KR20230022786A - 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식 및/또는 대사분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 나노 구조물 - Google Patents
생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식 및/또는 대사분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 나노 구조물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식되지 않고/않거나 대사분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 나노 구조물 및 이의 약학 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은, (i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및 (ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되, (iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며, (iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출할 수 있도록 설계된 것이 특징이다.
본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은, (i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및 (ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되, (iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며, (iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출할 수 있도록 설계된 것이 특징이다.
Description
본 발명은 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식되지 않고/않거나 대사분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 나노 구조물 및 이의 약학 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
나노입자가 생체 내 주입하여 사용할 때 필수적으로 보장되어야 할 특성은 생체적합성(biocompatibility 혹은 bioinertness)이다. 즉, 우리 몸에 주입시 알러지 등 면역 거부반응이 없어야 하며 독성이 없어야 한다.
나노입자의 주성분이 금속이고 그 금속성분이 체내에 독성을 일으키는 경우는 일부 금속원자가 산화되어 양이온으로 전환되어 생체 내 세포막이 손상되는 경우가 대부분이다. 은의 경우가 대표적인데 Ag(0)상태는 생체 내에서 영향을 미치지 않을 수 있으나 체내 전해질 성분에 의해 쉽게 부식(etching)되면 은 양이온(Ag+)과 초과산화물이 생성되어 세포막을 파괴할 수 있다.
금속산화물 (metal oxides), 양자점 (quantum dots), 귀금속 (noble metals) 등의 무기나노입자는 유기나노입자와 차별화된 독특한 광학적, 자기적, 전기적 특성을 나타낸다. 이러한 물리화학적성질을 활용하면 생명현상을 분자수준에서 정밀하게 관측, 조절, 제어하는 등 의학적으로 유용한 기능을 구현할 수 있다. 하지만 이러한 가능성에도 불구하고, 생체내 주입된 무기나노입자는 면역시스템에 의해 침입자로 인식되어 대식세포에 의해 탐식 및 장기에 축적되어 배출이 용이하지 않다. 무기나노입자의 성분이 양자점 등 중금속인 경우 배출되지 않고 체내에서 분해될 경우 독성을 일으킬 수 있다. 나노입자가 체내 질병 진단용 조영제로 사용되기 위해서는 안전하면서 사용 후 우리 몸에서 대사분해되지 않고 배출이 가능한 형태로 제조하는 기술이 필요하다.
자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)은 자기장 안에서 물의 수소 원자핵 스핀(nuclear spin)이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 방법으로서 현재 살아있는 사람이나 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간 영상화할 수 있는 영상 진단 장비 중의 하나이다.
생명과학이나 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해서 외부에서 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가하는 방법을 사용하는데, 이러한 물질을 조영제라고 하며, 초상자성 혹은 상자성의 물질을 이용하여 MRI로 보여야 할 부분의 신호의 대비를 주어 명확하게 구별할 수 있게 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내 물의 수소 원자핵 스핀이 외부 에너지에 의해 들뜨게 되었다가 다시 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상인데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 일으키고 MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직 간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다.
조영제들을 이용한 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 영상신호를 주변에 비해 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해준다. MRI영상을 얻기 원하는 신체부위의 영상신호를 주위보다 상대적으로 높게 만드는 조영제를 'positive' 조영제(T1 조영제)라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 'negative' 조영제(T2 조영제)라고 한다. 보다 상세하게는 MRI 조영제는 상자성 물질의 고스핀(high spin)을 이용한 T1 조영제와 강자성 혹은 초상자성 물질 주위의 자기 불균등성(magnetic inhomogeneity)을 이용한 T2 조영제로 나누어진다.
T1 조영제는 종이완에 관계하는 조영제이다. 이러한 종이완은 스핀(spin)의 Z축 방향의 자화성분(Mz)이 X 축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y축에 정렬(align) 한 후 에너지를 외부로 방출하며 원래의 값으로 돌아오는 과정이며, 이 현상을 "T1 이완(T1 relaxation)"이라고 표현한다. Mz가 처음 값의 63％로 돌아올 때까지의 시간을 "T1 이완시간(T1 relaxation time)" 이라고 하며, T1 이완이 짧을수록 MRI의 시그널은 크고, MRI 영상에서 밝게 나타난다.
T2 조영제는 횡이완에 관계하는 조영제이다. 스핀의 Z축 방향의 자화성분 Mz가 X축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y축에 정렬(align)한 후 스스로 에너지가 감쇠하거나 주변 스핀들에게 에너지를 방출하며 원래의 값으로 돌아오려고 하는데, 이 때 X-Y 평면상에서 스핀(spin)의 성분 Mxy가 지수 함수적으로 감쇠하는 현상을 "T2 이완(T2 relaxation)"이라고 표현한다. Mxy가 37％로 감쇠할 때까지의 시간을 "T2 이완시간(T2 relaxation time)" 이라고 하며, Mxy가 시간에 따라 감소하는 시간의 함수로 X-Y 평면의 Y축에 설치된 수신코일을 통하여 측정한 것을 자유 유도 감쇠 신호(free induction decay, FID)라고 한다. T2 이완시간이 짧은 조직은 MRI 상에 어둡게 나타난다.
현재까지 상업화된 MRI 조영제는 상자성(paramagnetic) 화합물이 'positive' 조영제로, 초상자성(superparamagnetic) 나노입자가 'negative' 조영제로 사용되고 있다. 현재 T2 조영제로 SPIO(Superparamagnetic iron oxide) 등 산화철 나노입자가 쓰이는데, T2 조영은 음조영으로서 주위에 비해 원하는 부위가 어두워지는 조영법으로 대비효과가 크지 않고, 블루밍 효과(blooming effect)로 실제보다 더 큰 면적이 조영되는 단점이 있다. 반면, TI 조영제는 양조영(positive contrast)이 되어 원하는 부위의 영상을 밝게 볼 수 있는 이점을 가지는데, 많은 스핀을 가진 물질(high spin material)이 사용된다. 그래서 보통 4f 오비탈의 홀스핀이 7개인 가돌리늄 복합체(complex)가 사용되고 있다.
가돌리늄 기반 조영제(gadolinium-based contrast agent, GBCA)는 이미 1980년대에 상용화 된 후로 큰 기술적 진전이 없는 실정이다. 최근 유리 가돌리늄의 독성으로 인한 비가역적 피부 및 장기의 경화반응을 보이는 부작용(신원성 전신섬유증)이 보고되었고, 또한 MRI 조영제를 주입했던 환자의 뇌 조직에 가돌리늄이 영구적으로 침착되는 것이 보고되면서 가돌리늄 조영제에 대한 위험성이 부각되고 있다. 또한, 만성신부전 환자에서 각종 혈관 질환의 유병률 및 사망률은 높지만 GBCA는 신원성 전신섬유증 위험 때문에 사용이 금지되어 있어 이들에서 안전하게 사용할 수 있는 MRI 조영제의 개발이 시급한 상태이다.
한편, 초상자성 물질로 산화철을 이용하는데 입자 크기에 따라 두 가지로 구분할 수 있다. 입자 크기가 50 nm 이상의 경우를 SPIO라고 하며, 그 이하의 크기를 가지는 것을 USPIO(ultrasmall superparamagnetic iron oxide)라고 한다. 입자의 크기가 작은 USPIO는 혈관에서 대식세포의 탐식 작용으로부터 덜 민감하여 장시간 체류하는 특성을 이용하여 혈관의 이상 유무를 확인할 수 있다. 주입량 또한 SPIO에 비해 적어 급속주입이 가능한 장점이 있다. 기존에 임상에서 사용된 Feridex와 Resovist가 SPIO의 대표적 예이다. 이들 조영제는 모두 공침법(co-precipitation)이라는 방법을 통해서 합성되었는데, 결정성이 좋지 않아서 자기적 특성이 높지 않았으며, 크기가 불균일하다는 한계가 있었다.
1990년 후반부터 나노입자 합성법으로 새롭게 개발된 열분해법을 이용하면서 5 ~ 20 nm 크기의 균일한 산화철 나노입자 합성법이 개발되었으며, 공침법으로 개발된 나노입자에 비해서 우수한 T2 조영효과를 갖고 있다는 사실이 보고되었다. 하지만 신호간섭이 심한 T2 강조영상보다 T1 강조영상이 정확도가 높고 임상에서도 선호되기 때문에 가돌리늄 계열의 조영제를 대체하기 위해서는 동급 혹은 그 이상의 T1 조영효과를 갖는 나노입자가 필요하다.
본 발명은 낮은 T1 조영효과, 장기 축적, 독성과 같은 자기 공명 영상(MRI) 조영제로서 산화철 나노 입자의 문제점들을 해결하고자 한다.
이를 위해, 본 발명은 체내 정상 조직 내 축적없이 몸 밖으로 완전 배출되는 약동학을 발휘하는 생체 내 주입용 나노 구조물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식되지 않고 대사 분해되지 않은 상태로 신장여과를 통해 소변으로 배출되는 생체 내 주입용 나노 구조물을 제공하고자 한다.
나아가, 본 발명은 생체 내 주입 후 혈관순환계에 흡수되며, 흡수된 이후에는 혈관밖누출 없이 신장여과를 통해 소변으로 수집하여 재사용도 가능한 생체 내 주입용 나노 구조물을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1양태는 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식 및/또는 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 나노 구조물로서, (i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및 (ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되, (iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며, (iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출된 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식 및/또는 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 생체 내 주입용 나노 구조물을 함유하는 약학 조성물로서, 상기 생체 내 주입용 나노 구조물은 제1양태의 생체 내 주입용 나노 구조물이고, (i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및 (ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되, (iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며, (iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출된 것이 특징인 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 투약(administration) 또는 주사(injection) 될 수 있으며, 생체 내 적용될 수 있는 한 투여법에 의해 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식 및/또는 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 생체 내 주입용 나노 구조물은,
(i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및
(ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되,
(iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며,
(iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출할 수 있도록 설계된 것이 특징이다.
이와 같은 형태로 정교하게 설계 및 합성된 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생리적 pH의 완충용액과 혈장에서 응집(aggregation) 또는 철 유리(leaching)없이 안정하며, 신장 여과 크기 한계보다 작은 컴팩트한 유체 역학적 직경과 우수한 콜로이드 안정성을 발휘할 수 있다.
철 이온과 배위결합하는 친수성 작용기의 비제한적인 예로는, 하이드록시, 카복시산, 카복시레이트, 아민 등이 있다.
본 발명자들은 가교제를 통해 덱스트란을 분자내/분자간 가교한 후, 덱스트란 기반 구형 코어 표면에 노출되어 있는 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 경우 T1 조영효과를 발휘할 수 있는 반면, 가교제를 통해 가교되지 않은 덱스트란 자체의 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 경우는 T1 조영효과를 발휘할 수 없다는 것을 발견하였다.
이에 기초하여, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 T1 조영효과를 발휘할 수 있도록, 덱스트란 기반 구형 코어 표면에 노출되어 있는 가교제 유래 친수성기들이 리간드로서 2가 내지 3가 철 이온과 배위결합을 통해 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 형성한 것이다(도 1). 이때, 말단에 노출된 가교제 1개 내지 3개가 하나의 철 이온과 배위결합할 수 있다.
가교제 유래 친수성 작용기는 가교제의 말단 작용기 자체 또는 이의 개질/치환된 작용기일 수 있다. 예컨대, 2가 내지 3가 철 이온은 덱스트란 구형 코어 표면의 가교제 유래 카르복시산 또는 카복시레이트기와 배위결합할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물(실시예 1)이 삼투압과 점도 등 정맥 주사제 제형으로서 갖추어야 할 적정 물리화학적 특성을 구현할 수 있음을 확인하였고(도 2), 동물실험을 통해 정맥 주사 후 T1 MRI 조영제 역할을 발휘하면서 혈관 벽을 통한 누출 없이 대식세포에 의해 탐식되지 않고 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되고 소변으로 수집하여 재활용 가능하다는 것을 확인하였다(도 4 ~ 8).
또한, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노구조물(실시예 2)은 관절강 혹은 척수강에 투여된 경우도 체내에서 대사 또는 분해되지 아니하고 T1 MRI 조영제 역할을 발휘하면서 혈액순환계(예, 세정맥)에 흡수되어 혈관 벽을 통한 누출 없이 신장여과를 통해 소변으로 배출되는 것을 발견하였다(도 10 ~ 도 16).
본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 MRI에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 지니도록 설계될 수 있어 생체 내에 주입 후 MRI을 통해 나노 구조물의 위치를 추적할 수 있으므로, 본 발명은 이를 이용하여 생체 내 주입 후 대식세포에 의한 탐식여부, 대사 분해 여부, 혈액순환 여부, 림프액순환 여부, 모세혈관을 통한 세포의 실질로 전달여부, 조직 내 축적 여부, 신장을 통해 소변으로 배출 여부, 생체 내 주입 후 혈관순환계에 흡수 여부, 혈관 벽을 통한 누출 여부, 소변을 통해 수집하여 재사용 가능여부를 동물실험을 통해 확인함으로써, 원하는 약동학 및 약력학적 특성을 발휘하는 맞춤형 생체적합성 나노 구조물을 제공할 수 있다는 것이 특징이다.
또한, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물이 나타내는 T1 MRI 신호 강도가 나노 구조물의 농도에 비례하도록 설계할 수 있으므로, MRI 영상의 신호로부터 나노 구조물의 농도를 수치화 또는 정량화하는 것이 가능하다(실시예 6 및 도 3). 따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생체 내 주입된 나노물질이 어떠한 경로로 흡수, 분포, 대사, 배출되는지를 비롯해 그 경로에 위치한 다양한 해부학적 구조, 기능 등 다양한 정보를 제공할 수 있는 조영제 역할도 수행할 수 있도록 설계될 수 있으므로, 동물실험을 통해 생체 내 주입용 나노 구조물 또는 이를 함유하는 약학조성물의 적용부위 및/또는 투여경로에 따른 생체 내 거동의 분석과 동 나노 구조물 또는 약학조성물이 목표한 생체 내 거동을 지닐 수 있도록 균일한 품질로 제조되었는지 여부에 대한 품질관리도 가능하며, 다양하게 축적된 생체 정보 데이터를 활용하여 환자(상태 및/또는 병력), 질환, 투여경로 및/또는 본 발명의 나노 구조물을 통해 전달하고자 하는 약물의 생리기전 맞춤형 생체 내 주입용 나노 구조물을 정교하게 설계가능하다.
[생체 내 주입용 나노 구조물의 제조방법]
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 비제한적인 일례로 하기 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제공될 수 있다:
덱스트란 수용액을 준비하는 제1단계;
상온에서 알칼리성 수용액과 에폭사이드(epoxide)를 적하하는 제2단계;
상온에서 2이상의 다가 아민류를 적하하여 말단 아민기를 가진 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 생성시키는 제3단계;
생성물을 침전시키는 제4단계;
생성물을 물에 재분산시키는 제5단계;
선택적으로(optionally), 말단 아민기 (terminal amine group)를 가진 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 투석(dialysis)하여 회수하는 제6단계;
다가 아민류에 의해 가교결합되고 이로 인해 말단 아민기 (terminal amine group)를 가지는 덱스트란 가교체 기반 나노입자에, 유기산 무수물(organic acid anhydride)를 투여하여 말단 아민기의 일부 또는 전부를 카복실산기(carboxylic acid groups) 및/또는 카르복실레이트기(carboxylate groups)로 치환하는 제7단계;
선택적으로(optionally), 카복실산 및/또는 카르복실레이트 작용기를 가진 덱스트란 가교체 기반 나노입자 용액을 정제하여 수분산가능한 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 준비하는 제8단계;
전 단계에서 준비된 수분산가능한 덱스트란 가교체 기반 나노입자에, 철 전구체(예, iron chloride) 수용액을 첨가하여, 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 형성시키는 제9단계; 및
선택적으로(optionally), 전 단계에서 형성된 나노 구조물을 한외여과(ultrafiltration) 하여 정제 또는 농축하는 제10단계.
