KR20230033334A - 면역거부반응 억제용 스페로이드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 면역거부반응 억제용 스페로이드, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 스페로이드는 라파마이신 미세입자에 의해 중간엽줄기세포의 PD-L1 발현이 증가되고, 이를 통하여 표면에 PD-L1 발현이 증가된 스페로이드는 생체 내 이식된 췌도 세포에 대하여 면역거부반응을 유도하는 T 세포 및 염증 반응을 억제하여 이식된 췌도 세포의 생존 기간 및 인슐린 분비 기능을 장기간 유지시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 스페로이드는 세포 이식체 면역거부반응 억제용 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 스페로이드와 췌도 세포를 포함하는 조성물은 당뇨병 치료를 위한 세포 치료제로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 면역거부반응 억제용 스페로이드, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
췌도는 알파(alpha), 베타(beta), 델타(delta) 세포로 이루어진 세포덩어리로 췌장에서 마치 섬처럼 떨어져 있다고 해서 붙여진 이름이다. 이중 베타 세포는 인슐린을 분비하여 혈액 속의 혈당을 조절하는 중요한 세포이다.
제 1형 당뇨병을 치료하기 위해 최근에는 인슐린을 분비하는 췌도세포 만을 췌장으로부터 분리하여 당뇨병환자에게 이식하는 동종간 이식 방법이 행해지고 있다. 1999년 Edmonton 프로토콜이 개발된 이래로 미국, 유럽에서 동종간 췌도 이식에 의한 당뇨병 치료건 수는 900여건에 이르고 있다. 최근에서는 이식된 췌도세포의 5년 생존율이 50 %에 이르는 등 췌도 이식이 당뇨병 치료의 중요한 대안으로 자리 잡아가고 있다. 하지만 이는 제 1 형 당뇨병 치료를 위한 가장 최선의 대안이기는 하나, 이식할 췌장이 부족하다는 것이 가장 큰 장벽이다.
이에 대한 대안으로 최근 돼지로부터 췌도세포를 분리하여 사람에게 이식하고자 하는 연구들이 진행되고 있다. 돼지 췌도세포는 사람과 생리적으로 유사하고, 많은 양을 얻을 수 있으며, 유전자 변형 등을 쉽게 할 수 있는 장점이 있다. 돼지 췌도세포를 이용한 당뇨병치료의 가능성은 설치류나 영장류를 이용한 여러 연구에서 증명되었다. 하지만 돼지 췌도세포를 사람에게 적용하여 당뇨병을 치료하기 위해서는 영장류를 이용한 전임상 연구가 반드시 선행되어야 한다. 2005년 미국의 Emory 대학과 미국의 Minnesorta 대학에서 돼지 췌도세포를 영장류에 이식하고 이식된 돼지 췌도세포의 장기간 생존을 최초로 확인한 이래로 지금까지 6 그룹에서 6개월이상의 이식된 췌도세포의 생존을 보고하고 있다. 이에 따라 이종 장기 이식 커뮤니티는 돼지 췌도세포 이종 이식의 임상 적용 가능성을 확인하고, 2009년 국제 이종 이식학회 (IXA)를 통해 이종췌도이 임상적용에 대한 국제적인 가이드라인을 합의하고 제정하였다. 이 가이드라인을 보면, 임상적용을 위한 전임상 연구의 성공적인 기준은 당뇨병에 걸린 영장류에 돼지 췌도세포 산물을 이식한 후 최소 6 개월 동안 정상 혈당상태 (normoglycemia) 또는 최소 수준의 돼지 C-펩티드가 8 마리 중 5 마리에서 검출되어야 한다. 그러나 이러한 국제적 가이드라인을 만족하는 연구결과는 세계적으로 면역억제요법을 제외하고 전무한 상황이다.
이식된 췌도세포가 수용체에서 장기간 생존하기 위해서는 이식된 췌도세포에 대해 발생하는 여러가지 면역반응을 어떻게 효과적으로 억제하느냐에 달려있다. 이러한 면역반응은 주로 이식 초 수분 내에 발생하는 IBMIR(instant bloodmediated inflammatory reaction)와 급성 및 만성 거부반응에 관여하는 T 세포, B 세포에 의한 면역반응으로 나눌 수 있다. 이중 이식된 췌도의 장기적인 생존을 위해서는 T 세포를 어떻게 효과적으로 조절하는가에 달려있다. T 세포에 의한 면역반응을 억제하기 위해 MMF, Rapamycin, Cyclosporine, Tacrolimus, Leflunomide, Alemtuzmab, CTLA4-Ig, LFA-3-Ig, FTY720, Bortezomib, CD40-CD40L blockade등의 약제들이 연구되어 왔다. 이 약제들 및 그 조합으로 설치류 및 영장류에서 이식된 췌도세포에 의한 당뇨병치료를 기대 할 수 있는 좋은 결과들이 발표되었다. 하지만 임상적용을 위해 필수적인 영장류를 대상으로 하는 연구에서는 임상적용을 위한 IXA 가이드 라인을 충족할 만한 유효성 높은 연구결과가 아직까지 발표되지 않고 있다. 이는 이들 면역억제요법은 영장류 이상의 고등동물 및 사람에게 적용하였을 경우 유효성 있는 연구 결과가 지속적으로 나오지 못하고 선별적으로 나올 수 있음을 의미한다. 또한, 기존의 면역억제제의 조합으로는 T 세포의 억제에 의한 단기간의 췌도세포 생존은 가능하지만 생체 내에서 장기간의 생존을 이끌어 내는 데는 한계가 있다.
본 발명은 면역거부반응으로부터 생체 내 세포 이식체를 보호하여 이식체의 생존 기간 및 세포 기능성을 향상시키기 위한 면역거부반응 억제용 스페로이드를 제공하며, 상기 스페로이드와 세포가 포함된 조성물을 세포 치료제로 제공하고자 한다.
본 발명은 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하며, PD-L1 발현이 증가된 스페로이드를 제공한다.
본 발명은 상기 스페로이드를 유효성분으로 함유하는 면역거부반응 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 라파마이신이 고분자로 캡슐화된 라파마이신 미세입자를 제조하는 단계(제1단계); 상기 라파마이신 미세입자와 중간엽줄기세포를 성장배지에 혼합하여 현탁액을 준비하는 단계(제2단계); 상기 현탁액을 고분자 용액에 주입한 후 배양하여 세포와 입자 융합 스페로이드를 제조하는 단계(제3단계); 및 상기 스페로이드를 회수하는 단계(제4단계)를 포함하는 이식체의 면역거부반응 억제용 스페로이드 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스페로이드 및 췌도 세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 스페로이드는 라파마이신 미세입자에 의해 중간엽줄기세포의 PD-L1 발현이 증가되고, 이를 통하여 표면에 PD-L1 발현이 증가된 스페로이드는 생체 내 이식된 췌도 세포에 대하여 면역거부반응을 유도하는 T 세포 및 염증 반응을 억제하여 이식된 췌도 세포의 생존 기간 및 인슐린 분비 기능을 장기간 유지시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 스페로이드는 세포 이식체 면역거부반응 억제용 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 스페로이드와 췌도 세포를 포함하는 조성물은 당뇨병 치료를 위한 세포 치료제로 제공될 수 있다.
도 1은 Rapamycin-loaded PLGA 마이크로 스피어 특성화를 확인한 결과로, 도 1a는 RAP-MP의 SEM 이미지 결과이며, 도 1b는 MP의 크기분포를 확인한 결과로, 200개 이상의 입자가 크기측정을 위해 사용되었으며, 도 1c는 순수 RAP 분말 (검은색 선), blank MP (빨간색 선) 및 RAP-MP (파란색 선)의 FTIR 분광법 결과이며, 도 1d는 37 ℃ 및 100 rpm에서 PBS (pH 7.4 및 1% Tween-20)에서 배양된 RAP-MP로 부터 35일 동안 측정된 RAP의 시험관 내 방출 프로파일 (n=3)결과이다.
도 2는 RAP-MP를 사용한 중간엽 줄기세포 (MSC)의 하이브리드 스페로이드 제작 및 특징을 확인한 결과로, 도 2a는 RAP-MP를 사용한 중간엽 줄기세포 (MSC)의 하이브리드 스페로이드 메틸셀룰로오스 기반 제조 공정에 대한 개략도로, 스페로이드는 배양 2시간 후 (0일) 메틸셀룰로오스 용액에서 회수되었고, 3일째 평가 전에 비부착 페트리디쉬에서 MEM-α 배지와 함께 배양되었다. 하나의 하이브리드 스페로이드는 이론적으로 2.5 × 104 MSC 및 RAP (100ng RAP에 해당하는 MP; 즉 HS100)를 함유하며, RAP-MP가 없는 스페로이드는 순수 스페로이드로 명명되었다, 도 2b 및 도 2c는 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100의 이미지 및 크기를 측정한 결과이며 (스케일 바 : 500 μm), 도 2d는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)으로 시각화된 하이브리드 HS100에서 쿠마린-6 (Cou6) 표지된 MP의 분포를 확이한 결과로, 세포핵은 Hoechst 33342 시약 (파란색)으로 염색되었으며 (스케일바 : 200 μm), 도 2e는 하이브리드 HS100의 SEM 이미지로, 빨간색 화살표는 MP를 나타내며 (스케일 바 : 30 μm) 도 2f는 배양 시간에 따른 하이브리드 HS100에서 RAP의 실제 양과 방출 비율 (n = 3-5)을 확인한 결과이며 도 2g는 Live/Dead 염색 분석을 사용하여 스페로이드의 세포 생존력을 확인한 결과이며 (스케일 바 : 200 μm), 도 2h 및 도 2i는 웨스턴 블롯 분석에서 Bax 수준을 측정하여 스페로이드에서 세포 자멸사의 평가한 결과로, Bax 수준은 각각의 GAPDH level (n = 6 개의 독립적인 실험)으로 정규화되었으며, 도 2i는 Bax 수준을 unpaired two-tailed t-test, * p <0.05를 사용하여 분석한 결과이다.
