KR100418391B1

KR100418391B1 - 새로운 세포주기 조절인자 억제제 ｈｙ52, 그의 제조방법및 항암제로서의 용도

Info

Publication number: KR100418391B1
Application number: KR10-2001-0037116A
Authority: KR
Inventors: 조율희; 임혜영; 이민아; 서수민; 김민경; 서한규; 김지홍; 임융호; 이창호; 백두진
Original assignee: (주)디스진; 이철훈
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2004-02-11
Also published as: KR20030005441A

Abstract

본 발명은Bauhinia forficata로부터 순수 분리된 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적 허용염, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적 허용염은 암세포의 세포주기 조절인자 억제 능력 및 세포사멸 (아폽토시스) 유도 능력이 우수하므로 세포주기 조절인자 억제제뿐만 아니라 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

화학식 1

Description

새로운 세포주기 조절인자 억제제 ＨＹ52, 그의 제조방법 및 항암제로서의 용도{NOVEL INHIBITOR HY52 AGAINST CELL CYCLE REGULATING FACTOR, PREPARATION THEREOF AND USE THEREOF IN ANTI-CANCER AGENT}

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 그의 제조 방법 및 그의 항암제로서의 용도에 관한 것이다.

인류는 암에 대한 도전을 계속해 오고 있다. 항암제 개발의 역사를 살펴보면, 지금까지는 주로 암세포를 죽이는 물질의 개발에 주력해 왔다.

1954년 Streptomyces 속에서 분리된 L-아자세린(L-Azaserine)을 백혈병 치료에 사용한 이래, 미토마이신(mitomycin), 불리에마이신(bleomycin), 안트라마이신(anthramycin), 다우노마이신(daunomycin) 등이 개발되어 암 치료에 이용되고 있는데, 이러한 항암제들은 세포를 죽이는 물질들로서, 암세포뿐만 아니라, 정상세포에도 독성을 나타내는 것으로 부작용이 심각하였다.

이와 같이 종래의 항암제들은 정상세포까지 죽이는 경우가 많았기 때문에, 최근에는 정상세포에는 작용하지 않고 암세포에만 작용할 수 있는 새로운 기전의 항암제에 대한 연구가 진행되고 있다.

최근에, 암의 발생은, 세포가 정상적으로 분화되지 못하고 이상적으로 증식을 계속하기 때문인 것으로 밝혀짐에 따라, 항암제의 개발도 종래의 암세포를 죽이는 방법에서, 암세포의 분화를 촉진시키거나 세포주기를 조절하여 이상증식을 하고 있는 암세포의 증식을 억제시키는 방향으로 나아가고 있는 것이다.

진핵세포는 세포주기에 따라 증식한다. 진핵세포의 증식은 DNA합성 (Synthesis phase: S기)과 세포의 분열과정 (Mitosis phase: M기)이 주기적으로 일어나는 것으로서, S기와 M기 사이에는 G₁기, G₂기가 있으며, 진핵세포는 G₁→S→G₂→M기의 주기를 차례로 돌며 증식하게 된다. 세포분열을 끝낸 세포는 다시 G₁기로 들어가는데 이 G₁기는 세포 내 대사가 가장 활발한 시기로 대부분의 세포는 많은 시간을 G₁기로 존재하게 된다.

정상세포는 G₁기에서 외부에서 신호가 있으면 S기로 진입하며, G₂기를 거쳐 세포분열을 일으켜 증식하고, 외부신호가 없으면 세포주기가 중단되어 G₁기에서 오래 정지된 상태인 G₀기로 존재한다. 반면, 암세포는 외부신호와는 상관없이 즉, 외부신호가 없는 경우에도 세포주기를 따라 DNA합성과 세포분열을 계속하면서 증식하고 있는 것이다. 따라서, 세포주기를 조절할 수 있다면, 세포주기를 중단시킴으로서 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것이다.