상기와 같은 제조방법을 통해 합성된 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 실시예 3과 같이 분석되었다.
덱스트란 분자의 팽윤 등에 의한 의도치 않은 수화크기 증가를 방지하기 위해, 본 발명은 덱스트란 단량체들을 수용액상에서 분자내 및/또는 분자간 가교시킨 것이다. 이때, 가교제에 의해 덱스트란 가교시 분자내 및/또는 분자간 가교를 통해 1개 내지 3개의 덱스트란 분자가 구형 코어를 형성한다는 것을 발견하였다. 상기 구형 코어는 덱스트란 분자 내 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기에서 가교제로 분자내 및/또는 분자간 가교하여 형성된 덱스트란 가교체 기반 나노입자일 수 있다.
덱스트란 가교체 기반 나노입자는 이의 합성 조건 및/또는 정제를 통해 가교 대상인 덱스트란 분자의 개수를 동일 또는 상이하게 제어할 수 있다.
예컨대, 본 발명은 제2단계 및 제3단계를 통해 고가의 촉매 없이 덱스트란 또는 이의 유도체 수용액에 (i) 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기 부위를 개질하는 에폭사이드(epoxide) 및 (ii) 가교제를 첨가하여 상온에서 반응시킴으로써, 덱스트란의 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기에서 가교제로 가교하여 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 제조할 수 있다.
제2단계에서 에폭사이드(epoxide)는 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기 부위를 개질하여 가교제와 반응할 수 있도록 하는 한 그 종류에 제한이 없으며, 바람직하게는 할로 알킬 옥시란 (halo alkyl oxirane)일 수 있으며, 예컨대 epichlorohydrin일 수 있다.
제3단계에서 다가 아민류는 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기 부위를 개질시킨 에폭사이드(epoxide) 유래 작용기와 공유결합할 수 있는 한 임의의 가교제로 대체할 수 있으며, 이 역시 본 발명의 범주에 속한다.
제2단계 및 제3단계는 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기에서 가교제를 통해 가교반응시킬 때 별도의 고가 촉매가 필요없기 때문에 경제적이다.
제4단계는 dielectric constant가 15 ~ 50 사이의 유기용매를 다량 첨가하여 수행할 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 상온(room temperature), 상압(atmospheric pressure), 수용액상(aqueous phase)에서 합성이 가능하여, 합성 후 별도의 친수화 과정이 필요 없으므로, 섭씨 200 도 이상의 고온, 비활성기체(inert atmosphere), 유기용매상(organic phase)에서 합성되며 친수화 과정을 수반하는 기존 산화철 기반 나노 입자 T1 MRI 조영제와 합성법적으로 다르다.
기존 산화철 기반 나노 입자 T1 MRI 조영제는 유기용매에서 합성되어 통상 그 표면에 소수성 분자가 부착되어 있으며, 생체 내 적용을 위해서는 친수화 과정이 필수적이다. 통상 친수화 과정은 소수성 분자를 친수성 분자로 교체하거나 소수성 분자에 친수성 분자를 덧붙여 2중 레이어로 만드는 등의 방법이 동반되는데, 이 과정에서 나노물질의 수화크기는 나노물질 코어 크기에 비해 비약적으로 증가하는 것으로 알려져 있다. 불행히도 생체 내 주입된 나노물질의 거동은 코어 크기가 아닌 수화크기를 따르게 된다. 이와 달리, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 신장 여과 크기 한계보다 작은 수화크기 및 분자량을 가지며 콜로이드 안정성을 발휘하도록 하기 위해 유기용매가 아닌 수용액 상태에서 합성될 수 있으며, 별도의 친수화 과정을 필요로 하지 않는다.
이와 같이 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 계면 활성제없이 실온에서 수용액에서 합성되며, 리간드 교환 단계가 없어서, 이러한 수 적합성(water compatibility)은 생물학적 사용에 유리하다.
아울러 상기 제조 방법에서 수득된 생체 내 주입용 나노 구조물은 물에 분산된 콜로이드(colloid) 형태로, 농축 정도에 따라 별도의 부형제(excipient) 없이도 등장성(isotonic)을 갖도록 할 수 있으며, 예컨대 제10단계를 통해 특별한 추가 가공 없이도 비발열성(non-pyrogenic)과 멸균(sterility)을 만족하여 얻어진 그 자체로 주사제(injectable solution) 약학조성물로 사용가능하다.
[가교 덱스트란 기반 구형 코어]
덱스트란(dextran)은 포도당의 축합으로부터 유래한 다당류로서, 하기 구조식과 같이 복잡한 분지형 글루칸이다. 주로 C-1 → C-6의 글리코사이드 결합을 가지고 있는 미생물 기원의 분지된 폴리-α-d-글루코사이드이다.
중합체의 주사슬은 글루코스 단량체들 사이에 α(1→6) 글리코사이드 결합으로 구성되어 있으며, 분지되는 부분은 α(1→3) 글리코사이드 결합으로 연결되어 있다.
덱스트란은 포도주의 미생물 생성물로 발견되었지만, 대량 생산은 세균을 사용한 공정이 개발된 후에 가능해졌다. 덱스트란은 현재 락토바실러스속의 특정 젖산균에 의해 수크로스로부터 생성된다.
덱스트란은 FDA에서 생체 적합성 물질로 승인한 것이다.
본 명세서에서, 덱스트란은 이의 다양한 유도체도 포함한다. 덱스트란 유도체의 비제한적인 예로는 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran, CM dextran), 덱스트란 설페이트(dextran sulphate), 디에틸아미노에틸 덱스트란(diethylaminoethyl dextran, DEAE-dextran) 등이 있다.
다양한 특정 크기의 덱스트란에 대한 요구가 산업적 응용 분야에서 증가하고 있다. 예를 들어, 크기가 70,000 ~ 100,000Da 범위인 덱스트란은 플라스마(plasma) 대체물로서 사용된다. 또한, 40,000Da의 덱스트란은, 가장 가능성 있게는 혈액의 점도를 감소시키고 적혈구성 응집을 억제하여, 혈류를 개선시키는데 사용된다. 약 10,000Da의 보다 작은 덱스트란 설페이트는 철 수송 인자 또는 항응고제로 사용된다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물에서 구형 코어는 복잡한 분지형 덱스트란이 가교제에 의해 분자내 및/또는 분자간 가교결합된 것으로, 수용액 상에서 분자내/분자간 가교결합을 통해서 이량체 내지 삼량체를 형성할 수 있으며, 덱스트란 분자의 팽윤 등에 의한 의도치 않은 수화크기 증가를 방지할 수 있다. 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물에서, 합성조건을 조절하여 복잡한 분지형 덱스트란 분자 1개만을 가교제로 분자내 가교결합하도록 조절하여 형성된 구형 코어 역시 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에 따라 복잡한 분지형 덱스트란계 단량체들을 수용액상에서 글루코스 빌딩블록의 -OH 작용기에서 가교제로 분자내 및/또는 분자간 가교시켜 컴팩트하게 입자화시킨 덱스트란 가교체 기반 나노입자는 원하는 수화크기 및 수팽윤도를 가지도록 제어하는 것이 용이하고 체액내 이동성을 예측가능하게 조절할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 덱스트란 가교체 기반 나노입자에서 가교제 치환 비율은 덱스트란 작용기 갯수의 2% 내지 50%로 조절가능하고, 가교제 중 2% 내지 98%는 일 말단이 가교에 참여하지 않고 말단이 외부에 노출되도록 조절할 수 있으므로, 덱스트란 가교체 기반 나노입자의 수팽윤도 및 수화크기를 원하는 대로 정교하게 제어할 수 있다.
신장 배설을 위해, 사용하는 덱스트란의 평균분자량은 10,000 Da 또는 그 이하, 덱스트란 분자가 가교되어 형성된 구형의 코어의 분자량은 35,000Da 이하인 것이 바람직하다.
특히, 덱스트란 기반 나노 구조물과 같은 고분자 수용액은 농도가 높아짐에 따라 점도를 가지게 된다. 고분자 물질의 분자량과 점도에 관한 식, Mark-Houwink Sakurada(MHS) equation에 따르면 고분자 물질의 점도는 분자량과 정비례 관계임이 알려져 있다. 주사제의 점도가 지나치게 높을 경우 혈관 폐색, 주입시 높은 압력으로 인한 혈관 손상 등 위험성이 동반될 수 있다. 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물을 정맥 주입의 용도로 활용하고자 할 경우 평균 분자량 10,000 Da 이하의 덱스트란, 바람직하게는 약 5,000 Da 이하의 덱스트란 분자를 사용하고 덱스트란 분자가 가교되어 형성된 구형의 코어의 분자량이 대략 15,000Da 이하인 것을 사용하면 정맥 주사에 적절한 점도를 구현할 수 있다는 것을 발견하였다(실시예 5).
또한, 실시예 1 ~ 5 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 덱스트란 분자의 평균분자량을 작게 조절할수록 본 발명의 나노 구조물을 고농도로 준비가능하므로, 희석정도를 조절하여 제형의 점도가 정교하게 조절가능하며, 주입하고자 하는 투여량에 대한 주입 부피를 감소시킬 수 있다.
평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자를 수용액상에서 가교제로 가교시키면 1개 내지 3개의 덱스트란 분자가 분자내 및/또는 분자간 가교를 통해 구형 코어를 형성하므로, 사용하는 덱스트란 분자의 평균분자량이 10,000 Da 이하인 본 발명의 나노 구조물로부터, 덱스트란 분자가 가교되어 형성된 구형의 코어의 분자량이 35,000Da 이하이면서 신장 배출을 위해 수화 직경이 10 nm 이하, 바람직하게 5 nm 이하인 나노 구조물을 구현할 수 있다.
본 발명에 따라 가교제를 통해 가교 반응 및/또는 가교반응 후 노출된 가교제의 일 말단을 추가 개질한 덱스트란 기반 구형 코어는 표면에 노출되어 있는 친수성기들이 철 이온과 배위결합하는 리간드를 제공한다.
이때, 친수성 작용기는 가교반응에 참여하지 않은 덱스트란의 작용기, 가교반응에 참여하지 않은 가교제의 일말단 작용기 및/또는 가교반응 후 노출된 가교제의 일 말단을 추가 개질시킨 작용기로부터 유래될 수 있다.
철 이온과 배위결합하는 친수성 작용기의 비제한적인 예로는, 하이드록시, 카복시산, 카복시레이트, 아민 등이 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물의 표면에 노출된 친수성 작용기가 아민일 경우 높은 pH에 따른 독성이 발생할 수 있는데 이는 아민기 일부 또는 전부를 카르복실기, 메틸기, 에틸기 등으로 치환하여 해결할 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물이 T1 MRI 조영제 역할을 수행하기 위해 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘 부분이 가교된 덱스트란 기반 구형 코어 표면 전부를 커버해야 하는 것이 아니므로, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 주사액 및/또는 체액 내 분산시키기 위해서 덱스트란에 연결된 가교제의 한쪽 말단 친수성 기 중 일부는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경에 노출할 수 있도록 설계된 것이 특징이다(도 1).
덱스트란 기반 구형 코어의 말단 하이드록시 및 예컨대 비 배위 카복시레이트 작용기는 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물에 수용성을 제공한다. 따라서, 덱스트란 기반 구형 코어의 표면에 노출된 친수성 기의 수화를 통해, 체액 내 분산안정성을 향상시킬 수 있다. 이로인해, 나노 구조물의 분산안정성을 확보할 수 있게 하여 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물이 체액에서 침전이나 엉김없이 안정적으로 분산되어 본연의 기능을 발휘하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 가교된 구형 코어 내 덱스트란의 크기와 전하를 다양하게 조절함으로써, 원하는 혈액 순환 시간과 신장 배설 프로필에 맞게 생체 내 주입용 나노 구조물의 전체 크기와 전하를 제어할 수 있다. 나아가, 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 음전하 작용기와 양전하 철 이온의 결합비율을 20% 내지 80% 범위 내에서 조절함으로써, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물의 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 조정할 수 있다.
한편, 가교된 덱스트란 기반 구형 코어의 표면에 노출된 가교제 유래 작용기 또는 친수성 작용기의 비제한적인 예로 아민기, 카르복실기, 히드록시기, 및/또는 싸이올기 등이 있다. 아민(amine), 싸이올(thiol), 카복실(carboxyl), 하이드록실(hydrodxyl) 같은 반응성 작용기는 표면 개질 뿐만 아니라 특정 세포의 수용체(receptor)와 특이적으로 결합하는 리간드(ligand), 항체 또는 이의 단편, 항원성 펩티드, 핵산 (DNA, RNA, 또는 이의 단편 등)과 같은 바이오 의약품 또는 다양한 종류의 저분자 약물과의 화학적결합을 용이하게 한다.
[구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘]
구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합되어 있는 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생리적 pH의 완충용액과 혈장, 림프액 등 다양한 체액에서 유리철 없이 안정하다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 것으로 (도 1), 덱스트란 기반 구형 코어 표면에 노출되어 있는 가교제 유래 친수성기들이 리간드로서 2가 내지 3가 철 이온과 배위결합을 통해 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 비연속적 쉘을 형성하므로, 비연속적 쉘의 커버 범위 및/또는 두께에 따라 MRI 영상에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 지니도록 또는 필요에 따라 T2 MRI 조영제로 설계할 수 있다.
Spin-spin relaxivity coefficient(r 2)와 spin-lattice relaxivity coefficient(r 1)의 비율(r 2 /r 1 ratio)은 조영제가 T1 MRI 조영제로 적합한지 혹은 T2 MRI 조영제로 적합한지를 판단하는 척도에 해당하며, 통상적인 T1 MRI 조영제는 약 1 ~ 2의 r 2/r 1 ratio를 지니며, T2 MRI 조영제는 바람직하게 5 이상의 r 2/r 1 ratio를 지닌다.
본 발명의 일실시예에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물을 합성한 후, r 1과 r 2를 각각 측정한 결과, T1 MRI 조영제로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 6, 도 3). 따라서, 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 MRI 영상에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 지니도록 설계될 수 있다.
또한, 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 비연속적 쉘은 별도의 화학 물질로 코팅되어 있지 않고, 그 자체로 노출되어, 물 분자의 접근을 용이하게 하여, 물분자 양성자의 이완을 가속화하는 등 T1 MRI 조영효과를 발휘하는데 있어 보다 유리하다.
예컨대, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 임상 가돌리늄 T1 MRI 조영제(GBCA)에 필적하는 실질적으로 작은 자화(magnetization)를 가지며 이상적인 낮은 r 2/r 1 비율로 최적의 T1 MRI 조영효과를 갖도록 설계 및 합성할 수 있다(실시예 6, 도 3).
따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 T1 MRI 조영제 특성으로 인해, 생체 내 미세 혈관, 요관, 림프관, 간, 비장, 관절강, 척수강 및/또는 각종 장기의 해부학적 구조를 시각화할 수 있는 영상을 제공할 수 있다. MRI를 통해 체내 조직 축적 및/또는 혈관 벽을 통한 누출 여부를 확인할 수도 있다.