도 3은 하이브리드 스페로이드에 의한 면역 관련 유전자 발현의 동적 변화을 확인한 결과로, 도 3a는 스페로이드 배양, 치료 및 평가의 간략도로, 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100은 사이토카인 칵테일 (IFN-γ 및 TNF-α)과 함께 또는 없이 성장 MEM-α 배지에서 배양 후 배양 1-3일째에 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석을 위해 수집되었으며, 도 3b는 열지도 유형으로 표시되는 유전자 발현 수준을 확인한 결과로, 데이터는 0일에 대한 log10 배 변화로 표현되었다 (n = 3 독립적인 실험 세트).
도 4는 하이브리드 스페로이드의 국소적 전달이 Rat-to-mouse 췌도 세포 이종 이식 생존을 향상시키는 효과를 확인한 결과로, 도 4a는 췌도 세포 이종 이식 모델의 그래픽 그림으로, 췌도 세포 (400 islet equivalents, IEQ)는 스트렙토마이신 (streptozocin, STZ)로 유도된 당뇨병 C57BL/6 마우스의 신장 캡슐 아래에 췌도 세포만 (대조군), RAP-MPs, 순수 스페로이드 또는 하이브리드 스페로이드와 함께 공동 이식되었으며, 0.5 × 106 MSC에 해당하는 스페로이드 20개가 이식 당 사용되었고, RAP-MP 그룹 및 하이브리드 HS100 그룹의 총 RAP 용량은 이식 당 ~ 1400ng이었다. 도 4b는 마우스 수혜자의 비 공복 혈당 (NBG) 수준을 확인한 결과이며, 도 4c는 췌도 세포 이종 이식 생존 시간에 대한 Kaplan-Meier 곡선이며, 도 4d 및 도 4e는 이식 후 12일째의 복강 내 포도당 내성 시험 (IPGTT) 및 각각의 area under the curve 분석값 (n = 3)이며, 도 4c는 Log-rank (Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 분석된 결과이며, 도 4e는 one-way ANOVA test를 사용하여 분석한 결과이다. (* p <0.05, ** p <0.01, #p <0.001, $ p <0.0001.)
도 5는 이식 후 12일째에 혈청 및 림프 기관을 수집하여 하이브리드 스페로이드 국소 전달이 췌도 세포 이식에 대한 전신 면역 반응 억제 효과를 확인한 결과로, 도 5a는 세포 측정 비드 어레이 (CBA) 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트 (n = 6)에 의해 결정된 혈청 내 사이토카인 수준을 확인한 결과로, 도 5b는 혈청 IFN-α/IL10 비율을 확인한 결과이며, 도 5c는 유세포 분석을 사용하여 배수 림프절 (DLN) 및 비장 (SPL) (n = 3-6)에서 총 세포에 대한 각 T 세포 집단의 백분율을 확인한 결과이며, 도 5a 및 c의 데이터는 one-way ANOVA test를 사용하여 분석되었으며, 도 5b의 데이터와 도 5a의 혈청 IL-10 수준은 unpaired two-tailed t-test를 사용하여 분석되었다. (* p <0.05, ** p <0.01.)
도 6은 국소적으로 전달된 하이브리드 스페로이드가 국소 면역 활성화를 감소시키고 면역 조절 T 세포 (Treg) 생성을 촉진시키는 것을 확인한 결과와, 도 6a는 분석을 위한 이식 후 12일째에 췌도 세포 분리 과정을 나타낸 개략도이며, 도 6b는 Perforin (PRF1), Granzyme B (GRMB), IFN-γ (IFNG), TNF-α (TNF), IL-10 (IL10), TGF-β1 (TGFB1) 및 FoxP3 (FOXP3)을 암호화하는 유전자의 상대적 발현을 확인한 결과이며 (n = 3), 도 6c는 이식편의 다중 면역 조직 화학 염색에 대한 대표적인 이미지 결과이며, 도 6d는 RAP-MP 및 하이브리드 HS100 그룹에서 T 세포 집단의 유세포 분석 평가 (n = 6)로, 도 6b의 데이터는 단방향 ANOVA 테스트를 사용하여 분석되었으며, 도 6d는 unpaired two-tailed t-test를 사용하여 분석한 결과이다. (* p <0.05, ** p <0.01, #p <0.001.)
도 7은 췌도 세포 이종 이식 생존에 대한 MSC 매개 PD-L1의 역할을 확인한 결과로, 도 7a 및 도 7b는 남은 GFP 신호 강도 (n = 3)에 의해 표현되는 시간 경과에 따른 췌도 세포 이종 이식에서의 GFP-발현 MSC의 머무름 현황을 확인한 결과이며, 도 7c는 이식 후 12 일째에 평가된 췌도 세포 및 순수 스페로이드 또는 하이브리드 HS100을 포함하는 전체 이식편에서의 상대적 PD-L1 유전자 발현 (n = 3)을 확인한 결과이며, 도 7d 내지 도 7f는 하이브리드 HS100 췌도 세포 이식을 받은 마우스에 항-PD-L1 항체 요법 (10일 및 20일에 2.5mg/kg/dose × 2 회 용량, 복강 내 경로; n = 6)을 적용한 결과로, 도 7d는 실험과정을 설명하는 개략도 이며, 도 7e는 NBG 확인 결과이며, 도 7f는 췌도 세포 이종 이식 생존 시간에 대한 Kaplan-Meier 곡선 그래프로, 각각의 이소타입 대조군 항체를 투여받은 이식된 마우스를 대조군 (n = 3)으로 사용하였으며, 도 7g 및 도 7h는 유세포 분석을 사용하여 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100에서 MSC에 의한 PD-L1의 표면 단백질 발현에 대한 in-vitro 및 in-vivo 확인한 결과로, 도 7g는 스페로이드는 평가 전 3일 동안 사이토카인 칵테일 없이 또는 존재하에 배양되었으며 (각 그룹 n = 2), 도 7h는 MSC를 췌도 세포 이식을 위한 스페로이드 제작 전에 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)로 표지하고, 평가를 위해 7일째에 이식편을 회수하였으며 (n = 3), MSC는 이중 양성 CFDA-SE+ PD-L1+ 인 경우 PD-L1을 발현하는 것으로 간주되었으며, 도 7i 내지 도 7l은 췌도 세포 이종 이식 생존에 있어 MSC에 의한 PD-L1 발현 효과를 확이한 결과로, 도 7i 실험과정에 대한 개략도로, MSC는 이식 전에 PD-L1 siRNA 또는 스크램블 siRNA (각각 50 nM)를 형질주입하였으며, 도 7k는 비공복상태의 혈당 (NBG)을 확인한 결과이며, 도 7l은 반복적으로 형질주입된 이종이식 췌도세포의 생존 시간 (n = 5)에 대한 Kaplan-Meier 곡선 결과이다.
도 2는 RAP-MP를 사용한 중간엽 줄기세포 (MSC)의 하이브리드 스페로이드 제작 및 특징을 확인한 결과로, 도 2a는 RAP-MP를 사용한 중간엽 줄기세포 (MSC)의 하이브리드 스페로이드 메틸셀룰로오스 기반 제조 공정에 대한 개략도로, 스페로이드는 배양 2시간 후 (0일) 메틸셀룰로오스 용액에서 회수되었고, 3일째 평가 전에 비부착 페트리디쉬에서 MEM-α 배지와 함께 배양되었다. 하나의 하이브리드 스페로이드는 이론적으로 2.5 × 104 MSC 및 RAP (100ng RAP에 해당하는 MP; 즉 HS100)를 함유하며, RAP-MP가 없는 스페로이드는 순수 스페로이드로 명명되었다, 도 2b 및 도 2c는 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100의 이미지 및 크기를 측정한 결과이며 (스케일 바 : 500 μm), 도 2d는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)으로 시각화된 하이브리드 HS100에서 쿠마린-6 (Cou6) 표지된 MP의 분포를 확이한 결과로, 세포핵은 Hoechst 33342 시약 (파란색)으로 염색되었으며 (스케일바 : 200 μm), 도 2e는 하이브리드 HS100의 SEM 이미지로, 빨간색 화살표는 MP를 나타내며 (스케일 바 : 30 μm) 도 2f는 배양 시간에 따른 하이브리드 HS100에서 RAP의 실제 양과 방출 비율 (n = 3-5)을 확인한 결과이며 도 2g는 Live/Dead 염색 분석을 사용하여 스페로이드의 세포 생존력을 확인한 결과이며 (스케일 바 : 200 μm), 도 2h 및 도 2i는 웨스턴 블롯 분석에서 Bax 수준을 측정하여 스페로이드에서 세포 자멸사의 평가한 결과로, Bax 수준은 각각의 GAPDH level (n = 6 개의 독립적인 실험)으로 정규화되었으며, 도 2i는 Bax 수준을 unpaired two-tailed t-test, * p <0.05를 사용하여 분석한 결과이다.
도 3은 하이브리드 스페로이드에 의한 면역 관련 유전자 발현의 동적 변화을 확인한 결과로, 도 3a는 스페로이드 배양, 치료 및 평가의 간략도로, 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100은 사이토카인 칵테일 (IFN-γ 및 TNF-α)과 함께 또는 없이 성장 MEM-α 배지에서 배양 후 배양 1-3일째에 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석을 위해 수집되었으며, 도 3b는 열지도 유형으로 표시되는 유전자 발현 수준을 확인한 결과로, 데이터는 0일에 대한 log10 배 변화로 표현되었다 (n = 3 독립적인 실험 세트).