최근 일련의 연구를 통해 이러한 세포주기의 몇몇 지점을 조절하는 효소들이 밝혀졌는데, 이들은 모두 단백인산화 효소(Protein kinase A, Protein kinase C, 세포증식 촉진인자 등)이며 이중 가장 중요한 조절역할을 하는 것이 세포증식 촉진인자(Maturation Promoting Factor, MPF)인 것으로 밝혀졌다. 이 세포증식 촉진인자에는 cdc2 단백인산화 효소와 cdk2단백인산화 효소가 있다. 따라서, Cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소 저해제란 새로운 개념의 항암제라고 할 수 있다. 즉, cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소란 세포주기를 조절하는 물질로서, cdc2 및 cdk2단백인산화 효소를 조절함에 의해 세포주기를 조절할 수 있고, 세포주기를 조절함에 의해 세포의 성장을 억제시킬 수 있다. 따라서 이상증식하고 있는 암세포의 cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소의 활성을 억제시키면 암세포의 성장을 억제할 수 있는 새로운 개념의 항암제로 사용할 수 있는 것이다.

본 발명자들은 세포주기를 조절함으로서 암세포의 증식을 억제할 수 있는 새로운 기전의 항암제 개발에 노력한 결과,Bauhinia forficata로부터 신물질을 분리하였으며, 이 신물질이 cdc2단백인산화 효소 및 cdk2 단백인산화 효소 저해제로 작용하고 항암 특성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은Bauhinia forficata로부터 분리된 신물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신물질의 세포주기 조절제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신물질의 cdc2 및 cdk2단백인산화 효소 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 목적은 상기 신물질의 항암제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은Bauhinia forficata로부터 상기 신물질을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 분취 고성능액체크로마토그램

도 2는 본 발명의 화학식 1의 화합물 (KBr 펠렛)의 적외선 흡수 스펙트럼

도 3은 ESI/MS에 의하여 측정된 본 발명의 화학식 1의 화합물의 질량분석

도 4는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 양성자 핵자기 공명 스펙트럼 (400MHz)

도 5는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 (100MHz)

도 6은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 구조

도 7은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 세포 성장 억제 활성 (MTT assay)

도 8은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 헵쥐투 (HepG2) 세포주에서의 cdc2 및 cdk2 발현 억제

도 9는 본 발명의 화학식 1의 화합물의 헵쥐투 (HepG2) 세포주에서의 아폽토시스 유도 활성을 도시한 것이다.

본 발명자들은Bauhinia forficata로부터 새로운 물질을 분리하였으며, 상기 물질이 아래의 화학식 1을 갖고, cdc2 및 cdk2단백인산화 효소의 활성을 저해하고, 세포 주기를 조절하며 항암 특성이 우수하다는 사실을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 아래의 화학식 1의 화합물(HY52로 명명함) 또는 그의 약학적 허용염을 제공한다.

화학식 1

상기한 화합물의 약학적 허용염의 예로는 염산, 황산, 인산 등의 무기염, 및 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산, 글루탐산 등의 유기염 등, 약학적으로 허용할 수 있는 산부가염을 들 수 있다.

본 발명은 또한 상기한 화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 Pata de Vaca(Bauhinia forficata)로부터 용매를 사용하여 추출하는 단계, 추출액을 여과하고 농축시키는 단계 및 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로는 상기 제조방법은 다음의 단계를 포함한다.

a) Pata de Vaca(Bauhinia forficata)의 건조 잎을 분쇄기로 분쇄하고,

b) 상기 분쇄된 Pata de Vaca(Bauhinia forficata)를 용매로 추출하여 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 추출액을 얻고,

c) 상기 추출액을 여과하고, 여과액을 증류하여 농축시키고,

d) 크로마토그래피로 정제하여 상기 화학식 1의 화합물을 정제하는 단계.

상기 방법에 사용할 수 있는 용매의 종류는 화학식 1의 화합물을 효과적으로 추출할 수 있는 용매이면 특별히 제한되지 아니한다. 그 예로는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 에틸렌글리콜 등을 포함하는 알콜, 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소 등을 포함하는 할로겐 원자로 치환된 탄화수소류, 테트라히드로푸란, DMF. DMSO, 에틸아세테이트 등을 들 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 70% 에탄올을 사용하여 추출하였으나, 이것은 예시에 불과할 뿐, 화학식 1의 화합물이 다른 용매, 예를 들면, 클로로포름, 염화메틸렌, 테트라히드로푸란 등에도 잘 용해되므로 이들을 사용하는 것을 제한하는 것은 아니다. 추출 시 온도는 특별히 제한되지 아니하나, 시간의 단축을 위해 사용되는 유기 용매의 끓는점 부근의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 에탄올의 경우 약 75 - 80℃에서 수행하였으며, 이를 경우 약 3시간 정도의 시간이 소요되었다. 클로로포름의 경우 55 - 62℃에서 수행될 수 있으며, 약 2 시간 정도의 시간이 소요되었다. 메탄올의 경우 약 75 - 80 ℃에서 수행하였으며, 이를 경우 약 3 시간 정도의 시간이 소요되었다.