본 발명에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물의 T1 MRI 혈관조영술 성능 분석 결과에 따르면(실시예 7), 정맥 투입 후 마우스의 경동맥, 심장, 대동맥, 하대정맥 등에서 T1 MRI 조영증강이 관찰되었다(도 4(가)). 주입전 대비 주입 후 혈관계가 밝게 나타나며 기존 가돌리늄 조영제 대비해서 더욱 작은 혈관까지 관찰되는 등 우수성이 확인되었다(도 4(다)). 또한, first-pass 시 뇌심혈관계에서 측정된 대조대비잡음비(contrast-to-noise ratio, CNR)는 4.87로 가돌리늄 조영제(Dotarem) 대비 200% 향상된 값을 나타내었으며, Steady-state시 뇌심혈관계에서 측정된 CNR은 Dotarem 대비 250% 향상된 것이 확인되어, 본 발명에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물의 조영효과가 Dotarem 대비 더 강하고 오랜 시간 지속됨을 확인하였다(도 4(나)). 따라서, 본 발명에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물은 현재 임상 GBCA에 비해 매우 강력하고 오래 지속되는 조영효과를 보여줄 수 있는 뇌심혈관계 특화조영제로 사용도 가능하다.
보통 기존의 조영제는 대비 효과가 짧은 시간 내 사라지기 때문에 촬영 가능한 시간(temporal scanning window)에 제약이 있었으나, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 대비 효과가 오래 지속되므로 시간의 제약이 적어 필요에 따라 스캐닝 시간을 늘려 MRI의 공간 해상도를 향상시킬 수 있다. 또한 임상현장에서 MRI 촬영 도중 환자가 움직일 경우 영상왜곡이 발생해 재촬영이 필요한 경우가 빈번한데, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 대비 효과가 오래 지속되어 이러한 재촬영에 효과적이다. 더욱이 임상현장의 제반 상황에 의해 조영제 투약 후 MRI 촬영을 즉시 시작하지 못할 경우 대비 효과가 사라져 검사가 불가능한 경우가 빈번한데, 대비 효과가 오래 지속되어 이러한 경우에도 효과적이다.
따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 MRI를 통해 생체 내에서 임상적으로 중요한 미세 혈관을 높은 공간 해상도로 시각화할 수 있는 기회를 제공할 수 있다(도 4, 실시예 7). 또한, 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 체내 조직 축적 및/또는 혈관밖누출(extravasation) 여부를 확인할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따라 T1 MRI 조영제의 기능을 발휘하는 생체 내 주입용 나노구조물이 생체 내 주입 후 신장여과를 통해 소변으로 대부분 배출되는 것을 MRI 촬영을 통해 확인할 수 있는 것(도 6 및 도 7); 및 관절강 내 주입 후 소변으로 수집할 수 있는 것(도 12)으로부터, 체내 투여, 분포 및 제거 경로에서 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노구조물은 생체 내 주입 후 혈장을 포함한 체내 체액뿐만 아니라 소변에서도 구형 코어 표면의 친수성기들에 배위결합된 2가 내지 3가 철 이온이 침출없이 안정하다는 것을 알 수 있다.
한편, 가돌리늄과 망간은 자연상태에서 인체에 존재하지 않는 원소로 조영제 등으로 사용되면 인체에 남아 영구 침착이나 피부경화증 같은 부작용이 생긴다.
이에 반해, 철은 인간의 혈액에 풍부하게 존재하고 인체 적혈구 내에 산소와 결합하는 중요 분자인 헤모글로빈의 중심원자이며 철분이 부족한 경우 철 결핍성 빈혈이 생기는 등 인체를 구성하는 주요 원소 중 하나이기 때문에, 본 발명에 따라 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노구조물은 가돌리늄계 또는 망간계 재료보다 생체 적합성이 높다.
관절 내 주사된 초상자성 산화철 나노 입자 (SPIO)는 실질적으로 장기간 배설없이 관절에 머무르는 것으로 보고되었다.
그러나, 본 발명에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물은 관절 내 주사시 관절 조직에 유해한 영향을 주지 않고 체내에 완전히 흡수되어 신장 제거 경로를 통해 안전하게 몸에서 배설된다(도 12). 즉, 본 발명에 따라 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노구조물은 관절 내 주입된 후 철 침출없이 관절강에 축적되지 않고 완전히 혈액순환계에 흡수되며 완전한 신장 제거가 가능한 최초의 성공사례이다. 따라서, 본 발명에 따라 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노구조물은 관절 부위에 주입되더라도 대식세포에 의해 탐식되지 않고 혈액순환계에 흡수되며 조직내에서 철 침출없이 신장을 통해 소변으로 배출되므로, 관절 질환의 원인인 철분 축적 부작용 가능성이 극히 낮다. 이러한 모든 특징은 본 발명에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물이 생체 내 주입 후 부작용 및/또는 독성 없이 넓은 투여량의 범위 내에서 MRI 조영제, 약물 전달체, 또는 조직 내 또는 혈액 내 정보 수집용 흡착제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, MR 관절 조영술을 위한 T1 MRI 조영제로서 놀라운 잠재력을 가지고 있음을 시사한다.
나아가, 본 발명에 따라 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노구조물의 다양한 용도와 관련하여, 한국특허출원 제10-2022-0028150호의 모든 내용이 본 발명 및 본 명세서에 통합된다.
[생체 내 주입용 나노 구조물의 전체 크기 및 표면 전하 설계]
생체 내 주입 후 대식세포에 의한 탐식여부, 대사 분해 여부, 혈액순환 여부, 림프액순환 여부, 모세혈관을 통한 세포의 실질로 전달여부, 조직 내 축적 여부, 신장여과를 통해 소변으로 배출 여부, 생체 내 주입 후 혈관순환계에 흡수 여부, 혈관 벽을 통한 누출 여부, 소변을 통해 수집하여 재사용 가능여부는 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물의 크기 조절을 통해 구현할 수 있다.
유무기 나노입자가 체내에 순환시 조직구조가 치밀한 정상조직보다 구조가 엉성한 암세포나 질병세포에 선택적으로 많이 축적될 가능성이 높다는 EPR(enhanced permeation and retention) 효과 발휘 여부 역시 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물의 크기 조절을 통해 구현할 수 있다.
따라서, 원하는 약동학 및 약력학적 특성을 발휘하는 맞춤형 생체 내 주입용 생체적합성 나노 구조물은 나노 구조물의 크기 조절과 관련이 있는, 구형 코어의 덱스트란 단량체의 분자량, 덱스트란 주사슬의 길이, 가교시의 가교제의 종류, 합성반응시 투여하는 가교제의 양과 투여 속도 및/또는 추가 화학 작용기 개질을 통해 다양하게 설계할 수 있다.
한편, 생체 내 주입용 나노 구조물의 표면 전하는 정맥 주사 나노 물질의 약동학과 거동을 크게 좌우한다. 예를 들어, 혈청 단백질이 전하를 매개로 나노물질에 비특이적으로 결합(즉, 옵소닌화, opsonization)하면 나노물질-단백질 복합체가 형성되어 단핵식세포계(mononuclear phagocyte system, MPS)에 탐식 및 장기에 축적이 촉진된다. 본래 나노물질이 신장여과 가능한 크기를 지녔다 하더라도, 이와 같이 단백질과 결합하게 되면 크기가 증가하여 신장여과 배출이 불가능해진다. 이러한 의도하지 않은 장기 축적을 피하고 신장여과 배출될 수 있는 나노 입자를 생산하려면 나노 입자에 옵소닌화를 효과적으로 방지할 수 있는 전하를 부여하는 것이 필수적이다.
따라서, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 혈청단백질의 비특이적 흡착이 안되도록 하기 위해, 표면전하를 -20mV ~ 0mV 로 조절하여 혈액 순환 시간과 신장 청소 여부를 조절할 수 있다. 양전하의 나노 구조체는 음전하를 띄는 생체 내 대부분의 세포에 비특이적인 정전기 결합을 할 수 있으므로 바람직하지 않다.
원하는 표면 전하는, 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서, 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않고 말단이 외부에 노출되도록 조절, 및/또는 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하도록 그 비율 조절을 통해 설계할 수 있다.
[생체 내 주입용 나노 구조물의 크기 및 분산 안정성(colloidal stability)]
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 덱스트란 구형 코어의 표면에 노출된 친수성 기(hydrophilic functional groups)의 수화를 통해, 체액(biological fluids) 내 분산안정성(colloidal stability)을 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서, 체액(biological fluids)은 세포내액 또는 세포외액일 수 있다. 세포외액에는 혈액, 림프액, 세포를 둘러싸고 있는 간질액(interstitial fluid)이 있다.
유체 역학적 직경이 1 ~ 30 nm 인 나노입자는 식세포에서 탈출하여 혈관을 통해 이동할 수 있다. 통상, 나노입자의 크기가 9 ~ 10 nm 이하가 되어야 신장을 거쳐 자연 배출이 가능하다.
따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 전체 직경이 10 nm 이하, 바람직하게는 8 nm ~ 1 nm, 더 바람직하게는 8 nm ~ 1.5 nm이고, 균일한 크기분포를 지니도록 설계할 수 있다. 직경이 상기 값을 초과할 경우 체내에서 균일한 분포와 배출을 나타내기 어렵다.
한편, 나노입자의 크기에 따라 섭취되는 장기와 그에 따른 인체 내 분포가 달라진다. 이때 간의 쿠퍼셀에 의해 50 nm 이상의 나노입자는 체내에서 빠르게 간에 축적되며, 아무리 작은 코어의 나노입자라 할 지라도 분산성을 가지지 못한다면 쉽게 뭉치기 때문에 망상내피계에 의한 탐식이 많을 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물의 전체 크기에 영향을 주는 덱스트란 기반 코어는 가교제에 의해 덱스트란 가교시 분자내 및/또는 분자간 가교를 통해 형성된 1~3개의 덱스트란 분자 가교체이고 이로인해 수팽윤이 억제되므로, 코어는 균일한 크기 분포를 지닌다. 또한, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 덱스트란 기반 구형 코어 표면에 노출되어 있는 친수성기들 일부가 리간드로서 2가 내지 3가 철 이온과 배위결합을 통해 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 비연속적 쉘을 형성하고, 덱스트란에 연결된 가교제의 일 말단 친수성 기가 쉘의 비연속적 노출면을 통해 수 환경(aqueous environment)에 노출되어 있으므로, 체외 및 체내에서 나노입자 간의 뭉치는 현상이 없으며 저장 안정성이 우수하다. 이로인해, 혈액 내 빠르게 분포하고 크기가 균일하여 균일한 조영 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 1시간 이상, 최대는 2시간 이상까지 영상 관찰이 가능하며 균일한 크기(10 nm 이하)로 수화직경 유지가 가능하여 간 내 망상내피계에 의한 탐식을 줄이고 이에 따라 혈류에서의 체류시간이 증가하는 한편 인체에 축적되지 않고 간에서 대사분해 없이 신장을 통해 배출되어 종래의 가듈리늄 기반 조영제가 가지는 문제점을 해결할 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 체내에서 분해되지 않으면서, 수화를 통한 체액 내 분산안정성(colloidal stability)을 유지하기 때문에, 혈관에서 신장으로 여과되고, 주사 후 1 시간 이내에 방광에 모이도록 설계가능하고 소변으로 몸에서 대부분 배설될 수 있다. 따라서, 재활용 가능할 뿐만아니라, 흡착 등을 통해 투여부위인 조직 내 또는 혈액 내 정보 수집도 가능하다.
[조영제]
본 발명의 생체 내 주입용 나노구조물은 MRI 조영제로 MR 혈관조영술(MR angiography), MR 관절조영술(MR arthrography), MR 뇌수조촬영술(MR cisternography), MR 척수조영술(MR myelography), MR 림프관조영술(MR lymphangiography), MR 담췌관촬영술(MR cholangiopancreatography) 또는 뇌, 복부 MRI 조영술 등에 사용될 수 있다.
동물실험을 통해 양성 조영제로 사용될 수 있음을 확인한 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 투여된 조직 물 분자의 양성자 이완 시간을 줄임으로써 자기공명영상의 신호를 극대화하여 생체조직의 구조와 기능을 보다 더 높은 대조도(contrast)로 관찰할 수 있도록 하는 일종의 약물이다. 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생체 조건(physiological conditions: pH 7.4, 37 ℃)에서 그리고 현재 MRI 기기의 자기장 세기 중 가장 일반적인 3.0 Tesla에서, T1 이완 속도(relaxation rate, R1 = 1/T1)는 5 sec-1일 수 있다.
조영제의 이완 속도는 조영제의 농도에 직접 영향을 받으며, 특정 농도 구간까지는 신호가 비례하여 증가하지만 그 이후에는 오히려 신호가 떨어지게 된다. 이러한 이유로 현재까지 여타의 조영제는 최적의 농도에 맞도록 임상 현장에서 별도의 희석 조제가 요구되었다. 반면 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 별도의 희석 없이도 높은 신호를 나타내어 생체 조직의 관찰과 진단이 용이하도록 최적의 농도로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 주변 조직과의 대조 효과를 발휘할 수 있을 뿐만 아니라(도 10), 체액 내 분포된 농도에 따라, MRI에서 나타나는 체액의 신호 크기가 달라져, 시계열적으로 조직 내 분포 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 나노구조물이 생체 내 주입용 조영제 약물로 사용될 경우 표적항원 결합 부위를 포함하는 단편, 항체, 압타머(aptamer), 인공항체(repebody) 등과 같은 약물 전달체에 연결하여 사용할 수 있다. 이 경우 표면에 표적 항원이 있는 세포 또는 표적 항원 함유 체내 부위로 타겟팅되어 해당 부위를 영상화/수치화 및 T1 MRI 신호 강도로 해당 부위에서 표적 항원 분포/농도를 수치화할 수 있을 뿐만 아니라, 종양 항원 특이적 항체 사용 시 높은 종양 흡수율이나 건강한 조직으로부터의 빠른 제거율 같은 향상된 효능을 지닐 수 있다.
나아가, MR 관절조영술, MR 뇌수조촬영술 또는 MR 척수조영술 시 조영제를 주입하기 위한 주사기 바늘의 최적 위치는 형광 투시 X-선(fluoroscopy)을 이용하여 결정된다. 소량의 요오드화된 X-선 조영제의 주입 패턴을 형광 투시 X-선으로 모니터하여 바늘이 정확한 위치에 있음을 확인 한 이후 MRI 조영제를 주입한다. 따라서, 예컨대 관절강 내에서 MRI 조영제는 필연적으로 요오드화된 X-선 조영제와 혼합된다. GBCA의 T1 MRI 조영효과가 요오드 조영제에 의해 낮아진다는 보고가 있다. 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 요오드화된 X-선 조영제와 혼합한 후에도 T1 조영효과를 발휘하므로, 임상 MR 관절조영술, MR 뇌수조촬영술 또는 MR 척수조영술 시 효과적이다.
한편, 본 발명에 따라 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물은 관절 내 주사시 적절한 연조직 대비를 제공하여 관절의 복잡한 해부학적 구조를 명확하게 시각화하며(도 10), 기존의 가돌리늄 조영제에 비해 상당히 크고 오래 지속되는 T1 MRI 조영 효과를 보여준다.
[혈액순환 후 신장을 통해 소변으로 배출]
통상, 나노입자의 크기가 9 ~ 10 nm 이하가 되야 신장을 거쳐 자연 배출이 가능하다.