도 4는 하이브리드 스페로이드의 국소적 전달이 Rat-to-mouse 췌도 세포 이종 이식 생존을 향상시키는 효과를 확인한 결과로, 도 4a는 췌도 세포 이종 이식 모델의 그래픽 그림으로, 췌도 세포 (400 islet equivalents, IEQ)는 스트렙토마이신 (streptozocin, STZ)로 유도된 당뇨병 C57BL/6 마우스의 신장 캡슐 아래에 췌도 세포만 (대조군), RAP-MPs, 순수 스페로이드 또는 하이브리드 스페로이드와 함께 공동 이식되었으며, 0.5 × 106 MSC에 해당하는 스페로이드 20개가 이식 당 사용되었고, RAP-MP 그룹 및 하이브리드 HS100 그룹의 총 RAP 용량은 이식 당 ~ 1400ng이었다. 도 4b는 마우스 수혜자의 비 공복 혈당 (NBG) 수준을 확인한 결과이며, 도 4c는 췌도 세포 이종 이식 생존 시간에 대한 Kaplan-Meier 곡선이며, 도 4d 및 도 4e는 이식 후 12일째의 복강 내 포도당 내성 시험 (IPGTT) 및 각각의 area under the curve 분석값 (n = 3)이며, 도 4c는 Log-rank (Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 분석된 결과이며, 도 4e는 one-way ANOVA test를 사용하여 분석한 결과이다. (* p <0.05, ** p <0.01, #p <0.001, $ p <0.0001.)
도 5는 이식 후 12일째에 혈청 및 림프 기관을 수집하여 하이브리드 스페로이드 국소 전달이 췌도 세포 이식에 대한 전신 면역 반응 억제 효과를 확인한 결과로, 도 5a는 세포 측정 비드 어레이 (CBA) 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트 (n = 6)에 의해 결정된 혈청 내 사이토카인 수준을 확인한 결과로, 도 5b는 혈청 IFN-α/IL10 비율을 확인한 결과이며, 도 5c는 유세포 분석을 사용하여 배수 림프절 (DLN) 및 비장 (SPL) (n = 3-6)에서 총 세포에 대한 각 T 세포 집단의 백분율을 확인한 결과이며, 도 5a 및 c의 데이터는 one-way ANOVA test를 사용하여 분석되었으며, 도 5b의 데이터와 도 5a의 혈청 IL-10 수준은 unpaired two-tailed t-test를 사용하여 분석되었다. (* p <0.05, ** p <0.01.)
도 6은 국소적으로 전달된 하이브리드 스페로이드가 국소 면역 활성화를 감소시키고 면역 조절 T 세포 (Treg) 생성을 촉진시키는 것을 확인한 결과와, 도 6a는 분석을 위한 이식 후 12일째에 췌도 세포 분리 과정을 나타낸 개략도이며, 도 6b는 Perforin (PRF1), Granzyme B (GRMB), IFN-γ (IFNG), TNF-α (TNF), IL-10 (IL10), TGF-β1 (TGFB1) 및 FoxP3 (FOXP3)을 암호화하는 유전자의 상대적 발현을 확인한 결과이며 (n = 3), 도 6c는 이식편의 다중 면역 조직 화학 염색에 대한 대표적인 이미지 결과이며, 도 6d는 RAP-MP 및 하이브리드 HS100 그룹에서 T 세포 집단의 유세포 분석 평가 (n = 6)로, 도 6b의 데이터는 단방향 ANOVA 테스트를 사용하여 분석되었으며, 도 6d는 unpaired two-tailed t-test를 사용하여 분석한 결과이다. (* p <0.05, ** p <0.01, #p <0.001.)
도 7은 췌도 세포 이종 이식 생존에 대한 MSC 매개 PD-L1의 역할을 확인한 결과로, 도 7a 및 도 7b는 남은 GFP 신호 강도 (n = 3)에 의해 표현되는 시간 경과에 따른 췌도 세포 이종 이식에서의 GFP-발현 MSC의 머무름 현황을 확인한 결과이며, 도 7c는 이식 후 12 일째에 평가된 췌도 세포 및 순수 스페로이드 또는 하이브리드 HS100을 포함하는 전체 이식편에서의 상대적 PD-L1 유전자 발현 (n = 3)을 확인한 결과이며, 도 7d 내지 도 7f는 하이브리드 HS100 췌도 세포 이식을 받은 마우스에 항-PD-L1 항체 요법 (10일 및 20일에 2.5mg/kg/dose × 2 회 용량, 복강 내 경로; n = 6)을 적용한 결과로, 도 7d는 실험과정을 설명하는 개략도 이며, 도 7e는 NBG 확인 결과이며, 도 7f는 췌도 세포 이종 이식 생존 시간에 대한 Kaplan-Meier 곡선 그래프로, 각각의 이소타입 대조군 항체를 투여받은 이식된 마우스를 대조군 (n = 3)으로 사용하였으며, 도 7g 및 도 7h는 유세포 분석을 사용하여 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100에서 MSC에 의한 PD-L1의 표면 단백질 발현에 대한 in-vitro 및 in-vivo 확인한 결과로, 도 7g는 스페로이드는 평가 전 3일 동안 사이토카인 칵테일 없이 또는 존재하에 배양되었으며 (각 그룹 n = 2), 도 7h는 MSC를 췌도 세포 이식을 위한 스페로이드 제작 전에 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)로 표지하고, 평가를 위해 7일째에 이식편을 회수하였으며 (n = 3), MSC는 이중 양성 CFDA-SE+ PD-L1+ 인 경우 PD-L1을 발현하는 것으로 간주되었으며, 도 7i 내지 도 7l은 췌도 세포 이종 이식 생존에 있어 MSC에 의한 PD-L1 발현 효과를 확이한 결과로, 도 7i 실험과정에 대한 개략도로, MSC는 이식 전에 PD-L1 siRNA 또는 스크램블 siRNA (각각 50 nM)를 형질주입하였으며, 도 7k는 비공복상태의 혈당 (NBG)을 확인한 결과이며, 도 7l은 반복적으로 형질주입된 이종이식 췌도세포의 생존 시간 (n = 5)에 대한 Kaplan-Meier 곡선 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 스페로이드를 제공하는 기술로, 상기 라파마이신 미세입자는 중간엽줄기세포의 PD-L1 발현을 증가시키고, 이를 통하여 표면에 PD-L1 발현이 증가된 스페로이드는 생체 내 이식된 췌도 세포에 대하여 면역거부반응을 유도하는 T 세포 및 염증 반응을 억제하여 이식된 췌도 세포의 생존 기간 및 인슐린 분비 기능을 장기간 유지시키는 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라, 본 발명의 발명자들은 상기 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하는 스페로이드를 세포 이식체 면역거부반응 억제용 조성물 로 제공하기 위해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하며, PD-L1 발현이 증가된 스페로이드를 제공할 수 있다.
상기 라파마이신 미세입자는 미세입자 100 중량부에 대하여, 라파마이신 0.1 내지 50 중량부 및 고분자 50 내지 99.9 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
상기 고분자는 PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid)], 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 중간엽줄기세포는 스페로이드 당 1 × 104 내지 3 × 104 세포가 포함되는 것일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSCs)는 지방조직으로 부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 라파마이신은 스페로이드 당 10 내지 200 ng이 포함되는 것일 수 있다.
상기 스페로이드는 라파마이신에 의해 중간엽줄기세포의 PD-L1 발현이 증가되며, 증가된 PD-L1 발현에 의해 이식체의 면역거부반응이 억제되는 것일 수 있다.
상기 이식체는 줄기세포, 췌도 세포, 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 혈관내피전구세포(endothelial Progenitor Cell) 및 근모세포(myoblast)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 내분비 세포일 수 있다.
본 발명은 상기 스페로이드를 유효성분으로 함유하는 면역거부반응 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 라파마이신이 고분자로 캡슐화된 라파마이신 미세입자를 제조하는 단계(제1단계); 상기 라파마이신 미세입자와 중간엽줄기세포를 성장배지에 혼합하여 현탁액을 준비하는 단계(제2단계); 상기 현탁액을 고분자 용액에 주입한 후 배양하여 세포와 입자 융합 스페로이드를 제조하는 단계(제3단계); 및 상기 스페로이드를 회수하는 단계(제4단계)를 포함하는 이식체의 면역거부반응 억제용 스페로이드 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 제3단계의 현탁액은 2 μl의 성장배지에 중간엽줄기세포 1 × 104 내지 3 × 104 세포가 포함되며, 라파마이신 10 내지 200 ng이 포함되는 것일 수 있다.
상기 제3단계는 상기 현탁액을 고분자 용액에 주입한 후 37 ℃에서 1 내지 3시간 배양하여 세포입자를 응축시키는 것일 수 있다.
상기 고분자 용액은 메틸셀룰로오스 용액일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 스페로이드 및 췌도 세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
상기 스페로이드는 중간엽줄기세포 0.1 × 106 내지 5 × 106 세포가 포함되는 것일 수 있으며, 상기 췌도 세포는 200 IEQs (islet equivalents) 내지 5000 IEQs가 포함되는 것일 수 있다.
상기 스페로이드는 PD-L1 발현이 증가되며, 이식된 췌도 세포에 대한 면역거부반응을 억제시켜 췌도 세포의 생존기간 및 인슐린 방출기간을 연장시키는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. RAP-MPs 제조 및 특징 분석
라파마이신 (RAP)는 수중유화법을 사용하여 PLGA 미소구체(RAP-MP)로 캡슐화되었다 (T. T. Nguyen, et al., Biomaterials 221, 119415, 2019). 간략하게, PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid), Resomer® RG504 H, 76 mg; Sigma-Aldrich) 및 RAP (4 mg; LC Laboratories, Woburn, MA)을 디클로메탄 (1 mL; Junsei Chemical, Japan)에 용해시켰다. 다음으로, 유기상을 폴리비닐알콜 용액(PVA, 1%, 5 mL; Sigma-Aldrich)에 21,000 rpm으로 4 분간 균질화하여 에멀전을 제조하였다. 에멀전을 4시간 동안 과량의 PVA 용액에 안정화시킨 후 5 주기의 원심분리 세척 단계로부터 RAP-MP를 수집하였으며, 마지막으로 추가 실험을 위해 RAP-MP를 동결건조하여 건조분말을 얻었다. RAP-MP의 크키 및 RAP의 화학적 특성을 각각 주사전자현미경 (SEM, S-4100; Hitachi, Tokyo, Japan) 및 푸리에 변환 적외선 분광기(FT-IR; Nicolet Nexus 670 FTIR Spectrometer, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 확인하였다.