용매로 추출하여 얻어진 추출액은 여과 및 용매의 증류에 의해 농축된다. 용매의 증류는 통상 감압 증류에 의해 성취되나, 대기압 하에서 증류하는 것을 배제하는 것은 아니다.

감압 증류된 농축액은 크로마토그래피에 의해 순수한 화합물로 정제된다. 본 발명에서는 농축액을 교환 수지인 에이치피-20 다이아이온(HP-20 Diaion)관 크로마토그래피, 역상의 분리 수지인 씨-에이틴(C-18)관 크로마토그래피 및 분취 고속 액체 크로마토그래피(컬럼: Vydac C18, 25mm X 250mm, 유속: 20ml/분, 이동상: 50% 아세트니트릴, 검출: UV 230nm, 지지시간(R/T): 10분)에 순차 적용하였으나, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 크로마토그래피에 사용되는 물질 및 전개 용매를 다양하게 변형할 수 있음은 자명할 것이다. 또한, 필요할 경우, 재결정에 의해 보다 순수한 화합물을 얻을 수 있다.

분리한 물질을 물리화학적 특성 및 적외선 흡수 스펙트럼, 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과, 분자량이 294이고 C₁₇H₃₀O₂N₂의 분자식으로 표시되는 상기 화학식 1의 고리탄화수소 구조를 갖는 신물질임을 확인하였다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여(근육내, 피하, 정맥내, 좌약 등)에 의해 투여된다. 적당한 투여량은 환자의 상태, 예를 들면 연령, 나이 및 증상의 정도 등에 따라 적절히 조절할 수 있지만, 통상 성인의 경우 100 내지 500 mg의 용량 범위에서 일반적으로 일회 또는 수 회로 나누어 1일당 100 내지 1,000 mg의 양으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 1일 300 - 1,000 mg의 양으로 투여되는 것이다.

또한, 본 발명의 조성물을 경구용 제제로서 조제하는 경우에는 부형제, 또한 필요에 따라서 결합제, 붕괴제,활택제, 착색제, 교미교취제 등을 가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복 정제, 과립제, 캡슐제 등으로 한다. 부형제로서는 예를 들면 젖당, 옥수수 전분, 백당, 포도당, 솔비트, 결정 셀룰로스 등이, 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알콜, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 아라비아 고무, 트라가칸트, 젤라틴, 셸락, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필스타치, 폴리비닐피리돈 등이, 붕괴제로서는 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로스,탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산칼슘, 덱스트란, 펙틴 등이, 활택제로서는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화 식물유 등이, 착색제로서는 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이, 교미교취제로서는 예를 들면 코코아 분말, 박하뇌, 방향산, 박하유, 용뇌, 계피 분말 등이 사용된다. 이들의 정제는, 과립제에는 당의, 젤라틴의, 기타 필요에 따라 적절히 코팅하는 것을 배제하는 것은 아니다. 주사제로 조제하는 경우에는 필요에 따라, pH 조정제, 완충제, 안정화제, 보존제 등을 첨가하고, 통상적인 방법에 의해,피하, 근육내, 정맥 주사제로 한다. 본 발명의 화학식 1의 화합물은 필요에 따라, 염산, 황산, 인산 등의 무기염, 및 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산, 글루탐산 등의 유기염 등, 약학적으로 허용할 수 있는 산부가염으로서도 약효를 충분히 발휘시킬 수 있다.

세포증식 촉진인자인 cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소는 촉매소단위체(catalytic subunit)인 cdk와 조절소단위체(regulatory subunit)인 싸이클린(cyclin)으로 구성되는데, cdk는 효모에서 사람에 이르기까지 상당한 유사성을 가지고 있다. 고등생물에서 G₁/S와 G₂/M 전이는 두 개의 각기 다른 cdk에 의해 조절을 받는데 G₁/S 전이는 cdk2-싸이클린 A 복합체가, G₂/M 전이는 cdc2-싸이클린 B 복합체가 중요한 역할을 하고 있다. Cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소는 세린(serine)/스레오닌(threonine) 단백인산화 효소이며, 상기한 바와 같이 세포주기에서 가장 중요한 시점인 세포분열시기와 DNA 합성시기에 관여하므로, 이러한 cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소의 활성을 조절할 수 있다면, 이상 증식을 하고 있는 암세포의 증식을 조절할 수 있는 것이다.