본 발명에 따라 가교 덱스트란 기반 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물의 중요한 특징은 응집(aggregation) 및 철 유리(leaching) 없이 우수한 콜로이드 안정성을 발휘함으로써 신장 여과 크기 한계보다 작은 컴팩트한 유체 역학적 직경을 유지하여 생체 내 배설 능력이 뛰어나다는 것이다. 혈관에서 불필요하게 오랫동안 순환하고 종종 장기에 축적되는 기존의 나노 입자 조영제와 달리, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 평균 유체 역학적 크기를 5 nm이하로 정교하게 조절 및 체내에서 응집 없이 콜로이드 안정성을 발휘할 수 있어서 체내에서 신장을 통해 변형 없이 완전히 배설될 수 있다.
본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물을 정맥 주사 후 얻은 쥐의 MRI 이미지를 보면, 방광에서 밝은 대비가 나타났다(도 6). 방광의 조영 증강은 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물이 혈관에 주입된 이후 신장에 의해 여과 및 뇨를 통해 변형 없이 배설되었음을 보여준다.
또한, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생체 내 주입 후 혈액순환계에 흡수되어 혈관 벽을 통한 누출(extravasation) 없이 신장을 통해 소변으로 배출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 변형 없이 신장을 통해 배설될 수 있으므로, 주입된 조직 내 정보 수집이 가능하고, MRI 조영제로 사용되어, 심혈관계, 뇌혈관계, 림프계, 근골격계 및/또는 뇌 척수 신경계 영상화 및/또는 수치화를 실현할 수 있다.
[대식세포에 의한 탐식]
약물 나노 제형은 약물을 질병 부위에 선택적으로 전달하거나 더 많은 양의 약물을 질병 부위에 전달할 수 있는 가능성을 갖고 있다. 하지만 불행히도 인공 나노 캐리어, 리포솜 및 고분자 나노입자 등 대부분의 약물 나노 제형은 질병 부위에 도달하기 전에 체내 면역 체계 중 하나인 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해 탐식되어 혈액 순환계에서 빠르게 제거되는 등 한계가 있다.
본 발명에 따라 가교 덱스트란 기반 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노구조물은 대식세포에 의해 탐식되지도, 혈관 내 옵소닌 단백질에 의해 결합되지도 않도록 다양한 조절인자로 조절할 수 있는 구조적 특징을 가지고 있다. 따라서, 원하는 혈액 순환 및 신장 제거 프로파일을 제공할 수 있다.
망상내피계는 대식세포계, 단핵식세포계(mononuclear phagocyte system, MPS)라고도 한다. 인체의 여러 부분에서 특정 물질들을 흡수하는 세포들이다. 이 세포들은 인체방어 메커니즘의 일부를 이룬다.
망상내피세포는 골수에 있는 전구세포로부터 만들어진다. 전구세포는 혈류로 방출되는 식세포인 단핵구로 발달되는데, 일부 단핵구는 순환계에 남지만 대부분은 체조직으로 들어가서 대식세포(macrophage)라고 하는 훨씬 더 큰 식세포가 된다. 대식세포 대다수는 움직이지 않는 세포로 조직 안에 남아서, 이물질을 걸러 파괴시킨다. 그러나 일부는 떨어져 나와 순환계나 세포사이 공간 안에서 떠돌아다닌다.
조직 내의 대식세포는 그 세포가 위치한 곳에 따라 모양과 이름이 다르다. 망상세포는 림프 절동과 비장, 골수에 있는 반면, 조직구는 피하조직에서 많이 발견된다. 신경소교세포(microglia)는 신경조직에, 폐포대식세포(alveolar macrophage)는 폐의 폐포에, 쿠퍼세포는 간에서 나타난다. 하나의 망상내피세포는 미생물들이나 세포, 심지어는 조그만 뼈조각이나 봉합물질 같은 이물질 조각도 먹어 치울 수 있다. 또한 몇 개의 운동성 대식세포가 융합하여 큰 이물질을 둘러싸는 하나의 식세포로 변화될 수도 있다. 식세포작용을 통해 대식세포는 인체 내부에 들어온 해로운 입자들에 대한 첫 방어선을 형성한다.
본 발명에 따라 T1 MRI 조영제의 기능을 발휘하는 생체 내 주입용 나노 구조물이 생체 내 주입 후 신장여과를 통해 소변으로 대부분 배출되는 것을 MRI을 통해 확인할 수 있는 것(도 6 및 도 7); 생체 내 주입 후 대변이 아닌 소변으로 대부분 수집되는 것(도 8); 및 관절강 내 주입 후 소변으로 수집할 수 있는 것(도 12)으로부터, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 체내 투여, 분포 및 제거 경로에서 대식세포에 의해 탐식(phagocytosis)되지 않고 대사 분해되지 않는 것을 알 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생체 내 주입 후 체내 투여, 분포 및 제거 경로에서 대식세포에 의해 탐식(phagocytosis)되지 않으므로, 세망내피계 기관의 대식세포 식세포작용으로 인해 간, 비장, 골수, 림프절 등에 흡수되지 아니한다.
또한, 본 발명에 따라 T1 MRI 조영제의 기능을 발휘하는 생체 내 주입용 나노 구조물이 정맥투여 또는 관절강 혹은 척수강에 투여된 경우 간, 비장, 골수, 림프절 등에 분포되지 아니한다는 것은, MRI 영상을 통해 확인할 수 있으며, 또한 소변으로 모두 변형없이 수집할 수 있는 것으로부터 확인할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따라 가교 덱스트란 기반 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물은 대식세포에 의해 탐식되지 않도록 설계할 수 있으므로, 생체 내 주입 후 흡수, 분포 및/또는 배출되는 경로 상에서 대사 분해도 없이 온전한 상태로 소변으로 배출가능하고, 소변으로 수집되어 재사용 또는 재활용도 가능하다.
또한, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 대식세포에 의해 탐식되지 않도록 설계되는 동시에 MRI 영상에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 지니도록 설계될 수 있으므로, 생체 내에 주입 후 MRI 영상을 통해 나노 구조물의 위치를 추적하여, 생체 내 주입 후 대식세포에 의한 탐식여부, 대사 분해 여부, 혈액순환 여부, 림프액순환 여부, 모세혈관을 통한 세포의 실질로 전달여부, 조직 내 축적 여부, 신장을 통해 소변으로 배출 여부, 생체 내 주입 후 혈관순환계에 흡수 여부, 혈관 벽을 통한 누출 여부, 소변을 통해 수집하여 재사용 가능여부를 확인할 수 있다.
[생체 내 거동_모세혈관 투과성]
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 정맥 내 투여된 경우 혈관벽을 통한 누출없이 혈액 순환 후 신장여과를 통해 소변으로 배출될 수 있게 설계되거나(실시예 1), 혈관 이외의 타 조직, 예컨대 관절강, 척수강으로 주입 후 혈관순환계에 흡수되어 혈관벽을 통한 누출없이 혈액 순환 후 신장여과를 통해 소변으로 배출될 수 있게 설계될 수 있다(실시예 2).
일반적으로 약물의 분포(drug distribution)란, 한 약물이 가역적으로 혈류를 떠나 세포외액과 조직으로 들어가는 과정이다. 정맥에 투여한 약물은 투여 직후 혈관(혈장)에서 신속히 사라져 조직(간질액)으로 들어가게 되는데, 여기에 관여하는 요인에는 심장박출량, 국소 혈류, 모세혈관 투과성, 조직용적 등 내재적 요인과 약물의 크기, 상대적인 친지성, 약물과 혈장/조직 단백질의 결합 등 약물의 물리화학적 특성이 있다. 이런 측면에서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 정맥 내 투여시 혈관벽을 통한 누출 또는 간질액으로 들어가는 과정 없이 혈액 순환 후 신장을 통해 소변으로 배출되는 것으로부터, 모세혈관 투과성 없게 설계될 수 있다(실시예 1).
모세혈관 구조는 내피 세포간 틈새 접합부(slit junction)에 의해 노출된 기저막 분획이라는 점에서 매우 다양하다. 간장 및 비장(spleen)에서 기저막의 대부분이 거대한 불연속적인 모세혈관에 의해 노출되어 있어서, 거대 혈장 단백이 통과할 수 있다. 뇌의 모세혈관구조는 연속성이며, 틈새 접합부가 없다. 빈틈없이 병렬된 세포가 혈액-뇌 장벽(BBB)을 구성하는 견고한 이음부(tight junction)를 형성한다. 약물이 뇌로 들어가기 위해서 중추신경계(CNS)의 모세혈관 내피세포를 통과하거나, 능동적으로 수송되어야 한다.
약물의 화학적 성상이 세포막 통과능력에 강력하게 영향을 미친다. 지용성 약물은 지질막에 용해되므로 모든 세포포면을 통과할 수 있다. 반면, 친수성 약물은 쉽게 세포막을 통과하지 못하므로, 틈새이음부(slit junction)를 통해 통과해야 한다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 덱스트란에 연결된 가교제의 한쪽 말단 친수성 기(one end of cross-linker having hydrophilic functional group)가 쉘의 비연속적 노출면을 통해 수 환경(aqueous environment)에 노출할 수 있도록 형성된 것이므로 친수성 약물에 해당하여 세포막뿐만아니라 모세혈관의 내피 세포간 틈새 접합부(slit junction)을 통과하지 못하도록, 즉 모세혈관 비투과성으로 설계할 수 있다.
[생체 내 주입 후 혈액 순환계에 흡수 및 재사용]
순환계는 몸 안의 각 기관에 영양과 산소, 에너지 등을 공급하고, 생명 활동으로 생기는 이산화탄소, 노폐물 등을 호흡계통이나 비뇨계통으로 전달하여 몸 밖으로 배출하도록 하는 혈액이나 림프액 같은 체액의 흐름을 담당하는 계통이다.
혈액의 순환은 심장의 운동에 의해 이루어진다. 순환 중인 혈액은 산소의 운반, 영양분의 공급, 대사과정에서 생긴 노폐물의 제거, 체온의 유지, 호르몬의 운반과 같은 역할을 한다.
상당히 많은 양의 이온, 영양분, 유기 노폐물, 용해된 기체, 물 등이 모세혈관을 통해 투과되며, 대부분 모세혈관으로 재흡수된다. 모세혈관을 떠난 체액과 모세혈관으로 돌아오는 체액은 거의 같은 양이며, 일부만 림프관을 통해 흡수된다. 이때, 림프관으로 흘러 들어가 혈액순환으로 돌아온다.
다세포생물에서는 세포가 형태적, 기능적으로 분화해 일반적으로 같은 종류의 세포가 모여 일정한 기능을 영위하도록 배열되어 있다. 이와 같은 유기적인 세포집단을 조직(tissue)이라고 한다.
동물의 조직은 형태와 기능에 따라 상피조직, 결합조직, 연골조직, 골조직, 혈액과 림프, 근조직, 신경조직으로 나눌 수 있다.
상피조직은 체표면, 소화기와 호흡기의 관강(管腔), 복막강(腹膜腔)과 심막강(心膜腔)의 체 강 등의 표면을 한 층에서 여러 층의 세포로 빈틈없이 덮고 있다. 서로 이웃하는 세포는 밀착되어 세포간질이 거의 없다. 상피조직은 때로는 함입해 분비세포군(선조직)을 이루며, 시각, 청각, 평형감각의 감각상피와 털, 손톱과 같이 특수한 성질을 가진 상피도 있다.
근조직은 수축운동을 하는 근세포로 이루어져 있다. 근세포는 전체적으로 가늘고 기다란 섬유 모양의 외형을 취하므로 근섬유라고 한다.
신경조직은 신경세포(뉴런)와 신경교세포(神經膠細胞, 글리아 세포)로 이루어지며 생체 정보의 유선적(有線的) 전달을 한다. 고등동물에서는 뇌와 척수를 중추신경계, 여기서 갈라져 나온 것을 말초신경계라고 한다. 중추신경계는 신경조직에 혈관과 결합조직이 더해진 것이다. 말초신경계도 신경세포와 섬유 및 섬유를 둘러싼 슈반 세포(글리아 세포에 해당)가 주성분이다.
결합조직, 연골조직, 골조직, 혈액과 림프의 4조직을 통틀어 지지(支持)조직이라 하고, 지지조직에는 세포간질이 풍부하며, 뼈, 연골, 결합조직은 몸과 기관의 형상을 유지하는 작용을 한다. 세포간질은 섬유와 기질(基質)로 이루어지며, 세포는 그 속에 묻혀 산재한다. 혈액과 림프액을 지지조직에 넣는 것은 혈장(血漿)과 림프장을 기질(基質), 피브린을 섬유로 볼 수 있기 때문이다.
림프관(lymphatic vessel)은 주로 피부나 점막 하층에서 액체와 물질을 혈관계로 수송하는 한쪽 방향이 막힌 투명한 관이다. 림프관은 림프를 조직에서 림프절로 운반한 후 림프절에서 다시 혈관으로 운반하는 작은 관이다. 림프관은 모세혈관보다 투과성이 더 높아 항원과 세포를 포함한 거대분자를 모세혈관보다 더 쉽게 흡수한다. 한편, 림프절(lymph node)은 림프관을 따라서 온몸에 분포하며 림프관과 림프 통로가 연결되는 부분이다.
림프액은 옅은 노란색을 띈 액체이며 혈액보다 단백질 성분은 적고 지방 성분은 많으며 림프구와 백혈구가 많다. 림프액은 림프관을 통해 전신을 순환하면서 각 세포의 영양분을 공급하고 노폐물을 받아들인다. 림프구는 면역반응을 나타내어 우리 몸에 침투한 세균, 바이러스 등에 대해 방어하는 역할을 한다.
혈액은 동맥을 통해 전신을 순환한 뒤 정맥으로 나오게 되는데 이때 일부의 체액이 세포 사이에 남게 되는 간질액 (혈장이 조직 내의 모세혈관에서 여과되어 배출된 조직이나 세포 사이를 채우고 있는 세포외액)이 생긴다. 이 간질액이 림프모세혈관으로 나오게 되면 이를 림프액이라 부른다. 림프액은 매우 느린 속도로 림프관으로 들어가 흘러서 마지막에 다시 혈류로 들어간다. 림프액은 모세 혈관 벽에서 흘러 나와 신체의 조직 세포를 목욕시킴으로써 조직내 노폐물을 제거한다.
상술하면, 이 체액 림프는 림프관을 통해 전신을 순환하면서 각 세포의 영양분을 공급하고 세포 밖으로 흘러나오는 이산화탄소(CO2)와 손상된 세포, 암세포, 세균 같은 폐기물을 운반한다. 이와 같은 과정을 마치면, 림프는 대경정맥과 쇄골하정맥 접합부에서 다시 혈액내로 들어가게 된다. 이처럼, 림프가 림프절을 통해 흘러나가는 과정에서 림프절 안의 림프구가 이물질과 반응하여 이를 제거하고, 다른 이물질들을 파괴하는 역할을 수행하는 것이다. 때문에 급성 염증과 같이 림프절이 외부에서 침입한 이물질을 걸러낼 때 림프절이 부어오르게 된다.
따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 신체 말단부위에 주입하여 림프관으로 흡수되거나 또는 림프관 내 직접 주입하도록 설계될 수 있고, 이 경우 림프관으로 흘러 들어가 림프절에서 림프구 및 대식세포에 의해 제거되지 않고 혈액순환계로 흡수될 수 있다.
본 발명에 따라 가교 덱스트란 기반 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물은 체내 주입된 후 조직 내에 축적되지 않고 완전히 혈액순환계에 흡수되며 신장여과를 통해 소변으로 통해 수집가능하도록 설계할 수 있다(도 6 ~ 8, 도 10 ~ 14).