또한, RAP-MP의 로딩 용량은 HPLC 방법으로 확인하였다. 간략하게, RAP는 아세토니트릴 (ACN)을 사용하여 RAP-MP로부터 추출되고 0.22-μm 막을 통하여 여과되었다.
크로마토그래피 파라미터는 다음과 같다: Inertsil column (4.6 x 150 mm, 5 μm; GL Sciences, Tokyo, Japan), 1 ml/min 당 ACN : H2O (85 : 15)가 포함된 등용매 이동상, 280 nm에서의 피크 검출 및 컬럼 온도 60℃.
RAP-MP의 시험관 내 방출 테스트는 1% 트윈 20이 포함된 인산완충식염수 (PBS, pH 7.4)에서 수행되었다. 마이크로스피어 (Microsphere) 현탁액을 진탕배양기 (shaking incubator, SI-64, 150; Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., South Korea)를 37℃, 150 rpm으로 유지시켜 인큐베이션하였다.
결정된 시간 포인트마다, RAP 수준을 정량하기 위해 상층액을 회수하였다.
2. 마우스 지방세포 유래 중간엽줄기세포 (MSC)의 분리 및 특징 분석
모든 동물실험은 국가지침에 따라 한국 영남대학교 기관윤리위원회의 승인을 받았다. 이전의 프로토콜을 약간 변형시킨 방법으로 C57BL6 마우스 (male, 8-10 week-old; Samtako, South Korea)로부터 중간엽줄기세포를 분리하였다 (P. Anderson, et al., Bio-protocol 5, e1642-e1642, 2015; G. Yu, et al., Methods Mol. Biol. 702, 29-36, 2011).
간략하게, 마우스를 경추 탈구로 희생시킨 후 에탄올 70 %에 담궈 살균한 후 피하지방 조직을 노출시켜 수집하고 작은 조각으로 자른 후 0.1 % 콜라게나아제 타입 P 용액으로 37 ℃에서 80 rpm으로 30 분간 소화시켰다.
그 후에, 완전 MEM-α 배지를 첨가하여 효소활성을 중화시킨 후 5 분간 400 × g에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 완전 MEM-α 배지에 재분산시키고 40-μm 세포 여과기를 이용하여 잔류 섬유 및 큰 지방세포를 제거하였다.
원심분리 후 수집된 세포를 37℃에서 하룻 밤 동안 배양하였다. 다음 날, 부착된 세포를 조심스럽게 PBS로 세척하여 잔해물 및 다른 부유 세포를 제거하였다. 배지는 MSC가 80-90% 합류에 도달할 때까지 2~3일마다 자주 교체하였다. MSC는 좋은 결과를 보장하기 위해 페세지 3-6 (p3-6) 이내에서 사용되었다.
분리된 MSC는 특이적인 세포 표면 마커 (CD29, CD44, CD90, Sca-1, CD11b, CD34 및 CD45) 뿐만 아니라 3가지 계통으로의 분화 능력을 앞선 프로토콜 (N. Kojima, et al., Biomaterials 33, 4508-4514, 2012)로 평가하여 특성화하였다.
3. 하이브리드 스페로이드 제작
하이브리드 스페로이드를 자유 수분 흡수성 고분자 기반 방법 (N. Kojima, et al., Biomaterials 33, 4508-4514, 2012)을 이용하여 제작하였다. 이 연구에서는 고분자 용액에 완전 MEM-α 배지 (growth medium)에 2% 메틸셀룰로스 (methylcellulose; Sigma-Aldrich)를 포함시켰다.
하나의 하이브리드 스페로이드의 경우, 성장배지에 25,000 개의 MSC와 RAP-MP를 완전히 혼합하여 2 μl 입자 현탁액으로 제조한 후 상기 현탁액을 고점도 메틸셀룰로오스 용액에 천천히 주입하였다. 자발적인 세포 입자 응축을 촉진시키기 위해 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
하이브리드 스페로이드는 성장배지를 첨가하여 메틸셀룰로오스 용액의 점도를 낮춘 후 회수되었다. 회수된 하이브리드 스페로이드는 비접착 페트리 디쉬에서 배양되기 전에 메틸셀룰로오스를 완전히 제거하기 위해 성장배지로 두 번 세척하였다. 각각 10 ng, 40 ng, 100 ng 및 200 ng의 RAP이 포함된 RAP-MP 하이브리드 스페로이드를 제조하고 각각 MS10, MS40, MS100 및 MS200로 명명하였다.
RAP-MP가 혼합되지 않은 MSC 스페로이드를 대조군으로 사용하였으며, 이미징을 위해 coumarin-6-loaded PLGA microspheres (Cou6-M)를 RAP-MP 대신 사용하였다.
4. 스페로이드의 형태 및 크기 분포
대조군 및 하이브리드 스페로이드의 형태를 현미경 시스템 (Eclipse Ti; Nikon Instruments Inc., Melville, NY) 하에서 관찰하였다. 크기 분산은 Nis-Element software를 이용하여 최소 30개의 스페로이드를 무작위로 선택하여 측정하였다.
5. 하이브리드 스페로이드의 마이크로스피어 분포
하이브리드 스페로이드 내 마이크로스피어의 분포를 먼저, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM; Nikon A1si, Nikon Instruments Inc., Melville, NY)으로 확인하였다.
간략하게, 배양 3일째에 하이브리드 스페로이드를 수집하고, PBS로 두 번 세척한 후 4% 파라포름알데하이드 (PFA) 용액 (Sigma-Aldrich)으로 고정시켰다. 다음으로 세포핵을 Hoechst 33342 solution (1:1000; Thermo Fisher Scientific)으로 실온에서 20분간 대비 염색하였다. 다음으로 시료를 스캔하여 Nis-Element software에서 스페로이드의 3차원 이미지를 재구성하였으며, 각각 파란색과 녹색으로 Cou6-MPs 및 세포핵을 표시하였다.
또한, SEM (S-4100; Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하여 앞선 프로토콜(C. Heckman, et al., Protocol Exchange (2007), doi:10.1038/nprot.2007.504.)에 따라 하이브리드 스페로이드를 확인하였다. 간략하게, 시료를 4% 글루타알데하이드 용액으로 60분간 고정시킨 후 1% OsO4, 3% 카르보하이드라지드 및 1% OsO4로 각각 15분간 연속하여 염색하였으며, 모든 물질은 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. SEM에서 중심 구조를 노출시키기 위해, 하이브리드 스페로이드를 백금층으로 스프레이 코팅하기 전에 날카로운 날을 사용하여 절반으로 절단하였다.
6. 세포 생존도 확인
Live/dead staining assay을 수행하여 세포 생존도를 확인하였다. 간략하게, 대조군 및 하이브리드 스페로이드를 수집하고, 0.67 μM 아크리딘 오렌지 (acridine orange, AO) 및 75 μM 프로피디움 아오딘 (propidium iodine, PI) (both from Sigma-Aldrich)이 포함된 용액으로 실온에서 30 분간 인큐베이션하여 생존 및 사멸 세포를 각각 AO로 녹색 염색 및 PI로 적색 염색한 후 형광 현미경 시스템 (Eclipse Ti; Nikon Instruments Inc., Melville, NY)으로 시각화하였다.
또한, 세포의 세포사멸적 상태를 앞선 프로토콜(T. T. Nguyen, et al., J Control Release 321, 509-518, 2020)을 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 간략하게 대조군 및 하이브리드 스페로이드를 수집하고 PBS로 두 번 세척하여 단일 세포로 분리하고, 얼음 위에서 MPER 용해 버퍼(Thermo Fisher Scientific)로 용해시켰다. 다음으로, Pierce Protein Assay 660 nm kit (Thermo Fisher Scientific)로 확인된 전체 단백질 30-40 μg을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리시킨 후 PVDF 막 (Immobilon-P, Merck Millipore)으로 옮겼다.
다음으로, 5% BSA가 포함된 트리스 완충액 (0.05% Tween 20 포함)으로 실온에서 1시간 동안 블로킹하고 래빗 항-Bax 항체 (1:1000; Cell Signaling) 또는 래빗 항-GAPDH 항체 (1:1000; Cell Signaling)로 4 ℃에서 하룻 밤 동안 인큐베이션하였다. 이후 세척 후 막을 항-래빗 IgG-HRP (1:5000, Santa Cruz)와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate solution (Thermo Fisher Scientific)으로 막을 인큐베이션하고 Fujifilm LAS-4000 mini system (Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 확인하였다.
7. LC/MS/MS 분석
하이브리드 스페로이드 내 RAP 수준을 LC/MS/MS를 이용하여 확인하였다.
간략하게, 결정된 시간 포인트마다 1 내지 3개의 하이브리드 스페로이드를 마이크로튜브에 수집하고 PBS로 두 번 세척하였다. RAP은 0.1-1.0 ml ACN과 프로브 초음파 처리하여 추출하였다. LC/MS/MS 분석을 위해 시료를 적절하게 희석하고 0.22-μm 막으로 여과하였다.
샘플의 매트릭스 효과를 보상하기 위해 FK506를 내부 대조군으로 사용하였다. LC/MS/MS 파라미터는 다음과 같다: HPLC Atlatis® dC18 column (2.1 x 150 mm, 3 μm; Water Coporations, Milford, MA)이 장착된 Agilent 1260 Infinity HPLC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). 구배 모드에서 ACN 및 2 mM 암모니움 아세테이트 완충액을 포함하는 용매 추출 (0-2.5 min: 90% ACN, 2.5-10.5 min: 5% ACN, 10.5-16.0 min: 90% ACN); 250 μl/min 유속; 60 ℃ 컬럼 온도. API-400 triple quadrupole (AB SCIEX, Framingham, MA) 탠덤 매스 시스템; 이온화 방법: 전자 분무, 양이온 모드; 검출모드: 다중 반응 모니터링 (MRM); m/z 931.8 ~ 864.6 이온 전이 관찰.
