의 S'1 기질 결합 포켓에 도킹된 것을 예시한 것이다.
도 10은 소화 시간의 함수로서 4개의 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 위내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 11은 소화 시간의 함수로서 4개의 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 12는 소화 시간의 함수로서 4개의 50% 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 위내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 13은 소화 시간의 함수로서 4개의 50% 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 14은 소화 시간의 함수로서 순수한 3,6,7-트리메틸루마진의 위내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 15는 소화 시간의 함수로서 순수한 3,6,7-트리메틸루마진의 장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖n)의 양을 예시한 것이다.
도 16은 세포 생존율에 대한 3,6,7-트리메틸루마진(2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖)의 효과를 예시한 것이다.
도 17은 분화된 THP-1 세포에서 지질다당류(055:B5, 1 ㎍/㎖) 유도 기질 메탈로펩티다제 9(MMP-9) 분비에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 효과를 예시한 것이다(n=2 반복)(원시 값 기준).
도 18은 분화된 THP-1 세포에서 지질다당류(055:B5, 1 ㎍/㎖) 유도 기질 메탈로펩티다제 9(MMP-9) 분비에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 효과를 예시한 것이다(n=2 반복)(절대 값 기준).
도 19는 인간 JAK1의 결정 구조를 예시한다(PDB ID: 6N7A).
도 20은 본래의 포즈(녹색 및 B로 표시됨)와 비교하여 KEV의 도킹된 포즈(보라색 및 A로 표시됨)를 예시한다.
도 21은 공지된 활성물(녹색 및 A로 표시됨), 비활성물(적색 및 B로 표시됨) 및 3,6,7-트리메틸루마진(황색 및 C로 표시됨)에 대해 보고된 포즈의 골드스코어 및 켐스코어 분포를 예시한다.
도 22는 도 6N7A에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 최고 순위 도킹된 포즈를 예시한다.
도 23은 인간 트랜스글루타미나제 2(PDB ID: 1KV3)의 결정 구조를 예시한다.
도 24는 본래의 포즈(B)와 비교하여 GDP의 도킹된 포즈(보라색 및 A로 표시됨)를 예시한다.
도 25는 공지된 활성물(녹색 및 A로 표시됨), 비활성물(적색 및 B로 표시됨) 및 3,6,7-트리메틸루마진(황색 및 C로 표시됨)에 대해 보고된 포즈의 골드스코어 및 켐스코어 분포를 예시한다.
도 26은 1KV3에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 최고 순위 도킹된 포즈를 예시한다.
도 27은 덱사메타손(Dex), 인도메타신(Indo) 또는 3,6,7-트리메틸루마진(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)으로의 처리 및 LPS로의 공동-자극 후 THP-1 세포에 대한 WST-1 검정에 의해 평가된 바와 같은 세포 생존율 퍼센트를 예시하는 그래프이다.
도 28은 LPS 노출 및 덱사메타손, 인도메타신 또는 3,6,7-트리메틸루마진과 조합하여 LPS로의 공동-처리 후 단핵구에서 COX-2의 단백질 발현을 예시한다. 도 28의 A는 COX-2 단백질 발현에 대한 대표적인 웨스턴 블롯을 제공하고, 도 28B는 상이한 개입에 노출된 THP-1 세포에서 COX-2의 상대적 단백질 발현을 예시하는 그래프이다.
도 1은 10 분 동안 MMP-9 활성에 의해 생성된 형광 강도를 예시하는 그래프이다.
도 2는 2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖ 범위의 3,6,7-트리메틸루마진으로부터 MMP-9 활성의 억제 백분율을 예시하는 그래프이다.
도 3은 3,6,7-트리메틸루마진 농도와 MMP-9 억제 사이의 상관관계를 예시하는 그래프이다.
도 4는 120 분에 걸쳐 412 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 MMP-9 활성을 예시하는 그래프이다.
도 5는 MMP-9의 활성에 대한 3,6,7-트리메틸루마진에 의한 억제 백분율을 예시하는 그래프이다.
도 6은 20 분 동안 3,6,7-트리메틸루마진과 발색 기질(A) 또는 반응 생성물(B) 사이에 유의한 상호작용이 없다는 것을 예시하는 그래프이다.
도 7은 일반적인 현상 완충액(컬럼 3 내지 컬럼 5), 3,6,7-트리메틸루마진 보충 완충액(컬럼 6 내지 컬럼 8), 및 NNGH(컬럼 9 내지 컬럼 11)에서 인큐베이션된 겔을 보여주는 전형적인 젤라틴 겔 자이모그래피를 나타낸 것이다.
도 8은 젤라틴 자이모그래피를 이용한 3,6,7-트리메틸루마진으로부의 억제 백분율을 예시하는 그래프이다(n=5).
도 9는 3,6,7-트리메틸루마진이 MMP-9의 S'1 기질 결합 포켓에 도킹된 것을 예시한 것이다.
도 10은 소화 시간의 함수로서 4개의 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 위내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 11은 소화 시간의 함수로서 4개의 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 12는 소화 시간의 함수로서 4개의 50% 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 위내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 13은 소화 시간의 함수로서 4개의 50% 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 14은 소화 시간의 함수로서 순수한 3,6,7-트리메틸루마진의 위내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖)을 예시한 것이다.
도 15는 소화 시간의 함수로서 순수한 3,6,7-트리메틸루마진의 장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 양(ng/㎖n)의 양을 예시한 것이다.
도 16은 세포 생존율에 대한 3,6,7-트리메틸루마진(2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖)의 효과를 예시한 것이다.
도 17은 분화된 THP-1 세포에서 지질다당류(055:B5, 1 ㎍/㎖) 유도 기질 메탈로펩티다제 9(MMP-9) 분비에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 효과를 예시한 것이다(n=2 반복)(원시 값 기준).
도 18은 분화된 THP-1 세포에서 지질다당류(055:B5, 1 ㎍/㎖) 유도 기질 메탈로펩티다제 9(MMP-9) 분비에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 효과를 예시한 것이다(n=2 반복)(절대 값 기준).
도 19는 인간 JAK1의 결정 구조를 예시한다(PDB ID: 6N7A).
도 20은 본래의 포즈(녹색 및 B로 표시됨)와 비교하여 KEV의 도킹된 포즈(보라색 및 A로 표시됨)를 예시한다.
도 21은 공지된 활성물(녹색 및 A로 표시됨), 비활성물(적색 및 B로 표시됨) 및 3,6,7-트리메틸루마진(황색 및 C로 표시됨)에 대해 보고된 포즈의 골드스코어 및 켐스코어 분포를 예시한다.
도 22는 도 6N7A에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 최고 순위 도킹된 포즈를 예시한다.
도 23은 인간 트랜스글루타미나제 2(PDB ID: 1KV3)의 결정 구조를 예시한다.
도 24는 본래의 포즈(B)와 비교하여 GDP의 도킹된 포즈(보라색 및 A로 표시됨)를 예시한다.
도 25는 공지된 활성물(녹색 및 A로 표시됨), 비활성물(적색 및 B로 표시됨) 및 3,6,7-트리메틸루마진(황색 및 C로 표시됨)에 대해 보고된 포즈의 골드스코어 및 켐스코어 분포를 예시한다.
도 26은 1KV3에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 최고 순위 도킹된 포즈를 예시한다.
도 27은 덱사메타손(Dex), 인도메타신(Indo) 또는 3,6,7-트리메틸루마진(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)으로의 처리 및 LPS로의 공동-자극 후 THP-1 세포에 대한 WST-1 검정에 의해 평가된 바와 같은 세포 생존율 퍼센트를 예시하는 그래프이다.
도 28은 LPS 노출 및 덱사메타손, 인도메타신 또는 3,6,7-트리메틸루마진과 조합하여 LPS로의 공동-처리 후 단핵구에서 COX-2의 단백질 발현을 예시한다. 도 28의 A는 COX-2 단백질 발현에 대한 대표적인 웨스턴 블롯을 제공하고, 도 28B는 상이한 개입에 노출된 THP-1 세포에서 COX-2의 상대적 단백질 발현을 예시하는 그래프이다.
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물, 염증, 통증 및/또는 염증성 질병, 특히, 염증, 통증 또는 염증성 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 방법, 및 용도가 본원에 기재된다.
정의
본 명세서의 목적 상, 본 명세서에서 사용되는 용어 "~을 포함하는(comprising)"은 "~의 전부 또는 적어도 일부로 이루어진("consisting in whole or at least in part of)"을 의미한다. 해당 용어를 포함하는 본 명세서의 진술을 해석할 때, 각 진술에서 그러한 용어로 시작되는 특징은 모두 존재할 필요가 있지만, 다른 특징도 존재할 수 있다. "~들은 포함하다(comprise)", ~은 포함하다(comprises), 및 "포함된(comprised)"과 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다.
용어 "약" 또는 "대략" 및 이의 문법적 변형은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%만큼 변하는 정량, 수준, 정도, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다.
용어 "의약" 또는 이의 문법적 변형은 의료용 제품을 지칭한다. 의료용 제품은 액체 제형, 캡슐, 정제, 츄어블 정제, 겔, 로션, 분말, 일용 소비재, 좌약, 화장품 제형, 스프레이 제제, 식품 제제, 음료, 정맥내 제제, 근육내 제제, 피하 제제, 및 용액을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "치료용 제품" 또는 이의 문법적 변형은 건강의 보조, 치유 또는 회복에 도움이 되는 제품을 지칭한다. 상기 제품은 일용 소비재, 액체 제형, 캡슐, 정제, 츄어블 정제, 겔, 로션, 분말 좌약, 스프레이 제제, 식품 제제, 음료, 화장품 제형, 정맥내 제제, 근육내 제제, 피하 제제 및 용액을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "염증성 질병"은 원치 않는 및/또는 비정상적인 염증과 관련된 질병 또는 장애를 의미한다.
용어 "염증"은 감염, 자극, 상해, 질환, 질병 또는 기타 원인의 결과로서 발적, 온기, 부종 및/또는 통증을 일으키는 신체 반응을 의미한다. 염증은 또한 세포 수준에서 특성규명될 수 있다. 세포 염증은 사이토카인, 케모카인 또는 반응성 질소 및 산소 종과 같은 다양한 염증 매개체의 생성에 의해 특성규명될 수 있다.
용어 "항-염증성" 또는 이의 문법적 변형은 항-염증성 화합물 또는 화합물들이 첨가되지 않은 지속 기간, 등급 또는 상황과 비교할 때, 사이토카인, 케모카인, 반응성 질소 및 산소 종과 관련된 염증의 예방, 완화, 약화, 진정, 억제 또는 감소를 지칭한다. 이는 또한 발적, 열감, 부종 및/또는 통증이 감소되는 경우 염증이 예방, 완화, 약화, 진정 또는 억제되는 것을 지칭하며, 감소된 양은 항-염증성 화합물 또는 화합물들이 첨가되지 않은 지속 기간, 등급 또는 상황에 비한 것이다.
조성물 또는 의약의 양 또는 투여량과 관련하여 용어 "치료적으로 유효한"은 대상체에서 염증, 통증 또는 본원에 기재된 질병 중 하나를 효과적으로 예방하거나, 개선하거나, 제거하기에 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 이 용어는 제한적인 것으로 여겨지지 않아야 한다. 이는 요망되는 적용에 따라 대상체에 대한 효과, 예를 들어, 항-염증 효과를 최적화시키는 조성물 또는 의약의 투여량의 양을 지칭할 수 있다.
용어 "건강 보충제"는 대상체의 식이에 보충되도록 의도된 제품을 의미한다.
용어 "치료"는 이의 가장 넓은 맥락에서 고려되어야 한다. 이 용어는 대상체가 완전 회복될 때까지 치료받는다는 것을 반드시 암시하지는 않는다. 따라서, "치료"는 특정 질병의 증상 또는 중증도를 감소, 완화 또는 개선하는 것, 또는 특정 질병이 발생할 위험을 예방하거나 달리 감소시키는 것을 포함한다. 이는 또한 질병의 완전 또는 부분 관해 상태를 유지하거나 촉진하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "미가공 꿀"은 최소 열(예를 들어, <50℃) 처리를 거쳤거나 어떠한 열 처리도 거치지 않은 꿀을 의미한다.
용어 "표준화된 농도"는 소정의 농도 범위를 충족시키는 것으로 결정된 농도를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "및" 또는 "또는", 또는 이 둘 모두를 의미한다.
본원에서 사용되는 명사 뒤의 "(들)"은 명사의 복수 및/또는 단수 형태를 의미한다.
본원에 개시된 다양한 수(예를 들어, 1 내지 10)에 대한 언급은 또한 그러한 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 또한 그러한 범위 내의 임의의 범위의 유리수(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급을 포함하는 것으로 의도된다.
"대상체"는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 비-인간 동물의 비-제한적 예는 반려 동물(예를 들어, 고양이 및 개), 말, 및 가축, 예컨대, 소, 양 및 사슴이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 3,6,7-트리메틸루마진, 예를 들어, 꿀에서 발견되는 3,6,7-트리메틸루마진이 항-염증 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 놀랍게도 3,6,7-트리메틸루마진이 항-염증 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 3,6,7-트리메틸루마진이 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 3,6,7-트리메틸루마진의 활성 및 안정성을 특성규명할 수 있는 것은 특히 다양한 TG2, JAK 및/또는 COX-2 관련 질병 및 염증성 질병, 구체적으로, 위장관의 염증성 질병의 예방, 개선, 또는 치료를 포함하여, 염증의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 조성물을 생산하는 능력을 제공한다.
프테리딘은 피리미도[4,5-b]피라진 고리 구조를 기반으로 하는 화합물 그룹이다. 바이사이클릭 화합물은 다수의 살아 있는 유기체에 의해 자연적으로 생성되며 흔히 프테린으로 지칭된다. 프테리딘 및 프테리딘 유도체는 또한 합성으로 생산될 수 있다. 다수의 프테리딘 유도체는 핵산, 아미노산, 신경전달 물질, 일산화질소뿐만 아니라 퓨린 및 방향족 아미노산의 합성을 포함하여 효소 보조인자로서 필수 대사 역할을 한다.
3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 꿀로부터의 프테리딘 유도체이다. 3,6,7-트리메틸루마진의 단리, 구조적 설명 및 합성은 본원에 참조로 포함되는 동일한 출원인에 의해 출원된 뉴질랜드 특허 출원 번호 제722140호(NZ 722140)에서 이전에 기재된 바 있다.
염증은 광범위한 질환과 결부되어 있는 다인성 현상이다. 건강한 내장에서, 장 점막은 친-염증성 사이토카인(예를 들어, 종양 괴사 인자, TNF-α, 인터페론, IFN-γ, IL-1, IL-6) 및 항-염증성 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10)의 복잡한 균형에 의해 조절되는 제어 반응 상태에 있다. 이의 결함은 유전적, 미생물적 및 환경적 요인 사이에 수반되는 복잡한 상호작용을 촉진하여 결국 면역/비-면역 반응의 지속적인 활성화로 귀결되고, 이는 활성 염증 및 조직 파괴를 초래할 수 있다. 염증을 해결하지 못하는 것은 위궤양, 염증성 장 질환(IBD), 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 위장 염증 관련 질병의 병인과 결부되어 있다.
TG2, JAK, 및/또는 COX-2와 관련된 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양, 소화성 궤양, 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병, 조현병, 양극성 기분 장애, 신경퇴행성 장애, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 신경계 장애, 파킨슨병, 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 만성 염증, 심혈관 질환, 암, 통증, 결장직장암(CRC), 근골격계 질환, 상처, 자가면역 질병, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염, 피부 홍반 루푸스, 셀리악병, 헌팅턴병 및 섬유증과 같은 다양한 여러 질병을 포함한다.
MMP
염증에서 MMP의 주요 역할 중 하나는 물리적 장벽을 조절하는 것이다. 염증성 세포 이동은 세포간 접합을 분해하는 이의 능력으로 인해 MMP에 의해 촉진된다. 내피 접착성 접합의 몇 가지 주요 성분이 MMP의 기질로 확인되었다. 이들 세포 성분의 분해는 혈관 투과성을 증가시켜 염증 세포 및 혈장 단백질의 유입을 허용한다.