따라서, 이렇게 설계된 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생체 내 주입 후 흡수, 분포 및/또는 배출되는 경로 상에서 대사 분해도 없이 온전한 상태로 소변으로 수집가능하므로, 재사용 또는 재활용도 가능하다. 또한, 흡착 등을 통해 투여부위인 조직 내, 림프계 또는 혈액 내 정보 수집도 가능하다.
[면역반응_독성]
전술한 바와 같이 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 신체 말단부위에 주입 시 림프관으로 흡수되거나 림프관에 직접 주입되거나 림프관에 직접 주입될 수 있고, 림프가 림프절을 통해 흘러나가는 과정에서 림프절 안의 림프구에 의해 제거되지 않기 때문에 림프절이 부어오르는 급성 염증 없이, 혈액순환계로 흡수될 수 있다.
한편, 혈액 내에는 적혈구와 백혈구가 있으며, 이 중 백혈구가 면역세포들이다. 백혈구는 중성구, 호산구, 호염구, 단핵구(monocyte), 혈소판, 림프구(lymphocyte)와 같이 여러 세포로 구성되어 있고, 림프구로는 B-림프구, T-림프구와 자연살해(natural killer, NK) 세포가 있다. 단핵구는 혈관을 통해 조직으로 이동하여 선천성 면역에서 매우 중요한 역할을 하는 대식세포(macrophagy)로 분화된다. 이들 백혈구들은 모두 면역반응에 관여한다.
선천성 면역(innate immunity)은 체내로 침입하는 항원에 대해 종류에 관계없이 비특이적으로 반응하며, 특별한 기억작용은 없다.
항원은 대식세포 안에서 분해된 후 주조직 적합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex) 분자와 결합하게 되고, 결합된 조각은 세포 표면에 붙어 있게 된다. 이러한 항원제시라는 과정을 통해서 선천성 면역(1차 면역)과 적응면역(2차 면역)은 연결되고, 선천성 면역이 2차 면역으로 이어진다.
요컨대, 전술한 바와 같이, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 생체 내 주입 후 체내 투여, 분포 및 제거 경로에서 대식세포에 의해 탐식(phagocytosis)되지 않도록 설계할 수 있으므로, 선천성면역 및/또는 적응면역(adapted immunity) 관련 면역반응을 유도하는 항원으로 작용하지 아니하고, 이로인해 염증, 알레르기, 과민증(hypersensitivity), 이상증(abnormality), 증후군(syndrome) 등의 질병을 유발하지도 아니할 수 있다.
동물실험을 통해, 본 발명에 따라 가교제에 의해 가교되고 표면에 노출되어 있는 가교제 유래 친수성기들이 리간드로서 2가 내지 3가 철 이온과 배위결합을 통해 2가 내지 3가 철 이온 쉘이 형성되어 있는 덱스트란 기반 구형 코어는 체내에서 분해되지 않으며, 고용량에서도 체중감소를 유도하지 않으면서(도 15), 혈액화학의 모든 테스트항목에서 정상범위를 나타났으며(도 16), 조직병리결과에서도 병리학적 이상소견이나 병변이 관찰되지 않았다(도 16). 즉, 본 발명의 나노 구조물은 독성이 없도록 그리고 뛰어난 생체 내 적합성을 발휘하도록 충분히 설계할 수 있다.
[정맥 투여_혈액순환용 나노 구조물]
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 뇌심혈관계를 혈액순환할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 정맥에 주입 시 간에서 제거되지 않으므로, 혈액순환 후 신장을 통해 소변으로 배출되는 혈액순환용 나노 구조물로 사용될 수 있다. 따라서, 혈액순환하면서 혈액 내 정보 수집이 가능하고, 경동맥, 심장, 대동맥, 하대정맥, 뇌혈관 중 적어도 하나의 혈액순환하면서 조영제 역할을 수행할 수 있어, 각 조직/기관별 혈관 구조와 형태의 영상화, 혈류와 혈액동력학적 정보 분석도 가능하다.
본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 정맥 주사 후 T1 MRI 조영제 역할을 발휘하면서 혈관 벽을 통한 누출 없이 대식세포에 의해 탐식되지 않고 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되도록 설계될 수 있다(도 4 ~ 8). 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물의 일구체예는 동물실험에서 혈액순환 후 혈관에서 신장으로 여과되고 주사 후 1 시간 이내에 방광에 모이고 소변으로 몸에서 배설되었다.
또한, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 삼투압과 점도 등 정맥 주사제 제형으로서 갖추어야할 적정 물리화학적 특성을 구현할 수 있다(실시예 1, 도 2). 덱스트란 단량체의 평균분자량을 작게 조절할수록 본 발명의 나노 구조물을 고농도로 준비가능하므로, 희석정도를 조절하여 정맥 투여 제형의 점도가 정교하게 조절가능하다(실시예 1 ~ 5 및 도 2).
본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 대조효과가 상대적으로 오래 유지되어 MRI 촬영시 스캔 시간을 길게 하여 MRI의 공간 해상도를 향상시킬 수 있도록 설계할 수 있으므로, 생체 내 전신의 혈관계를 보다 더 높은 해상도로 영상화 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 MRI를 통해 생체 내에서 임상적으로 매우 중요하나 기존의 조영제로 관찰하기 어려운 미세혈관을 영상화 할 수 있는 특징이 있다. 예컨대, 실시예 1의 나노 구조물 INV-001을 이용하여 0.078 mm x 0.078 mm x 0.078 mm의 공간 해상도로 랫드 뇌의 이미징을 수행한 결과, 약 0.078 mm 두께의 미세 뇌혈관도 선명하게 관찰할 수 있었다(도 4(다)). 현재 임상현장에서 가장 널리 사용되는 3 테슬라(Tesla) MRI 기기의 공간해상도가 약 1 mm인 것을 감안할 때, 본 나노 구조물 INV-001로 구현한 0.078 mm의 해상도는 약 13배 향상된 것이다.
[관절강(joint cavity) 및 척수강(intrathecal space) 투여]
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 주입된 부위에 축적되지 않고 체내로 흡수되며, 흡수된 나노 구조물은 신장 청소를 통해 배설되는 것이 특징이다.
예컨대, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 관절강(articular cavity) 또는 척수강(intrathecal space)에 주입 시 혈액순환계에 흡수되어 신장을 통해 소변으로 배출되도록 설계될 수 있다.
실시예 2의 나노 구조물 INV-002는 덱스트란 가교체에 철분이 결합된 대략 5 nm의 수화지름을 가진 입자이다. 실시예 2의 나노 구조물 INV-002의 수 평균 분자량은 ~32 kDa로 혈청 알부민의 약 절반이고 유체 역학적 직경은 ~5 nm이므로, 실시예 2의 나노 구조물 INV-002의 크기가 정맥 배출(venous drainage)에 필요한 크기 기준을 충족하고 관절 내 주사(intra-articular injection) 사용에 최적임을 나타낸다.
관절(articulation)이란 둘 이상의 골간의 접합부위 즉, 뼈와 뼈 사이가 서로 맞닿아 연결되어 있는 부위를 말하며 우리 몸의 활동을 가능하게 하는 중요한 부위이다. 관절의 뼈와 뼈 사이에는 관절연골(articular cartilage)이라는 유리연골의 얇은 층이 있다. 연골 주머니모양의 구조의 윤활막(synovial membrane)과 윤활액이라는 끈끈한 액체를 분비하는 윤활막세포(synoviocyte)로 구성된 윤활조직이 있다. 윤활액은 단백질, 염류, 하이알루론산 등을 포함하고 있으며 관절 표면에 영양을 공급하고 관절 부위를 매끄럽게 한다. 윤활액에는 또한 백혈구와 림프구가 존재한다.
백혈구(leukocyte)는 수백만개로 혈액과 조직에서 이물질을 잡아먹거나 항체를 형성함으로써 감염에 저항하여 신체를 보호하는 역할을 한다. 림프구(lymphocyte)는 B세포와 T세포의 2가지로 나누어져 있는데, 2가지 모두 몸에서 이물질(항원)을 식별하여 이에 결합한다. 이들 2종류의 림프구는 조직과 기관에서 활동한다.
혈관은 관절주머니의 섬유층과 윤활막이 만나는 부분까지만 들어가 있어서 관절연골에는 영양공급이 직접적으로 되지 않는다.
관절강(joint cavity)은 움직이는 동안 활액 관절(synovial joints)의 관절 연골(articular cartilage) 사이의 마찰을 감소시키는 점성 액체인 활액(synovial fluids)으로 채워져 있다. 활액은 히알루론산, 단백질 및 효소를 포함한 다양한 분자를 포함하는 것으로 알려져 있다. 활액에 있는 물질은 우리 몸의 순환계와 연결된 림프관이나 정맥 혈관에 배출하여 제거할 수 있다.
배출(drainage)에 대한 정확한 크기 제한에 대한 명확한 이해는 없지만 활막(synovium)은 일반적으로 알부민(분자량: 약 66.5 kDa) 및 IgG(분자량: 약 150 kDa)와 같은 비교적 작은 물질에 투과성이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 균질한 분포, 효과적인 MR 관절 조영술 및 조영제의 배설을 위해 더 작은 크기의 조영제 (< ~7 nm)가 선호되며, 본 발명의 나노 구조물은 이들 조건을 동시 충족하도록 설계될 수 있다.
척수강내 주사(intrathecal injection)은 척주관(spinal canal, 척수관; vertebral canal, 축추관) 및 지주막하공간(subarachnoid space) 내로 주사바늘을 통해 약물을 주입하는 방법이다. 척주관은 각각의 척추뼈에 위치한 척추뼈구멍들이 연속적으로 이어져 1개의 관을 형성한 것이다. 척주관 속에는 척수와 수막, 혈관, 말초신경의 일부가 위치하고 이들을 보호한다. 또한 척추강내 주사는 지주막하공간으로 주입되기 때문에 지주막과 연막 사이의 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)에 약물이 도달된다.
본 발명의 나노 구조물은 또한, 척수강내 주사를 통해 척주관/지하막하공간 내 균질한 분포, 효과적인 MR 뇌수조촬영술(MR cisternography) 또는 MR 척수조영술(MR myelography) 및 조영제의 배설이 가능하도록 설계될 수 있다(실시예 13, 도 14).
[림프관 투여_림프액 순환용 나노 구조물]
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 신체 말단부위에 주입하여 림프관으로 흡수되거나 림프관 주입시 림프액 순환할 수 있도록 설계할 수 있다.
림프계는 면역 체계의 필수적인 부분이며, 감염과 암에 대항하여 싸우는 특수 백혈구를 생성하고 처리하는 흉선, 골수, 비장, 편도, 충수, 소장 내 파이어판 등의 기관들이 포함된다. 림프계는 (i) 얇은 벽으로 이루어진 림프관, (ii) 림프절, (iii) 2개의 집합관으로 구성된다.
림프관은 온몸에 분포하고, 모세혈관(동맥과 정맥을 연결하는 가장 작은 혈관)보다 크며, 가장 작은 정맥보다도 작다. 대부분의 림프관에는 엉길 수 있는 림프가 계속 한 방향으로(심장 쪽으로) 흐르게 하기 위해 정맥처럼 판막이 있다. 몸 전체의 조직에서 림프라는 체액을 배출하고 림프관은 림프를 조직에서 림프절로 운반한 후 두 집합관을 통해 체액을 정맥계로 돌려보낸다.
림프는 모세혈관의 아주 얇은 벽을 통해 세포 사이의 공간으로 확산된 체액에서 시작한다. 체액의 대부분은 모세혈관에 재흡수되고 나머지는 림프관 속으로 배출되어 궁극적으로 정맥에 되돌아간다. 림프는 또한 (i) 체액이 조직에 영향을 제공하는 단백질, 무기질, 영양소, 기타 물질, (ii) 조직 체액에 들어온 손상된 세포, 암세포, 이물질(예: 세균과 바이러스)를 비롯하여 많은 다른 물질을 함유한다.
림프절은 림프를 위한 집합 센터로 기능하는 작은 콩 모양의 기관이다. 모든 림프는 전략적으로 위치한 림프절을 통해 지나면서 손상 세포, 암세포, 이물질을 걸러낸다. 또한 림프절에는 손상된 세포, 암세포, 감염성 미생물, 이물질을 포식해 파괴하도록 특화된 백혈구(예: 림프구 및 대식세포) 또한 존재한다. 따라서 림프계의 중요한 기능은 손상된 세포를 몸에서 제거하고 감염과 암의 확산을 방지하는 것이다. 일부 림프절은 피부 아래, 특히 목, 겨드랑이, 서혜부에 군집된다. 다른 림프절은 신체 내부, 예를 들어 복부 안에 깊숙이 있다.
림프절은 집합관 속으로 배출하고 집합관은 쇄골 아래 위치한 두 개의 쇄골하 정맥 속으로 내용물을 배출한다. 이 정맥은 만나서 상대정맥, 즉 상체로부터 온 혈액을 심장 속으로 배출하는 대정맥을 이룬다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 신체 말단부위에 주입하여 림프관으로 흡수되거나 림프관에 직접 주입할 수 있도록 설계될 수 있고, 이 경우 신체 말단부위에 주입 시 또는 림프관에 직접 주입 시 림프관으로 흘러 들어가 림프절에서 림프구 및 대식세포에 의해 제거되지 않고 혈액순환계로 흡수될 수 있다.
나아가, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물이 MRI 조영제 역할을 수행하는 경우 림프관내에 흡수/주입되면 림프액 순환경로에서 림프관 폐색, 림프부종, 종창성 림프절, 림프절염, 림프종, 다른 기관의 종양이 종양 근처의 림프절로 이동 등 림프관 이상유무를 MRI 이미징할 수 있다.
[대사를 통한 약물제거(Drug clearance Through Metabolism)]
본 발명에 따른 나노 구조물은 생체 내 주입용이므로 일종의 약물이다.
일단 약물이 체내에 들어가면 제거과정이 시작된다. 약물제거 주요경로는 (1) 간장대사, (2) 담즙배설, (3) 요중배설이다.
제거에는 생체변환(biotransformation, 약물대사)과 배설(excretion)을 포함한다. 배설(excretion)은 체내에서 원약물(intact drug)을 제거하는 것이다.
간 및 비장과 같은 기관에 남아있는 나노 입자의 비율이 높으면 배설 성능이 만족스럽지 않다는 것을 의미한다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 체내 투여 후 정상 조직 내 축적없이 소변을 통해 100% 수집되는 것으로부터, (1) 간장대사, (2) 담즙배설 되지 아니하고, (3) 요중배설 경로만 이용하여 체내에서 제거될 수 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 체내 주입된 사용량 대비 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 요중 배설을 통해 수집할 수 있다.
[기타 약동학적 물성]
혈장단백과의 가역적인 결합은 비확산성 형태로 약물을 포획하여, 혈관 구획(compartment) 밖으로 수송을 지연시킨다. 알부민은 주요한 약물 결합 부위이고, 약물의 저장고로 작용한다. 혈중에 유리된(free) 약물의 농도가 약물제거(clearance)로 인해 감소할 때, 알부민에 결합된 약물은 알부민으로부터 해리된다. 따라서, 혈장 중 총 약물의 일정분획으로서 유리 약물 농도를 유지시킨다.
그러나, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 전하가 -20 mV ~ 0 mV 로 조절되어, 알부민과 같은 혈장단백질과 결합하지 아니한다. 이는 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물이 혈관에서 신장으로 여과되고 주사 후 1 시간 이내에 방광에 모이고 소변으로 몸에서 배설되는 것으로부터 유추할 수 있다.