8. 사이토카인 처리
염증 상태에 노출되었을 경우, MSC 스페로이드의 상태를 확인하기 위해, TNF-α (10 ng/ml; Novus Biologicals, LLC, CO) 및 IFN-α (20 ng/ml; Biolegend)가 포함된 사이토카인 칵테일을 처리하였다. 미리 정해진 시간 포인트 마다 대조군과 하이브리드 스페로이드를 회수하여, PBS로 두번 세척하고 유세포 분석 (flow cytometry) 또는 실시간 PCR을 수행하였다.
9. 랫트 췌도 (pancreatic islets) 분리
췌도 공여자로 Spague-Drague rats (male, 8-10 week-age; Samtako, South Korea)를 사용하였다. 간략하게, 경추 탈구시켜 랫트를 희생시키고 췌장을 노출시킨 후 간담관을 통해 0.08% 콜라게나아제 P 형 용액 (Sigma-Aldrich)을 주입시켰다. 37 ℃에서 18분 동안 인큐베이션하여 췌장을 분해시켰다. Histopaque-1077 용액 (Sigma-Aldrich) 구배 방법으로 외분비 세포로부터 췌도를 분리하였다. 마지막으로 이식전에 기능 회복을 위해 췌도를 완전 RPMI 배지로 3일간 배양하였다.
10. C57BL/6 생쥐에 세포 이식
세포 이식을 위해 스트렙토조신 (Streptozocin)으로 유도된 당뇨병 C57BL/6 생쥐 (male, 8-10 week-age; Samtako, South Korea)를 수혜자로 사용하였다. 꼬리 정맥 혈액에서 비공복혈당 (Non-fasting blood glucose, NBG) 수치를 주기적으로 측정하여 연속 2일 동안 NBG > 350 mg/dL인 당뇨병 상태를 확인하였다.
다음으로, 신장을 노출시켜 캡슐 아래 구멍을 제작하였다. 이식 튜브에 20개의 스페로이드 (0.5 × 106 MSCs)가 있거나 없는 400 IEQ 섬 세포를 준비하여 신장 캡슐 구멍에 주입하였다.
RAP-MP 전달을 위해, 주입 전 이식 튜브에 ~ 5 μl PBS를 별로도 주입하였으며, 연속 2일 동안 NBG > 200 mg/dL 경우 이식편이 거부된 것으로 간주하였다. 또한, 복강 내 당부하 검사 (IPGTT)를 수행하여 당 부하 (i.p, 2.0 g/kg)에 대한 이식된 섬 세포에 의한 인슐린 분비 적응을 확인하였다.
11. 실시간 PCR
정량적 실시간 PCR 분석을 수행하여 mRNA 발현 변화를 확인하였다.
시험관 내 분석으로 스페로이드 시료를 수집하고, PBS로 두 번 세척한 후 TRIzol 시약 (Thermo Fisher Scientific)으로 용해시켰다. 클로로포름을 첨가하여 상층 수상으로부터 전체 mRNA를 분리하고 추가 정제를 위해, 이소프로판올 및 에탄올로 연속 침전법을 이용하여 추가 정제하였다. 생체 내 연구를 위해, ReliaPrepTM RNA Tissue Miniprep kit (Promega, Madison, WI)를 이용하여 이식체로부터 mRNA를 추출하였다. 다음으로 제조사의 설명서에 따라, GoScript™ Reverse Transcription Kit (Promega, Madison, WI)를 이용하여 분리된 mRNA로 cDNA를 합성하였다.
이후, 적합한 프라이머 쌍(표 2)과 SYBR Green Kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 타겟 mRNA의 상대적 발현 수준은 표적 mRNA Ct 값을 그래프 또는 18S rRNA 값으로 정규화하는 비교 역치(Ct) 방법으로 계산하였다.
| Gene | Forward primer sequence | Reverse primer sequence |
| COX-1 | TCGGAGCCCCAGATATAGCA | TTTCCGGCTAGAGGTGGGTA |
| COX-2 | GGGCTCAGCCAGGCAGCAAAT | GCACTGTGTTTGGGGTGGGCT |
| IL1RN | TAGCAAATGAGCCACAGACG | ACATGGCAAACAACACAGGA |
| IL4 | TCAACCCCCAGCTAGTTGTC | TGTTCTTCGTTGCTGTGAGG |
| IL6 | ACAACCACGGCCTTCCCTACTT | CACGATTTCCCAGAGAACATGTG |
| IL10 | CCAGGGAGATCCTTTGATGA | CATTCCCAGAGGAATTGCAT |
| TGFB1 | TTGCTTCAGCTCCACAGAGA | TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC |
| IDO1 | GCTTTGCTCTACCACATCCAC | CAGGCGCTGTAACCTGTGT |
| INOS | GCTCGCTTTGCCACGGACGA | AAGGCAGCGGGCACATGCAA |
| HO-1 | GGTGATGGCTTCCTTGTACC | AGTGAGGCCCATACCAGAAG |
| MHC-I | GGCAATGAGCAGAGTTTCCGAG | CCACTTCACAGCCAGAGATCAC |
| MHC-II | GTGTGCAGACACAACTACGAGG | CTGTCACTGAGCAGACCAGAGT |
| CD86 | GATTATCGGAGCGCCTTTCT | CCACACTGACTCTTCCATTCTT |
| PD-L1 | TGCGGACTACAAGCGAATCACG | CTCAGCTTCTGGATAACCCTCG |
| PRF1 | TCATCATCCCAGCCGTAGT | ATTCATGCCAGTGTGAGTGC |
| GRMB | ACTCTTGACGCTGGGACCTA | AGTGGGGCTTGACTTCATGT |
| IFNG | TTCTTCAGCAACAGCAAGGC | TCAGCAGCGACTCCTTTTCC |
| TNF | TAGCCAGGAGGAGAACAGAAAC | CCAGTGAGTGAAAGGGACAGAAC |
| FOXP3 | CCTGGTTGTGAGAAGGTCTTCG | TGCTCCAGAGACTGCACCACTT |
| GAPDH | ACCACAGTCCATGCCATCAC | TCCACCACCCTGTTGCTGTA |
| 18S RNA | TCAACACAGGGATCGGACAACACA | GCCTTGGATCAAGTTCACAGGCAA |
12. 마우스 혈청 사이토카인 정량
심장 천자로 수혜자의 심장으로부터 전혈을 채취하였다.
혈액을 실온에서 15 내지 30분 동안 응고되도록 방치한 후 2000×g로 40℃에서 10분간 원심분리하여 혈액으로 부터 혈청을 분리하고, 분리된 혈청은 사용 전까지 - 80℃에서 저장하였다. 사이토카인 수준을 정량하기 위해, 제조사의 설명서에 따라, BD CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. Flowjo software version 7.6 (Becton, Dickinson & Company)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
13. 유세포 분석(Flow cytometry)
형광 활성 세포 분류 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS) 분석으로 MSC 및 면역 세포의 표면 마커를 확인하였다. 일반적으로, MSC 스페로이드 또는 림프계 기관 (비장, 림프절)을 단일 세포로 분리하고 0.3% BSA가 포함된 PBS 염색완충액으로 2회 세척하였다. 시료를 특이적 형광 결합된 항체와 얼음 위에서 30 분간 인큐베이션하였다. 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 4% PFA 용액(Sigma-Aldrich)으로 고정하고 FACSCalibur (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
세포내 항원 염색은 BD BioSciences에서 제공한 설명서대로 수행하였다. 각각의 이소형 대조군 항체를 이용하여 세포 표면에 IgG의 비특이적 결합을 보완하였으며, Flowjo software version 7.6 (Becton, Dickinson & Company)을 이용하여 상기 결과를 처리하였다.
14. 조직학적 연구
이식 후 12일째 조직형태를 확인하기 위해, 이식편이 있는 신장을 수집하였다. 일부 실험의 거부 이식편과 장기 기능 이식편 (125일)이 있는 수혜자로부터 시료를 수집하였다. 시료를 40% PFA 용액 (Sigma-Aldrich)으로 1 내지 2일간 고정시킨 후 30% 수크로오스 용액 (Alfa Aesar, Ward Hill, MA)에 3일간 담궜다.
다음으로, deep freezing microtome system (HM450; Thermo Fisher Scientific)으로 10 μm 절편으로 제작하고, 젤라틴 코팅된 유리 슬라이드 위에 올려놓았다. 시료를 수조에서 98℃, 30분 동안 시트르산 완충용액 (pH 6.0, with 0.05% Tween-20)으로 에피토프 회수를 수행하고, 15분 동안 3% 하이드록시퍼옥사이드로 내인성 퍼옥시다아제 활성을 억제하였다. 염색 영역을 제한하기 위해 소수성 펜을 사용하여 주위에 원을 제작하였다. 또한, Vector Laboratories에서 제공받은 설명서에 따라 삼중 면역조직화학 염색을 수행하여 이식편의 섬 (islet) 및 T-세포에 공동 염색하였다.
각 항원 염색을 위해, 먼저 절편에 2% BSA, 10% 정상 혈청 (Vector Laboratories) 및 0.3% 트리톤 X-100가 포함된 PBS 용액으로 비특이적 결합을 차단하고, 아비딘 용액 및 비오틴 용액 (Vector Laboratories)으로 각각 실온에서 15분간 차단하였다. 이후, 절편을 Insulin (1:300; ProteinTech, Suite 300 Rosemont, IL), CD3 (1:300; Novus Biologicals, LLC, CO 80112), Foxp3 (1:200; Biolegend) 또는 PDL1 (1:300; Cell Signaling) 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척 후 절편을 바이오틴이 결합된 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 HRP-표지된 ABC kit working solution으로 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. ImmPACT® DAB (brown) 기질 용액, ImmPACT® VIP (purple) 기질 용액 또는 ImmPACT® SG (gray blue) 기질 용액과 실온에서 2 내지 15분간 인큐베이션하여 신호를 검출하였다. PBS로 세척과 건조 후, 절편을 현미경시스템을 이용하여 이미징 전에 VectorMount® Permanent Mounting Medium (Vector Laboratories)에 올렸다. 이식편 내 조절 T-세포의 백분율은 이중 CD3+Foxp3+ 세포의 수를 총 CD3+ 세포로 나누어 계산하였다.