MMP-9(젤라티나제 B로도 알려짐)는 다수의 사이토카인 및 케모카인을 친-IL-1β 및 IL-8과 같은 보다 활성 형태로 단백질분해 처리할 수 있는 주요 친염증성 효소이다(Schonbeck et al., 1998; Van den Steen, Proost, Wuyts, Van Damme, & Opdenakker, 2000). 또한, MMP-9는 밀착 접합부에서 오클루딘을 분해하여 염증 세포 및 단백질의 유입을 촉진함으로써 상피 장벽 투과성을 조절할 수 있으며(Caron et al., 2005; Reijerkerk et al., 2006), 점막 손상 및 세포 리모델링을 초래하는 세포외 기질(ECM) 분해에 크게 관여하는 것으로 보고되었다(Swarnakar et al., 2007). MMP-9는 신경정신병(예컨대, 조현병, 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암 및 관절염을 포함하여 다수의 질병과 관련이 있다(Rybakowski 2009, Fingleton (2007), Reinhard, 2015).
MMP-9는 또한 위궤양의 발생 및 중증도와 매우 관련이 있다. 수많은 연구에서 위궤양화 과정 중에 MMP-9의 발현 및 활성이 상승된다는 것이 보고되었다(Pradeepkumar Singh, Kundu, Ganguly, Mishra, & Swarnakar, 2007; Swarnakar et al., 2005, 2007). 또한, 에탄올-유도 위궤양은 용량-, 시간- 및 중증도-의존적 방식으로 pro-MMP-9 활성의 상승과 관련이 있고, MMP-9가 위궤양의 재발에 대한 위험인자라는 것이 보고되었다(Li et al., 2013).
MMP-9의 발현 및 분비는 정상적인 건강한 조직에서 매우 낮다. 위궤양의 형성 동안, 산화 스트레스의 유도는 MMP-9의 분비를 강화시키고, 점막 손상을 초래한다(Ganguly & Swarnakar, 2012; Li et al., 2013). 따라서, MMP-9는 위궤양화의 예방 및 치유에서 알려진 치료 표적이다.
그러므로, MMP-9-관련 질병은 MMP-9의 발현이 증가한 질병이고, MMP-9의 발현 증가 또는 과발현이 있는 염증성 질병을 포함한다. 이러한 질병은 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 다른 MMP-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 하나의 특정 구현예에서, MMP-9 관련 염증성 질병은 위궤양 또는 위염이다. MMP-9 관련 질병은 또한, 예컨대, 신경정신병(예컨대, 조현병, 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암 및 관절염을 포함하여 다른 질병을 포함한다.
COX-2
COX-2는 친염증성 효소이고, 다수의 염증성 및 통증 관련 질병의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
COX-2와 신경-염증성 및 퇴행성 질환에서 이것이 하는 역할은 광범위하게 연구되어 왔다. COX-2 과발현은 뇌 저산소증/허혈 및 발작과 같은 다수의 질병뿐만 아니라 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 염증성 만성 질환에서 신경독성과 관련이 있었다(Minghetti, L (2007); Minghetti (2004)).
COX-2는 또한 장 면역 반응의 조절에서 중요한 역할을 한다. TLR(예컨대, TLR4)에 의해 장 내강에서 외래 작용제, 예를 들어, 박테리아 산물의 인식 시, COX-2 발현은 NF-κB와 같은 전사 인자에 의해 유도된다. COX-2 활성화는 NF-κB의 억제 및 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 γ(PPAR-γ)의 활성화를 통해 및 점막 장벽 기능의 변형에 의해 염증 과정에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 친염증성으로 간주되어, COX-2는 IBD 환자의 염증 조직에서 상향조절되는 것으로 또한 오랫동안 인식되어 왔다.
COX-2는 또한 암의 진행 및 발달과 관련이 있다. 예를 들어, 결장직장암(CRC) 환자에서 COX-2 발현은 대부분의 CRC 조직에서 발견되며, 좋지 않은 생존과 관련이 있다(Wang et al., (2010)).
상기로부터 인지될 바와 같이, COX-2 관련 질병은 COX-2의 발현 또는 과발현의 증가와 관련된 질병이다. 이러한 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머병), 신경계 장애, 예컨대, 파킨슨병 및/또는 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염(예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 및 강직성 척추염), 만성 염증, 심혈관 질환, 통증, 암(예컨대, 결장직장암(CRC)) 및 근골격계 질환을 포함한다.
상기로부터 인지될 바와 같이, COX-2 관련 질병은 또한 COX-2 관련 통증, 예를 들어, 급성 통증(예컨대, 신체 손상에 의해 초래된 통증), 만성 통증 및/또는 월경통(월경과 관련된 통증)일 수 있다. 통증은 또한 상기 COX-2 관련 질병 중 어느 하나와 관련된 통증일 수 있다.
JAK
JAK는 4개의 세포내 티로신 키나제의 패밀리이다: JAK1, JAK2, JAK3, 및 티로신 키나제 2(TYK2). JAK 및 7개의 세포내 전사 인자의 패밀리 - 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) -를 조합하여 'JAK-STAT' 경로의 활성화를 통해 많은 사이토카인 기능을 발휘한다. 사이토카인이 이의 수용체의 세포외 도메인에 결합한 후, JAK는 세포내 도메인에 결합하고 활성화한다. 이는 세포질내 STAT의 동원, 인산화 및 활성화를 초래하여, 이들이 핵으로 전위되고, 이어서 염증에 관여하는 다양한 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있게 한다. 현재의 치료적 관리 하에서, 상당수의 IBD 환자가 지속적인 관해를 달성하지 못한다. 새로운 약물 표적 중에서, JAK 억제제는 임상 시험에서 유리한 안전성 프로파일과 함께 효능을 입증한 유망한 새로운 부류의 약물이다. 토파시티닙은 궤양성 대장염의 치료를 위해 승인된 최초의 JAK 억제제이다.
상기로부터 인지될 바와 같이, JAK 관련 질병은 'JAK-STAT' 경로의 활성화와 관련된 질병이다. 이러한 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스를 포함한다.
TG2
TG2는 단백질에서 글루타민 잔기의 폴리아민화를 촉매작용하는 칼슘-의존성 효소이다. TG2는 IBD, 및 셀리악병 및 패혈증을 포함하는 많은 다른 염증성 질환과 연관된다. NF-kB는 TG2에 의해 활성화된 다음, 중합되고 이에 따라 이의 C-말단 글루타민 클러스터를 가교시킴으로써 이의 억제제인 IkBα를 불활성화시킨다. 전임상 연구에 따르면, TG2는 또한 PPARγ의 응집 및 기능적 격리를 통해 염증을 촉진할 수 있으며, 여기서 TG2의 특정 시험관내 억제가 PPARγ 및 염증성 사이토카인 수준을 회복시킬 수 있다는 것을 나타냈다. TG2는 또한 조직 손상, 염증 또는 저산소증으로 인한 산화 스트레스에 의해 활성화된다. 활성화 후, 단백질은 많은 단백질을 공유적으로 활성화시켜 세포 생존에 관여하는 세포 부착 분자, 사이토카인 및 다른 매개체의 조절을 야기한다. TG2는 염증을 유발하는 역할을 하므로 이의 활성을 하향 조절하는 것은 아마도 IBD의 치료에 유용할 것이다. 연구는 또한 이전에 IBD 환자의 혈청에서 유의하게 높은 수준의 트랜스글루타미나제2 항체를 보고한 바 있다.
상기로부터 인지될 바와 같이, TG2 관련 질병은 TG2의 발현 또는 과발현의 증가와 관련된 질병이다. 이러한 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증 및 암을 포함한다. TG2는 또한 상처 치유에서 역할을 한다.
상기로부터 인지될 바와 같이, COX-2는 염증, 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하고/치료하거나 염증 및/또는 통증과 관련된 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한, 특히, 위장관의 염증과 관련된 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 바람직한 표적이다. COX-2는 또한 COX-2와 관련된 다른 질병, 예컨대, 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머병), 신경계 장애, 예컨대, 파킨슨병 및/또는 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염(예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 및 강직성 척추염), 만성 염증, 심혈관 질환, 통증(예컨대, 급성 통증(예컨대, 신체적 손상에 의해 초래된 통증), 만성 통증 및/또는 월경통(월경과 관련된 통증)), 암(예컨대, 결장직장암(CRC)) 및 근골격계 질환을 치료하기 위한 바람직한 표적이다.
본 발명자들은 3,6,7-트리메틸루마진 및 이를 포함하는 조성물이 COX-2 억제 활성을 가지며, 따라서 COX-2 관련 질병, 예컨대, 염증 및/또는 통증과 관련된 질병의 예방, 개선 또는 치료의 방법에 유용하다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 놀랍게도, 3,6,7-트리메틸루마진이 COX-2의 발현을 억제한다는 것을 발견하였다. COX-2 억제 효과는 유의미하여 특히 염증 및 통증의 예방 및/또는 치료에서, 예를 들어, 위염 및 위궤양을 포함하는 위장 염증성 질환과 같은 염증성 질병의 치료에서 우수한 효능 및 잠재적으로 광범위한 적용 및 용도를 시사한다.
일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 염증성 질병이다. 일 구현예에서, 염증성 질병은 위장관의 염증과 관련된다. 일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머병), 신경계 장애, 예컨대, 파킨슨병 및/또는 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염(예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 및 강직성 척추염), 만성 염증, 심혈관 질환, 통증(예컨대, 급성 통증(예컨대, 신체적 손상에 의해 초래된 통증), 만성 통증 및/또는 월경통(월경과 관련된 통증)), 암(예컨대, 결장직장암(CRC)) 및 근골격계 질환으로부터 선택된다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 3,6,7-트리메틸루마진이 JAK에 결합하고, 따라서 JAK와 관련된 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 일 구현예에서, 질병은 염증성 질병이다.
일 구현예에서, TG2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증, 암 및 상처로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, JAK 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 위장관의 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 염증은 COX-2 관련 염증이다. 일 구현예에서, 염증은 대상체의 위장관과 관련된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 COX-2 관련 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 통증은 급성 통증, 만성 통증 및/또는 월경통이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 위장관의 염증과 관련된 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 염증은 위장관의 염증이다.
일 구현예에서, 본 발명은 COX-2 관련 질병, TG2 관련 질병 및/또는 JAK 관련 질병과 관련된 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 COX-2 관련 질병, TG2 관련 질병 및/또는 JAK 관련 질병과 같은 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머병), 신경계 장애, 예컨대, 파킨슨병 및/또는 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염(예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 및 강직성 척추염), 만성 염증, 심혈관 질환, 통증(예컨대, 급성 통증(예컨대, 신체적 손상에 의해 초래된 통증), 만성 통증 및 월경통(월경과 관련된 통증)), 암(예컨대, 결장직장암(CRC)) 및 근골격계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TG2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증, 암 및 상처로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, JAK 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기로부터 인지될 바와 같이, 3,6,7-트리메틸루마진 및 이를 포함하는 조성물은 대상체의 정상적인 소화를 보조하거나 유지하고, 대상체의 건강한 소화를 보조하거나 유지하고, 대상체의 전반적인 내장 건강 및 웰빙을 보조하거나 유지하는 것을 포함하여 광범위한 다른 용도에 유용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 개시된 방법, 용도 및 조성물에서 3,6,7-트리메틸루마진의 기원은 렙토스페르뭄으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 스코파리움(마누카)으로부터 유래된다.
본 발명의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 기원은 꿀이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원이다.
일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움(마누카로도 지칭됨)으로부터의 꽃 기원이다.
하나의 특정 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된다. 본 발명의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속 식물의 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질로부터 직접적으로 유래된다. 본 발명의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속의 식물의 과즙으로부터 직접적으로 유래된다. 일 양태에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
본 발명의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 합성이다.
예를 들어, 3,6,7-트리메틸루마진은 NZ 722140에 기재된 바와 같이 그리고 하기에 나타나 있는 바와 같이 합성될 수 있다.
하기 반응식을 참조하면, 그리고 문헌[Gala et al, (1997)]의 연구에 따르면, 위치 3에서 6-아미노우라실(5)의 N-메틸화는 촉매량의 황산(H2SO4)의 존재 하에서 헥사메틸디실라잔(HDMS)으로 처리 시 엑소사이클릭 아미노 및 카보닐 기의 실릴화를 통해 달성되었다. 암모늄 설페이트는 또한 촉매로서 사용될 수 있다. 이어서, 2 단계에 걸쳐 71% 수율로 유기 용매로서 디메틸포름아미드(DMF)의 존재 하에서 아이오도메탄(Mel)을 사용하여 메틸화가 수행되었다. 디메틸설페이트는 또한 메틸화제로 사용될 수 있다. 수성 후처리 동안 후속적인 탈실릴화에 의해 6-아미노-3-메틸우라실(6)이 78% 수율로 수득되었다.
그 후에, 아미노 우라실(6)이 소듐 니트라이트(NaNO2) 및 아세트산(AcOH) 용액으로 처리되고, 이어서 70℃에서 수성 용매 암모니아(NH3) 중에 소듐 디티오나이트(Na2S2O4)로의 환원으로(Chaudhari et al., 2009) 2 단계에 걸쳐 31% 수율로 5,6-디아미노-3-메틸우라실(7)이 제공되었다. 니트로화 첫 번째 단계에 사용될 수 있는 대안적인 산은 염산을 포함한다. 소듐 니트라이트 및 아세트산으로의 첫 번째 단계 환원에 대한 대안은 수성 또는 유기 용매에서 탄소 상 팔라듐 또는 플래티넘 디옥사이드와 같은 촉매를 사용하는 촉매 수소화이다.
에탄올(EtOH) 및 아세트산(AcOH) 용액 중 2,3-부탄디온(8) 용액과 디아미노우라실(7)의 축합에 의해 무색 고형물로서 3,6,7-트리메틸루마진(3)이 제공되었다. 축합 단계에서 사용하기 위한 대안적인 산은 염산이다. 합성 3,6,7-트리메틸루마진의 분광 데이터(UV-vis, IR, 1H NMR, 및 13C NMR)는 단리된 천연 생성물과 매우 일치했다. 게다가, 천연 생성물과 합성 생성물 둘 모두의 1H NMR 스펙트럼은 동일했다. 따라서, 3,6,7-트리메틸루마진(3)의 구조는 3,6,7-트리메틸루마진으로 확정되었다.
화합물(9) 
의 대안적인 합성은 상기 나타낸 
중간체 화합물의 N-3에서의 메틸화 또는 Curtius, Hofmann, Lossen 또는 Schmidt 재배열에 의해 생성된 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는 일시적인 이소시아네이트 종으로의 하기 나타낸 중간체 화합물의 전환에 의한 것이다.
상기를 참조할 때, 위치 3에서 6-아미노우라실(5)의 N-듀테로메틸화는 촉매량의 황산(H2SO4)의 존재 하에서 헥사메틸디실라잔(HDMS)으로 처리 시 엑소사이클릭 아미노 및 카보닐 기의 실릴화를 통해 달성되었다. 이어서, 2 단계에 걸쳐 71% 수율로 유기 용매로서 디메틸포름아미드(DMF)의 존재 하에서 아이오도메탄-d 3(CD3l)을 사용하여 메틸화가 수행되었다. 수성 후처리 동안 후속적인 탈실릴화에 의해 6-아미노-3(2H3)메틸우라실(9)이 78% 수율로 수득되었다.
그 후에, 아미노 우라실(6)이 소듐 니트라이트(NaNO2) 및 아세트산(AcOH) 용액으로 처리되고, 이어서 70℃에서 수성 용매 암모니아(NH3) 중에 소듐 디티오나이트(Na2S2O4)로의 환원으로(Chaudhari et al., 2009) 2 단계에 걸쳐 31% 수율로 5,6-디아미노-3(2H3)메틸우라실(10)이 제공되었다. 니트로화 첫 번째 단계에 사용될 수 있는 대안적인 산은 염산을 포함한다. 소듐 니트라이트 및 아세트산으로의 첫 번째 단계 환원에 대한 대안은 수성 또는 유기 용매에서 탄소 상 팔라듐 또는 플래티넘 디옥사이드와 같은 촉매를 사용하는 촉매 수소화이다.
에탄올(EtOH) 및 아세트산(AcOH) 용액 중 2,3-부탄디온(8)과 디아미노 우라실(10)의 축합에 의해 무색 고형물로서 3,6,7-(3-2H3)트리메틸루마진(11)이 제공되었다.
재료 및 방법
모든 반응을 건조 질소 분위기 하에 화염- 또는 오븐-건조 유리기구에서 수행하였다. 모든 시약은 시약 등급으로 구입하였으며, 추가 정제 없이 사용하였다. LC Technical SP-1 용매 정제 시스템을 사용하여 디메틸 포름아미드를 탈기하고 건조시켰다. 에탄올을 Mg(OEt)2 상에서 증류하였다. 에틸 아세테이트, 메탄올 및 페트롤륨 에테르는 사용 전에 증류하였다. 다른 모든 용매는 달리 명시되지 않는 한 입수된 대로 사용하였다. 고체상 추출(SPE)은 Strata C18 E 70Å, 55 μm 20 g/60 mL 컬럼을 사용하여 수행하였다. RP-HPLC는 262 nm, 280 nm 및 320 nm에서 작동하는 DAD 검출기와 함께 0.2 mL/분의 유량으로 Jupiter C18 300Å, 5 μm, 2.0 mm × 250 mm 컬럼을 사용하여 Agilent 1100으로 수행하였다. 5% B 내지 100% B의 적절하게 조정된 구배를 이용하였고, 여기서 용매 A는 H2O 중 0.1% HCOOH이고 B는 MeCN 중 20% A였다. 요망되는 용매와 함께 0.063 mm 내지 0.1 mm 실리카 겔을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피를 수행하였다. 박층 크로마토 그래피(TLC)는 0.2 mm Kieselgel F254(Merck) 실리카 플레이트를 사용하여 수행하고, 화합물은 254 nm 또는 365 nm에서 UV 조사 및/또는 수성 소듐 하이드록사이드 중의 포타슘 퍼망가네이트 및 포타슘 카보네이트의 용액으로 염색하여 시각화하였다. 분취용 TLC는 500 μm, 20 × 20 cm UniplateTM(Analtech) 실리카 겔 TLC 플레이트를 사용하여 수행하고, 화합물은 254 nm 또는 365 nm에서 UV 조사를 사용하여 시각화하였다. 융점을 Kofler 핫-스테이지 장치에서 결정하고, 보정하지 않았다. 적외선 스펙트럼을 필름 ATR 샘플링 액세서리에서 Perkin-Elmer 스펙트럼 100 FTIR 분광기를 사용하여 얻었다. 흡수 최대 값은 파수(cm-1)로 표현하였다. NMR 스펙트럼은 1H 핵의 경우 400 MHz 및 13C 핵의 경우 100 MHz에서 작동하는 Bruker Avance 400 분광기, 1H 핵의 경우 400 MHz, 및 13C 핵의 경우 100 MHz에서 작동하는 Bruker DRX 400 분광기, 1H 핵의 경우 500 MHz, 및 13C 핵의 경우 125 MHz에서 작동하는 Bruker Avance AVIII-HD 500 분광기 또는 1H 핵의 경우 600 MHz, 및 13C 핵의 경우 150 MHz에서 작동하는 Bruker Avance 600 분광기에서 나타난 바와 같이 기록하였다. 1H 및 13C 화학적 이동은 CDCl3(1H 및 13C) 또는 (CD3)2SO(1H 및 13C)에 대한 백만분율(ppm)로 보고된다. 15N 화학적 이동은 Bruker 라이브러리 함수 "xiref"에 의해 구현되는 바와 같은 통합 
척도(Harris et al., 2008)를 사용하여 참조되었다. 1H NMR 데이터는 화학적 이동, 상대 적분, 다중선(s, 단일선; 배정)으로 보고된다. 배정은 필요한 경우 COSY, NOESY, HSQC 및 HMBC 실험의 도움으로 이루어졌다. 고분해능 질량 스펙트럼은 ESI 이온화원이 있는 Bruker micrOTOF-Q II 질량 분광기에서 기록되었다. 자외선-가시 스펙트럼은 Shimadzu UV-2101PC 스캐닝 분광광도기에서 H2O 용액으로 실행되었다.
일 구현예에서, 본 발명은 상술된 방법에 사용하기 위한 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 꿀로 이루어진다.
일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖ 또는 약 80 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 2.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖ 또는 70 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏, 35 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 40 ㎎/㎏ 내지 45 ㎎/㎏, 45 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏ 내지 55 ㎎/㎏, 55 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏ 내지 70 ㎎/㎏ 또는 70 ㎎/㎏ 내지 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 포함한다.
일 구현예에서, 꿀은 미가공 꿀이다. 일 구현예에서, 꿀은 당업자에게 널리 공지되어 있을 방법에 따라 열처리되거나 저온살균된다.
하나의 특정 구현예에서, 조성물은 꿀 추출물을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀 추출물로 이루어진다.
일 구현예에서, 꿀 추출물은 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 꿀 추출물은 추출물이 유래된 꿀에서 자연 발생하는 것으로 확인된 3,6,7-트리메틸루마진의 농도보다 높은 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 추출물이 유래되는 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 추출물이 유래된 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
일 구현예에서, 추출물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 추출물은 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 450 약 500 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖ 내지 90 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖ 내지 350 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖, 약 450 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 약 500 ㎍/㎖ 내지 550 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖ 내지 600 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖ 내지 650 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖ 내지 700 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖ 내지 850 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖ 내지 900 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖ 내지 950 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 추출물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 추출물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 추출물은 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏ 내지 45 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏ 내지 55 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏ 내지 70 ㎎/㎏ 또는 약 70 ㎎/㎏ 내지 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏ 내지 300 ㎎/㎏, 약 300 ㎎/㎏ 내지 350 ㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏ 내지 400 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏ 내지 450 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏ 내지 550 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏ 내지 600 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏ 내지 650 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏ 내지 700 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏ 내지 750 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏ 내지 800 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏ 내지 850 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏ 내지 900 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏ 내지 950 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏ 내지 1000 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏ 내지 1100 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏ 내지 1200 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏ 내지 1300 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏ 내지 1400 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏ 내지 1500 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏ 내지 1600 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏ 내지 1700 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏ 내지 1800 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏ 내지 1900 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏ 내지 2000 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏ 내지 2100 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏ 내지 2200 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏ 내지 2300 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏ 내지 2400 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏ 내지 2500 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏ 내지 2600 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏ 내지 2700 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏ 내지 2800 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏ 내지 2900 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 적어도 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 실질적으로 순수한 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀 추출물을 포함하고, 꿀을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀로부터 단리되는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
3,6,7-트리메틸루마진은 당업자에게 널리 공지된 임의의 방법에 의해 단리될 수 있다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 꿀을 SPE(고상 추출), 이어서 순상 플래쉬 크로마토그래피 및 분취용 TLC(박막 크로마토그래피)로 처리함으로써 단리된다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 NZ 722140으로 공개된 본 출원인의 이전 특허에 기재된 바와 같이 그리고 하기에 나타나 있는 바와 같은 방법에 의해 단리된다.
3,6,7-트리메틸루마진의 화학적 단리
미가공 마누카 꿀(51.3 g)을 H2O + 0.1% HCOOH(150 ㎖)에 용해시키고, 20 분 동안 음파처리하였다. 생성된 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과액을 다음 단계에 사용하였다.
여과액을 100 ㎖의 두 부분으로 나누고, 각 부분을 MeOH-H2O + 0.1% HCOOH(1:9, 80 ㎖)를 사용하여 SPE로 처리하여 요망되지 않는 물질을 제거하였다. 그 후에, 요망되는 분획을 MeOH-H2O + 0.1% HCOOH(4:1, 80 ㎖)를 사용하여 용리시켰다. 두 분획을 합하고, 농축시켜, 조 추출물(0.23 g)을 제공하고, 이를 플래쉬 크로마토그래피(페트롤륨 에테르-EtOAc 1:4)에 의해 추가로 정제하여 갈색 고형물로서 정제된 추출물(3 ㎎)을 제공하였다.
여러 정제된 추출물을 합하고(총 6 ㎎), 분취용 TLC(페트롤륨 에테르-EtOAc 1:3, 4 회 실행)에 의해 추가로 정제하여 무색 고형물로서 3(4 ㎎)(하기 도시된 바와 같은)을 제공하였다.
렙토스페르뭄 꿀에 대한 제안된 바이오마커인 렙토스페린(4)(Kato et al. 2012 and 2014; Aitken, et al. 2013; 하기 도시된 바와 같은 구조)의 존재에 대하여 HPLC를 사용하여 렙토스페르뭄, 유칼립투스(Eucalyptus), 쿤제아(Kunzea) 및 나이티아(Knightia) 종으로부터 유래된 뉴질랜드 및 호주 꿀을 검사하는 동안, 320 nm에서 예상치 못한 UV 흡광도가 주지되었다.
이러한 피크는 렙토스페린이 검출되지 않은 엘. 수브테누에로부터 유래된 꿀을 포함하여 렙토스페르뭄 꿀(엘. 스코파리움, 엘. 스코파리움 변종 엑시니움, 엘. 폴리갈리폴리움, 엘. 수브테누에)에서만 관찰되었다. 고상 추출(SPE), 이어서 역상 HPLC의 사용은 320 nm에서의 UV 흡광도를 나타낸 화합물의 정제를 가능하게 하였다. 그러나, 이러한 방법은 시간 소모적이고, 수율이 낮으며, 확장 가능하지 않았으므로, 보다 효율적인 단리 방법이 추구되었다. 마누카 꿀을 SPE, 이어서 순상 플래쉬 크로마토그래피 및 분취용 TLC로 처리하는 것은 분광기 분석을 수행하기에 충분한 양의 무색 고체로서 3,6,7-트리메틸루마진의 단리를 가능하게 하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 꿀을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 합성 3,6,7-트리메틸루마진 및 꿀로 이루어진다. 일 구현예에서, 조성물은 단리된 3,6,7-트리메틸루마진 및 꿀로 이루어진다.
일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 속으로부터의 꽃 기원이다. 일 구현예에서, 꿀은 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된다.
일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진의 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 450 약 500 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖, 내지 약 1000 ㎍/㎖의 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖ 내지 90 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖ 내지 350 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖, 약 450 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 약 500 ㎍/㎖ 내지 550 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖ 내지 600 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖ 내지 650 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖ 내지 700 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖ 내지 850 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖ 내지 900 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖ 내지 950 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖의 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 조성물은 약 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏ 내지 45 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏ 내지 55 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏ 내지 70 ㎎/㎏ 또는 약 70 ㎎/㎏ 내지 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏ 내지 300 ㎎/㎏, 약 300 ㎎/㎏ 내지 350 ㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏ 내지 400 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏ 내지 450 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏ 내지 550 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏ 내지 600 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏ 내지 650 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏ 내지 700 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏ 내지 750 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏ 내지 800 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏ 내지 850 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏ 내지 900 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏ 내지 950 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏ 내지 1000 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏ 내지 1100 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏ 내지 1200 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏ 내지 1300 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏ 내지 1400 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏ 내지 1500 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏ 내지 1600 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏ 내지 1700 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏ 내지 1800 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏ 내지 1900 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏ 내지 2000 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏ 내지 2100 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏ 내지 2200 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏ 내지 2300 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏ 내지 2400 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏ 내지 2500 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏ 내지 2600 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏ 내지 2700 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏ 내지 2800 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏ 내지 2900 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 3000 ㎎/㎏의 합성 3,6,7-트리메틸루마진 또는 단리된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 0.1% 내지 100%의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 적어도 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하거나, 실질적으로 순수한 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
꿀-유래 3,6,7-트리메틸루마진 및/또는 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 부작용을 가질 것으로 예상되지 않는다. 3,6,7-트리메틸루마진은 일부 꿀에서 자연 발생적이며, 3,6,7-트리메틸루마진을 함유하는 이러한 꿀은 수년 동안 판매되고 소비되어 왔다.
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 의약, 치료 제품 또는 건강 보충제로서 제형화될 수 있다.
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 액체 제형, 캡슐, 일용 소비재, 츄어블 정제, 정제, 좌약, 정맥내 제제, 근육내 제제, 피하 제제, 용액, 식품, 음료, 식이 보충제, 화장품 제형, 겔, 로션, 분말 또는 스프레이를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 전달 시스템으로 제형화된다.
하나의 특정 구현예에서, 상술된 바와 같은 본 발명의 방법은 약 1 ㎎ 내지 약 3000 ㎎의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 상술된 바와 같은 본 발명의 방법은 약 1 ㎎, 10 ㎎, 20 ㎎, 30 ㎎, 40 ㎎, 50 ㎎, 60 ㎎, 70 ㎎, 80 ㎎, 90 ㎎, 100 ㎎, 150 ㎎, 200 ㎎, 250 ㎎, 300 ㎎, 350 ㎎, 400 ㎎, 450 ㎎, 500 ㎎, 550 ㎎, 600 ㎎, 650 ㎎, 700 ㎎, 750 ㎎, 800 ㎎, 850 ㎎, 900 ㎎, 950 ㎎, 1000 ㎎, 1100 ㎎, 1200 ㎎, 1300 ㎎, 1400 ㎎, 1500 ㎎, 1600 ㎎, 1700 ㎎, 1800 ㎎, 1900 ㎎, 2000 ㎎, 2100 ㎎, 2200 ㎎, 2300 ㎎, 2400 ㎎, 2500 ㎎, 2600 ㎎, 2700 ㎎, 2800 ㎎, 2900 ㎎, 또는 3000 ㎎의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 상술된 바와 같은 본 발명의 방법은 조성물이 꿀 또는 꿀 추출물인 것을 포함하여 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법에서 꿀은 약 5 g 내지 약 100 g의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 꿀은 약 5 g, 10 g, 15 g, 20 g, 25 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 또는 100 g의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 꿀은 약 1 티스푼 및 약 5 테이블스푼의 꿀과 같은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 꿀은 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여된다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 단회 용량으로서 또는 분할 용량으로서 투여된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은 1 회, 2 회, 3 회 또는 4 회 개별 용량으로서 투여된다.
하나의 특정 구현예에서, 상술된 바와 같은 본 발명의 방법은 일일 1 회, 2 회, 3 회 또는 4 회의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상술된 바와 같은 본 발명의 방법은 주 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회 또는 7 회의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다.
3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 꿀 샘플마다 유의하게 다를 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 하나의 특정 구현예에서, 꿀을 포함하는 조성물은 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은
- 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 제1 조성물을 선택하고;
- 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 적어도 하나의 추가 조성물을 선택하고;
- 제1 조성물을 제2 조성물과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 최종 조성물을 수득함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은
- 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 제1 조성물을 선택하고;
- 선택된 제1 조성물을
○ 합성 3,6,7-트리메틸루마진;
○ 단리된 3,6,7-트리메틸루마진;
○ 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 꿀 추출물; 및/또는
○ 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된 3,6,7-트리메틸루마진 중 하나 이상과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 조성물을 형성함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물은
- 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 꿀을 포함하는 제1 조성물을 선택하고;
- 선택된 꿀을 포함하는 제1 조성물을
○ 합성 3,6,7-트리메틸루마진;
○ 단리된 3,6,7-트리메틸루마진; 및
○ 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 꿀 추출물; 및/또는
○ 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된 3,6,7-트리메틸루마진 중 하나 이상과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 조성물을 형성함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀, 꿀 추출물, 단리된 3,6,7-트리메틸루마진 및/또는 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 식물로부터 직접적으로 유래된 3,6,7-트리메틸루마진은 렙토스페르뭄 속 식물의 꽃, 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질로부터 직접적으로 유래된다.
일 구현예에서, 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진이다. 일 구현예에서, 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 450 약 500 ㎍/㎖, 약 550 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 650 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 750 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 850 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 또는 약 950 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진이다.
일 구현예에서, 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏이다. 일 구현예에서, 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏, 약 80 ㎎/㎏, 약 90 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏, 약 150 ㎎/㎏, 약 200 ㎎/㎏, 약 250 ㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 350 ㎎/㎏, 약 400 ㎎/㎏, 약 450 ㎎/㎏, 약 500 ㎎/㎏, 약 550 ㎎/㎏, 약 600 ㎎/㎏, 약 650 ㎎/㎏, 약 700 ㎎/㎏, 약 750 ㎎/㎏, 약 800 ㎎/㎏, 약 850 ㎎/㎏, 약 900 ㎎/㎏, 약 950 ㎎/㎏, 약 1000 ㎎/㎏, 약 1100 ㎎/㎏, 약 1200 ㎎/㎏, 약 1300 ㎎/㎏, 약 1400 ㎎/㎏, 약 1500 ㎎/㎏, 약 1600 ㎎/㎏, 약 1700 ㎎/㎏, 약 1800 ㎎/㎏, 약 1900 ㎎/㎏, 약 2000 ㎎/㎏, 약 2100 ㎎/㎏, 약 2200 ㎎/㎏, 약 2300 ㎎/㎏, 약 2400 ㎎/㎏, 약 2500 ㎎/㎏, 약 2600 ㎎/㎏, 약 2700 ㎎/㎏, 약 2800 ㎎/㎏, 또는 약 2900 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진이다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 크로마토그래피, 분석용 측정, 분광광도계 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 역상 HPLC 시스템에 의해 결정된다.
일 구현예에서, 꿀 중 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 NZ 722140에서 이전에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물을 제조하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 꿀을 포함하는 제1 조성물을 시험하는 단계;
b. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 꿀을 포함하는 적어도 하나의 추가 조성물을 시험하는 단계;
c. 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀을 포함하는 조성물을 선택하는 단계;
d. 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀을 포함하는 적어도 하나의 추가 조성물을 선택하는 단계; 및
e. 꿀을 포함하는 선택된 조성물을 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 꿀을 포함하는 조성물은 조성물이 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진의 농도를 갖는 경우 선택된다.
일 구현예에서, 방법은 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 것을 식별하는 라벨과 함께 항-염증 활성을 갖는 것으로 식별된 조성물을 패키징하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진이다. 일 구현예에서, 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏ 내지 35 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 또는 약 40 ㎎/㎏ 내지 45 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏ 내지 55 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏ 내지 70 ㎎/㎏ 또는 약 70 ㎎/㎏ 내지 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진이다.
하나의 특정 구현예에서, 조성물은 꿀 또는 꿀 추출물이다.
일 구현예에서, 항-염증 활성을 갖는 조성물은 상기 및 하기에 기술된 바와 같은 방법들 중 어느 하나에 사용하기에 적합하다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 크로마토그래피, 분석용 측정, 분광광도계 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 역상 HPLC에 의해 결정된다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 NZ 722140에서 이전에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결정된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 것으로 조성물을 식별하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 조성물을 시험하고;
i. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 것으로 조성물을 식별하거나;
ii. 조성물이 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 작은 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 조성물을 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖지 않는 것으로 식별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 조성물은 조성물이 꿀, 꿀 추출물, 단리된 3,6,7-트리메틸루마진 및/또는 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진을 함유하는 경우 항-염증 활성을 갖는 것으로 결정된다.
일 구현예에서, 방법은 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 것을 식별하는 라벨과 함께 항-염증 활성을 갖는 것으로 그리고 항-염증 활성을 갖는 것으로 식별된 조성물을 패키징하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 항-염증 활성을 갖는 조성물은 상기 및 하기에 기술된 바와 같은 방법들 중 어느 하나에 사용하기에 적합하다.
하나의 특정 구현예에서, 조성물은 꿀 또는 꿀 추출물이다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 염증과 관련된 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법에 사용하기에 적합한 항-염증, 진통 및/또는 TG2, JAK 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물을 식별하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 조성물을 시험하고;
i. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 조성물을 위장관의 염증과 관련된 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법에 사용하기에 적합한 것으로 식별하거나;
ii. 조성물이 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 작은 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 조성물을 위장관의 염증과 관련된 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법에 사용하기에 적합하지 않은 것으로 식별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀, 꿀 추출물, 단리된 3,6,7-트리메틸루마진 및/또는 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 염증과 관련된 질병은 COX-2 관련 질병, TG2 관련 질병 및/또는 JAK-관련 질병이다.
일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머병), 신경계 장애, 예컨대, 파킨슨병 및/또는 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염(예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 및 강직성 척추염), 만성 염증, 심혈관 질환, 통증(예컨대, 급성 통증(예컨대, 신체적 손상에 의해 초래된 통증), 만성 통증 및 월경통(월경과 관련된 통증)), 암(예컨대, 결장직장암(CRC)) 및 근골격계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TG2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. TG2는 또한 상처 치유에서 역할을 한다.
일 구현예에서, JAK 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 방법은 상기 방법에 의해 확인된 조성물이 약 5 내지 약 80 mg/kg의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는다는 것을 확인하는 라벨로 상기 조성물을 패키징하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 염증 및/또는 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법에 사용하기에 적합한 항염증, 진통 및/또는 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물을 식별하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대하여 꿀 배치를 시험하고;
i. 조성물이 약 5 mg/kg 초과 내지 약 80 mg/kg의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 염증 및/또는 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법에 사용하기에 적합한 것으로 조성물을 식별하거나;
ii. 조성물이 약 5 mg/kg 미만의 3,6,7-트리메틸루마진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 함유하는 경우 염증 및/또는 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법에 사용하기에 적합하지 않은 것으로 조성물을 식별하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 조성물은 꿀, 꿀 추출물, 단리된 3,6,7-트리메틸루마진 및/또는 합성 3,6,7-트리메틸루마진을 포함한다.
일 구현예에서, 염증 및/또는 통증은 TG2, JAK, 및/또는 COX-2 관련 질병으로부터 선택된 질병과 관련된다.
일 구현예에서, COX-2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증 및 알츠하이머병), 신경계 장애, 예컨대, 파킨슨병 및/또는 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염(예컨대, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염 및 강직성 척추염), 만성 염증, 심혈관 질환, 통증(예컨대, 급성 통증(예컨대, 신체적 손상에 의해 초래된 통증), 만성 통증 및/또는 월경통(월경과 관련된 통증)), 암(예컨대, 결장직장암(CRC)) 및 근골격계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, TG2 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, TG2-관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 셀리악병, 헌팅턴병, 섬유증, 암 및 상처로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, JAK 관련 질병은 위장 염증성 질환, 위궤양(예컨대, 소화성 궤양), 위염, JAK 관련 염증성 질병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염 및/또는 식도 궤양, 신경정신병(예컨대, 조현병 및 양극성 기분 장애), 다발성 경화증, 신경퇴행성 장애(예컨대, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 및 알츠하이머병), 심혈관 질환, 암, 관절염, 만성 염증, 자가면역 질병, 궤양성 대장염, 원형탈모증, 아토피성 피부염, 미만성 경피증, 크론병, 백반증, 혈구식세포 증후군, 비감염성 포도막염 및 피부 홍반 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 염증 및/또는 통증은 위장관과 관련된다.
일 구현예에서, 방법은 상기 방법에 의해 확인된 조성물이 약 5 내지 약 80 mg/kg의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는다는 것을 확인하는 라벨로 상기 조성물을 패키징하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 크로마토그래피, 분석용 측정, 분광광도계 및/또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도는 역상 HPLC에 의해 결정된다.
질량 분광기를 사용하는 마누카 꿀 중 3,6,7-트리메틸루마진의 정량화
본 발명의 일 구현예에서, 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 NZ 722140에서 이전에 기재된 바와 같은 그리고 하기에 나타나 있는 바와 같은 방법에 의해 결정된다.
탠덤 질량 분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 측정하는 정량적 기법이 기술된다. 더 중질의 3,6,7-트리메틸루마진 동위원소를 합성하고, 마누카 꿀로부터의 매트릭스 효과를 보상하기 위해 내부 표준물로서 사용하였다. 마누카 꿀에는 내인성 화합물의 간섭이 없었으며, 3 Da 질량 차이는 질량 스펙트럼에서 명확하게 구별될 수 있다. LC-MS/MS의 아래에 추가로 기술되는 결과는 HPLC 정량화 및 형광 분광기의 이전 데이터와 밀접한 상관관계가 있다. 따라서, 3,6,7-트리메틸루마진은 세 가지 방법 모두를 사용하여 정확하게 결정될 수 있다. LC-MS/MS 정량화로부터의 결과는 HPLC로부터의 이전 데이터보다 비교적 낮았으며, 이는 동일한 HPLC 피크 하에서 소량의 공동-용리 화합물에 기인할 수 있다. 이러한 결과들은 정량적 질량 분광기가 마누카 꿀 인증을 위한 독립적 또는 보완적 접근 방식으로 사용될 수 있다는 것을 입증해 준다.
LC-MS/MS 방법을 검증하기 위해, 더 중질의 3,6,7-트리메틸루마진 동위원소의 보충 전 및 후에 전형적인 마누카 꿀의 질량 스펙트럼을 얻었다. 나타나 있는 바와 같이, m/z 210-212의 마누카 꿀 중 내인성 화합물로부터의 유의한 간섭 피크는 없었다. 동위원소 간의 3 Da 질량 차이는 질량 스펙트럼에서 명확하게 확인될 수 있다. 마누카 꿀의 최종 시험 농도는 비교적 높은 질량 스펙트럼 분해능을 유지하면서 당 농도를 감소시키기 위해 0.2% w/v에서 결정되었다.
LC-MS/MS 정량화
LC-단계 동안, 내인성 3,6,7-트리메틸루마진과 더 중질의 동위원소는 정확히 동시에(12.85 분) 공동-용리되었다. 이들 이성질체는 거의 동일한 MS/MS 스펙트럼을 나타냈지만, m/z 189 내지 m/z 192에서 3Da 질량 이동에 의해서만 구별되었다. 가장 풍부한 공통 이온은 148.05 m/z에서 관찰되었다. 중질 동위원소는 이러한 단편 이온으로 표현되는 구조 부분에 존재하지 않았다. 이러한 공통 이온은 배경 간섭을 줄이기 위해 3,6,7-트리메틸루마진 정량화에 사용된다.
LC-MS/MS 및 HPLC 정량화의 비교
내인성 3,6,7-트리메틸루마진 농도는 질량 분광기 정량화를 사용하여 3 ㎎/㎏ 내지 44 ㎎/㎏으로 정량화되었다. 결과는 동일한 세트의 마누카 꿀 샘플(R2= 0.9517)에 대한 HPLC 분석으로부터의 이전 데이터와 강한 선형 상관관계를 입증해 주었다. 질량 분광기 결과는 이전의 HPLC 정량화(5 ㎎/㎏ 내지 52 ㎎/㎏)보다 비교적 더 낮았다는 점이 주지되어야 한다. 이는 다른 UV-흡수 화합물이 동일한 HPLC 피크 하에서 3,6,7-트리메틸루마진과 공동-용리되었을 수 있다는 것을 시사한다.
질량 분광기 정량화로부터의 결과는 또한 ex330 nm 내지 em470 nm(R2= 0.8995)에서 시그니처 형광과 마찬가지로 상관관계가 있다.
3,6,7-트리메틸루마진의 구조 설명
3,6,7-트리메틸루마진의 화학적 구조 설명은 NZ 722140에 기재되어 있고, 하기에 나타나 있는 바와 같다.
[표 1]
3 a에 대한 1H, 13C 및 15N NMR 데이터
a 1H (400 MHz); 13C (100 MHz); 15N (60.8 MHz), 화학적 이동은 1H-15N HMBC NMR 데이터로부터 간접적으로 결정됨. b HMBC 상관관계는 표시된 탄소 또는 질소에 대해 명시된 양성자로부터임.
상기 표 1을 참조하면, 미지 화합물의 분자식은 양이온 HRESIMS에 의해 C9H10N4O2로 확립되었다. 화합물은 CD3OD 및 CDCl3에 가용성이었는데; 후자는 CD3OD에 기록된 스펙트럼에 존재하지 않은 δ 8.55 ppm(H-1)에서 광범위 공명의 존재로 인해 NMR 스펙트럼을 기록하는 데 사용되었다. 이러한 피크는 이의 화학적 이동과 IR 스펙트럼에서 특유의 하이드록실 흡수의 부재에 기초하여 아미드 양성자로 배정되었다. δ 2.63 ppm(H-10) 및 δ 2.67 ppm(H-11)에서 두 개의 단일선은 이들의 화학적 이동에 기초하여 헤테로아릴 메틸기로 배정되었고, δ 3.50 ppm(H-9)에서 나머지 단일선은 2개의 사차 카보닐 13C 신호(C-2, C-4, 하기 참조)에 대한 동일한 강도의 HMBC 상관관계로 인한 및 δ 28.5 ppm(C-9)에서 탄소 신호에 대한 HSQC 상관관계로 인해 N-메틸기로 배정되었다.
각각 δ 292.0 ppm 및 δ 329.9 ppm에서 H-10 및 H-11에서 N-5 및 N 8까지의 1H-15N HMBC 상관관계는 이들 두 메틸기가 피라진 고리에 부착되었음을 시사하였다. 2,3-디메틸 치환 패턴은 H-10에서 C-7까지, 그리고 H-11에서 C-6까지 1H-13C HMBC 상관관계에 기초하여 배정되었다.
구조의 높은 불포화도와 피라진 고리의 존재를 감안할 때, 미지 화합물에 대해 융합된 헤테로사이클릭 구조가 제안되었다. 더욱이, 탄소 C-2, C-4 및 C-4a의 화학적 이동과 루마진 구조를 함유하는 천연 생성물의 유사한 탄소에 대해 보고된 이동 사이에 유사성이 주지되었다(Pfleiderer, 1984; Kakoi, et al. 1995; Voerman, et al., 2005; Meyer, et al. 2010; Chen, et al. 2014). 이러한 관찰은 H-9에서 C-2 및 C-4까지의 HMBC 상관관계 및 H-10에서 C-4a까지의 추가 4개의 결합 커플링과 연관하여 3,6,7-트리메틸루마진(3)으로서 단리된 화합물의 구조의 잠정적 배정으로 이어졌다.
3,6,7-트리메틸루마진(3)은 최초로 1958년에 합성되었다(Curran & Angier, 1958). 그 이후로, 이는 관련 루마진에 대하여 여러 연구에서 보고되었다(Pfleiderer & Fink, 1963; Pfleiderer & Hutzenlaub, 1973; Ritzmann & Pfleiderer, 1973; Ram, et al. 1977; Southon & Pfleiderer, 1978; Uhlmann & Pfleiderer, 1981; Ram, et al. 1982; Bartke & Pfleiderer, 1989; Acu
a-Cueva, et al. 2000). 루마진 3에 대한 특성규명 데이터는 융점(Curran & Angier, 1958; Pfleiderer & Hutzenlaub, 1973), 원소 분석(Curran & Angier, 1958) 및 UV-vis 피크(Pfleiderer & Hutzenlaub, 1973; Ritzmann & Pfleiderer, 1973; Uhlmann & Pfleiderer, 1981)로 국한되고; NMR, MS 또는 IR 데이터는 지금까지 보고된 바 없다.
상기 및 하기에 인용되는 모든 출원, 특허 및 간행물의 전체 개시는 본원에 참고로 포함된다.
의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "조성물"은 꿀, 꿀 추출물, 또는 건조 꿀을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 임의의 종래 기술에 대한 언급은 종래 기술이 세계의 어느 국가에서든 시도한 분야에서 공통의 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의의 형태의 제안으로 간주되어서는 안된다.
본 발명은 또한 광범위하게는, 개별적으로 또는 총괄적으로 본 출원의 명세서에 언급되거나 지시된 부분, 요소 및 특징으로 상기 부분, 요소 및 특징 중 둘 이상의 임의의 또는 모든 조합으로 이루어진다고 할 수 있다.
전술한 설명에서 공지된 임의의 등가물을 갖는 정수 또는 성분이 언급되는 경우, 이들 정수는 개별적으로 기재된 것처럼 본원에 포함된다.
본원에 기재된 현재 바람직한 구현예에 대한 다양한 수정 및 변형은 당업자에게 명백할 것이라는 점이 주지되어야 한다. 이러한 수정 및 변형은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 수반되는 이점을 줄이지 않으면서 이루어질 수 있다. 따라서, 이러한 수정 및 변형은 첨부된 청구범위에 기재된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
상기 확인된 조성물, 의약, 방법 및 용도는 이제 도면 및 특정 실시예를 참조함으로써 기술된다.
실시예 1 - 형광 검정
본 실시예에서, 형광 억제제 스크리닝은 MMP-9의 잠재적인 억제제를 식별하기 위한 빠르고 민감한 고처리량 방법을 제공한다.
방법 및 재료
MMP-9 억제제 스크리닝 검정(형광) 키트는 Abcam(멜버른, 호주)에서 구입하였다. 형광 키트는 재조합 MMP-9 효소, MMP 억제제 NNGH(N-이소부틸-N-[4-메톡시페닐설포닐]글리실 하이드록삼산), DMSO에 가용화된 MMP 형광성 기질, 형광 검정 완충액 및 96-웰 투명 마이크로플레이트를 포함한다.
MMP-9에 대한 억제 활성은 상업적인 MMP-9 억제제 스크리닝 검정 키트를 사용하여 평가하였다. MMP-9 활성은 SpectraMax iD3 다중-모드 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, 새너제이, USA)를 사용하여 측정된 형광 강도의 변화로서 표현하였다.
검정은 특정 부위에서 MMP-9에 의해 가수분해될 수 있는 FRET-태그(형광 공명 에너지 전달) 기질을 사용한다(Abcam, 2018). FRET 기질의 절단은 켄칭된 형광 Mca(7-메톡시쿠마린-4-일)-아세틸기를 방출한다(Abcam, 2018). 키트는 켄칭된 형광성 기질 Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2를 사용하고, 여기서 Mca 형광은 MMP에 의해 절단될 때까지 Dpa에 의해 켄칭된다. MMP-9에 의해 산출된 형광 생성물의 양은 형광측정법으로 검출될 수 있으며, 이는 효소 활성에 비례한다. 형광은 ex 330 nm 내지 em 470 nm에서 3,6,7-트리메틸루마진으로부터의 형광 간섭을 최소화하기 위해 ex 320 nm 내지 em 395 nm에서 측정되었다. 최종 반응 부피가 100 ㎕인 키트에 포함된 96-웰 투명 마이크로플레이트에서 검정을 수행하였다. 기질을 첨가하기 전에, MMP-9 효소를 37℃에서 60 분 동안 시험 샘플 및 억제제 대조군과 함께 인큐베이션하였다. 형광 기질은 반응을 개시하기 위해 검정 전에 각 웰에 첨가하였다. 검정은 20 분 동안 수행되게 하였으며, 반응 챔버의 온도를 내지 37℃로 설정하였다.
상기 개략된 바와 같이 제조된 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 시험 샘플을 제조하였다.
양성 대조군은 억제 백분율을 계산하기 위한 참조로서 사용된 MMP-9 및 형광 기질만을 포함하였다. 광범위 스펙트럼의 MMP 억제제 NNGH는 음성 대조군으로서 포함시켰다. 다양한 시험 대조군이 또한 MMP-9 및 3,6,7-트리메틸루마진에 의해 생성된 자가형광을 측정하는 데 필수적인 형광 기질 없이 시험 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하였다.
결과
합성된 3,6,7-트리메틸루마진을 2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖(LC-MS/MS에 의해 측정된 경우 3 ㎍/㎖ 내지 44 ㎍/㎖)의 마누카 꿀에서 확인된 농도에서 반응 혼합물에 보충하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 형광 강도의 변화는 모든 3,6,7-트리메틸루마진 샘플 및 대조군에 대해 선형이었다. NNGH 양성 대조군에서 형광의 변화는 거의 없었다. 대조적으로, 억제제가 없는 음성 대조군에 대해 형광의 꾸준한 증가가 관찰되었다. 3,6,7-트리메틸루마진 샘플은 이의 자가형광 성질로 인해 더 높은 초기 형광을 나타냈다. 각 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 형광 대조군을 이 검정에 포함시켰다.
본 연구에서, 모든 시험된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진은 도 2에 도시된 바와 같이 12% 내지 99% 범위의 MMP-9에 대하여 억제 활성을 나타냈다. 억제제가 없는 음성 대조군과 비교하여, MMP-9 활성은 5 ㎍/㎖ 이상의 농도의 3,6,7-트리메틸루마진에 의해 유의하게 억제되었다(모두 p<0.05). 2.5 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 MMP-9 활성을 12% 억제하였으나, 이러한 억제는 유의하지 않았다(p>0.05). 3,6,7-트리메틸루마진은 40 ㎍/㎖에서 MMP-9를 거의 완전히 억제하였으며, NNGH 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없었다(p>0.05). MMP-9의 억제는 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대하여 용량-의존적인 것으로 보였는데, 이는 더 높은 3,6,7-트리메틸루마진 농도가 항상 더 낮은 농도에 비해 더 강한 억제를 나타냈기 때문이다(모두 p<0.05). 데이터는 평균 ± SEM으로 나타나 있다. n=4. ****p<0.0001.
MMP-9의 억제 백분율은 도 3에 나타낸 바와 같이 3,6,7-트리메틸루마진의 농도와 양의 상관관계에 있었다. 상관관계는 R2가 0.9965인 2차 다항식 모델에 가장 적합하다. 이들 데이터에 기초하여, 3,6,7-트리메틸루마진의 IC50은 11.5 ㎍/㎖로 계산되었다. IC50은 11.5 ㎍/㎖로 계산되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타나 있다. n=4.
실시예 2 - 비색 검정
본 실시예에서, MMP-9 비색 억제제 스크리닝 키트를 3,6,7-트리메틸루마진의 생체활성을 추가로 조사하기 위해 사용하였다.
방법 및 재료
MMP-9 억제제 스크리닝 검정(비색) 키트는 Abcam(멜버른, 호주)에서 구입하였다. 키트는 재조합 MMP-9 효소, MMP 억제제 NNGH, MMP 발색 기질, 비색 분석 완충액 및 96-웰 투명 마이크로플레이트를 포함한다.
비색 키트는 티오펩티드를 MMP에 의해 가수분해되어 설프하이드릴기를 생성할 수 있는 발색성 기질(Ac-PLG-[2-머캅토-4-메틸-펜타노일]-LG-OC2H5))로 사용한다. 이러한 중간체 생성물은 추가로 DTNB[5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), 엘만 시약]와 반응하여 2-니트로-5-티오벤조산을 형성하는데, 이는 412 nm에서 흡광도에 의해 검출될 수 있다. 흡광도의 변화를 SpectraMax iD3 다중-모드 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, 새너제이, USA)를 사용하여 측정하였다. 최종 반응 부피가 100 ㎕인 편리한 96-웰 마이크로플레이트에서 검정을 수행하였다. 검정 전에, 모든 시험 샘플 및 억제제 대조군을 37℃에서 60 분 동안 MMP-9와 함께 인큐베이션하였다. 반응을 개시하기 위해 발색 기질을 각 웰에 첨가하였다. 검정은 37℃에서 120 분 동안 수행되게 하였다. 흡광도를 처음 20 분 동안 1 분 간격으로 측정한 다음, 검정이 종료될 때까지 10 분 간격으로 측정하였다.
재조합 MMP-9 및 발색 기질을 100% 효소 활성을 나타내는 양성 대조군으로서 사용하였다. NNGH를 음성 대조군으로서 사용하였다. 3,6,7-트리메틸루마진 농도 범위를 비색 검정 완충액으로 희석하여 반응 생성물의 흡광도를 측정하였다.
결과
3,6,7-트리메틸루마진의 기저 억제 생체활성을 MMP-9 비색 억제제 스크리닝 키트를 사용하여 추가로 조사하였다. 비색 키트는 MMP에 의해 가수분해될 수 있는 티오펩티드 기질을 사용하여 설프하이드릴기 중간체를 생성하고, 이는 엘만 시약과 추가로 반응하여 2-니트로-5- 티오벤조산을 형성한다. 엘만 시약은 단백질 설프하이드릴의 농도를 검출하는 데 사용되며, 반응 생성물은 412 nm에서의 흡광도에 의해 검출될 수 있다(Riener, Kada, & Gruber, 2002).
억제 생체활성은 먼저 반응 혼합물에 3,6,7-트리메틸루마진(40 ㎍/㎖)을 보충함으로써 조사하였다(도 4). 억제제가 없는 음성 대조군과 비교하여, 흡광도의 변화율은 3,6,7-트리메틸루마진 보충 샘플에서 약간 더 낮았다. NNGH를 대부분의 MMP-9 활성을 억제한 양성 대조군으로서 사용하였다. NNGH는 1.3 μM에서 MMP-9를 완전히 억제할 것으로 예상되지 않았다(Abcam, 2019). 흡광도의 변화는 처음 40 분 동안 3,6,7-트리메틸루마진 샘플 및 대조군에 대해 선형이었다. 생성물은 불안정한 것으로 보였고, 40 분 후에 분해되기 시작했다. 추가 계산을 위해 반응의 처음 20 분을 선택하였다.
3,6,7-트리메틸루마진은 2.5 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖의 농도에서 MMP-9에 대해 억제 생체활성을 나타냈다. 3,6,7-트리메틸루마진 샘플의 흡광도 변화를 음성 대조군(억제제 없음, 100% MMP-9 활성)과 비교하여 억제 백분율을 계산하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 3,6,7-트리메틸루마진 샘플은 MMP-9를 3.5% 내지 10% 억제하였다(n=5, 각각 2 회 상호 반복). 음성 대조군과 비교하여, 더 높은 농도(20 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖)의 3,6,7-트리메틸루마진은 MMP-9에 대해 상당한 억제를 나타냈다(모두 p<0.0001). 더 낮은 3,6,7-트리메틸루마진 농도(2.5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖)에서 MMP-9 억제 수준은 미미했다(모두 p>0.05). 40 ㎍/㎖에서 80 ㎍/㎖까지 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 증가시키는 것은 MMP-9를 더 억제하지 않았다(둘 모두 10% 억제, p>0.05). 이는 3,6,7-트리메틸루마진이 발색 기질에 비해 MMP-9 효소[E] 또는 효소-기질 복합체[ES]에 대해 상대적으로 낮은 결합 친화도(Ki)를 가질 수 있다는 것을 시사한다.
MMP-9의 부재 하에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 발색 기질 및 반응 생성물에 의해 생성된 흡광도 신호를 간섭하지 않았다. 3,6,7-트리메틸루마진(40 ㎍/㎖ 및 80 ㎍/㎖)을 기질(도 6의 A) 및 반응 생성물(도 6의 B)과 함께 20 분 동안 인큐베이션함으로써 이를 조사하였다. 두 경우 모두에서, 3,6,7-트리메틸루마진은 흡광도 신호를 유의하게 간섭하지 않았다.
실시예 3: 젤라틴 겔 자이모그래피
3,6,7-트리메틸루마진에 의한 MMP-9의 억제를 확인하기 위해, 본 발명자들은 젤라틴 겔 자이모그래피를 수행하여 MMP-9의 활성을 검출하였다. 젤라틴 겔 자이모그래피는 젤라틴을 분해하는 이의 능력으로 인해 MMP-9(젤라티나제) 활성을 검출하도록 독특하게 설계된다.
방법 및 재료
Novex™ 10% 자이모그램 Plus(젤라틴) 단백질 겔(15 웰)을 Thermo Fisher Scientific Inc.(오클랜드, 뉴질랜드)에서 구입하였다. 자이모그램 분석에 필요한 모든 화학 물질은 또한 Thermo Fisher에서 구입하였고, 이들은 Novex™ Sharp 예비염색된 단백질 표준물, Novex 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액, Novex 트리스-글리신 SDS 러닝 완충액, Novex 자이모그램 재생 완충액 및 Novex 자이모그램 현상 완충액을 포함하였다. 이중 증류수를 Sartorius Arium® Pro(18.2 MΩ cm) 정수 시스템에서 정제하였다. 3,6,7-트리메틸루마진으로부터 MMP-9의 억제를 확인하기 위한 독립적인 기법으로서 젤라틴 겔 자이모그래피를 수행하였다. 이 기법은 젤라틴이 매립(embed)된 비-환원 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔을 사용한다. 단백질은 전기영동 중에 이동되고 분리된다. SDS는 전기영동 후 제거되고, 겔은 이후 효소 활성에 필요한 필수 보조인자와 함께 인큐베이션된다. 매립된 젤라틴은 MMP-9에 의해 분해되어 쿠마시 블루 염료로 염색한 후 진청색 배경에 투명한 밴드를 생성할 수 있다. 젤라티나제 활성은 이미지 분석 소프트웨어로 평가할 수 있는 밴드 밀도계측으로 표현된다. 젤라틴 겔 자이모그래피는 비교적 저렴한 비용의 매우 민감한 기법이다(Leber & Balkwill, 1997). 추가로, 이러한 접근법은 겔을 통한 이들의 이동 거리에 기초하여 구별될 수 있기 때문에 pro- 및 활성 MMP 둘 모두의 젤라티나제 활성을 동시에 검출할 수 있다(Rossano et al., 2014).
MMP-9 효소를 5 ㎍/㎖의 최종 시험 농도로 희석하였다. 웰 당 10 ㎕의 총 로딩 부피를 달성하도록 MMP-9 효소를 로딩 완충액 및 물과 약하게 혼합하였다. 겔 전기영동을 XCell SurelockTM Mini-Cell 시스템(Thermo Fisher Scientific, 오클랜드, 뉴질랜드)를 사용하여 수행하였다. 상부 챔버에 200 ㎖의 1X 트리스-글리신 SDS 러닝 완충액을 채우고, 하부 챔버에 600 mL를 채웠다. 겔을 105 분 동안 125 V의 정전압 및 30 mA(시작 전류)에서 작동시켰다. 전기영동 후, 겔을 제거하고, 약하게 교반하면서 30 분 동안 1X 재생 완충액에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 겔을 조심스럽게 더 작은 조각으로 절단하고, 추가로 1X 현상 완충액 또는 3,6,7-트리메틸루마진 보충 현상 완충액에서 약한 교반 하에 30 분 동안 별개로 인큐베이션하였다. 겔을 추가로 3,6,7-트리메틸루마진의 존재 또는 부재 하에서 새로운 현상 완충액과 함께 37℃에서 13 시간 동안 인큐베이션하였다. 또한 NNGH를 양성 대조군으로서 2.6 μM의 현상 완충액에 첨가하였다.
인큐베이션 후, 젤라틴 겔을 약한 교반 하에 물로 3 회(각각 5 분) 헹궜다. 20 ㎖의 SimplyBlue Safestain을 첨가하여 겔을 염색하고, 약한 교반 하에 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이를 SimplyBlue Safestain을 제거함으로써 탈색하고, 약한 교반 하에 실온에서 2 시간 동안 물로 헹궜다. MMP-9 활성을 ImageJ 버전 1.52a에서 밀도계측을 사용하여 분석하였다.
결과
MMP-9에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 생체활성을 정상 현상 완충액에서 인큐베이션된 젤라틴 겔을 3,6,7-트리메틸루마진-보충 및 NNGH-보충 완충액과 비교함으로써 젤라틴 자이모그래피를 사용하여 추가로 검사하였다. 이 연구에 사용된 MMP-9 효소를 분자 상호작용에 대한 더 많은 정보를 제공하기 위해 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트(4-APMA)에 의해 부분적으로 활성화시켰다. 겔 상의 투명한 밴드는 도 7에 나타낸 바와 같이 MMP-9로부터의 젤라티나제 활성을 나타낸다. 상단의 투명한 밴드는 불활성 MMP-9(약 47 kDa)의 피브로넥틴 도메인으로부터의 젤라티나제 활성을 나타낸다. 하단 밴드는 활성 MMP-9로부터의 젤라티나제 활성을 나타내며, 여기서 pro-도메인은 절단된다(약 37 kDa). 전기영동 동안, pro-MMP-9는 SDS에 의해 변성된 다음, Triton X-100과 같은 세제로 SDS를 제거하여 재생하였다(Ren, Chen, & Khalil, 2017). 이러한 리폴딩 과정은 pro-도메인을 절단하지 않으면서 소정 비율의 pro-MMP-9를 자가활성화시킨다(Woessner, 1995). 그러나, 자가활성화된 pro-MMP-9는 생체내에서 실제 활성을 나타내지 않을 수 있다.
3,6,7-트리메틸루마진은 젤라틴 자이모그래피를 사용하여 활성 및 불활성 MMP-9 둘 모두로부터 감소된 젤라티나제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 억제제가 없는 음성 대조군(도 7, 컬럼 3 내지 컬럼 5)과 비교하여, 두 투명 밴드 모두의 면적은 3,6,7-트리메틸루마진-처리 겔에서 감소된 것으로 나타났다(도 7, 컬럼 6 내지 컬럼 8). 양성 대조군 NNGH는 활성 MMP-9로부터 젤라티나제 활성을 완전히 억제하였다(도 7, 컬럼 9 내지 컬럼 10). 불활성 MMP-9로부터의 NNGH-처리 겔에서 일부 젤라티나제 활성이 있는 것으로 보였는데, 이는 아마도 피브로넥틴 도메인으로부터의 잔류 젤라티나제 활성의 결과이다.
3,6,7-트리메틸루마진은 활성 및 불활성 MMP-9 둘 모두로부터 젤라티나제 활성을 유의하게 감소시켰다(도 8, 둘 모두 p<0.001). 3,6,7-트리메틸루마진 및 NNGH로부터의 억제 백분율을 밀도계측에 의해 분석하고, 도 8에 플롯팅하였다. 억제 백분율은 광학 밀도를 음성 대조군(억제제 없음)과 비교함으로써 계산되었다. 나타낸 바와 같이, 3,6,7-트리메틸루마진은 활성 및 불활성 MMP-9의 활성을 각각 31% 및 17%까지 유의하게 억제하였다(둘 모두 p<0.01). 3,6,7-트리메틸루마진은 불활성 MMP-9에 비해 활성 MMP-9에 대하여 유의하게 더 강한 억제를 나타냈다(p<0.05)는 점이 주지되어야 한다. 이는 3,6,7-트리메틸루마진이 MMP-9의 아연 활성 부위와 더 많이 상호작용할 가능성이 있다는 것을 시사한다. 또한, NNGH가 아연 이온과 특이적으로 상호작용하는 NNGH 처리에서도 동일한 패턴이 관찰될 수 있다(Bertini et al., 2005).
실시예 4 - MMP-9로의 3,6,7-트리메틸루마진의 분자 도킹
본 실시예에서, 3,6,7-트리메틸루마진과 MMP-9 사이의 비-공유 상호작용을 예상하기 위해 분자 도킹 연구를 수행하였다.
원리
분자 도킹은 리간드와 생체거대분자 표적의 비-공유 상호작용을 예상하기 위해 시도되는 계산 절차이다. AutoDock 및 AutoDock Vina는 일반적으로 연구자들이 생체분자 복합체를 결정하는 데 도움을 주기 위해 흔히 사용되는 계산 도구이다. 소프트웨어는 모든 비틀림 자유(torsional freedom)를 효율적으로 탐색하면서 표적화된 단백질과 리간드 사이의 최소 상호작용 에너지를 계산한다. AutoDock은 경험적 자유 에너지 힘 장과 신속한 Lamarckian 유전 알고리즘 검색 방법에 기초한다(Goodsell & Olson, 1990; Morris et al., 2009). AutoDock Vina는 속도 및 정확성을 유의하게 향상시키는 더 간단한 스코어링 기능 및 신속한 구배-최적화 형태 검색을 사용한다(Trott & Olson, 2010).
방법 및 재료
MMP-9 및 3,6,7-트리메틸루마진에 대한 분자 도킹 연구를 AutoDock Vina v1.1.2를 사용하여 수행하였다. 도킹 준비, 도킹 후 분석 및 시각화를 Chimera v1.13.1에서 수행하였다(Pettersen et al., 2004). 3,6,7-트리메틸루마진의 3D 구조는 Avogadro v1.2.0에 도시되었다(Hanwell et al., 2012). MMP-9(PDB ID: 1L6J)의 전체 3D 결정학적 구조를 RCSB 단백질 데이터 뱅크를 통해 검색하였다(Elkins et al., 2002).
키메라(Chimera)를 사용하여 두 화합물 모두에 대해 도킹 준비를 수행하였다. Smart Minimizer 알고리즘을 이용함으로써 3,6,7-트리메틸루마진 구조를 최소화하였다. 비틀림 각도의 검출 및 Gasteiger 전하의 배정도 키메라에서 수행하였다. 수소 원자를 추가하고, 비-극성 수소 원자를 병합하고, 누락된 원자를 확인하고, Gasteiger 전하를 배정함으로써 MMP-9 구조물을 제조하였다. 격자 박스를 Å3=35, 45, 48(x,y,z 좌표=30, 30, 35)의 부피로 MMP-9 효소의 촉매 도메인에 한정하였다. 이는 도킹 계산에 수반된 단백질의 면적을 한정하였다.
AutoDock Vina에서 완전성을 8로 설정하고 결합 모드의 수를 10으로 설정하여 분자 도킹을 수행하였다. 최고 점수를 갖는 최상의 결합 형태를 AutoDock Vina에 나열하고, 키메라에서 시각화하였다. 각 결합 포즈(binding pose)에 대한 잠재적 분자간 수소 결합도 키메라에서 분석하였다.
결과
분자 도킹은 3,6,7-트리메틸루마진과 MMP-9 사이의 유의한 결합 친화성을 예상하였다. 3,6,7-트리메틸루마진은 AutoDock Vina를 사용하여 -7.9의 최고 도킹 점수로 MMP-9의 활성 부위에 성공적으로 도킹되었다(표 2). AutoDock Vina 점수는 수소 결합, 소수성 상호작용 및 비틀림 패널티의 조합을 고려하여 두 화합물이 결합하는 데 필요한 예상 에너지를 나타낸다(Chang, Ayeni, Breuer, & Torbett, 2010). 결과적으로, 가장 유리한 결합 형태는 음의 점수로 표현된다. 비교하여, 가장 활성인 합성 MMP-9 억제제의 도킹 점수는 AutoDock Vina를 사용하여 -7.6 내지 -8.9의 범위였다(Rathee et al., 2018).
[표 2]
Autodock Vina에 의해 계산된 예상 점수.
3,6,7-트리메틸루마진은 Tyr420 잔기와 수소 결합을 형성함으로써 S'1 기질 결합 부위에 도킹되었다. S'1 기질 결합 부위는 활성 부위 아연에 가장 근접하게 쪼개진 활성 부위의 중심에 프레임화된다. 다른 결합 포켓과 비교하여, S'1 포켓은 아미노산 구성과 포켓의 깊이 둘 모두에서 MMP에 따라 다르다(Aureli et al., 2008). 결과적으로, S'1 포켓은 기질 결합 특이성을 결정하고, 다수의 MMP 억제제에 대한 표적이다. 특히 MMP-9의 경우, 상이한 억제제와의 공-결정화는 Arg424 잔기가 고도로 가요성이며, 이것이 일부 MMP 억제제가 S1' 포켓으로 이동할 수 있게 한다는 것을 드러냈다(Tochowicz et al., 2007).
이전의 도킹 연구에서, 카복실산 및 설폰아미드 하이드록사메이트 기를 갖는 합성 억제제는 S'1 포켓에 결합되었고; 반면에, 티오-에스테르 기는 S'1 포켓 및 S1 포켓 둘 모두와 상호작용한다(Tandon & Sinha, 2011). 잠재적 수소 결합은 MMP9의 S'1 공동의 벽 부근에서 3,6,7-트리메틸루마진의 N-H 기와 Tyr420 사이에서 확인되었다(도 9). S'1 벽 잔기는 흔히 기질 또는 억제제(Tyr420, Pro421, Tyr423)에 대한 주쇄간 수소 결합을 위한 수소 수용체로서 작용한다(Tandon & Sinha, 2011). 카보닐기 또는 N-H 기를 갖는 아연 결합 억제제는 S1' 포켓과의 수소 결합 상호작용에 대한 기회를 제공한다(Tandon & Sinha, 2011). 두 구조 모두 3,6,7-트리메틸루마진에 존재한다.
이러한 결과들은 추가로 피브로넥틴 II 형 도메인 내에 위치한 MMP-9의 엑소사이트에서 3,6,7-트리메틸루마진의 결합을 뒷받침하였다. 본 발명자들은 MMP-9와의 3,6,7-트리메틸루마진의 높은 골드 스코어(53.4)를 추가로 확인하였다(도킹은 리간드 당 총 10 회의 GA 실행 및 최대 검색 효율로 GOLD v5.7.3에 의해 수행됨. 도킹된 포즈(docked pose)는 GoldScore로 스코어링됨). 이러한 결과들은 3,6,7-트리메틸루마진이 젤라틴의 결합을 방해함으로써 MMP-9의 엑소사이트와 상호작용할 수 있다는 것을 뒷받침하였다. 분자 도킹 분석으로부터의 결과는 추가로 피브로넥틴 II 형 도메인 내에 위치하는 MMP-9의 엑소사이트에서 3,6,7-트리메틸루마진의 결합을 뒷받침하였다.
실시예 5 - 위장 환경 모의
3,6,7-트리메틸루마진의 항-염증성 생체활성이 위장내 소화 동안 유지될 수 있는 정도는 알려져 있지 않다. 이러한 생체활성 분자는 낮은 pH에서 또는 소화 효소에 의해 변형을 거치고, 부분적으로 또는 완전히 이의 생물학적 활성을 잃을 수 있다.
3,6,7-트리메틸루마진-함유 꿀 샘플의 모의 위내 소화, 이어서 모의 장내 소화를 시험관내에서 수행하였다. 이러한 과정 동안 소정의 시점에 3,6,7-트리메틸루마진의 잔류량을 분석하기 위해 위내 소화물(gastric digesta) 또는 장내 소화물(intestinal digesta)을 분리하였다.
재료 및 방법
위장 환경 모의:
모의 위장내 소화를 정적 모델을 사용하여 수행하였다. 모의 위액(SGF) 및 모의 장액(SIF)은 글로벌 컨센서스 프로토콜(Minekus et al 2014)에 따라 제조하였다. SGF는 위의 섭식 상태를 모사하기 위해 pH 3을 갖는다. 마누카 꿀(또는 꿀 용액)과 혼합되면 최종 혼합물에는 2000 U/㎖의 펩신이 함유된다. 사용 전 2 ㎎/㎖의 판크레아틴(8 × USP, 또는 200 U/㎖의 프로테아제 활성 기준) 및 20 mM의 돼지 담즙 추출물을 함유하는 SIF는 소장의 섭식 상태를 모사하기 위해 pH 7을 갖는다.
위내 소화:
모의 위내 소화에서, 2 g의 마누카 꿀을 2 h의 기간 동안 95 rpm 진탕 하에 37℃에서 2 ㎖의 SGF에서 인큐베이션하였다(삼중). 선택된 시점(0 분, 30 분, 60 분 및 120 분)에 소정 부피(0.1 ㎖)의 혼합물을 3,6,7-트리메틸루마진 분석을 위해 회수하였다. 분석을 위한 용액을 펩신 활성을 정지시키기 위해 0.1 ㎖의 SIF(pH 7)를 첨가하여 얼음 위에 유지시켰다. 대조군으로서 순수한 3,6,7-트리메틸루마진 용액을 비교 목적으로 동일한 방식으로 처리하였다.
장내 소화:
2 h의 위내 소화 후, 1 ㎎/㎖의 판크레아틴 및 10 mM의 돼지 담즙 추출물을 함유하는 최종 혼합물을 갖도록, 생성된 용액을 1:1의 부피비로 SIF(pH 7)와 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 95 rpm의 진탕 하에 4 h 동안 인큐베이션하였다(삼중). 선택된 시점(0 분, 60 분, 120 분 및 240 분)에 소정 부피(0.1 ㎖)의 혼합물을 3,6,7-트리메틸루마진 농도 분석을 위해 회수하였다. 회수된 용액에서 판크레아틴 활성은 5 mmol/ℓ의 Pefabloc®를 첨가함으로써 켄칭시켰다(Egger et al 2019).
3,6,7-트리메틸루마진 보유 분석:
3,6,7-트리메틸루마진 분석을 위한 위내 소화물 및 장내 소화물을 HPLC 분석 전에 불용성 분획(예를 들어, 판크레아틴)을 제거하도록 처리하였다. 간략히, 모든 샘플을 0.1% 포름산으로 희석한 다음 14,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하였다. 분석을 위해 상청액을 채취하였다. 상이한 시점에 3,6,7-트리메틸루마진의 양을 문헌에 보고된 바와 같이 이전에 3,6,7-트리메틸루마진 및 렙토스페린을 분석하기 위해 사용된 역상 HPLC 시스템을 사용하여 분석하였다(Bin Lin et al 2017). 간략히, 샘플을 0.1% v/v 포름산에서 5 배 희석하였다. Hypersil GOLD 컬럼(150 × 2.1 mm, 3 μM 입도)은 고정상(25℃)으로 사용되고, 이동상은 0.1% 포름산(상 A) 및 80:20 아세토니트릴:0.1% 포름산(상 B)으로 이루어질 것이다. 주입 부피는 3 ㎕이고, 유량은 0.200 ㎖이고, 다음과 같은 구배 용리를 사용하여 3,6,7-트리메틸루마진 등을 분리하였다: 초기 2 분(5% 상 B), 7 분째(25% B), 14 분째(50% B), 16 분째(100% B), 19 분째(5% B) 및 20 분째(5% B, 유지 10 분). 3,6,7-트리메틸루마진의 신호는 320 nm에서 검출되었다.
통계 분석:
두 개의 평균 값 사이의 차이 유의성을 양측 독립표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석하였다. 두 개 초과의 평균 값을 비교했을 때, 유의성 차이를 일원배치 분산 분석, 이어서 Bonferroni의 다중 비교 검정에 의해 분석하였다(SPSS Statistics 버전 24, IBM). 차이는 p<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
4개의 꿀 샘플의 모의 위장내 소화의 결과는 마누카 꿀로부터의 3,6,7-트리메틸루마진이 소화관의 가혹한 환경에서 매우 안정적이라는 것을 나타냈다. 연구의 종료, 즉, 2 h의 위내 소화 + 4 h까지 장내 소화까지 4개의 꿀 샘플로부터의 초기 3,6,7-트리메틸루마진 양의 거의 100%가 소화물에서 완전히 회수될 수 있었다. 확실한 분해는 관찰되지 않았다. 상세한 역학은 도 10 및 도 11에 나타나 있으며, 여기서 처음 2 h 안에 3,6,7-트리메틸루마진이 모의 위액에서 인큐베이션되었고, 반면에 후속 4 h는 장내 소화 단계를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD를 나타내고, n = 3이다. 원시 데이터는 표 3에 요약되어 있다.
실험 결과의 세부 사항
[표 3]
* 기술적인 문제로 인해 3 회가 아닌 2 회 반복에 기초함.
표 3: 4개의 마누카 꿀 샘플(A, B, C, D)의 위장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 잔류량. 데이터는 평균 ± SD을 나타내고, n=3임.
후속 연구에서, 상이한 농도의 마누카 꿀에서 3,6,7-트리메틸루마진의 안정성을 이해하기 위해 희석된 마누카 꿀 샘플의 위장내 소화를 수행하였다. 또한 3,6,7-트리메틸루마진(순수 화합물)의 안정성을 동일한 시험관내 소화 프로토콜을 이용하여 시험하였다. 결과는 3,6,7-트리메틸루마진의 안정성이 소화되지 않은 미가공 꿀의 안정성 프로파일과 비교할 때 50 %(w/w)의 마누카 꿀 용액(도 12 및 도 13)에서, 또는 소화 배지에 직접적으로 노출 시(도 14 및 도 15) 변하지 않는다는 것을 나타냈다. 데이터는 평균 ± SD를 나타내고, n = 3이다. 유의한 분해는 관찰되지 않았다. 상세한 역학을 보여주는 원시 데이터는 표 4에 요약되어 있다.
[표 4]
표 4: 50% (w/w)의 마누카 꿀 용액(A, B, C, D) 및 3,6,7-트리메틸루마진 화합물의 위장내 소화 동안 3,6,7-트리메틸루마진의 잔류량. 데이터는 평균 ± SD을 나타내고, n=3임.
소화관에서 3,6,7-트리메틸루마진 운명(fate)에 대한 시험관내 연구는 희석된(50% 희석) 마누카 꿀 샘플 A, B, C 및 D로부터, 그리고 이의 가장 순수한 형태에서 시험하는 경우, 생체활성 화합물 3,6,7-트리메틸루마진의 높은 안정성을 분명히 나타냈다.
실시예 6 - 인간 대식세포 세포주에서 기질 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 효과
본 발명자들은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 기법을 이용하여 인간 대식세포 세포주(THP-1)에서 지질다당류(LPS) 유도 MMP-9 분비를 억제하는, 마누카 꿀에 존재하는 3,6,7-트리메틸루마진의 효능을 조사했다.
대식세포는 MMP-9 분비가 증가된 세균 인자와 친-염증성 사이토카인 둘 모두에 반응하는 것으로 알려져 있기 때문에 위 MMP의 잠재적인 공급원이다. 따라서, THP-1로부터의 MMP-9 분비는 위 염증의 마커로 사용될 수 있다.
2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 MMP-9 억제 활성에 대하여 시험하였다. 아지트로마이신을 양성 대조군으로 선택하였다. 40 ㎍/㎖(38% 감소) 및 30 ㎍/㎖(23% 감소)의 3,6,7-트리메틸루마진은 20 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖에 비해 LPS(1 ㎍/㎖) 처리 분화된 THP-1 세포로부터 MMP-9 분비를 유의하게 감소시켰다(p<0.05). 40 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 MMP-9를 감소시켰고, 이러한 감소는 30 ㎍/㎖ 초과의 아지트로마이신보다 약간 높았다. 그러나, 세포 생존율 보고에 기초하면, 30 ㎍/㎖(13% 세포 사멸)은 40 ㎍/㎖(20% 세포 사멸)보다 약간 더 안전하다.
방법
용량:
3,6,7-트리메틸루마진을 분화된 THP-1 세포를 사용하여 MMP-9 염증 반응의 이의 억제에 대하여 2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖의 용량으로 시험하였다.
세포 배양:
THP-1 세포(ATCC, ATCTIB202)를 RPMI-1640(Gibco, 11875093) + 0.05 mM 2-머캅토에탄올 + 10% 소 태아 혈청(FCS) + 1% 펜-스트렙에서 성장시켰다. 실험을 위해, 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)만이 있는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
THP-1 단핵구 세포를 96-웰 플레이트에 2.5×105 개 세포/㎖의 밀도로 시딩하고, 72 시간 동안 10 ng/㎖의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Bergin et al)(Sigma, P1585-1MG, Lot# SLBX889, 100% 순도)를 사용하여 대식세포로 분화시켰다. 그 후에, PMA 배지를 분화된 THP-1 세포로부터 제거한 다음, 세포를 RPMI-1640 배지에서 1 회 세척한 다음 약 5 시간 동안 정치시켰다.
LPS 자극 및 3,6,7-트리메틸루마진에 의한 처리:
분화된 THP-1 세포를 이. 콜라이(E. coli) 055:B5(Sigma, L6529; Lot#037K4068)로부터 LPS로 자극하였다. LPS를 1 ㎍/㎖의 농도에서 시험하였다(Kong et al). 세포를 LPS 단독으로 또는 2.5 ㎍/㎖ 내지 40 ㎍/㎖의 농도 범위의 3,6,7-트리메틸루마진(오클랜드 대학으로부터 수령하고, 1 ㎎/㎖의 스톡 농도로 RPMI-1640에 희석하고, 스톡을 사용 전 2 일 동안 냉장고에 보관함)과 조합하여 인큐베이션하였다. 6 μM 아지트로마이신(Sigma, Cat#75199-25MG, Lot#069M4826V)을 양성 대조군으로서 사용하였다(Vandooren et al). 이어서, 세포를 24 시간 동안 상이한 처리로 인큐베이션하였다(Kong et al). 24 시간 후, 세포 배양 배지를 수집하고, MMP-9 ELISA(R&D systems, RDSDY91105 lot# P239459 및 DY008 Lot #P239900)를 사용하여 MMP-9 농도를 측정하였다. 세포를 이후 세포 생존율을 위해 WST-1과 함께 인큐베이션하였다.
2개의 추가 96-웰 플레이트를 상기와 같이 처리하고, 배지를 제거하고, 추후 RT-PCR 실험을 위해 세포를 함유하는 플레이트를 -80℃에서 동결시켰다.
Elisa 특이성:
이러한 인간 MMP-9 검정은 92 kDa pro-MMP-9 및 82 kDa 활성 MMP-9를 측정한다. 이는 65 kDa 형태를 측정하지 않는다. 이 검정은 또한 인간 공급원 물질로부터 단리된 리포칼린-2/NGAL에 복합체화될 때 인간 MMP-9를 인식한다.
50 ng/㎖로 제조된 하기 인자들을 분석하였고, 이들은 교차 반응성 또는 간섭을 나타내지 않았다: MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-12, MMP-13, MMP-14, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, TIMP-4, 재조합 마우스 MMP-9.
재조합 인간 TIMP-1은 이 검정에서 교차 반응하지 않지만, 1.56 ng/㎖ 초과의 농도에서 간섭한다.
세포 생존율 및 예비 MMP-9 분비 시험:
상이한 용량에서 3,6,7-트리메틸루마진의 세포독성을 측정하기 위해, 2-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노소듐 염(WST-1)(Roche, 11644807001, Lot#45255800)을 사용하였다. WST-1은 비색 검정을 이용하여 세포 증식, 생존율 및 세포독성을 측정하기 위한 세포 증식 시약이다(Gosert(2011); Peskin(2000)).
인큐베이션 후, ELISA를 사용하여 MMP-9 분비 시험을 위해 배양 배지의 일부를 채취하고 저장하였다. 다음으로, 플레이트에 남아 있는 배지를 제거하고, RPMI-1640 배지(1:10 희석) 중 100 ㎕의 WST-1을 각 세포 웰에 첨가하고, 추가 4 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 450 nm의 파장에서 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 세포독성을 하기와 같이 계산하였다:
[각 샘플에 대한 WST-1 점수/대조군에 대한 WST-1 점수] × 100
80% 미만의 WST-1 점수가 세포 독성으로 간주될 것이다.
통계 분석:
가변성을 더 잘 포착하기 위해, 각 처리를 각 플레이트(2개의 플레이트)에서 적어도 삼중으로 수행하였다. 삼중 웰로부터의 배지를 풀링하고, MMP-9 ELISA에 대해 이중으로 분석하였다. 엑셀로 LPS가 있는 배지와 다른 치료법 간 스튜던트 검정을 수행하였다.
결과
40 ㎍/㎖ 농도의 3,6,7-트리메틸루마진은 연구에서 선택된 다른 농도(2.5 ㎍/㎖ 내지 30 ㎍/㎖)보다 약간 더 많은 세포독성 %를 가졌다(도 16). 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 그러나, 이는 독성의 존재에 대한 고려에 있어서 경계선(79.8)이었다. 40 ㎍/㎖(38% 감소) 및 30 ㎍/㎖(23% 감소)의 3,6,7-트리메틸루마진은 20 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖에 비해 LPS(1 ㎍/㎖) 처리 분화된 THP-1 세포로부터 MMP-9 분비를 유의하게(P<0.05) 감소시켰다(도 17). 도 17에서, 소문자는 치료 간 유의한 차이를 나타낸다. a - 40 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 mmp-9 분비를 억제하고(P = 0.02); b - 30 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 mmp-9 분비를 억제한다(P = 0.02). 40 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 30 ㎍/㎖ 초과의 아지트로마이신보다 MMP-9를 더 많이 감소시켰다. 조정 값(LPS 관련)은 도 18에 제시되어 있다. 도 18에서 소문자는 처리 간의 유의한 차이를 나타낸다. a - 40 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 mmp-9 분비를 억제하고(P = 0.00), b - 30 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진은 mmp-9 분비를 억제하고(P = 0.04); c - 아지트로마이신은 mmp-9 분비를 억제한다(P=0.00).
실시예 7: 분자 도킹 - TG2, COX-2 및 JAK
분자 도킹은 안정한 부가물을 제공하기 위해 2개 이상의 분자의 상호작용을 포함하는 생물정보학 모델링이다. 이는 관심 표적에 대한 리간드의 결합 능력을 예측하는 데 사용된다. 리간드 및 표적의 결합 성질에 따라, 이는 임의의 복합체의 3차원 구조를 예측한다. 공동-결정화된 리간드 및 표적의 추가적인 공지된 억제제(예를 들어, TG2, COX-2 및 JAK)를 도킹하여 포즈 예측 품질을 검증하고 활성 리간드에 대한 양성 대조군으로서 작용하였다. 예를 들어, TG2, COX-2 또는 JAK 친화성을 갖는 것으로 알려지지 않은 화학적 또는 약리학적으로 관련된 리간드를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 모든 화합물은 Chem3D v18.1에서 MMFF94 힘-장으로 최소화되었다. 리간드 당 총 10 회 GA 실행 및 최대 검색 효율로 GOLD v5.7.3에 의해 도킹을 수행하였다. 도킹된 포즈를 골드스코어로 스코어링한 다음, 켐스코어로 다시 스코어링하였다.
결과
추정 JAK-1 리간드로서의 3,6,7-트리메틸루마진
스코어 클러스터의 분석은 공지된 활성물과 데코이 리간드 사이의 매우 분명한 차이를 보여준다. 3,6,7-트리메틸루마진(골드스코어 -43.31; 켐스코어 - 19.33)은 2개의 클러스터 사이의 공간을 차지하지만, 공지된 활성물의 중심보다 데코이 리간드의 중심에 더 가깝다.
3,6,7-트리메틸루마진의 기하학 및 전자 분석을 3-21G 기준 세트와 함께 양자 기계적 Hartree-Fock 방법을 사용하여 계산하였다. 3,6,7-트리메틸루마진의 구조에 대한 기하학 및 전자 분석은 아데노신의 아데닌 모이어티를 연상시키는 잠재적인 수소 결합 패턴을 갖는 음의 정전기 전위의 3 개의 별개의 영역을 나타냈다. 이론으로 국한시키지 않으면서, 본 발명자들은 JAK-1의 ATP 결합 부위에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 유의한 결합을 예측한다. 이는 ATP 결합 부위에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 구조적 친화성에 기인한다.
구조 데이터
다양한 리간드와 공동-결정화된 인간 JAK1의 결정학적으로-분해된 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 이용 가능하다. 항목 6N7A(도 19)는 이의 높은 분해능(1.33 Å) 및 3,6,7-트리메틸루마진에 대한 공동-결정화된 리간드의 화학적 유사성으로 인해 표적 구조로 선택되었다.
프로토콜 설계
공동-결정화된 리간드 및 추가의 공지된 JAK1 억제제는 도킹되어 포즈 예측 품질을 검증하고 활성 리간드에 대한 양성 대조군으로 작용하였다. JAK1의 다른 PDB 항목으로부터의 공동-결정화된 리간드 및 ChEMBL 데이터베이스에 보고된 JAK1 활성을 갖는 리간드는 활성 화합물 세트로서 사용되었다. 유사한 분자량 및/또는 구조를 갖는 소분자가 데코이 리간드로서 사용되었다. 화합물은 이들의 PDB ID(3 문자 코드) 또는 CHEMBL ID로 보고된다. 모든 화합물은 Chem3D v18.1에서 MMFF94 힘-장으로 최소화되었다. 리간드 당 총 10 회 GA 실행 및 최대 검색 효율로 GOLD v5.7.3으로 도킹을 수행하였다. 도킹된 포즈를 골드스코어로 스코어링한 다음, 켐스코어로 다시 스코어링하였다.
구조 6N7A에 대한 도킹
수소를 첨가하고 공동-결정화된 리간드 KEV를 제거하고 재도킹하여 포즈 예측을 검증하였다(도 20). 나머지 리간드를 동일한 실행으로 도킹시켰다. 다른 포즈가 공동-결정화된 리간드의 좌표와 더 상당히 중첩되는 경우를 제외하고는 최고-득점 포즈가 보고되었다(표 5).
[표 5]
스코어 클러스터의 분석(도 21)은 공지된 활성물과 데코이 리간드 사이의 매우 분명한 차이를 보여준다. 3,6,7-트리메틸루마진은 활성 및 데코이 리간드의 2개의 클러스터 사이의 공간을 차지한다. 이는 시험관내 3,6,7-트리메틸루마진의 잠재적 효능의 증거를 제공한다.
3,6,7-트리메틸루마진에 대한 최상위 순위 포즈의 분석은 3 개의 개별 리간드 원자로부터 Leu959 및 Ser961의 백본 헤테로원자까지의 H 결합 상호작용을 보여준다. (도 22).
이러한 H 결합의 존재는 고무적이지만, 상호작용은 임의의 아미노산 측쇄를 포함하지 않는다. 백본 상호작용은 활성 화합물의 결합 포즈에서 드물지 않지만, 대부분의 단백질 결합 부위가 노출된 백본 헤테로원자를 함유하기 때문에, H 결합에 의한 또는 방향족 상호작용을 통한 측쇄의 결합은 리간드에 특이성을 부여하는 데 필요하다. 이러한 관찰 및 클러스터 분석의 결과를 고려할 때, 3,6,7-트리메틸루마진은 임의의 명명된 JAK-1 활성물의 가장 높은 골드스코어를 갖는 것으로 나타났다.
추정 TG2 리간드로서의 3,6,7-트리메틸루마진
스코어 클러스터의 분석은 대부분의 데코이 리간드가 비교적 높은 켐스코어를 갖지만 낮은 골드스코어를 갖는 흥미로운 경향을 보여준다. 공동-결정화된 리간드 GDP 및 TG2의 다른 XRD 구조로부터의 리간드는 가장 높은 골드스코어뿐만 아니라 가장 낮은 켐스코어를 갖는다. 3,6,7-트리메틸루마진은 두 번째로 낮은 골드스코어(37.52)이지만 상당히 높은 켐스코어(20.38)를 갖는다.
구조 데이터
다양한 리간드와 공동-결정화된 인간 트랜스글루타미나제 2의 결정학적으로-분해된 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 이용 가능하다. 항목 1KV3(도 23)은 결합된 소분자(GDP)로 이용 가능한 야생형의 가장 높은 분해능(2.8 Å) 모델이었기 때문에 표적 구조로서 선택되었다.
프로토콜 설계
공동-결정화된 리간드 및 추가의 공지된 트랜스글루타미나제 2 억제제는 도킹되어 포즈 예측 품질을 검증하고 활성 리간드에 대한 양성 대조군으로 작용하였다. 다른 공동-결정화된 리간드 외에, ChEMBL 데이터베이스를 사용하여 활성 화합물 세트를 정의하기 위해 유리하게 낮은 IC50 값을 갖는 리간드를 확인하였다. 3,6,7-트리메틸루마진과 유사한 화학 구조 및/또는 분자량을 갖는 소분자 세트를 데코이 리간드로서 사용하였다. 모든 화합물은 Chem3D v18.1에서 MMFF94 힘-장으로 최소화되었다. 리간드 당 총 10 회 GA 실행 및 최대 검색 효율로 GOLD v5.7.3으로 도킹을 수행하였다. 도킹된 포즈를 골드스코어로 스코어링한 다음, 켐스코어로 다시 스코어링하였다.
구조 1KV3에 대한 도킹
수소를 첨가하고 공동-결정화된 리간드 GDP를 제거하고 재도킹하여 포즈 예측을 검증하였다(도 24). 나머지 리간드를 동일한 실행으로 도킹시켰다. 다른 포즈가 공동-결정화된 리간드의 좌표와 더 상당히 중첩되는 경우를 제외하고는 최고-스코어링 포즈가 보고되었다(표 6).
[표 6]
스코어 클러스터의 분석(도 25)은 대부분의 데코이 리간드가 비교적 높은 켐스코어를 갖지만 낮은 골드스코어를 갖는 흥미로운 경향을 보여준다. 공동-결정화된 리간드 GDP 및 트랜스글루타미나제 2의 다른 XRD 구조로부터의 리간드는 가장 높은 켐스코어뿐만 아니라 가장 낮은 골드스코어를 갖는다. 3,6,7-트리메틸루마진은 두 번째로 낮은 골드스코어를 갖지만 상당히 높은 켐스코어를 갖는다.
3,6,7-트리메틸루마진에 대한 최상위 순위 포즈의 분석은 Arg580에서 카르보닐 및 피라진 질소로의 H 결합 상호작용을 보여준다(도 26). 또한, Phe174와 피라진 고리 사이에 η-η 스태킹 상호작용이 존재한다.
그러나, 3,6,7-트리메틸루마진의 질소를 공여하는 H 결합과 효소의 골격 질소를 공여하는 H 결합 사이에는 충돌이 있다. 또한, 결합 포켓의 표면은 일반적으로 보이는 것보다 더 용매-노출되며, 메틸 치환체만이 매립된 공동에 위치한다. 이는 다른 도킹된 리간드와 비교하여 상대적으로 낮은 골드스코어(도 25)에 반영되는 상호작용의 강도를 상당히 약화시킨다. 요약하면, 높은 켐스코어는 시험관내에서 3,6,7-트리메틸루마진의 효능에 대한 실질적인 증거를 제공한다.
추정 COX-2 리간드로서의 3,6,7-트리메틸루마진
본 발명자들은 또한 3,6,7-트리메틸루마진이 COX-2에 결합하여 이를 억제하고, 따라서 COX-2 관련 질병을 치료하는 데 유용할 수 있다고 예측한다.
실시예 8:
LPS(이. 콜라이 O111:B4)-유도된 COX-2 단백질 발현의 억제
THP-1 인간 단핵구 세포에서 COX-2 발현을 억제하기 위한 3,6,7-트리메틸루마진의 시험관내 활성을 평가하였다. 순환 단핵구, 수지상 세포 및 장 상주 대식세포를 포함하는 단핵구 세포는 장관에 풍부하고, 대장염 및 장 염증의 매개를 포함하여 다수의 COX-2 관련 질병에서 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
재료 및 방법
THP-1 세포에서 샘플 세포독성
인간 단핵구 THP-1 세포를 밤새 성장 배지(10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지)에서 50,000 개 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직-배양 처리된 플레이트에 시딩하였다. 3,6,7-트리메틸루마진 샘플 희석액을 인산염 완충 식염수(PBS)에서 제조하고, 세포를 3,6,7-트리메틸루마진(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖), 10 ㎍/㎖ 덱사메타손, 10 μM 인도메타신, 또는 PBS 대조군에서 제조한 후 18 시간 동안 100 ng/㎖ LPS(이. 콜라이 O111:B4)로 자극하였다. 대조군 웰을 WST-1 시약(Roche, NZ)을 첨가하기 전에 1 시간 동안 과산화수소(0 mM, 0.5 mM, 1 mM, 및 2 mM)로 처리하였다. WST-1 시약을 18 시간 인큐베이션 기간의 종료 시 모든 웰에 첨가하고, 후속적으로 WST-1 첨가 30 분 및 1 시간 10 분 후에 흡광도 판독치를 측정하였다. 세포 생존율은 LPS-자극된 PBS 대조군으로부터의 변화 백분율을 나타냈다. 세포 생존율이 LPS-자극된 대조군의 80% 미만이고 LPS-자극된 또는 비자극된 대조군과 유의하게 상이한 샘플 용량은 세포독성으로 간주되었다.
THP-1 단핵구 세포의 LPS-자극
THP-1 세포를 성장 배지에서 500,000 개 세포/웰의 밀도로 12-웰 조직-배양 처리된 플레이트에 밤새 시딩하였다. 3,6,7-트리메틸루마진 샘플 희석액을 PBS에서 제조하고, 세포를 3,6,7-트리메틸루마진(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖), 10 ㎍/㎖ 덱사메타손, 10 μM 인도메타신, 또는 PBS 대조군으로 처리한 후 24 시간 동안 100 ng/㎖ LPS(이. 콜라이 O111:B4)로 자극하였다. 인도메타신은 수성 완충액에 가용성이지 않기 때문에, 인도메타신을 함유하지 않는 모든 웰에 세포 생존 또는 활성에 대한 임의의 DMSO 효과를 제어하기 위해 0.025% DMSO를 첨가하였다. 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제제(Sigma P2714)를 함유하는 RIPA 완충액에서 15 분 동안 얼음 위에 용해시켰다. 15 분 동안 14,000 xg에서 원심분리에 의해 잔해를 펠렛화하고, 웨스턴 블롯에 의한 이후 분석을 위해 용해물 상청액을 -80℃에서 동결시켰다.
COX-2의 단백질 발현
반정량적 COX-2(Abcam ab188183) 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯을 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액으로 용해된 THP-1 단핵구 세포에서 수행하였다. 총 10 μg의 단백질을 프리캐스트 10% 아크릴아미드 겔(BioRad, NZ)에 로딩한 다음, 실온에서 120 V의 전기영동에 의해 분리하였다. 이후, 단백질을 얼음 위에서 90 V로 90 분 동안 전기영동에 의해 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고, 막에 대한 비특이적 단백질 결합을 방지하기 위해 4℃에서 밤새 상용 완충액(BioRad 12010020)으로 차단하였다. 이어서, 막을 관심 단백질에 상응하는 일차 항체와 함께 1 h 동안 인큐베이션하였다. COX-2 및 β-액틴에 대한 일차 항체(하우스키핑 단백질; Biolegend 622102)는 모두 토끼로부터 공급되었다. PBS-Tween 완충액으로 3 회 10 분 세척 사이클 후, 막을 당나귀 항-토끼 IgG(H + L) HRP 접합체(Biolegend 406401)와 함께 1 h 동안 인큐베이션하였다. 이후, 막을 전술한 바와 같이 세척하고, ECL 웨스턴 블롯 기질 키트(BioRad 170-5061)를 사용하여 결합된 관심 항체를 검출하였다. 웨스턴 블롯 이미지를 Amersham™ Imager 600(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)으로 캡처하고, 단백질 밴드의 밀도계 측정을 수반된 이미지 분석 소프트웨어로 분석하였다.
통계 분석
웨스턴 블롯의 분석을 위해, 관심 단백질로부터의 밀도계 측정을 각 샘플에 대한 β-액틴의 밀도계에 표준화하였다. 스튜던트 T-검정을 적용하여 비처리 LPS-자극된 세포와 비교하여 3,6,7-트리메틸루마진, 덱사메타손 및 인도메타신으로 처리된 THP-1 세포로부터의 단백질 발현의 차이를 검출하였다. 유의성 수준은 p ≤ 0.05로 설정되었다.
결과
WST-1 세포 생존율 검정
도 27은 PBS, 10 ㎍/㎖ 덱사메타손(Dex), 10 μM 인도메타신(Indo) 또는 Lepteridine™ 3,6,7-트리메틸루마진(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)으로의 처리 및 18 시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로의 공동-자극 후 THP-1 세포에 대한 WST-1 검정에 의해 평가된 바와 같은 세포 생존율 퍼센트를 보여준다. 데이터는 평균 ± SD이다. 평균 80% 미만의 생존율(가로 점선)은 세포가 더 이상 생존할 수 없음을 나타낸다.
THP-1 세포에 대한 WST-1 세포 생존율 검정은 LPS(각각 1 ug/㎖ 및 100 ng/㎖), DEX 및 INDO의 농도가 세포 사멸을 유도하지 않았음을 보여주었다. THP-1 세포에서, 3,6,7-트리메틸루마진의 농도 중 어느 것도 세포 사멸을 유도하지 않았다(도 27). 3,6,7-트리메틸루마진에 의해 야기된 COX-2 단백질 발현의 임의의 유의한 감소가 세포의 손실보다는 COX-2와의 상호작용의 결과일 가능성이 있을 것으로 확신된다.
THP-1 세포에서 COX-2의 단백질 발현
상이한 용량의 3,6,7-트리메틸루마진, 덱사메타손 또는 인도메타신과 LPS로 공동-처리된 THP-1 단핵구에서 COX-2의 단백질 발현을 웨스턴 블롯에 의해 반-정량적으로 측정하였다.
[표 7]
THP-1 세포에서 COX-2 단백질 발현
표 7: LPS에 대한 노출 및 덱사메타손, 인도메타신 또는 3,6,7-트리메틸루마진으로의 공동-처리 후 THP-1 세포에서 COX-2 단백질 발현. 데이터는 6 개의 독립적인 실험(n = 6)으로부터의 평균 ± SEM이다.
도 28은 LPS 노출 및 덱사메타손, 인도메타신 또는 3,6,7-트리메틸루마진과 조합된 LPS로의 공동-처리 후 단핵구에서 COX-2의 단백질 발현이다. COX-2 단백질 발현에 대한 대표적인 웨스턴 블롯은 A에 제시되어 있다. 상이한 개입에 노출된 THP-1 세포에서 COX-2의 상대적인 단백질 발현은 B에 제시되어 있다. 데이터는 6 개의 독립적인 실험(n = 6)으로부터의 평균 ± SEM이다.
이 프로젝트에서 사용된 LPS의 농도에 대한 THP-1 단핵구의 노출은 COX-2 단백질 발현의 유의한 증가를 초래하였다. LPS 및 인도메타신(10 μmol/L)으로 THP-1의 공동-처리는 LPS-유도된 COX-2 발현을 유의하게 감소시키지 않았다. 이는 인도메타신이 COX-2 억제제이기 때문에 예상되었지만, 발현을 억제하는 것으로 당 분야에 공지되어 있지 않다.
시험된 모든 용량에서 3,6,7-트리메틸루마진으로 공동-처리된 THP-1 세포에서 COX-2의 평균 단백질 발현은 LPS-자극된 세포와 비교하여 감소하였는데, 이는 LPS-유도된 COX-2 단백질 발현에 대한 3,6,7-트리메틸루마진의 조절 효과를 가리킨다. 덱사메타손과 50 ug/㎖ 3,6,7-트리메틸루마진 둘 모두는 LPS 처리와 비교하여 COX-2 단백질의 유의한 감소를 나타냈다. 3,6,7-트리메틸루마진은 COX-2 단백질 발현을 LPS-자극된 세포와 비교하여 대략 16% 내지 23% 만큼 감소시켰다.
COX-2 단백질 발현은 양성과 음성 둘 모두로 조절되며, 이에 의해 COX-2에 의한 PGE2 생산의 감소는 COX-2 단백질의 감소를 야기한다(Cilenti et al., 2021; Inoue et al., 2000). 조절장애 염증 하에서, PGE2 및 다른 친염증성 프로스타글란딘의 높은 생산은 COX-2 단백질 발현 및 활성을 증가시킨다(Jabbour et al., 2005; Vichai et al., 2005).
참고문헌
Claims (36)
- 대상체에서 COX-2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
COX-2 관련 질병이 염증성 질병인, 방법. - 제2항에 있어서,
염증성 질병이 위장관의 염증과 관련된, 방법. - 제1항에 있어서,
COX-2 관련 질병이 위장 염증성 질환, 위궤양, 소화성 궤양, 위염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군(IBS), 소화기 질환, 위식도 역류성 질환(GERD), 속쓰림, 위산 역류, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염, 구강 궤양, 구내염, 인두염, 치은염, 식도 궤양, 염증성 및 퇴행성 신경계 장애, 신경정신병, 조현병, 양극성 기분 장애, 신경퇴행성 장애, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 신경계 장애, 파킨슨병, 발작, 뇌 저산소증/허혈, 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증, 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 만성 염증, 심혈관 질환, 암, 통증, 결장직장암(CRC) 및 근골격계 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제1항에 있어서,
COX-2 관련 질병이 통증인, 방법. - 제5항에 있어서,
통증이 급성 통증, 만성 통증 및/또는 월경통인, 방법. - 대상체에서 COX-2 관련 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서,
염증이 대상체의 위장관과 관련된, 방법. - 대상체에서 COX-2 관련 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서,
통증이 급성 통증, 만성 통증 및/또는 월경통인, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진의 기원이 꿀인, 방법. - 제11항에 있어서,
꿀이 실질적으로 렙토스페르뭄 스코파리움(Leptospermum scoparium), 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움(Leptospermum polygalifolium), 렙토스페르뭄 수브테누에(Leptospermum subtenue), 및/또는 이들의 조합으로부터의 꽃 기원인, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진의 기원이 렙토스페르뭄으로부터의 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질인, 방법. - 제13항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진의 기원이 렙토스페르뭄 스코파리움, 렙토스페르뭄 폴리갈리폴리움, 렙토스페르뭄 수브테누에, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된 식물로부터의 과즙, 뿌리, 열매, 종자, 껍질, 오일, 잎, 나무, 줄기 또는 기타 식물 물질인, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진이 합성인, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물이 꿀 또는 꿀 추출물을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 치료적 유효량의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 약 2.5 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖ 또는 약 80 ㎍/㎖의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제17항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서,
조성물이 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물이 액체 제형, 일용 소비재, 캡슐, 정제, 츄어블 정제, 겔, 로션, 분말, 좌약, 화장품 제형, 정맥내 제제, 근육내 제제, 피하 제제, 용액, 식품, 음료, 식이 보충제 또는 스프레이로서 제형화되는, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물이
● 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 제1 조성물을 선택하고;
● 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 적어도 하나의 추가 조성물을 선택하고;
● 제1 조성물을 제2 조성물과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 조성물을 수득함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물이
● 알려진 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는 제1 조성물을 선택하고;
● 선택된 제1 조성물을
○ 합성 3,6,7-트리메틸루마진;
○ 단리된 3,6,7-트리메틸루마진;
○ 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 꿀 추출물; 및/또는
○ 렙토스페르뭄 속의 식물로부터 직접적으로 유래된 3,6,7-트리메틸루마진 중 하나 이상
과 조합하여 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 3000 ㎎/㎏의 표준화된 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 조성물을 형성함으로써 수득된 표준화된 농도의 3,6,7-트리메틸루마진을 갖는, 방법. - 항-염증, 진통 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 조성물을 제조하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 꿀을 포함하는 제1 조성물을 시험하는 단계;
b. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 꿀을 포함하는 적어도 하나의 추가 조성물을 시험하는 단계;
c. 약 5 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀을 포함하는 조성물을 선택하는 단계;
d. 약 5 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진보다 큰 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀을 포함하는 적어도 하나의 추가 조성물을 선택하는 단계; 및
e. 꿀을 포함하는 선택된 조성물을 조합하여 적어도 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 80 ㎎/㎏의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 갖는 꿀 조성물을 형성하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제27항에 있어서,
꿀을 포함하는 조성물이, 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏, 약 15 ㎎/㎏, 약 20 ㎎/㎏, 약 25 ㎎/㎏, 약 30 ㎎/㎏, 약 35 ㎎/㎏, 약 40 ㎎/㎏, 약 45 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏, 약 55 ㎎/㎏, 약 60 ㎎/㎏, 약 70 ㎎/㎏ 또는 약 80 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진의 농도를 갖는 경우 선택되는, 방법. - 항-염증, 진통 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 것으로 조성물을 식별하는 방법으로서,
a. 3,6,7-트리메틸루마진 농도에 대해 조성물을 시험하는 단계; 및
i. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 초과의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 항-염증, 진통 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖는 것으로 조성물을 식별하는 단계; 또는
ii. 조성물이 약 5 ㎎/㎏ 미만의 3,6,7-트리메틸루마진 농도를 함유하는 경우 항-염증, 진통 및/또는 COX-2 억제 활성을 갖지 않는 것으로 조성물을 식별하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제29항에 있어서,
조성물이 꿀을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한, 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물.
- COX-2 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도.
- COX-2 관련 염증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도.
- COX-2 관련 통증을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도.
- 대상체에서 TG2 및/또는 JAK 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- TG2 및/또는 JAK 관련 질병을 예방하거나, 개선하거나, 치료하기 위한 의약의 제조에서 3,6,7-트리메틸루마진을 포함하는 조성물의 용도.
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