많은 약물은 조직에 축적되어, 간질액과 혈액보다 조직에서 보다 높은 약물 농도를 나타낸다. 약물은 지질, 단백질 또는 핵산과의 결합으로 인해 축적될 수 있다. 약물은 능동적으로 조직에 수송될 수도 있다. 조직 저장고는 약물의 주요 자원으로 작용하며, 작용을 연장시키거나 국소적인 약물독성을 일으킬 수도 있다.
그러나, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은, 체내 투여 후 정상 조직 내 축적없이 소변을 통해 100% 수집되는 것으로부터, 지질, 단백질 또는 핵산과 결합되지 않은 것을 유추할 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 축적이나 유해한 영향없이 혈관, 관절강, 척수강을 포함한 체내에서 완전히 제거되며 신장 제거 경로를 통해 신체에서 안전하게 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 혈관뿐만아니라 체내(예, 관절강, 척수강) 주입된 후 신장 제거 가능한 약동학의 성공적인 시연을 통해, 나노 물질의 생체 내 적용 가능성을 확대할 수 있다.
본 발명에 따라 가교 덱스트란 기반 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비한 생체 내 주입용 나노 구조물은 덱스트란의 분자량, 덱스트란 주사슬의 길이, 가교시의 가교제의 종류, 합성반응시 투여하는 가교제의 양과 투여 속도 및 추가 화학 작용기 개질 중 적어도 하나를 조절함으로써, 나노 구조물의 전체 크기 및 전체 전하 조절을 통해, 원하는 혈액 순환 시간 및 신장 배설 약동학을 부여할 수 있다.
도 5에는 본 발명의 일구체예에 따른 정맥 내 주입용 나노 구조물(실시예 1)의 약동학 분석 데이터가 예시되어 있다. 본 발명에 따른 생체 내 주입용 나노 구조물은 혈관순환계에 흡수된 후, 빠른 반감기를 나타내며 소실될 수 있다.
본 발명은 생체 내 주입 후 체내에서 대사 또는 분해되지 아니하고, 혈액순환계에 흡수되어 혈관 벽을 통한 누출 없이 신장여과를 통해 소변으로 수집하여 재사용 가능하도록 설계한 생체 내 주입용 나노 구조물을 제공할 수 있으며, 이를 재사용 가능한 조영제 및/또는 약물 전달체 또는 흡착제로 사용할 수 있다.
본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물은 가돌리늄 기반 조영제와 유사한 T1 MRI 조영효과를 발휘하며 혈액 내 빠르게 분포하고 1시간 이상 혈관 영상이 가능하며, 최대 0.078 mm x 0.078 mm x 0.078 mm의 고해상도 촬영이 가능하고, 조영 후 신장을 통해 배설될 수 있다.
도 1은 정맥 내 주입용 나노 구조물의 모식도이다.
도 2는 정맥 내 주입용 나노 구조물(코드명 INV-001)과 관절강 내 주입용 나노 구조물(코드명 INV-002)의 최대 농축시 농도 및 점도 비교결과이다.
도 3은 나노 구조물의 T1 MRI 조영효과에 대한 데이터이다.
(가-라) 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 T1 MRI 조영효과 측정 비교 실험 데이터. T1 MRI 조영효과 측정을 위한 샘플 사진(가), 측정된 T1 MRI 신호 (나), 측정된 r 1 (다) 및 r 2 값 (라). (마) 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001과 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002의 r 2/r 1 ratio 비교. (바,사) 실시예 2의 INV-002 용액을 포함하는 팬텀(phantom)의 T1 강조영상(바) 및 T2강조영상(사).
도 4는 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 동물 혈관 조영효력 평가 데이터이다. (가) INV-001 정맥 투여 후 촬영한 T1 MRI 영상. (나) 혈관계에서 측정한 대조대비잡음비(contrast-to-noise ratio, CNR)의 시계열 그래프. (다) 랫드에 INV-001 정맥 투여 후 0.078 mm x 0.078 mm x 0.078 mm 공간해상도로 촬영한 3차원 MRI 영상으로 랫드 뇌를 각각 sagittal, coronal, transverse 방향에서 바라본 이미지.
도 5는 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 약동학 분석 데이터이다. (가) INV-001을 정맥 주입 후 시간에 따른 혈액 내 철 함량 분석 결과. (나) INV-001의 약동학 파라미터.
도 6는 쥐 정맥에 INV-001를 주입한 뒤 각기 다른 시간 촬영한 T1 MRI 영상 데이터이다.
도 7은 정맥 주입된 INV-001의 체내 분포 및 신장배출 정량분석 데이터이다. (가) INV-001 주입후, 몸 전체 및 방광부분의 CNR변화. (나) 몸 전체 CNR 변화 대비 방광 부분 CNR 변화.
도 8은 INV-001 투여군과 식염수 투여 대조군의 소변/대변 속 철 함량비교 데이터이다. (가) 소변 속 철 함량 및 (나) 대변 속 철 함량 비교.
도 9는 INV-002이 요오드화된 X-선 조영제와 혼합되었을 때의 T1 MRI 조영효과를 나타내는 데이터이다.
도 10은 랫드 관절강에 INV-002을 주입하여 촬영한 랫드 자기공명영상 관절조영술 효력 데이터이다. (가,나) 관절강 내 조직 구조 모식도. (다,라) INV-002 주입 실험군과 식염수 주입 대조군의 랫드 관절 MRI 영상. INV-002 주입전/후 (마) T1 MRI 신호 강도 비교 및 (바) 관절 내 조직의 CNR 비교.
도 11은 자기공명영상 관절조영술에 있어 INV-002와 Dotarem의 효력을 비교한 데이터이다. 도 11 랫드 관절강 내 (가) INV-002 와 (나) Dotarem 주입 후 각기 다른 시간 촬영한 T1 MRI 영상 및 (다) 관절강 내 신호대비잡음비(signal-to-noise ratio, SNR)의 시계열 그래프.
도 12는 랫드 관절강 내 INV-002 주입 후 채취한 소변과 식염수 주입 후 채취한 소변 내 (가) 철 양 비교 및 (나) 소변 샘플 색 비교 데이터이다.
도 13은 Perls Prussian blue 조직면역화학염색법을 이용한 랫드 관절강 내 미량 철 분석 데이터이다. (가) INV-002가 주입된 랫드 관절강 조직과 (나) 식염수 주입 랫드 관절강 조직의 현미경 사진.
도 14는 랫드 척수강 내 INV-002 주입 후 촬영한 T1 MRI 영상의 시계열 데이터이다.
도 15는 랫드 관절강 내 INV-002 주입 후 14일간 측정한 체중 패턴 데이터이다.
도 16은 랫드 관절강 내 INV-002 주입 후 분석한 혈액화학 및 조직병리 데이터이다. 랫드 관절강 내 INV-002 주입한 실험군 및 식염수 주입 대조군의 (가) 혈액화학분석결과. (나) INV-002 주입 실험군 및 (다) 식염수 주입 대조군의 조직병리 사진.
도 2는 정맥 내 주입용 나노 구조물(코드명 INV-001)과 관절강 내 주입용 나노 구조물(코드명 INV-002)의 최대 농축시 농도 및 점도 비교결과이다.
도 3은 나노 구조물의 T1 MRI 조영효과에 대한 데이터이다.
(가-라) 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 T1 MRI 조영효과 측정 비교 실험 데이터. T1 MRI 조영효과 측정을 위한 샘플 사진(가), 측정된 T1 MRI 신호 (나), 측정된 r 1 (다) 및 r 2 값 (라). (마) 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001과 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002의 r 2/r 1 ratio 비교. (바,사) 실시예 2의 INV-002 용액을 포함하는 팬텀(phantom)의 T1 강조영상(바) 및 T2강조영상(사).
도 4는 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 동물 혈관 조영효력 평가 데이터이다. (가) INV-001 정맥 투여 후 촬영한 T1 MRI 영상. (나) 혈관계에서 측정한 대조대비잡음비(contrast-to-noise ratio, CNR)의 시계열 그래프. (다) 랫드에 INV-001 정맥 투여 후 0.078 mm x 0.078 mm x 0.078 mm 공간해상도로 촬영한 3차원 MRI 영상으로 랫드 뇌를 각각 sagittal, coronal, transverse 방향에서 바라본 이미지.
도 5는 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 약동학 분석 데이터이다. (가) INV-001을 정맥 주입 후 시간에 따른 혈액 내 철 함량 분석 결과. (나) INV-001의 약동학 파라미터.
도 6는 쥐 정맥에 INV-001를 주입한 뒤 각기 다른 시간 촬영한 T1 MRI 영상 데이터이다.
도 7은 정맥 주입된 INV-001의 체내 분포 및 신장배출 정량분석 데이터이다. (가) INV-001 주입후, 몸 전체 및 방광부분의 CNR변화. (나) 몸 전체 CNR 변화 대비 방광 부분 CNR 변화.
도 8은 INV-001 투여군과 식염수 투여 대조군의 소변/대변 속 철 함량비교 데이터이다. (가) 소변 속 철 함량 및 (나) 대변 속 철 함량 비교.
도 9는 INV-002이 요오드화된 X-선 조영제와 혼합되었을 때의 T1 MRI 조영효과를 나타내는 데이터이다.
도 10은 랫드 관절강에 INV-002을 주입하여 촬영한 랫드 자기공명영상 관절조영술 효력 데이터이다. (가,나) 관절강 내 조직 구조 모식도. (다,라) INV-002 주입 실험군과 식염수 주입 대조군의 랫드 관절 MRI 영상. INV-002 주입전/후 (마) T1 MRI 신호 강도 비교 및 (바) 관절 내 조직의 CNR 비교.
도 11은 자기공명영상 관절조영술에 있어 INV-002와 Dotarem의 효력을 비교한 데이터이다. 도 11 랫드 관절강 내 (가) INV-002 와 (나) Dotarem 주입 후 각기 다른 시간 촬영한 T1 MRI 영상 및 (다) 관절강 내 신호대비잡음비(signal-to-noise ratio, SNR)의 시계열 그래프.
도 12는 랫드 관절강 내 INV-002 주입 후 채취한 소변과 식염수 주입 후 채취한 소변 내 (가) 철 양 비교 및 (나) 소변 샘플 색 비교 데이터이다.
도 13은 Perls Prussian blue 조직면역화학염색법을 이용한 랫드 관절강 내 미량 철 분석 데이터이다. (가) INV-002가 주입된 랫드 관절강 조직과 (나) 식염수 주입 랫드 관절강 조직의 현미경 사진.
도 14는 랫드 척수강 내 INV-002 주입 후 촬영한 T1 MRI 영상의 시계열 데이터이다.
도 15는 랫드 관절강 내 INV-002 주입 후 14일간 측정한 체중 패턴 데이터이다.
도 16은 랫드 관절강 내 INV-002 주입 후 분석한 혈액화학 및 조직병리 데이터이다. 랫드 관절강 내 INV-002 주입한 실험군 및 식염수 주입 대조군의 (가) 혈액화학분석결과. (나) INV-002 주입 실험군 및 (다) 식염수 주입 대조군의 조직병리 사진.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 정맥 내 주입용 나노 구조물의 합성
180 μmol의 덱스트란(평균분자량 5,000 Da)을 9 mL의 증류수 용해시키고 75 mmol의 에피클로로히드린 및 75 mmol의 NaOH를 첨가했다. 그 다음, 380 mmol 디에틸렌트리아민을 첨가하고 상온(room temperature, RT)에서 24 시간 동안 교반하였다. 상온에서 24 시간의 석시닐화 반응 후, 덱스트란 코어를 5 kD 분자량 컷오프(MWCO) 필터로 투석에 의해 정제하였다. 과량의 염화철 6 수화물 용액을 덱스트란 코어 용액에 첨가하였다. 1M NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정하여 상온에서 1시간 반응 후 투석으로 정제하여, 도 1에 도시된 나노 구조물(코드명: INV-001)을 합성하였다.
실시예 2: 관절강 내 주입용 나노 구조물의 합성
180 μmol의 덱스트란(평균분자량 10,000 Da)을 9 mL의 증류수에 용해시키고 75 mmol의 에피클로로히드린 및 75 mmol의 NaOH를 첨가했다. 그 다음, 380 mmol 에틸렌디아민을 첨가하고 상온(room temperature, RT)에서 24 시간 동안 교반하였다. 상온에서 24 시간의 석시닐화 반응 후, 덱스트란 코어를 15 kD 분자량 컷오프(MWCO) 필터로 투석에 의해 정제하였다. 과량의 염화철 6 수화물 용액을 덱스트란 코어 용액에 첨가하였다. 1M NaOH를 사용하여 pH를 8로 조정하여 상온에서 1시간 반응 후 투석으로 정제하여 나노 구조물(코드명: INV-002)를 합성하였다.
실시예 3: 나노 구조물의 분석
상기 실시예 1과 실시예 2에서 합성된 나노 구조물은 육안으로 관찰시 그 성상은 노란색 내지 황갈색의 투명한 용액이며, 철의 함량과 덱스트란의 함량은 각각 유도결합플라스마(ICP)와 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid method)으로 분석한 결과 그 비율이 질량기준 약 3 : 100 로 분석되었다. 가교제 유래 작용기의 수는 가교반응 이후 프탈알데하이드 정량(o-phthalaldehyde assay)과 원소분석(elemental analysis)을 통해 확인한 결과 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50% 이고, 이 중 20% 내지 50%는 가교에 참여하지 않고 말단이 외부에 노출되어 있는 것으로 분석되었다. 철 이온을 결합시킨 이후 프탈알데하이드 정량을 재 실시한 경우에도 가교제 유래 작용기가 검출되는 점으로 미루어, 가교제 유래 작용기의 일부는 철 이온과 결합되고 남은 일부는 비결합형태로 노출됨을 확인하였다. 합성된 나노 구조물은 동적광산란법(dynamic light scattering)을 통해 분석한 결과 수화지름(hydrodynamic diameter)은 신장여과제한크기(renal filtration cutoff)인 8 nm 이내에서 균일한 크기 분포를 나타내는 것이 확인되었고 전하는 -20 mV ~ 0 mV로 확인되었다. 크기배제크로마토그래피 법(Gel permeation chromatography)를 통해 측정한 평균분자량은 INV-001의 경우 약 10 ~ 15 kD, INV-002의 경우 약 30 ~ 35 kDa으로 각각의 나노 구조물이 평균 분자량 약 5,000 Da, 10,000 Da인 덱스트란으로 합성된 것으로 미루어 덱스트란 분자 2개 내지 3개가 가교된 것으로 분석되었다.
비교예 1: 3 nm 산화철 합성
3 nm 산화철 입자는 이전 보고서에 따라 합성되었다. 간단히, 10 mmol의 올레에이트 철 착물(iron-oleate complex), 60 mmol의 올레일 알코올 및 294 mmol의 디 페닐 에테르를 250mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 10℃/min의 일정한 승온 속도로 200 ℃까지 가열 한 후 실온으로 냉각시켰다. 합성된 나노 입자는 과량의 아세톤으로 침전된 다음 테트라 하이드로 퓨란에 재 분산되었다. 4 mL의 산화철 나노 입자-테트라 히드로 푸란 용액(10 mg/mL)을 에탄올 중 400 mg의 PEG-포스페이트와 혼합하고 70℃에서 8 시간 동안 가열 하였다. 최종 생성물은 20 kDa MWCO를 사용하는 동적 투석 장치로 정제되었다.