<실시예 1> RAP-MP (Rapamycin-Microparticle)의 제조 및 특성 확인
RAP-MP는 수중유화법으로 성공적으로 제작되었다. RAP-MP의 특성을 확인한 결과, 도 1a 및 도 1b와 같이 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지에서 RAP-MP는 매끄러운 표면과 1 ~ 8μm (평균 ± SD = 4.4 ± 1.7μm)의 크기 범위를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 도 1c와 같이 blank-M에 비해 RAP-MP의 FTIR 스펙트럼에서 새로운 피크가 나타나지 않았기 때문에 RAP가 PLGA 마이크로스피어에 물리적으로 캡슐화되어 있음이 확인되었다. 또한 HPLC에 의해 결정된 RAP-MP의 로딩 용량 (LC) 및 캡슐화 효율 (EE)은 각각 4.10 ± 0.26% 및 82.0 ± 5.2% 였으며, 도 1d와 같이 RAP-MP의 방출패턴은 처음 2일 동안 최소한의 버스트와 함께 30일 동안 RAP에 대한 지속 방출을 나타내었다.
<실시예 2> 마우스 지방 조직 유래 MSC (Mesenchymal Stem Cell, 중간엽 줄기세포)의 특성 확인
MSC를 표준 프로토콜에 따라 C57BL/6 마우스의 피하 지방 조직에서 분리하였다. 분리된 MSC는 도 2a와 같이 전형적인 섬유아세포 모양을 나타내었으며 CD29, CD44, CD90 및 Sca-1을 포함한 마커 세트에 대해 ≥95 % 양성인 반면 CD11b, CD34 및 CD45에 대해 음성 (< 2%)을 나타내었다. 또한, 이들 MSC는 도 2b와 같이 알리자린 레드 S (Alizarin red S) 염색된 칼슘 결정의 침착에 의해 골 형성 계통으로, 오일 레드 O (Oil red O) 염색된 지질 방울의 축적에 의해 지방 생성 계통으로, 알시안 블루 (Alcian blue) 염색된 글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycans)의 축적에 의해 연골 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 메틸셀룰로오스 용액에서 균일한 스페로이드의 형성
메틸셀룰로오스 용액을 사용한 스페로이드의 제조를 설명한 도 3a를 참고하면 원칙적으로, 자유 물 분자는 마이크로스피어 (MP)가 있거나 없는 MSC의 현탁액을 주입한 후 점성 메틸셀룰로오스 용액에 의해 빠르게 흡수되며, 결과적으로 MSC와 MP는 서로 밀접하게 접촉하여 2시간 이내에 세포-입자 하이브리드 스페로이드의 자발적이고 안정적인 형성을 촉진하였다. 본 발명에서 하나의 하이브리드 스페로이드는 2.5 × 104 개의 MSC와 10, 40, 100 및 200 ng RAP에 해당하는 다양한 양의 MP로 구성되었으며 (각각 HS10, HS40, HS100 및 HS200 그룹), MP가 없는 스페로이드는 순수 스페로이드로 정의되었다. 상기 스페로이드의 크기 차이는 도 3b 및 도 3c와 같이 큰 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 예를 들어, 순수 스페로이드와 하이브리드 스페로이드 HS100은 0일에 각각 740 ± 47 μm 및 744 ± 32 μm의 크기를 나타내었다 (p = 0.6849, t 테스트). 흥미롭게도, 이러한 스페로이드는 도 2b 내지 도 2c와 같이 시간이 지남에 따라 세포-세포 수축의 결과로 배양 3일 후 ~ 1.5 배까지 상당한 크기 감소를 나타내었다 (순수 스페로이드 : 492 ± 32 μm 및 하이브리드 스페로이드 HS100 : 478 ± 21 μm; 보충 그림 2c, d).
다음으로, 배양 3일째에 하이브리드 스페로이드의 MP 분포를 확인하기 위해, 각각 하이브리드 HS100의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 및 SEM 이미지 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 2d 및 도 2e와 같이 CLSM에서 볼 수 있듯이 Cou6-MP로 표지된 MP는 청색 표지된 세포 핵과 얽혀, 하이브리드 스페로이드 전체에 균일하게 분포되어 있는 것으로 나타났다. 또한 SEM 이미지에서 MP가 세포 매트릭스와 명확하게 구별되는 형태를 가진 하이브리드 스페로이드를 확인할 수 있었다. 또한 하이브리드 스페로이드 안의 MP의 밀도는 첨가한 MP의 농도에 비례하는 것으로 나타났다.
또한, 액체 크로마토그래피 다중 질량 분석법 (LC-MS/MS) 분석을 사용하여 하이브리드 스페로이드의 RAP의 실제 함량을 확인하였다. 도 2f를 참고하면 각각의 하이브리드 스페로이드 MS10, MS40, MS100 및 MS200에서 총 9.46 ± 1.08 (포착효율, EE = 94.6 ± 10.8%), 38.34 ± 4.54 (EE = 95.8 ± 11.4%), 98.08 ± 10.98 (EE = 98.1 ± 11.0%) 및 216.79 ± 17.21 ng (EE = 108.4 ± 8.6%)의 RAP이 확인되었다.
다음으로, 하이브리드 스페로이드에서 RAP의 방출 패턴을 확인하였다. 흥미롭게도 RAP-MP의 초기 로딩량에 관계없이 모든 그룹에서 유사한 RAP 릴리스 프로파일이 확인되었다. 도 2f를 참고하면 특히, RAP는 첫 주에 50 ~ 70 %, 두 번째 주에 10 ~ 20 %가 방출되었으며 3주 후에는 하이브리드 스페로이드에서 거의 소진되는 것이 확인되었다. 상기 결과와 같이 하이브리드 스페로이드에서의 RAP 방출은 RAP-MP 서스펜션보다 빠르게 나타나는 것이 확인되었다 (도 1d).
대형 스페로이드의 제작은 종종 영양분 및 산소 침투의 제한으로 인해 세포 생존력에 문제를 나타낸다. 그러나, 도 2G와 같이 3일째의 Live/Dead 염색 분석에서 메틸셀룰로오스 배지에서 제작된 스페로이드가 현적배양 기법으로 제작된 스페로이드와 대조적으로 높은 세포 생존력을 유지하는 것이 확인되었다. 또한, 웨스턴블롯 (western blot) 분석에서 확인된 바와 같이 스페로이드의 형성은 단층 (2차원, 2D) 배양 세포와 비교하여 pro-apoptotic Bax 단백질 수준을 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 특히, 하이브리드 스페로이드에 RAP-MP를 통합하면 용량 의존적으로 Bax 수준이 더 감소했지만 세포 사멸 수에는 큰 변화가 나타나지 않았다 (도 2g).
<실시예 4> 하이브리드 스페로이드 형성 후 MSC에 의한 면역 조절 유전자 발현 개선 확인
3D 배양 MSC는 2D 배양 MSC와 비교하여 향상된 면역 조절 효과를 나타내는 것으로 알려져있다. 먼저 역전사 중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR) 분석을 이용해 순수 스페로이드의 면역 조절 유전자 발현에 대한 동적 변화를 배양 시간에 따라 확인하였다. 이를 위해 순수 스페로이드를 제작하고 MEM-α 배지에서 1-3일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 3b와 같이 배양 시간에 따라 CD86, MHC-I, MHC-II, TGFB1, IL1RN 및 IL4의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
배양 1일째에는 INOS 및 HO-1 유전자 발현에서 일시적인 증가가 확인되었으나, 순수 스페로이드에 의한 PD-L1, IL6 및 COX2의 유전자 발현은 배양 3일 후에 유의미하게 감소하는 것으로 나타났다. 염증 환경을 모방하기 위해 배양 중에 10 ng/ml TNF-α 및 20 ng/ml IFN-α를 함유하는 사이토카인 칵테일을 스페로이드에 처리하였다. 흥미롭게도, 도 3b와 같이 3 일간 사이토카인 칵테일에 노출된 그룹은 비처리 그룹에 비해 IDO (69.5 ± 19.4 배), iNOS (5.4 ± 0.5 배), PD-L1 (6.9 ± 2.9 배), MHC-1 (8.5 ± 2.2 배) 및 MHC-2 (1.8 ± 0.5 배) 수준이 상당히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, MSC 스페로이드에 RAP-MP 결합 효과를 확인하였다. 순수 스페로이드 및 하이브리드 HS100은 도 3과 같이 사이토카인 칵테일 없이 또는 함께 성장 MEM-α 배지에서 배양되었다. 사이토카인 칵테일이 없는 경우 배양 3일째에 순수 스페로이드보다 하이브리드 HS100에서 COX-2 (2.3 ± 0.5 배, p = 0.0102), IL6 (3.6 ± 0.4 배, p = 0.0005), TGFB1 (3.1 ± 0.8 배, p = 0.0096) 및 PD-L1 (1.4 ± 0.1 배, p = 0.0001)의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 사이토카인 노출시에는 하이브리드 HS100에서 MHC-I, IL10 및 PD-L1의 유전자 발현을 각각 1.5 ± 0.3 배 (p = 0.0318), 1.7 ± 0.1 배 (p <0.0001) 및 2.0 ± 0.1 배 증가시켰다. (p <0.0001). 그러나 3일째에 IDO1 및 INOS의 유전자 발현 수준은 RAP-MP 통합의 결과로 각각 1.9 ± 0.5, 1.3 ± 0.1 배 감소하였다.
<실시예 5> 국소화 하이브리드 스페로이드의 마우스 모델에서 이종 췌도 세포 생존력 향상 확인
하이브리드 스페로이드의 강력한 면역 반응을 확인하기 위해, 췌장 Rat-Mice islet 이종 이식 모델을 확립하였다. 도 4a와 같이 췌도 세포 (400 Islet equivalents, IEQs)로만 이루어진 대조군 (Islet only), RAP-MPs, 순수 스페로이드 또는 하이브리드 스페로이드를 스트렙토조신 (STZ)-유도된 당뇨병 C57BL/6 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식했다. 0.5 × 106 MSC에 해당하는 20 개의 스페로이드가 이식 당 사용되었다.