본 발명자들은 상기 화학식 1의 화합물이 세포주기 조절의 가장 중요한 조절인자인 세포증식 촉진인자, 즉 cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소의 작용을 저해하여 세포증식을 억제한다는 사실을 확인하였다. 구체적으로는 세포 주기 조절에 관여하는 효소인 cdc2와 cdk2의 항체(antibody)를 이용하여 막에 부착시킨 후, HY52에 의한 이들 효소들의 발현 양상의 변화를 보기 위해, ECL-플러스 시약(ECL-plus reagent)으로 반응시킨 후 엑스-레이 필름에 노출하여 관찰하였으며, 그 결과, cdc2의 발현 양상은 화학식 1의 화합물을 약 80 ug/ml 처리했을 경우부터 줄어들기 시작하며, 약 110 ug/ml을 처리한 경우에는 거의 발현이 되지 않았다. Cdk2의 경우는 더욱 더 저해 활성이 뚜렷하여, 약 40 ug/ml의 농도로 처리했을 경우부터 서서히 발현의 감소가 일어나다가, 약 110 ug/ml의 경우엔 전혀 발현되지 않았다. 또한 세포의 하우스 키핑 (house-keeping) 단백질인 액틴의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 재시도해 본 결과, 모든 경우에 동일한 액틴의 발현 양상을 확인 할 수 있었다. 이러한 사실로부터 cdc2와 cdk2의 발현이 화학식 1의 화합물에 의해 특이적으로 저해됨을 알 수 있었다.

또한, 헵쥐투(HepG2, 간암세포)에 대한 세포 성장 억제율을 조사한 결과, 화학식 1의 화합물은 대조군의 세포 성장 억제율의 50%의 억제율을 나타내는 농도인IC₅₀치가 약 80㎍/ml (0.27 mM)을 나타내었다. 그리고, 마우스의 고형암에 대한 증식 억제 효과를 조사한 결과 화학식 1의 화합물을 투여한 경우 대조군에 비하여 고형암이 현저히 감소하였으며, 특히 약 100 mg/kg 농도로 투여했을 경우 통계학적으로 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 화학식 1의 화합물이 세포의 증식을 억제하는 효과가 뛰어나며 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 기술할 것이나, 이러한 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니며, 특허청구범위에 기재된 발명의 정신 및 보호범위 내에서 다양한 보완 및 변형이 가능하다는 것은 자명할 것이다.

<실시예>

본 발명자들은 미국 텍사스 소재 Rain-tree라는 아마존 유역의 열대 우림 식물 소재 공급처로부터 10kg의 Pata de Vaca(Bauhinia forficata)의 건조 잎을 입수하여, 70% 에탄올로 환류 추출(reflux extraction)하여 얻은 추출물로부터 실시예 1과 같은 방법으로 항암 활성 물질인 화학식 1을 갖는 화합물을 분리, 제조하였다. 제조 과정을 확립하기 위한 분석 방법으로는, 각 단계에 있어서 암세포를 이용한 MTT 분석 실험을 통한 세포 성장 저해 분석(cell growth inhibition assay)을 운용하였다.

<실시예 1> 화학식 1을 갖는 화합물(HY52)의 제조방법

Pata de Vaca의 건조 잎을 분쇄기에 의해 분말화 한 후, 70% 에탄올로 80℃에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 그 추출액을 여과 시킨 후, 여과액을 감압 농축하여 에탄올만을 제거시킨 후, 이온 교환 수지인 에이치피-20 다이아이온(HP-20 Diaion)관 크로마토그래피, 역상의 분리 수지인 씨-에이틴(C-18)관 크로마토그래피, 분취 고속 액체 크로마토그래피(컬럼: Vydac C18, 25mm X 250mm, 유속: 20ml/분, 이동상: 50% 아세트니트릴, 검출: UV 230nm, HY52의 지지시간(R/T): 10분)에 순차 적용하여 순수한 화학식 1의 화합물을 분리하였다.