실시예 4: 나노 구조물의 농축 비교
실시예 1의 INV-001과 실시예 2의 INV-002을 3 kDa 분자량 컷오프(MWCO)의 원심분리필터(Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter, Millipore)에 넣고 fixed angle rotor 원심분리기를 이용해 25℃에서 1시간 동안 14,000 X g의 중력가속도를 가하여 농축하였다. 농축된 샘플의 철 농도를 유도결합플라즈마(inductively coupled plasma, ICP)를 이용하여 정량한 결과 도 2에 도시된 것처럼 INV-001은 약 2.6 mg/ml, INV-002는 약 1.6 mg/ml로 분석되어 INV-001은 INV-002 대비 약 160% 더 고농도로 제조가 가능한 것으로 분석되었다.
실시예 5: 나노 구조물의 점도 측정 비교
실시예 4에서 최대로 농축한 INV-002와 동일한 농도를 갖도록 INV-001를 희석 조제한 뒤 INV-001과 INV-002를 시험관에 담고 시험관을 40도의 항온조에 약 30분간 방치한 뒤 꺼내어 진동형점도계(SV-10, AND)의 유리샘플컵에 위치시켰다. 샘플의 온도가 시간에 따라 서서히 떨어져 약 37.5℃가 되었을 때의 점도를 측정하였다. 도 2에 도시된 것처럼 INV-001의 점도는 INV-002 대비 약 25% 더 낮은 것으로 분석되었다.
실시예 1 ~ 4 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 평균분자량이 더 작은 덱스트란 분자를 사용할수록 본 발명의 나노 구조물을 고농도로 준비가능하므로, 희석정도를 조절하여 제형의 점도가 정교하게 조절가능하다.
실시예 6 : 나노 구조물의 T1 MRI 조영효과 측정 비교
상술한 나노 구조물이 T1 MRI 조영제로 적합한 조영효과를 지니는지 분석하기 위하여 spin-spin relaxivity coefficient(r 2)와 spin-lattice relaxivity coefficient(r 1)를 각각 측정하고 그 비율(r 2/r 1 ratio)을 계산하였다. r 2/r 1 ratio는 조영제가 T1 MRI 조영제로 적합한지 혹은 T2 MRI 조영제로 적합한지를 판단하는 척도에 해당하며, 통상적인 T1 MRI 조영제는 약 1 ~ 2의 r 2/r 1 ratio를 지니며, T2 MRI 조영제는 바람직하게 5 이상의 r 2/r 1 ratio를 지닌다.
도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 INV-001의 9.4 Tesla MRI 팬텀촬영을 통한 조영효과 분석 결과에 따르면, r 1은 2.62 mM-1s-1, r 2는 2.73 mM-1s-1으로 확인되었다. 최종적으로 계산된 INV-001의 r 2/r 1 ratio는 1.06이었으며, INV-002 역시 r 2/r 1 ratio 가 1.3으로 INV-001과 INV-002 모두 T1 MRI 조영제로 적합한 조영효과를 지니는 것으로 분석되었다.
또한, 도 3의 (가)(나)로부터 알 수 있는 바와 같이, 농도가 높은 INV-001 샘플은 더 밝은 신호를 보여준다.
한편, 도 3(바)는 실시예 2의 INV-002 용액을 포함하는 팬텀(phantom)의 T1 강조영상이다. 도 3(바)에서 알 수 있는 바와 같이, 농도가 높은 샘플은 더 밝은 신호를 보여준다. 대조적으로, 더 높은 농도에서도 T2 강조영상에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다 (도 3(사)).
즉, 본 발명의 생체 내 주입용 나노 구조물의 T1 MRI 신호 강도는 조영제의 농도 의존성이다. 즉, 농도가 높을수록 T1 MRI 신호 강도가 강하다.
실시예 7 : 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 동물 혈관 조영효력 평가
동물용 MRI 장비에서 삼차원 조영증강 T1 MRI 강조영상기법으로 혈관조영술을 진행하였다. 7주령 이상의 수컷 Balb/c 마우스에 실시예 1의 INV-001을 단회 정맥 투여한 후 대조대비잡음비(contrast-to-noise ratio, CNR)을 평가하고 기존 가돌리늄 조영제(Dotarem)와 비교하였다. 또한, 조영효과의 지속시간을 확인하고 기존 가돌리늄 조영제와 비교하였다.
도 4(가)에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 INV-001 주입 후 T1 MRI 혈관조영술을 실시한 결과, 주입전 대비 뇌심혈관계가 밝게 나타나며 마우스의 경동맥, 심장, 대동맥, 하대정맥 등을 선명히 관찰 할 수 있었다.
도 4(나)에 나타난 바와 같이, first-pass 시 뇌심혈관계에서 측정된 CNR은 4.87로 가돌리늄 조영제 대비 200% 향상된 값을 나타내었다. Steady-state시 뇌심혈관계에서 측정된 CNR은 Dotarem 대비 250% 향상된 것이 확인되어 INV-001의 조영효과가 가돌리늄 조영제 대비 더 강하고 오랜 시간 지속됨을 확인하였다.
실시예 1의 INV-001이 지닌 강하고 오래 지속되는 조영효과를 활용하면 고해상도 MRI 영상촬영이 가능함을 확인하였다. 도 4(다)에 도시된 바와 같이, 랫드 뇌 혈관을 0.078 mm x 0.078 mm x 0.078 mm의 공간해상도로 촬영하여 0.078 mm의 미세뇌혈관을 선명히 관찰할 수 있었다.
실시예 8 : 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 흡수
7주령 이상의 수컷 Sprague-Dawley rat에 실시예 1의 INV-001을 단회 정맥 투여 후 혈액내의 흡수를 평가하였다. INV-001 투여 전, 투여 후 1분, 15분, 30분, 60분, 120분, 24시간 시점에 혈액을 채혈하고, 원심분리기를 가하여 혈장을 분리해 낸 뒤 혈장 내 철 농도를 ICP를 이용하여 정량하였다.
도 5(가)에 도시된 바와 같이, 흡수시험 분석 결과, 시간에 따른 혈장내 철의 양은 미정맥에 INV-001 주입 후 1분이내로 혈장내 철 농도가 올라가며 시간이 지날수록 내려갔다. INV-001 주입 후 24시간이 지난 후에는 혈장내의 철 농도가 주입전 수준으로 회복되었다. 도5(나)와 같이 INV-001에 대한 AUClast는 253.8 ± 31.66 ng·hr/mL, Cmax는 67.81 ± 12.48 ng/mL, Tmax는 0.01667 ± 0.00 hr로 INV-001은 체내에서 흡수된 후, 빠른 반감기를 나타내며 소실되는 것으로 분석되었다.
실시예 9 : 정맥 내 주입용 나노 구조물 INV-001의 배출
실시예 8의 결과와 같이 정맥주입된 INV-001은 빠르게 흡수되는 것으로 분석된 바, 흡수된 INV-001의 분포 및 배출을 평가하기 위해 60분 동안 MRI 연속 이미징 실시하였다. 그 결과 도 6에 도시된 것과 같이 주입 후 20분부터 방광에서 INV-001의 신호가 관찰되었으며 시간이 지남에 따라 그 신호가 점점 더 강하게 나타났으며 주입 후 60분 째에는 대부분의 신호가 방광에서 나타났다. 전체 MRI 신호 중 방광에서 나타나는 신호의 비율을 분석한 결과 도 7에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 INV-001은 주입 60분 내 주입량대비 약 91%가 방광으로 이동함을 확인하였다.
보다 더 정확한 배출 분석을 위해 상기 MRI 분석에 이어서, 배뇨, 배변의 철 함량 분석을 실시하였다. 7주령 이상의 수컷 Sprague-Dawley rat에 실시예 1의 INV-001을 단회 정맥 투여한 뒤 투여 직후부터 투여 후 12시간까지, 투여 후 12시간부터 투여 후 24시간 까지의 시점에 뇨와 변을 채집하였다. 배뇨, 배변의 철 함량 방법은 각각 비모수, 모수 통계 방법을 이용해 통계적 유의미성 산출하였다.
그 결과 도 8(가)에 도시된 바와 같이, INV-001을 주입한 실험군으로부터 채집한 배뇨 중 철 함량과 아무것도 주입하지 않은 대조군의 배뇨 중 철 함량 간에는 통계적으로 유의미한 차이가 나타나(p-value = 0.01996) INV-001이 뇨로 배출되는 것을 확인하였다. 반면 배변의 경우 도 8(나)에 도시된 바와 같이, INV-001을 주입한 실험군과 아무것도 주입하지 않은 대조군의 철 함량에 있어 통계적 유의성이 확인되지 않았다.
이상의 결과를 종합할 때, 실시예 1의 INV-001은 투여 후 뇨를 통해 배출되는 것으로 분석되었다.
실시예 10 : 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002의 T1 MRI 조영 효과
실시예 2의 INV-002를 자기공명영상 관절조영술(MR arthrography)용 T1 MRI 조영제로 사용할 수 있는지 확인하기 위해 요오드화된 X-선 조영제(iodinated X-ray contrast agent)와 혼합한 후에도 T1 MRI 조영효과가 유지되는지 테스트하였다.
본 테스트를 위해 INV-002를 요오드화된 X-선 조영제와 혼합하는 이유는 다음과 같다. 실제 임상 현장에서 자기공명영상 관절조영술을 시행할 때 관절강 내 정확한 위치에 조영제를 주사하기 위해 형광 투시 X-선(x-ray fluoroscopy)를 활용한다. 주사기 바늘이 관절강 내 정확하게 위치했는지를 확인하기 위해 소량의 요오드화된 X-선 조영제를 주입하고 조영제가 관절강 내 퍼져나가는 패턴을 형광 투시 X-선으로 관찰한다. 주사기 바늘의 의도한 위치에 있음이 확인된 경우, MRI 조영제를 주입한다. 이 때문에 관절강 내에서 MRI 조영제는 필연적으로 요오드화된 X-선 조영제와 혼합된다. 일부 MRI 조영제의 경우 요오드화된 X-선 조영제와 혼합될 경우 T1 MRI 조영효과가 낮아지는 사례가 알려져 있다.
테스트를 위해 실시예 2의 INV-002와 대표적인 요오드화된 X-선 조영제 중 하나인 Iopamidol의 혼합물을 조제하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, INV-002-Iopamidol 혼합물은 일반적으로 동일한 농도의 INV-002 보다 더 강한 T1 MRI 조영효과를 나타내었다. 예를 들어, INV-002와 Iopamidol을 1:1로 혼합한 경우 같은 농도의 INV-002 대비 약 2배 더 강한 T1 MRI 조영효과를 나타내었다. 이상의 결과로부터 실시예 2의 INV-002가 요오드화 X-선 조영제와 혼합될 경우에도, 강한 T1 MRI 조영효과가 유지되어 자기공명영상 관절조영술에 효과적으로 활용될 수 있음이 확인되었다.
실시예 11 : 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002을 활용한 자기공명영상 관절조영술
7주령 이상의 수컷 Sprague-Dawley rat를 산소와 이소플루란 혼합기체를 이용해 마취시킨 뒤 실시예 2의 INV-002를 무릎 관절에 주입한 뒤 fast-spin echo 시퀀스를 활용하여 T1 강조 MRI 영상을 촬영하였다.
도 10(가-라)에 도시된 바와 같이, INV-002를 주입한 동물의 무릎 관절강은, 주입하지 않은 대조군 무릎 관절강에 비해 MRI 영상에서 상당히 밝게 나타난다. 이러한 신호 강도의 변화는 도 10(마,바)에 도시된 바와 같이 정량적 수치로도 확인 가능하다. 예를 들어, 관절활액의 T1 신호 강도는 4,900 (주사 전)에서 21,000 (주사 후)으로 향상된다. 다음으로, 반월 상 연골, 캡슐, 십자형, 뼈 및 지방 영역을 포함한 관절강 내 여러 조직의 CNR을 분석하였다. 이 때 CNR은 활액과 각 해부학의 평균 신호 강도 차이를 배경 신호 강도의 표준 편차로 나눈 값이다. INV-002 주입 후 반월 상 연골, 캡슐, 십자형, 뼈 및 지방 영역의 CNR은 주입 전 대비 각각 10, 8.5, 18, 14, 12 및 4 배 증가하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, INV-002의 조영효과는 가돌리늄 조영제(예, Dotarem) 대비 더 강할 뿐 아니라 더 오랜 시간 지속되었다. 조영효과의 정량적 분석을 위해 관절강 내 2 곳(주황색 화살표)의 SNR를 측정하여 그 평균값을 시간에 따라 표시하였다. INV-002와 Dotarem은 주사 후 0.25 시간에 가장 높은 SNR을 나타내었으며 이 때 INV-002의 SNR은 Dotarem 대비 약 2배 더 높은 것으로 분석되었다. Dotarem의 SNR은 0.5 시간 이내에 주입하기 이전 수준으로 감소하는 반면, INV-002는 주입 후 6시간까지 유의미한 SNR이 유지되었으며, 주입 후 9 시간부터는 조영증강이 관찰되지 않았다.
이러한 결과로부터 실시예 2의 INV-002가 관절내 조영증강 효과를 나타내어 관절내 해부학적 구조물의 확인에 있어 도움이 될 수 있음을 보여주며, Dotarem 대비 조영효과가 오래 지속되어 고해상도 촬영, 반복 촬영, 촬영 실패 시 재촬영 등의 유용한 기회를 제공할 수 있을 것으로 분석되었다.
실시예 12 : 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002의 배출
실시예 11의 결과처럼 INV-002를 랫드 무릎 관절강 내 주입한 뒤 9 시간부터 조영증강이 관찰되지 않는 점을 미루어, INV-002는 9 시간 이내에 흡수되어 관절강 밖으로 배출되는 것으로 판단되었다. 보다 더 정확한 배출경로 분석을 위해 7 주령 이상의 Sprague-Dawley rat 무릎 관절강 내 INV-002를 주입 후 소변을 수집하였다. 0 ~ 24, 24 ~ 48, 48 ~ 72 시간에 수집된 소변 내 철분 함량은 ICP를 이용하여 분석하였다. 대조군은 식염수를 주입한 뒤 동일한 시점과 방법으로 소변을 채집 및 철분 함량을 분석하였다.
그 결과 도 12(가)에 도시된 바와 같이, INV-002 주입 수컷 및 암컷 쥐에서 채집한 소변 내 철 함량이 식염수 주입 대조군보다 통계적으로 유의하게 차이나는 것이 확인되었다. 특히 소변 내 총 철의 양은 약 0.018 mg으로 주입한 철의 양과 오차범위 내에서 동일한 것으로 분석되어, 관절강 내 주입된 INV-002는 주입 후 24시간 내에 대부분이 소변 배설을 통해 체내에서 배설될 수 있음을 나타낸다. 도 12(나)에서 볼 수 있듯이, INV-002 주입 후 채집한 소변 샘플의 색상은 INV-002의 색으로 인해 식염수 주입 대조군에 비해 더 어두운 갈색을 나타내는 것으로 분석되었다.
관절강 내 주입된 INV-002가 완전히 배출되었는지 확인하기 위하여, 미량의 철분도 검출할 수 있는 조직면역화학염색법(Perl's Prussian blue iron staining)을 사용하고 현미경 분석을 진행하였다. INV-002 주입 실험동물의 관절 조직을 채취하고 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 다음 Perls Prussian blue iron staining을 진행한 뒤 디지털 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 도 13에서 볼 수 있듯이, INV-002를 주입한 그룹과 식염수를 주입한 대조군 모두 철 축적이 없음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터 관절강 내 주입된 INV-002는 관절강 내 축적없이 뇨로 배출되는 것으로 분석되었다.
실시예 13 : 척수강 내 주입된 나노 구조물 INV-002의 조영효과 및 배출
실시예 11의 결과처럼 관절강 내 주입된 INV-002가 관절강 밖으로 배출되는 것을 확인한 데 이어 INV-002가 척수강에 주입되었을 때에도 조영효과를 나타내는지 그리고 배출될 수 있는지 확인하기 위해 실험하였다. 7주령 이상의 Sprague-Dawley rat를 산소와 이소플루란 혼합기체를 이용해 마취시킨 뒤 실시예 2의 INV-002를 척수강에 주입한 뒤 fast-spin echo 시퀀스를 활용하여 T1 강조영상을 촬영하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, INV-002를 주입한 동물의 척수강은 T1 MRI 영상에서 밝은 신호로 관찰되었다. 주입 전과 대비하여 주입 직후 척수강이 밝아지며, 주입 후 30분과 60분에 최대로 밝아졌다. 주입 후 90분에는 밝기가 감소하여 주입 후 120분에는 주입전과 비슷한 수준으로 감소하였다.
이상으로부터 척수강내 주입된 나노 구조물 INV-002가 척수강 바깥으로 배출되는 것으로 분석되었다.
실시예 14 : 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002의 단회투여 안전성 시험
INV-002의 관절강 내 국소독성을 평가하기 위해 INV-002를 Sprague-Dawley rat과 Beagle Dog의 관절내 단회투여하고 2주 관찰하였다. 국소독성시험에 사용된 INV-002의 농도는 실시예 3의 농축가능한 최고 농도인 1.6 Fe mg/mL 로, 임상시험용시 사용예정인 의약품의 농도인 0.14 Fe mg/mL 대비 약 11 배 고농도였으며, 시험동물 관절내 투여 가능한 최대부피(rat은 0.1 mL, Beagle dog는 1 mL)를 투여하여 시험하였다. 이 경우 Rat에 주입된 양은 0.16 Fe mg/head, Beagle dog의 경우 1.6 Fe mg/head 였다.
그 결과 이상증상은 관찰되지 않았으며, 도 15에서 볼 수 있듯이 INV-002 주입 군과 아무것도 주입하지 않은 대조군 사이에 체중 패턴에도 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 NOAEL(No Observed Adverse Effect Level, 무독성량)이 각각 0.160 Fe mg/head, 1.60 Fe mg/head로 임상적용예정용량의 각각 23 배, 6 배로 분석되어 뛰어난 안전성을 나타내었다.
실시예 15 : 관절강 내 주입용 나노 구조물 INV-002의 단회투여 혈액화학 및 조직병리 시험
실시예 2의 INV-002가 순환계에 흡수되어 신장 제거 경로를 통해 배설되는 것으로 밝혀졌기 때문에 간 기능(alanine transaminase, ALT; aspartate transaminase, AST; alkaline phosphatase, ALP; gamma-glutamyltransferase, GGT) 및 신장 기능(blood urea nitrogen, BUN; creatinine, CR)을 평가하기 위해 혈액 화학 검사를 수행하였다. 혈액화학 분석을 위해 복부 대동맥에서 채혈하고 원심분리를 통해 혈청을 분리하였다. ALT, AST, ALP, GGT, BUN, CR 수치는 생화학 자동 분석기를 사용하여 분석하였다.
조직병리시험을 위해 각 장기를 10 % 중성 완충 포르말린에 고정한 다음 제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 헤마톡 실린 및 에오신 염색을 위해 처리했다. 조직 절편은 1 분 동안 에오신으로 대조 염색한 뒤 디지털 현미경으로 분석하였다.
그 결과 도 16에 도시된 것처럼 혈액화학의 모든 테스트항목에서 정상범위를 나타내었으며, 조직병리결과에서도 병리학적 이상소견이나 병변이 관찰되지 않아 INV-002가 뛰어난 생체 내 적합성을 지니는 것으로 분석되었다.
세포 구조의 비정상적인 변화(예: 붕괴, 왜곡 또는 확장)가 관찰되지 않았다.
어떤 기관도 출혈, 염증 또는 괴사를 보이지 않았으며 이는 INV-002의 무독성을 나타낸다. 혈액 화학 분석 결과, INV-002를 주사 한 쥐에서 정상적인 신장 및 간 기능을 확인했다.
Claims (30)
- 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식(phagocytosis) 및/또는 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 나노 구조물로서,
(i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및
(ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되,
(iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며,
(iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출된 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물. - 제1항에 있어서, 덱스트란 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기와 배위결합한 2가 내지 3가 철 이온에 의해, (a) 생리적 pH의 완충용액 및 혈장에서 응집(aggregation) 또는 철 유리(leaching) 없이 안정하고/하거나, (b) T1 MRI 조영제 기능을 발휘할 수 있는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 생체 내 주입용 나노 구조물이 나타내는 T1 MRI 신호 강도는 생체 내 주입용 나노 구조물의 농도에 비례하고, 이로 인해 자기공명영상 (MRI)의 신호로부터 나노 구조물의 농도를 수치화 또는 정량화 가능하고/하거나, 나노 구조물의 생체 내 시간에 따른 분포 정도를 영상화 또는 수치화 가능한 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 자기공명영상(MRI)에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 발휘하도록 설계되어,
(i) 생체 내 주입 후 MRI을 통해 나노 구조물의 위치를 추적할 수 있고/있거나,
(ii) 생체 내 주입 후 흡수, 분포, 대사 및/또는 배출되는 경로, 및/또는 그 경로에 위치한 다양한 해부학적 구조 및/또는 기능 정보를 제공할 수 있는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물. - 제1항에 있어서, 자기공명영상(MRI)에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 발휘하도록 설계되어,
생체 내 주입 후 대식세포에 의한 탐식여부, 대사 분해 여부, 혈액순환 여부, 림프액순환 여부, 모세혈관을 통한 세포의 실질로 전달여부, 조직 내 축적 여부, 신장을 통해 소변으로 배출 여부, 생체 내 주입 후 혈관순환계에 흡수 여부, 혈관 벽을 통한 누출 여부, 및 소변을 통해 수집하여 재사용 가능여부 중 적어도 하나를 확인하여, 원하는 약동학 및 약력학적 특성을 발휘하는 맞춤형 생체적합성 나노 구조물을 제공할 수 있는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물. - 제1항에 있어서, 자기공명영상(MRI)에서 밝은 신호를 나타내는 T1 MRI 조영제의 기능을 발휘하도록 설계되어,
동물실험을 통해 생체 내 주입용 나노 구조물 또는 이를 함유하는 약학조성물의 적용부위 및/또는 투여경로에 따른 생체 내 거동의 분석이 가능하고/하거나 동 나노 구조물 또는 약학조성물이 목표한 생체 내 거동을 지닐 수 있도록 균일한 품질로 제조되었는지 여부에 대한 품질관리가 가능한 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물. - 제1항에 있어서, 다양하게 축적된 생체 정보 데이터를 활용하여, 나노 구조물을 통해 전달하고자 하는 약물의 생리기전, 환자, 질환 및/또는 투여경로 맞춤형 나노 구조물로 정교하게 설계가능한 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 신장 여과 크기 한계(renal clearance cut-off size)보다 작은 유체 역학적 직경(hydrodynamic diameter) 및 분자량(molecular weight)을 가지며, 콜로이드 안정성을 발휘하도록, 생체 내 덱스트란 구형 코어 내 덱스트란 분자의 평균분자량은 10,000 Da 이하이고, 덱스트란 분자가 가교되어 형성된 구형의 코어의 분자량은 35,000Da 이하이며, 나노 구조물의 수화 직경은 10 nm 이하인 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 덱스트란 구형 코어의 표면에 노출된 친수성 기(hydrophilic functional groups)의 수화를 통해, 체액(biological fluids) 내 분산안정성(colloidal stability)이 향상된 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 철 이온이 결합하는 가교제 유래 친수성 작용기는 가교제의 말단 작용기 또는 이의 개질된 작용기인 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 덱스트란 구형 코어 표면의 가교제 유래 작용기 중 일부 또는 전부는 카르복시산 또는 카복시레이트 기인 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 혈장에서 응집(aggregation) 또는 철 유리(leaching)없이 안정하고, 생체 내 주입 후 체내에서 대사 또는 분해되지 아니하여, 소변을 통해 수집하여 재사용 가능한 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 뇌심혈관계를 혈액순환하는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 생체 내 주입 후 혈액순환계에 흡수되어 혈관 벽을 통한 누출(extravasation) 없이 신장을 통해 소변으로 배출되는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 림프관, 관절강(articular cavity) 또는 척수강(intrathecal space)에 주입 시 혈액순환계에 흡수되어 신장을 통해 소변으로 배출되는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 정맥에 주입 시 간에서 제거되지 않고 혈액순환 후 신장을 통해 소변으로 배출되는 혈액순환용 나노 구조물인 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 생체 내 주입 후 조직 또는 장기에 축적되지 않고 신장 청소를 통해 배설되는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 덱스트란의 분자량, 덱스트란 주사슬의 길이, 가교시의 가교제의 종류, 합성반응시 투여하는 가교제의 양과 투여 속도 및 추가 화학 작용기 개질 중 적어도 하나를 조절함으로써, 나노 구조물의 전체 크기 및 전체 전하 조절을 통해, 원하는 혈액 순환 시간 및 신장 배설 약동학 (pharmacokinetics)이 부여된 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 쉘은 별도의 화학 물질로 코팅되어 있지 않고, 그 자체로 노출되어, 물분자의 접근을 용이하게 하여, 물분자 수소 원자핵 스핀의 이완을 가속화(accelerate water proton relaxation) 하는데 있어 보다 유리한 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 제1항에 있어서, 자기 공명 영상(MRI) 촬영시 조영제(contrast agent)로 작용하여 생체 내 미세 혈관, 요관, 간, 비장, 림프관, 관절강, 척수강 및/또는 해부학적 구조를 시각화할 수 있는 것이 특징인 생체 내 주입용 나노 구조물.
- 생체 내 주입 후 대식세포에 의해 탐식(phagocytosis) 및/또는 대사 분해되지 않은 상태로 신장을 통해 소변으로 배출되는 생체 내 주입용 나노 구조물을 함유하는 약학 조성물로서,
상기 생체 내 주입용 나노 구조물은 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 생체 내 주입용 나노 구조물이고,
(i) 평균분자량이 10,000 Da 이하인 덱스트란 분자 1개 내지 3개를 가교제로 가교하여 형성된 구형 코어; 및
(ii) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들에 2가 내지 3가 철 이온이 배위결합된 비연속적 쉘을 구비하되,
(iii) 전하가 -20 mV ~ 0 mV가 되도록 구형 코어 덱스트란과 철의 질량 비율이 100 : 2 ~ 100 : 10 이면서 가교제 치환 비율이 덱스트란 작용기 갯수의 10% 내지 50%로 조절된 것이고, 가교제 중 20% 내지 50%는 일 말단이 가교에 참여하지 않으며,
(iv) 구형 코어 표면의 가교제 유래 친수성기들 중 외부에 노출된 작용기의 20% 내지 80%만 철 이온과 결합하고, 나머지는 철 이온과 결합하지 않고 수 환경(aqueous environment)에 노출된 것이 특징인 약학 조성물. - 제21항에 있어서, 생체 내 주입용 나노구조물은 철 침출 없이 대식세포에 의해 탐식되지 않고 신장을 통해 소변으로 배출되어, 관절 질환의 원인인 관절에의 철분 축적을 야기하지 아니하는 것이 특징인 약학 조성물.
- 제21항에 있어서, 혈관 구조와 형태의 영상화, 혈류와 혈액동력학적 정보 분석, 및/또는 심혈관계, 뇌혈관계, 림프계, 근골격계 및/또는 뇌 척수 신경계 영상화를 실현하기 위해 상기 생체 내 주입용 나노 구조물이 MRI 조영제로 사용되는 것이 특징인 약학 조성물.
- 제21항에 있어서, 생체 내 주입용 나노 구조물은 주변 조직과의 대조 효과를 발휘하며, 체액 내 분포된 농도에 따라, 자기공명영상(MRI)에서 나타나는 체액의 신호 크기가 달라져, 시계열적으로 조직 내 분포 여부를 확인할 수 있는 것이 특징인 약학 조성물.
- 제21항에 있어서, 요오드화된 X-선 조영제와 병용사용시에도 T1 조영효과를 발휘하는 것이 특징인 약학 조성물.
- 제21항에 있어서, 생체 내 주입용 나노구조물을 MRI 조영제로 함유하고 MR 혈관조영술(MR angiography), MR 관절조영술(MR arthrography), MR 뇌수조촬영술(MR cisternography), MR 척수조영술(MR myelography), MR 림프관조영술(MR lymphangiography), MR 담췌관촬영술(MR cholangiopancreatography) 또는 뇌, 복부 MRI 조영술에 사용되는 것이 특징인 약학 조성물.
- 제21항에 있어서, MRI 조영제; 및/또는 약물 전달체, 또는 조직 내, 혈액 내 또는 림프액 내 정보 수집용 흡착제로 사용되는 것이 특징인 약학 조성물.
- 제21항에 있어서, 덱스트란의 평균분자량을 조절하여, 농도 및 점도가 조절된 정맥 주사제 또는 림프관 주사제로 사용되는 것이 특징인 약학조성물.
- 제21항에 있어서,
덱스트란 수용액을 준비하는 제1단계;
상온에서 알칼리성 수용액과 에폭사이드(epoxide)를 적하하는 제2단계;
상온에서 2이상의 다가 아민류를 적하하여 말단 아민기를 가진 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 생성시키는 제3단계;
생성물을 침전시키는 제4단계;
생성물을 물에 재분산시키는 제5단계;
선택적으로(optionally), 말단 아민기 (terminal amine group)를 가진 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 투석(dialysis)하여 회수하는 제6단계;
다가 아민류에 의해 가교결합되고 이로 인해 말단 아민기 (terminal amine group)를 가지는 덱스트란 가교체 기반 나노입자에, 유기산 무수물(organic acid anhydride)를 투여하여 말단 아민기의 일부 또는 전부를 카복실산기(carboxylic acid groups) 및/또는 카르복실레이트기(carboxylate groups)로 치환하는 제7단계;
선택적으로(optionally), 카복실산 및/또는 카르복실레이트 작용기를 가진 덱스트란 가교체 기반 나노입자 용액을 정제하여 수분산가능한 덱스트란 가교체 기반 나노입자를 준비하는 제8단계;
전 단계에서 준비된 수분산가능한 덱스트란 가교체 기반 나노입자에, 철 전구체 수용액을 첨가하여, 2가 내지 3가 철 이온으로 구성된 쉘을 형성시키는 제9단계; 및
선택적으로(optionally), 전 단계에서 형성된 나노 구조물을 한외여과(ultrafiltration) 하여 정제 또는 농축하는 제10단계를 포함하는 제조방법에 의해 준비하되,
수득된 생체 내 주입용 나노 구조물은 물에 분산된 콜로이드(colloid) 형태로, 특별한 추가 가공 없이도 멸균(sterility) 및 비발열성(non-pyrogenic)을 만족하여 얻어진 그 자체로 주사제(injectable solution) 로 사용가능하고/하거나 농축 정도에 따라 별도의 부형제(excipient) 없이도 등장성(isotonic)을 갖도록 할 수 있는 것이 특징인 약학조성물. - 제21항에 있어서, 상기 생체 내 주입용 나노 구조물은 MRI 조영제 약물로서 표적항원 결합 부위를 포함하는 약물 전달체에 연결된 것이 특징인 약학조성물.
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2022
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| Publication number | Publication date |
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