또한, RAP-MP, 하이브리드 HS10, HS40, HS100 및 HS200 그룹에서 이식 당 처리된 RAP의 총 용량은 1534.0 ± 499.8, 139.4 ± 24.2, 538.3 ± 24.6, 1378.2 ± 87.0 및 2882.2 ± 41.0 ng로 결정되었다 (RAP-MP 대 HS100에서 p = 0.6225).
췌도 세포 수혜자의 비 공복 혈당 (NBG) 수준과 Kaplan-Meier 이식편 생존 곡선을 각각 도 4b 및 도 4c와 같이 확인하였다. 확인된 바와 같이, 대조군의 췌도 세포는 평균 이식편 생존 시간 (MST)이 9일 (평균 ± 표준 편차 (SD) = 9.2 ± 0.8 일)로 조기 거부되었다. 순수 스페로이드와 췌도 세포의 공동 이식은 7일의 MST (평균 ± SD = 7.2 ± 1.8 일; p = 0.0518 vs 대조군)로 췌도 세포 생존 개선이 나타나지 않았다. 한편, 국소 단일 용량 RAP-MP 전달은 대조군에 비해 췌도 세포 생존을 약 2배 연장시켰다. 특히, RAP-MP 그룹의 MST는 18.5일 (평균 ± SD = 21.2 ± 7.5일, p = 0.0008 vs 대조군)이었다. 그러나 RAP-MP 그룹의 췌도 세포 이식편은 40일 후에 기능이 발견되지 않았다.
상기 결과로부터 RAP-MP 단독은 일시적인 면역 억제만을 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나 국소적 하이브리드 스페로이드는 강력한 면역 거부로부터 췌도 세포 이종 이식편의 효과적인 보호 효과를 나타내었으며, 상기 효과는 RAP 용량 의존적으로 나타났다. 도 4b 및 도 4c와 같이 HS10, HS40, HS100 및 HS200을 받은 수여자는 MST 52일 (평균 ± SD = 59.6 ± 38.5일), 62일 (평균 ± SD = 55.2 ± 35.8일), 61일 (평균 ± SD = 69.9 ± 22.9일) 및 95.5 일 (평균 ± SD = 75.4 ± 34.9일) (모든 p 값 <0.0001 vs 대조군 또는 vs 순수 스페로이드 그룹)의 생존 기간을 나타내었다.
또한, 하이브리드 스페로이드를 이식 받은 췌도 세포 수혜자 중 79 % (24개 중 19개), 17 % (24개 중 4개) 및 8 % (24개 중 2개)가 각각 50일 이상, 100일 이상 및 125일 이상 기능을 유지하였다. 장기 이식 수용 (> 125 일)은 하이브리드 HS10 (n = 1) 및 HS100 (n = 1) (검은 색 원; 그림 4b 및 보충 그림 9)을 받은 두마리의 수혜자에서 확인되었다. 하이브리드 HS100 그룹의 혈청 내 RAP 수준은 분석 시점에서 거의 검출되지 않았다 (<1 ng/ml).
한편, 면역 보호에 대한 RAP의 지속 방출 요구 사항을 평가하기 위해, 3일 동안 100 nM RAP 용액으로 전처리된 순수 스페로이드와 췌도 세포를 공동 이식했다.
그 결과, 대조군과 순수 스페로이드 그룹이 조기에 췌도 세포 이식편 거부 (MST = 10 일)를 나타내었다. 또한, 반대쪽 신장 캡슐에서 췌도 세포와 하이브리드 HS100을 개별적으로 이식하면 초기 거부 반응이 발생했기 때문에 췌도 세포 영역으로 하이브리드 스페로이드의 국소 전달이 면역 보호를 발휘하는 데 필수적임이 확인되었다 (MST = 10일, p = 0.1842 vs 대조군). (또한 인간 MSC로 형성된 하이브리드 스페로이드가 췌도 세포 이종 이식 생존에 보호 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 확인하였다. 결과적으로, 인간 유래 하이브리드 HS100과 췌도 세포의 공동 이식은 초기 거부 반응을 막지 못하였다 (MST = 9일, p = 0.7319 vs 대조군; 보충 그림 11).)
이식 후 12 일째에 포도당 과부화시 췌도 세포 이식편의 반응성을 평가하기 위해 복강 내 포도당 내성 검사 (IPGTT)를 수행하였다.
그 결과, 도 4d 및 도 4e와 같이, 국소화 하이브리드 HS100 그룹과 RAP-MP 그룹은 비 당뇨 (정상) 마우스와 마찬가지로 포도당 상승에 정상적으로 반응하였다. 대조적으로, 대조군과 순수 스페로이드 그룹의 혈당 강하 효과가 지연되는 것이 확인됨에 따라, 대조군과 순수 스페로이드 그룹의 췌도 세포는 작동하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 국소적 하이브리드 스페로이드의 면역조절 효과 확인
면역 반응을 조사하기 위해 이식 후 12 일째에 혈액, 비장 (SPL), draining lymph nodes (DLN) 및 이식편을 수집했습니다. 전혈에서 분리된 혈청은 cytometric bead array (CBA) mouse Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트로 사이토카인 수준을 측정하는데 사용되었다.
그 결과, 도 5a와 같이 IL-2 (26.0 ± 18.8 pg/ml, p = 0.006), IL-4 (28.6 ± 19.1 pg/ml, p = 0.0037), IL-6 (27.1 ± 17.9 pg/ml, p = 0.0038), IL-10 (32.6 ± 15.8 pg/ml, p = 0.0022), IL-17 (36.5 ± 32.3 pg/ml), IFN-γ (31.0 ± 21.8 pg/ml, p = 0.013) 및 TNF-α (30.6 ± 17.9 pg/ml, 0.0144) (모든 p 값 vs 정상 마우스, one-way ANOVA test, IL-10는 unpaired two tailed t-test 사용)를 포함한 염증성 및 항 염증성 사이토카인의 혈청 수준이 대조군 췌도 세포 (Islet only) 이식 시 유의하게 증가하였다. 흥미롭게도, 국소 전달된 하이브리드 스페로이드 그룹은 현저하게 감소된 수준의 IL-2 (5.4 ± 1.1 pg/ml, p = 0.0074), IL-4 (6.9 ± 3.0 pg/ml, p = 0.0046), IL-6 (5.5 ± 2.1 pg/ml, p = 0.0048), IFN-γ (7.7 ± 2.6 pg/ml, p = 0.0153) 및 TNF-α (11.1 ± 3.2 pg/ml, p = 0.0345) (모든 p 값 vs 대조군)을 나타내었다. 한편, 이러한 사이토카인 수준은 대조군에 비해 순수 스페로이드 및 RAP-MP 그룹에서 약간 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 췌도 세포 이식군에서 IL-10의 혈청 수준에는 유의미한 변화가 없었다.
면역 활성화의 진행을 평가하기 위해 혈액 내 Th1/Th2 집단의 균형을 반영하는 IFN-γ/IL10 비율을 계산하였다. 그 결과, 도 5b와 같이 대조군 (0.90 ± 0.29), 순수 스페로이드 (0.84 ± 0.11), RAP-MP (0.61 ± 0.26) 및 하이브리드 HS100 (0.54 ± 0.23, p = 0.0411 vs 대조군; unpaired two-tailed t-test)과 같은 그룹간에 IFN-γ/IL10 비율은 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 하이브리드 스페로이드의 국소전달시 낮은 면역 활성화를 나타내는 것이 확인되었다.
다음으로, 유세포 분석을 수행하기 위해, DLN 및 SPL에서 면역 세포를 분리하여 배양하였으며, 각 면역 세포 집단의 백분율은 총 세포수를 기반으로 계산되었다. 유세포 분석을 수행한 결과, 도 5c와 같이 두 림프 기관에서 이식된 그룹 사이에서 총 CD4+ 및 CD8+ T 총 세포 비율에 큰 변화가 없는 것으로 확인되었다.
그럼에도 불구하고, DLN에서 CD4+:CD8+ T 세포 집단의 비율은 대조군과 순수 스페로이드 그룹에서 감소하는 경향을 나타내었다. 특히, 대조군에 비해 하이브리드 HS100의 국소 전달은 effector memory CD8 + CD44highCD62Llow T 세포 (CD8+ TEM) 및 central memory CD8 + CD44highCD62high T 세포 (CD8+ TCM) (DLN : 4.75 ± 0.85% 대 7.46 ± 1.52%, p = 0.0386; SPL : 2.41 ± 0.30 % 대 3.35 ± 0.59 %, p = 0.0454)의 생성을 급격히 감소시켰다 (DLN : 0.44 ± 0.01% 대 0.92 ± 0.13%, p = 0.0174; SPL : 0.36 ± 0.11% 대 0.63 ± 0.12%, p = 0.0019). 더욱이, 하이브리드 HS100은 DLN에서 CD4+FoxP3+ T 세포 (CD4+ Treg)의 생성을 촉진하는 것으로 확인되었다 (4.21 ± 0.77 % vs 3.00 ± 0.59 %의 순수 스페로이드 그룹, p = 0.0240).
다음으로 이식편이 있는 신장을 검색하여 국소 면역 반응을 확인하였다. 이식편에서 면역 관련 유전자 발현은 qRT-PCR로 분석하였다.