분리한 물질 HY52는 물리화학적 특성 및 적외선 흡수 스펙트럼, 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과, 분자량이 294이고 C₁₇H₃₀O₂N₂의 분자식으로 표시되는 고리탄화수소의 구조를 갖는 신물질임을 확인하였다. 구체적인 물성 테스트 데이터는 다음과 같다.

물성 테스트

(1) 분취 고성능액체크로마토그라피 상의 특징을 도 1에 도시하였다.

(2) 용해성: 상기 화학식 1의 화합물은 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 염화메틸렌, 테트라히드로푸란 등에 잘 용해되었다.

(3) 적외선 흡수 스펙트럼

측정계기는 퍼킨엘머(Perkin Elmer)사의 파라곤 2000(Paragon 2000) FT-IR이었으며 HY52를 포타슘브로마이드(KBr)로 펠렛(pellet)을 만들어 측정하였다. 적외선 흡수 스펙트럼은 도 2에 도시하였다.

(4) 질량분석

측정계기는 VG사의 마크로매스오토스펙(Micromass Autospec)였으며 ESI/MS를 위한 용매는 메탄올(methanol)을 사용하였고 질량(m/z)은 294(도 3에서는 분자량 +나트륨 = 317)로 관찰되었다. 질량분석 스펙트럼은 도 3과 같다.

(5) 고성능질량분석

측정계기는 VG사의 마이크로매스오토스펙(Micromass Autospec)였으며 고성능질량분석 (HR/MS)을 위한 용매는 메탄올(methanol)을 사용하였다. 고성능질량분석 결과 얻은 원소 조성은 C₁₇H₃₀O₂N₂였고 실험값과 이론값의 차이는 -7.0 ppm이었다.

(6) 핵자기공명 스펙트럼

측정계기는 브루커(Bruker)사의 DPX400(9.4 T)이었으며 용매는 중수소클로로포름이었다.

가) 양성자 핵자기공명 스펙트럼

양성자 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 4에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다.

¹H-NMR(400MHz) δ: 0.86-1.02(m), 1.03-1.25(m), 1.30(m), 2.04-2.33(m), 2.64(s), 3.49(s), 4.16(s), 5.34-5.69(m)

나) 탄소 핵자기공명 스펙트럼

탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 5에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다.

¹²C-NMR(100MHz) δ: 14.2(q), 20.8(t), 27.6(t), 28.8(t), 28.9(t), 29.0(t), 29.4(t), 29.7(t), 35.3(t), 40.7(d), 72.2(d), 123.8(d), 125.9(d), 127.8(d), 132.9(d), 134.9(d), 135.2(d)

(7) 화학식 1을 갖는 화합물의 전체적 구조

탄소 핵자기공명 스펙트럼의 첨두가 17개로 관찰되었고 고성능질량분석 결과도 탄소가 17인 사실로부터 화학식 1의 화합물은 탄소 17개로 이루어진 화합물로 결정되었다. 또한 120 ppm과 140 ppm사이에 6개의 첨두가 관찰되었기 때문에 세개의 이중 결합을 가지고 있다고 결정되었다. 양성자 핵자기공명 스펙트럼에서 1 ppm에서 2 ppm 사이에 위치하는 첨두들이 가장 많이 관측된 사실로부터 화학식 1의 화합물은 포화탄소 사슬이 포함되었다고 결정되었다. 데프트(DEPT)실험으로부터 얻은 탄소의 다중도 결과는 화학식 1의 화합물이 오직 한 개의 메틸기(CH₃)만을 포함하고 있다고 보여주었는데 이는 상기 화합물의 구조가 한부분은 메틸기로 구성되어 있고 다른 끝은 고리로 연결되어 있음을 알려준다. 72.2 ppm에서 관찰된 탄소 첨두는 화학식 1의 화합물에 한 개의 산소가 연결되어 있음을 보여 주는 결과였다. 17개의 탄소 첨두들 중 이중 결합을 이루는 6개와 산소와 연결된 1개의 제외한 10개의 탄소는 모두 10 ppm에서 40 ppm 사이에 위치하기 때문에 이들은 모두 탄화수소사슬로 결정되었다. 이차원핵자기공명분광법 (COSY 및 HMQC) 으로 얻은 스펙트럼의 해석으로부터 탄화수소 사슬을 결정하였는데 그 구조는 CH₃-CH₂-CH₂-CH=CH-CH=CH-CH=CH-CH(OH)-CH₂-C₆H₆였다. 탄화수소 사슬에 연결된 산소는 엔하이드록시아민 (-N(NH₂OH))이 연결되어야만 고성능질량분석 결과와 일치된 구조를 갖는다. 또한 탄화수소 사슬의 끝에 있는 C₆H₆는 환으로 되어있는 구조를 갖는다. 결정된 화합물의 구조는 화학식 1과 같으며, 그것을 도 6에 나타내었다.

<실시예 2>

실시예 1에서 분리한 신물질 화학식 1의 화합물(HY52)이 암세포의 성장을 억제하는 지와 cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소 등의 세포주기 조절인자를 저해하는 지를 알아보기 위하여 다음의 실험들을 실시하였다.

MTT 분석 실험

96 웰 플레이트(96 well plate)에 암세포를 1.4 × 10⁵cells/ml로 조절한 배지 100㎕에 다양한 농도의 HY52 1㎕를 넣고, 37℃, CO₂배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양된 세포의 성장 억제율을 측정하기 위해 각 웰에 MTT 시약를 15㎕씩 분주 후, 포마잔(formazan) 형성을 위해 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후 상층액을 제거, 반응 정지 용액으로서 디메틸설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 100㎕씩 분주하고, 형성된 포마잔이 잘 녹을 때까지 흔들어 주었다. 억제 농도를 측정하기 위해 엘라이자(ELISA, molecular device, USA)를 사용하였으며, 암세포로는 헵쥐투(HepG2, 간암세포)를 사용하였다. HY52의 세포 성장 억제율은 대조군의 세포 성장 억제율의 50%의 억제율을 나타내는 농도인 IC₅₀치가 약 80㎍/ml (0.27 mM)을 나타내었다 (도 7 참조).

Cdc ₂ kinase 활성 억제 측정

Cdc2 kinase 활성 억제의 측정은 노코다졸(nocodazole)(1㎍/ml)의 20시간 처리에 의해 세포의 분열 과정(M phase)이 저지된 헬라 셀(HeLa cell) 추출물을 cdc2 키나제의 소스로 사용하여 50mM Tris, pH 7.4, 2mM DTT, 10mM 염화마그네슘, 1mMEGTA, 40mM β-글리세로포스페이트, 0.1mM 소듐 바나데이트, 1μCi[γ-³²P] ATP (50μM ATP) 그리고 기질인 히스톤 H₁을 함유한 반응액에 HY52를 농도별로 처리한 후, 최종 25㎕가 되도록 부피를 조절하여 30℃에서 15분 반응시켰다. 그 후 100% 트리클로로아세틱액시드를 6㎕ 가하여 얼음 위에서 40분 동안 방치하고, 10,000 ×g에서 15분 원심분리 한 뒤 상층액 15㎕를 p-81 페이퍼에 스파팅하였다. 스파팅된 P-18 페이퍼를 75mM 인산으로 15분씩 3번 세척하여 건조시킨 후, 방사능(radioactivity)을 액체 신틸래이션 카운터(liquid scintillation counter, Beckman, San Diego, CA)로 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, cdc2 키나제에 대한 HY52의 IC₅₀값은 약 700 ug/ml (2.4mM) 이었으며, 농도 의존적으로 저해하는 사실을 알 수 있었다.

HY52의 농도에 따른 cdc2 단백인산화 효소의 저해활성
HY52 농도 (ug/ml)	CPM 값	저해활성 (%)
대 조 군	53,202	0
5	58,599	-9
50	45,001	25.1
500	33,674	37.8
1,000	10,542	81.1
IC₅₀값 = 700 ug/ml

웨스턴 블럿 (Western blot)을 통한 세포주기 조절인자 억제 확인

간암세포주인 HepG2에 활성물질 HY53을 농도 별(0, 20, 40, 80, 110 ug/ml)로 처리하고 12시간동안 배양한 후, 1,500rpm으로 원심분리하여 세포를 모은 후 D-PBS로 세척하였다. 세척 후 모은 세포를 세포 용해 완충액 (50mM Tris-Cl pH 8.0,5mM EDTA, 150mM 염화나트륨, 1% 트리톤 X-100, 1mM PMSF, 1ⅹ프로테아제 저해제)에 균질하게 현탁시켰다. 균질하게 현탁된 세포를 호모게나이져로 용해시키고 얼음에서 10분 유지한 후, 15,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 추출된 단백질은 바이오-라드(Bio-Rad) 방법에 의거하여 정량하였다. 단백질(15㎍)을 10-15% SDS-PAGE에 분리시킨 후 PVDF 막(membrane)에 전이하였다. 전이한 막을 5% 탈지분유가 포함된 TBS-T 완충액을 이용하여 비특이적 결합 부위(non-specific binding site)를 억제시킨 후 TBS-T 완충액으로 세척하였다. 세포 주기 조절에 관여하는 효소인 cdc2와 cdk2의 항체(antibody)를 이용하여 막에 부착시킨 후, HY52에 의한 이들 효소들의 발현 양상의 변화를 보기 위해, ECL-플러스 시약(ECL-plus reagent)(Amersham, Buckinghamshire, UK)로 반응, 엑스-레이 필름(X-ray film)에 노출하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, cdc2의 발현 양상은 HY52를 80 ug/ml 처리했을 경우부터 줄어들기 시작하며, 110 ug/ml을 처리한 경우에는 거의 발현이 되지 않았다. Cdk2의 경우는 더욱 더 저해 활성이 뚜렷하여, 이미 HY52를 40 ug/ml의 농도로 처리했을 경우부터 서서히 발현의 감소가 일어나다가, 110 ug/ml의 경우엔 전혀 발현되지 않았다. 이러한 실험 결과를 정량적으로 입증하기 위하여, 상기의 실험에 사용하였던 PVDF 막을 세척한 후, 세포의 하우스 키핑 (house-keeping) 단백질인 액틴의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 재시도 해본 결과, 모든 경우에 동일한 액틴의 발현 양상을 확인할 수 있었다. 이 사실은 HY52를 HepG2 세포에 처리하였을 경우, 하우스 키핑 (house-keeping) 단백질인 액틴의 양엔 변화가 없으나, cdc2와 cdk2의 발현량이 줄어든 것은 HY52가 특이적으로 암세포의 세포주기 조절인자인 두 효소를 저해함을 입증한 것이다.

<실시예 3> HY52에 의한 암세포 세포사멸 (아폽토시스) 유도 효과

HY52를 처리한 암세포의 세포주기별 분포비율 및 아폽토시스 발생 비율을 분석하기 위해 프로피디움 요오드 (propidium iodine)를 이용하여 실시하였다. HY52를 농도 별(0, 25, 50, 80, 110 ug/ml)로 처리한 암세포주를 12시간 동안 37℃, 5% CO₂하에서 배양한 뒤, 회수한 다음, 모은 세포를 PBS로 2회 세척, 70% 에탄올을 넣은 후 4℃에서 4시간 고정시켰다. 고정된 세포는 PBS로 세척하고, 250 ug/ml RNaseA와 25ug/ml 프로피듐 요오드(propidium iodine)가 포함된 PBS로 4℃에서 30분간 반응시킨다. 염색된 DNA 함량 분석은 488 활성화, 15 mW인 FASTAR 플로우 사이토미터(flow cytometer)(Becton dickinson)를 이용하여 측정하고 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software)로 분석하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.

세포의 초기, 말기의 아폽토시스의 분포를 보기 위해, 두 종류의 염색(Annexin V + P.I)방법을 이용하였다. HY52를 처리한 세포를 바인딩 버퍼(binding buffer)(10mM Hepes/NaOH, pH7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl₂)에 현탁 시킨 뒤, Annexin V(1ug/ml)를 가한 후, P.I(10ug/ml)와 추가로 반응시켰다. 세포를 두 종류의 형광물질로 염색한 후, FASTAR 플로우 사이토미터로 측정하고 셀 퀘스트 소프트웨어로 분석하였다. 실험 결과, HepG2 세포에 HY52를 50 ug/ml 이하처리할 경우에는 아폽토시스가 유도된 세포의 비율이 10% 미만이지만, 80 ug/ml 및 110 ug/ml을 처리하면 28.62% 및 56.18%로 급격히 증가하기 시작하였다. 이상의 결과는 간암세포주인 HepG2에 HY52를 처리하면 농도 의존적으로 세포사멸이 유도된다는 사실을 확인시켜준다.

<실시예 4> 실험 동물 모델에서의 항암 효과

한 군에 마우스 (C3H/He 마우스, 4주령 수컷)를 6마리씩 배분하여 모두 3개의 군으로 나누었다. 마우스의 복강 내에 MH134 헤파토마 세포를 1x10⁵세포수/마우스로 주사하여 고형암 실험동물 모델로 만들었으며, 그 다음날부터 시험 물질을 투여하였다.

HY52를 0.5% CMC-염수 (carboxymethyl cellulose sodium saline)에 현탁시켜 두 번째와 세 번째 시험군에 각각 50 mg/kg, 100 mg/kg씩 4주 동안 매일 경구 투여하였다. 첫 번째 시험군은 대조군으로서 0.5% CMC-염수를 4주 동안 매일 경구 투여하였다.

시험 물질 투여 후 35일째 되는 날, 마우스로부터 고형암을 적출하여 그 무게를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

HY52의 고형암 증식 억제 효과
	시험 약물	투여량	종양 무게 (g)^a
시험군 1(대조군)	-	-	5.22 ±0.66
시험군 2	HY52	50 mg/kg	3.89 ±0.25
시험군 3	HY52	100 mg/kg	2.73 ±0.15^b
a: 평균 ±표준편차b: p<0.05

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, HY52를 투여한 시험군에서는 대조군에 비하여 고형암이 현저히 감소하였으며, 특히 약 100 mg/kg 농도로 투여했을 경우 통계학적으로 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있었다. 이와 같이 본 발명에서 발굴한 HY52는 암의 증식을 억제하는 효과를 나타내므로 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 HY52는 암세포의 세포주기 조절인자 억제 능력 및 세포사멸 (아폽토시스) 유도 능력이 우수하므로 세포주기 조절인자 억제제뿐만 아니라 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

화학식 1을 갖는 화합물 또는 그의 약학적 허용염:

화학식 1
제1항에 있어서, 상기 화학식 1을 갖는 화합물이 분자량이 294이고 C₁₇H₃₀O₂N₂의 분자식을 갖고, 아래의 양성자 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.

¹H-NMR(400MHz) δ: 0.86-1.02(m), 1.03-1.25(m), 1.30(m), 2.04-2.33(m), 2.64(s), 3.49(s), 4.16(s), 5.34-5.69(m)

¹²C-NMR(100MHz) δ: 14.2(q), 20.8(t), 27.6(t), 28.8(t), 28.9(t), 29.0(t), 29.4(t), 29.7(t), 35.3(t), 40.7(d), 72.2(d), 123.8(d), 125.9(d), 127.8(d), 132.9(d), 134.9(d), 135.2(d)
제1항에 있어서, 상기 약학적 허용염이 염산, 황산 및 인산을 포함하는 무기염 또는 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산 및 글루탐산을 포함하는 유기염인 화합물.
제1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적 허용염을 유효성분으로 포함하는 항암제.
제1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적 허용염을 유효성분으로 포함하는 세포주기 조절제.
제1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적 허용염을 유효성분으로 포함하는 cdc2 및 cdk2 단백인산화 효소의 저해제.
Pata de Vaca(Bauhinia forficata)로부터 용매를 사용하여 추출하는 단계, 추출액을 여과하고 농축시키는 단계 및 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 제조방법이:

a) Pata de Vaca(Bauhinia forficata)의 건조 잎을 분쇄기로 분쇄하고,

b) 상기 분쇄된Bauhinia forficata를용매로 추출하여 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 추출액을 얻고,

c) 상기 추출액을 여과하고, 여과액을 증류하여 농축시키고,

d) 크로마토그래피로 정제하여 상기 화학식 1의 화합물을 정제하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
제7항에 있어서, 추출용 용매가 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 및 에틸렌글리콜을 포함하는 알콜; 염화메틸렌, 클로로포름 및 사염화탄소를 포함하는 할로겐 원자로 치환된 탄화수소류; 테트라히드로푸란, DMF, DMSO 및 에틸아세테이트로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 크로마토그래피에 의한 정제가 교환 수지인 에이치피-20 다이아이온(HP-20 Diaion)관 크로마토그래피, 역상의 분리 수지인 씨-에이틴(C-18)관 크로마토그래피 및 분취 고속 액체 크로마토그래피에 순차 적용함에 의해 성취되는 것을 특징으로 하는 방법.