그 결과, 도 6a와 같이 하이브리드 HS100 그룹은 PRF1 (Perforin), IFNG (IFN-γ)의 발현에서 유의미한 감소가 나타난 반면, TGFB1 (TGF-β1) 및 FOXP3 (FoxP3)의 발현은 크게 증가하였다 (대조군 대비 최소 3배 차이, p <0.05). 또한, GRMB (granzyme B)와 IL10 (IL-10)의 발현은 하이브리드 HS100 전달의 결과로 각각 감소 및 증가하는 경향을 나타내었다. 놀랍게도 TNF (TNF-α)는 이식된 그룹 사이에서 큰 변화는 없었습니다. 게다가, RAP-MP 그룹의 유전자 발현 프로파일은 낮은 TGFB1 및 FOXP3 발현을 제외하고는 이 시점 (이식 후 12일)의 하이브리드 HS100 그룹과 유사한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 췌도 세포 이종 이식편의 조직 형태학적 특성을 헤마톡실린 & 에오신 (H & E) 및 다중면역조직 화학염색을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 6c와 같이 대조군 및 순수 스페로이드 그룹은 T 세포 (파란색 염색)에 침투하는 수 많은 숙주 세포들이 확인되었으며, 동시에 해리된 인슐린 양성 췌도 세포 (갈색 염색)가 감소하는 모습이 확인되었다. 대조적으로, 하이브리드 HS100 또는 RAP-MP와 췌도 세포의 공동 국소화는 이식 후 초기에 이식편에 대한 일반적인 숙주 세포 모집을 감소시켰다. 그러나 대부분의 췌도 세포는 하이브리드 HS100 이식편에서 손상되지 않은 반면 RAP-MP 이식편에서 T 세포 침입에 의한 거부반응으로 파괴되었다. 흥미롭게도, 우리는 하이브리드 HS100 그룹에서 침투한 T 세포 중에서 가장 많은 FoxP3-양성 조절 T 세포 (Treg; 보라색 염색)를 확인할 수 있었다.
추가로, 면역 세포 집단을 정량적으로 확인하기 위해 12일째에 하이브리드 HS100 및 RAP-MP 그룹의 췌도세포 이식편을 수집하고 단일 세포로 분리하여 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6d와 같이 CD8+ T 세포의 수는 상대적으로 차이가 없었으나, CD4+:CD8+ T 세포의 비율 뿐만 아니라 CD4+ T 세포의 세포 수 증가를 확인할 수 있었다. 특히, 하이브리드 HS100의 전달은 RAP-MP 단독 전달에 비해 이식편에서 CD4+ Treg 세포의 절대 수와 백분율을 크게 증가시켰다.
상기 결과들로부터 국소적으로 전달된 하이브리드 스페로이드가 전신 면역 활성화를 감소시키고 초기 췌도세포 이식 거부를 예방하기 위해 Treg 세포 집단의 생성을 촉진시키는 것이 확인되었다.
<실시예 7> 하이브리드 스페로이드에서의 향상된 PD-L1 발현을 통한 면역 조절 확인
먼저, 순수 스페로이드 또는 하이브리드 HS100을 췌도 세포와 이식한 후 MSC의 생존을 추적하였다. 이를 위해 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 MSC를 사용하여 스페로이드를 제작했다. 그런 다음 이식편이 있는 신장을 회수하여 GFP 신호를 감지해 이미지화 하였다. 그 결과, 도 7a 및 도 7b와 같이 두 그룹의 GFP 강도는 시간이 경과함에 따라 극적으로 감소했다. 그러나 하이브리드 HS100 그룹에서 GFP 발현 및 MSC의 머무름 시간은 순수 스페로이드 그룹에 비해 상당히 개선되었다. GFP 신호는 10 일째에 각각 25.5 ± 16.1 % 및 0.7 ± 1.0 %를 유지하였으며 (p = 0.019), 20 일째에는 하이브리드 HS100 그룹 (6.4 ± 3.5 %)에서 GFP 신호가 여전히 감지된 반면 순수 스페로이드 그룹에서는 감지되지 않았다.
면역 조절에서 PD-L1은 중요한 역할을 함으로, 이식 후 12일에 전체 췌도 세포 이종 이식편에서 PD-L1의 유전자 발현을 확인하였다. 도 7c를 참고하면, 흥미롭게도 하이브리드 HS100 그룹은 순수 스페로이드 그룹보다 PD-L1의 유전자 수준이 훨씬 더 높았다 (3.1 ± 1.7배 vs 1.1 ± 0.7배, p = 0.1381).
또한, 췌도 세포 이종 이식 생존 시간에 대한 PD-L1의 역할을 확인하였다. 당뇨병이 유도된 마우스의 신장 캡슐 아래에 하이브리드 HS100와 함께 췌도 세포를 이식하였다. 그 후, 10일째 및 20일째에 마우스에 항-PD-L1 항체 용액 또는 각각의 이소타입 대조군 항체 용액 (각각 2.5mg/kg/dose)의 2회 용량을 복강 내 주사하였다. 도 7d와 같이 NBG을 관찰 결과, 항-PD-L1 항체 처리 직후 췌도 세포 이식편이 거부되었으며, 도 7e 및 도 7f와 같이 MST는 18 일 (p <0.01 vs 이소타입 대조군)로 확인되었다.
상기 결과로부터 하이브리드 스페로이드에서 이식된 MSC에 의해 발현된 PD-L1이 생체 내 면역 조절 효과에 관여할 수 있다고 가설을 세웠다. 따라서 MSC에 의한 PD-L1의 표면 발현을 유세포 분석으로 확인하였다. 스페로이드는 평가 전 3일 동안 20 ng/ml IFN-γ 및 10 ng/ml TNF-α를 함유하는 사이토카인 칵테일을 처리하거나 존재하지 않는 조건에서 배양되었다.
그 결과, 도 7g와 같이 PD-L1은 비자극 상태 (사이토카인 칵테일 없이)에서도 MSC 표면에 발현되는 것이 확인되었으나, 사이토카인 칵테일에 대한 노출 후에는 발현이 극적으로 증가하였으며, 놀랍게도, 하이브리드 HS100은 순수 스페로이드에 비해 각각 1.31 ± 0.04 배 및 3.14 ± 0.29 배의 변화로 비자극 및 자극 조건 모두에서 지속적으로 더 높은 PD-L1 수준을 나타내었다 (p 값 <0.01).
또한 생체 내 이식된 스페로이드에 의한 PD-L1의 발현을 측정하였다. 이를 위해 MSC는 췌도 세포 이식을 위한 스페로이드 제작 전에 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)로 표지되었으며, 유세포 분석을 위해 7일째에 이식편을 회수하였다. 그 결과, 도 7h와 같이, CFDA-SE+ PD-L1+ MSC 집단의 백분율은 순수 스페로이드보다 하이브리드 HS100을 포함하는 이식편에서 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (각각 94.1 ± 2.6 % 대 89.2 ± 3.8 %). 중요한 것은, 하이브리드 HS100에서 더 높은 중앙 형광 강도 (p = 0.038)가 확인되는 것과 같이 표면 PD-L1 풍부도에서 상당히 높은 것이 확인되었다. 췌도 세포 이종 이식 생존에 대하여 MSC에 의해 발현되는 PD-L1의 역할을 조사하기 위해 도 7i와 같이 이식 전 MSC에 50 nM PD-L1 siRNA 또는 50 nM 스크램블 siRNA로 반복적으로 형질주입시켰다.
그 결과, 도 7j 및 도 7k과 같이 PD-L1 siRNA로 형질주입된 하이브리드 HS100을 포함하는 췌도 세포 이식편은 22일의 MST를 보이며 초기에 중단되었지만, 스크램블 siRNA로 형질주입된 그룹은 40일에도 기능을 유지하였다 (p = 0.0256 vs 스크램블 siRNA 그룹).
상기 결과들로부터, 하이브리드 HS100에서 MSC에 의한 향상된 PD-L1 발현은 MSC 유지 및 췌도 세포 이종 이식 생존율을 향상시키는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (15)
- 중간엽줄기세포 및 라파마이신 미세입자를 포함하며, PD-L1 발현이 증가된 스페로이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 라파마이신 미세입자는 미세입자 100 중량부에 대하여, 라파마이신 0.1 내지 50 중량부 및 고분자 50 내지 99.9 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 스페로이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 고분자는 PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid)], 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스페로이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 스페로이드 당 1 × 104 내지 3 × 104 세포가 포함되는 것을 특징으로 하는 스페로이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 라파마이신은 스페로이드 당 10 내지 200 ng이 포함되는 것을 특징으로 하는 스페로이드.
- 청구항 1에 있어서, 상기 스페로이드는 라파마이신 미세입자에 의해 중간엽줄기세포의 PD-L1 발현이 증가되며, 증가된 PD-L1 발현에 의해 이식체의 면역거부반응이 억제되는 것을 특징으로 하는 스페로이드.
- 청구항 6에 있어서, 상기 이식체는 줄기세포, 췌도 세포, 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 혈관내피전구세포(endothelial Progenitor Cell) 및 근모세포(myoblast)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 세포인 것을 특징으로 하는 스페로이드.
- 청구항 1항의 스페로이드를 유효성분으로 함유하는 면역거부반응 억제용 조성물.
- 라파마이신이 고분자로 캡슐화된 라파마이신 미세입자를 제조하는 단계(제1단계);
상기 라파마이신 미세입자와 중간엽줄기세포를 성장배지에 혼합하여 현탁액을 준비하는 단계(제2단계);
상기 현탁액을 고분자 용액에 주입한 후 배양하여 세포와 입자 융합 스페로이드를 제조하는 단계(제3단계); 및
상기 스페로이드를 회수하는 단계(제4단계)를 포함하는 이식체의 면역거부반응 억제용 스페로이드 제조방법법. - 청구항 9에 있어서, 상기 제3단계의 현탁액은 2 μl의 성장배지에 중간엽줄기세포 1 × 104 내지 3 × 104 세포가 포함되며, 라파마이신 10 내지 200 ng이 포함되는 것을 특징으로 하는 스페로이드 제조방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 제3단계는 상기 현탁액을 메틸셀룰로오스 용액에 주입한 후 37℃에서 1 내지 3시간 배양하여 세포입자를 응축시키는 것을 특징으로 하는 스페로이드 제조방법.
- 청구항 1항의 스페로이드 및 췌도 세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 스페로이드는 중간엽줄기세포 0.1 × 106 내지 5 × 106 세포가 포함되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 췌도 세포는 200 IEQs (islet equivalents) 내지 5000 IEQs가 포함하되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 스페로이드는 PD-L1 발현이 증가되며, 이식된 췌도 세포에 대한 면역거부반응을 억제시켜 췌도 세포의 생존기간 및 인슐린 방출기간을 연장시키는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |